KR20180067809A

KR20180067809A - 골다공증 저항성 마우스 모델 및 이를 이용한 골다공증 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20180067809A
Application number: KR1020160169150A
Authority: KR
Inventors: 이태훈; 김수희; 안선희; 정승훈; 이명화
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2018-06-21
Also published as: KR101942257B1

Abstract

본 발명은 골다공증 저항성 마우스 모델 및 이를 이용한 골다공증 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 골다공증의 저항성을 향상시킨 연구 모델 마우스를 제공함으로써, 골다공증 관련 유전체의 기능연구로 활용할 수 있고, 골다공증 약물의 타겟 유전자를 발굴할 수 있으며, 골다공증의 조절 작용점 분석 및 신규 신호 전달계를 규명할 수 있고, 골다공증의 조절 기전 제시에 활용될 수 있는, 골다공증 저항성 마우스 모델 및 이를 이용한 골다공증 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

골다공증 저항성 마우스 모델 및 이를 이용한 골다공증 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법 {Osteoporosis resistant mouse, and active substances screening method for preventing or treating osteoporosis using the mouse}

본 발명은 골다공증 저항성 마우스 모델 및 이를 이용한 골다공증 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

골 밀도의 감소를 일으키는 골 질환은 뼈의 대사 즉 새로운 뼈를 생성하는 골 생성과 오래된 뼈를 제거하는 골 소실 속도의 불균형에서 기인한다.

골다공증은 이러한 불균형에서 기인으로 것으로, 나이가 많을수록 발생할 확률이 높아지는 골 질환이다. 이에 전 세계적인 고령화 추세와 함께 골다공증 및 관련 질환 보유 인구가 증가하면서 현대사회의 심각한 문제로 대두되고 있다. 때문에, 고령화 사회에 대비하여 삶의 질 향상을 위해 골 발생 증진 및 골 소실 예방을 통한 골다공증 치료 방안의 연구, 치료제 발굴을 위한 동물 모델 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 골 소실을 감소시키면서 골 생성을 증가시킬 수 있는 골다공증 예방 또는 치료제를 스크리닝할 수 있고, 골다공증 치료의 근본적인 인자를 발굴할 수 있는 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제2016-111985호

본 발명은 골다공증 저항성이 증가된 마우스 모델의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 골다공증 저항성이 증가된 마우스 모델의 제조방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 골다공증에 치료 활성 물질을 스크리닝 할 수 있는 방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 골다공증을 연구할 수 있는 키트의 제공을 목적으로 한다.

1. PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자가 과발현된, 골다공증 저항성 마우스 모델.

2. 마우스에서 PrdxV 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 골다공증 저항성 마우스 모델 제조 방법.

3. 위 2에 있어서, 상기 과발현은 PrdxV 유전자가 삽입된 발현카세트를 상기 마우스의 수정란에 도입시켜 수행되는, 골다공증 저항성 마우스 모델 제조 방법.

4. 개체의 골수세포 내 PrdxV 유전자를 과발현시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 골다공증의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법.

5. PrdxV 유전자가 과발현된 골다공증 저항성 마우스 모델을 포함하는 골다공증 연구용 키트.

본 발명의 마우스 모델은 골다공증 약물의 타겟 유전자를 발굴할 수 있으며, 골다공증의 조절 작용점 분석 및 신규 신호 전달계를 규명할 수 있고, 골다공증의 조절 기전 제시에 활용될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 약물의 표적 물질을 발굴하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 골 밀도를 증가시키는 물질을 발굴할 수 있다.

