KR20180036166A

KR20180036166A - 피부 각질 개선 효과가 있는 아텔로콜라겐을 추출하는 방법

Info

Publication number: KR20180036166A
Application number: KR1020160126416A
Authority: KR
Inventors: 이태호; 민정환; 김난영; 문영섭; 문창훈; 안용석; 고창익
Original assignee: (주)컬러핑크알앤디; (주)청룡수산
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-04-09
Also published as: KR101868805B1

Abstract

본 발명은 아텔로콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로 좀 더 자세하게는, 넙치의 어피를 초음파로 처리하여 아텔로콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 아텔로콜라겐 추출 방법은 기존의 초음파를 이용한 콜라겐 추출 방법보다 간편하면서도 단순화한 공정으로 아텔로콜라겐을 효율적으로 추출할 수 있으며, 특히 콜라겐의 기본 구조는 유지하면서 텔로펩타이드 부분을 제거한 아텔로콜라겐을 높은 농도로 추출할 수 있다.

Description

피부 각질 개선 효과가 있는 아텔로콜라겐을 추출하는 방법 {A method for extracting ahtelcollagen in the skin horny improvement}

본 발명은 초음파를 이용하여 높은 효율성을 가지는 아텔로콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.

콜라겐은 모든 동물에 가장 풍부하게 존재하는 구조 단백질이며, 전체 단백질의 약 30%를 차지한다. 이 중 약 40%는 피부의 표피세포 구성에 중요한 역할을 하고 있으며, 약 20%는 뼈의 연골, 나머지는 혈관, 내장, 치아 등 신체에 광범위하게 분포한다. 콜라겐을 구성하고 있는 polypeptide chain은 분자량 약 950 KDa의 polypeptide chain 3개가 우측으로 꼬여있는 나선 구조를 갖고 있으며, glycine-X-Y 형태로 존재하는 특징이 있으며, 여기서 X는 proline Y는 proline 또는 hydroxyproline으로 하는 기본 구조를 가장 큰 특징으로 한다. 이와 같은 콜라겐은 피부노화에 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 자외선 노출이 심하거나 연령이 높아짐에 따라서 콜라겐 조직의 손실이 크게 되고, 이로 인한 피부 주름의 형성, 피부 탄력 등을 잃어버리게 된다. 따라서 피부노화 방지를 위한 연구의 일환으로서 콜라겐에 대한 연구는 현재까지도 많은 연구자들에 의해 수행되어 있으며, 특히 콜라겐의 기능성에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며 산업적으로도 피부노화 방지를 위한 화장품, 건강보조식품 등의 소재로 많이 활용하고 있다.

일반적으로 표피에 존재하는 콜라겐은 1형으로서 콜라겐 전체에서 차지하는 비중이 가장 크며, 상업적으로 이용되고 있는 대부분의 콜라겐도 1형이며, 우피나 돈피 유래 제품이 대다수이다. GME (Gelatin Manufacturers of Europe, www.gelatin.org)의 보고에 따르면 2005년도 전세계 콜라겐 및 젤라틴의 생산량은 306,800톤이며, 그 중 72.1 %가 돈피와 우피로부터 생산되고, 뼈 등의 부산물로부터 26.6 %, 기타 천연물을 이용한 생산량은 1.3 %인 것으로 알려져 있다. 이 중에서도 식용으로 사용하는 콜라겐 및 젤라틴은 생산량의 80 %가 돈피로부터 제조되고 있으며, 10 %만이 우피를 이용하고 있지만 최근 광우병 등의 발생으로 인하여 우피의 사용량은 점차 감소하고 있어서 상대적으로 돈피와 기타 원료의 사용량이 증가하고 있다. 그러나 돈피 또한 구제역 발생지역에 따른 지역적 제한 등으로 인해 돼지 부산물을 이용한 콜라겐 및 젤라틴의 생산은 위생안전성 측면에서 문제로 대두되고 있어 기존 우피나 돈피 등의 육상동물 부산물의 대체 원료에 대한 탐색이 현재까지도 계속 연구되고 있는 실정이다.

