KR20180032245A - 말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 포함하는 건강기능식품 및 이의 제조방법 - Google Patents
말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 포함하는 건강기능식품 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 말뼈 추출물 50 내지 80 중량% 및 백수오 농축액 20 내지 50 중량%를 포함하며, 상기 말뼈 추출물은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 추출한 추출물이고, 상기 백수오 농축액은 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축한 농축액인 건강기능식품 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 건강기능식품은 높은 항산화, 항염 및 파골세포 분화 억제 효과 활성을 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 추출한 말뼈 추출물 및 백수오에 에탄올 수용액을 첨가하여 추출한 백수오 농축액을 포함하는 건강기능식품 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
백수오는 마디풀과의 다년생으로, 우리나라가 원산지이고 시계 방향으로 감아 올라가면서 뻗는 식물로 줄기나 잎을 자르면 백색 유액이 나오며 뿌리의 주근은 마와 같이 비대한 모습을 하고 있다. 백수오의 주요 성분으로는 총질소, 전분, 조지방, 광물질, 레시틴, 안트라퀴논 유도체 등이 있는데, 이중 레시틴은 심장을 강하게 하며 안트라퀴논 유도체는 중추신경계에 대한 흥분 작용을 하며 장 연동 운동을 강화시켜 약한 설사작용을 일으키는 것으로 알려져 있다.
근래에는 백수오의 추출물을 이용하여, 갱년기 남성의 테스토스테론 분비 증강 효과를 가지면서도 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 남성 갱년기 질환 예방 또는 개선을 위한 약학적 조성물과 같은 기술들이 개발되었고, 또한 다른 천연물들과 함께 혼합하여 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용되기도 했으며, 항균 조성물로 사용되기도 했다.
상기와 같이, 백수오는 다양한 기능을 가질 수 있는 바, 우수한 활성을 갖는 유효성분 및 지표물질을 고함량 포함하여 섭취 시 생체 내에서 다양한 이로운 기능을 하면서 일상생활에서도 쉽게 이용될 수 있는 다양한 제품 생산에 대한 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 유효성분을 함유하는 백수오 농축액을 포함하여 다양한 체내 활성을 나타내는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 우수한 효과를 나타내는 백수오 농축액 함유 건강기능식품의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 말뼈 추출물 50 내지 80 중량% 및 백수오 농축액 20 내지 50 중량%를 포함하며, 상기 말뼈 추출물은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 추출한 추출물이고, 상기 백수오 농축액은 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축한 농축액인 건강기능식품을 제공한다.
또한, 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 말뼈 추출물을 제조하는 단계; 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축하여 백수오 농축액을 제조하는 단계; 및 상기 말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 혼합하는 단계를 포함하는 건강기능식품의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 고함량의 사이난디온 A를 포함하고 있어, 뛰어난 항염, 항산화 및 파골세포 억제 효능을 나타낼 수 있어 특히 뼈 관련 기능성을 개선할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 건강기능식품의 제조방법은 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량을 극대화할 수 있으며 뛰어난 항염, 항산화 및 파골세포 억제 효능을 나타내는 건강기능식품을 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 하나의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 폴리페놀 함량을 나타낸 것이다.
도 2는 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 ABTs 라디칼 제거 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 DPPH 라디칼 제거 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 RAW 264.7 세포 독성 및 항염 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 1차 용매 분획물들의 지표물질 함량을 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물들(V1-V13)의 항산화 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 11은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 항산화 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12 내지 도 16은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 항염 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 항암 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 18 및 도 19는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 파골세포 분화 억제 활성능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20 내지 도 23은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 파골세포 분화 억제 활성능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 기존 말뼈 액기스의 관능평가를 나타낸 그래프이다.
도 25는 도 24의 실시예에 따른 백수오 추출물을 포함하는 말뼈 액기스의 관능 평가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 ABTs 라디칼 제거 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 DPPH 라디칼 제거 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 도 1의 실시예에서 백수오 추출물의 용매 분획에 따른 RAW 264.7 세포 독성 및 항염 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 1차 용매 분획물들의 지표물질 함량을 나타낸 것이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물들(V1-V13)의 항산화 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 11은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 항산화 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12 내지 도 16은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 항염 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 항암 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 18 및 도 19는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 파골세포 분화 억제 활성능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20 내지 도 23은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 백수오 추출물의 2차 분획물인 V13에 포함된 유효 성분의 파골세포 분화 억제 활성능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 기존 말뼈 액기스의 관능평가를 나타낸 그래프이다.
도 25는 도 24의 실시예에 따른 백수오 추출물을 포함하는 말뼈 액기스의 관능 평가를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 말뼈 추출물 50 내지 80 중량% 및 백수오 농축액 20 내지 50 중량%를 포함하며, 상기 말뼈 추출물은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 추출한 추출물이고, 상기 백수오 농축액은 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축한 농축액인 건강기능식품을 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 건강기능식품은 말 사골 또는 말 정육의 추출물인 말뼈 추출물 및 백수오 농축액이 시너지효과를 나타내므로 항염, 항산화 활성은 물론 뼈 기능 향상에 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 이때, 상기 말뼈 추출물은 50 내지 80 중량%일 수 있고, 백수오 농축액이 20 내지 50 중량%일 수 있는 바, 상기 함량 범위에서 시너지 효과가 가장 극대화될 수 있으므로 바람직하다.
한편, 상기 건강기능식품은 추가로 대추 농축액 또는 배 농축액 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하고 있을 수도 있는 바, 대추 농축액 또는 배 농축액에서 알려진 생체 내 기능을 건강기능식품에 부가할 수 있으며, 특히 그 향과 맛이 익숙한 대추나 배를 사용하여 건강기능식품의 맛, 색, 외관 및 전체적인 기호도를 향상시킬 수 있다.