본 발명의 골다공증 연구용 키트는 골 대사에 관여하는 유전체 또는 단백질체를 발굴하는 데 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 골다공증 저항성 마우스 모델을 제조하기 위한 벡터의 일 실시예를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 PrdxV (7kb) 및 MAR(Matrix attached Region) (3kb)과 일부 pCR3.1 vector 부위 (1.1kb)가 총 11.1kb인 것을 나타낸 것이다.
도 3은 도 1의 벡터에 제한효소를 처리하였을 때 11.1kb의 인간 PrdxV가 삽입된 부위가 검출되는 것을 나타낸 것이다.
도4는 마이크로인젝션한 유전자를 가지고 태어난 마우스를 선발하기 위해 DNA분석한 사진을 나타낸 것으로 마우스로부터 분리된 DNA 중 도2의 부분이 검출된 것을 나타낸 것이다.
도 5는 야생형 마우스와 본 발명의 골다공증 저항성 마우스 모델에서 PrdxV의 유전자 존재 여부 및 단백질 발현 여부를 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 본 발명의 골다공증 저항성 마우스 모델의 차세대 마우스 장기 및 조직에서 PrdxV의 과발현 여부를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 파골 및 조골 세포 분화 시 PrdxV의 발현율을 분석한 것이다.
도 8는 PrdxV를 과발현 시킨 골다공증 저항성 마우스 모델의 생체 유래 파골 및 조골세포 분화능을 평가한 것이다.
도 9은 PrdxV를 과발현 시킨 골다공증 저항성 마우스 모델에서 골다공증이 개선되는지 여부를 in vivo에서 검증한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PrdxV 유전자가 과발현된 인간을 제외한 골다공증 저항성 마우스 모델을 제공한다.

골다공증은 인구학적 요인 (연령, 체중, 신장, 경제수준, 학력, 가사활동 등), 여성관련요인 (초경연령, 폐경 및 폐경 연령, 임신횟수, 수유방법, 수유기간, 피임약 복용 등), 생활양식 및 내과적 질환 등의 요인 (모계 가족력, 흡연, 과다한 음주와 카페인 섭취, 적은 칼슘 섭취, 운동부족, 특정 약물의 장기적 복용 등)의 이유로 발생하며, 뼈 형성보다는 뼈 흡수가 늘면서 골 밀도가 줄어 발생한다.

PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자는 포유류 유래 PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있고, 예를 들어, 침팬지, 필리핀원숭이, 대초원들쥐, 마우스, 소, 시궁쥐 또는 인간 유래, 보다 구체적으로 인간 PrdxV 유전자(NCBI Reference Sequence: NC_000011.9, 서열번호 1)일 수 있다. 상기 "PrdxV"는 "Prdx 5""Peroxiredoxin-5" 및 "퍼록시레독신 5" 등으로 표현될 수 있다.

인간 PrdxV 유전자(NCBI Reference Sequence: NC_000011.9, 서열번호 1)는 인간의 11번 염색체에 위치한 유전자로, 마우스 모델 내에서 상기 PrdxV 단백질이 과발현되면 마우스의 파골세포의 분화율이 낮아지고, 조골세포의 분화율이 높아져 골 밀도가 증가한다는 것을 본 발명자들이 최초로 발견하여 본 발명을 착안하였다.

즉, 본 발명의 마우스 모델은 인간 PrdxV가 과발현되어 골 밀도의 감소로 골다공증이 발생하는 것을 억제하여 골다공증에 저항성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 마우스 모델을 골다공증 연구 모델로 사용함으로써 골다공증 관련 유전체의 기능연구로 활용할 수 있고, 골다공증 약물의 타겟 유전자를 발굴할 수 있으며, 골다공증의 조절 작용점 분석 및 신규 신호 전달계를 규명할 수 있고, 골다공증의 조절 기전 제시에 활용이 가능하여 유용하게 이용될 수 있다.

골다공증 저항성 모델은 마우스 외 랫트(rat), 소, 말, 돼지, 원숭이, 오리, 개, 고양이 등 인간을 제외한 포유 동물이 될 수 있고, 이 경우, 상기 포유 동물은 상기 포유동물 내 PrdxV가 과발현 또는 인간 PrdxV가 과발현된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 양태로 골다공증 저항성 마우스 모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은 마우스에서 PrdxV 유전자를 과발현시키는 단계를 포함한다.

PrdxV 유전자의 과발현은 마우스 내 PrdxV 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자의 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현 조절서열의 변형, 특히 프로모터의 교체 또는 변형 및 유전자 내 돌연변이에 의한 발현 증가 등에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자는 포유류 유래 PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있고, 예를 들어, 침팬지, 필리핀원숭이, 대초원들쥐, 마우스, 소, 시궁쥐 또는 인간 유래, 보다 구체적으로 인간 PrdxV 유전자(NCBI Reference Sequence: NC_000011.9, 서열번호 1)일 수 있다.

PrdxV 유전자를 과발현시키는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대, PrdxV 유전자가 삽입된 발현카세트를 마우스의 수정란에 도입시켜 발생되는 것일 수 있다.

