KR20180039398A - 다공성 격벽 및 자석을 이용한 표적물질 검출용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적물질의 존재 여부를 간편하게 확인할 수 있는 2 이상의 입자 및 표적물질 검출부를 포함하는 표적물질 검출용 키트에 관한 것으로, 상기 키트를 이용하면 표적물질에 대하여 서로 다른 결합 분자를 사용하여 입자 간의 비대칭 복합체를 형성시킬 수 있으며, 이를 간편하게 확인 및 분석하여 복수의 표적물질을 효율적으로 검출할 수 있다.

Description

다공성 격벽 및 자석을 이용한 표적물질 검출용 키트{A kit for detecting the target materials using porous wall and magnets}

본 발명은 다공성 격벽 및 자석을 이용하는 표적물질 검출부와 2 이상의 입자를 포함하는 표적물질 검출용 키트에 관한 것이다.

시료 내 표적물질을 검출하거나 분리하는 기술은 질병 진단, 식품 검사, 환경 모니터링 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 전통적인 검출 방법에는 면역분석법이 있으며, 그 검출 원리 및 방법에 따라 방사면역분석법, 효소면역측정법, 형광항체법, 화학발광면역측정법 등이 있다. 최근에는 금과 실리카 등 다양한 종류의 나노 입자들을 항체나 효소 표면에 결합시켜 검출 감도를 높이려는 시도가 있었다.

생체 시료에서 특정의 표적물질을 검출 또는 분리하는 방법으로서, 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지 또는 자성 입자를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이들 중에서 자성 입자를 이용하는 방법에 따르면, 표면에 표적 생체물질과 결합할 수 있는 프로브를 갖는 자성 입자를 시료 용액에 투입하여 표적 생체물질을 포획하고, 다시 자성 입자와 표적 생체물질을 분리함으로써 표적 생체물질을 분리 추출한다. 이렇게 자성 입자를 이용하여 표적 생체물질을 검출 또는 분리하는 방법(bead based separation)은 세포, 단백질, 핵산 등의 생체물질을 검출 또는 분리하는데 널리 이용되고 있다(비특허문헌 1). 또한 자성 나노입자의 조성을 변화시켜 자기 민감도(susceptibility)나 자화도(magnetization) 차이를 이용하여 여러 생체물질을 분리할 수 있는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1).

1. 대한민국 공개특허 제10-2016-0024804호

1. BioChip J., Vol.8, 1 (2014), 1~7

본 발명의 일 양상은

자기장을 생성시키는 자기장 발생부;

상기 자기장 발생부의 하부와 연결되며, 내부공간을 구비하는 시료수용부;

상기 시료수용부의 내부공간을 상하로 격리하는 다공성 격벽; 및

상기 다공성 격벽으로 격리된 내부공간 사이의 전압 변화를 감지하는 전압 측정부를 포함하는 표적물질 검출부; 및

표적물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 2 이상의 입자를 포함하는 것으로, 상기 2 이상의 입자 중 어느 하나는 자성 입자인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은

자기장을 생성시키는 자기장 발생부;

상기 자기장 발생부의 하부와 연결되며, 내부공간을 구비하는 시료수용부;

