KR20180058411A

KR20180058411A - 사방오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20180058411A
Application number: KR1020160157351A
Authority: KR
Inventors: 이사라; 이종석; 양희선
Original assignee: 대한민국(환경부 국립생물자원관장)
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2018-06-01

Abstract

본 발명은 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 사방오리 추출물로부터 분리된 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G) 화합물은 세포노화를 효과적으로 억제하여 피부 노화 방지에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

사방오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장료 조성물{Cosmetic composition for antioxidant comprising Alnus firma extract as active ingredients}

본 발명은 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 자외선이나 외부 환경적 요인에 의해 생성된 활성산소 에 의해서 세포막이 공격당하게 되어 세포가 파괴되고, 피부에 염증(inflammation)이 일어나고, 염증화된 조직이 생리학적 진행 메카니즘에 의해 단백질이나 유전자 물질 등을 파괴하여 주름 등을 형성하여 일어난다. 즉 피부노화의 주원인은 활성 산소이며, 이의 생성원인은 외적으로는 자외선, 공해, 합성세제 등이며, 내부적 요인으로는 염증, 세포 파괴, 심리적 스트레스 등이다. 피부세포가 노령화되면서 피부세포 내의 과산화물 수치는 급격히 증가하고, 활성산소에 의해 세포 및 세포막의 구성성분이 과산화물질로 되어 단백질 손상이 일어나 세포 및 세포막의 기능이 원활히 수행되지 않는다. 또한 활성산소에 의해 손상된 세포나 조직을 치유하기 위하여 외부 이물질의 침입 및 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응인 염증이 일어난다. 그러나 상기 염증의 작용은 인접해 있는 조직세포와 비세포 성분에 손상을 일으키기도 한다. 적절한 조건 하에서는 염증의 초기상태가 지난 후 정상기능을 되찾게 되지만, 염증을 자극하는 물질이 제거되지 않거나 지속적으로 생성되면 만성염증이 일어나 심각한 조직 손상을 유발하게 되며, 과다염증에 의한 단백질 분해 효소에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 결합조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라 나아가 빠른 피부 노화를 초래하게 된다. 그러므로 활성산소를 억제하는 것은 피부노화 억제에 중요한 요소이다.

이러한 피부세포 노화를 억제하는 효능이 있는 물질들에 대한 연구결과도 보고되고 있다. 비타민 C, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), NS398 및 에피프리에델라놀(epifriedelanol)과 같은 약물 또는 단일 성분들이 세포 노화를 억제하는 것으로 알려져 있다.

한국공개특허 제10-2013-0135133호 한국등록특허 제10-0459267호

본 발명자들은 부작용이 없고 새로운 피부노화 억제제를 찾던 중 사방오리 추출물 유래 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 우수한 피부노화 억제 효과를 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)를 유효성분으로 함유하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

[화학식 1]

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)를 유효성분으로 함유하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

한 구체예에서, 상기 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 사방오리(Alnus firma) 추출물로부터 분리된 것일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 사방오리 추출물은 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출되는 것일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 사방오리 추출물은 사방오리의 전초로부터 얻은 추출물인 것일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것일 수 있다.

본 발명은 사방오리 추출물로부터 분리된 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G) 화합물이 세포노화를 억제함을 확인함으로써 피부 노화 방지에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G) 화학식이다.
도 2는 UPLC-Q-Orbitrap-MS를 이용한 사방오리 추출물 내 퀘세틴 3-β-Ｄ-글루코사이드 크로마토그램 및 스펙트럼 분석 결과이다.
(a) 사방오리 고체상추출 40% 메탄올 분획물 크로마토그램(negative mode);
(b) 사방오리 고체상추출 40% 메탄올 분획물 내 퀘세틴 3-β-Ｄ-글루코사이드 분자량(463-464, negative mode) 선택 크로마토그램;
(c) 퀘세틴 3-β-Ｄ-글루코사이드 표준물질 분자량(463-464, negative mode) 선택 크로마토그램;
(d) 사방오리 40% 메탄올 분획물 내 퀘세틴 3-β-Ｄ-글루코사이드 스팩트럼;
(e) 퀘세틴 3-β-Ｄ-글루코사이드 표준물질 스펙트럼
도 3은 피부 섬유아세포에서 사방오리 추출물의 세포독성 평가 결과이다.
도 4는 과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 사방오리 추출물의 세포보호능 평가 결과이다.
도 5는 과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 사방오리 고상추출 메탄올 분획물(20, 40, 60, 80, 100%)의 세포보호능 평가 결과이다.
도 6은 피부 섬유아세포의 조기 세포노화 모델에서 사방오리 추출물의 노화억제 활성 평가 결과이다.
도 7은 피부 섬유아세포에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 세포독성 평가 결과이다.
도 8은 과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 세포보호능 평가 결과이다.
도 9는 피부 섬유아세포의 조기 세포노화 모델에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 노화억제 활성 평가 결과이다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