발현카세트는 특정 뉴클레오티드 단편을 발현시키기 위한 수단을 나타내며, 통상적인 발현벡터가 상기 발현카세트의 예가 될 수 있다. 예컨대, 발현 카세트는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

발현카세트에 삽입되는 PrdxV 유전자는 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 대한 인지 및 적절한 전사에 요구되는 다른 인자를 제공함으로써 코딩서열의 발현을 제어하는 코딩서열의 상류(5')에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있으며, 코딩서열 또는 기능을 갖는 RNA의 발현을 조절할 수 있는 최소 프로모터와 조절성분을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있다. "작동 가능하게 연결된다"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.

프로모터는 마우스 모델 내에서 작동할 수 있으면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 프로모터는 TATA 박스와 전사 개시위치를 특정하는 역할을 하는 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터를 포함할 수 있으며, 발현 제어를 위한 조절성분이 더 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프로모터는 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래된 상이한 성분들로 이루어질 수 있으며, 또는 합성 DNA 절편으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프로모터는 또한 생리적 또는 성장 조건에 대한 반응으로 전사 개시의 유효성을 제어하는 단백질 인자의 결합에 관여하는 DNA 서열을 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프로모터는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 사용할 수 있으며, 그 예로 U6 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터, CaMV 35S 프로모터, Rsyn7 프로모터, 라이스 액틴(rice actin) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, ALS 프로모터 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

발현카세트는 프로모터 외에도 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 터미네이터, 복제기점 등을 포함할 수 있으며, 마우스 모델 내에서 작동할 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있고, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

또한, 마우스의 수정란은 PrdxV 유전자가 과발현된 마우스 모델과 정상 마우스 또는 동종의 마우스 모델과의 교배를 통해 제조될 수 있다.

본 발명은 다른 양태로 골다공증의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 개체 내 골수세포의 PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자를 과발현시키는 물질을 선별하는 단계를 포함한다.

예방 또는 치료는 질환과 관련된 원치 않는 증상을 경감하거나, 질환이 발병하기 전에 증상이 나타나는 것을 예방하거나, 질환의 진행을 늦추거나, 증상의 악화를 늦추거나, 관해 기간의 개시를 높이거나, 질환의 만성 진행 단계에서 야기되는 비가역적 손상을 줄이거나, 진행 단계의 개시를 지연시키거나, 질환의 중증도를 감소시키거나 질환을 치료하거나, 생존율을 개선하거나 회복 속도를 더욱 빠르게 유도하거나, 질환이 발생하는 것 또는 이들의 조합에 효과적인 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 말한다.

개체는 포유류일 수 있으며, 예를 들어, 침팬지, 필리핀원숭이, 대초원들쥐, 마우스, 소, 시궁쥐 또는 인간, 보다 구체적으로 인간일 수 있다.

골수세포는 인간을 제외한 포유동물로부터 분리되지 않고 생체 내 존재하는 것일 수 있고, 당업계에서 잘 알려진 바와 같이 인간을 포함한 포유동물의 골수강으로부터 적합한 도구 (예를 들면, 주사 바늘)를 이용하여 물리적으로 분리된 것일 수 있다. 상기 골수세포는 제한되지 않으나, 조혈모세포 및/또는 간엽계 줄기세포일 수 있다.

물질은 정맥 내 주사, 복강 내 주사 등의 비경구 투여 또는 경구 투여를 통해 개체의 골수세포 표면과 맞닿거나, 골수세포 내로 투여되는 것을 말하며, 접촉은 in vitro 및/또는 in vivo에서 이루어질 수 있다. 이 때, 대상 물질의 투여량은 대상 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 물질로 예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 대상 물질은 신규 또는 널리 알려진 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 대상 물질은 염을 형성할 수 있으며, 이러한 염으로 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등을 들 수 있으며, 구체적으로 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

PrdxV 유전자의 발현 증가 여부의 확인은 PrdxV 단백질의 양 또는 PrdxV mRNA의 양의 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

PrdxV mRNA의 발현량의 측정을 위해 당업계에 공지된 기술을 사용할 수 있으며, 예컨대, 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

PdrxV 단백질의 발현량의 측정을 위해 당업계에 공지된 기술을 통하여 측정할 수 있으며, 예컨대, 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

