KR20180021080A - 단백질 분해 유도 태그 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자인 단백질 분해 유도 태그, 적어도 1개의 단백질 분해 유도 태그와 단백질에 결합하는 적어도 1개의 단백질 결합 분자의 컨쥬게이트인 단백질 분해 유도 분자, 및 그들의 용도를 제공한다.

Description

단백질 분해 유도 태그 및 그 용도
본 개시는, 단백질 분해 유도 태그 및 그 용도에 관한 것이다.
세포, 생체 등에서의 표적 단백질의 양(발현)을 컨트롤하는 것은, 표적 단백질의 기능 및 표적 단백질이 관여하는 생명 현상을 해석하는데 있어서 매우 유용하다. 표적 단백질이 질환의 원인인 경우에는, 표적 단백질의 양을 감소시킴으로써, 질환을 예방 또는 치료하는 것도 가능해진다고 생각할 수 있다.
종래에, 표적 단백질의 양을 DNA 레벨에서 조작하는 기술로서, 표적 단백질을 코딩하는 유전자를 결손시키는 유전자 녹아웃(knock-out) 기술이 알려져 있다. 또한, 표적 단백질의 양을 RNA 레벨에서 조작하는 기술로서 siRNA(small interfering RNA)를 이용하여 표적 단백질의 mRNA를 분해하는 RNAi(RNA interference) 기술이 알려져 있다.
그러나, 유전자 녹아웃 기술은, 시간 및 비용의 문제 뿐 아니라, 생명 윤리상의 문제도 발생할 수 있다. 또한, 유전자 녹아웃 기술은, 표적 단백질의 유전자 자체를 결손시키는 기술이기 때문에, 의약에 응용할 수 없다.
한편, RNAi 기술은, 오프 타겟 효과의 문제가 있어, 표적 단백질의 양을 특이적으로 컨트롤하는 것은 어렵다. 또한, RNAi 기술은, siRNA의 전달이 어려워, 의약에 대한 응용에는 과제가 많다.
이러한 배경으로부터, 최근이 되어, 표적 단백질을 세포 내에서 분해함으로써, 표적 단백질의 양을 단백질 레벨에서 조작하는 기술이 주목받고 있다. 이 기술은, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 이용하는 유비퀴틴 의존적인 기술과, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 이용하지 않는 유비퀴틴 비의존적인 기술로 크게 나뉘어진다.
유비퀴틴 의존적인 기술로서는, 표적 단백질에 결합하는 분자와 유비퀴틴 리가아제(E3)에 결합하는 분자를 연결한 복합체를 이용하는 기술이 알려져 있다(예를 들어, 일본 특허공개공보 2013-056837호, 미국 특허명세서 제 7208157호, Itoh 등의 논문(Itoh, Y. et al., "Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown. ", Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 3229-3241), Demizu 등의 논문(Demizu, Y. et al., "Design and synthesis of estrogen receptor degradation inducer based on a protein knockdown strategy. ", Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012, 15, 1793-1796), 및 Hines 등의 논문(Hines, J. et al., "Posttranslational protein knockdown coupled to receptor tyrosine kinase activation with phosphoPROTACs. ", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013, 110(22), 8942-8947)을 참조). 이 기술은, 상기 복합체를 통해 표적 단백질과 유비퀴틴 리가아제를 연결시켜, 표적 단백질을 특이적으로 유비퀴틴화하여 프로테아솜에 의한 분해로 유도하는 것이다. 그리고, 상기 복합체는, SNIPER(Specific and Nongenetic IAP-dependent Protein ERaser), PROTAC(PROteolysis TArgeting Chimera) 등으로 불리는 경우도 있다.
한편, 유비퀴틴 비의존적인 기술로서는, 표적 단백질에 결합하는 분자와 소수성 태그를 연결한 복합체를 이용하는 기술이 알려져 있다(예를 들어, 국제 공개공보 제 2012/003281호, Long 등의 논문(Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation. ", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637), 및 Neklesa 등의 논문(Neklesa, T.K. et al., "Greasy tags for protein removal. ", Nature, 2012, 487, 308-309)을 참조). 이 기술은, 상기 복합체와 표적 단백질을 결합시킴으로써, 표적 단백질이 부분적으로 언폴딩(unfolding)된 상태를 모방하여, 프로테아솜에 의한 분해로 유도하는 것으로 여겨지고 있다.
그러나, 표적 단백질에 결합하는 분자와 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 분자를 연결한 복합체를 이용하는 상술한 유비퀴틴 의존적인 기술은, 범용성이 낮다고 하는 문제가 있다. 즉, 유비퀴틴 리가아제는 포유류에서는 1000종류 이상 존재하고, 표적 단백질의 인식에 중요한 역할을 하고 있으므로, 표적 단백질에 맞추어 복합체를 설계할 필요가 있다.
또한, 표적 단백질에 맞추어 복합체를 설계할 필요가 있으므로, 표적 단백질은 기존에 알려진 것이 아니면 안되고, 예를 들어, 분해된 단백질 중에서 표적 단백질을 동정하는 도구에 응용하는 것은 어렵다.
한편, 표적 단백질에 결합하는 분자와 소수성 태그를 연결한 복합체를 이용하는 상술한 유비퀴틴 비의존적인 기술은, 소수성 태그에 기인하여, 세포막 투과성이 낮고, 세포 독성이 높다는 문제가 있다.
본 개시는, 상기와 같은 사정을 감안하여, 표적 단백질의 분해를 유도하는 신규 단백질 분해 유도 태그 및 그 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 구체적인 수단에는, 아래의 실시형태가 포함된다.
<1> 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자인 단백질 분해 유도 태그.
<2> 프로테아제 저해제의 프로테아제 저해 활성을 활성 상실(失活)시킨 구조를 갖는 <1>에 기재된 단백질 분해 유도 태그.
<3> 상기 프로테아제가 프로테아솜인 <1>에 기재된 단백질 분해 유도 태그.
<4> 프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킨 구조를 갖는 <3>에 기재된 단백질 분해 유도 태그.
<5> 상기 프로테아솜 저해 활성이, 카스파제 유사활성, 트립신 유사활성, 및 키모트립신 유사활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 저해 활성인 <4>에 기재된 단백질 분해 유도 태그.
<6> 후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자를 선발하는 공정을 포함하는 단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법.
<7> 상기 프로테아제가 프로테아솜인 <6>에 기재된 단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법.
<8> 프로테아제 저해제의 활성 부위의 구조를 개변하여, 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시키는 공정을 포함하는 단백질 분해 유도 태그의 제조 방법.
<9> 후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 분자를 프로테아제 저해제로서 선발하는 공정을 더 포함하는 <8>에 기재된 단백질 분해 유도 태그의 제조 방법.
<10> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그를 2종 이상 포함하는 단백질 분해 유도 태그 라이브러리.
<11> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 적어도 1개의 단백질 분해 유도 태그와 단백질에 결합하는 적어도 1개의 단백질 결합 분자의 컨쥬게이트인 단백질 분해 유도 분자.
<12> <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자를 2종 이상 포함하는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리.
<13> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, 또는 <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물.
<14> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, 또는 <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정을 포함하는 표적 단백질의 분해 방법.
<15> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, 또는 <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정을 포함하는 표적 단백질의 기능 해석 방법.
<16> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, 또는 <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도하는 공정; 및
상기 단백질 분해 유도 태그 또는 상기 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도된 단백질을 동정하는 공정;을 포함하는 표적 단백질의 동정 방법.
<17> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, 또는 <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정; 및
상기 표적 단백질 이외의 활성 또는 발현이 변화된 단백질을 동정하는 공정;을 포함하는 표적 단백질을 통한 경로 분자의 동정 방법.
<18> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, <10>에 기재된 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자, 또는 <12>에 기재된 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 표적 단백질이 존재하는 계에 공급하여, 상기 표적 단백질의 분해를 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하는 공정을 포함하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자의 스크리닝 방법.
<19> 상기 표적 단백질이 질환 원인 물질이며, 상기 표적 단백질의 분해를 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 질환의 예방 또는 치료 성분 후보로서 선발하는 <18>에 기재된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자의 스크리닝 방법.
<20> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, <10>에 기재된 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자, 또는 <12>에 기재된 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 개선시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하는 공정을 포함하는 질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법.
<21> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, <10>에 기재된 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자, 또는 <12>에 기재된 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 악화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발하는 공정을 포함하는 질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법.
<22> <1>~<5> 중 어느 한 항에 기재된 단백질 분해 유도 태그, <10>에 기재된 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, <11>에 기재된 단백질 분해 유도 분자, 또는 <12>에 기재된 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 변화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발하는 공정을 포함하는 질환 관련 단백질의 특정 방법.
본 개시에 의하면, 표적 단백질의 분해를 유도하는 신규 단백질 분해 유도 태그 및 그 용도를 제공할 수 있다.
도 1은 실시예에서 사용한 플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)의 플라스미드 맵(plasmid map)을 나타내는 도면이다.
도 2a는 TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2b는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 TMP-CiKD_Bortezomib 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 열 이동 분석(shift assay) 결과를 나타내는 도면이다.
도 4a는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β1에 대한, TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 4b는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β2에 대한, TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 4c는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β5에 대한, TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 5a는 TMP-CiKD_ALLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 5b는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 TMP-CiKD_ALLN 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 7a는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β1에 대한, TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 7b는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β2에 대한, TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 7c는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β5에 대한, TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 8a 는 TMP-CiKD_MLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 8b는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 8c는 TMP-CiKD_MLN 및 보르테조밉을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 첨가한 HeLa 세포에서의 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 10a는 MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 첨가한 HeLa 세포에 있어서, 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석에 의해 검출된 밴드의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 10b는 MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 첨가한 HeLa 세포에 있어서, 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석에 의해 검출된 밴드를 나타내는 도면이다.
도 11은 MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 투여한 마우스 개체의 간 조직 추출물에서의 내재 발현 표적 단백질(마우스 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 12a는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β1에 대한, TMP-CiKD_DMT 및 MG-132의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 12b는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β2에 대한, TMP-CiKD_DMT 및 MG-132의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 12c는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β5에 대한, TMP-CiKD_DMT 및 MG-132의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 13은 TMP-CiKD_DMT 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 14a는 TMP-CiKD_DMT를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 14b는 TMP-CiKD_DMT를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 14c는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 15a는 TMP-CiKD_DMT, TMP, 또는 TMP-CiKD_DMT 및 보르테조밉을 첨가한 HeLa 세포에 있어서, 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석에 의해 검출된 밴드의 정량 결과를 나타내는 도면이다.
도 15b는 TMP-CiKD_DMT, TMP, 또는 TMP-CiKD_DMT 및 보르테조밉을 첨가한 HeLa 세포에 있어서, 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석에 의해 검출된 밴드를 나타내는 도면이다.
도 16은 TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, TMP-CiKD_Bortezomib, 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 아래의 실시 형태에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서의 「단백질」은, 아미노산 잔기 수가 2이상일 수도 있고, 이른바 「펩티드」도 포함된다.
본 명세서에 있어서 「~」를 이용하여 나타낸 수치 범위는, 「~」 앞뒤에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 「공정」이라는 말에는, 다른 공정에서 독립한 공정뿐 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우에도 그 공정의 목적이 달성되면, 해당 공정도 포함된다.
<단백질 분해 유도 태그>
본 개시의 단백질 분해 유도 태그는, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자이다. 단백질 분해 유도 태그는, 직접적으로 결합, 또는 단백질 결합 분자를 통해 간접적으로 결합한 단백질을 프로테아제에 의한 분해(녹다운)로 유도하기 위해 이용된다. 단백질 분해 유도 태그는, 표적 단백질과 결합 가능한 경우에는 단독으로, 표적 단백질과 결합 가능하지 않은 경우에는 표적 단백질에 결합하는 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트(후술하는 단백질 분해 유도 분자)로 함으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고(즉, 유비퀴틴 비의존적으로), 표적 단백질을 프로테아제에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능하다.
그리고, 단백질 분해 유도 태그가 표적 단백질과 결합 가능하다는 것은, 단백질 분해 유도 태그가 공유결합, 수소결합, 소수 결합, 반데르발스 힘 등에 의해 표적 단백질과 결합 가능하면 되고, 결합 양태는 제한되지 않는다.
아래에서는, 이 단백질 분해 유도 태그를 CiKD(Chemical interaction and KnockDown) 태그라고도 부른다.
프로테아제로서는 특별히 제한되지 않고, 프로테아제 활성을 갖는 모든 분자를 들 수 있다. 예를 들어, 프로테아솜과 같은 복합체형 프로테아제일 수도 있고, 프로테아솜 이외의 프로테아제일 수도 있다. 또한, 프로테아제 활성을 갖는 한, 프로테아솜의 일부분일 수도 있다.
프로테아솜으로서는, 예를 들어, 26S 프로테아솜, 면역 프로테아솜, 및 흉선 프로테아솜을 들 수 있다.
26S 프로테아솜은, 20S 프로테아솜에 19S 프로테아솜이 2개 결합한 것이다. 20S 프로테아솜은, α1~α7의 7개의 서브유닛으로 구성되는 α링과 β1~β7의 7개의 서브유닛으로 구성되는 β링이, αββα의 순서로 겹쳐진 통 모양 구조를 하고 있고, β1, β2, 및 β5가 각각 카스파제 유사활성, 트립신 유사활성, 및 키모트립신 유사활성이라고 하는 촉매 활성을 발휘한다.
면역 프로테아솜은, 촉매 서브유닛 β1, β2, 및 β5가 각각 β1i, β2i, 및 β5i로 치환된 것이다(Science, 1994, 265, 1234-1237).
흉선 프로테아솜은, β1i 및 β2i와 함께, 흉선 피질 상피 세포(cTEC) 특이적으로 발현하는 β5t가 삽입된 것이다(Science, 2007, 316, 1349-1353).