본 발명자들은 피부세포 보호능이 우수하고, 세포 노화를 억제하는 효과를 가지는 새로운 소재를 연구하던 중, 사방오리 추출물이 이러한 기능을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 피부노화 억제 효과가 우수하면서도, 피부에 안전한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 피부노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

한 구체예에서, 분리된 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G)는 사방오리 추출물에서 분리한 것 일 수 있다. 본 발명의 사방오리 추출물을 제조하는데 사용된 용매는 알코올 수용액으로, 상기 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액 및 부탄올 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 또한 상기 알코올 수용액은 에탄올 수용액인 것이 바람직하며, 에탄올 수용액은 50 내지 80%(v/v) 에탄올 수용액인 것이 바람직하고, 70% (v/v) 에탄올 수용액인 것이 더욱 바람직하다.

한 구체예에서, 사방오리 추출물은 상기 사방오리 알코올 조추출물, 바람직하게는 에탄올 조추출물을 고체상 추출(solid phase extraction, SPE)를 이용하여 20, 40, 60, 80, 100% 메탄올 분획물을 수득하였다. 이 중 세포생존율이 가장 우수한 고체상추출 40% 메탄올 분획물로부터 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물을 포함하는 추출물이 수득된다(도 1 및 도 5 참조). 또한, 구조 분석 결과, 본 발명에서 수득한 화학식 1로 표시되는 화합물은 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)인 것으로 확인하였다.

상기 사방오리 에탄올 조추출물 및 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 세포보호능을 가짐으로써 세포노화 억제 활성을 가진다(도 6 및 도 9 참조). 본 발명의 사방오리 추출물 및 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 과산화수소로 유도되는 산화적 손상에 대한 세포보호능을 조사함으로써, 사방오리 추출물 및 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 세포노화 억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 상기 사방오리 추출물은 기존에 세포보호능을 가진 물질로 알려진 아스코르브산(ascorbic acid)과 활성이 비슷하거나 높게 나타났으며, 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G)는 N-acetylcystein(NAC)과 활성이 비슷하거나 약간 낮게 나타나, 상기 결과로부터 사방오리 추출물 및 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 세포 노화 억제 활성이 우수함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 사방오리 추출물 또는 이로부터 분리한 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드를 유효성분으로 함유하는 항산화용, 피부 노화 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 사방오리 추출물 또는 이로부터 분리한 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 세포보호 효과가 뛰어나 피부 노화억제를 위한 화장품 시료로서 이용될 수 있다.

본 발명의 사방오리 추출물 또는 이로부터 분리한 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 피부노화 억제용 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 피부노화 억제 작용을 달성하기에 유효한 양으로 함유할 수 있으며, 각종의 비제한적인 제형, 예를 들면 크림, 로션, 화장수, 마사지 크림 또는 에센스 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 또한 그의 제형에 따라 다른 통상의 성분을 포함할 수 있으며, 이들 통상의 성분의 종류 및 함량은 당업자에게 주지되어 있다. 본 발명의 조성물은 그의 피부노화 억제 작용을 위해, 사방오리 추출물 또는 상기 화합물(화학식 1) 이외에 다른 기존의 피부노화 억제 성분들을 더 함유할 수도 있으며, 이들 기존의 피부노화 억제 성분들의 종류 및 함량은 당업자에게 주지되어 있다.