이런 경우에, 상기 건강기능식품은 말뼈 추출물 50 내지 80 중량%, 백수오 농축액 10 내지 40 중량%, 대추 농축액 5 내지 15 중량% 및 배 농축액 5 내지 15 중량%를 포함할 수 있으며, 이러한 함량 범위 내에서 말뼈 추출물 및 백수오 농축액의 뼈 강화 기능과 전체적인 기호도를 최적화시킬 수 있다.
한편, 상기 백수오 농축액은 백수오에 60 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축한 농축액일 수 있는 바, 다른 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액에 비해, 60 중량%의 에탄올을 함유하는 에탄올 수용액을 추출 용매로 사용할 경우 추출되는 적정한 추출 수율과 유효 성분 함량을 모두 나타낼 수 있어 바람직하다.
상기 백수오 농축액은 사이난디온 A(Cynandione A)를 포함할 수 있는 바, 상기 사이난디온 A는 백수오 추출물의 여러 가지 성분 중 하나로, 가장 높은 항산화 활성, 항염 활성, 항암 활성 및 파골 세포 분화 억제 활성을 나타내는 화합물이며, 본 발명의 유효 성분 내지 지표 성분으로 사용된다.
또한, 본 발명은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 말뼈 추출물을 제조하는 단계; 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축하여 백수오 농축액을 제조하는 단계; 및 상기 말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 혼합하는 단계를 포함하는 건강기능식품의 제조방법을 제공한다. 상기와 같이, 본 발명에 따른 제조방법을 따라 건강기능식품을 제조하는 경우, 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량을 극대화하여 뛰어난 항염, 항산화 및 파골세포 억제 효능을 나타내는 건강기능식품을 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 상기 혼합하는 단계에서 대추 농축액 또는 배 농축액 중에서 선택된 하나 이상의 농축액을 더 포함하여 혼합할 수도 있다.
이때, 상기 건강기능식품은 상기 혼합하는 단계에서 말뼈 추출물 50 내지 80 중량%, 백수오 농축액 10 내지 40 중량%, 대추 농축액 5 내지 15 중량% 및 배 농축액 5 내지 15 중량%를 혼합할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공하는 것이다.
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실시예
1>
백수오
전처리
원료로 사용된 백수오근은 3년간 재배하여 10월~11월에 수확한 것으로, 제주도의 대정읍 무릉리 소재의 생산농가에서 수확한 후 거피를 제거하지 않고 바로 세척하여 40℃, 120시간 열풍 건조한 것을 구입하였다. 이후 열풍 건조된 백수오근을 1 cm 정도의 길이로 파쇄기를 사용하여 절단하였고, 이를 50℃에서 24시간 동안 2차 열풍 건조하여 완전히 건조된 상태로 냉장보관 하였다.
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실시예
2> 1차
분획물에
포함된 유효성분의 기능성 분석
1.
분획물의
기능성 분석
상기 실시예 1에서 건조 절단된 백수오근 1.5 Kg에 70% 에탄올을 가하여 48시간동안 2회 정치 추출하였고, 이후 여과 및 감압 농축하여 70% 에탄올 추출물 400 g을 얻었다. 상기 추출물을 4가지 군으로 나누어, 증류수에 현탁시킨 후 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 용매 분획하여 추출물을 이루는 성분들을 분석하였다.
1) 폴리페놀 함량 분석
상기 백수오근의 용매 분획에 따른 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여, 각 분획 용액 100 μL(1 mg/mL)과 증류수 900 μL를 혼합하고, Folin & Ciocalteau's phenol reagent 100 uL를 첨가하여 잘 섞은 후, 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 완료 후, 20% Na2CO3 300 uL를 넣어 다시 혼합한 다음 증류수를 가하여 총 부피를 2 mL로 조정하였다. 23℃에서 2시간 동안 방치한 후, 760 nm에서 흡광도를 측정하고, 갈산(gallic acid, 1 mg/mL)을 이용한 검량선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
2) 플라보노이드 함량 분석
상기 백수오근의 용매 분획에 따른 플라보노이드 함량을 측정하기 위하여, 4개의 분획 용액을 각각 1 mg/mL의 농도가 되게 증류수에 희석한 후 200 μL을 취해 여기에 에탄올 800 μL과 5% NaNO2 60 μL을 첨가하여 균질하게 혼합하고 5분간 실온에서 반응시켰다. 반응 완료 후 10% AlCl3을 60 μL 첨가하여 다시 실온에서 5분간 반응시켰고, 반응이 완료된 후에 1M NaOH 용액을 400 μL 첨가하여 1분간 상온에서 다시 한 번 반응시켰다. 이후 반응이 완료된 시료에 증류수 500 μL을 가하여 균질화시킨 후 200 μL을 취하여 96 웰 플레이트에 분주하여 마이크로플레이트 리더기(Microplate Reader; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준물질로서 케르세틴(quercetin; Sigma Chemical Co.)을 이용하여 표준곡선을 작성하였고, 시료의 총 플라보노이드 함량은 mg quercetin equivalents(QE)/g로 표기하였다.
3)
ABTs
라디칼 소거 활성 측정
상기 백수오근의 용매 분획에 따른 ABTs 라디칼 소거 활성능을 측정하기 위하여, 7 mM ABTs와 2.45 mM 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate)를 섞고, 상온에서 16시간 배양(incubation) 시켜 ABTs 양이온(ABTs+)을 생성하였다. 이렇게 ABTs 양이온이 생성된 용액을 734 nm에서의 흡광도 값이 0.7 이하가 되도록 희석하여 시험 용액으로 제조하였다. 이렇게 제조된 ABTs+ 용액(시험 용액) 100 μL에 상기 4개의 분획 용액 100 μL를 각각 가하여 3분 후에 흡광도 값을 측정하였다. 이때, 항산화능, 즉 라디칼 소거능은 아스코르브산(Ascorbic acid)을 대조군으로 하기의 산출식을 이용하여 백분율로 나타냈다.