이에 따른 대안으로 최근에 부각되는 연구 분야는 어류의 어피에서 콜라겐을 추출하는 것이지만, 기존 어피에서 고분자의 콜라겐 생산은 고농도의 산을 사용하여 추출한 후 정제하는 과정을 필요로 하며, 추출 시간이 약 3일 이상이 소요되고 그 과정이 매우 복잡하며 콜라겐의 추출수율도 약 20 % 정도로 매우 낮은 것이 현실이다. 따라서 이러한 어류를 이용한 고분자 콜라겐 생산 방식은 과도한 산의 사용으로 인한 중화 및 폐수처리에 따른 처리 비용 증가와 장시간의 추출 시간과 복잡한 공정에 비해 매우 낮은 추출수율이 산업적인 문제점으로 지적되고 있다.

이러한 문제점을 극복하고자 대한민국 등록특허 제10-1248617호에서는 어피를 산성용액 하에서 초음파 처리하여 콜라겐 추출물을 수득하는 제1단계; 상기 콜라겐 추출물에서 콜라겐과 초음파 처리된 어피를 분리하는 제2단계; 및 상기 초음파 처리된 어피를 제1단계 및 제 2단계를 반복하여 수행하여 콜라겐을 추출하는 방법을 제공하고 있으며, 구체적으로 0.01 ~ 0.5 M 농도의 아세트산과, 20 kHz의 주파수로 초음파 처리하여 24 시간 동안 0 내지 10 ℃의 온도 조건에서 추출을 진행하여 약 40% 정도의 추출수율을 가지는 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 내용을 기술하고 있지만, 여전히 공정이 복잡하고 추출 시간이 오래 걸리는 문제점, 그리고 산업적으로 이용하기 어려운 낮은 추출수율은 크게 개선하지 못하였다. 아텔로콜라겐은 제1형 콜라겐 분자의 양쪽 말단에 나선을 형성하지 않은 텔로펩타이드 (telopeptide)라고 불리는 부분을 제거한 콜라겐을 말하며, 이러한 아텔로콜라겐은 일반 콜라겐에 비하여 면역반응이 없어 의약품이나 화장품 등의 원료로 많이 사용한다. 하지만, 현재까지 일반적으로 사용하고 있는 텔로펩타이드의 제거 방법은 펩신을 처리하거나 불활성화 과정을 거쳐 만들고 있으며, 복잡한 콜라겐 추출 공정을 더욱 복잡하고 어렵게 만들어 고순도의 제1형 아텔로콜라겐을 경제적으로 얻는 것은 현실적으로 어려운 실정이다.

또한 대한민국 등록특허 제10-0679712호에서는 불가사리로부터 아텔로콜라겐(atelocollagen), 수용성 저분자 콜라겐펩티드(collagen peptide) 및 산가용성 저분자 콜라겐 펩티드를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

즉, 불가사리 껍질에 알칼리를 처리하여 비 콜라겐 성분을 제거하는 방법으로 콜라겐섬유를 제조하고 주석산 또는 구연산을 이용하여 pH를 산성으로 조절한 다음 저온에서 산성프로테아제로 가수분해한 후 염석, 투석, 살균 과정을 거쳐서 아텔로콜라겐을 제조하는 방법과 저온에서 중성프로테아제를 이용하여 상기 아텔로콜라겐으로부터 수용성 저분자 콜라겐펩티드를 제조하는 방법 및 불가사리 콜라겐 섬유로부터 산가용성 콜라겐펩티드를 생산하는 방법이 개시되어 있으나 분리공정이 복잡하고 수율이 낮으며, 산으로 처리함에 따른 오염 등의 문제점을 가지고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1603276호에는 방사선 조사 기술을 이용한 해파리로부터 콜라겐을 추출하는 방법이 개시되어 있으나 방사선의 사용에 따른 유해성에 논란의 문제점을 가지고 있었다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1248617호 1. 대한민국 등록특허 제10-0679712호 1. 대한민국 등록특허 제10-1603276호

본 발명은 기존의 콜라겐 추출 방법 또는 아텔로콜라겐 추출 방법의 문제점이었던 추출 시간의 단축과 추출수율의 향상을 목표로 하면서 동시에 콜라겐 기본 구조는 유지하면서 콜라겐 말단의 텔로펩타이드를 제거한 아텔로콜라겐을 추출하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명에서 사용하는어류는 Paralichthys olivaceus로 표준어는 넙치이다. 영문명은 Jeju Olive flounder, 일본명은 ヒラメ (히라메), 중국어표기는 比目魚라 하여 대한민국 전 연해와 일본의 가지 연안 그리고 중국해 연안에 널리 분포한다. 넙치의 가장 큰 특징은 두 눈이 한쪽 (왼쪽)으로 쏠려 있다는 것이며, 넙치와 가자미류 (도다리)의 가장 큰 차이는 눈의 위치와 입의 크기이다. 눈의 위치는 가자미 (도다리)가 오른편에 있는데 비해 넙치가 왼편에 있으므로 ‘우 도다리, 좌 광어’, 또는 ‘오른쪽 도다리, 왼쪽 광어 (두 글자)’로 넙치를 구분 할 수가 있다.