화장료 조성물의 제조시에 유상 성분의 함량은 유화 능력 보강 및 경제성 등을 고려하여 선택되며, 유상 성분으로서 주로 사용될 수 있는 오일로는 식물성 오일, 광물성 오일, 실리콘유 및 합성유 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 이외에는 유화 능력을 보강하기 위하여 계면활성제, 고급 알코올 등을 0.1 내지 5 중량% 첨가할 수 있다. 이러한 계면 활성제로는 비이온 계면활성제와 같은 통상적인 계면활성제를 사용할 수 있으며, 고급 알코올로는 탄소수가 12 내지 20인 알코올을 단독 또는 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 화장료 조성물의 제조시에 수상 성분은 점도 또는 경도를 조절하기 위하여 카보머, 산탄검, 벤토나이트 등과 같은 1종 이상의 점증제를 0.001 내지 5 중량% 더 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 필요에 따라 고급 지방산, 비타민 등의 약효 성분과 자외선 차단제, 산화 방지제, 방부제, 향료, 착색제, pH 조절제 등 통상적인 화장품에서 사용되는 성분을 더 첨가할 수 있다.

본 발명의 사방오리 추출물 또는 이로부터 분리한 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드를 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제용 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 사방오리 추출물 또는 이로부터 분리한 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 1 내지 15 중량%, 바람직하게는 2 내지 10 중량%의 양으로 첨가된다.

이하 실시예를 통하여 본 발명에 따른 화합물의 제조방법을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 사방오리 추출물( EEAF )의 제조

사방오리 추출물(Ethanol Extract of Alnus firma; EEAF)은 100 g의 시료(전초)를 70%(v/v) 에탄올 수용액 1L에 침지시킨 후 실온(25℃)에서 24시간 동안 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액은 모두 합하였다. 추출물은 필터 페이퍼(Whatman, No.3, Maidstone, Kent, UK)로 여과한 후, 회전진공농축기(EYELA, N-3000, Tokyo, Japan)를 사용하여 감압농축한 후, 동결건조(Ilshinbiobase Co., Ltd, Yangju, Korea) 하였다.

< 실시예 2> 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D-glucoside;Q3G)의 고체상추출(SPE) 분획 및 분리

상기 실시예 1에서 수득한 사방오리 전초 동결건조 추출물 1g은 70% 에탄올 700 ?L와 함께 용해하였다. 20% 메탄올 50 mL으로 미리 세척하여 준비한 C18 Sep-Pak 카트리지(Waters, USA)에 샘플을 로딩한 다음, 50 mL의 20, 40, 60, 80, 100% 메탄올을 순차적으로 추출물 샘플에 적용하였다. 상기의 과정에서 수득한 각 추출물은 감압농축기를 이용하여 농축하였고, 실험에 사용하기 전 -70℃ 이하에서 보관하였다.

사방오리 고체상추출 40% 메탄올 분획물은 diode array detector L-2455와 pump L-2130 (Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용한 prep-HPLC에 의해 정제되었다. 분리는 YMC-Pack pro C18 컬럼 (길이 250 mm × 직경 4.6 mm, 입자크기 5 μm)으로 수행되었다. 이동상 A는 5% 아세토나이트릴, B는 100% 아세토나이트릴으로 하였고, 농도구배는 0-2분간 100% A, 2-62분간 0-40% B, 62-67분간 40-100% B, 67-72분간 0-100% A 으로 하였다. prep-HPLC를 수행하기 전에, HPLC 프로파일링을 위해 사방오리 고체상추출 40% 메탄올 분획물 1mg을 주입하였다. 이때 유량은 1 mL/min이고, photodiode array는 220-600nm에서 수행하였다. 뒤이어 고체상추출 40% 메탄올 분획물 40 mg 은 분획을 위해 prep-HPLC 에 주입되었다. 이때 유량은 1 mL/min으로 하였고, 피크는 220nm에서 관찰하였다. 분당 분획을 수행한 다음, 분획은 감압농축기에 의해 건조되었고, 실험 전 -70℃ 이하에서 보관하였다.