※ 산출식
: ABTs radical scavenging activity = (1-A TestA Control)×100
4)
DPPH
라디칼 소거 활성 측정
상기 백수오근의 용매 분획에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성능을 측정하기 위하여, 4개의 분획 용액 100 μL과 DPPH를 메탄올에 100 μM의 농도로 녹인 DPPH 용액 900 μL을 넣고 혼합하여 실온(암실)에서 30분간 방치하였다. 이후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로는 아스코르브산을 사용하였고, 하기 산출식을 이용하여 DPPH 라디칼 소거량을 계산하였다.
※ 산출식 : % DPPH = (A-B)/A X 100
(A : Absorbance of the control, B : Absorbance of the sample)
5) RAW 264.7 세포 독성 측정
상기 백수오근의 용매 분획에 따른 세포 독성을 측정하기 위하여, 한국세포주은행에서 얻어 고 글루코오스 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s modi?ed Eagle's medium, DMEM; Gibco-BRL)에서 배양한 RAW 264.7 세포에 각 분획 용액를 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후, Ez-cyto를 각각의 세포에 10 μL 씩 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 340 nm에서 흡광도를 측정하여, 세포에 각각 캠퍼롤(Kaempferol), 미리시트린(myricitrin) 및 설포라판(sulforaphane)을 첨가한 대조군들과 비교했을 때의 RAW 264.7 세포에 대한 시료의 세포독성을 평가하였다.
6) in vitro 항염활성 측정
상기 백수오근의 용매 분획에 따른 항염 활성을 측정하기 위하여, 상기 RAW 264.7 세포에 LPS(100 ng/ml)와 4개의 분획물 시료(550 μg/ml)를 각각 동시에 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 중에 생성되는 일산화질소(NO)의 양은 그리스(Griess) 시약(1%(w/v) 설파닐아마이드(sulfanilamide), 0.1% 2.5(v/v)로 혼합된 인산 및 N-(1-나필)에틸렌다이아민(Sigma) 100 μL을 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 530 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 생성된 NO의 양은 아질산염 소듐(sodium nitrite, NaNO2)의 검량선과 비교하여 환산하였다. 대조군은 캠퍼롤(Kaempferol), 미리시트린(myricitrin) 및 설포라판(sulforaphane)을 첨가하였다.
7) 실험 결과
상기와 같이 폴리페놀 함량 측정, 플라보노이드 함량 측정, ABTs 자유 유리기 소거 활성능 측정, DPPH 자유 유리기 소거 활성능 측정, 세포 독성 측정 및 항염 활성 측정의 실험 결과들을 각각 도 1 내지 도 5에 나타내었다.
하기 도 1 및 도 2에 따르면, 에틸아세테이트 분획물이 폴리페놀 함량 43.38 mg GAE/g 및 플라보노이드 함량 51.92 mg GAE/g으로 가장 높은 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타내었다. 또한, 도 3 및 도 4를 참조하면, 250 μg/ml에서 ABTs 라디칼 및 DPPH 라디칼에 대해 각각 79.9% 및 50.3%로 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 소거활성을 나타내었다. 한편, 도 5에 따르면, RAW 264.7 세포에서의 세포 생존율은 에틸아세테이트 분획물의 경우 70.0±0.9%로 대조군에 비해 낮은 세포 독성을 나타내었으며, NO 생성 저해능은 550 μg/ml에서 82.0%로 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수하였다.
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실시예
3> 1차
분획물에
포함된 지표물질의 함량 분석
1차 분획물에 포함된 지표 물질의 함량을 측정하기 위해, 상기 실시예 2에서 사용한 4가지의 분획물을 이용하여 지표 물질인 사이난디온 A의 함량을 측정하였다. 구체적으로, 표준품 사이난디온 A를 메탄올에 녹이고, 다시 메탄올로 희석시켜 200, 100, 50, 25, 12.5 ppm의 표준 시약을 제조하였고, 이를 실린지 필터로 여과하여 사용하였다. 이후, 70% 에탄올 및 증류수에 상기 분획물들을 녹여 각각 10,000 ppm 농도로 희석하고 실린지필터로 여과하여 시료를 제조하였다. 이후 다음과 같은 분석 조건으로 HPLC를 수행하여 지표물질의 함량을 분석하였다: 분석기기는 Waters(USA) Hihg performance liquid chromatography system e2695였고, 검출기는 Waters(USA) Photodiode array detector 2998(270nm)였으며, capcellpak MG C18 4.6×250mm, 5um(25℃)의 컬럼을 사용하였고, 10 ul의 시료를 주입하여 H2O(0.5% Acetic acid) 및 ACN의 용매 조건 하에서 그 함량을 측정하였다.
그 결과가 도 6에 나타난 바와 같았다. 구체적으로, 에틸아세테이트 분획물에서 사이난디온 A의 함량이 3.81 %로 가장 높게 나타났으며 그 외의 분획물에서는 미량의 함량을 보였다.
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실시예
4> 2차
분획물에
포함된 물질들의 기능성 분석
1) 에틸아세테이트
분획물에서
유효 성분의 분리
상기 실시예 2의 4가지 용매 분획물 중 가장 높은 폴리페놀, 플라보노이드의 함량 및 라디칼 소거 활성을 보였던 에틸아세테이트 분획을 진공 액체 크로마토그래피(Vacuum liquid chromatography, 10×5cm, silicagel, 20~40 mash)를 이용하여 2차로 분리하였으며 용출 용매는 헥산, 디클로로메탄(CH2Cl2), 에틸아세테이트, 메탄올을 사용하였고, 이 용출 용매 4가지를 순서대로 천천히 흘려보내면서 분획물 13개를 얻어, 각 분획물을 V1 내지 V13으로 명명하였다. 대조군으로는 Me(s)를 사용하였다.