PrdxV mRNA 또는 단백질 발현량 외 골다공증과 상관 관계가 있는 지표 값의 예를 들면, 대퇴골의 골밀도 및 골량 증가, 두개골의 두께 및 골밀도 증가, 혈청 내의 IL-6 감소 또는 OPG 증가, RANKL 감소, 조골세포의 분화를 조절하는 전사 조절자인 Fra2, NF-AT1, JunD, Fos 유전자 발현 증가 및 조골세포 분화 인자인 알카린포스파타제(ALP) 및 COLLⅠ 유전자 발현 증가 등이 있으며, 이들 지표를 추가로 더 확인함으로써 대상 물질을 골다공증 예방 또는 치료 활성 물질로 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명은 개체 내 골수세포의 PrdxV(Peroxiredoxin-5) 단백질을 과발현시키는 물질을 선별하는 단계를 포함한다.

식별단계에서는 대상물질을 처리하지 않은 골수세포의 PrdxV 단백질 발현량과 대상 물질을 접촉한 후의 PrdxV 단백질 발현량을 비교하거나, 양성 대조군, 음성 대조군 등과 대상 물질을 처리한 골수세포의 PrdxV 단백질 발현량을 비교하는 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로 골다공증 연구용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 PrdxV 유전자가 과발현된 골다공증 저항성 마우스 모델을 포함한다.

PrdxV 유전자는 전술한 PrdxV 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

연구용 키트는 제한되지 않으나, PCR 키트, 마이크로어레이 키트, 바이오 칩 키트, 면역 분석용 키트, 면역 크로마토그래피 키트, 루미넥스 어세이 키트, 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 면역학적 도트 키트 및 바이오센서, DNA Chip 또는 RNA 칩(유전 자 칩), Protein Chip(단백질 칩), Cell Chip(세포 칩) 등의 바이오칩(bio chip) 등일 수 있다.

연구용 키트는 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

기질로는 예컨대, 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등을 들 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase) 등을 들 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등을 들 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아 민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. PrdxV (Peroxiredoxin-5) 과발현 벡터 제조

인간 PrdxV 유전자(NCBI Reference Sequence: NC_000011.9)를 과발현하는 벡터를 제작하기 위해 Promoter site부터 poly A signal까지 PCR로 증폭하였다.

상기 PCR로 증폭한 인간 PrdxV (프로모터, 엑손, 인트론 및 poly A signal 모두 포함, 7kb)을 pCR3.1 vector (Invitrogen, Genbank Accession No. AF060226)의 Sal I과 Mlu I 제한효소 부위에 클로닝하고, BamH I과 SalI 제한효소 부위에 MAR(matrix attachment region sequence) (3kb) (Genbank Accession No. AF405540, Gallus gallus lysozyme precursor)를 삽입하여 PrdxV 유전자를 과발현하는 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터의 모식도를 도 1에 나타냈다.

상기 인간 PrdxV, MAR 및 pCR3.1 vector의 일부분 (ApaL I(도 2에서 BamH I과 가까운 곳의 제한효소 자리)에서 MluI사이)는 총 11.1kb의 길이를 가진다(도 2 및 3).

2. 골다공증 저항성 마우스 모델(PrdxV 과발현) 제조

앞서 제작한 PrdxV 유전자 과발현 벡터를 제한효소 APaL1(도 2에서 BamH I과 가까운 곳의 제한효소 자리)과 MluI으로 절단한 후，절단된 벡터 5ng을 미세주입법 (microinjection)으로 1,306 개의 마우스 배아세포 (BDF/1 종)에 주입시켰다. 주입된 배아세포 가운데 639개의 배아세포를 39마리의 가임신한 대리모 난관팽대부에 다시 주입하여 20일 후에 55마리의 마우스를 생산하였다.

상기 생산된 마우스에서 PrdxV 유전자가 과발현되는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 마우스의 꼬리를 잘라 게놈 DNA를 추출하고 추출된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 PrdxV 유전자가 과발현된 형질전환 마우스를 선별하였다. PCR은 인간 PrdxV 부분을 탐지할 수 있는 서열번호 2(5'-ATTTGCATTGGGCATTAGTGT-3') 및 서열번호 3(5'-CCAACCCTTGACCCAATGAC-3')의 hgPrdxV 프라이머 5pmole/μl로 94℃ 5분; 94℃ 1분, 60℃ 1분 및 72℃ 1분의 30사이클: 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다.

