JPWO2016204197A1 - タンパク質分解誘導タグ及びその用途 - Google Patents

タンパク質分解誘導タグ及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2016204197A1
JPWO2016204197A1 JP2017525270A JP2017525270A JPWO2016204197A1 JP WO2016204197 A1 JPWO2016204197 A1 JP WO2016204197A1 JP 2017525270 A JP2017525270 A JP 2017525270A JP 2017525270 A JP2017525270 A JP 2017525270A JP WO2016204197 A1 JPWO2016204197 A1 JP WO2016204197A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
proteolysis
inducing
protein
molecule
tmp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2017525270A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6954619B2 (ja
Inventor
宮本　悦子
悦子 宮本
正晃 小沢
正晃 小沢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo University of Science
Original Assignee
Tokyo University of Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo University of Science filed Critical Tokyo University of Science
Publication of JPWO2016204197A1 publication Critical patent/JPWO2016204197A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6954619B2 publication Critical patent/JP6954619B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/48—Two nitrogen atoms
    • C07D239/49—Two nitrogen atoms with an aralkyl radical, or substituted aralkyl radical, attached in position 5, e.g. trimethoprim
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/08—Methods of screening libraries by measuring catalytic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグ、少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグと、タンパク質に結合する少なくとも１つのタンパク質結合分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子、及びそれらの用途を提供する。

Description

本開示は、タンパク質分解誘導タグ及びその用途に関する。
細胞、生体等における標的タンパク質の量（発現）をコントロールすることは、標的タンパク質の機能及び標的タンパク質が関与する生命現象を解析する上で非常に有用である。標的タンパク質が疾患の原因である場合には、標的タンパク質の量を減少させることで、疾患を予防又は治療することも可能になると考えられる。
従来、標的タンパク質の量をＤＮＡレベルで操作する技術として、標的タンパク質をコードする遺伝子を欠損させる遺伝子ノックアウト技術が知られている。また、標的タンパク質の量をＲＮＡレベルで操作する技術として、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を用いて標的タンパク質のｍＲＮＡを分解するＲＮＡｉ（RNA interference）技術が知られている。
しかし、遺伝子ノックアウト技術は、時間及びコストの問題に加え、生命倫理上の問題も生じ得る。また、遺伝子ノックアウト技術は、標的タンパク質の遺伝子自体を欠損させる技術であるため、医薬に応用することはできない。
一方、ＲＮＡｉ技術は、オフターゲット効果の問題があり、標的タンパク質の量を特異的にコントロールすることは困難である。また、ＲＮＡｉ技術は、ｓｉＲＮＡのデリバリーが困難であり、医薬への応用には課題が多い。
このような背景から、近年になり、標的タンパク質を細胞内で分解することにより、標的タンパク質の量をタンパク質レベルで操作する技術が注目されている。この技術は、標的タンパク質のユビキチン化を利用するユビキチン依存的な技術と、標的タンパク質のユビキチン化を利用しないユビキチン非依存的な技術とに大別される。
ユビキチン依存的な技術としては、標的タンパク質に結合する分子とユビキチンリガーゼ（Ｅ３）に結合する分子とを連結した複合体を用いる技術が知られている（例えば、特開２０１３−０５６８３７号公報、米国特許第７２０８１５７号明細書、Itohらの論文（Itoh, Y. et al., "Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown.", Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 3229-3241）、Demizuらの論文（Demizu, Y. et al., "Design and systhesis of estrogen receptor degradation inducer based on a protein knockdown strategy.", Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012, 15, 1793-1796）、及びHinesらの論文（Hines, J. et al., "Posttranslational protein knockdown coupled to receptor tyrosine kinase activation with phosphoPROTACs.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013, 110(22), 8942-8947）を参照）。この技術は、上記複合体を介して標的タンパク質とユビキチンリガーゼとを結び付け、標的タンパク質を特異的にユビキチン化してプロテアソームによる分解へと導くものである。なお、上記複合体は、ＳＮＩＰＥＲ（Specific and Nongenetic IAP-dependent Protein ERaser）、ＰＲＯＴＡＣ（PROteolysis TArgeting Chimera）等と称されることもある。
一方、ユビキチン非依存的な技術としては、標的タンパク質に結合する分子と疎水性のタグとを連結した複合体を用いる技術が知られている（例えば、国際公開第２０１２／００３２８１号、Longらの論文（Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation.", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）、及びNeklesaらの論文（Neklesa, T.K. et al., "Greasy tags for protein removal.", Nature, 2012, 487, 308-309）を参照）。この技術は、上記複合体と標的タンパク質とを結合させることにより、標的タンパク質が部分的にアンフォールディングした状態を模倣し、プロテアソームによる分解へと導くものと考えられている。
しかし、標的タンパク質に結合する分子とユビキチンリガーゼに結合する分子とを連結した複合体を用いる前述のユビキチン依存的な技術は、汎用性が低いという問題がある。すなわち、ユビキチンリガーゼは哺乳類では１０００種類以上存在し、標的タンパク質の認識に重要な役割を果たしているため、標的タンパク質に合わせて複合体を設計する必要がある。
また、標的タンパク質に合わせて複合体を設計する必要があることから、標的タンパク質は既知でなければならず、例えば、分解されたタンパク質の中から標的タンパク質を同定するツールに応用することは困難である。
一方、標的タンパク質に結合する分子と疎水性のタグとを連結した複合体を用いる前述のユビキチン非依存的な技術は、疎水性のタグに起因し、細胞膜透過性が低く、細胞毒性が高いという問題がある。
本開示は、上記のような事情に鑑み、標的タンパク質の分解を誘導する新規なタンパク質分解誘導タグ及びその用途を提供することを課題とする。
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグ。
＜２＞ プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造を有する＜１＞に記載のタンパク質分解誘導タグ。
＜３＞ 前記プロテアーゼがプロテアソームである＜１＞に記載のタンパク質分解誘導タグ。
＜４＞ プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有する＜３＞に記載のタンパク質分解誘導タグ。
＜５＞ 前記プロテアソーム阻害活性が、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性である＜４＞に記載のタンパク質分解誘導タグ。
＜６＞ 候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子を選抜する工程を含むタンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法。
＜７＞ 前記プロテアーゼがプロテアソームである＜６＞に記載のタンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法。
＜８＞ プロテアーゼ阻害剤の活性部位の構造を改変し、プロテアーゼ阻害活性を失活させる工程を含むタンパク質分解誘導タグの製造方法。
＜９＞ 候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する分子をプロテアーゼ阻害剤として選抜する工程を更に含む＜８＞に記載のタンパク質分解誘導タグの製造方法。
＜１０＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグを２種以上含むタンパク質分解誘導タグライブラリー。
＜１１＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグと、タンパク質に結合する少なくとも１つのタンパク質結合分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子。
＜１２＞ ＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子を２種以上含むタンパク質分解誘導分子ライブラリー。
＜１３＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子を含む医薬組成物。
＜１４＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程を含む標的タンパク質の分解方法。
＜１５＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程を含む標的タンパク質の機能解析方法。
＜１６＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する工程と、
前記タンパク質分解誘導タグ又は前記タンパク質分解誘導分子によって分解が誘導されたタンパク質を同定する工程と、
を含む標的タンパク質の同定方法。
＜１７＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程と、
前記標的タンパク質以外の活性又は発現が変化したタンパク質を同定する工程と、
を含む標的タンパク質を介した経路分子の同定方法。
＜１８＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、＜１０＞に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子、又は＜１２＞に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを標的タンパク質が存在する系に供給し、前記標的タンパク質の分解を誘導するタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程を含むタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子のスクリーニング方法。
＜１９＞ 前記標的タンパク質が疾患原因物質であり、前記標的タンパク質の分解を誘導するタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を疾患の予防又は治療成分候補として選抜する＜１８＞に記載のタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子のスクリーニング方法。
＜２０＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、＜１０＞に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子、又は＜１２＞に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を改善させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程を含む疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法。
＜２１＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、＜１０＞に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子、又は＜１２＞に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を悪化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜する工程を含む疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法。
＜２２＞ ＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、＜１０＞に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、＜１１＞に記載のタンパク質分解誘導分子、又は＜１２＞に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を変化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜する工程を含む疾患関連タンパク質の特定方法。
本開示によれば、標的タンパク質の分解を誘導する新規なタンパク質分解誘導タグ及びその用途を提供することができる。
実施例で使用したプラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）のプラスミドマップを示す図である。 TMP-CiKD_Bortezomibを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）解析結果を示す図である。 ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 TMP-CiKD_Bortezomib又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブの阻害活性を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブの阻害活性を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブの阻害活性を示す図である。 TMP-CiKD_ALLNを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 TMP-CiKD_ALLN又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、TMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、TMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、TMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。 TMP-CiKD_MLNを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 TMP-CiKD_MLN及びボルテゾミブを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを添加したＨｅＬａ細胞における内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を示す図である。 MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを添加したＨｅＬａ細胞において、内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析により検出されたバンドの定量結果を示す図である。 MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを添加したＨｅＬａ細胞において、内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析により検出されたバンドを示す図である。 MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを投与したマウス個体の肝臓組織抽出物における内在発現標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析結果を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、TMP-CiKD_DMT及びＭＧ−１３２の阻害活性を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、TMP-CiKD_DMT及びＭＧ−１３２の阻害活性を示す図である。 プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、TMP-CiKD_DMT及びＭＧ−１３２の阻害活性を示す図である。 TMP-CiKD_DMT又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を示す図である。 TMP-CiKD_DMTを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 TMP-CiKD_DMTを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。 TMP-CiKD_DMT、ＴＭＰ、又はTMP-CiKD_DMT及びボルテゾミブを添加したＨｅＬａ細胞において、強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析により検出されたバンドの定量結果を示す図である。 TMP-CiKD_DMT、ＴＭＰ、又はTMP-CiKD_DMT及びボルテゾミブを添加したＨｅＬａ細胞において、強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析により検出されたバンドを示す図である。 TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、TMP-CiKD_Bortezomib、又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析結果を示す図である。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書における「タンパク質」は、アミノ酸残基数が２以上であればよく、いわゆる「ペプチド」も含まれる。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