2) 항산화 활성 측정
① 폴리페놀 함량 분석
상기에서 얻은 13개의 분획물의 항산화 활성을 측정하기 위해, 실시예 2에서 수행한 방법으로 13개 분획물의 폴리페놀 함량을 분석하였다.
② DPPH 자유 유리기 소거활성 분석
상기에서 얻은 13개의 분획물의 항산화 활성을 측정하기 위해, 실시예 2에서 수행한 방법으로 13개 분획물의 DPPH 자유 유리기 소거활성을 분석하였다.
3) 실험 결과
상기 분획물들의 항산화 활성을 측정한 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 도 7에 따르면, V5가 307.1 mg GAE/g로 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타냈으며, 다음으로는 V4, V6가 각각 216.1, 195.9 mg GAE/g로 높게 나타났다. 또한, 도 8에 따르면, V5가 50 μg/ml에서 92.8%의 DPPH 자유 유리기 저해 활성을 나타내 가장 우수하였으며, 다음으로 V6, V4가 각각 67.5% 61.3%로 우수한 것으로 나타났다. 즉, 상기 결과를 종합하면, V5가 항산화 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.
<
실시예
5> 2차
분획물에
포함된 유효 성분(지표물질)의 분리
1차 분획물에 포함된 지표 물질의 함량을 측정하기 위해, 상기 실시예 3에서 얻은 13개의 분획물중 항산화 활성이 가장 우수하다고 판단된 V5 분획물 2.6 g을 얻었고, 여기서 얻어진 V5 일부 화합물 1.3 g을 메탄올에 녹인 후 여과하여 얻은 시료 756.3 mg을 HPLC로 분리하였다. 이때 HPLC 조건은 다음과 같았다: 먼저 표준품 사이난디온 A를 메탄올에 녹인 후 다시 메탄올에 희석시켜 200, 100, 50, 25, 12.5 ppm 표준 시약으로 제조하고 실린지 필터로 여과하여 사용하였다. 다음으로, 상기 시료를 70% 에탄올 및 증류수에 녹여 10,000 ppm으로 희석하고 실린지 필터로 여과하여 HLPC를 수행하였다. HLPC 수행 시 분석기기는 Waters(USA) High performance liquid chromatography system e2695였으며, 검출기는 Waters(USA) Photodiode array detector 2998(270nm)이었다. HLPC에 사용된 컬럼은 capcellpak MG C18 4.6×250mm, 5um(25℃)이었고, 시료의 주입량은 10ul이었다. 용매로는 H2O(0.5% 아세트산 포함 및 ACN를 사용하였다.
상기 HLPC 수행 이후 단일 화합물 26 mg을 얻었으며, 이 단일 화합물을 동정하기 위하여 NMR을 사용하였고, 문헌과 대조하여 이 화합물이 사이난디온 A임을 확인하였다.
Cynandione
A
1H NMR(400 MHz, CD3OD) δH(ppm) : 2.18 (3H, s, 8-CH3), 2.51 (3H, s, 8'-CH3), 6.48 (1H, d, J=8.7 Hz, 5'-H), 6.80 (1H, d, J=9.1 Hz, 4-H), 6.95 (1H, d, J=8.7 Hz, 5-H), 7.74 (1H, d, J=9.1 Hz, 4'-H) 13C NMR(75 MHz, CD3OD) δC(ppm) : 26.4 (C-8'), 30.9 (C-8), 108.8 (C-5'), 113.0 (C-3'), 114.4 (C-1') 118.3 (C-4), 120.3 (C-2), 121.9 (C-5), 127.5 (C-1), 134.0 (C-4′), 149.0 (C-6), 152.5 (C-3), 163.6 (C-2', 6'), 203.4 (C-7'), 207.3 (C-7)
<
실시예
6> 2차
분획물에
포함된 유효 성분(지표물질)의 항산화 활성 측정
1) 활성산소 흡수력(Oxygen radical
absorbance
capacity,
ORAC
) 측정
상기 실시예 5에서 얻은 사이난디온 A의 활성산소 흡수력을 측정하기 위하여, 인산 버퍼(phosphate buffer, 0.075M K2HPO4 : 0.075M NaH2PO4 = 61.5 : 38.5(v/v) pH 7.0) 75 mM를 플루오레세인 소듐염(fluorescein sodium salt; Sigma Chemical Co.)에 가하여 78 nM 농도가 되도록 하여 표준 용액을 제조하였다. 상기 사이난디온 A가 포함된 시료와 표준용액 100 μL에 26 mM 형광물질 50 μL를 가하고, 과산화 라디칼 유발물질인 2,2‘-아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(2,2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride, AAPH)를 상기 인산 완충액에 가해 34 mM로 희석한 뒤, 희석한 용액 50 μL를 더 가하여 반응시켰다.
반응 완료 후, FLUOstar OPTIMA(BMG Labtech, Inc., Offenburg, Germany)를 사용하여 여기 파장(excitation) 485 nm, 방출 파장(emission) 538 nm의 조건에서 1시간 동안 3분마다 흡광도를 측정하였고, 하기의 산출식으로 ORAC 활성 측정능을 계산하였다. 이때, 대조군은 항산화능력이 좋은 커큐민을 사용하였으며, 사이난디온 A 시료 대신 커큐민을 혼합하여 제조하였다.