< 실시예 3> 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D-glucoside;Q3G)의 분석

상기 실시예 1의 동결 건조된 사방오리 추출물 및 실시예 2의 사방오리 고체상추출 40% 메탄올 분획물에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)가 분석되었다. 분석한 기기는 UHPLC-Q-Orbitrap-MS로 Dionex Ultimate 3000 UHPLC system (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)과 Q-Exactive Orbitrap MS(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) system 으로 구성되었다. UHPLC system은 Ultimate 3000 RS autosampler, Ultimate 3000 RS pump, Ultimate 3000 RS Column Compartment 그리고 Dionex Chromelon software (Version 6.8, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 갖추었다.

Hypersil Gold C18 selectivity LC column (길이 50 mm x 직경 2.1 mm, 입자크기 1.9 μm; Thermo Fisher scientific)은 0.1% 포름산을 포함하는 아세토나이트릴(acetonitrile, (이동상 B))과 0.1% 포름산을 포함하는 물(이동상 A)을 0.3 mL/분의 유속으로 사용하였다. Gradient program은 다음과 같이 작동된다: 0-20분 간 0-100% B, 다음 0.5분간 0-100% A 그리고 컬럼은 다음 인젝션 이전에 2.5분간 100% A에서 재평형된다. 각 주입에 대한 총 작동 시간은 23분이다. 인젝션 볼륨은 10 μL이다. 컬럼 오븐 온도와 자동견본기(autosampler)의 온도는 대표적으로 25℃와 4℃로 세팅하였다. Q-Exactive Orbitrap MS는 heated electrospray ionization source (HESI)를 갖추었고, 음이온 모드에서 작동된다. MS는 전체 스캔 모드에서 작동된다. 스프레이 전압(-), 모세관 온도, 프로브 히터 온도 그리고 S-lens RF 레벨은 대표적으로 3.3 kV, 320℃, 300℃, 60으로 세팅했다. 차단가스와 보조 가스 유량은 대표적으로 30 과 10 L/min으로 세팅하였다. 정상섬유세포에서의 충돌유도해리(collision-induced dissociation)와 C-trap의 감쇠 가스(damping gas)를 위해 질소는 분무안정화를 위해 사용되었다. 다음의 파라미터는 full MS scan mode에서 사용된다.: 해상도 35,000 FWHM, 스캔 범위 100-1000 m/z, 자동이득조절장치(AGC) 타겟은 1e⁶에서 최대 인젝션 타임(injection time (IT)) 100ms와 함께 세팅되었다. AIF scan mode를 위해, 질량분석은 17,500 FWHM, AGC target 3e⁶ 에서 최대 인젝션 타임(injection time (IT)) 100ms, 마이크로스캔 1로 스캔 범위 80에서 1000m/z 와 함께 세팅되었다. 4중극자 유래의 모든 이온은 정상화된 30V 충돌에너지(CE, collision energy)에서 분해(파괴)된 HCD collision cell로 보내진다. 기구는 음성 및 양성 모드에서 제조업자의 교정 솔루션을 이용하여 일주일에 한번씩 교정된다. 표준 퀘세틴-3-O-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G)의 정량값은 외부 곡선(external curves)을 이용하여 도출하였고, 농도 범위는 0.49-7.81 μg/mL이였다. 데이터 분석은 Xcalibur 3.0 Software를 이용하여 가공하였고, full scan information은 식별과 정량을 위해 사용되었으며, 그리고 MS/MS scan은 확인(confirmation)을 위해 사용되었다.

사방오리 추출물에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin 3-β-D-glucoside; Q3G)는 UHPLC-Q-Orbitrap-MS를 이용하여 아래 표와 같이 동정 및 정량 하였고, 퀘세틴 3-β-Ｄ-글루코사이드의 분자량은 MW. 464으로 확인하였다(표 1 및 도 2 참조).