상기 시료수용부의 내부공간을 상하로 격리하는 다공성 격벽; 및

상기 다공성 격벽으로 격리된 내부공간 사이의 전압 변화를 감지하는 전압 측정부를 포함하는 표적물질 검출부; 및

표적물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 2 이상의 입자를 포함하는 것으로, 상기 2 이상의 입자 중 어느 하나는 자성 입자인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트에 포함되는 자기장 발생부는 자석, 솔레노이드 및 초전도자석으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며 자석인 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "자기장(magnetic field)"이란 자석이나 전류, 변화하는 전기장 등의 주위에 자기력이 작용하는 범위를 말하며, "자기장 발생부"란 자석, 전자석 등을 이용하여 일시적 또는 영구적으로 자기장을 생성시키는 구성을 의미한다. 외부 자기장 없이도 자체적인 자기장을 유지하여 자성을 유지하는 물질을 자석(강자성체)이라고 하며, 전자석(electro-magnet)은 전류가 흐르면 자화되는 자석으로 솔레노이드(solenoid), 초전도자석 등이 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 검출용 키트에서 표적물질 검출부는 자기장의 세기(tesla, 테슬라)를 조절할 수 있는 자기장 조절부를 추가로 포함할 수 있다. 자기장의 세기를 조절함으로써 자성 입자-폴리스티렌 입자 이합체의 포집 정도를 조절할 수 있으며, 전자석은 전류의 세기를 조절하여 자기장의 세기를 조절할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 검출용 키트는 키트의 입자와 검출 대상이 되는 시료가 접촉하는 공간을 제공하는 시료수용부를 포함하고 있으며, 상기 시료수용부에는 미세공(micropore)이 형성된 다공성 격벽(porous wall)이 있어 내부 공간을 상하로 구분하고 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 미세공은 0.5 내지 10 ㎛ 크기인 것이 바람직하고, 0.5 내지 5 ㎛ 크기인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 미세공은 시료수용부의 내부공간에서 입자들이 이동하는 통로 역할을 하며, 미세공의 크기에 따라 단일의 입자 또는 입자-입자 이합체를 통과시킬 수 있다.

상기 다공성 격벽은 실리콘나이트라이드(silicon nitride, SiNx), 니트로셀룰로오스(nitrocellulose), 셀룰로스, PVDF(poly vinyldienfluoride), PES(polyethersufone), 유리섬유 및 나일론으로 이루어진 군에서 선택되는 소재로 이루어진 것일 수 있으며, 실리콘나이트라이드로 이루어진 것이 바람직하다.

상기 표적물질 검출부에서 시료수용부는 자기장 발생부의 하부와 연결되어 있지만 분리가 가능하며, 시료수용부에서 다공성 격벽은 탈착이 가능하기 때문에 시료수용부의 내부 공간에 검출 대상이 되는 시료 및 전해질 용액을 주입할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 검출용 키트에서 입자는 금 입자, 은 입자와 같은 금속 입자, 실리카 입자 및 고분자 입자 등 입자의 재질에 상관없이 이용될 수 있으나, 폴리스티렌 입자인 것이 바람직하다. 또한, 상기 키트에서 입자의 종류는 2 이상일 수 있으며, 2 종류인 것이 가장 바람직하다. 입자가 2 종류인 경우 입자의 재질이 서로 상이한 것이 바람직하며, 두 입자 중 어느 하나는 자성 입자인 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 검출용 키트는 자기장을 이용하여 상기 자성 입자와 다른 입자를 분리하며, 자기장 발생부에서 자기장이 생성되는 경우 자성 입자는 다공성 격벽의 미세공을 통과하여 시료수용부의 하부에서 상부로 이동할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 입자는 서로 다른 크기를 갖는 것이 바람직하며, 어느 한 입자의 크기가 나노미터 규모인 경우 다른 입자는 그 이상 크기의 나노미터, 또는 마이크로미터 크기일 수 있다. 또한, 상기 입자 중 크기가 작은 입자가 자성 입자인 것이 바람직하며, 그 크기는 100 ㎚ 내지 3 ㎛의 범위인 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "결합 분자(binding molecules)"란 상기 입자의 표면에 화학 결합을 통해 연결되어 있으며, 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있어 상기 입자와 표적물질의 특이적인 결합을 매개하는 분자를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 결합 분자는 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자이면 어떠한 것이든 가능하며, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 결합 분자는 예를 들어, 효소, 항체, 리간드, 앱타머 또는 마이크로 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 분자는 항체 또는 앱타머일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것뿐만 아니라 효소, 앱타머, 리간드 등의 분자가 표적에 높은 친화성과 특이성을 가지면서 결합하는 것을 의미한다.