※ 산출식
AUC (area under the curve) = 1+(f1/f0)+(f2/f0)+(f3/f0)+……+(f19/f0)+(f20/f0)
Relative ORAC value
= [(AUCsample-AUCblank)/(AUCtrolox-AUCblank)]×(molarity of trolox/gram of sample)
2)
ABTs
라디칼 소거 활성 측정
상기 사이난디온 A를 포함하는 시료 100 μL를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 ABTs 라디칼 소거 활성능을 측정하였다.
3)
DPPH
라디칼 소거 활성 측정
상기 사이난디온 A를 포함하는 시료 100 μL를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 DDPH 라디칼 소거 활성능을 측정하였다.
4) 실험 결과
상기에서 측정한 유해 산소 흡수 능력, ABTs 자유 유리기 소거활성 및 DPPH 자유 유리기 소거활성을 분석한 결과를 도 9 내지 도 11에 나타내었다. 도 9를 참조하면, 사이난디온 A의 경우, 10 μM에서 72.04 μM TE로 커큐민의 16.20 μM TE보다 4.4배 이상 높은 유해 산소 흡수 능력을 나타냈다. 또한, 도 10 및 도 11을 참조하면, 사이난디온 A는 IC50 값이 19.1 μM로 아스코르브산의 28.2 μM보다 우수한 결과를 보였으며, DPPH 자유 유리기 소거활성 분석 결과에서도 IC50 값이 32.3 μM로 아스코르브산의 44.2 μM보다 우수한 결과를 나타내었다.
<
실시예
7> 2차
분획물에
포함된 유효 성분(지표물질)의 항염 활성 측정
1) NO 생성 및 세포 독성 측정
상기 사이난디온 A의 항염 활성능을 측정하기 위하여, 실시예 2에서 수행한 방법과 같이, 상기에서 준비한 RAW 264.7 세포에 여러 가지 농도의 시료와, LPS(100 ng/ml), 인터페론(IFN) 및 LPS과 IFN의 혼합물을 동시에 첨가하여 각각을 24시간 동안 배양하였다.
이후 생성된 NO의 양은 그리스(Griess)시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 아질산염(nitrite)의 형태로 측정하여 50% 저해 농도인 IC50 값으로 나타내었고, WST-1(EZ-CyTox enhanced cell viability assay kit; Daeil Lab Service, Seoul, Korea) 방법을 이용하여 세포 생존율을 3회 반복 측정하였으며, 50% 세포 독성을 나타내는 농도인 CC50 값으로 나타내었다. 또한, 세포독성이 낮으면서 NO 생성 저해능이 높은가를 확인하기 위해, 선택성 지수(selectivity index, SI= CC50/IC50)를 산출하였다.
2)
iNOS
, COX-2, 사이토카인 생성 억제 효과 분석
RAW 264.7 세포에서 사이난디온 A의 iNOS, COX-2와 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 mRNA 생성 억제효과를 분석하기 위하여, RAW 264.7 세포로 RT-PCR을 수행하였다. 우선 LPS는 iNOS, COX-2와 사이토카인의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있으므로, LPS(100ng/ml) 처리하여 RAW 264.7 세포의 사이토카인 생성을 유도하였다.
이후 수행한 RT-PCR의 조건은 다음과 같았다: RAW 264.7 세포를 2.0×105 cells/well만큼 6 웰 플레이트에 심어 18시간 전 배양하고, 여러 농도(0, 32, 63, 125, 250 mM)로 사이난디온 A와 LPS(100 ng/mL)를 동시 처리하여 배양하였다. 총 RNA는 TRI Reagent(MRC, Cincinnati, OH)를 이용하여 분리하였다. 세포에 TRI reagent를 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리(13000 rpm, 10 min)했고, 상층액에 동량의 이소프로판 알콜을 첨가한 후 다시 원심분리(13000 rpm, 10 min)하여 RNA을 침전시켰다. 침전된 RNA를 75%의 처리된 에탄올로 세척한 후 건조시켜 리보핵산가수분해효소(RNase) 저해제인 디에틸피로카르본산(DEPC)이 처리된 증류수에 녹였다. 이후 260 nm의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280 nm의 비율이 1.6-1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 실험에 사용하였다.
cDNA 합성은 Improm-IITM cDNA kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하였다. 상기에서 추출한 1 mg의 총 RNA를 올리고(dT) 프라이머, dNTP(0.5mM), 1 unit RNase 저해제 그리고 Improm-IITM reverse transcrip tase(2U)를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 1시간, 70℃ 에서 10분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)은 1 mL cDNA, 4 mM의 각 프라이머 세트와 10X 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250 mM dNTP, 25 mM MgCl2, 1 unit Taq 폴리머라아제(iNtRON, Korea)를 혼합한 후 증류수를 가하여 반응액을 25μL로 맞춘 다음 Bio-Rad PCR 기기를 이용하여 실시하였다. 상기 프라이머 세트는 하기 <표 1>에 나타난 바와 같으며, Xenotech에서 구입하였다.