＜タンパク質分解誘導タグ＞
本開示のタンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子である。タンパク質分解誘導タグは、直接的に結合、又はタンパク質結合分子を介して間接的に結合したタンパク質をプロテアーゼによる分解（ノックダウン）へと導くために用いられる。タンパク質分解誘導タグは、標的タンパク質と結合可能である場合には単独で、標的タンパク質と結合可能でない場合には標的タンパク質に結合するタンパク質結合分子とのコンジュゲート（後述するタンパク質分解誘導分子）とすることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、標的タンパク質をプロテアーゼによる分解（ノックダウン）へと導くことが可能である。
なお、タンパク質分解誘導タグが標的タンパク質と結合可能であるとは、タンパク質分解誘導タグが共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等により標的タンパク質と結合可能であればよく、結合態様は制限されない。
以下では、このタンパク質分解誘導タグをＣｉＫＤ（Chemical interaction and KnockDown）タグとも称する。
プロテアーゼとしては特に制限されず、プロテアーゼ活性を有するあらゆる分子が挙げられる。例えば、プロテアソームのような複合体型プロテアーゼであってもよく、プロテアソーム以外のプロテアーゼであってもよい。また、プロテアーゼ活性を有する限り、プロテアソームの一部分であってもよい。
プロテアソームとしては、例えば、２６Ｓプロテアソーム、免疫プロテアソーム、及び胸腺プロテアソームが挙げられる。
２６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに１９Ｓプロテアソームが２つ結合したものである。２０Ｓプロテアソームは、α１〜α７の７つのサブユニットから構成されるαリングと、β１〜β７の７つのサブユニットから構成されるβリングとが、αββαの順に積み重なった筒状構造をしており、β１、β２、及びβ５がそれぞれカスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性という触媒活性を発揮する。
免疫プロテアソームは、触媒サブユニットβ１、β２、及びβ５がそれぞれβ１ｉ、β２ｉ、及びβ５ｉに置き換わったものである（Science, 1994, 265, 1234-1237）。
胸腺プロテアソームは、β１ｉ及びβ２ｉとともに、胸腺皮質上皮細胞（ｃＴＥＣ）特異的に発現するβ５ｔが組み込まれたものである（Science, 2007, 316, 1349-1353）。
また、プロテアソーム以外のプロテアーゼとしては、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、アミノペプチダーゼ、アンジオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体Ｂ因子、補体Ｄ因子、ジペプチジルペプチダーゼＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ディスパーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、フィシン、グランザイムＢ、カリクレイン、ロイシンアミノペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロカスパーゼ３、プロナーゼＥ、プロテイナーゼＫ、レニン、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、細胞質アラニルアミノペプチダーゼ、エンケファリナーゼ、ネプリライシン等が挙げられる。
本明細書において「プロテアーゼに対して親和性を有する」とは、例えば、プロテアーゼに対して共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等により結合可能であることを意味する。タンパク質分解誘導タグの存在下においてプロテアーゼの熱安定性が変化する場合、タンパク質分解誘導タグはプロテアーゼと相互作用可能であると判断することができる。
また、本明細書において「プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない」とは、例えば、プロテアーゼの分解活性サイトに共有結合しないことを意味する。タンパク質分解誘導タグの存在下においてもプロテアーゼによってタンパク質が分解され、更にプロテアーゼ阻害剤を共存させるとタンパク質の分解が阻害される場合、タンパク質分解誘導タグはプロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないと判断することができる。
タンパク質分解誘導タグとしては、低分子化合物、天然物、ペプチド等が挙げられる。タンパク質分解誘導タグの分子量は、例えば、５０〜５０００の範囲内である。
タンパク質分解誘導タグの構造は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないものである限り、特に制限されない。タンパク質分解誘導タグは、候補分子の中から後述するスクリーニング方法によって得ることもでき、また、後述する製造方法によって製造することもできる。
ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、例えば、下記式（Ｉ）で表される構造とすることができる。
式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜２０の炭化水素基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数６〜２０のアリールオキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、又はハロゲノ基を示す。
炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アリール基、これらの組み合わせ等が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基等の炭素数１〜２０のアルキル基；ビニル基、アリル基等の炭素数２〜２０のアルケニル基；フェニル基、ナフチル基等の炭素数６〜２０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基等の炭素数７〜２０のアリールアルキル基；トリル基、キシリル基等の炭素数７〜２０のアルキルアリール基；等が挙げられる。
ハロゲノ基としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。
別の態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造とすることができる。プロテアソーム阻害活性としては、より具体的には、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性が挙げられる。
ここで、「プロテアソーム阻害活性を失活させた構造」には、プロテアソーム阻害活性を完全に消失させた構造に加え、プロテアソーム阻害活性を減弱させた構造も含まれる。ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、元のプロテアソーム阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の２倍以上である。
プロテアソーム阻害剤としては、プロテアソーム阻害活性を有するあらゆる化合物を使用することができる。プロテアソーム阻害剤は、プロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）に対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアソーム阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
プロテアソーム阻害剤は、抗癌剤等として研究が進んでおり、医薬品として認可済みの化合物及び臨床試験中の化合物が数多く存在する。また、プロテアソーム阻害剤は、分子量が比較的小さく、疎水性が低いものが多く、細胞膜透過性、細胞毒性等の問題も生じ難い。このため、プロテアソーム阻害剤を基にタンパク質分解誘導タグを合成することは、非常に合理的且つ効率的である。
プロテアソーム阻害剤の一例を以下の表１及び表２に示す。表１及び表２に示すプロテアソーム阻害剤は、いずれも２０Ｓプロテアソームに対して親和性を有する２０Ｓプロテアソーム阻害剤である。ただし、本実施形態で使用可能なプロテアソーム阻害剤がこれらの例に限定されるものではない。
例えば、ボロン酸型プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（Bortezomib）は、下記式に示すように、活性部位であるボロニル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al. Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
また、ボロン酸型プロテアソーム阻害剤であるＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８は、下記式に示すように、活性部位であるボロン酸エステル部位又はボロニル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al. Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
このため、ボルテゾミブ、ＭＬＮ９７０８、及びＭＬＮ２２３８の活性部位であるボロニル基又はボロン酸エステル部位を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
なお、ＣＥＰ−１８７７０等の他のボロン酸型プロテアソーム阻害剤についても、活性部位を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
また、アルデヒド型プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮは、下記式に示すように、活性部位であるホルミル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al. Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
このため、ＡＬＬＮの活性部位であるホルミル基を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
なお、ＭＧ−１３２、ＢＳｃ−２１１８、ＰＳＩ等の他のアルデヒド型プロテアソーム阻害剤についても、活性部位であるホルミル基を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有するタンパク質分解誘導タグの一例を以下の表３及び表４に示す。表中のＲで表される１価の基としては、カルボキシ基、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数６〜２０のアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
プロテアソーム阻害剤の他の例を以下の表５〜表１０に示す。これらのプロテアソーム阻害剤についても、上記と同様にしてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
別の態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼ阻害剤（前述したプロテアソーム阻害剤を除く）のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造とすることができる。
ここで、「プロテアーゼ阻害活性を失活させた構造」には、プロテアーゼ阻害活性を完全に消失させた構造に加え、プロテアーゼ阻害活性を減弱させた構造も含まれる。ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼ阻害剤の阻害対象となるプロテアーゼに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、元のプロテアーゼ阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の２倍以上である。
プロテアーゼ阻害剤としては、プロテアーゼ阻害活性を有するあらゆる化合物を使用することができる。プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアーゼ阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
プロテアーゼ阻害剤の一例を以下の表１１〜表７８に示す。これらのプロテアーゼ阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。ただし、本実施形態で使用可能なプロテアーゼ阻害剤がこれらの例に限定されるものではない。プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤については、必要に応じて、既存のデータベース（例えば、"MEROPS-the peptidase database"(http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml)）の情報を参照することができる。
なお、以上の説明では、便宜上、プロテアソーム阻害剤とプロテアソーム阻害剤以外のプロテアーゼ阻害剤とを区別したが、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物も知られている。したがって、このような化合物を用いることで、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者に対して親和性を有するタンパク質分解誘導タグを得ることができる。
プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物の一例を下記の表７９に示す。後述する実施例１０では、表７９のＮｏ．１に示すカルパイン阻害剤（ＡＬＬＮ）のプロテアーゼ（プロテアソーム）阻害活性を失活させたタンパク質分解誘導タグを用いている。ただし、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物はこれらの例に限定されるものではない。
別の態様では、タンパク質分解誘導タグとして、プロテアソーム活性化剤を使用することができる。プロテアソーム活性化剤は、プロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）に対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しない化合物であり、タンパク質分解誘導タグとして使用することができる。すなわち、本開示によれば、プロテアソーム活性化剤のタンパク質分解誘導タグとしての使用が提供される。
プロテアソーム活性化剤の一例を以下の表８０〜表８２に示す。ただし、本実施形態で使用可能なプロテアソーム活性化剤がこれらの例に限定されるものではない。
＜タンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法＞
本開示のタンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法は、候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子を選抜する工程を含むものである。ある態様では、プロテアーゼはプロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）である。
候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子を選抜する方法は特に制限されず、例えば、以下の方法を採用することができる。
まず、候補分子を準備する。候補分子としては、化合物ライブラリー、薬剤ライブラリー、天然物ライブラリー等のライブラリーを利用することができる。候補分子は、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）用のプレート、マイクロアレイプレート、金属プレート等の各ウェルに固定化しておくことが好ましい。