본 발명의 아텔로콜라겐은 넙치에서 추출/정제한 제1형 콜라겐으로서, 제I형 콜라겐의 전형적인 구조인 α1 (α3), α2, 및 β chain에 해당하는 성분을 함유하고 있으며, 300 KDa 이하의 분자량을 가지는 특징을 가지며, 아텔로콜라겐 구조의 모든 서열에서의 N-, C- 말단 영역에 텔로펩타이드 영역 부분이 콜라겐 체인에서 검출되지 않는 atelocollagen의 전형적인 구조적 특성을 가지고 있다. 또한 어류의 이취를 발생시키는 트리메틸아민(TMA)과 디메틸아민(DMA) 등과 같은 비린내를 생성하는 원인 물질이 존재하지 않는 아텔로콜라겐이다.

본 발명에 사용한 초음파는 강도에 따라 물질의 구성, 구조 및 물리적인 상태나 flow rate 등과 같은 물리화학적인 특성에 대한 정보를 증명하는데 이용되는 저강도 초음파 (low intensity ultrasonication)와 유화를 일으키거나 cell의 붕괴, 화학적 반응을 촉진시키고 효소의 작용을 억제시키는데 적용되는 고강도 초음파 (high intensity ultrasonication)로 분류된다. 특히, 본 발명에 사용한 고강도 초음파는 최근 제약 산업 분야의 약제의 합성, 그리고 식품의 가공에 점차 그 영역을 확대하고 있는 추세이며, MHz범위의 저강도 초음파와는 대조적으로, 물질의 특성을 바꿀 수 있는 특징이 있다. 이러한 고강도 초음파는 가열 (heating), 공동현상 (cavitation effect), 압축과 팽창 (compression & rarefaction) 및 난류 (turbulence) 등의 특성을 가지고 있으며, 이 중 가장 특징적인 것은 공동현상이다. 고강도 초음파는 액체 내에서 초당 수백에서 수 천 만개의 미세기포 (microbubble)를 생성하게 되는데, 이 미세기포들이 생성과 소멸을 반복하면서 높은 난류 (turbulent flow) 상태를 일으켜 순간적으로 온도를 5,000 K까지 상승시키고, 1,200 bar의 압력을 발생시켜 반응이 촉진되거나 주위 물질을 파괴하게 되는데, 이를 공동현상이라 한다.

본 발명자들은 콜라겐을 추출하는 과정 중에 고강도 초음파를 사용할 경우 공동현상에 의해 콜라겐 구조의 텔로펩타이드 부분이 제거되는 현상을 발견하여, 기존의 초음파 추출 방법보다 훨씬 경제적으로 산업화가 용이하도록 콜라겐을 추출할 수 있을 뿐만 아니라 펩신 등의 처리 과정을 거치지 않고도 직접적으로 초음파 추출 과정만으로 텔로펩타이드를 제거하여 아텔로콜라겐을 추출하는 공정이 가능하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 의한 아텔로콜라겐 추출 방법은 초음파 처리를 이용함으로써 기존의 콜라겐 추출 방법보다 산성용액의 농도를 줄이고 높은 수율로 짧은 시간에 콜라겐을 추출할 수 있고, 그 콜라겐은 텔로펩타이드가 제거된 아텔로콜라겐으로 화장품 및 제약 산업에 매우 유용하여 산업적 이용가능성이 매우 높은 특징이 있다.