| 유전자 | 프라이머 서열 | 서열번호 | |
| iNOS | 정방향 | 5’-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3’ | 1 |
| 역방향 | 5’-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3 | 2 | |
| COX-2 | 정방향 | 5’-CACTACATCCTGACCCACTT-3’ | 3 |
| 역방향 | 5’-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3’ | 4 | |
| TNF-α | 정방향 | 5’-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3’ | 5 |
| 역방향 | 5’-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3’ | 6 | |
| IL-1β | 정방향 | 5’-CAGGATGACATGAGCACC-3’ | 7 |
| 역방향 | 5’-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3’ | 8 | |
| IL-6 | 정방향 | 5’-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3’ | 9 |
| 역방향 | 5’-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3’ | 10 | |
| TRAP | 정방향 | 5'-AAATCACTCTTTAAGACCAG-3' | 11 |
| 역방향 | 5'-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3' | 12 | |
| cathepsin K | 정방향 | 5'-CCTCTCTTGGTGTCCATACA-3' | 13 |
| 역방향 | 5'-ATCTCTCTGTACCCTCTGCA-3' | 14 | |
| MMP-9 | 정방향 | 5'-CTGTCCAGACCAAGGGTACAGCCT-3' | 15 |
| 역방향 | 5'-GTGGTATAGTGGGACACATAGTGG-3' | 16 | |
| β-actin | 정방향 | 5’-AGGCTGTGCTGTCCCTGTATGC-3' | 17 |
| 역방향 | 5’-ACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAA-3’ | 18 |
PCR 종료 후, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% 아가로오스 겔에서 전기영동을 실시하고 브롬화 에티듐(ethidium bromide, EtBr)으로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator, SLB Mylmagger TM)에서 특정 밴드를 확인하였다. 각 결과에 대한 분석은 LabWorks Imaging and Analysis Software(UVP labwork, USA)를 사용하여 진행하였다.
3) 실험 결과
상기에서 측정한 NO 생성 억제효과, 세포 독성 효과 및 iNOS, COX-2, 사이토카인 억제 효과를 측정하여 도 12 내지 도 16에 나타내었다.
LPS만을 처리한 도 12를 참조하면, 사이난디온 A는 500, 250 μM에서 각각 81.9, 5.9%의 세포독성을 나타내었다. 각각의 IC50 값과 CC50 값은 94.0, 371.6 μM으로 나타났으며, 세포독성을 나타내지 않는 농도인 125 μM에서는 63.4%의 NO 억제활성을 보여 효과적으로 염증매개인자인 NO 생성을 저해하는 것으로 나타났다.
IFN만을 처리한 도 13을 참조하면, IC50 값은 80.0 μM으로 나타났으며, 또한, LPS와 IFN을 동시에 처리한 도 14를 참조하면, IC50 값은 226.5 μM이며, LPS 처리 세포 > IFN 처리 세포 > LPS+IFN 처리 세포 순으로 염증매개인자인 NO 생성을 저해하는 것으로 나타났다.
도 15 및 도 16을 참조하면, LPS를 처리하지 않는 실험군에서는 사이토카인 mRNA 생성을 유도하지 않았고, 사이난디온 A와 LPS를 처리한 실험군은 LPS만을 단독 처리한 실험군 대비 COX-2와 사이토카인 중 IL-6가 유의적으로 감소하였다.
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실시예
8> 2차
분획물에
포함된 유효 성분(지표물질)의 항암 활성 측정
1)
암 세포
생장 저해 효과 측정
대장암 세포주인 HT-29, MKN-74 위암 세포주, 폐암 세포주인 NCI-H1229를 한국세포주은행에서 분양받았으며, 100 units/mL의 페니실린과 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Gibco Inc., Grand Island, NY, USA), 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco Inc.)이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.
암세포 생장 저해효과는 상기 실시예 5에서 수행한 WST-1 assay를 이용하여 측정하였다. 우선 HT-29와 NCI-H1229 세포(2.5×105 cells/mL)를 각각 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 배양하였다. 이후, 사이난디온 A를 농도별로 10 μL 가하였고, 24시간 동안 배양한 다음 WST-1 용액을 10 μL 가해 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 사용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2) 실험 결과
상기와 같이 수행한 암 세포 억제 능력을 측정한 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17을 참조하면, 사이난디온 A는 암세포에서는 특별한 효과를 보이지 않는 것으로 나타났다.
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실시예
9> 2차
분획물에
포함된 유효 성분(지표물질)의 파골세포 분화 억제
활성능
측정 1
1) 대식 세포를 이용한 파골세포 분화 억제 활성 측정
한국 세포주 은행에서 분양받은 RAW 264.7 마우스 유래 대식 세포주를 고 글루코오스 DMEM에 5% FBS와 1X 항생제를 혼합한 배지에서 5% CO2, 37℃ 조건으로 배양하였다. 배양된 RAW 264.7 대식세포를 2,000 cells/cm2 되도록 24 웰 플레이트에 시딩(seeding)한 후 24시간 후에 농도별 시료와 핵 인자 카파-B 리간드 수용체 촉진제(Soluble Receptor Activator of Nuclear Factors κB Ligand, sRANKL)을 100 ng/mL 처리하여 72시간 동안 파골세포로 분화하도록 유도하였다. 이후, 세포에서 생성되는 타르타르-항 산 인산분해효소(Tartrate-resistant Acid Phosphatase, TRACP)의 양을 Takara 사의 TRAP and ALP Assay Kit와 TRACP and ALP stain kit을 이용하여 측정하였다.
2) 실험 결과
파골세포를 포함한 단핵세포들은 TRAP를 가지고 있고, 효소적 가수분해에 의해 naphthol AS-BI와 GBC solution이 결합하여 불용성의 염료(maroon dye)를 형성하여 세포가 붉은색으로 염색된다. 이에 대한 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.
도 18 및 도 19를 참조하면, sRANKL에 의한 파골세포형성이 현저히 증가하였으며, 사이난디온 A를 처리한 결과 sRANKL 단독처리에 비해 파골세포형성을 강하게 억제하였다. 그리고 TRAP assay kit에서도 사이난디온 A 100 μM 처리군에서는 sRANKL 단독처리에 비해 약 65%의 TRAP 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
<
실시예
10> 2차
분획물에
포함된 유효 성분(지표물질)의 파골세포 분화 억제
활성능
측정 2
1) 단백질 발현 양상 비교
상기 실시예 9에서 얻어진 결과를 토대로, mRNA 발현 양상이 저해된 TRAP과 MMP-9에 대한 면역 블로팅(Immunoblotting)을 실시하여, sRANKL을 처리하지 않은 실험군, 처리한 실험군 및 사이난디온 A와 함께 처리한 실험군을 비교하였다.