次いで、各ウェルに固定化された候補分子に対して、蛍光色素、核酸（ｍＲＮＡ又はＤＮＡ）等で標識されたプロテアーゼを作用させた後、各ウェルを洗浄する。プロテアーゼの蛍光色素による標識には、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）との融合タンパク質、Ｃ末端ラベル化による標識等を利用することができる。また、プロテアーゼの核酸による標識には、ＩＶＶ（in vitro virus）法（ｍＲＮＡディスプレイ法とも称される）、ＤＮＡディスプレイ法等のディスプレイ法などを利用することができる。
そして、プロテアーゼの標識に基づき、プロテアーゼに対して親和性を有する分子を特定する。プロテアーゼが蛍光色素で標識されている場合、蛍光を検出することで、プロテアーゼに対して親和性を有する分子を特定することができる。また、プロテアーゼがｍＲＮＡで標識されている場合、逆転写ＰＣＲにより核酸の配列を検出することで、プロテアーゼに対して親和性を有する分子を特定することができる。
次いで、プロテアーゼに対して親和性を有する分子の中から、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子を特定する。プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害するか否かの評価には、例えば、後述する実施例に記載した方法を採用することができる。
＜タンパク質分解誘導タグの製造方法＞
本開示のタンパク質分解誘導タグの製造方法は、プロテアーゼ阻害剤の活性部位の構造を改変し、プロテアーゼ阻害活性を失活させる工程を含むものである。ある態様では、プロテアーゼ阻害剤はプロテアソーム阻害剤であり、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させることによりタンパク質分解誘導タグを製造する。
前述したとおり、プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアーゼ阻害剤の活性部位の構造を改変し、プロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを製造することができる。
タンパク質分解誘導タグの製造に用いるプロテアーゼ阻害剤は、既知のプロテアーゼ阻害剤であってもよく、候補分子の中からスクリーニングによって得たものであってもよい。すなわち、タンパク質分解誘導タグの製造方法は、候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する分子をプロテアーゼ阻害剤として選抜する工程を更に含んでいてもよい。
例えば、前述したタンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法では、プロテアーゼに対して親和性を有する分子の中から、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子を特定するため、スクリーニング過程で、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する分子（プロテアーゼ阻害剤）を特定することにもなる。そこで、このようにスクリーニングにより得られたプロテアーゼ阻害剤を用いて、タンパク質分解誘導タグを製造してもよい。
＜タンパク質分解誘導タグライブラリー＞
本開示のタンパク質分解誘導タグライブラリーは、前述したタンパク質分解誘導タグを２種以上含むものである。タンパク質分解誘導タグライブラリーは、後述するスクリーニング方法等に利用することが可能である。
＜タンパク質分解誘導分子＞
本開示のタンパク質分解誘導分子は、前述した少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグと、タンパク質に結合する少なくとも１つのタンパク質結合分子とのコンジュゲートである。このタンパク質分解誘導分子によれば、タンパク質結合分子と標的タンパク質とを結合させることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく、標的タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる（例えば、後述する実施例２、７、１２、１５、１６、２１〜２３を参照）。
なお、タンパク質結合分子と標的タンパク質との結合態様としては、共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等が挙げられ、特に制限されない。
標的タンパク質としては、例えば、細胞内又は細胞膜に存在するタンパク質が挙げられる。標的タンパク質は、変異によって生成した変異タンパク質であってもよく、転座等によって生成した融合タンパク質であってもよい。また、標的タンパク質は、内因性のタンパク質であってもよく、ウイルス、細菌等に由来する外来性のタンパク質であってもよい。また、標的タンパク質は、何らかの要因により分解が滞って蓄積したタンパク質であってもよい。ある態様では、標的タンパク質は、細胞周期、シグナル伝達、細胞分化、細胞脱分化、細胞増殖、又はサイトカイン等の生理活性物質の産生に関与するタンパク質である。
なお、標的タンパク質は、予め特定されていなくてもよい。タンパク質分解誘導分子を用いることで、後述のように未知の標的タンパク質を同定することができる。
タンパク質結合分子としては、低分子化合物、抗体、ペプチド等の医薬；サイトカイン、成長因子、ホルモン等の内因性の生理活性物質；天然物、代謝物、植物成分、食品成分などが挙げられる。
標的タンパク質の中には、結合する分子（阻害剤等）が知られているものも存在するため（例えば、国際公開第２００８／１２３２６６号参照）、このような既知の分子をタンパク質結合分子として使用することができる。標的タンパク質に結合する分子が未知の場合には、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）により、結合する分子をスクリーニングしてもよい。また、標的タンパク質と結合する抗体を作製し、これをタンパク質結合分子として使用してもよい。
タンパク質分解誘導タグとタンパク質結合分子とのコンジュゲートの様式は、タンパク質分解誘導タグのプロテアーゼとの親和性、及びタンパク質結合分子のタンパク質との結合性が維持される限り、特に制限されない。
タンパク質分解誘導分子は、例えば、少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグと少なくとも１つのタンパク質結合分子とが連結された構造とすることができる。タンパク質分解誘導分子は、１つのタンパク質分解誘導タグと１つのタンパク質結合分子とが連結された構造であってもよく、１つのタンパク質分解誘導タグと複数のタンパク質結合分子とが連結された構造であってもよく、複数のタンパク質分解誘導タグと１つのタンパク質結合分子とが連結された構造であってもよく、複数のタンパク質分解誘導タグと複数のタンパク質結合分子とが連結された構造であってもよい。ある態様では、タンパク質分解誘導分子は、１つのタンパク質分解誘導タグと１つのタンパク質結合分子とが連結された構造である。
タンパク質分解誘導タグにおけるタンパク質結合分子との連結位置は、プロテアーゼとの親和性が維持される限り、特に制限されない。例えば、タンパク質分解誘導タグが、前述のように、プロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアソーム阻害剤）の活性部位を他の構造部分に置き換えた構造である場合、この置き換えた他の構造部分においてタンパク質結合分子と連結することができる。具体的に、プロテアーゼ阻害剤の活性部位をカルボキシ基に置き換えた場合、カルボキシ基を介してタンパク質結合分子と連結することができる。
一方、タンパク質結合分子におけるタンパク質分解誘導タグとの連結位置は、タンパク質との結合性が維持される限り、特に制限されない。
なお、タンパク質分解誘導タグ及びタンパク質結合分子は、相互に連結可能な構造であってもよい。タンパク質分解誘導タグとタンパク質結合分子とを直接連結することが困難な場合には、相互に連結可能とする構造を、タンパク質分解誘導タグ及びタンパク質結合分子の少なくとも一方に導入することも考えられる。
例えば、タンパク質結合分子としては、標的タンパク質に結合する既知の分子を使用することができるが、この既知の分子とタンパク質分解誘導タグとを直接連結することが困難な場合も想定される。このような場合には、タンパク質分解誘導タグと連結可能な構造を当該既知の分子に導入し、タンパク質結合分子として使用してもよい。
＜タンパク質分解誘導分子ライブラリー＞
本開示のタンパク質分解誘導分子ライブラリーは、前述したタンパク質分解誘導分子を２種以上含むものである。タンパク質分解誘導分子を２種以上含む態様としては、タンパク質分解誘導タグの種類は同じであるものの、タンパク質結合分子の種類が異なる２種以上のタンパク質分解誘導分子を含む態様、タンパク質結合分子の種類は同じであるものの、タンパク質分解誘導タグの種類が異なる２種以上のタンパク質分解誘導分子を含む態様、タンパク質分解誘導タグ及びタンパク質結合分子の種類が異なる２種以上のタンパク質分解誘導分子を含む態様等が挙げられる。
タンパク質分解誘導分子ライブラリーの製造方法は特に制限されない。
タンパク質分解誘導分子ライブラリーの製造方法の一例としては、タンパク質結合分子のライブラリーに含まれる各タンパク質結合分子を、タンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートとする方法が挙げられる。タンパク質結合分子のライブラリーとしては、化合物ライブラリー、薬剤ライブラリー、天然物ライブラリー等が挙げられる。例えば、化学反応、架橋反応等を利用して、タンパク質結合分子のライブラリーに含まれる各タンパク質結合分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、タンパク質分解誘導分子ライブラリーを製造することができる。
タンパク質分解誘導分子ライブラリーの製造方法の他の例としては、前述したタンパク質分解誘導タグライブラリーに含まれる各タンパク質分解誘導タグを、タンパク質結合分子とのコンジュゲートとする方法が挙げられる。
タンパク質分解誘導分子ライブラリーは、後述するスクリーニング方法等に利用することが可能である。
＜医薬組成物＞
本開示の医薬組成物は、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を含むものである。前述したとおり、タンパク質分解誘導タグは、標的タンパク質と結合可能である場合には単独で、標的タンパク質と結合可能でない場合には、標的タンパク質と結合可能なタンパク質結合分子とのコンジュゲート（タンパク質分解誘導分子）とすることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく、標的タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能である。このため、標的タンパク質がある疾患の原因（疾患原因物質）となっている場合には、標的タンパク質を分解へと導くタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いることで、その疾患に対する医薬組成物を製造することができる。そして、この医薬組成物を患者に投与することで、患者の体内において標的タンパク質を分解へと導き、疾患の予防又は治療に繋げることが可能となる（例えば、マウス個体におけるノックダウン実験である後述する実施例１６を参照）。
標的タンパク質の形状に基づいて創薬を行う従来の創薬方法論では、プロテオームの約７５％が医薬にならない標的（undruggable targets）であると言われている。この点、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子によれば、原理的にあらゆるタンパク質を標的とすることができる。
ここで、標的タンパク質は、真核又は原核生物（動物、植物、菌類、酵母、大腸菌等）のタンパク質である。標的タンパク質は、変異によって生成した変異タンパク質であってもよく、転座等によって生成した融合タンパク質であってもよい。また、標的タンパク質は、内因性のタンパク質であってもよく、ウイルス、細菌等に由来する外来性のタンパク質であってもよい。また、標的タンパク質は、何らかの要因により分解が滞って蓄積したタンパク質であってもよい。
医薬組成物は、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子以外の成分を含有していてもよい。例えば、医薬組成物は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、医薬組成物は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。
医薬組成物の剤形は特に制限されない。医薬組成物の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
医薬組成物の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
＜標的タンパク質の分解方法＞
本開示の標的タンパク質の分解方法は、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程を含むものである。
タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する方法は特に制限されない。例えば、細胞、組織、又は臓器を培養する培地にタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を添加してもよい。細胞、組織、及び臓器は、プロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）を有する真核又は原核生物（動物、植物、菌類、酵母、大腸菌等）に由来するものであればよい。或いは、プロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）を有する真核又は原核生物の生体に、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を経口的又は非経口的に投与してもよい。投与対象としては、ヒト等の霊長類、マウス、ラット、豚、犬、猫などが挙げられる。或いは、試験管内（無細胞）のプロテアーゼ分解系（例えば、プロテアソーム分解系）にタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を添加してもよい。
前述したとおり、タンパク質分解誘導タグは、標的タンパク質と結合可能である場合には単独で、標的タンパク質と結合可能でない場合には、標的タンパク質と結合可能なタンパク質結合分子とのコンジュゲート（タンパク質分解誘導分子）とすることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく、標的タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能である。
＜標的タンパク質の機能解析方法＞
本開示の標的タンパク質の機能解析方法は、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程を含むものである。ここで、標的タンパク質の機能解析とは、標的タンパク質が特定されている場合に、その機能を解析することを意味する。標的タンパク質は、その機能が全く解明されていないものに限らず、機能の一部が解明されているものであってもよい。
タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する方法は特に制限されない。例えば、細胞、組織、又は臓器を培養する培地にタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を添加してもよい。或いは、プロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）を有する真核又は原核生物の生体に、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を経口的又は非経口的に投与してもよい。或いは、試験管内（無細胞）の機能解析系に、プロテアーゼ分解系（例えば、プロテアソーム分解系）とともに、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を添加してもよい。
前述したとおり、タンパク質分解誘導タグは、標的タンパク質と結合可能である場合には単独で、標的タンパク質と結合可能でない場合には、標的タンパク質と結合可能なタンパク質結合分子とのコンジュゲート（タンパク質分解誘導分子）とすることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく、標的タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能である。そこで、例えば、真核若しくは原核生物又はその細胞を用いた場合には、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導した後に、細胞又は生体の表現型の変化を解析することで、標的タンパク質の機能を解析することができる。また、試験管内（無細胞）の機能解析系を用いた場合には、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導した後に、標的タンパク質の有無による分子ネットワークの違い（変化）を解析することで、標的タンパク質の機能を解析することができる。
従来、動物の生体内における標的タンパク質の機能を解析する場合には、遺伝子ノックアウトマウスを作製することが一般的である。しかし、遺伝子ノックアウトマウスの作製には長期間（例えば、１年以上）を要するという問題がある。近年、ゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９）が開発されるに至ったが、このＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９の技術を用いても、遺伝子ノックアウトマウスの作製には数ヶ月から半年の期間を要する。この点、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子によれば、標的タンパク質を短期間で分解（ノックダウン）へと導き、遺伝子ノックアウトマウスを作製した場合と同等の効果を奏することができる。また、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子によれば、標的タンパク質の機能を動的に解析することも可能である。
＜標的タンパク質の同定方法＞
本開示の標的タンパク質の同定方法は、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する工程と、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子によって分解が誘導されたタンパク質を同定する工程と、を含むものである。ここで、標的タンパク質の同定とは、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質結合分子に結合する標的タンパク質を同定することを意味する。タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質結合分子は、結合する標的タンパク質が全く知られていないものに限らず、標的タンパク質の一部が知られているものであってもよい。