본 발명의 키트는 크기가 상이한 2종 이상의 입자 및 인식 부위가 서로 상이한 결합 분자를 이용한 것으로, 결합 분자가 표적물질의 서로 다른 부위를 인식하기 때문에 높은 정확도로 표적물질을 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 키트를 이용한 표적물질의 검출원리를 개략적으로 나타낸 것이다. 결합분자가 연결되어 있는 2종의 입자와 검출하고자 하는 시료를 접촉시키면, 표적물질이 존재하는 경우 자성 입자-표적물질-폴리스티렌 입자 복합체가 형성된다. 이후 상기 복합체를 검출하기 위하여 자기장을 발생시키면 자성 입자가 다공성 격벽을 통과하여 시료수용부의 상부로 이동하게 되며, 자성 입자의 이동에 따라 자성 입자-표적물질-폴리스티렌 입자 복합체 또한 상부 방향으로 움직이게 된다. 그러나, 자성 입자-표적물질-폴리스티렌 입자 복합체는 크기가 크기 때문에 다공성 격벽에 존재하는 미세공을 통과할 수 없으며, 이 경우 전류의 흐름이 방해를 받게 된다. 따라서, 다공성 격벽에 의하여 격리되는 시료수용부의 상하 내부공간에서 발생하는 임피던스(impedance) 차이를 측정하여 자성 입자-표적물질-폴리스티렌 입자 복합체의 존재 유무, 즉 표적물질의 존재 여부를 확인할 수 있게 된다.

도 2는 본 발명의 키트에서 표적물질 검출부(100)의 구성을 구체적으로 나타낸 것이다.

상기 표적물질 검출부(100)에서 자기장 발생부(110)는 자성 입자가 이동할 수 있도록 자기장을 생성시키고, 시료수용부(120)는 상기 자기장 발생부의 하부와 연결되어 자기장의 영향을 받으며, 검출하고자 하는 시료와 키트에 포함된 입자가 접촉하는 내부공간을 제공한다. 또한, 상기 시료수용부에 포함된 다공성 격벽(130)은 시료수용부의 내부공간을 상하로 구분한다. 전압 측정부(140)는 다공성 격벽에 의하여 격리된 내부공간에서 임피던스 변화를 감지하고, 이를 수행하기 위하여 시료수용부의 내부공간에 담지되어 있는 전극(150)을 포함한다.

표적물질 검출부의 작동 방식은 하기와 같다.

표적물질 검출용 키트에 포함된 2종 이상의 입자는 표적물질의 서로 다른 부위를 인식하는 연결분자를 포함하고 있어, 시료 내에 표적물질이 존재하는 경우 입자-표적물질-입자 복합체를 형성하게 된다. 자기장 발생부의 하부와 연결되어 있는 시료수용부(120)에서 검사하고자 하는 시료와 키트에 포함된 2종 이상의 입자를 접촉시키고, 자기장 발생부(110)에서 자기장을 생성시킨다. 자기장이 발생하면 자성 입자 또는 자성 입자와 결합하고 있는 입자 이합체는 자기장 발생부가 있는 시료수용부의 상부 쪽으로 이동하게 되며, 이 과정에서 시료수용부의 내부공간을 상하로 격리하는 다공성 격벽(130)을 만나게 된다. 다공성 격벽(130)에는 특정 크기의 미세공이 형성되어 있어 일정 크기 이하의 입자 또는 이합체만 통과시키는 역할을 하는데, 표적물질-입자 복합체에 의하여 미세공이 폐쇄되는 경우 전류의 흐름이 방해를 받아 시료수용부의 상하부 내부공간에서 임피던스의 차이가 발생하게 된다. 전압 측정부(140)는 시료수용부의 내부공간에 담지되어 있는 전극(150)을 이용하여 상기 임피던스 차이를 감지하고, 이를 통하여 미세공의 폐쇄 여부, 즉 표적물질의 존재 여부를 확인한다.