면역 블로팅의 구체적인 과정은 다음과 같다: 상기 대식 세포를 2-3회 PBS로 세척한 후 100 mL의 0.1M PMSF, 0.1M NaO4, 0.5M NaF, 5 mg/mL 아프로티닌(aprotinin)과 류펩틴(leupeptin)이 첨가된 RIPA 용혈 버퍼(RIPA lysis buffer; Upstate Biotechnology, USA)를 가하여 1시간 동안 세포를 용혈시킨 후 원심분리(15,000 rpm, 15min)하여 세포막 등의 필요 없는 성분을 제거하였다. 단백질의 농도는 BSA(bovine serum albumin)을 표준화하여 Bio-Rad protein assay kit를 사용하여 정량하였다. 30 mg/mL의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리한 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(poly vinylidene difluoride membrane, PVDF membrane; Milipore, USA)에 200 mA로 90분 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 PVDF 막은 5% 탈지유가 첨가된 블로킹 버퍼(blocking buffer; Tirs-buffered daline-0.1% (w/v) Tween-20 : TBS-T)를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 1차 항체와 반응하였다. 이후, TBS-T로 3회 수세한 후 2차 항체 퍼록시다아제와 컨쥬게이트된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 완료 후 ECL detection reagent(Amersham Biosciences, Piscataway., NJ, USA)를 사용하여 결과를 확인하였고, 각 단백질 발현량은 LabWorks Imaging and Analysis Software(UVP Labworks, USA)로 분석한 후 b-actin에 대한 발현량으로 보정하여 정량화하였다.
2) 유전자 발현 비교
사이난디온 A에 의한 분화 관련 유전자 발현을 비교하기 위해, RAW 264.7 세포에 sRANKL(30 ng/ml)을 처리하여 파골세포형성을 유도한 후, TRAP 염색으로 분화 여부를 확인하고, 상기 실시예 7에서 수행한 방법과 동일하게 파골세포의 분화 과정의 발현 마커로 사용되는 TRAP, MMP-9, cathepsin K와 같은 유전자의 발현 변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 이때 RT-PCR의 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 45초, 55-57℃에서 45초, 70℃에서 60초간 반응시켜 18-27 사이클로 DNA를 증폭하였으며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% 아가로오스 겔에서 전기영동을 실시하고 브롬화 에티듐(ethidium bromide, EtBr)으로 염색하여 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator, SLB MylmaggerTM)에서 특정한 밴드를 확인하였다. 각 결과에 대한 분석은 LabWorks Imaging and Analysis Software(UVP labwork, USA)를 사용하여 수행하였다
3) 실험 결과
상기 파골 세포 분해와 관련된 단백질들의 발현 양상을 확인한 것을 도 20 및 도 21에 나타내었다. 도 20 및 도 21에 따르면, TRAP, MMP-9은 sRANKL 자극에 의해 발현양이 현저히 증가하였으며, 사이난디온 A와 함께 처리한 군에서는 감소하는 것으로 나타났다. 특히 100 μM의 사이난디온 A을 처리한 군에서 TRAP는 97%, MMP-9는 70%를 각각 저해한 것으로 나타났다.
또한, 상기 파골 세포 분화 유전자 발현 변화를 도 22 및 도 23에 나타내었다. 도 22 및 도 23에 따르면, TRAP, MMP-9은 RAW 264.7 세포에서 sRANKL 자극을 주지 않은 정상세포에 비해 발현량이 현저히 증가하였으며, 사이난디온 A와 함께 처리한 군에서는 감소하는 것으로 나타났다. 100 μM의 사이난디온 A를 처리한 군에서 TRAP는 64.6%, MMP-9는 91.6% 만큼 저해되었다. 그러나 또 하나의 마커인 cathepsin K는 약 7%만의 억제를 보여 억제 정도가 TRAP나 MMP-9에 비해서는 약한 것으로 나타났다.
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실시예
11>
백수오
추출물을 포함하는 말뼈
엑기스의
제조
1) 원료의 준비
상기 실시예 1에서 준비한 백수오근을 추출기에 투입한 후, 추출 용매로 60%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 백수오근 중량의 약 10배가 되도록 투입하였다. 1차 추출 시에는 상온에서 6시간 동안 순환 추출하였고, 추출이 완료된 추출물을 카트리지 필터(1 μm)로 여과하여 농축기로 이동시켰다. 이후 2차 추출 시에는 1차 추출의 잔재물에 상기 60%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 투입한 후 상온에서 6시간 동안 순환 추출하였고, 카트리지 필터(1μm)로 여과 및 농축하였다. 이후 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합한 후 50℃ 이하에서 농축하였다.
2) 말뼈
엑기스
제조
말 사골 및 말 정육과 혼합한 약재(결명자, 홍화자, 보리, 갈근, 당귀, 천궁, 작약, 삽주, 보령, 숙지황, 감초, 계피, 황기, 감귤피, 두충, 계지, 상지, 구기자, 지구자, 산사자, 인진, 오가목, 복분자 등 23 품목), 대추, 생강, 들깨가루 등의 원료를 넣고 원료 중량의 5배가 되도록 정제수를 추출 용매로 사용하여 고압 추출하였다. 이때 추출액은 고형분을 7% 함유하였다. 상기 추출액을 냉각시킨 후 원료통에 넣고 냉장 보관하였다. 이후, 상기 말뼈 엑기스 및 상기에서 제조한 백수오 농축액 및 타사에서 구입한 대추 농축액, 배 농축액을 각각 60% 20%, 10%, 10%가 되도록 혼합한 후, 추출기에 투입하여 잘 섞어 주었다. 이후 90℃ 이상에서 30분 이상 살균하고, 카트리지 필터(1 μm)로 여과하였다. 여과된 시제품 조성물을 1포 용량 단위에 따라 약 봉투에 충진한 후, 마지막으로 90℃ 이상의 온도에서 10분 이상 레토르트 살균하여 냉각시켜 말뼈 엑기스 시제품을 제조하였다.