그리고 ApaL I(도 2에서 BamH I과 가까운 곳의 제한효소 자리)과 Sal I을 탐지할 수 있는 서열번호 4(5'-GGAATAAGGGCGACACGGAA-3') 및 서열번호 5(5'-TGAGTGTTGTTCCAGTTTGG-3')의 pCR3.1 vector 프라이머 5pmole/μl로 94℃ 5분; 94℃ 1분, 52℃ 1분 및 72℃ 1분의 30사이클: 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR 수행을 통해 얻은 DNA 산물은 아가로스겔에서 전기영동한 뒤, 상기 인간 PrdxV 및 상기 MAR을 포함하는 단편 (11.1kb)을 가지는 PrdxV 유전자가 과발현된 골다공증 저항성 마우스 모델을 선별하였다(도 4 및 5).

도 4 및 5에 나타난 바와 같이, 골다공증 저항성 마우스 모델에서 상기 벡터가 삽입된 것을 확인하였으며(도 4), 삽입된 벡터에서 인간 PrdxV (Prdx 5)를 과발현하는 것을 확인하였다(도 5).

3. 골다공증 저항성 마우스 모델의 차세대에서 PrdxV 유전자의 과발현 효과

상기 실시예 2에서 생산된 골다공증 저항성 마우스 모델의 차세대에서 PrdxV 유전자가 과발현되는지 여부를 확인하기 위하여 통상적인 방법에 의해 웨스턴 블럿 분석법을 수행하였다.

구체적으로 전술한 방법으로 제조한 수컷 마우스 (BCF/1종)와 야생형 암컷 마우스 (BDF/1종)를 교배하여 태어난 새끼를 해부하여 신장，허파，간，비장，피부 및 골수 조직을 분리하여 단백질을 추출한 다음 이를 통상적인 방법으로 웨스턴 블릿 분석에 이용하였다. 보다 구체적으로 상기 조직을 (어떤 화합물로) 용해시킨 후 13,000 rpm으로 원심 분리하여 상층의 조단백질 (crude extract)을 수득하고 수득된 각각의 단백질 양을 정량한 후，동일한 양을 각각 12% SDS-PAGE 겔(gel)에 로딩(loading)시켰다. 상기 겔(gel)에 로딩된 단백질을 폴리비닐리덴 다이플루오리드(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(membrane)에 옮긴 후， 인간 PrdxV에 대한 폴리클론 항체(AbFrontier，SF-PAOOI0)와 반응시킨 다음， 홀스래디쉬 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 토끼의 면역글로불린(IgG)과 반응시켰다. 상기 반응 결과 특이적으로 결합된 단백질을 ECL(enzyme coupled immunoluminescence)로 확인하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이，상기 골다공증 저항성 마우스 모델의 차세대(next generation)에서도 야생형 마우스나 형질전환 되지 않은 마우스에 비해 신장，허파 및 간 조직 등에서 PrdxV 단백질이 과발현된 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 골다공증 저항성 마우스 모델의 PrdxV 유전자가 과발현되는 형질이 차세대에도 그대로 잘 전달됨을 확인하였다.

실험예

1. PrdxV의 조골 및 파골세포의 분화 연관성 분석

각 분화 단계의 조골 및 파골세포로부터 단백질 추줄 및 정량 후 95℃에서 10분 동안 끓였다. 단백질은 15% SDS-PAGE 겔에서 로딩하고 웨스턴 블롯을 실시하였다 웨스턴 블롯은 PrdxV와 로딩 대조군으로 β-actin과 특이적으로 결합하는 l차 항체 사용 후, HRP이 연결된 2차 항체 (Cell Signaling Technology)를 이어서 사용하였다. ECL 시스템(iNtRON, South Korea)로 면역반응 단백질을 검출하였다. 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, RANKL을 처리한 경우 처리하지 않은 경우에 비해 PrdxV의 발현량이 시간이 지날수록 감소하는 것을 확인하였고(7A), AA+β-GP를 처리하였을 경우 처리하지 않은 경우에 비해 시간에 따라 PrdxV의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(7B). 상기 결과로부터 파골세포의 분화가 증가하면 PrdxV의 발현량이 감소하고, 조골세포의 분화가 증가하면 PrdxV의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.