또한, 프로테아솜 이외의 프로테아제로서는, β-세크레타아제, γ-세크레타아제, 아미노펩티다아제, 안지오텐신 변환 효소, 브로멜라인, 카르파인 I, 카르파인 II, 카복시펩티다아제 A, 카복시펩티다아제 B, 카복시펩티다아제 P, 카복시펩티다아제 Y, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 13, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 D, 카텝신 G, 카텝신 L, 키모트립신, 클로스트리파인, 콜라게나아제, 보체 C1r, 보체 C1s, 보체 B인자, 보체 D인자, 디펩티딜펩티다아제 I, 디펩티딜펩티다아제 II, 디펩티딜펩티다아제 IV, 디스파제, 엘라스타아제, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Glu-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 피신, 그란자임 B, 칼리크레인, 류신아미노펩티다아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 메탈로프로테아제, 파파인, 펩신, 플라스민, 프로카스파제 3, 프로나아제 E, 프로테이나제 K, 레닌, 서몰리신, 트롬빈, 트립신, 세포질 알라닐아미노펩티다아제, 엔케팔리나아제, 네프릴리신 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「프로테아제에 대하여 친화성을 갖는다」란, 예를 들어, 프로테아제에 대하여 공유결합, 수소결합, 소수 결합, 반데르발스 힘 등에 의해 결합 가능한 것을 의미한다. 단백질 분해 유도 태그의 존재하에 있어서 프로테아제의 열안정성이 변화하는 경우, 단백질 분해 유도 태그는 프로테아제와 상호 작용 가능하다고 판단할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 「프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는다」란, 예를 들어, 프로테아제의 분해 활성 부위(site)에 공유결합하지 않는 것을 의미한다. 단백질 분해 유도 태그의 존재하에서도 프로테아제에 의해 단백질이 분해되고, 추가로 프로테아제 저해제를 공존시키면 단백질의 분해가 저해되는 경우, 단백질 분해 유도 태그는 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는다고 판단할 수 있다.
단백질 분해 유도 태그로서는, 저분자 화합물, 천연물, 펩티드 등을 들 수 있다. 단백질 분해 유도 태그의 분자량은, 예를 들어, 50~5000 범위 내이다.
단백질 분해 유도 태그의 구조는, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 것인 한, 특별히 제한되지 않는다. 단백질 분해 유도 태그는, 후보 분자 중에서 후술하는 스크리닝 방법에 따라 얻을 수도 있고, 또한, 후술하는 제조 방법에 따라 제조할 수도 있다.
어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는, 예를 들어, 하기 식 (I)로 표시되는 구조로 할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00001
식 (I) 중, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 탄소수 1~20의 탄화수소기, 탄소수 1~20의 알콕시기, 탄소수 6~20의 아릴옥시기, 하이드록시기, 카복시기, 아미노기, 또는 할로게노기(halogeno group)를 나타낸다.
탄화수소기로서는, 알킬기, 알케닐기, 아릴기, 이들의 조합 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 메틸기, 에틸기 등의 탄소수 1~20의 알킬기;비닐기, 알릴기 등의 탄소수 2~20의 알케닐기;페닐기, 나프틸기 등의 탄소수 6~20의 아릴기;벤질기, 페네틸기 등의 탄소수 7~20의 아릴알킬기;톨릴기, 자일릴기 등의 탄소수 7~20의 알킬 아릴기; 등을 들 수 있다.
할로게노기로서는, 플루오로기, 클로로기, 브로모기 등을 들 수 있다.
다른 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는, 프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킨 구조로 할 수 있다. 프로테아솜 저해 활성으로서는, 보다 구체적으로는, 카스파제 유사활성, 트립신 유사활성, 및 키모트립신 유사활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 저해 활성을 들 수 있다.
여기서, 「프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킨 구조」에는, 프로테아솜 저해 활성을 완전히 소실시킨 구조 뿐 아니라, 프로테아솜 저해 활성을 감약(減弱)시킨 구조도 포함된다. 어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는, 카스파제 유사활성, 트립신 유사활성, 및 키모트립신 유사활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 50% 저해 농도(IC50)가, 원래의 프로테아솜 저해제의 50% 저해 농도(IC50)의 2배 이상이다.
프로테아솜 저해제로서는, 프로테아솜 저해 활성을 갖는 모든 화합물을 사용할 수 있다. 프로테아솜 저해제는, 프로테아솜(복합체형 프로테아제)에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아솜에 의한 단백질의 분해를 저해하는 화합물이다. 따라서, 프로테아솜 저해제의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환하여 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아솜 저해제는, 항암제 등으로서 연구가 진행되고 있고, 의약품으로서 인가가 끝난 화합물 및 임상시험 중의 화합물이 많이 존재한다. 또한, 프로테아솜 저해제는, 분자량이 비교적 작고, 소수성이 낮은 것이 많아, 세포막 투과성, 세포 독성 등의 문제도 생기기 어렵다. 그러므로, 프로테아솜 저해제를 바탕으로 단백질 분해 유도 태그를 합성하는 것은, 매우 합리적이면서도 효율적이다.
프로테아솜 저해제의 일예를 아래의 표 1 및 표 2에 나타낸다. 표 1 및 표 2에 나타내는 프로테아솜 저해제는, 모두 20S 프로테아솜에 대하여 친화성을 갖는 20S 프로테아솜 저해제이다. 단, 본 실시 형태에서 사용 가능한 프로테아솜 저해제가 이들의 예에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00002
Figure pct00003
예를 들어, 붕소산(boronic acid)형 프로테아솜 저해제인 보르테조밉(Bortezomib)은, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 활성 부위인 보로닐기(boronyl group)가 20S 프로테아솜의 분해 활성 부위와 공유결합함으로써, 프로테아솜 활성을 저해하는 것이 알려져 있다(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115).
[화학식 2]
Figure pct00004
또한, 붕소산형 프로테아솜 저해제인 MLN9708 및 MLN2238은, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 활성 부위인 붕소산 에스테르 부위 또는 보로닐기가 20S 프로테아솜의 분해 활성 부위와 공유결합함으로써, 프로테아솜 활성을 저해하는 것이 알려져 있다(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115).
[화학식 3]
Figure pct00005
그러므로, 보르테조밉, MLN9708, 및 MLN2238의 활성 부위인 보로닐기 또는 붕소산 에스테르 부위를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환하여 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
그리고, CEP-18770 등의 다른 붕소산형 프로테아솜 저해제에 대해서도, 활성 부위를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환함으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
또한, 알데히드형 프로테아솜 저해제인 ALLN은, 하기 식에 나타내는 바와 같이, 활성 부위인 포르밀기가 20S 프로테아솜의 분해 활성 부위와 공유결합함으로써, 프로테아솜 활성을 저해하는 것이 알려져 있다(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115).
[화학식 4]
Figure pct00006
그러므로, ALLN의 활성 부위인 포르밀기를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환하여 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
그리고, MG-132, BSc-2118, PSI 등의 다른 알데히드형 프로테아솜 저해제에 대해서도, 활성 부위인 포르밀기를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환함으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킨 구조를 갖는 단백질 분해 유도 태그의 일예를 아래의 표 3 및 표 4에 나타낸다. 표 중의 R로 표시되는 1가의 기로서는, 카복시기, 탄소수 1~20의 알킬기, 탄소수 6~20의 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등을 들 수 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
프로테아솜 저해제의 다른 예를 아래의 표 5~표 10에 나타낸다. 이들의 프로테아솜 저해제에 대해서도, 상기와 동일하게 하여 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
다른 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는, 프로테아제 저해제(상술한 프로테아솜 저해제를 제외한다)의 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시킨 구조로 할 수 있다.
여기서, 「프로테아제 저해 활성을 활성 상실시킨 구조」에는, 프로테아제 저해 활성을 완전히 소실시킨 구조뿐 아니라 프로테아제 저해 활성을 감약시킨 구조도 포함된다. 어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는, 프로테아제 저해제의 저해 대상이 되는 프로테아제에 대한 50% 저해 농도(IC50)가, 원래의 프로테아제 저해제의 50% 저해 농도(IC50)의 2배 이상이다.
프로테아제 저해제로서는, 프로테아제 저해 활성을 갖는 모든 화합물을 사용할 수 있다. 프로테아제 저해제는, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 화합물이다. 따라서, 프로테아제 저해제의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환하여 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아제 저해제의 일예를 아래의 표 11~표 78에 나타낸다. 이들의 프로테아제 저해제의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환하여 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다. 단, 본 실시 형태에서 사용 가능한 프로테아제 저해제가 이들의 예에 한정되는 것은 아니다. 프로테아제 및 프로테아제 저해제에 대해서는, 필요에 따라, 기존의 데이터베이스(예를 들어, "MEROPS-the peptidase database"(http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml))의 정보를 참조할 수 있다.
Figure pct00015
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Figure pct00081
Figure pct00082
그리고, 이상의 설명에서는, 편의상, 프로테아솜 저해제와 프로테아솜 저해제 이외의 프로테아제 저해제를 구별했지만, 프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제 양자의 활성을 저해 가능한 화합물도 알려져 있다. 따라서, 이러한 화합물을 이용함으로써, 프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제 양자에 대하여 친화성을 갖는 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제 양자의 활성을 저해 가능한 화합물의 일예를 하기 표 79에 나타낸다. 후술하는 실시예 10에서는, 표 79의 No. 1에 나타내는 카르파인 저해제(ALLN)의 프로테아제(프로테아솜) 저해 활성을 활성 상실시킨 단백질 분해 유도 태그를 이용하고 있다. 단, 프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제 양자의 활성을 저해 가능한 화합물은 이들의 예에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00083
다른 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그로서 프로테아솜 활성화제를 사용할 수 있다. 프로테아솜 활성화제는, 프로테아솜(복합체형 프로테아제)에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아솜에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 화합물로, 단백질 분해 유도 태그로서 사용할 수 있다. 즉, 본 개시에 의하면, 프로테아솜 활성화제의 단백질 분해 유도 태그로서의 사용이 제공된다.
프로테아솜 활성화제의 일예를 아래의 표 80~표 82에 나타낸다. 단, 본 실시 형태에서 사용 가능한 프로테아솜 활성화제가 이들의 예에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
<단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법>
본 개시의 단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법은, 후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자를 선발하는 공정을 포함하는 것이다. 어떤 양태에서는, 프로테아제는 프로테아솜(복합체형 프로테아제)이다.
후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자를 선발하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 아래의 방법을 채용할 수 있다.
우선, 후보 분자를 준비한다. 후보 분자로서는, 화합물 라이브러리, 약제 라이브러리, 천연물 라이브러리 등의 라이브러리를 이용할 수 있다. 후보 분자는, 고속대량스크리닝(High Throughput Screening; HTS) 용 플레이트, 마이크로 어레이 플레이트, 금속 플레이트 등의 각 웰에 고정화해 두는 것이 바람직하다.
이어서, 각 웰에 고정화된 후보 분자에 대하여, 형광 색소, 핵산(mRNA 또는 DNA) 등으로 표지된 프로테아제를 작용시킨 후, 각 웰을 세정한다. 프로테아제의 형광 색소에 의한 표지에는, GFP(Green Fluorescent Protein)와의 융합 단백질, C말단 라벨링에 의한 표지 등을 이용할 수 있다. 또한, 프로테아제의 핵산에 의한 표지에는, IVV(in vitro virus)법(mRNA 디스플레이법이라고도 불린다), DNA 디스플레이법 등의 디스플레이법 등을 이용할 수 있다.
그리고, 프로테아제의 표지를 바탕으로, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 분자를 특정한다. 프로테아제가 형광 색소로 표지되어 있는 경우, 형광을 검출함으로써, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 분자를 특정할 수 있다. 또한, 프로테아제가 mRNA로 표지되어 있는 경우, 역전사 PCR에 의해 핵산의 서열을 검출함으로써, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 분자를 특정할 수 있다.
이어서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 분자 중에서, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자를 특정한다. 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는지 아닌지의 평가에는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법을 채용할 수 있다.
<단백질 분해 유도 태그의 제조 방법>
본 개시의 단백질 분해 유도 태그의 제조 방법은, 프로테아제 저해제의 활성 부위의 구조를 개변하여, 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시키는 공정을 포함하는 것이다. 어떤 양태에서는, 프로테아제 저해제는 프로테아솜 저해제이며, 프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킴으로써 단백질 분해 유도 태그를 제조한다.
상술한 바와 같이, 프로테아제 저해제는, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 화합물이다. 따라서, 프로테아제 저해제의 활성 부위의 구조를 개변하여, 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 제조할 수 있다.
단백질 분해 유도 태그의 제조에 이용하는 프로테아제 저해제는, 이미 알려진 프로테아제 저해제일 수도 있고, 후보 분자 중에서 스크리닝에 의해 얻은 것일 수도 있다. 즉, 단백질 분해 유도 태그의 제조 방법은, 후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 분자를 프로테아제 저해제로서 선발하는 공정을 더 포함하고 있을 수도 있다.
예를 들어, 상술한 단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법에서는, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 분자 중에서, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자를 특정하므로, 스크리닝 과정에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 분자(프로테아제 저해제)를 특정하게 되는 경우도 된다. 따라서, 이와 같이 스크리닝에 의해 얻어진 프로테아제 저해제를 이용하여, 단백질 분해 유도 태그를 제조할 수도 있다.
<단백질 분해 유도 태그 라이브러리>
본 개시의 단백질 분해 유도 태그 라이브러리는, 상술한 단백질 분해 유도 태그를 2종 이상 포함하는 것이다. 단백질 분해 유도 태그 라이브러리는, 후술하는 스크리닝 방법 등에 이용하는 것이 가능하다.
<단백질 분해 유도 분자>
본 개시의 단백질 분해 유도 분자는, 상술한 적어도 1개의 단백질 분해 유도 태그와 단백질에 결합하는 적어도 1개의 단백질 결합 분자의 컨쥬게이트이다. 이 단백질 분해 유도 분자에 의하면, 단백질 결합 분자와 표적 단백질을 결합시킴으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고, 표적 단백질을 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능해진다(예를 들어, 후술하는 실시예 2, 7, 12, 15, 16, 21~23을 참조).
그리고, 단백질 결합 분자와 표적 단백질의 결합 양태로서는, 공유결합, 수소결합, 소수 결합, 반데르발스 힘 등을 들 수 있고, 특별히 제한되지 않는다.
표적 단백질로서는, 예를 들어, 세포 내 또는 세포막에 존재하는 단백질을 들 수 있다. 표적 단백질은, 변이에 의해 생성된 변이 단백질일 수도 있고, 전좌(轉座) 등에 의해 생성된 융합 단백질일 수도 있다. 또한, 표적 단백질은, 내인성 단백질일 수도 있고, 바이러스, 세균 등에 유래하는 외래성 단백질일 수도 있다. 또한, 표적 단백질은, 어떠한 요인에 의해 분해가 정체되어 축적된 단백질일 수도 있다. 어떤 양태에서는, 표적 단백질은, 세포 주기, 신호 전달, 세포 분화, 세포 탈분화, 세포 증식, 또는 사이토카인 등의 생리 활성 물질의 산생(産生)에 관여하는 단백질이다.
그리고, 표적 단백질은, 미리 특정되어 있지 않을 수도 있다. 단백질 분해 유도 분자를 이용함으로써, 후술과 같이 미지의 표적 단백질을 동정할 수 있다.
단백질 결합 분자로서는, 저분자 화합물, 항체, 펩티드 등의 의약;사이토카인, 성장 인자, 호르몬 등 내인성 생리 활성 물질;천연물, 대사물, 식물 성분, 식품 성분 등을 들 수 있다.