도 1은 실시예 2을 제외한 비교예 1 및 비교예 2의 콜라겐이 펩신에 의해 분해되는 것을 나타내는 것이다.
도 2는 실시예 2의 콜라겐을 urea buffer 조건에서 염기서열을 분석한 결과이며, 실시예 2의 콜라겐에 텔로펩타이드가 존재하지 않는 아텔로콜라겐 임을 증명하는 것이다.
도 3은 실시예 2의 콜라겐을 ammonium bicarbonate buffer 조건에서 염기서열을 분석한 결과이며, 실시예 2의 콜라겐에 텔로펩타이드가 존재하지 않는 아텔로콜라겐 임을 증명하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시료의 전처리

넙치의 어피는 대한민국 제주도에서 포획되는 수산물을 사용하였으며, 어피를 수거하여 바로 냉동 보관하여 부패를 방지하였다. 어피는 안쪽에 잔존하는 근육과 바깥쪽의 비늘을 제거한 후 얼음물에 세척하여 불순물을 제거하고, 어피 중량에 대하여 5 배의 5 M 농도의 NaCl 용액을 가하여 잘 교반하였다. 이와 같은 조작을 3 회 이상 반복하였으며, 모든 조작은 4 ℃ 이하에서 실시하였다. 그 다음 어피를 4 ℃ 이하로 보관된 증류수로 세척한 후, 20 배 중량비율의 냉 에탄올을 첨가하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반 하면서 탈지하고 이를 차가운 수돗물에 수세하여 4 ℃에서 24 시간 동안 말린 후 사용하였다.

실시예 2. 아텔로콜라겐 추출

탈지한 어피의 시료에 중량비율로 200배에 해당하는 0.05 M 농도의 아세트산 용액을 가하여 600 kHz 진동수의 초음파를 3시간 동안 처리하여 콜라겐을 추출하였다. 초음파 처리는 Ultrasonic processor (MX sonic, MIRAE Ultrasonic Tech, Korea)를 사용하였으며, 초음파 처리로 인한 온도 상승을 방지하기 위하여 Chiller (Auto Chiller, Hyundai Eng Co. LTD., Korea)를 이용하여 시료가 들어있는 용기 주변을 냉각수로 순환시키면서 4 ℃를 유지하였다. 이렇게 추출한 아텔로콜라겐 추출액을 10,000×g에서 20 분간 원심분리 한 후 얻은 상등액에 동일한 중량비율의 2 M 농도의 NaCl 용액을 가하여 4 ℃에서 잘 교반 한 후 다시 10,000×g에서 20 분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 4 ℃ 이하로 보관된 0.2 M 인산수소2나트륨 용액에 넣어 pH 7 ∼ 8로 1시간 이상 조절하고, 다시 10,000×g에서 20 분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 얻어진 침전물의 중량비율로 2배에 해당하는 50 % 에탄올 용액을 가하여 4 ℃에서 잘 교반 한 후 10,000×g에서 20 분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 4 ℃ 이하에서 보관된 증류수에 넣어 1시간 정도 교반한 후 다시 10,000×g에서 20 분간 원심분리하여 아텔로콜라겐을 정제하였다.

비교예 1. 산가수분해에 의한 콜라겐 추출

탈지한 어피의 시료에 중량비율로 200배에 해당하는 0.5 M 농도의 아세트산 용액을 가하여 72 시간 동안 콜라겐을 추출하였다. 초음파 처리와 비교하기 위하여 추출 조건은 시료가 들어있는 용기 주변을 냉각수로 순환시키면서 4 ℃를 유지하였다. 이렇게 추출한 콜라겐을 실시예 2의 정제 과정과 동일한 방법으로 정제를 하였다.

비교예 2. 저강도 초음파 추출

탈지한 어피의 시료에 중량비율로 200배에 해당하는 0.05 M 농도의 아세트산 용액을 가하여 20 kHz 진동수의 초음파를 12 시간 동안 처리하여 콜라겐을 추출하였다. 초음파 처리는 Ultrasonic processor (MX sonic, MIRAE Ultrasonic Tech, Korea)를 사용하였으며, 초음파 처리로 인한 온도 상승을 방지하기 위하여 Chiller (Auto Chiller, Hyundai Eng Co. LTD., Korea)를 이용하여 시료가 들어있는 용기 주변을 냉각수로 순환시키면서 4 ℃를 유지하였다. 이후 콜라겐의 정제 과정은 실시예 2와 동일하게 진행하였다.

실험예 1. 콜라겐 추출수율 비교

실시예 2와 비교예 1, 비교예 2의 추출물을 대상으로 콜라겐 추출수율을 비교하였다. 콜라겐 추출수율의 계산은 총 단백질 함량에 대한 추출 후의 단백질 함량의 비로 다음과 같은 식에 의해서 산출하였다.