標的タンパク質の同定方法では、まず、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する。
タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する方法は特に制限されない。例えば、前述した標的タンパク質の分解方法を採用することができる。
次いで、タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子によって分解が誘導されたタンパク質を同定する。前述したとおり、タンパク質分解誘導タグは、標的タンパク質と結合可能である場合には単独で、標的タンパク質と結合可能でない場合には、標的タンパク質と結合可能なタンパク質結合分子とのコンジュゲート（タンパク質分解誘導分子）とすることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく、標的タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能である。そこで、例えば、細胞からタンパク質を抽出してプロテオーム解析を行い、量が減少しているタンパク質を特定することで、標的タンパク質を同定することができる。
＜標的タンパク質を介した経路分子の同定方法＞
本開示の標的タンパク質を介した経路分子の同定方法は、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程と、標的タンパク質以外の活性又は発現が変化したタンパク質を同定する工程と、を含むものである。ここで、標的タンパク質を介した経路分子の同定とは、標的タンパク質が介在するタンパク質経路（シグナル伝達経路等）における、標的タンパク質以外の他のタンパク質を同定することを意味する。標的タンパク質を介した経路分子は、全く知られていないものに限らず、その一部が知られているものであってもよい。
標的タンパク質を介した経路分子の同定方法では、まず、前述したタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する。
タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する方法は特に制限されない。例えば、前述した標的タンパク質の分解方法を採用することができる。
次いで、標的タンパク質以外の活性又は発現が変化したタンパク質を同定する。前述したとおり、タンパク質分解誘導タグは、標的タンパク質と結合可能である場合には単独で、標的タンパク質と結合可能でない場合には、標的タンパク質と結合可能なタンパク質結合分子とのコンジュゲート（タンパク質分解誘導分子）とすることで、標的タンパク質のユビキチン化を介することなく、標的タンパク質をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能である。このとき、標的タンパク質の分解に伴い、標的タンパク質が介在するタンパク質経路上の他のタンパク質についても、活性又は発現が変化し得る。そこで、活性又は発現が変化している他のタンパク質を特定することで、標的タンパク質を介した経路分子を同定することができる。
なお、標的タンパク質の増加又は減少がある疾患の原因となっている場合には、標的タンパク質を介した経路分子を同定することで、疾患のメカニズムの解明にも繋がると考えられる。
＜タンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子のスクリーニング方法＞
本開示のタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子のスクリーニング方法は、前述したタンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーを標的タンパク質が存在する系に供給し、標的タンパク質の分解を誘導するタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程を含むものである。
標的タンパク質が存在する系としては特に制限されず、例えば、プロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）を有する真核又は原核生物の細胞を用いたプロテアーゼ分解系（例えば、プロテアソーム分解系）であってもよく、試験管内（無細胞）のプロテアーゼ分解系（例えば、プロテアソーム分解系）であってもよい。
標的タンパク質が存在する系に供給した、タンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーの中に、標的タンパク質と結合可能なタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子が含まれている場合、標的タンパク質がプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導かれる。そこで、スクリーニングに際しては、そのような標的タンパク質の分解を誘導するタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜すればよい。
上記のスクリーニング方法によれば、原理的に、任意の標的タンパク質を分解へと導くタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を得ることができる。更に、標的タンパク質がある疾患の原因（疾患原因物質）となっている場合には、標的タンパク質を分解へと導くタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を、その疾患の予防又は治療成分候補として選抜することができる。
＜疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法＞
本開示の疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法の一態様は、前述したタンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を改善させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程を含むものである。
また、本開示の疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法の別の態様は、前述したタンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を悪化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜する工程を含むものである。
疾患モデル系としては特に制限されず、疾患モデル動物、疾患モデル細胞等が挙げられる。
疾患モデル系に供給した、タンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーの中に、疾患に関連するタンパク質（疾患関連タンパク質）と結合可能なタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子が含まれている場合、疾患関連タンパク質がプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導かれる。
疾患関連タンパク質が分解される結果、疾患の症状が改善された場合には、その疾患関連タンパク質の増加が、疾患の発症又は進行に関与している可能性がある。そこで、疾患の症状を改善させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜することで、疾患の予防又は治療成分候補を得ることができる。
一方、疾患関連タンパク質が分解される結果、疾患の症状が悪化した場合には、その疾患関連タンパク質の減少が、疾患の発症又は進行に関与している可能性がある。そこで、疾患の症状を悪化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜することで、疾患の予防又は治療成分候補を得ることができる。
＜疾患関連タンパク質の特定方法＞
本開示の疾患関連タンパク質の特定方法は、前述したタンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を変化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜する工程を含むものである。
疾患モデル系にタンパク質分解誘導タグ、タンパク質分解誘導タグライブラリー、タンパク質分解誘導分子、又はタンパク質分解誘導分子ライブラリーを供給すると、疾患モデル系内におけるタンパク質の分解（ノックダウン）に伴い、疾患の症状が変化し得る。そこで、疾患の症状を変化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜することで、疾患関連タンパク質を特定することができる。
特定された疾患関連タンパク質に関する情報は、例えば、疾患の予防又は治療成分の開発に利用することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
以下の実施例で使用される化合物等の略称は以下のとおりである。
ｅｃ：Escherichia coli
ＤＨＦＲ：Dihydrofolate reductase
ＴＭＰ：Trimethoprim
H-Phe-OtBu・HCl：L-Phenylalanine t-butyl ester hydrochloride
ＤＭＦ：N,N-Dimethylformamide
ＤＭＴ−ＭＭ：4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
ＴＦＡ：Trifluoroacetic acid
H-Leu-OtBu・HCl：L-Leucine t-butyl ester hydrochloride
ＤＩＥＡ：N,N-Diisopropylethylamine
Ｄ−ＭＥＭ：Dulbecco's modified eagle's medium
ＦＢＳ：Fetal bovine serum
ＥＤＴＡ：Ethylenediamine tetraacetic acid
ＨＡ：Hemagglutinin
ＧＦＰ：Green fluorescent protein
ＤｓＲｅｄ：Discosoma sp. red fluorescent protein
ＤＭＳＯ：Dimethyl sulfoxide
ＰＢＳ：Phosphate buffered saline
ＴＢＳ：Tris buffered saline
ＳＤＳ：Sodium dodecyl sulfate
ＰＡＧＥ：Polyacrylamide gel ectrophoresis
ＢＰＢ：Bromophenol blue
ＰＶＤＦ：Polyvinylidene difluoride
ＡＭＣ：7-Amino-4-methylcoumarin
H-Gly-OtBu・HCl：L-Glycine t-butyl ester hydrochloride
ＰｙＢＯＰ：1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
ＭＴＸ：Methotrexate
ＤＭＡ：N,N-Dimethylacetamide
ＢＯＰ：1H-Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate
ＴＥＡ：Triethylamine
ＨＡＴＵ：O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate
ＧＡＰＤＨ：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
＜実施例１：タンパク質分解誘導タグとしてCiKD_Bortezomibを用い、タンパク質結合分子としてＴＭＰ誘導体を用いたタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）の合成＞
実施例１では、下記の合成スキームに従って、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_Bortezomibを合成した。
タンパク質分解誘導タグとしては、ボルテゾミブ（Bortezomib）の活性部位であるボロニル基をカルボキシ基に置き換えたBortezomib-COOH（CiKD_Bortezomib）を用いた。また、タンパク質結合分子としては、大腸菌ＤＨＦＲと結合するジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であるＴＭＰにアミノ基を含む官能基を導入したＴＭＰ誘導体（ＴＭＰ−ＮＨ２）を用いた。そして、Bortezomib-COOHとＴＭＰ−ＮＨ２とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_Bortezomibを合成した。
TMP-CiKD_Bortezomibの合成方法の詳細は以下のとおりである。
（化合物１の合成）
ナスフラスコにピラジンカルボン酸（152.8 mg, 1.23 mmol, 1 eq, Code No. 357-00042, 和光純薬工業(株)）及びH-Phe-OtBu・HCl（253.8 mg, 0.98 mmol, 0.8 eq, Code No. 10Y830617, 渡辺化学工業(株)）を仕込み、脱水ＤＭＦを１０ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ−ＭＭ（1.02 g, 3.69 mmol, 3 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（ヘキサン／クロロホルム＝１／１〜０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物１（482.3 mg, 1.47 mmol, quant.）を得た。
（化合物２の合成）
ナスフラスコに化合物１（398.4 mg, 1.22 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを７ｍＬ加え、室温にて２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、化合物２（318.8 mg, 96 %）を得た。
（化合物３の合成）
ナスフラスコに化合物２（271.3 mg, 1.00 mmol, 1 eq）及びH-Leu-OtBu・HCl（223.8 mg, 1.00 mmol, 1 eq, Code No. 14G110356, 渡辺化学工業(株)）を仕込み、脱水ＤＭＦを１０ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＥＡを２ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ−ＭＭ（553.4 mg, 2.00 mmol, 2 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて３時間撹拌した。冷却下で２０ｍＬの１０質量％食塩水／０．１Ｎ 塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。０．５Ｎ 塩酸水溶液、次いで食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（ヘキサン／クロロホルム＝１／１〜０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物３（168.1 mg, 0.38 mmol, 38%）を得た。
（化合物４（Bortezomib-COOH）の合成）
ナスフラスコに化合物３（157.3 mg, 0.36 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを６ｍＬ加え、室温にて２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、化合物４（Bortezomib-COOH）（179.6 mg, 0.48 mmol, quant.）を得た。
（化合物５（TMP-CiKD_Bortezomib）の合成）
ナスフラスコに化合物４（Bortezomib-COOH）（55.7 mg, 0.15 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＭＰ−ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（62.7 mg, 0.15 mmol, 1 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを７ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＥＡを２ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ−ＭＭ（207.5 mg, 0.75 mmol, 5 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて３時間撹拌した。冷却下で２０ｍＬの１０質量％食塩水／０．１Ｎ 塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。０．５Ｎ 塩酸水溶液、次いで食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）により分離精製処理を行った。次いで、TLC silica gel 60（Code No. HX264817, Merck）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いた分離精製処理により、化合物５（TMP-CiKD_Bortezomib）（2.3 mg, 0.0029 mmol, 2%, isolated yield）を得た。
＜実施例２：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析）＞
実施例２では、TMP-CiKD_Bortezomibを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
（培養細胞の準備）