표적 단백질 중에는, 결합하는 분자(저해제 등)가 알려져 있는 것도 존재하므로(예를 들어, 국제 공개공보 제 2008/123266호 참조), 이러한 이미 알려진 분자를 단백질 결합 분자로서 사용할 수 있다. 표적 단백질에 결합하는 분자가 미지인 경우에는, 고속대량스크리닝(HTS)에 의해, 결합하는 분자를 스크리닝할 수도 있다. 또한, 표적 단백질과 결합하는 항체를 제작하여, 이것을 단백질 결합 분자로서 사용할 수도 있다.
단백질 분해 유도 태그와 단백질 결합 분자의 컨쥬게이트의 양식은, 단백질 분해 유도 태그의 프로테아제와의 친화성, 및 단백질 결합 분자의 단백질과의 결합성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다.
단백질 분해 유도 분자는, 예를 들어, 적어도 1개의 단백질 분해 유도 태그와 적어도 1개의 단백질 결합 분자가 연결된 구조로 할 수 있다. 단백질 분해 유도 분자는, 1개의 단백질 분해 유도 태그와 1개의 단백질 결합 분자가 연결된 구조일 수도 있고, 1개의 단백질 분해 유도 태그와 복수의 단백질 결합 분자가 연결된 구조일 수도 있고, 복수의 단백질 분해 유도 태그와 1개의 단백질 결합 분자가 연결된 구조일 수도 있고, 복수의 단백질 분해 유도 태그와 복수의 단백질 결합 분자가 연결된 구조일 수도 있다. 어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 분자는, 1개의 단백질 분해 유도 태그와 1개의 단백질 결합 분자가 연결된 구조이다.
단백질 분해 유도 태그에서의 단백질 결합 분자와의 연결 위치는, 프로테아제와의 친화성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 단백질 분해 유도 태그가, 상술한 바와 같이, 프로테아제 저해제(예를 들어, 프로테아솜 저해제)의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환한 구조인 경우, 이 치환한 다른 구조 부분에 있어서 단백질 결합 분자와 연결할 수 있다. 구체적으로, 프로테아제 저해제의 활성 부위를 카복시기로 치환한 경우, 카복시기를 통해 단백질 결합 분자와 연결할 수 있다.
한편, 단백질 결합 분자에서의 단백질 분해 유도 태그와의 연결 위치는, 단백질과의 결합성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다.
그리고, 단백질 분해 유도 태그 및 단백질 결합 분자는, 서로 연결 가능한 구조일 수도 있다. 단백질 분해 유도 태그와 단백질 결합 분자를 직접 연결하는 것이 어려운 경우에는, 서로 연결 가능하게 하는 구조를, 단백질 분해 유도 태그 및 단백질 결합 분자 중 적어도 한쪽에 도입하는 것도 생각할 수 있다.
예를 들어, 단백질 결합 분자로서는, 표적 단백질에 결합하는 이미 알려진 분자를 사용할 수 있지만, 이 이미 알려진 분자와 단백질 분해 유도 태그를 직접 연결하는 것이 어려운 경우도 가정할 수 있다. 이러한 경우에는, 단백질 분해 유도 태그와 연결 가능한 구조를 해당 이미 알려진 분자에 도입하여, 단백질 결합 분자로서 사용할 수도 있다.
<단백질 분해 유도 분자 라이브러리>
본 개시의 단백질 분해 유도 분자 라이브러리는, 상술한 단백질 분해 유도 분자를 2종 이상 포함하는 것이다. 단백질 분해 유도 분자를 2종 이상 포함하는 양태로서는, 단백질 분해 유도 태그의 종류는 동일하지만, 단백질 결합 분자의 종류가 상이한 2종 이상의 단백질 분해 유도 분자를 포함하는 양태, 단백질 결합 분자의 종류는 동일하지만, 단백질 분해 유도 태그의 종류가 상이한 2종 이상의 단백질 분해 유도 분자를 포함하는 양태, 단백질 분해 유도 태그 및 단백질 결합 분자의 종류가 상이한 2종 이상의 단백질 분해 유도 분자를 포함하는 양태 등을 들 수 있다.
단백질 분해 유도 분자 라이브러리의 제조 방법은 특별히 제한되지 않는다.
단백질 분해 유도 분자 라이브러리의 제조 방법의 일예로서는, 단백질 결합 분자의 라이브러리에 포함되는 각 단백질 결합 분자를, 단백질 분해 유도 태그와의 컨쥬게이트로 하는 방법을 들 수 있다. 단백질 결합 분자의 라이브러리로서는, 화합물 라이브러리, 약제 라이브러리, 천연물 라이브러리 등을 들 수 있다. 예를 들어, 화학 반응, 가교 반응 등을 이용하여, 단백질 결합 분자의 라이브러리에 포함되는 각 단백질 결합 분자와 단백질 분해 유도 태그를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 제조할 수 있다.
단백질 분해 유도 분자 라이브러리의 제조 방법의 다른 예로서는, 상술한 단백질 분해 유도 태그 라이브러리에 포함되는 각 단백질 분해 유도 태그를, 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트로 하는 방법을 들 수 있다.
단백질 분해 유도 분자 라이브러리는, 후술하는 스크리닝 방법 등에 이용하는 것이 가능하다.
<의약 조성물>
본 개시의 의약 조성물은, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 포함하는 것이다. 상술한 바와 같이, 단백질 분해 유도 태그는, 표적 단백질과 결합 가능한 경우에는 단독으로, 표적 단백질과 결합 가능하지 않은 경우에는, 표적 단백질과 결합 가능한 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트(단백질 분해 유도 분자)로 함으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고, 표적 단백질을 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능하다. 그러므로, 표적 단백질이 어떤 질환의 원인(질환 원인 물질)이 되어 있는 경우에는, 표적 단백질을 분해로 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용함으로써, 그 질환에 대한 의약 조성물을 제조할 수 있다. 그리고, 이 의약 조성물을 환자에게 투여함으로써, 환자의 체내에 있어서 표적 단백질을 분해로 유도하여, 질환의 예방 또는 치료에 연결하는 것이 가능해진다(예를 들어, 마우스 개체에서의 녹다운 실험인 후술하는 실시예 16을 참조).
표적 단백질의 형상를 바탕으로 창약(創藥)을 수행하는 종래의 창약 방법론에서는, 프로테옴(Proteome)의 약 75%가 의약이 되지 않는 표적(undruggable targets)이라고 말해지고 있다. 이 점에서, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의하면, 원리적으로 모든 단백질을 표적으로 할 수 있다.
여기서, 표적 단백질은, 진핵 또는 원핵 생물(동물, 식물, 균류, 효모, 대장균 등)의 단백질이다. 표적 단백질은, 변이에 의해 생성된 변이 단백질일 수도 있고, 전좌 등에 의해 생성된 융합 단백질일 수도 있다. 또한, 표적 단백질은, 내인성 단백질일 수도 있고, 바이러스, 세균 등에 유래하는 외래성 단백질일 수도 있다. 또한, 표적 단백질은, 어떠한 요인에 의해 분해가 정체되어 축적된 단백질일 수도 있다.
의약 조성물은, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자 이외의 성분을 함유하고 있을 수도 있다. 예를 들어, 의약 조성물은, 제제 소재로서 관용의 유기 또는 무기의 담체를 함유하고 있을 수도 있다. 이 담체는, 고형 제제에 있어서는, 부형제, 활택제, 결합제, 붕괴제 등으로서, 액상 제제에 있어서는, 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 등으로서 배합된다. 또한, 의약 조성물은, 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제 등의 제제 첨가물을 함유하고 있을 수도 있다.
의약 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않는다. 의약 조성물의 제형으로서는, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 트로키제, 시럽제, 유제, 현탁제, 필름제 등의 경구제;주사제, 점적제, 외용제, 좌제, 펠렛, 경비제, 경폐제(흡입제), 점안제 등의 비경구제; 등을 들 수 있다.
의약 조성물의 투여량은, 투여 대상, 투여 경로, 대상 질환, 증상 등에 따라 적절히 결정된다.
<표적 단백질의 분해 방법>
본 개시의 표적 단백질의 분해 방법은, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정을 포함하는 것이다.
단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포, 조직, 또는 장기를 배양하는 배지에 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 첨가할 수도 있다. 세포, 조직, 및 장기는, 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)를 갖는 진핵 또는 원핵 생물(동물, 식물, 균류, 효모, 대장균 등)에 유래하는 것이면 된다. 혹은, 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)를 갖는 진핵 또는 원핵 생물의 생체에, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수도 있다. 투여 대상으로서는, 인간 등의 영장류, 마우스(mouse), 랫(rat), 돼지, 개, 고양이 등을 들 수 있다. 혹은, 시험관 내(무세포)의 프로테아제 분해계(예를 들어, 프로테아솜 분해계)에 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 첨가할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 단백질 분해 유도 태그는, 표적 단백질과 결합 가능한 경우에는 단독으로, 표적 단백질과 결합 가능하지 않은 경우에는, 표적 단백질과 결합 가능한 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트(단백질 분해 유도 분자)로 함으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고, 표적 단백질을 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능하다.
<표적 단백질의 기능 해석 방법>
본 개시의 표적 단백질의 기능 해석 방법은, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정을 포함하는 것이다. 여기서, 표적 단백질의 기능 해석이란, 표적 단백질이 특정되어 있는 경우에, 그 기능을 해석하는 것을 의미한다. 표적 단백질은, 그 기능이 전혀 해명되어 있지 않은 것에 한정하지 않고, 기능의 일부가 해명되어 있는 것일 수도 있다.
단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포, 조직, 또는 장기를 배양하는 배지에 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 첨가할 수도 있다. 혹은, 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)를 갖는 진핵 또는 원핵 생물의 생체에, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수도 있다. 혹은, 시험관 내(무세포)의 기능 해석계에, 프로테아제 분해계(예를 들어, 프로테아솜 분해계)와 함께, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 첨가할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 단백질 분해 유도 태그는, 표적 단백질과 결합 가능한 경우에는 단독으로, 표적 단백질과 결합 가능하지 않은 경우에는, 표적 단백질과 결합 가능한 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트(단백질 분해 유도 분자)로 함으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고, 표적 단백질을 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들어, 진핵 혹은 원핵 생물 또는 그 세포를 이용했을 경우에는, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도한 후에, 세포 또는 생체의 표현형의 변화를 해석함으로써, 표적 단백질의 기능을 해석할 수 있다. 또한, 시험관 내(무세포)의 기능 해석계를 이용했을 경우에는, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도한 후에, 표적 단백질의 유무에 의한 분자 네트워크의 차이(변화)를 해석함으로써, 표적 단백질의 기능을 해석할 수 있다.
종래, 동물의 생체 내에서의 표적 단백질의 기능을 해석하는 경우에는, 유전자 녹아웃 마우스를 제작하는 것이 일반적이다. 그러나, 유전자 녹아웃 마우스의 제작에는 장기간(예를 들어, 1년 이상)을 필요로 한다는 문제가 있다. 최근, 게놈 편집 기술(CRISPR/CAS9)이 개발되기에 이르렀지만, 이 CRISPR/CAS9의 기술을 이용해도, 유전자 녹아웃 마우스의 제작에는 수개월 내지 반년의 기간을 필요로 한다. 이 점에서, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의하면, 표적 단백질을 단기간에 분해(녹다운)로 유도하여, 유전자 녹아웃 마우스를 제작했을 경우와 동등한 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의하면, 표적 단백질의 기능을 동적으로 해석하는 것도 가능하다.
<표적 단백질의 동정 방법>
본 개시의 표적 단백질의 동정 방법은, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도하는 공정; 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도된 단백질을 동정하는 공정;을 포함하는 것이다. 여기서, 표적 단백질의 동정이란, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 결합 분자에 결합하는 표적 단백질을 동정하는 것을 의미한다. 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 결합 분자는, 결합하는 표적 단백질이 전혀 알려지지 않은 것에 한정하지 않고, 표적 단백질의 일부가 알려져 있는 것일 수도 있다.
표적 단백질의 동정 방법에서는, 우선, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도한다.
단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상술한 표적 단백질의 분해 방법을 채용할 수 있다.
이어서, 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도된 단백질을 동정한다. 상술한 바와 같이, 단백질 분해 유도 태그는, 표적 단백질과 결합 가능한 경우에는 단독으로, 표적 단백질과 결합 가능하지 않은 경우에는, 표적 단백질과 결합 가능한 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트(단백질 분해 유도 분자)로 함으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고, 표적 단백질을 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들어, 세포로부터 단백질을 추출하여 프로테옴 해석을 수행하고, 양이 감소하고 있는 단백질을 특정함으로써, 표적 단백질을 동정할 수 있다.
<표적 단백질을 통한 경로 분자의 동정 방법>
본 개시의 표적 단백질을 통한 경로 분자의 동정 방법은, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정; 표적 단백질 이외의 활성 또는 발현이 변화된 단백질을 동정하는 공정;을 포함하는 것이다. 여기서, 표적 단백질을 통한 경로 분자의 동정이란, 표적 단백질이 개재하는 단백질 경로(신호 전달 경로 등)에서의, 표적 단백질 이외의 다른 단백질을 동정하는 것을 의미한다. 표적 단백질을 통한 경로 분자는, 전혀 알려지지 않은 것에 한정하지 않고, 그 일부가 알려져 있는 것일 수도 있다.
표적 단백질을 통한 경로 분자의 동정 방법에서는, 우선, 상술한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도한다.
단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상술한 표적 단백질의 분해 방법을 채용할 수 있다.
이어서, 표적 단백질 이외의 활성 또는 발현이 변화된 단백질을 동정한다. 상술한 바와 같이, 단백질 분해 유도 태그는, 표적 단백질과 결합 가능한 경우에는 단독으로, 표적 단백질과 결합 가능하지 않은 경우에는, 표적 단백질과 결합 가능한 단백질 결합 분자와의 컨쥬게이트(단백질 분해 유도 분자)로 함으로써, 표적 단백질의 유비퀴틴화를 통하지 않고, 표적 단백질을 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능하다. 이 때, 표적 단백질의 분해에 따라, 표적 단백질이 개재하는 단백질 경로상의 다른 단백질에 대해서도, 활성 또는 발현이 변화될 수 있다. 따라서, 활성 또는 발현이 변화되어 있는 다른 단백질을 특정함으로써, 표적 단백질을 통한 경로 분자를 동정할 수 있다.
그리고, 표적 단백질의 증가 또는 감소가 있는 질환의 원인이 되어 있는 경우에는, 표적 단백질을 통한 경로 분자를 동정함으로써, 질환의 메커니즘 해명에도 연결된다고 생각된다.