3) 말뼈
엑기스의
관능 측정
상기에서 제조한 백수오 추출물 함유 말뼈 엑기스를 기존 말뼈 엑기스와 비교하기 위해 말뼈 엑기스의 관능 평가를 통상적으로 알려진 관능 평가 방법으로 수행하였다.
그 결과가 도 24 및 도 25에 나타난 바와 같았다. 분석 결과, 기존 말뼈 엑기스의 경우, 색과 향이 각각 3.83, 3.67로 상대적으로 우수하나, 맛과 전체적 기호도는 각각 2.95, 3.26으로 비교적 낮은 점수를 보였다. 반면에, 상기에서 제조한 본 발명의 말뼈 엑기스는 외관, 색, 맛, 전체적 기호도가 평균 3.47점 이상으로 매우 우수했다. 구체적으로, 전체적 기호도가 3.58로 가장 우수했으며, 다음으로 색과 향기, 맛이 각각 3.53, 3.53, 3.47로 모두 3점 이상의 결과를 보였다.
<
실시예
12>
백수오
추출물을 포함하는
제주말뼈환의
제조
백수오 추출물을 포함하는 건강기능식품의 또 다른 예로, 말뼈 분말, 말뼈 엑기스, 백수오 농축액, 대추 농축액, 백년초 분말, 효소처리 스테비아, 박하향 등의 원재료들을 하기 <표 2>에 나타난 것과 같은 배율로 혼합한 후, 통상적으로 알려진 환 제조 방법으로 말뼈환을 제조하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> hallsangreenpork
<120> Health Functional Food Comprising Horse-bone Extract and
Cynanchum Wilfordii concentrate, and Method for Preparing the
Same
<130> DP-2016-0009
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
cccttccgaa gtttctggca gcagc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggctgtcaga gcctcgtggc tttgg 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
cactacatcc tgacccactt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
atgctcctgc ttgagtatgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ttgacctcag cgctgagttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
cctgtagccc acgtcgtagc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
caggatgaca tgagcacc 18
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ctctgcagac tcaaactcca c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gtactccaga agaccagagg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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tgctggtgac aaccacggcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
aaatcactct ttaagaccag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ttattgaata gcagtgacag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
cctctcttgg tgtccataca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
atctctctgt accctctgca 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ctgtccagac caagggtaca gcct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
gtggtatagt gggacacata gtgg 24
<210> 17
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<400> 17
aggctgtgct gtccctgtat gc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
acccaagaag gaaggctgga aa 22
Claims (8)
- 말뼈 추출물 50 내지 80 중량% 및 백수오 농축액 20 내지 50 중량%를 포함하며, 상기 말뼈 추출물은 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 추출한 추출물이고, 상기 백수오 농축액은 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축한 농축액인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 제 1 항에 있어서, 상기 건강기능식품은 추가로 대추 농축액 또는 배 농축액 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 제 2 항에 있어서, 상기 건강기능식품은 말뼈 추출물 50 내지 80 중량%, 백수오 농축액 10 내지 40 중량%, 대추 농축액 5 내지 15 중량% 및 배 농축액 5 내지 15 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 제 1 항에 있어서, 상기 백수오 농축액은 백수오에 60 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축한 농축액인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 제 1 항에 있어서, 상기 백수오 농축액은 사이난디온 A를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 말 사골 또는 말 정육에 물을 첨가하여 말뼈 추출물을 제조하는 단계; 백수오에 50 내지 80 중량%의 에탄올을 포함하는 에탄올 수용액을 첨가하여 추출하고, 여과 후 농축하여 백수오 농축액을 제조하는 단계; 및 상기 말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품의 제조방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 건강기능식품은 상기 혼합하는 단계에서 대추 농축액 또는 배 농축액 중에서 선택된 하나 이상의 농축액을 더 포함하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품의 제조방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 건강기능식품은 상기 혼합하는 단계에서 말뼈 추출물 50 내지 80 중량%, 백수오 농축액 10 내지 40 중량%, 대추 농축액 5 내지 15 중량% 및 배 농축액 5 내지 15 중량%를 혼합하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품의 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160120700A KR101852788B1 (ko) | 2016-09-21 | 2016-09-21 | 말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 포함하는 건강기능식품 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160120700A KR101852788B1 (ko) | 2016-09-21 | 2016-09-21 | 말뼈 추출물 및 백수오 농축액을 포함하는 건강기능식품 및 이의 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20180032245A true KR20180032245A (ko) | 2018-03-30 |
| KR101852788B1 KR101852788B1 (ko) | 2018-05-03 |
Family
ID=61900145
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| KR (1) | KR101852788B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210065725A (ko) * | 2019-11-27 | 2021-06-04 | 한국 한의학 연구원 | 백수오 배양근 추출물을 유효성분으로 함유하는 골성장 촉진 또는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
-
2016
- 2016-09-21 KR KR1020160120700A patent/KR101852788B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| KR20210065725A (ko) * | 2019-11-27 | 2021-06-04 | 한국 한의학 연구원 | 백수오 배양근 추출물을 유효성분으로 함유하는 골성장 촉진 또는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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| KR101852788B1 (ko) | 2018-05-03 |
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