前培養培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（Code No. 041-29775, 和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ（Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone）及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（Code No. 168-23191, 和光純薬工業(株)）を添加した培地を準備した。そして、この前培養培地中、ＨｅＬａ細胞（Lot No. 60143948, ATCC）を３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。継代培養時の培養皿としては、直径１００ｍｍのCell Culture Dish-Treated（Sterile, Non pyrogenic）（Code No. TR4002, TrueLine）を用いた。継代培養は７０％〜８０％コンフルエント時に行い、トリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（Code No. 201-16945, 和光純薬工業(株)）処理により細胞を剥離した後、４分の１量の細胞を１０ｍＬの前培養培地で培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質である大腸菌ＤＨＦＲ（詳細には、ＨＡタグを介した大腸菌ＤＨＦＲとＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄを一過的に過剰発現させ、TMP-CiKD_Bortezomibの標的タンパク質への作用を評価した。
プラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）は、ブランダイス大学（米国）のLizbeth Hedstrom教授より提供を受けた（Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation.", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）。pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFPのプラスミドマップを図１に示す。このプラスミドを大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（Code No. 27106, QIAGEN）で精製した。
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入には、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（Code No. 297-73201, 和光純薬工業(株)）を用いた。ScreenFectAのDilution Bufferを２本の１．５ｍＬチューブに６００μＬずつ加えた。そして、一方のチューブにはScreenFectAのTransfection Reagentを３０μＬ添加し（溶液Ａ）、他方のチューブにはプラスミドを１２μｇ添加し（溶液Ｂ）、それぞれを軽くピペッティングした後、室温にて２分間静置した。溶液Ａと溶液Ｂとを軽く混ぜ合わせ、室温にて３０分間静置した（溶液Ｃ）。トリプシン処理により回収した１．２×１０５細胞／２４ｍＬの細胞溶液に溶液Ｃを混合し、２４ウェルプレート（Code No. TR5002, TrueLine, 日本ジェネティクス(株)）に４×１０４細胞／８００μＬ／ウェルの細胞密度で播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）の添加）
以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_Bortezomibを添加した。プラスミドを導入してから４０時間培養後、前培養培地を除去し、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyrvate）（Code No. 045-32245, 和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Code No. G7513, Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を各ウェル当たり３００μＬ添加した。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。所定濃度のTMP-CiKD_Bortezomibを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。
なお、コントロールとしては、TMP-CiKD_Bortezomibを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（ＦＡＣＳ解析によるTMP-CiKD_Bortezomibの標的分解（ノックダウン）の評価）
TMP-CiKD_Bortezomib（８０μＭ）又はＴＭＰ（８０μＭ）の添加２４時間後、培地を除去し、３７℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（Code No. 041-29775, 和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ（Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone）及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（Code No. 168-23191, 和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり３００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、４℃のＦＡＣＳバッファー（１質量％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、氷上に静置した。
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、細胞中におけるＧＦＲ及びＤｓＲｅｄの発現を定量した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー(株)）により細胞１個当たりのＧＦＲ／ＤｓＲｅｄ比を算出し、標的分解によるグラフのシフトから、TMP-CiKD_Bortezomibによる標的分解（ノックダウン）の効率を確認した。
TMP-CiKD_Bortezomibを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図２Ａに示す。また、ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図２Ｂに示す。
図２Ａに示すとおり、TMP-CiKD_Bortezomib（８０μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）と比較してグラフが大きく左にシフトしており、標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）が分解されていることが確認できた。シフト量から推測される分解効率は５０％〜６０％程度であった。一方、図２Ｂに示すとおり、ＴＭＰ（８０μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、標的タンパク質が分解されていないことが確認できた。
＜実施例３：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）を添加したＨｅＬａ細胞における、タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）と強制発現標的タンパク質（ｅｃＤＨＦＲ）との親和性の評価（熱シフトアッセイ）＞
実施例３では、TMP-CiKD_Bortezomibを添加したＨｅＬａ細胞における、TMP-CiKD_Bortezomibと強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）との親和性について、熱シフトアッセイにより評価した。
（培養細胞の準備、ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。また、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞にプラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を導入した後、２４ウェルプレートに播種した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）の添加）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_Bortezomibを添加した。コントロールとしては、TMP-CiKD_Bortezomibを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（熱シフトアッセイによるTMP-CiKD_Bortezomibの標的親和性の評価）
TMP-CiKD_Bortezomib（４０μＭ）又はＴＭＰ（４０μＭ）の添加３時間後、培地を除去し、３７℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（Code No. 041-29775, 和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ（Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone）及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（Code No. 168-23191, 和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり３００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、ＣＥＴＳＡバッファー（ＴＢＳにプロテアーゼ阻害剤であるcOmplete, Mini, EDTA-free（Roche）を使用直前に添加）を１８０μＬ添加して懸濁した。懸濁後の細胞溶液を９本の１．５ｍＬチューブに２０μＬずつ分注し、室温にて３０分間静置した。静置後、９本のチューブをそれぞれ３８℃、４２℃、４６℃、５０℃、５４℃、５８℃、６２℃、６６℃、又は７０℃で３分間熱処理し、室温にて３分間静置した。静置後、細胞溶液を液体窒素で瞬間凍結し、氷上で融解させた。この凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３５００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり１７μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１５０Ｖで４０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、４０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を１５００倍希釈して用いた。室温にて９０分間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
TMP-CiKD_Bortezomib又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を図３に示す。
図３に示すとおり、コントロール（ＤＭＳＯ）では約５０℃までしか大腸菌ＤＨＦＲを検出することができなかったが、ＴＭＰ（４０μＭ）を添加した場合には、大腸菌ＤＨＦＲとＴＭＰとが相互作用することにより、約５４℃まで大腸菌ＤＨＦＲを検出することができた。同様に、TMP-CiKD_Bortezomib（４０μＭ）を添加した場合には、大腸菌ＤＨＦＲとTMP-CiKD_Bortezomibとが相互作用することにより、約５４℃まで大腸菌ＤＨＦＲを検出することができた。なお、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ単独では、大腸菌ＤＨＦＲと相互作用することはなかった。
この結果から、TMP-CiKD_Bortezomibは、ＴＭＰ−ＮＨ２とCiKD_Bortezomibとが連結されたものであるが、ＴＭＰと同程度に大腸菌ＤＨＦＲとの親和性を有することが確認できた。
＜実施例４：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）のプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性の評価＞
実施例４では、TMP-CiKD_Bortezomibのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。
評価には、20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold（Bioscience）を用い、２０Ｓプロテアソームのβ５（キモトリプシン様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ１（カスパーゼ様活性）の各βサブユニットに特異的なＡＭＣ結合プロテアソーム蛍光基質のＣ末端が切断されることにより生成するＡＭＣをMulti-Detection Microplate Reader（Synergy HT, BIO-TEK）により測定した。測定波長は、励起光（Ex.）を３６０ｎｍ、蛍光（Em.）を４６０ｎｍとした。
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図４Ａ〜図４Ｃに示す。
図４Ａ〜図４Ｃに示すとおり、β１及びβ５に対して、TMP-CiKD_Bortezomibでは、ボルテゾミブ単独と比較して阻害活性がほぼ弱まり、ボルテゾミブの阻害活性が失活していることが確認できた。β２については、ボルテゾミブではあまり阻害されないことが報告されており（Kisselev, A.F. et al. Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）、この報告と矛盾しない結果であった。
また、β２及びβ５に対して、TMP-CiKD_Bortezomibの濃度依存的に阻害活性が高まることから、TMP-CiKD_Bortezomibとプロテアソームとの親和性が確認された。
＜実施例５：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_Bortezomib）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定＞
実施例５では、TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブ（Code No. sc-217785, Santa Cruz Biotechnology）について、２０Ｓプロテアソームのβ１、β２、及びβ５の各プロテアソーム活性に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した。
５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定には、20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold（Bioscience）を用い、２０Ｓプロテアソームのβ５（キモトリプシン様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ１（カスパーゼ様活性）の各βサブユニットに特異的なＡＭＣ結合プロテアソーム蛍光基質のＣ末端が切断されることにより生成するＡＭＣをMulti-Detection Microplate Reader（Synergy HT, BIO-TEK）により測定した。測定波長は、励起光（Ex.）を３６０ｎｍ、蛍光（Em.）を４６０ｎｍとした。
試験化合物（TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブ）は、それぞれ以下の表８３に示す６点の濃度に調整した。
試験化合物と２０Ｓプロテアソーム（０．１μｇ）とを室温で３０分間インキュベーションした。そこへ発光基質であるSuc-LLVY-AMC（β５により分解される）、Bz-VGR-AMC（β２により分解される）、及びZ-LLE-AMC（β１により分解される）をそれぞれ１００μＭとなるように加え、室温でインキュベーションした。１時間後にプロテアソーム活性により生成したＡＭＣを測定した。試験化合物の各々の濃度におけるプロテアソーム分解阻害値を、コントロール（ＤＭＳＯ）との相対値として求めた。６点の濃度の阻害値を用い、解析ソフトウェアImageJ（NIH）により回帰曲線を作成し、４係数（ａ：マルサス係数、ｂ：混雑定数、ｃ：傾き、ｄ：切片）を得た。そして、得られた４係数及びｙ＝０．５（５０％阻害）を以下の４係数ロジスティック曲線の回帰式に導入し、ｘの値（ＩＣ５０）を算出した。
４係数ロジスティック曲線の回帰式：ｙ＝ｄ＋(ａ−ｄ)／(１＋(ｘ／ｃ)ｂ)
TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を以下の表８４に示す。
表８４に示すとおり、TMP-CiKD_Bortezomibは、ボルテゾミブと比較して、β１、β２、及びβ５の全てについて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が大きく増加しており、ボルテゾミブの阻害活性が失活していることが確認できた。
＜実施例６：タンパク質分解誘導タグとしてCiKD_ALLNを用い、タンパク質結合分子としてＴＭＰ誘導体を用いたタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）の合成＞
実施例６では、下記の合成スキームに従って、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_ALLNを合成した。
タンパク質分解誘導タグとしては、ＡＬＬＮの活性部位であるホルミル基をカルボキシ基に置き換えたALLN-COOH（CiKD_ALLN）を用いた。また、タンパク質結合分子としては、実施例１と同様にＴＭＰ−ＮＨ２を用いた。そして、ALLN-COOHとＴＭＰ−ＮＨ２とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_ALLNを合成した。
TMP-CiKD_ALLNの合成方法の詳細は以下のとおりである。
（化合物６（ALLN-COOH）の合成）