<단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자의 스크리닝 방법>
본 개시의 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자의 스크리닝 방법은, 상술한 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 표적 단백질이 존재하는 계(系)에 공급하여, 표적 단백질의 분해를 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하는 공정을 포함하는 것이다.
표적 단백질이 존재하는 계로서는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)를 갖는 진핵 또는 원핵 생물의 세포를 이용한 프로테아제 분해계(예를 들어, 프로테아솜 분해계)일 수도 있고, 시험관 내(무세포)의 프로테아제 분해계(예를 들어, 프로테아솜 분해계)일 수도 있다.
표적 단백질이 존재하는 계에 공급한, 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리 중에, 표적 단백질과 결합 가능한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자가 포함되어 있는 경우, 표적 단백질이 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도된다. 따라서, 스크리닝 시에는, 그러한 표적 단백질의 분해를 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하면 된다.
상기 스크리닝 방법에 의하면, 원리적으로, 임의의 표적 단백질을 분해로 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 얻을 수 있다. 또한, 표적 단백질이 어떤 질환의 원인(질환 원인 물질)이 되어 있는 경우에는, 표적 단백질을 분해로 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를, 그 질환의 예방 또는 치료 성분 후보로서 선발할 수 있다.
<질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법>
본 개시의 질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법의 일 양태는, 상술한 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 개선시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하는 공정을 포함하는 것이다.
또한, 본 개시의 질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법의 다른 양태는, 상술한 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 악화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발하는 공정을 포함하는 것이다.
질환 모델계로서는 특별히 제한되지 않고, 질환 모델 동물, 질환 모델 세포 등을 들 수 있다.
질환 모델계에 공급된, 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리 중에, 질환에 관련된 단백질(질환 관련 단백질)과 결합 가능한 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자가 포함되어 있는 경우, 질환 관련 단백질이 프로테아제(예를 들어, 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도된다.
질환 관련 단백질이 분해되는 결과, 질환의 증상이 개선되었을 경우에는, 그 질환 관련 단백질의 증가가, 질환의 발증(發症) 또는 진행에 관여하고 있을 가능성이 있다. 따라서, 질환의 증상을 개선시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발함으로써, 질환의 예방 또는 치료 성분 후보를 얻을 수 있다.
한편, 질환 관련 단백질이 분해되는 결과, 질환의 증상이 악화되었을 경우에는, 그 질환 관련 단백질의 감소가, 질환의 발증 또는 진행에 관여하고 있을 가능성이 있다. 따라서, 질환의 증상을 악화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발함으로써, 질환의 예방 또는 치료 성분 후보를 얻을 수 있다.
<질환 관련 단백질의 특정 방법>
본 개시의 질환 관련 단백질의 특정 방법은, 상술한 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 변화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발하는 공정을 포함하는 것이다.
질환 모델계에 단백질 분해 유도 태그, 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 단백질 분해 유도 분자, 또는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 공급하면, 질환 모델계 내에서의 단백질의 분해(녹다운)에 따라, 질환의 증상이 변화될 수 있다. 따라서, 질환의 증상을 변화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발함으로써, 질환 관련 단백질을 특정할 수 있다.
특정된 질환 관련 단백질에 관한 정보는, 예를 들어, 질환의 예방 또는 치료 성분의 개발에 이용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 한정되는 것은 아니다.
아래의 실시예에서 사용되는 화합물 등의 약칭은 아래와 같다.
ec:Escherichia coli
DHFR:Dihydrofolate reductase
TMP:Trimethoprim
H-Phe-OtBuㆍHCl:L-Phenylalanine t-butyl ester hydrochloride
DMF:N, N-Dimethylformamide
DMT-MM:4-(4,6-Dimethoxy-1, 3, 5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
TFA:Trifluoroacetic acid
H-Leu-OtBuㆍHCl:L-Leucine t-butyl ester hydrochloride
DIEA:N, N-Diisopropylethylamine
D-MEM:Dulbecco's modified eagle's medium
FBS:Fetal bovine serum
EDTA:Ethylenediamine tetraacetic acid
HA:Hemagglutinin
GFP:Green fluorescent protein
DsRed:Discosoma sp. red fluorescent protein
DMSO:Dimethyl sulfoxide
PBS:Phosphate buffered saline
TBS:Tris buffered saline
SDS:Sodium dodecyl sulfate
PAGE:Polyacrylamide gel ectrophoresis
BPB:Bromophenol blue
PVDF:Polyvinylidene difluoride
AMC:7-Amino-4-methylcoumarin
H-Gly-OtBuㆍHCl:L-Glycine t-butyl ester hydrochloride
PyBOP:1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino) phosphonium hexafluorophosphate
MTX:Methotrexate
DMA:N, N-Dimethylacetamide
BOP:1H-Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate
TEA:Triethylamine
HATU:O-(7-Azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate
GAPDH:Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
<실시예 1:단백질 분해 유도 태그로서 CiKD_Bortezomib을 이용하고, 단백질 결합 분자로서 TMP 유도체를 이용한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)의 합성>
실시예 1에서는, 하기 합성 반응식(scheme)에 따라, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_Bortezomib을 합성했다.
단백질 분해 유도 태그로서는, 보르테조밉(Bortezomib)의 활성 부위인 보로닐기를 카복시기로 치환한 Bortezomib-COOH(CiKD_Bortezomib)를 이용했다. 또한, 단백질 결합 분자로서는, 대장균 DHFR과 결합하는 디하이드로 엽산 리덕타아제 저해제인 TMP에 아미노기를 포함하는 관능기를 도입한 TMP 유도체(TMP-NH2)를 이용했다. 그리고, Bortezomib-COOH와 TMP-NH2를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_Bortezomib을 합성했다.
[화학식 5]
Figure pct00087
TMP-CiKD_Bortezomib의 합성 방법의 자세한 것은 아래와 같다.
(화합물 1의 합성)
가지형 플라스크에 피라진카복실산(152.8 mg, 1.23 mmol, 1 eq, Code No. 357-00042, 와코준야쿠코교(주)) 및 H-Phe-OtBuㆍHCl(253.8 mg, 0.98 mmol, 0.8 eq, Code No. 10Y830617, 와타나베카가쿠코교(주))을 투입하고, 탈수 DMF를 10mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DMT-MM(1.02 g, 3.69 mmol, 3 eq, Code No. 329-53751, 와코준야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 첨가하여 실온에서 18시간 교반했다. 반응 용액을 물로 희석하고, 아세트산 에틸로 3회 추출했다. 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류(留去)한 후, 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(헥산/클로로포름=1/1~0/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 1(482.3 mg, 1.47 mmol, quant.)을 얻었다.
(화합물 2의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 1(398.4 mg, 1.22 mmol)을 투입하고, 디클로로 메탄을 5mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, TFA를 7 mL 첨가하여 실온에서 2시간 교반했다. 용매를 감압 증류한 후, 진공 건조하여, 화합물 2(318.8 mg, 96 %)를 얻었다.
(화합물 3의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 2(271.3 mg, 1.00mmol, 1 eq) 및 H-Leu-OtBuㆍHCl(223.8 mg, 1.00mmol, 1 eq, Code No. 14G110356, 와타나베카가쿠코교(주))을 투입하고, 탈수 DMF를 10mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DIEA를 2 mL 첨가하여 용액을 중성으로 만들었다. 실온에서 5분간 교반한 후, DMT-MM(553.4 mg, 2.00mmol, 2 eq, Code No. 329-53751, 와코준야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 첨가하여 실온에서 3시간 교반했다. 냉각하에서 20mL의 10 질량% 식염수/0. 1N 염산 수용액을 첨가하여 아세트산 에틸로 3회 추출했다. 0.5N 염산 수용액, 이어서 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류한 후, 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(헥산/클로로포름=1/1~0/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 3(168.1 mg, 0.38 mmol, 38%)을 얻었다.
(화합물 4(Bortezomib-COOH)의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 3(157.3 mg, 0.36 mmol)을 투입하고, 디클로로 메탄을 5mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, TFA를 6 mL 첨가하여 실온에서 2시간 교반했다. 용매를 감압 증류한 후, 진공 건조하여, 화합물 4(Bortezomib-COOH)(179.6 mg, 0.48 mmol, quant.)를 얻었다.
(화합물 5(TMP-CiKD_Bortezomib)의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 4(Bortezomib-COOH)(55.7 mg, 0.15mmol, 1 eq) 및 별도 합성한 TMP-NH2(Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)(62.7 mg, 0.15mmol, 1 eq)를 투입하고, 탈수 DMF를 7 mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DIEA를 2 mL 첨가하여 용액을 중성으로 만들었다. 실온에서 5분간 교반한 후, DMT-MM(207.5mg, 0.75mmol, 5eq, Code No. 329-53751, 와코준야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 첨가하여 실온에서 3시간 교반했다. 냉각하에서 20mL의 10 질량% 식염수/0. 1N 염산 수용액을 첨가하여 아세트산 에틸로 3회 추출했다. 0.5N 염산 수용액, 이어서 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류한 후, 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=10/1)에 의해 분리 정제 처리를 수행했다. 이어서, TLC silica gel 60(Code No. HX264817, Merck)(클로로포름/메탄올=10/1)을 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 5(TMP-CiKD_Bortezomib)(2.3 mg, 0.0029 mmol, 2%, isolated yield)를 얻었다.
<실시예 2:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(FACS 해석)>
실시예 2에서는, TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, FACS 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비)
전배양 배지로서는, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(Code No. 041-29775, 와코준야쿠코교(주))에 10 질량% FBS(Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone) 및 1 질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(Code No. 168-23191, 와코준야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 준비했다. 그리고, 이 전배양 배지 중, HeLa 세포(Lot No. 60143948, ATCC)를 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다. 계대 배양 시의 배양 접시로서는, 직경 100mm의 Cell Culture Dish-Treated(Sterile, Non pyrogenic)(Code No. TR4002, TrueLine)를 이용했다. 계대 배양은 70%~80% 합류(confluent) 시에 수행하고, 트립신(0.25w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTAㆍ4Na Solution with Phenol Red)(Code No. 201-16945, 와코준야쿠코교(주)) 처리에 의해 세포를 박리한 후, 4분의 1 양의 세포를 10mL의 전배양 배지에서 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 표적 단백질인 대장균 DHFR(상세하게는, HA 태그를 통한 대장균 DHFR과 GFP의 융합 단백질) 또는 비교용의 DsRed를 일시적으로 과잉 발현시켜, TMP-CiKD_Bortezomib의 표적 단백질에 대한 작용을 평가했다.
플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)는, 브랜다이스 대학(미국)의 Lizbeth Hedstrom 교수로부터 제공받았다(Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation. ", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637). pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP의 플라스미드 맵을 도 1에 나타낸다. 이 플라스미드를 대장균에서 증폭한 후, Miniprep Kit(Code No. 27106, QIAGEN)으로 정제했다.
HeLa 세포에 대한 플라스미드 도입에는, 트랜스펙션 시약인 ScreenFectA(Code No. 297-73201, 와코준야쿠코교(주))를 이용했다. ScreenFectA의 Dilution Buffer를 2개의 1.5mL 튜브에 600μL씩 첨가했다. 그리고, 한쪽의 튜브에는 ScreenFectA의 Transfection Reagent를 30μL 첨가하고(용액 A), 다른 쪽의 튜브에는 플라스미드를 12μg 첨가하고(용액 B), 각각을 가볍게 피펫팅(pipetting)한 후, 실온에서 2분간 정치(靜置)했다. 용액 A와 용액 B를 가볍게 혼합하여, 실온에서 30분간 정치했다(용액 C). 트립신 처리에 의해 회수한 1. 2×105세포/24 mL의 세포 용액에 용액 C를 혼합하고, 24 웰 플레이트(Code No. TR5002, TrueLine, 니뽄제네틱스(주))에 4×104 세포/800μL/웰의 세포 밀도로 파종한 후, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)의 첨가)
아래와 같이 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가했다. 플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양 후, 전배양 배지를 제거하고, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(Code No. 045-32245, 와코준야쿠코교(주))에 1 질량% L-글루타민 용액(Code No. G7513, Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 각 웰당 300μL 첨가했다. 그리고, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. 소정 농도의 TMP-CiKD_Bortezomib을 함유하는 DMSO 용액을 각 웰당 3μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다.
그리고, 대조군으로서는, TMP-CiKD_Bortezomib을 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(FACS 해석에 의한 TMP-CiKD_Bortezomib의 표적 분해(녹다운)의 평가)
TMP-CiKD_Bortezomib(80μM) 또는 TMP(80μM)의 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, 37℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 2 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTAㆍ4Na Solution with Phenol Red)(와코준야쿠코교(주))을 각 웰당 200μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(Code No. 041-29775, 와코준야쿠코교(주))에 10 질량% FBS(Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone) 및 1 질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(Code No. 168-23191, 와코준야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 300μL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, 2 mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, 4℃의 FACS 버퍼(1 질량% FBS/PBS)를 500μL 첨가하여, 빙상에 정치했다.
유세포 분석(flow cytometry)에는 BD FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 세포 중에서의 GFR 및 DsRed의 발현을 정량했다. FACS 해석 직전에, 세포 용액을 구멍 지름 32μm의 메쉬를 통과시켜, FACS 튜브로 옮겼다. 해석 소프트 FLOWJO(토미디지털바이올로지(주))에 의해 세포 1개당 GFR/DsRed 비를 산출하여, 표적 분해에 의한 그래프의 이동으로부터, TMP-CiKD_Bortezomib에 의한 표적 분해(녹다운)의 효율을 확인했다.
TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 2a에 나타낸다. 또한, TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 2b에 나타낸다.