UHPLC-Q-Orbitrap-MS를 이용한 사방오리 추출물 유래 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드 동정 및 정량

Compounds	Identification					Quantity
Compounds	RT^a(min)	m/z Nega^b	Formula	Δppm	MS²FragmentPattern^c	μg/g dried sample^d	Regression curve	R²
Quercetin-3-O-glucoside	5.9	463.09	C₂₁H₁₉O₁₂	2.37	463 > 301	1.14	y = 2E+08x - 2E+08	0.9886
^aRetention time. ^bIondetectedinnegativemode.^cMS²fragmentpatternsdetectedinnegativemode.^dCompoundamountsindriedsample(μg/g).

< 실시예 4> 사람 섬유아세포에서 사방오리 추출물 및 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)의 세포노화 억제 효능 조사

4-1. 실험재료

세포는 사람 섬유아세포(Human dermal fibroblast cells;HDFs)를 사용하였고, 상기 세포는 미국의 유전자은행(American Type Culture Collection/Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다. 사람 섬유아세포는 열로 비활성화 시킨 10% FBS, 2 mM 글루타메이트, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 50% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 약 80% 정도 세포가 자라면, 0.25% 트립신-EDTA 용액을 처리하여 세포를 분리한 후, DMEM에서 48시간 동안 추가적으로 계대배양 하였다. 본 연구에서 세포는 10 에서 15까지 미리 계대배양한 것을 이용하였다.

4-2. 세포 생존율 분석

세포 생존율은 XTT(2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt) assay(WelGene, Seoul, Korea) 방법으로 분석하였다. 세포가 정체기(log phase)까지 배양되었을 때, 24시간 동안 96-웰 플레이트(1×10⁴ cells/well)에 분주하였다. 세포는 정해진 농도에 따라 대조군과 처리군으로 나누어 실험하였다. 24시간 후의 생존세포의 수는 XTT 분석에 의해 결정되었다.

사방오리 추출물(EEAF)의 과산화수소로 유도된 세포사멸 세포에 대한 보호효과를 조사하기 위해, 사람 섬유아세포(5×10⁴ cells/well)를 12-웰 플레이트에 넣고 48시간 동안 배양한 뒤, 상기 세포에 사방오리 추출물 0, 25, 50, 100 μg/mL, 아스코르브산(ascorbic acid) 50 μM을 4시간 처리하였고, 뒤이어 1 mM의 과산화수소를 각 웰에 첨가하였다. 배양 3시간 후, 생존세포의 수는 XTT 분석을 통해 결정되었다.

과산화수소로 유발된 세포사멸에 대한 고체상 추출물(solid phase extraction (SPE) extracts)의 효과를 결정하기 위해, 사람 섬유아세포는 12-웰 플레이트에 분주되었다. 배양 48시간 후, 세포는 4시간 동안 고상추출 메탄올 분획물(20, 40, 60, 80, 100%)을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 나누어 만들었고 뒤이어, 1 mM의 과산화수소를 각 웰에 첨가하였다. 3시간 배양 후, 생존세포의 수는 XTT 분석으로 결정하였다.

세포 생존율 = (처리군/대조군)X100%

4-3. 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D- glucoside )의 세포 생존율 분석

과산화수소로 유도된 세포사멸에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 세포보호능을 분석하기 위해, 세포생존율은 MTT 분석을 이용하여 결정하였다. 사람 섬유아세포(5×10⁴ cells/well)는 12-웰 플레이트에 분주되었고 48 시간 동안 배양되었다. 상기 배양된 세포는 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드를 4시간동안 처리한 군과 무처리한 군으로 나누었고, 뒤이어 1 mM 과산화수소를 각 웰에 첨가하였다. 3시간 배양 후, 0.5 mg/mL MTT 시약을 첨가하였고, 뒤이어 3시간 동안 추가 배양하였다. 각 웰의 포르마잔 크리스털(Formazan crystals)은 isopropyl alcohol 에서 용해되었고, 흡광도는 마이크로플레이트리더를 이용하여 570nm에서 결정되었다.