ナスフラスコにＡＬＬＮ（87.2 mg, 0.23 mmol, 1 eq, Code No. 07036-24, ナカライテスク(株)）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、Oxone（212.1 mg, 0.69 mmol, 3 eq, Code No. 228036, Sigma-Aldrich）を反応溶液に直接加え、室温にて５時間撹拌した。反応溶液を水で希釈した後、クロロホルムで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜１０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物６（ALLN-COOH）（27.0 mg, 0.068 mmol, 30%）を得た。
（化合物７（TMP-CiKD_ALLN）の合成）
ナスフラスコに化合物６（ALLN-COOH）（26.8 mg, 0.067 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＭＰ−ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（26.0 mg, 0.060 mmol, 0.9 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＥＡを０．１ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ−ＭＭ（30.0 mg, 0.11 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて２時間撹拌した。冷却下で１０ｍＬの１０質量％食塩水／０．１Ｎ 塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。０．５Ｎ 塩酸水溶液、次いで食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いた分離精製処理により、化合物７（TMP-CiKD_ALLN）（8.2 mg, 0.010 mmol, 15%, isolated yield）を得た。
＜実施例７：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析）＞
実施例７では、TMP-CiKD_ALLNを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
（培養細胞の準備、ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。また、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞にプラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を導入した後、２４ウェルプレートに播種した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）の添加）
TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_ALLNを用いること以外は実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_ALLNを添加した。コントロールとしては、TMP-CiKD_ALLNを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（ＦＡＣＳ解析によるTMP-CiKD_ALLNの標的分解（ノックダウン）の評価）
TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_ALLNを用いること以外は実施例２と同様にして、TMP-CiKD_ALLNによる標的分解（ノックダウン）の効率を確認した。
TMP-CiKD_ALLNを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図５Ａに示す。また、ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図５Ｂに示す。
図５Ａに示すとおり、TMP-CiKD_ALLN（８０μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）と比較してグラフが大きく左にシフトしており、標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）が分解されていることが確認できた。シフト量から推測される分解効率は６０％〜７０％程度であった。一方、図５Ｂに示すとおり、ＴＭＰ（８０μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、標的タンパク質が分解されていないことが確認できた。
＜実施例８：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）を添加したＨｅＬａ細胞における、タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）と強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）との親和性の評価（熱シフトアッセイ）＞
実施例８では、TMP-CiKD_ALLNを添加したＨｅＬａ細胞における、TMP-CiKD_ALLNと強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）との親和性について、熱シフトアッセイにより評価した。
（培養細胞の準備、ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。また、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞にプラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を導入した後、２４ウェルプレートに播種した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）の添加）
TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_ALLNを用いること以外は実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_ALLNを添加した。コントロールとしては、TMP-CiKD_ALLNを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（熱シフトアッセイによるTMP-CiKD_ALLNの標的親和性の評価）
TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_ALLNを用いること以外は実施例３と同様にして、熱シフトアッセイによるTMP-CiKD_ALLNの標的親和性の評価を行った。
TMP-CiKD_ALLN又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を図６に示す。
図６に示すとおり、コントロール（ＤＭＳＯ）では約５０℃までしか大腸菌ＤＨＦＲを検出することができなかったが、ＴＭＰ（４０μＭ）を添加した場合には、大腸菌ＤＨＦＲとＴＭＰとが相互作用することにより、約５４℃まで大腸菌ＤＨＦＲを検出することができた。同様に、TMP-CiKD_ALLN（４０μＭ）を添加した場合には、大腸菌ＤＨＦＲとTMP-CiKD_ALLNとが相互作用することにより、約５８℃まで大腸菌ＤＨＦＲを検出することができた。
この結果から、TMP-CiKD_ALLNは、ＴＭＰ−ＮＨ２とCiKD_ALLNとが連結されたものであるが、大腸菌ＤＨＦＲとの親和性がＴＭＰよりも高いことが確認できた。
＜実施例９：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）のプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性の評価＞
実施例９では、TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_ALLNを用いること以外は実施例４と同様にして、TMP-CiKD_ALLNのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図７Ａ〜図７Ｃに示す。
図７Ａ〜図７Ｃに示すとおり、β２及びβ５の活性に対して、TMP-CiKD_ALLNでは、ＡＬＬＮ単独と比較して阻害活性が弱まり、ＡＬＬＮの阻害活性が失活していることが確認できた。β１については、ＡＬＬＮではあまり阻害されないことが報告されており（Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266）、この報告と矛盾しない結果であった。
また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、TMP-CiKD_ALLNの濃度依存的に阻害活性が高まることから、TMP-CiKD_ALLNとプロテアソームとの親和性が確認された。
＜実施例１０：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_ALLN）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定＞
実施例１０では、TMP-CiKD_Bortezomib及びボルテゾミブの代わりにTMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮ（Code No. 07036-82, ナカライテスク(株)）を用いること以外は実施例５と同様にして、２０Ｓプロテアソームのβ１、β２、及びβ５の各プロテアソーム活性に対するTMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した。なお、試験化合物（TMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮ）は、それぞれ以下の表８５に示す６点の濃度に調整した。
TMP-CiKD_ALLN及びＡＬＬＮの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を以下の表８６に示す。
表８６に示すとおり、TMP-CiKD_ALLNは、ＡＬＬＮと比較して、β１、β２、及びβ５の全てについて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が大きく増加しており、ＡＬＬＮの阻害活性が失活していることが確認できた。
＜実施例１１：タンパク質分解誘導タグとしてCiKD_MLNを用い、タンパク質結合分子としてＴＭＰ誘導体を用いたタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_MLN）の合成＞
実施例１１では、下記の合成スキームに従って、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_MLNを合成した。
タンパク質分解誘導タグとしては、ＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８の活性部位であるボロン酸エステル部位又はボロニル基をカルボキシ基に置き換えたMLN-COOH（CiKD_MLN）を用いた。また、タンパク質結合分子としては、実施例１と同様にＴＭＰ−ＮＨ２を用いた。そして、MLN-COOHとＴＭＰ−ＮＨ２とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_MLNを合成した。
TMP-CiKD_MLNの合成方法の詳細は以下のとおりである。
（化合物８の合成）
枝付きナスフラスコにH-Gly-OtBu・HCl（286.8 mg, 1.69 mmol, 1 eq, Code No. AK-46074, Ark Pharm）を仕込み、窒素置換した。窒素気流下で脱水ＤＭＦ１０ｍＬとＤＩＥＡ５ｍＬとを加え、室温にて撹拌した。２，５−ジクロロ安息香酸（309.3 mg, 1.62 mmol, 1 eq, Code No. AK-47665, Ark Pharm）を１ｍＬの脱水ＤＭＦ及び１ｍＬのＤＩＥＡに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（1.02 g, 1.96 mmol, 1.2 eq, Code No. 8.51009.0005, Novabiochem, Merck）を１ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチル／ヘキサン（＝４／１）で２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（ヘキサン／クロロホルム＝１／１〜０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物８（531.0 mg, 1.75 mmol, 103%）を得た。
（化合物９の合成）
ナスフラスコに化合物８（212.4 mg, 0.70 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを５ｍＬ加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、化合物９（190.7 mg, quant.）を得た。
（化合物１０の合成）
枝付きナスフラスコに化合物９（190.7 mg, 0.77 mmol, 1 eq）及びH-Leu-OtBu・HCl（175.8 mg, 0.79 mmol, 1 eq, Code No. 14G110356, 渡辺化学工業(株)）を仕込み、窒素置換した。窒素気流下で脱水ＤＭＦ５ｍＬとＤＩＥＡ５ｍＬとを加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（886.7 mg, 1.70 mmol, 2.2 eq, Code No. 8.51009.0005, Novabiochem, Merck）を１．５ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチル／ヘキサン（＝４／１）で２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（ヘキサン／クロロホルム＝１／１〜０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物１０（244.2 mg, 0.58 mmol, 76%）を得た。
（化合物１１（MLN-COOH）の合成）
ナスフラスコに化合物１０（240.8 mg, 0.58 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを５ｍＬ加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、化合物１１（MLN-COOH）（214.7 mg, 0.59 mmol, 100%）を得た。
（化合物１２（TMP-CiKD_MLN）の合成）
枝付きナスフラスコに化合物１１（MLN-COOH）（210.3 mg, 0.58 mmol, 1 eq）を仕込み、窒素置換した。別途合成したＴＭＰ−ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（207.6 mg, 0.48 mmol, 0.8 eq）を５ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加えた。ＤＩＥＡを５ｍＬ加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（765.2 mg, 1.47 mmol, 2.5 eq, Code No. 8.51009.0005, Novabiochem, Merck）を１．５ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜４／１, gradient）により分離精製処理を行った。次いで、TLC silica gel 60（Code No. HX264817, Merck）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いた分離精製処理により、化合物１２（TMP-CiKD_MLN）（20.2 mg, 0.026 mmol, 5%, isolated yield）を得た。
＜実施例１２：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_MLN）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析）＞
実施例１２では、TMP-CiKD_MLNを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
（培養細胞の準備、ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。また、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞にプラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を導入した後、２４ウェルプレートに播種した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_MLN）の添加）
TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_MLNを用いること以外は実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_MLNを添加した。また、TMP-CiKD_MLNを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、TMP-CiKD_MLN及びボルテゾミブを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。コントロールとしては、TMP-CiKD_MLNを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（ＦＡＣＳ解析によるTMP-CiKD_MLNの標的分解（ノックダウン）の評価）
TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_MLN、又はTMP-CiKD_MLN及びボルテゾミブを用いること以外は実施例２と同様にして、TMP-CiKD_MLNによる標的分解（ノックダウン）の効率を確認した。
TMP-CiKD_MLNを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図８Ａに示す。また、ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図８Ｂに示す。また、TMP-CiKD_MLN及びボルテゾミブを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図８Ｃに示す。