도 2a에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_Bortezomib(80μM)을 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 비교하여 그래프가 크게 왼쪽으로 이동하고 있어, 표적 단백질(대장균 DHFR)이 분해되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이동량으로부터 추측되는 분해 효율은 50%~60% 정도였다. 한편, 도 2b에 나타내는 바와 같이, TMP(80μM)를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 그래프가 겹쳐져, 표적 단백질이 분해되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 3:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)를 첨가한 HeLa 세포에서의, 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)와 강제 발현 표적 단백질(ecDHFR)의 친화성의 평가(열 이동 분석)>
실시예 3에서는, TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가한 HeLa 세포에서의, TMP-CiKD_Bortezomib과 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 친화성에 대하여, 열 이동 분석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비, HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로 HeLa 세포에 플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)를 도입한 후, 24 웰 플레이트에 파종했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)의 첨가)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가했다. 대조군으로서는, TMP-CiKD_Bortezomib을 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(열 이동 분석에 의한 TMP-CiKD_Bortezomib의 표적 친화성의 평가)
TMP-CiKD_Bortezomib(40μM) 또는 TMP(40μM)의 첨가 3시간 후, 배지를 제거하고, 37℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 2 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTAㆍ4Na Solution with Phenol Red)(와코준야쿠코교(주))을 각 웰당 200μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(Code No. 041-29775, 와코준야쿠코교(주))에 10 질량% FBS(Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone) 및 1 질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(Code No. 168-23191, 와코준야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 300μL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, 2 mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, CETSA 버퍼(TBS에 프로테아제 저해제인 cOmplete, Mini, EDTA-free(Roche)를 사용 직전에 첨가)를 180μL 첨가하여 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 9개의 1.5mL 튜브에 20μL씩 분주하고, 실온에서 30분간 정치했다. 정치 후, 9개의 튜브를 각각 38℃, 42℃, 46℃, 50℃, 54℃, 58℃, 62℃, 66℃, 또는 70℃에서 3분간 열처리하고, 실온에서 3분간 정치했다. 정치 후, 세포 용액을 액체 질소로 순간 동결하여, 빙상에서 융해시켰다. 이 동결 융해를 3회 반복한 후, 원심분리(13500rpm×20분간, 4℃)하여, 상청액(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(14 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 열차단(heat block)했다. 조제한 영동 샘플은, 각 웰당 17μL씩 적용(apply)했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 150V로 40분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 40분간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/High-salt TBS-T(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 씻어내고, 1% 탈지유/High-salt TBS-T 중에서 항체 반응을 수행했다. 항체로서는, Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity(3F10) Rat monoclonal antibody(25U/mL)(Roche)를 1500배 희석하여 이용했다. 실온에서 90분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 High-salt TBS(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저(luminoimejianalyzer) LAS-3000(후지필름(주))를 이용하여 검출했다.
TMP-CiKD_Bortezomib 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 대조군(DMSO)에서는 약 50℃까지 밖에 대장균 DHFR을 검출할 수 없었지만, TMP(40μM)를 첨가했을 경우에는, 대장균 DHFR과 TMP가 상호 작용함으로써, 약 54℃까지 대장균 DHFR을 검출할 수 있었다. 마찬가지로 TMP-CiKD_Bortezomib(40μM)을 첨가했을 경우에는, 대장균 DHFR과 TMP-CiKD_Bortezomib이 상호 작용함으로써, 약 54℃까지 대장균 DHFR을 검출할 수 있었다. 그리고, 프로테아솜 저해제인 보르테조밉 단독으로는, 대장균 DHFR과 상호 작용하는 일은 없었다.
이 결과로부터, TMP-CiKD_Bortezomib은, TMP-NH2와 CiKD_Bortezomib이 연결된 것이지만, TMP와 동일한 정도로 대장균 DHFR과의 친화성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성의 평가>
실시예 4에서는, TMP-CiKD_Bortezomib의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성을 평가했다.
평가에는, 20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold(Bioscience)를 이용하여 20S 프로테아솜의 β5(키모트립신 유사활성), β2(트립신 유사활성), 및 β1(카스파제 유사활성)의 각 β서브유닛에 특이적인 AMC 결합 프로테아솜 형광 기질의 C말단이 절단됨으로써 생성되는 AMC를 Multi-Detection Microplate Reader(Synergy HT, BIO-TEK)에 의해 측정했다. 측정 파장은, 여기광(Ex.)을 360nm, 형광(Em.)을 460nm로 했다.
β1(카스파제 유사활성), β2(트립신 유사활성), 및 β5(키모트립신 유사활성)의 각 프로테아솜 활성을 도 4a~도 4c에 나타낸다.
도 4a~도 4c에 나타내는 바와 같이, β1 및 β5에 대하여, TMP-CiKD_Bortezomib에서는, 보르테조밉 단독과 비교하여 저해 활성이 거의 약해져, 보르테조밉의 저해 활성이 활성 상실되어 있는 것을 확인할 수 있었다. β2에 대해서는, 보르테조밉에서는 그다지 저해되지 않는 것이 보고되어 있고(Kisselev, A.F. et al. Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115), 이 보고와 모순되지 않는 결과였다.
또한, β2 및 β5에 대하여, TMP-CiKD_Bortezomib의 농도 의존적으로 저해 활성이 높아지는 것으로부터, TMP-CiKD_Bortezomib과 프로테아솜의 친화성이 확인되었다.
<실시예 5:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_Bortezomib)의 50% 저해 농도(IC50)의 측정>
실시예 5에서는, TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉(Code No. sc-217785, Santa Cruz Biotechnology)에 대하여, 20S 프로테아솜의 β1, β2, 및 β5의 각 프로테아솜 활성에 대한 50% 저해 농도(IC50)를 측정했다.
50% 저해 농도(IC50)의 측정에는, 20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold(Bioscience)를 이용하여 20S 프로테아솜의 β5(키모트립신 유사활성), β2(트립신 유사활성), 및 β1(카스파제 유사활성)의 각 β서브유닛에 특이적인 AMC 결합 프로테아솜 형광 기질의 C말단이 절단됨으로써 생성되는 AMC를 Multi-Detection Microplate Reader(Synergy HT, BIO-TEK)에 의해 측정했다. 측정 파장은, 여기광(Ex.)을 360nm, 형광(Em.)을 460nm로 했다.
시험 화합물(TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉)은, 각각 아래의 표 83에 나타내는 6점의 농도로 조정했다.
Figure pct00088
시험 화합물과 20S 프로테아솜(0. 1μg)을 실온에서 30분간 인큐베이션했다. 거기에 발광 기질인 Suc-LLVY-AMC(β5에 의해 분해된다), Bz-VGR-AMC(β2에 의해 분해된다), 및 Z-LLE-AMC(β1에 의해 분해된다)를 각각 100μM가 되도록 첨가하여 실온에서 인큐베이션했다. 1시간 후에 프로테아솜 활성에 의해 생성한 AMC를 측정했다. 시험 화합물의 각각의 농도에서의 프로테아솜 분해 저해값을, 대조군(DMSO)과의 상대값으로서 구했다. 6점의 농도의 저해값을 이용하고, 해석 소프트웨어 ImageJ(NIH)에 의해 회귀 곡선을 작성하여, 4계수(a:맬서스 계수, b:혼잡 상수, c:기울기, d:절편)를 얻었다. 그리고, 얻어진 4계수 및 y=0.5(50% 저해)를 아래의 4계수 로지스틱 곡선(logistic curve)의 회귀식에 도입하여, x의 값(IC50)을 산출했다.
4계수 로지스틱 곡선의 회귀식:y=d+(a-d)/(1+(x/c)b)
TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉의 50% 저해 농도(IC50)를 아래의 표 84에 나타낸다.
Figure pct00089
표 84에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_Bortezomib은, 보르테조밉과 비교하여, β1, β2, 및 β5 모두에 대하여 50% 저해 농도(IC50)가 크게 증가하고 있어, 보르테조밉의 저해 활성이 활성 상실되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6:단백질 분해 유도 태그로서 CiKD_ALLN을 이용하고. 단백질 결합 분자로서 TMP 유도체를 이용한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)의 합성>
실시예 6에서는, 하기 합성 반응식에 따라, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_ALLN을 합성했다.
단백질 분해 유도 태그로서는, ALLN의 활성 부위인 포르밀기를 카복시기로 치환한 ALLN-COOH(CiKD_ALLN)를 이용했다. 또한, 단백질 결합 분자로서는, 실시예 1과 마찬가지로 TMP-NH2를 이용했다. 그리고, ALLN-COOH와 TMP-NH2를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_ALLN을 합성했다.
[화학식 6]
Figure pct00090
TMP-CiKD_ALLN의 합성 방법의 자세한 것은 아래와 같다.
(화합물 6(ALLN-COOH)의 합성)
가지형 플라스크에 ALLN(87.2 mg, 0.23 mmol, 1 eq, Code No. 07036-24, 나카라이테스크(주))을 투입하고, 탈수 DMF를 2 mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, Oxone(212.1 mg, 0.69 mmol, 3 eq, Code No. 228036, Sigma-Aldrich)을 반응 용액에 직접 첨가하여 실온에서 5시간 교반했다. 반응 용액을 물로 희석한 후, 클로로포름으로 3회 추출했다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류했다. 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=20/1~10/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 6(ALLN-COOH)(27.0mg, 0.068 mmol, 30%)을 얻었다.
(화합물 7(TMP-CiKD_ALLN)의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 6(ALLN-COOH)(26.8 mg, 0.067 mmol, 1 eq) 및 별도 합성한 TMP-NH2(Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)(26.0mg, 0.060mmol, 0.9 eq)를 투입하고, 탈수 DMF를 2 mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DIEA를 0. 1 mL 첨가하여 용액을 중성으로 만들었다. 실온에서 5분간 교반한 후, DMT-MM(30.0mg, 0.11 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 와코준야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 첨가하여 실온에서 2시간 교반했다. 냉각하에서 10mL의 10 질량% 식염수/0. 1N 염산 수용액을 첨가하여 아세트산 에틸로 3회 추출했다. 0.5N 염산 수용액, 이어서 식염수로 세정한 후, 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류한 후, 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=10/1)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 7(TMP-CiKD_ALLN)(8.2 mg, 0.010mmol, 15%, isolated yield)을 얻었다.
<실시예 7:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(FACS 해석)>
실시예 7에서는, TMP-CiKD_ALLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, FACS 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비, HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로 HeLa 세포에 플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)를 도입한 후, 24 웰 플레이트에 파종했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)의 첨가)
TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_ALLN을 이용하는 것 이외는 실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_ALLN을 첨가했다. 대조군으로서는, TMP-CiKD_ALLN을 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(FACS 해석에 의한 TMP-CiKD_ALLN의 표적 분해(녹다운)의 평가)
TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_ALLN을 이용하는 것 이외는 실시예 2와 동일하게 하여, TMP-CiKD_ALLN에 의한 표적 분해(녹다운)의 효율을 확인했다.
TMP-CiKD_ALLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 5a에 나타낸다. 또한, TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 5b에 나타낸다.
도 5a에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_ALLN(80μM)을 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 비교하여 그래프가 크게 왼쪽으로 이동하고 있어, 표적 단백질(대장균 DHFR)이 분해되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이동량으로부터 추측되는 분해 효율은 60%~70% 정도였다. 한편, 도 5b에 나타내는 바와 같이, TMP(80μM)를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 그래프가 겹쳐져, 표적 단백질이 분해되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 8:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)를 첨가한 HeLa 세포에서의, 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)와 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 친화성의 평가(열 이동 분석)>
실시예 8에서는, TMP-CiKD_ALLN을 첨가한 HeLa 세포에서의, TMP-CiKD_ALLN과 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 친화성에 대하여, 열 이동 분석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비, HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로 HeLa 세포에 플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)를 도입한 후, 24 웰 플레이트에 파종했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)의 첨가)
TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_ALLN을 이용하는 것 이외는 실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_ALLN을 첨가했다. 대조군으로서는, TMP-CiKD_ALLN을 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(열 이동 분석에 의한 TMP-CiKD_ALLN의 표적 친화성의 평가)
TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_ALLN을 이용하는 것 이외는 실시예 3과 동일하게 하여, 열 이동 분석에 의한 TMP-CiKD_ALLN의 표적 친화성의 평가를 실시했다.
TMP-CiKD_ALLN 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타내는 바와 같이, 대조군(DMSO)에서는 약 50℃까지 밖에 대장균 DHFR을 검출할 수 없었지만, TMP(40μM)를 첨가했을 경우에는, 대장균 DHFR과 TMP가 상호 작용함으로써, 약 54℃까지 대장균 DHFR을 검출할 수 있었다. 마찬가지로 TMP-CiKD_ALLN(40μM)을 첨가했을 경우에는, 대장균 DHFR과 TMP-CiKD_ALLN이 상호 작용함으로써, 약 58℃까지 대장균 DHFR을 검출할 수 있었다.
이 결과로부터, TMP-CiKD_ALLN은, TMP-NH2와 CiKD_ALLN이 연결된 것이지만, 대장균 DHFR과의 친화성이 TMP보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 9:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성의 평가>
실시예 9에서는, TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_ALLN을 이용하는 것 이외는 실시예 4와 동일하게 하여, TMP-CiKD_ALLN의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성을 평가했다.
β1(카스파제 유사활성), β2(트립신 유사활성), 및 β5(키모트립신 유사활성)의 각 프로테아솜 활성을 도 7a~도 7c에 나타낸다.
도 7a~도 7c에 나타내는 바와 같이, β2 및 β5의 활성에 대하여, TMP-CiKD_ALLN에서는, ALLN 단독과 비교하여 저해 활성이 약해져, ALLN의 저해 활성이 활성 상실되어 있는 것을 확인할 수 있었다. β1에 대해서는, ALLN에서는 그다지 저해되지 않는 것이 보고되어 있고(Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266), 이 보고와 모순되지 않는 결과였다.
또한, β1, β2, 및 β5 중 어느 하나에 대해서도, TMP-CiKD_ALLN의 농도 의존적으로 저해 활성이 높아지는 것으로부터, TMP-CiKD_ALLN과 프로테아솜과의 친화성이 확인되었다.
<실시예 10:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_ALLN)의 50% 저해 농도(IC50)의 측정>
실시예 10에서는, TMP-CiKD_Bortezomib 및 보르테조밉 대신에 TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN(Code No. 07036-82, 나카라이테스크(주))을 이용하는 것 이외는 실시예 5와 동일하게 하여, 20S 프로테아솜의 β1, β2, 및 β5의 각 프로테아솜 활성에 대한 TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN의 50% 저해 농도(IC50)를 측정했다. 그리고, 시험 화합물(TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN)은, 각각 아래의 표 85에 나타내는 6점의 농도로 조정했다.
Figure pct00091
TMP-CiKD_ALLN 및 ALLN의 50% 저해 농도(IC50)를 아래의 표 86에 나타낸다.
Figure pct00092
표 86에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_ALLN은, ALLN과 비교하여, β1, β2, 및 β5 모두에 대하여 50% 저해 농도(IC-50)가 크게 증가하고 있어, ALLN의 저해 활성이 활성 상실되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 11:단백질 분해 유도 태그로서 CiKD_MLN을 이용하고, 단백질 결합 분자로서 TMP 유도체를 이용한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_MLN)의 합성>
실시예 11에서는, 하기 합성 반응식에 따라, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_MLN을 합성했다.
단백질 분해 유도 태그로서는, MLN9708 및 MLN2238의 활성 부위인 붕소산 에스테르 부위 또는 보로닐기를 카복시기로 치환한 MLN-COOH(CiKD_MLN)를 이용했다. 또한, 단백질 결합 분자로서는, 실시예 1과 마찬가지로 TMP-NH2를 이용했다. 그리고, MLN-COOH와 TMP-NH2를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_MLN을 합성했다.