2. 파골세포 분화 시스템 확립

8주령 마우스 대퇴 및 경골 내부를 α-MEM 배지에서 세척하여 골수세포를 회수하였다. 회수된 골수세포는 10% FBS (Fetal bovine serum), 1% penicillin/streptomycin(PS)을 함유하는 α-MEM 배지에서 하루 동안 배양하였다. 그 후 부유한 세포들만을 회수한 후 30 ng/mL M-CSF (PeproTech, Rocky Hill, NJ)를 함유하는 배지에서 3일 동안 배양하여, 회수된 세포들이 골수유래대식세포 (bone marrow derived macrophage; BMM)로 분화되도록 유도하였다.

골수유래대식세포로 분화되도록 유도된 세포 중 기질에 부착되지 않은 세포들은 제거하고 부착된 세포들은 30 ng/mL M-CSF 및 50 ng/mL RANKL (PeproTech)을 함유한 배지에서 5일 동안 배양하여 파골세포로 분화하도록 유도하였다. 부착된 세포들을 배양하는 동안 2일마다 새로운 배지에서 교체하였다. 부착된 세포들의 분화 정도를 평가하기 위해 RANKL 처리 후 0일에서 5일까지 각 분화단계의 세포들을 3.7% formaldehyde로 30분간 고정한 후 tartrate-resistant acid phosphatase, leukocyte (TRAP) kit (Sigma-Aldrich, 5t. Louis, MO)로 염색하였다. TRAP-양성을 보이는 거대다핵을 가지는 세포들 (5개 이상의 핵을 가진 세포들)의 수를 측정함으로써 파골세포로의 분화 정도를 평가하였다.

도 8A에 나타난 바와 같이, 골다공증 저항성 마우스 모델(PrdxV-OE)가 정상 마우스에 비해 파골세포 분화능이 저하(골 흡수 저하)되는 것을 확인하였다.

3. 조골세포 분화 시스템 확립

8 내지 10주령 마우스의 대퇴 및 경골 내부를 α-MEM 배지에서 세척하여 골수세포를 회수하였다. 회수된 골수세포는 20% FBS, 1% PS를 함유하는 α-MEM 배지에서 10 내지 12일 동안 배양하였다. 배양하는 동안 2일마다 새로운 배지에서 교체하면서 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)로 분화된 세포만 보존하였다. 이 후 기질에 부착된 중간엽 줄기세포들을 5mM β-glycerophosphate (β-GP), 50 μg/ml ascorbic acid(AA), 10 nM dexamethasone을 함유한 배지 (10% FBS, 1% PS를 함유한 α-MEM)로 21일 동안 배양하여 조골세포로의 분화를 유도하였다. 분화 정도를 평가하기 위해 β-GP, AA 및 10 nM dexamethasone 처리 후 0일에서 21일까지 각 분화단계의 세포들을 3.7% formaldehyde로 30분간 고정한 후 alkaline phosphatase(ALP)와 alizazin red(AR) S로 조골세포 분화 활성도 및 골 미네랄화를 평가하였다.

도 8B에 나타난 바와 같이, 골다공증 저항성 마우스 모델의 조골세포 분화능의 경우, 정상 마우스에 비해 증가(골 형성 증가)하는 것으로 확인되었다.

4. 골다공증 저항성 마우스 모델에 골다공증 유발

8주령의 암컷 마우스가 난소절제술(Ovariectomy, OVX)을 수행하기 위해 사용되었다. 마취 후 등쪽 요추 부위 정중선 주변의 털을 제거하고 수술 부위를 포비돈 요오드(Povidone-iodine)와 알코올로 소독하였다 등쪽 마지막 늑골로부터 꼬리 쪽으로 1cm 거리의 요추 정중선 피부를 0.5 내지 1cm 절개하고, 요추로부터 배쪽 정중선 쪽으로 1 내지 1.5cm 거리의 피부 아래 복막과 연결되어 있는 양쪽 (왼쪽과 오른쪽) 근육 조직을 0.5cm 절개한 후 포셉으로 난소주변을 둘러싸고 있는 지방조직을 잡아당겨 난소와 난소와 근접한 일부 자궁각을 외부로 노출시켰다. 난소와 가까운 왼쪽과 오른쪽 자궁각을 봉합사로 결찰하고 왼쪽과 오른쪽 난소를 절제한 후 복강 내로 다시 집어 넣었다 그 후 절개된 피부를 봉합하고 소독하였으며, 2개월 후 체중과 골 밀도 등을 평가함으로써 골다공증 유발을 확인하였고, 이를 실험에 사용하였다. 한편 피부 절개 후 난소를 적출한 후 난소 절제 없이 다시 복강 내로 난소를 집어넣은 군이 대조군(sham)으로 사용되었다.