図８Ａに示すとおり、TMP-CiKD_MLN（８０μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）と比較してグラフが大きく左にシフトしており、標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）が分解されていることが確認できた。シフト量から推測される分解効率は６０％〜７０％程度であった。一方、図８Ｂに示すとおり、ＴＭＰ（８０μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、標的タンパク質が分解されていないことが確認できた。
また、図８Ｃに示すとおり、TMP-CiKD_MLN（８０μＭ）及びボルテゾミブ（１．５μＭ）を添加した場合には、TMP-CiKD_MLN（８０μＭ）を添加した場合よりも標的タンパク質の分解が阻害された。この結果は、TMP-CiKD_MLNによって、標的タンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていたことを示唆している。
＜実施例１３：タンパク質分解誘導タグとしてCiKD_MLNを用い、タンパク質結合分子としてＭＴＸ誘導体を用いたタンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）の合成＞
実施例１３では、下記の合成スキームに従って、タンパク質分解誘導分子であるMTX-CiKD_MLNを合成した。
タンパク質分解誘導タグとしては、ＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８の活性部位であるボロン酸エステル部位又はボロニル基をカルボキシ基に置き換えたMLN-COOH（CiKD_MLN）を用いた。また、タンパク質結合分子としては、ＤＨＦＲと結合するジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であるＭＴＸにアミノ基を含む官能基を導入したＭＴＸ誘導体（ＭＴＸ−ＮＨ２）を用いた。そして、MLN-COOHとＭＴＸ−ＮＨ２とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるMTX-CiKD_MLNを合成した。
MTX-CiKD_MLNの合成方法の詳細は以下のとおりである。
（化合物２１（MTX-NH2）の合成）
化合物１３をＤＭＡ中でトリフェニルホスフィンジブロミドと反応させ、化合物１４を得た。化合物１４を窒素気流下でＤＭＡに溶解した後、化合物１５とＤＩＥＡとを加えて反応させ、化合物１６を得た（収率：69%）。次いで、化合物１６と化合物１７とを窒素気流下でＤＭＳＯに溶解し、ＢＯＰ試薬により縮合反応を行い、化合物１８を得た（収率：46%）。次いで、化合物１８と化合物１９とを窒素気流下でＤＭＡに溶解し、ＨＡＴＵにより縮合反応を行い、化合物２０を得た（収率：69%）。次いで、化合物２０をジクロロメタンに溶解し、ＴＦＡにより脱保護を行うことで、化合物２１（MTX-NH2）を得た。
（化合物２２（MTX-CiKD_MLN）の合成）
化合物２１（MTX-NH2）と、化合物１２（TMP-CiKD_MLN）の合成に用いた化合物１１とを窒素気流下でＤＭＦに溶解し、ＰｙＢＯＰにより縮合反応を行った（室温、３時間）。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１〜４／１, gradient）により分離精製処理を行った。次いで、TLC silica gel 60（クロロホルム／メタノール＝８５／１５）を用いた分離精製処理により、化合物２２（MTX-CiKD_MLN）を得た（単離収率：8%）。
＜実施例１４：タンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）を添加したＨｅＬａ細胞における、タンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）と内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）との親和性の評価（熱シフトアッセイ）＞
実施例１４では、MTX-CiKD_MLNを添加したＨｅＬａ細胞における、MTX-CiKD_MLNと内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）との親和性について、熱シフトアッセイにより評価した。
（培養細胞の準備及び細胞播種）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。トリプシン処理により回収した細胞溶液を、２４ウェルプレート（Code No. TR5002, TrueLine, 日本ジェネティクス（株））に４×１０４細胞／８００μＬ／ウェルの細胞密度で播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）の添加）
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にMTX-CiKD_MLNを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyrvate）（Code No. 045-32245, 和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Code No. G7513, Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。MTX-CiKD_MLNを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、前培養培地を除去したウェルに各ウェル当たり５００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。
なお、コントロールとしては、MTX-CiKD_MLNを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＭＴＸを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（熱シフトアッセイによるMTX-CiKD_MLNの標的親和性の評価）
MTX-CiKD_MLN（４０μＭ）又はＭＴＸ（４０μＭ）の添加３時間後、培地を除去し、３７℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（Code No. 041-29775, 和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ（Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone）及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（Code No. 168-23191, 和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり０．８ｍＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、ＣＥＴＳＡバッファー（ＴＢＳにプロテアーゼ阻害剤であるcOmplete, Mini, EDTA-free（Roche）を使用直前に添加）を１７０μＬ添加して懸濁した。懸濁後の細胞溶液を９本の１．５ｍＬチューブに２０μＬずつ分注し、室温にて３０分間静置した。静置後、９本のチューブをそれぞれ３８℃、４２℃、４６℃、５０℃、５４℃、５８℃、６２℃、６６℃、又は７０℃で３分間熱処理し、室温にて３分間静置した。静置後、細胞溶液を液体窒素で瞬間凍結し、氷上で融解させた。この凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３５００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり１７μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１６０Ｖで６０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＤＨＦＲ抗体（sc-377091, SantaCruz）を５００倍希釈して用いた。４℃にて一晩振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, BETHYL）を１００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを添加したＨｅＬａ細胞における内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を図９に示す。
図９に示すとおり、コントロール（ＤＭＳＯ）では約４２℃までしかヒトＤＨＦＲを検出することができなかったが、MTX-CiKD_MLN（４０μＭ）を添加した場合には、ヒトＤＨＦＲとMTX-CiKD_MLNとが相互作用することにより、約５０℃までヒトＤＨＦＲを検出することができた。
この結果から、MTX-CiKD_MLNは、ＭＴＸ−ＮＨ２とCiKD_MLNとが連結されたものであるが、ヒトＤＨＦＲとの親和性を有することが確認できた。
＜実施例１５：タンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）を添加したＨｅＬａ細胞における内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析）＞
実施例１５では、MTX-CiKD_MLNを添加したＨｅＬａ細胞における内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
（培養細胞の準備及び細胞播種）
実施例１４と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備し、２４ウェルプレートに播種した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）の添加）
実施例１４と同様にして、ＨｅＬａ細胞にMTX-CiKD_MLNを添加した。コントロールとしては、MTX-CiKD_MLNを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＭＴＸを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（ウェスタンブロット解析によるMTX-CiKD_MLNの標的分解（ノックダウン）の評価）
MTX-CiKD_MLN（５０μＭ、１００μＭ、若しくは２００μＭ）又はＭＴＸ（５０μＭ、１００μＭ、若しくは２００μＭ）の添加１６時間後、培地を除去し、４℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free (REF 11 836 170 001), Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップ（P1000）を用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり２０μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１６０Ｖで６５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。メンブレンは、２５ｋＤａマーカーの位置で２つに分割した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＤＨＦＲ抗体（sc-14780, SantaCruz、５００倍希釈）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて９０分間（抗ＤＨＦＲ抗体）又は４５分間（抗ＧＡＰＤＨ抗体）振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。
MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを添加したＨｅＬａ細胞において、内在発現標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析により検出されたバンドの定量結果を図１０Ａに示し、検出されたバンドを図１０Ｂに示す。
図１０Ａ及び図１０Ｂに示すとおり、MTX-CiKD_MLNを添加した場合には、濃度依存的に標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）の量が減少した。一方、ＭＴＸを添加した場合には、濃度が２００μＭの場合であっても、標的タンパク質（ヒトＤＨＦＲ）の量の減少は観察されなかった。
＜実施例１６：タンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）を投与したマウス個体における内在発現標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価＞
実施例１６では、MTX-CiKD_MLNを投与したマウス個体における内在発現標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
（マウスへのタンパク質分解誘導分子（MTX-CiKD_MLN）の投与）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（７週齢、雄）（日本クレア(株)）に、ＤＭＳＯ、１０ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ、５０ｍｇ／ｋｇ MTX-CiKD_MLN、又は１００ｍｇ／ｋｇ MTX-CiKD_MLNを２４時間投与した（ｎ＝３）。MTX-CiKD_MLN及びＭＴＸは、ＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＳＯの濃度が１０体積％となるようにトウモロコシ油（Code No. 25606-55，ナカライテスク(株)）に溶解させ、腹腔内投与した。マウスは、餌及び水が自由摂取できる環境下で飼育した。投与２４時間後に、ソムノペンチル（製造番号：3214101、共立製薬(株)）による深麻酔下で、マウスを解剖した。肝臓、腎臓、脾臓、心臓、及び肺を摘出し、液体窒素で瞬間凍結させた。
（マウス組織のウェスタンブロット解析）
凍結した肝臓（４０ｍｇ）を粉砕した後、９８０μＬの１×ＴＫＭ組織溶解バッファー（50 mM トリエタノールアミン（pH 7.8）, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.25 M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free（Code No.03969-21, ナカライテスク(株)）, 1 mM DTT，Ricombinant RNase inhibitor 5μL/mL（40 U/μL, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA））を加え、１５分間回転（１ｒｐｍ、２５℃）させた。遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（肝臓組織抽出物）を回収した。抽出したタンパク質は、分光光度計で濃度を定量した。
回収した肝臓組織抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で５分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、１００μｇ／２０μＬ／ウェル（ＤＨＦＲ検出用）又は５０μｇ／１０μＬ／ウェル（ＧＡＰＤＨ検出用）となるようにアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１６０Ｖで６０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、９０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＤＨＦＲ抗体（sc-14780, SantaCruz、５００倍希釈）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、１％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で１０分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
MTX-CiKD_MLN又はＭＴＸを投与したマウス個体の肝臓組織抽出物における内在発現標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析結果を図１１に示す。
図１１に示すとおり、５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのMTX-CiKD_MLNをマウスに２４時間投与した場合には、濃度依存的に、肝臓組織内の標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）の量が減少した。この結果は、マウス個体において、僅か１日で約７０％〜８０％の標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）が分解されたことを示している。一方、１０ｍｇ／ｋｇのＭＴＸをマウスに２４時間投与した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）よりも、肝臓組織内の標的タンパク質（マウスＤＨＦＲ）の量が増加した。
＜実施例１７：タンパク質分解誘導タグとしてCiKD_DMTを用い、タンパク質結合分子としてＴＭＰ誘導体を用いたタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）の合成＞
実施例１７では、下記の合成スキームに従って、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_DMTを合成した。
タンパク質分解誘導タグとしては、前述した式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２をいずれもメトキシ基とした化合物（ＤＭＴ）を用いた。ＤＭＴは、プロテアソーム阻害剤に由来しないものの、プロテアソームに対して親和性を有する化合物である。また、タンパク質結合分子としては、実施例１と同様にＴＭＰ−ＮＨ２を用いた。そして、ＤＭＴとＴＭＰ−ＮＨ２とを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるTMP-CiKD_DMTを合成した。
TMP-CiKD_DMTの合成方法の詳細は以下のとおりである。