[화학식 7]
Figure pct00093
TMP-CiKD_MLN의 합성 방법의 자세한 것은 아래와 같다.
(화합물 8의 합성)
가지(枝))달린 가지형 플라스크에 H-Gly-OtBuㆍHCl(286.8 mg, 1.69 mmol, 1 eq, Code No. AK-46074, Ark Pharm)을 투입하고, 질소 치환했다. 질소 기류하에서 탈수 DMF 10mL와 DIEA 5mL를 첨가하여 실온에서 교반했다. 2, 5-디클로로 안식향산(309.3 mg, 1.62 mmol, 1 eq, Code No. AK-47665, Ark Pharm)을 1 mL의 탈수 DMF 및 1 mL의 DIEA에 용해한 후, 반응 용액에 첨가하고, 실온에서 20분간 교반했다. PyBOP(1.02 g, 1.96 mmol, 1.2 eq, Code No. 8.51009.0005, Novabiochem, Merck)를 1 mL의 탈수 DMF에 용해한 후, 반응 용액에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 아세트산 에틸/헥산(=4/1)으로 2회 추출했다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류했다. 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(헥산/클로로포름=1/1~0/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 8(531.0mg, 1.75mmol, 103%)을 얻었다.
(화합물 9의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 8(212.4 mg, 0.70mmol)을 투입하고, 디클로로 메탄을 5mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, TFA를 5mL 첨가하여 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 증류한 후, 진공 건조하여, 화합물 9(190.7 mg, quant.)를 얻었다.
(화합물 10의 합성)
가지달린 가지형 플라스크에 화합물 9(190.7 mg, 0.77 mmol, 1 eq) 및 H-Leu-OtBuㆍHCl(175.8 mg, 0.79 mmol, 1 eq, Code No. 14G110356, 와타나베카가쿠코교(주))을 투입하고, 질소 치환했다. 질소 기류하에서 탈수 DMF 5mL와 DIEA 5mL를 첨가하여 실온에서 20분간 교반했다. PyBOP(886.7 mg, 1.70mmol, 2.2 eq, Code No. 8.51009.0005, Novabiochem, Merck)를 1.5mL의 탈수 DMF에 용해한 후, 반응 용액에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 아세트산 에틸/헥산(=4/1)으로 2회 추출했다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류했다. 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(헥산/클로로포름=1/1~0/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 10(244.2 mg, 0.58 mmol, 76%)을 얻었다.
(화합물 11(MLN-COOH)의 합성)
가지형 플라스크에 화합물 10(240.8 mg, 0.58 mmol)을 투입하고, 디클로로 메탄을 5mL 첨가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, TFA를 5mL 첨가하여 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 증류한 후, 진공 건조하여, 화합물 11(MLN-COOH)(214.7 mg, 0.59 mmol, 100%)를 얻었다.
(화합물 12(TMP-CiKD_MLN)의 합성)
가지달린 가지형 플라스크에 화합물 11(MLN-COOH)(210.3 mg, 0.58 mmol, 1 eq)을 투입하고, 질소 치환했다. 별도 합성한 TMP-NH2(Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)(207.6 mg, 0.48 mmol, 0.8 eq)를 5mL의 탈수 DMF에 용해한 후, 반응 용액에 첨가했다. DIEA를 5mL 첨가하여 실온에서 20분간 교반했다. PyBOP(765.2 mg, 1.47 mmol, 2.5eq, Code No. 8.51009.0005, Novabiochem, Merck)를 1.5mL의 탈수 DMF에 용해한 후, 반응 용액에 첨가하고, 실온에서 18시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 아세트산 에틸로 2회 추출했다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류하고, 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=20/1~4/1, gradient)에 의해 분리 정제 처리를 수행했다. 이어서, TLC silica gel 60(Code No. HX264817, Merck)(클로로포름/메탄올=10/1)을 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 12(TMP-CiKD_MLN)(20.2 mg, 0.026 mmol, 5%, isolated yield)를 얻었다.
<실시예 12:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_MLN)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(FACS 해석)>
실시예 12에서는, TMP-CiKD_MLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, FACS 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비, HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다. 또한, 실시예 2와 마찬가지로 HeLa 세포에 플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)를 도입한 후, 24 웰 플레이트에 파종했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_MLN)의 첨가)
TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_MLN을 이용하는 것 이외는 실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_MLN을 첨가했다. 또한, TMP-CiKD_MLN을 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군 외에, TMP-CiKD_MLN 및 보르테조밉을 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군도 준비했다. 대조군으로서는, TMP-CiKD_MLN을 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(FACS 해석에 의한 TMP-CiKD_MLN의 표적 분해(녹다운)의 평가)
TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_MLN, 또는 TMP-CiKD_MLN 및 보르테조밉을 이용하는 것 이외는 실시예 2와 동일하게 하여, TMP-CiKD_MLN에 의한 표적 분해(녹다운)의 효율을 확인했다.
TMP-CiKD_MLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 8a에 나타낸다. 또한, TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 8b에 나타낸다. 또한, TMP-CiKD_MLN 및 보르테조밉을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 8c에 나타낸다.
도 8a에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_MLN(80μM)을 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 비교하여 그래프가 크게 왼쪽으로 이동하고 있어, 표적 단백질(대장균 DHFR)이 분해되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이동량으로부터 추측되는 분해 효율은 60%~70% 정도였다. 한편, 도 8b에 나타내는 바와 같이, TMP(80μM)를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 그래프가 겹쳐져, 표적 단백질이 분해되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8c에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_MLN(80μM) 및 보르테조밉(1.5μM)을 첨가했을 경우에는, TMP-CiKD_MLN(80μM)을 첨가했을 경우보다 표적 단백질의 분해가 저해되었다. 이 결과는, TMP-CiKD_MLN에 의해, 표적 단백질이 프로테아솜에 의한 분해로 유도되고 있던 것을 시사하고 있다.
<실시예 13:단백질 분해 유도 태그로서 CiKD_MLN을 이용하고, 단백질 결합 분자로서 MTX 유도체를 이용한 단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)의 합성>
실시예 13에서는, 하기 합성 반응식에 따라, 단백질 분해 유도 분자인 MTX-CiKD_MLN을 합성했다.
단백질 분해 유도 태그로서는, MLN9708 및 MLN2238의 활성 부위인 붕소산 에스테르 부위 또는 보로닐기를 카복시기로 치환한 MLN-COOH(CiKD_MLN)를 이용했다. 또한, 단백질 결합 분자로서는, DHFR과 결합하는 디하이드로엽산 리덕타아제 저해제인 MTX에 아미노기를 포함하는 관능기를 도입한 MTX 유도체(MTX-NH2)를 이용했다. 그리고, MLN-COOH와 MTX-NH2를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 MTX-CiKD_MLN을 합성했다.
[화학식 8]
Figure pct00094
MTX-CiKD_MLN의 합성 방법의 자세한 것은 아래와 같다.
(화합물 21(MTX-NH2)의 합성)
화합물 13을 DMA 중에서 트리페닐포스핀디브로마이드와 반응시켜, 화합물 14를 얻었다. 화합물 14를 질소 기류하에서 DMA에 용해한 후, 화합물 15와 DIEA를 첨가하여 반응시켜, 화합물 16을 얻었다(수율:69%). 이어서, 화합물 16과 화합물 17을 질소 기류하에서 DMSO에 용해하고, BOP 시약에 의해 축합 반응을 수행하여, 화합물 18을 얻었다(수율:46%). 이어서, 화합물 18과 화합물 19를 질소 기류하에서 DMA에 용해하고, HATU에 의해 축합 반응을 수행하여, 화합물 20을 얻었다(수율:69%). 이어서, 화합물 20을 디클로로메탄에 용해하고, TFA에 의해 탈보호를 수행함으로써, 화합물 21(MTX-NH2)을 얻었다.
(화합물 22(MTX-CiKD_MLN)의 합성)
화합물 21(MTX-NH2)과 화합물 12(TMP-CiKD_MLN)의 합성에 이용한 화합물 11을 질소 기류하에서 DMF에 용해하고, PyBOP에 의해 축합 반응을 수행했다(실온, 3시간). 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 아세트산 에틸로 3회 추출했다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류하고, 실리카 겔 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=20/1~4/1, gradient)에 의해 분리 정제 처리를 수행했다. 이어서, TLC silica gel 60(클로로포름/메탄올=85/15)을 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 22(MTX-CiKD_MLN)를 얻었다(단리(單離) 수율:8%).
<실시예 14:단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)를 첨가한 HeLa 세포에서의, 단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)와 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)과의 친화성의 평가(열 이동 분석)>
실시예 14에서는, MTX-CiKD_MLN을 첨가한 HeLa 세포에서의, MTX-CiKD_MLN과 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 친화성에 대하여, 열 이동 분석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비 및 세포 파종)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다. 트립신 처리에 의해 회수한 세포 용액을, 24 웰 플레이트(Code No. TR5002, TrueLine, 니뽄제네틱스(주))에 4×104 세포/800μL/웰의 세포 밀도로 파종한 후, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 16시간 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)의 첨가)
세포 파종으로부터 16시간 후에, 아래와 같이 하여, HeLa 세포에 MTX-CiKD_MLN을 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(Code No. 045-32245, 와코준야쿠코교(주))에 1 질량% L-글루타민 용액(Code No. G7513, Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 그리고, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. MTX-CiKD_MLN을 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1 체적%가 되도록 배지와 혼합하고, 전배양 배지를 제거한 웰에 각 웰당 500μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다.
그리고, 대조군으로서는, MTX-CiKD_MLN을 함유하는 DMSO 용액 대신에, MTX를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(열 이동 분석에 의한 MTX-CiKD_MLN의 표적 친화성의 평가)
MTX-CiKD_MLN(40μM) 또는 MTX(40μM)의 첨가 3시간 후, 배지를 제거하고, 37℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 1 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTAㆍ4Na Solution with Phenol Red)(와코준야쿠코교(주))을 각 웰당 200μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(Code No. 041-29775, 와코준야쿠코교(주))에 10 질량% FBS(Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone) 및 1 질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(Code No. 168-23191, 와코준야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 0. 8 mL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하고, 상청액을 제거한 후, 2 mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, CETSA 버퍼(TBS에 프로테아제 저해제인 cOmplete, Mini, EDTA-free(Roche)를 사용 직전에 첨가)를 170μL 첨가하여 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 9개의 1.5mL 튜브에 20μL씩 분주하고, 실온에서 30분간 정치했다. 정치 후, 9개의 튜브를 각각 38℃, 42℃, 46℃, 50℃, 54℃, 58℃, 62℃, 66℃, 또는 70℃에서 3분간 열처리하고, 실온에서 3분간 정치했다. 정치 후, 세포 용액을 액체 질소로 순간 동결하여, 빙상에서 융해시켰다. 이 동결 융해를 3회 반복한 후, 원심분리(13500rpm×20분간, 4℃)하여, 상청액(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(14 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 열차단했다. 조제한 영동 샘플은, 각 웰당 17μL씩 적용했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 160V로 60분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 2시간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 중에서 일차 항체 반응을 수행했다. 일차 항체로서는, 항DHFR 항체(sc-377091, SantaCruz)를 500배 희석하여 이용했다. 4℃에서 하룻밤 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 일차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 중에서 2차 항체 반응을 수행했다. 2차 항체로서는, 항마우스 IgG(H+L) 항체(A90-116P-33, BETHYL)를 10000배 희석하여 이용했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 첨가한 HeLa 세포에서의 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9에 나타내는 바와 같이, 대조군(DMSO)에서는 약 42℃까지 밖에 인간 DHFR을 검출할 수 없었지만, MTX-CiKD_MLN(40μM)을 첨가했을 경우에는, 인간 DHFR과 MTX-CiKD_MLN이 상호 작용함으로써, 약 50℃까지 인간 DHFR을 검출할 수 있었다.
이 결과로부터, MTX-CiKD_MLN은, MTX-NH2와 CiKD_MLN이 연결된 것이지만, 인간 DHFR과의 친화성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 15:단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)를 첨가한 HeLa 세포에서의 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(웨스턴 블롯 해석)>
실시예 15에서는, MTX-CiKD_MLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비 및 세포 파종)
실시예 14와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비하고, 24 웰 플레이트에 파종했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)의 첨가)
실시예 14와 동일하게 하여, HeLa 세포에 MTX-CiKD_MLN을 첨가했다. 대조군으로서는, MTX-CiKD_MLN을 함유하는 DMSO 용액 대신에, MTX를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(웨스턴 블롯 해석에 의한 MTX-CiKD_MLN의 표적 분해(녹다운)의 평가)
MTX-CiKD_MLN(50μM, 100μM, 혹은 200μM) 또는 MTX(50μM, 100μM, 혹은 200μM)의 첨가 16시간 후, 배지를 제거하고, 4℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 1 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 세포 용해 버퍼(CelLytic M, Sigma)와 프로테아제 저해제(cOmplete Mini, EDTA-free(REF 11 836 170 001), Roche)의 혼합 용액을 각 웰당 27μL 첨가했다. 4℃에서 15분간 정치한 후, 피펫팁(P1000)을 이용하여 빙상에서 세포를 박리했다. 세포 용액을 1.5mL 튜브에 회수하고, 액체 질소로 순간 동결한 후, 빙상에서 융해시켰다. 융해 후, 원심분리(12000rpm×15분간, 4℃)하여, 상청액(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(14 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 열차단했다. 조제한 영동 샘플은, 각 웰당 20μL씩 적용했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 160V로 65분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 2시간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 멤브레인은, 25kDa 마커의 위치에서 2개로 분할했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 중에서 일차 항체 반응을 수행했다. 일차 항체로서는, 항DHFR 항체(sc-14780, SantaCruz, 500배 희석) 및 항GAPDH 항체(sc-32233, SantaCruz, 20000배 희석)를 이용했다. 실온에서 90분간(항DHFR 항체) 또는 45분간(항GAPDH 항체) 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 일차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 중에서 2차 항체 반응을 수행했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다. 검출된 밴드의 정량에는, 화상 처리 소프트웨어 ImageJ(NIH)를 이용했다.
MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 첨가한 HeLa 세포에 있어서, 내재 발현 표적 단백질(인간 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석에 의해 검출된 밴드의 정량 결과를 도 10a에 나타내고, 검출된 밴드를 도 10b에 나타낸다.
도 10a 및 도 10b에 나타내는 바와 같이, MTX-CiKD_MLN을 첨가했을 경우에는, 농도 의존적으로 표적 단백질(인간 DHFR)의 양이 감소했다. 한편, MTX를 첨가했을 경우에는, 농도가 200μM인 경우라도, 표적 단백질(인간 DHFR)의 양의 감소는 관찰되지 않았다.