4-4. 노화 베타-갈락토시다제(SA-β-Gal) 활성 분석

과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포의 노화 정도를 분석하기 위해, 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase;SA-β-gal) 염색법을 이용하였다. 사람 섬유아세포는 500 μM 과산화수소를 2시간 동안 처리하여 조기 노화를 유발시켰다. 사람 섬유아세포는 0.25% 트립신-EDTA로 수득하였으며, 상기 수득한 세포를 PBS로 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드로 15분간 상온에서 고정시킨 후 PBS로 세척한 다음, 신선한 SA-β-gal staining solution (1 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM magnesium chloride, pH 6.0)으로 상온에서 밤새(overnight) 배양하였다. 배양의 마지막에, 상기 세포는 PBS로 세척하였다. 노화세포는 100배율의 표준 현미경에서 파란색(blue-stained)으로 염색되어 구별하였다. 파란색으로 염색된 SA-β-gal-양성 세포는 노화세포의 비율을 결정하는 슬라이드의 5개 랜덤 필드에서 측정하였다.

< 실험예 1> 사람 섬유아세포에서 사방오리 추출물의 세포노화 억제 효능 조사

1-1. 사방오리 추출물의 세포독성 평가

사방오리 추출물(EEAF)의 세포독성을 결정하기 위해, 세포 생존율은 XTT 분석을 이용하여 측정하였다. 사람 섬유아세포는 96-웰 플레이트에 분주되었고 24시간동안 배양하였으며, 0, 25, 50 and 100 μg/mL의 농도로 사방오리 추출물을 24시간 처리하였다. 사방오리 추출물은 100 μg/mL의 농도까지 어떠한 세포독성을 야기하지 않았다(도 3 참조).

1-2. 사방오리 추출물의 세포보호능 평가

과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 사방오리 전초 추출물(EEAF) 및 고상추출 메탄올 분획물(20, 40, 60, 80, 100%)의 세포보호능을 조사하기 위해, 사람 섬유아세포에 25, 50, 100 μg/mL의 다양한 사방오리 추출물 및 고상추출 메탄올 분획물을 4시간 동안 미리 처리한 군, 50 μM 아스코르브산을 4시간 처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 무처리군을 만든 다음, 여기에 1 mM 과산화수소를 3시간 동안 각각 처리하여 실험하였다. 1 mM 과산화수소만 처리된 군(아무것도 처리하지 않은 무처리군은 대조군(control)과 비교하여 사람 섬유아세포의 세포생존율이 60%로 감소되었다. 양성 대조군(positive control)으로서 사용된 50 μM 아스코르브산을 미리 처리한 군에서는, 과산화수소만 처리된 군과 비교하여 사람 섬유아세포의 세포생존율을 회복시키는 것으로 확인하였다. 사방오리 추출물(25, 50 및 100 μg/mL)을 미리 처리한 군에서는 과산화수소에 의해 유도된 세포사멸을 예방하는 것으로 확인하였다(도 4 참조).

또한, 고상추출 메탄올 분획물(20, 40, 60, 80, 100%)을 미리 처리한 군에서는 100%를 제외한 분획물에서 과산화수소에 의해 유도된 세포사멸을 예방하는 것으로 확인 되었으며, 특히, 40% 분획물에서 높은 세포보호능을 보였다(도 5 참조).

상기의 결과를 통해, 본원 발명의 사방오리 전초 추출물은 세포 보호능이 우수한 아스코르브산만큼 세포보호능이 우수하였으며, 특히, 40% 고상추출 메탄올 분획물에서 높은 세포보호능을 보였다.

1-3. 사방오리 추출물의 노화억제 활성 평가

과산화수소로 유도된 사람 섬유아세포의 조기 노화에 대한 사방오리 추출물의 노화 억제 분석은 SA-β-gal 활성을 통해 측정하였다. SA-β-gal positive staining는 복제와 계대배양에 따라 증가되므로, SA-β-gal은 노화 세포 표지자(cellular marker)로서 제공될 수 있다. 따라서 사람 섬유아세포에서의 과산화수소 처리로 인한 SA-β-gal 양성 노화 세포 축적을 본 연구에 이용하였다.

과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 사방오리 추출물(EEAF)의 세포보호능을 조사하기 위해, 사람 섬유아세포에 25, 50, 100 μg/mL의 다양한 농도의 사방오리 추출물을 4시간 동안 전처리한 군, 50 μM 아스코르브산을 4시간 전처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 무처리군을 만든 다음, 각 처리군에 1 mM 과산화수소를 3시간 동안 각각 처리하여 실험하였다.