본 발명의 키트를 이용하면, 표적물질의 서로 다른 부위를 인식하는 결합 분자 및 2종 이상의 입자를 사용하여 입자 간의 비대칭 복합체를 형성시킬 수 있으며, 자기장을 이용하여 상기 복합체를 다른 입자와 분리하여 확인 및 분석함으로써 표적물질을 효율적으로 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 키트를 이용하여 표적물질을 검출하는 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 표적물질 검출용 키트에서 표적물질 검출부의 구성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 키트를 이용하여 시간 경과에 따른 임피던스 및 전류 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 도이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인플루엔자 A 핵단백질과 입자의 결합 유도

인플루엔자 A 핵단백질(Influenza A nucleoprotein, 이하 '핵단백질'로 표기함)과 입자가 결합하여 복합체를 형성하도록 유도하기 위하여 하기와 같이 실험하였으며, 핵단백질과 입자가 결합하는 경우 크기가 비대칭인 입자 이합체가 형성된다.

구체적으로, 0.5 ㎛ 크기의 자성 입자(magnetic beads) 100 fM 및 2.8 ㎛ 크기의 폴리스티렌 입자(polystyrene beads) 10 fM을 준비한 후 EDC-NHS{(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)-(N-hydroxysuccinimide)}를 처리하여 활성화시켰다. 이후 상기 활성화시킨 각각의 입자와 인식 부위가 서로 상이한 핵단백질 항체를 혼합하여 입자와 항체의 결합을 유도하였다. 다음으로 결합 완충용액(1X PBS 및 0.01% tween20)에 용해되어 있는 핵단백질(10 pM; 실험군) 또는 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 'BSA'로 표기함; 대조군) 각각을 상기 항체-입자 복합체와 충분한 시간 동안 접촉시켜 단백질-항체-입자 복합체의 형성을 유도하였다.

실시예 2: 단백질-항체-입자 복합체의 형성 여부 확인

상기 실시예 1에서 실험한 단백질-항체-입자 복합체의 형성 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로 시료용기의 하부에 상기 실시예 1에서 실험한 단백질-항체-입자 복합체를 주입하고, 전류가 흐를 수 있도록 시료용기의 내부공간을 전해질 용액으로 충전하였다. 이후 상부에 위치한 자석을 작동시키고, 격벽으로 구분된 시료용기의 상부 및 하부에서 충분한 시간 동안 전류 및 임피던스(impedance)를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 것과 같이 시간이 경과할수록 임피던스가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 입자에 의해 격벽의 미세공이 막히면서 임피던스가 증가한 것을 의미한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

100: 표적물질 검출부;
110: 자기장 발생부;
120: 시료수용부;
130: 다공성 격벽;
140: 임피던스 측정부;
150: 전극

Claims (8)

1. 자기장을 생성시키는 자기장 발생부;
   상기 자기장 발생부의 하부와 연결되며, 내부공간을 구비하는 시료수용부;
   상기 시료수용부의 내부공간을 상하로 격리하는 다공성 격벽; 및
   상기 다공성 격벽으로 격리된 내부공간 사이의 임피던스 변화를 감지하는 임피던스 측정부를 포함하는 표적물질 검출부; 및
   표적물질의 서로 다른 인식 부위에 특이적으로 결합하는 결합 분자가 연결된 2 이상의 입자를 포함하는 것으로, 상기 2 이상의 입자 중 어느 하나는 자성 입자인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 자기장 발생부는 자석, 솔레노이드 및 초전도자석으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 표적물질 검출부는 자기장의 세기를 조절할 수 있는 자기장 조절부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 다공성 격벽은 0.5 내지 10 ㎛ 크기의 미세공이 형성된 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 다공성 격벽은 실리콘나이트라이드(silicon nitride), 니트로셀룰로오스, 셀룰로스, PVDF(poly ethylene terephthalate), PES(polyethersufone), 유리섬유 및 나일론으로 이루어진 군에서 선택되는 소재로 이루어진 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 입자는 금속 입자, 실리카 입자 및 고분자 입자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 자성입자는 100 ㎚ 내지 3 ㎛ 크기인 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 결합 분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 지질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 키트.

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