<실시예 16:단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)를 투여한 마우스 개체에서의 내재 발현 표적 단백질(마우스 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가>
실시예 16에서는, MTX-CiKD_MLN을 투여한 마우스 개체에서의 내재 발현 표적 단백질(마우스 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(마우스에의 단백질 분해 유도 분자(MTX-CiKD_MLN)의 투여)
C57BL/6J 야생형 마우스(7주령, 수컷)(니혼쿠레아(주))에, DMSO, 10mg/kg MTX, 50mg/kg MTX-CiKD_MLN, 또는 100mg/kg MTX-CiKD_MLN을 24시간 투여했다(n=3). MTX-CiKD_MLN 및 MTX는, DMSO에 용해한 후, DMSO의 농도가 10체적%가 되도록 옥수수유(Code No. 25606-55, 나카라이테스크(주))에 용해시켜, 복강 내 투여했다. 마우스는, 먹이 및 물을 자유 섭취할 수 있는 환경하에서 사육했다. 투여 24시간 후에, 솜노펜틸(somnopentyl)(제조 번호:3214101, 쿄리츠세이야쿠(주))에 의한 심마취하에서, 마우스를 해부했다. 간, 신장, 비장, 심장, 및 폐를 적출하여, 액체 질소로 순간 동결시켰다.
(마우스 조직의 웨스턴 블롯 해석)
동결한 간(40mg)을 분쇄한 후, 980μL의 1×TKM 조직 용해 버퍼(50mM 트리에탄올 아민(pH 7.8), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 0.25M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free(Code No.03969-21, 나카라이테스크(주)), 1 mM DTT, Recombinant RNase inhibitor 5μL/mL(40U/μL, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA))를 첨가하여 15분간 회전(1 rpm, 25℃)시켰다. 원심분리(3000rpm×15분간, 4℃)하여, 상청액(간 조직 추출물)을 회수했다. 추출한 단백질은, 분광 광도계로 농도를 정량했다.
회수한 간 조직 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(14 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 5분간 열차단했다. 조제한 영동 샘플은, 100μg/20μL/웰(DHFR 검출용) 또는50μg/10μL/웰(GAPDH 검출용)이 되도록 적용했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 160V로 60분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 90분간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 중에서 일차 항체 반응을 수행했다. 일차 항체로서는, 항DHFR 항체(sc-14780, SantaCruz, 500배 희석) 및 항GAPDH 항체(sc-32233, SantaCruz, 20000배 희석)를 이용했다. 실온에서 60분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 일차 항체 반응 후, 1% 탈지유/TBS-T 중에서 2차 항체 반응을 수행했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 10분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
MTX-CiKD_MLN 또는 MTX를 투여한 마우스 개체의 간 조직 추출물에서의 내재 발현 표적 단백질(마우스 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석 결과를 도 11에 나타낸다.
도 11에 나타내는 바와 같이, 50mg/kg 또는 100mg/kg의 MTX-CiKD_MLN을 마우스에 24시간 투여했을 경우에는, 농도 의존적으로, 간 조직내의 표적 단백질(마우스 DHFR)의 양이 감소했다. 이 결과는, 마우스 개체에 대하여, 불과 1일에 약 70%~80%의 표적 단백질(마우스 DHFR)이 분해된 것을 나타내고 있다. 한편, 10mg/kg의 MTX를 마우스에 24시간 투여했을 경우에는, 대조군(DMSO)보다, 간 조직내의 표적 단백질(마우스 DHFR)의 양이 증가했다.
<실시예 17:단백질 분해 유도 태그로서 CiKD_DMT를 이용하고, 단백질 결합 분자로서 TMP 유도체를 이용한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)의 합성>
실시예 17에서는, 하기 합성 반응식에 따라, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_DMT를 합성했다.
단백질 분해 유도 태그로서는, 상술한 식 (I)에 있어서 R1 및 R2를 모두 메톡시기로 한 화합물(DMT)을 이용했다. DMT는, 프로테아솜 저해제에 유래하지 않지만, 프로테아솜에 대하여 친화성을 갖는 화합물이다. 또한, 단백질 결합 분자로서는, 실시예 1과 마찬가지로 TMP-NH2를 이용했다. 그리고, DMT와 TMP-NH2를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CiKD_DMT를 합성했다.
[화학식 9]
Figure pct00095
TMP-CiKD_DMT의 합성 방법의 자세한 것은 아래와 같다.
가지형 플라스크에 TMP-NH2(Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)(31.7 mg, 0.073 mmol)를 투입하고, 탈수 DMF를 0. 3 mL 첨가했다. 실온에서 10분간 교반한 후, DIEA를 0. 1 mL 첨가하여 실온에서 10분간 교반했다. DMT-MM(33.6 mg, 0.12 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 와코준야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 첨가하여 실온에서 18시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 클로로포름으로 5회 추출했다. 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류했다. 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나카라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=92/8)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, TMP-CiKD_DMT(25.8 mg, 0.045mmol, 62%, isolated yield)를 얻었다.
<실시예 18:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성의 평가>
실시예 18에서는, TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 10μM 또는 100μM의 TMP-CiKD_DMT를 이용하는 것 이외는 실시예 4와 동일하게 하여, TMP-CiKD_DMT의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성을 평가했다. 양성 대조군으로서는, 프로테아솜 저해제인 MG-132를 이용했다.
β1(카스파제 유사활성), β2(트립신 유사활성), 및 β5(키모트립신 유사활성)의 각 프로테아솜 활성을 도 12a~도 12c에 나타낸다.
도 12a~도 12c에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_DMT는, MG-132와 비교하여, 프로테아솜 저해 활성이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, β1, β2, 및 β5 중 어느 하나에 대해서도, TMP-CiKD_DMT의 농도 의존적으로 저해 활성이 높아지는 것으로부터, TMP-CiKD_DMT가 프로테아솜과 온화한 친화성을 가지고 있는 것이 시사되었다. 즉, DMT는, 프로테아솜과 친화성을 가지지만, 분해를 저해하지 않는다고 평가되었다.
<실시예 19:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)의 50% 저해 농도(IC50)의 측정>
실시예 19에서는, TMP-CiKD_Bortezomib 대신에 TMP-CiKD_DMT를 이용하는 것 이외는 실시예 5와 동일하게 하여, 20S 프로테아솜의 β1, β2, 및 β5의 각 프로테아솜 활성에 대한 TMP-CiKD_DMT의 50% 저해 농도(IC50)를 측정했다. 양성 대조군으로서는, 프로테아솜 저해제인 MLN2238를 이용했다.
TMP-CiKD_DMT 및 MLN2238의 50% 저해 농도(IC50)를 아래의 표 87에 나타낸다.
Figure pct00096
표 87에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_DMT는, MLN2238과 비교하여, 프로테아솜 저해 활성이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 20:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)를 첨가한 HeLa 세포에서의, 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)와 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 친화성의 평가(열 이동 분석)>
실시예 20에서는, TMP-CiKD_DMT를 첨가한 HeLa 세포에서의, TMP-CiKD_DMT와 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 친화성에 대하여, 열 이동 분석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다.
(HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 표적 단백질인 ecDHFR(상세하게는, HA 태그를 통한 ecDHFR과 GFP와의 융합 단백질) 또는 비교용 DsRed를 일시적으로 과잉 발현시켜, TMP-CiKD_DMT의 표적 단백질에 대한 작용을 평가했다.
플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)는, 브랜다이스 대학(미국)의 Lizbeth Hedstrom 교수로부터 제공받았다(Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation. ", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637). 이 플라스미드를 대장균에서 증폭한 후, Miniprep Kit(Code No. 27106, QIAGEN)로 정제했다.
HeLa 세포에 대한 플라스미드 도입에는, 트랜스펙션 시약인 ScreenFectA(Code No. 297-73201, 와코준야쿠코교(주))를 이용했다. ScreenFectA의 Dilution Buffer를 2개의 1.5mL 튜브에 250μL씩 첨가했다. 그리고, 한쪽의 튜브에는 ScreenFectA의 Transfection Reagent를 12μL 첨가하고(용액 A), 다른 쪽의 튜브에는 플라스미드를 6μg 첨가하고(용액 B), 각각을 가볍게 피펫팅한 후, 실온에서 2분간 정치했다. 용액 A와 용액 B를 가볍게 혼합하여 실온에서 30분간 정치했다(용액 C). 트립신 처리에 의해 회수한 6×105세포/12 mL의 세포 용액에 용액 C를 혼합하고, 24 웰 플레이트(Code No. TR5002, TrueLine, 니뽄제네틱스(주))에 4×104 세포/800μL/웰의 세포 밀도로 파종한 후, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)의 첨가)
플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 아래와 같이 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_DMT를 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(Code No. 045-32245, 와코준야쿠코교(주))에 1 질량% L-글루타민 용액(Code No. G7513, Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 그리고, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1 체적%가 되도록 배지와 혼합하고, 전배양 배지를 제거한 웰에 각 웰당 300μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다.
그리고, 대조군으로서는, TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(열 이동 분석에 의한 TMP-CiKD_DMT의 표적 친화성의 평가)
TMP-CiKD_DMT(28μM) 또는 TMP(40μM)의 첨가 3시간 후, 배지를 제거하고, 37℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 1 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTAㆍ4Na Solution with Phenol Red)(와코준야쿠코교(주))을 각 웰당 300μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(Code No. 041-29775, 와코준야쿠코교(주))에 10 질량% FBS(Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone) 및 1 질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(Code No. 168-23191, 와코준야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 1 mL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, 2 mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, CETSA 버퍼(TBS에 프로테아제 저해제인 cOmplete, Mini, EDTA-free(Roche)를 사용 직전에 첨가)를 180μL 첨가하여 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 9개의 1.5mL 튜브에 20μL씩 분주하고, 실온에서 30분간 정치했다. 정치 후, 9개의 튜브를 각각 38℃, 42℃, 46℃, 50℃, 54℃, 58℃, 62℃, 66℃, 또는 70℃에서 3분간 열처리하고, 실온에서 3분간 정치했다. 정치 후, 세포 용액을 액체 질소로 순간 동결하여, 빙상에서 융해시켰다. 이 동결 융해를 3회 반복한 후, 원심분리(13500rpm×20분간, 4℃)하여, 상청액(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(14 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 열차단했다. 조제한 영동 샘플은, 각 웰당 17μL씩 적용했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 150V로 40분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 40분간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/High-salt TBS-T(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 씻어내고, 1% 탈지유/High-salt TBS-T 중에서 항체 반응을 수행했다. 항체로서는, Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity(3 F10) Rat monoclonal antibody(25U/mL)(Roche)를 1000배 희석하여 이용했다. 실온에서 90분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 High-salt TBS(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
TMP-CiKD_DMT 또는 TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 열 이동 분석 결과를 도 13에 나타낸다.
대조군(DMSO)에서는 약 50℃까지 밖에 대장균 DHFR을 검출할 수 없었지만, TMP(40μM)에서는 약 54℃까지, TMP-CiKD_DMT(28μM)에서는 약 62℃까지 대장균 DHFR을 검출할 수 있었다.
이 결과로부터, TMP-CiKD_DMT는, TMP-NH2와 DMT가 연결된 것이지만, 대장균 DHFR과의 친화성이 TMP보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 21:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(FACS 해석)>
실시예 21에서는, TMP-CiKD_DMT를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, FACS 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다.
(HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 표적 단백질인 대장균 DHFR(상세하게는, HA 태그를 통한 대장균 DHFR과 GFP와의 융합 단백질) 또는 비교용의 DsRed를 일시적으로 과잉 발현시켜, TMP-CiKD_DMT의 표적 단백질에 대한 작용을 평가했다.
플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)는, 브랜다이스 대학(미국)의 Lizbeth Hedstrom 교수로부터 제공받았다(Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation. ", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637). 이 플라스미드를 대장균에서 증폭한 후, Miniprep Kit(Code No. 27106, QIAGEN)로 정제했다.
HeLa 세포에 대한 플라스미드 도입에는, 트랜스펙션 시약인 ScreenFectA(Code No. 297-73201, 와코준야쿠코교(주))를 이용했다. ScreenFectA의 Dilution Buffer를 2개의 1.5mL 튜브에 960μL씩 첨가했다. 그리고, 한쪽의 튜브에는 ScreenFectA의 Transfection Reagent를 40μL 첨가하고(용액 A), 다른 쪽의 튜브에는 플라스미드를 16μg 첨가하고(용액 B), 각각을 가볍게 피펫팅한 후, 실온에서 2분간 정치했다. 용액 A와 용액 B를 가볍게 혼합하여 실온에서 30분간 정치했다(용액 C). 트립신 처리에 의해 회수한 2. 7×105세포/18 mL의 세포 용액에 용액 C를 혼합하고, 24 웰 플레이트(Code No. TR5002, TrueLine, 니뽄제네틱스(주))에 6×104 세포/400μL/웰의 세포 밀도로 파종한 후, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)의 첨가)
아래와 같이 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_DMT를 첨가했다. 플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 전배양 배지를 제거하고, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(Code No. 045-32245, 와코준야쿠코교(주))에 1 질량% L-글루타민 용액(Code No. G7513, Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 각 웰당 297μL 첨가했다. 그리고, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. 소정 농도의 TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 각 웰당 3μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다.
그리고, 대조군으로서는, TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
TMP-CiKD_DMT(56μM 혹은 112μM) 또는 TMP(80μM)의 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, 37℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 1 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTAㆍ4Na Solution with Phenol Red)(와코준야쿠코교(주))을 각 웰당 300μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(Code No. 041-29775, 와코준야쿠코교(주))에 10 질량% FBS(Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone) 및 1 질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(Code No. 168-23191, 와코준야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 500μL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, 2 mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여, 상청액을 제거한 후, 4℃의 FACS 버퍼(1 질량% FBS/PBS)를 500μL 첨가하여, 빙상에 정치했다.
유세포 분석에는 BD FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 세포 중에서의 GFR 및 DsRed의 발현을 정량했다. FACS 해석의 직전에, 세포 용액을 구멍 지름 32μm의 메쉬를 통과시켜, FACS 튜브로 옮겼다. 해석 소프트 FLOWJO(토미디지털바이올로지(주))에 의해 세포 1개당 GFR/DsRed 비를 산출하고, 표적 분해에 의한 그래프의 이동으로부터, TMP-CiKD_DMT에 의한 표적 분해(녹다운)의 효율을 확인했다.
TMP-CiKD_DMT(56μM)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 14a에 나타낸다. 또한, TMP-CiKD_DMT(112μM)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 14b에 나타낸다. 또한, TMP를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 FACS 해석 결과를 도 14c에 나타낸다.