그 결과, 과산화수소수만 처리된 군(아무것도 처리하지 않은 무처리군)과 비교하여 사방오리 추출물 50, 100 μg/mL의 처리군에서는 SA-β-gal 양성 노화 세포를 억제하는 것으로 확인하였다. 따라서 사방오리 추출물은 과산화수소로 유도된 사람 섬유아세포 조기 노화를 억제하는 효능이 있는 것으로 확인하였다(도 6 참조).

종합적으로, 상기 실험예 1의 결과를 통해 사방오리 추출물이 사람 섬유아세포에서의 산화적 스트레스 유도 세포 손상과 조기 노화를 억제하는 보호효과가 있음을 확인하였다.

< 실험예 2> 사람 섬유아세포에서 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D-glucoside;Q3G)의 세포노화 억제 효능 조사

2-1. 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D- glucoside;Q3G )의 세포독성 평가

퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(Q3G) 추출물의 세포생존율은 세포독성평가를 통해 확인하였고, 이는 MTT 분석을 이용하였다. 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 50 μg/mL 농도까지 어떠한 세포독성을 보이지 않았다(도 7 참조).

2-2. 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D- glucoside;Q3G )의 세포보호능 평가

과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드의 세포보호능을 조사하기 위해, 사람 섬유아세포에 1, 5, 10 μg/mL의 다양한 농도의 사방오리 추출물을 4시간 동안 전처리한 군, 5 mM N-acetylcystein(NAC)을 4시간 전처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 무처리군을 만든 다음, 여기에 1 mM 과산화수소를 3시간 동안 각각 처리하여 실험하였다.

1 mM 과산화수소만 처리된 군 (아무것도 처리하지 않은 무처리군)은 대조군(control)과 비교하여 사람 섬유아세포의 세포생존율이 60% 감소되었다. 양성 대조군(positive control)으로서 사용된 5 mM N-acetylcystein(NAC)을 미리 처리한 군에서는, 과산화수소만 처리된 군과 비교하여 사람 섬유아세포의 세포 생존율을 회복시키는 것으로 확인하였다. 이와 유사하게 1, 5, 10 μg/mL 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드를 전처리한 군은 과산화수소에 의해 유도된 세포사멸을 예방(보호)하는 것으로 확인하였다(도 8 참조).

2-3. 퀘세틴 -3-O-β-D-글루코사이드( quercetin -3-O-β-D- glucoside;Q3G )의 노화억제 활성 평가

과산화수소로 유도된 사람 섬유아세포의 조기 노화에 대한 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)의 노화 억제 분석은 SA-β-gal 활성을 통해 측정하였다. 과산화수소를 처리한 사람 섬유아세포에서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)의 세포보호능을 조사하기 위해, 사람 섬유아세포에 1, 5, 10 μg/mL의 다양한 농도의 사방오리 추출물을 4시간 동안 전처리한 군, 5 mM N-acetylcystein(NAC)을 4시간 처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 무처리군을 만든 다음, 여기에 1 mM 과산화수소를 3시간 동안 각각 처리하여 실험하였다.

그 결과, 과산화수소만 처리된 군과 비교하여 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드 1, 5, 10 μg/mL의 처리는 SA-β-gal 양성 노화 세포를 억제하는 것으로 확인하였다. 따라서 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 과산화수소로 유도된 사람 섬유아세포 조노화를 억제하는 효능이 있는 것으로 확인하였다(도 9 참조).

종합적으로, 상기 실험예 2의 결과를 통해 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 사람 섬유아세포에서의 산화적 스트레스 유도 세포 손상과 조기 노화를 억제하는 보호효과가 있음을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드(quercetin-3-O-β-D-glucoside;Q3G)를 유효성분으로 함유하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물
[화학식 1]

.
제 1 항에 있어서,
상기 퀘세틴-3-O-β-D-글루코사이드는 사방오리(Alnus firma) 추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 사방오리 추출물은 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 사방오리 추출물은 사방오리의 전초로부터 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것을 특징으로 하는 피부 세포노화 억제용 화장료 조성물.