5. Micro-computed tomography (μCT)를 이용한 골 표현형 분석

대조군과 OVX 마우스 대퇴골을 회수하여 주변의 근육조직을 제거하고 10% 중성 포르말린(Sigma-Aldrich)으로 고정하였다. 고정 24시간 후 μCT촬영 전 PBS로 한번 세척 후 대퇴골 원위(경골과 인접한 대퇴골 부위)가 50 kV, 201 mA, 0.5-mm aluminum filter에서 엑스레이가 방출되는 Skyscan 1172 system (Bruker, Kontich, Belgium)으로 촬영하였다. 촬영된 골 이미지를 image reconstruction software(CTAn; Bruker, Mimics 14.0; Leuven, Materialise, Belgium)로 골 밀도 수치 분석을 하였다(bone volume fraction (8V/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular number (Tb.N), trabecular separation (Tb.Sp)).

골다공증 유발을 위해 난소절제술 (Ovariectomy; OVX)을 실시한 후 골 대사 표현형(골용적, 해면골두께, 해면골 개수, 해면골 간격)을 평가한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 난소절제술을 실시한 PrdxV-OE 마우스에서 정상 마우스에 비해 골용적 (BV/TV), 해면골 두께 (Tb.Th), 해면골 개수(Tb. N)의 증가와 해면골 간격 (Tb. Sp)의 감소가 관찰되었다.

6. 결론

상기의 결과에 따를 때, PrdxV 유전자의 발현을 증가시킴으로써 골 흡수 저하 및 골 형성 증가를 유도할 수 있고, 이를 통해 골 밀도를 향상시킬 수 있다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Osteoporosis resistant mouse, and active substances screening method for preventing or treating osteoporosis using the mouse <130> 16P09018 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7096 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human genomic Peroxiredoxin 5(PrdxV) <400> 1 gggcaggctg ctgctcacgc taccgctcct ccgccagaca gcgggcaaag tgctggccca 60 tttctatggg gtgaagctgg agggcaaggt gcccatgcac aagctgttct tggagatgct 120 cgaggccatg atggactgag gcaaggggtg ggactggtgg gggttctggc aggacctgcc 180 tagcatgggg tcagccccaa gggctggggc ggagctgggg tctgggcagt gccacagcct 240 gctggcaggg ccagggcaat gccatcagcc cctgggaaca ggccccacgc cctctcctcc 300 ccctcctagg gggtgtcaga agctgggaac gtgtgtccag gctctgggca cagtgctgcc 360 ccttgcaagc cataacgtgc ccccagagtg tagggggcct tgcggaagcc atagggggct 420 gcacgggatg cgtgggaggc agaaacctat ctcagggagg gaaggggatg gaggccagag 480 tctcccagtg ggtgatgctt ttgctgctgc ttaatcctac cccctcttca aagcagagtg 540 ggacttggag agcaaaggcc 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<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCR3.1 vector primer <400> 4 ggaataaggg cgacacggaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCR3.1 vector primer <400> 5 tgagtgttgt tccagtttgg 20

Claims

PrdxV(Peroxiredoxin-5) 유전자가 과발현된, 골다공증 저항성 마우스 모델.
마우스에서 PrdxV 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 골다공증 저항성 마우스 모델 제조 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 과발현은 PrdxV 유전자가 삽입된 발현카세트를 상기 마우스의 수정란에 도입시켜 수행되는, 골다공증 저항성 마우스 모델 제조 방법.
개체의 골수세포 내 PrdxV 유전자를 과발현시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 골다공증의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법.
PrdxV 유전자가 과발현된 골다공증 저항성 마우스 모델을 포함하는 골다공증 연구용 키트.