도 14a 및 도 14b에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_DMT를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 비교하여, 농도 의존적으로 그래프의 왼쪽으로의 이동량이 커지고 있어 표적 단백질(대장균 DHFR)이 분해되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이동량으로부터 추측되는 분해 효율은 60%~70% 정도였다. 한편, 도 14c에 나타내는 바와 같이, TMP를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)과 그래프가 겹쳐져, 표적 단백질이 분해되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 22:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(웨스턴 블롯 해석)>
실시예 22에서는, TMP-CiKD_DMT를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다.
(HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 표적 단백질인 대장균 DHFR(상세하게는, HA 태그를 통한 대장균 DHFR과 GFP와의 융합 단백질) 또는 비교용의 DsRed를 일시적으로 과잉 발현시켜, TMP-CiKD_DMT의 표적 단백질에 대한 작용을 평가했다.
플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)는, 브랜다이스 대학(미국)의 Lizbeth Hedstrom 교수로부터 제공받았다(Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation. ", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637). 이 플라스미드를 대장균에서 증폭한 후, Miniprep Kit(Code No. 27106, QIAGEN)로 정제했다.
HeLa 세포에 대한 플라스미드 도입에는, 트랜스펙션 시약인 ScreenFectA(Code No. 297-73201, 와코준야쿠코교(주))를 이용했다. ScreenFectA의 Dilution Buffer를 2개의 1.5mL 튜브에 250μL씩 첨가했다. 그리고, 한쪽의 튜브에는 ScreenFectA의 Transfection Reagent를 12μL 첨가하고(용액 A), 다른 쪽의 튜브에는 플라스미드를 4. 8μg 첨가하고(용액 B), 각각을 가볍게 피펫팅한 후, 실온에서 2분간 정치했다. 용액 A와 용액 B를 가볍게 혼합하여 실온에서 30분간 정치했다(용액 C). 트립신 처리에 의해 회수한 7. 7×104 세포/7. 7 mL의 세포 용액에 용액 C를 혼합하고, 24 웰 플레이트(Code No. TR5002, TrueLine, 니뽄제네틱스(주))에 4×104 세포/400μL/웰의 세포 밀도로 파종한 후, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT)의 첨가)
플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 아래와 같이 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_DMT를 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(Code No. 045-32245, 와코준야쿠코교(주))에 1 질량% L-글루타민 용액(Code No. G7513, Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 그리고, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1 체적%가 되도록 배지와 혼합하고, 전배양 배지를 제거한 웰에 각 웰당 300μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다. 또한, TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군 외에, TMP-CiKD_DMT 및 보르테조밉을 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군도 준비했다. TMP-CiKD_DMT, 또는 TMP-CiKD_DMT 및 보르테조밉의 첨가 12시간 후에, 단백질 합성 저해제인 사이클로헥시마이드(heximide)를 50μg/mL의 농도가 되도록 배지 중에 첨가했다.
그리고, 대조군으로서는, TMP-CiKD_DMT를 함유하는 DMSO 용액 대신에, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(웨스턴 블롯 해석에 의한 TMP-CiKD_DMT의 표적 분해(녹다운)의 평가)
TMP-CiKD_DMT, 또는 TMP-CiKD_DMT 및 보르테조밉의 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, 4℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 1 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 세포 용해 버퍼(CelLytic M, Sigma)와 프로테아제 저해제(cOmplete Mini, EDTA-free(REF 11 836 170 001), Roche)의 혼합 용액을 각 웰당 55μL 첨가했다. 4℃에서 15분간 정치한 후, 피펫팁(P1000)을 이용하여 빙상에서 세포를 박리했다. 세포 용액을 1.5mL 튜브에 회수하고, 액체 질소로 순간 동결한 후, 빙상에서 융해시켰다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 원심분리(13000rpm×20분간, 4℃)하여, 상청액(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(8 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 열차단했다. 조제한 영동 샘플은, 각 웰당 40μL씩 적용했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 150V로 50분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 40분간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/High-salt TBS-T(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 씻어내고, 1% 탈지유/High-salt TBS-T 중에서 항체 반응을 수행했다. 항체로서는, Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity(3 F10) Rat monoclonal antibody(25U/mL)(Roche)를 1000배 희석하여 이용했다. 실온에서 1시간 진탕시킨 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 High-salt TBS(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
그 다음, 동일한 멤브레인을 이용하여, 대조군인 GAPDH의 검출 반응을 수행했다. 멤브레인을 TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6)로 세정하고, 5% 탈지유/TBS-T 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 중에서 일차 항체 반응을 수행했다. 일차 항체로서는, 항GAPDH 항체(sc-32233, SantaCruz, 20000배 희석)를 이용했다. 실온에서 60분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 일차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 중에서 2차 항체 반응을 수행했다. 2차 항체로서는, 항마우스 IgG(H+L) 항체(A90-116P-33, BETHYL)를 20000배 희석하여 이용했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다. 검출된 밴드의 정량에는, 화상 처리 소프트웨어 ImageJ(NIH)를 이용했다.
TMP-CiKD_DMT, 또는 TMP-CiKD_DMT 및 보르테조밉을 첨가한 HeLa 세포에 있어서, 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석에 의해 검출된 밴드의 정량 결과를 도 15a에 나타내고, 검출된 밴드를 도 15b에 나타낸다.
도 15a 및 도 15b에 나타내는 바와 같이, TMP-CiKD_DMT(112μM)를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)을 기준으로 한 분해 효율이 약 60%였다. 한편, TMP-CiKD_DMT(112μM) 및 보르테조밉(1μM)을 첨가했을 경우에는, 표적 단백질의 분해가 저해되었다. 이 결과는, TMP-CiKD_DMT에 의해, 표적 단백질이 프로테아솜에 의한 분해로 유도되고 있던 것을 시사하고 있다.
<실시예 23:단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib)를 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)의 평가(웨스턴 블롯 해석)>
실시예 23에서는, TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 분해(녹다운)에 대하여, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(배양 세포의 준비)
실시예 2와 동일하게 하여, HeLa 세포를 준비했다.
(HeLa 세포에 대한 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 표적 단백질인 대장균 DHFR(상세하게는, HA 태그를 통한 대장균 DHFR과 GFP와의 융합 단백질) 또는 비교용의 DsRed를 일시적으로 과잉 발현시켜, TMP-CiKD_DMT의 표적 단백질에 대한 작용을 평가했다.
플라스미드(pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)는, 브랜다이스 대학(미국)의 Lizbeth Hedstrom 교수로부터 제공받았다(Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation. ", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637). 이 플라스미드를 대장균에서 증폭한 후, Miniprep Kit(Code No. 27106, QIAGEN)로 정제했다.
HeLa 세포에 대한 플라스미드 도입에는, 트랜스펙션 시약인 ScreenFectA(Code No. 297-73201, 와코준야쿠코교(주))를 이용했다. ScreenFectA의 Dilution Buffer를 2개의 1.5mL 튜브에 400μL씩 첨가했다. 그리고, 한쪽의 튜브에는 ScreenFectA의 Transfection Reagent를 20μL 첨가하고(용액 A), 다른 쪽의 튜브에는 플라스미드를 10. 3μg 첨가하고(용액 B), 각각을 가볍게 피펫팅한 후, 실온에서 2분간 정치했다. 용액 A와 용액 B를 가볍게 혼합하여 실온에서 30분간 정치했다(용액 C). 트립신 처리에 의해 회수한 8×105세포/16 mL의 세포 용액에 용액 C를 혼합하고, 24 웰 플레이트(Code No. TR5002, TrueLine, 니뽄제네틱스(주))에 4×104 세포/800μL/웰의 세포 밀도로 파종한 후, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포에 대한 단백질 분해 유도 분자(TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib)의 첨가)
플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 아래와 같이 하여, HeLa 세포에 TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(Code No. 045-32245, 와코준야쿠코교(주))에 1 질량% L-글루타민 용액(Code No. G7513, Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 그리고, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib을 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1 체적%가 되도록 배지와 혼합하고, 전배양 배지를 제거한 웰에 각 웰당 300μL 첨가하여, 37℃, 5체적% CO2의 조건하에서 배양했다.
그리고, 대조군으로서는, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(웨스턴 블롯 해석에 의한 표적 분해(녹다운)의 평가)
TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib의 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, 4℃의 PBS(와코준야쿠코교(주))를 각 웰당 1 mL 첨가하여 세포를 세정했다. PBS의 제거 후, 세포 용해 버퍼(CelLytic M, Sigma)와 프로테아제 저해제(cOmplete Mini, EDTA-free(REF 11 836 170 001), Roche)의 혼합 용액을 각 웰당 30μL 첨가했다. 4℃에서 10분간 정치한 후, 피펫팁(P1000)을 이용하여 빙상에서 세포를 박리했다. 세포 용액을 1.5mL 튜브에 회수하고, 액체 질소로 순간 동결한 후, 빙상에서 융해시켰다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 원심분리(13500rpm×20분간, 4℃)하여, 상청액(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대하여, 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔(12 웰)은, TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은, 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 열차단했다. 조제한 영동 샘플은, 각 웰당 20μL씩 적용했다. 영동 마커로서는, Precision Plus Protein Dual Color Standards(Bio-Rad)를 이용했다. 전기 영동은 160V로 45분간 수행했다(영동 버퍼;195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 35분간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은, 5% 탈지유/High-salt TBS-T(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6) 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 씻어내고, 1% 탈지유/High-salt TBS-T 중에서 항체 반응을 수행했다. 항체로서는, Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity(3 F10) Rat monoclonal antibody(25U/mL)(Roche)를 500배 희석하여 이용했다. 실온에서 2시간 진탕시킨 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 High-salt TBS(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
그 다음, 동일한 멤브레인을 이용하여, 대조군인 GAPDH의 검출 반응을 수행했다. 멤브레인을 TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6)로 세정하고, 5% 탈지유/TBS-T 중, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 중에서 일차 항체 반응을 수행했다. 일차 항체로서는, 항GAPDH 항체(sc-32233, SantaCruz, 10000배 희석)를 이용했다. 실온에서 60분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 일차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 중에서 2차 항체 반응을 수행했다. 2차 항체로서는, 항마우스 IgG(H+L) 항체(A90-116P-33, BETHYL)를 20000배 희석하여 이용했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 그리고, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노이미지애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다. 검출된 밴드의 정량에는, 화상 처리 소프트웨어 ImageJ(NIH)를 이용했다.
TMP-CiKD_DMT, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 또는 TMP-CiKD_Bortezomib을 첨가한 HeLa 세포에서의 강제 발현 표적 단백질(대장균 DHFR)의 웨스턴 블롯 해석 결과를 도 16에 나타낸다.
도 16에 나타내는 바와 같이, 80μM 또는 160μM의 TMP-CiKD_DMT를 첨가했을 경우에는, 대조군(DMSO)을 기준으로 한 분해 효율이, 각각 72%, 91%였다. 또한, TMP-CiKD_MLN, TMP-CiKD_ALLN, 및 TMP-CiKD_Bortezomib의 160μM에서의 분해 효율은, 각각 82%, 45%, 28%였다.
2015년 6월 19일에 출원된 일본 출원 2015-123740 및 2016년 4월 8일에 출원된 일본 출원 2016-078324의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 각각의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의해 포함되는 것이 구체적이면서, 각각에 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 포함된다.

Claims (22)

  1. 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자인 단백질 분해 유도 태그.
  2. 제 1항에 있어서,
    프로테아제 저해제의 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시킨 구조를 갖는 단백질 분해 유도 태그.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 프로테아제가 프로테아솜인 단백질 분해 유도 태그.
  4. 제 3항에 있어서,
    프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 활성 상실시킨 구조를 갖는 단백질 분해 유도 태그.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 프로테아솜 저해 활성이, 카스파제 유사활성, 트립신 유사활성, 및 키모트립신 유사활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 저해 활성인 단백질 분해 유도 태그.
  6. 후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자를 선발하는 공정을 포함하는 단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 프로테아제가 프로테아솜인 단백질 분해 유도 태그의 스크리닝 방법.
  8. 프로테아제 저해제의 활성 부위의 구조를 개변하여, 프로테아제 저해 활성을 활성 상실시키는 공정을 포함하는 단백질 분해 유도 태그의 제조 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    후보 분자 중에서, 프로테아제에 대하여 친화성을 갖는 한편, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 분자를 프로테아제 저해제로서 선발하는 공정을 더 포함하는 단백질 분해 유도 태그의 제조 방법.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그를 2종 이상 포함하는 단백질 분해 유도 태그 라이브러리.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1개의 단백질 분해 유도 태그와 단백질에 결합하는 적어도 1개의 단백질 결합 분자의 컨쥬게이트인 단백질 분해 유도 분자.
  12. 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자를 2종 이상 포함하는 단백질 분해 유도 분자 라이브러리.
  13. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 또는 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 또는 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정을 포함하는 표적 단백질의 분해 방법.
  15. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 또는 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정을 포함하는 표적 단백질의 기능 해석 방법.
  16. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 또는 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 단백질의 분해를 유도하는 공정;및
    상기 단백질 분해 유도 태그 또는 상기 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도된 단백질을 동정하는 공정;을 포함하는 표적 단백질의 동정 방법.
  17. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 또는 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자를 이용하여 표적 단백질의 분해를 유도하는 공정; 및
    상기 표적 단백질 이외의 활성 또는 발현이 변화된 단백질을 동정하는 공정;을 포함하는 표적 단백질을 통한 경로 분자의 동정 방법.
  18. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 제 10항에 따른 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자, 또는 제 12항에 따른 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 표적 단백질이 존재하는 계에 공급하여, 상기 표적 단백질의 분해를 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하는 공정을 포함하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자의 스크리닝 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 표적 단백질이 질환 원인 물질이며, 상기 표적 단백질의 분해를 유도하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 질환의 예방 또는 치료 성분 후보로서 선발하는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자의 스크리닝 방법.
  20. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 제 10항에 따른 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자, 또는 제 12항에 따른 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 개선시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 선발하는 공정을 포함하는 질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법.
  21. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 제 10항에 따른 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자, 또는 제 12항에 따른 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 악화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발하는 공정을 포함하는 질환의 예방 또는 치료 성분 후보의 스크리닝 방법.
  22. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 유도 태그, 제 10항에 따른 단백질 분해 유도 태그 라이브러리, 제 11항에 따른 단백질 분해 유도 분자, 또는 제 12항에 따른 단백질 분해 유도 분자 라이브러리를 질환 모델계에 공급하여, 질환의 증상을 변화시키는 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자를 추출하고, 추출된 단백질 분해 유도 태그 또는 단백질 분해 유도 분자에 의해 분해가 유도되는 단백질을 선발하는 공정을 포함하는 질환 관련 단백질의 특정 방법.

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