콜라겐 추출수율 (%) = (상등액 중의 단백질 농도/총 단백질 농도)×100

그 결과 다음과 같이 고강도 초음파 추출을 진행하였을 경우 추출수율이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

	아세트산의 농도	시간(h)	콜라겐 추출수율 (%)
비교예 2	0.50 M	72	20
비교예 1	0.05 M	12	40
실시예 2	0.05 M	3	62

또한 추출 시간도 현저히 줄어들어 동일한 공정으로 콜라겐을 추출할 경우 고강도 초음파를 이용한 콜라겐 추출 방법이 월등히 경제적이고 효율적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 콜라겐의 특성 확인

추출한 콜라겐의 구조적 특성을 확인하기 위해 펩신을 이용하여 콜라겐의 분해 반응을 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2를 대상으로 진행하여 전기영동법으로 분석한 결과 전형적인 콜라겐 구조를 가지고 있으며, 비교예 1과 비교예 2는 실시예 2에 비하여 콜라겐 분해 반응이 진행하였음을 확인하였다. 각각의 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2의 추출물을 100 ℃에서 5분간 가열하여 gelatin으로 변형시킨 것을 각각 1 mg/mL로 조절하고, 단백질 농도에 대해 0.50 %의 pepsin을 첨가하여 10 ℃에서 0-30분간 반응시켰다. 반응한 시료는 8 M urea, 2 % mercaptoehanol, 20 mM tris-HCl buffer (pH 8.0)을 첨가하고, 100 ℃에서 2분간 가열하여 효소 활성을 정지시킨 후 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 아텔로콜라겐의 경우 일반적인 콜라겐과 달리 펩신이나 트립신 같은 단백질 분해효소에 의해 분해가 일어나지 않고 오로지 콜라게네이즈에 의해서만 분해가 일어나므로 본 실험예 2를 통하여 실시예 2는 아텔로콜라겐, 비교예 1과 2는 텔로펩타이드가 존재하는 콜라겐인 것을 확인할 수 있었다. 이 전기영동의 실험 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 보면 알 수 있듯이 비교예 1과 비교예 2의 경우 펩신에 의해 콜라겐이 분해되어 실시예 2에서 보이지 않던 적은 분자량 단위의 콜라겐 파편이 보이면서 제일 위쪽의 농도가 묽어 지는 것으로 콜라겐이 분해되었다는 것을 확인할 수 있다. 또한 실시예 2의 아텔로콜라겐의 분자량이 300 kDa 이하라는 것도 확인할 수 있었다.

실험예 3. 실시예 2의 아텔로콜라겐 증명

실시예 2의 추출물이 아텔로콜라겐이 맞는지 확인하기 위하여 염기 서열을 분석을 Q-TOF 방법으로 진행하여 텔로펩타이드가 존재하는지 확인하였다. 그 결과들을 도 2에 나타내었다.

그 결과 모든 서열에서 N-, C-말단 영역이 일정 부분 검출되지 않는 특성이 모두 확인되었으며 실시예 2의 추출액 속의 콜라겐 구조 속에는 텔로펩타이드 영역이 존재하지 않는다는 것을 확인하였다. 또한 콜라겐 제1형 단백질 조성을 가지는 특징도 함께 가지고 있는 것을 확인하여 실시예 2는 아텔로콜라겐이 확실하다는 것을 확인하였다.

지금까지 예시적인 실시를 통하여 본 발명을 상세하게 기술하였으며, 본 발명이 속하는 산업 분야의 기술자나 연구자들은 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변화를 실시할 수 있고, 그의 요소들을 적절하게 대체할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서 본 발명이 본 발명을 설명하는 실시예에 개시된 내용에 국한되는 것은 아니며, 본 발명의 특허청구 범위에 속하는 모든 실시 사항을 포함한다.

Claims

넙치 (Paralichthys olivaceus)의 어피로부터 아텔로콜라겐을 추출하기 위해 아텔로콜라겐의 추출용매를 가한 후 콜라겐의 텔로펩타이드를 제거하거나 또는 비활성화시키기 위해 초음파를 이용하여 높은 효율성을 가지는 아텔로콜라겐을 추출하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기의 초음파는 600 kHz의 진동수를 가지는 고강도 초음파를 1 내지 6시간 동안 1 내지 10 ℃의 온도 조건에서 방사하여 아텔로콜라겐을 추출하는 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐을 추출하는 방법.
제 1항에 있어서,
상기의 아텔로콜라겐의 추출용매는 0.05 M 농도의 아세트산인 것을 특징으로 하는 아텔로콜라겐을 추출하는 방법.