ナスフラスコにＴＭＰ−ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（31.7 mg, 0.073 mmol）を仕込み、脱水ＤＭＦを０．３ｍＬ加えた。室温で１０分間撹拌した後、ＤＩＥＡを０．１ｍＬ加え、室温で１０分間撹拌した。ＤＭＴ−ＭＭ（33.6 mg, 0.12 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、クロロホルムで５回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝９２／８）を用いた分離精製処理により、TMP-CiKD_DMT（25.8 mg, 0.045 mmol, 62%, isolated yield）を得た。
＜実施例１８：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）のプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性の評価＞
実施例１８では、TMP-CiKD_Bortezomibの代わりに１０μＭ又は１００μＭのTMP-CiKD_DMTを用いること以外は実施例４と同様にして、TMP-CiKD_DMTのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。ポジティブコントロールとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２を用いた。
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図１２Ａ〜図１２Ｃに示す。
図１２Ａ〜図１２Ｃに示すとおり、TMP-CiKD_DMTは、ＭＧ−１３２と比較して、プロテアソーム阻害活性が著しく低いことが確認できた。また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、TMP-CiKD_DMTの濃度依存的に阻害活性が高まることから、TMP-CiKD_DMTがプロテアソームと穏やかな親和性を有していることが示唆された。すなわち、ＤＭＴは、プロテアソームと親和性を有するものの、分解を阻害しないと評価された。
＜実施例１９：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定＞
実施例１９では、TMP-CiKD_Bortezomibの代わりにTMP-CiKD_DMTを用いること以外は実施例５と同様にして、２０Ｓプロテアソームのβ１、β２、及びβ５の各プロテアソーム活性に対するTMP-CiKD_DMTの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した。ポジティブコントロールとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＬＮ２２３８を用いた。
TMP-CiKD_DMT及びＭＬＮ２２３８の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を以下の表８７に示す。
表８７に示すとおり、TMP-CiKD_DMTは、ＭＬＮ２２３８と比較して、プロテアソーム阻害活性が著しく低いことが確認できた。
＜実施例２０：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）を添加したＨｅＬａ細胞における、タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）と強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）との親和性の評価（熱シフトアッセイ）＞
実施例２０では、TMP-CiKD_DMTを添加したＨｅＬａ細胞における、TMP-CiKD_DMTと強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）との親和性について、熱シフトアッセイにより評価した。
（培養細胞の準備）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質であるｅｃＤＨＦＲ（詳細には、ＨＡタグを介したｅｃＤＨＦＲとＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄを一過的に過剰発現させ、TMP-CiKD_DMTの標的タンパク質への作用を評価した。
プラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）は、ブランダイス大学（米国）のLizbeth Hedstrom教授より提供を受けた（Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation.", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）。このプラスミドを大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（Code No. 27106, QIAGEN）で精製した。
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入には、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（Code No. 297-73201, 和光純薬工業(株)）を用いた。ScreenFectAのDilution Bufferを２本の１．５ｍＬチューブに２５０μＬずつ加えた。そして、一方のチューブにはScreenFectAのTransfection Reagentを１２μＬ添加し（溶液Ａ）、他方のチューブにはプラスミドを６μｇ添加し（溶液Ｂ）、それぞれを軽くピペッティングした後、室温にて２分間静置した。溶液Ａと溶液Ｂとを軽く混ぜ合わせ、室温にて３０分間静置した（溶液Ｃ）。トリプシン処理により回収した６×１０５細胞／１２ｍＬの細胞溶液に溶液Ｃを混合し、２４ウェルプレート（Code No. TR5002, TrueLine, 日本ジェネティクス(株)）に４×１０４細胞／８００μＬ／ウェルの細胞密度で播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）の添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_DMTを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyrvate）（Code No. 045-32245, 和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Code No. G7513, Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。TMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、前培養培地を除去したウェルに各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。
なお、コントロールとしては、TMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（熱シフトアッセイによるTMP-CiKD_DMTの標的親和性の評価）
TMP-CiKD_DMT（２８μＭ）又はＴＭＰ（４０μＭ）の添加３時間後、培地を除去し、３７℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（Code No. 041-29775, 和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ（Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone）及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（Code No. 168-23191, 和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり１ｍＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、ＣＥＴＳＡバッファー（ＴＢＳにプロテアーゼ阻害剤であるcOmplete, Mini, EDTA-free（Roche）を使用直前に添加）を１８０μＬ添加して懸濁した。懸濁後の細胞溶液を９本の１．５ｍＬチューブに２０μＬずつ分注し、室温にて３０分間静置した。静置後、９本のチューブをそれぞれ３８℃、４２℃、４６℃、５０℃、５４℃、５８℃、６２℃、６６℃、又は７０℃で３分間熱処理し、室温にて３分間静置した。静置後、細胞溶液を液体窒素で瞬間凍結し、氷上で融解させた。この凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３５００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり１７μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１５０Ｖで４０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、４０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を１０００倍希釈して用いた。室温にて９０分間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
TMP-CiKD_DMT又はＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の熱シフトアッセイ結果を図１３に示す。
コントロール（ＤＭＳＯ）では約５０℃までしか大腸菌ＤＨＦＲを検出することができなかったが、ＴＭＰ（４０μＭ）では約５４℃まで、TMP-CiKD_DMT（２８μＭ）では約６２℃まで大腸菌ＤＨＦＲを検出することができた。
この結果から、TMP-CiKD_DMTは、ＴＭＰ−ＮＨ２とＤＭＴとが連結されたものであるが、大腸菌ＤＨＦＲとの親和性がＴＭＰよりも高いことが確認できた。
＜実施例２１：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析）＞
実施例２１では、TMP-CiKD_DMTを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
（培養細胞の準備）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質である大腸菌ＤＨＦＲ（詳細には、ＨＡタグを介した大腸菌ＤＨＦＲとＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄを一過的に過剰発現させ、TMP-CiKD_DMTの標的タンパク質への作用を評価した。
プラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）は、ブランダイス大学（米国）のLizbeth Hedstrom教授より提供を受けた（Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation.", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）。このプラスミドを大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（Code No. 27106, QIAGEN）で精製した。
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入には、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（Code No. 297-73201, 和光純薬工業(株)）を用いた。ScreenFectAのDilution Bufferを２本の１．５ｍＬチューブに９６０μＬずつ加えた。そして、一方のチューブにはScreenFectAのTransfection Reagentを４０μＬ添加し（溶液Ａ）、他方のチューブにはプラスミドを１６μｇ添加し（溶液Ｂ）、それぞれを軽くピペッティングした後、室温にて２分間静置した。溶液Ａと溶液Ｂとを軽く混ぜ合わせ、室温にて３０分間静置した（溶液Ｃ）。トリプシン処理により回収した２．７×１０５細胞／１８ｍＬの細胞溶液に溶液Ｃを混合し、２４ウェルプレート（Code No. TR5002, TrueLine, 日本ジェネティクス(株)）に６×１０４細胞／４００μＬ／ウェルの細胞密度で播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）の添加）
以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_DMTを添加した。プラスミドを導入してから４０時間培養した後、前培養培地を除去し、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyrvate）（Code No. 045-32245, 和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Code No. G7513, Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を各ウェル当たり２９７μＬ添加した。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。所定濃度のTMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。
なお、コントロールとしては、TMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
TMP-CiKD_DMT（５６μＭ若しくは１１２μＭ）又はＴＭＰ（８０μＭ）の添加２４時間後、培地を除去し、３７℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（Code No. 041-29775, 和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ（Code No. SH30910.03, Lot No. AYG161516, HyClone）及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（Code No. 168-23191, 和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり５００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、４℃のＦＡＣＳバッファー（１質量％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、氷上に静置した。
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、細胞中におけるＧＦＲ及びＤｓＲｅｄの発現を定量した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFLOWJO（トミーデジタルバイオロジー(株)）により細胞１個当たりのＧＦＲ／ＤｓＲｅｄ比を算出し、標的分解によるグラフのシフトから、TMP-CiKD_DMTによる標的分解（ノックダウン）の効率を確認した。
TMP-CiKD_DMT（５６μＭ）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図１４Ａに示す。また、TMP-CiKD_DMT（１１２μＭ）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図１４Ｂに示す。また、ＴＭＰを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のＦＡＣＳ解析結果を図１４Ｃに示す。
図１４Ａ及び図１４Ｂに示すとおり、TMP-CiKD_DMTを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）と比較して、濃度依存的にグラフの左へのシフト量が大きくなっており、標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）が分解されていることが確認できた。シフト量から推測される分解効率は６０％〜７０％程度であった。一方、図１４Ｃに示すとおり、ＴＭＰを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、標的タンパク質が分解されていないことが確認できた。
＜実施例２２：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析）＞
実施例２２では、TMP-CiKD_DMTを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
（培養細胞の準備）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質である大腸菌ＤＨＦＲ（詳細には、ＨＡタグを介した大腸菌ＤＨＦＲとＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄを一過的に過剰発現させ、TMP-CiKD_DMTの標的タンパク質への作用を評価した。
プラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）は、ブランダイス大学（米国）のLizbeth Hedstrom教授より提供を受けた（Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation.", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）。このプラスミドを大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（Code No. 27106, QIAGEN）で精製した。
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入には、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（Code No. 297-73201, 和光純薬工業(株)）を用いた。ScreenFectAのDilution Bufferを２本の１．５ｍＬチューブに２５０μＬずつ加えた。そして、一方のチューブにはScreenFectAのTransfection Reagentを１２μＬ添加し（溶液Ａ）、他方のチューブにはプラスミドを４．８μｇ添加し（溶液Ｂ）、それぞれを軽くピペッティングした後、室温にて２分間静置した。溶液Ａと溶液Ｂとを軽く混ぜ合わせ、室温にて３０分間静置した（溶液Ｃ）。トリプシン処理により回収した７．７×１０４細胞／７．７ｍＬの細胞溶液に溶液Ｃを混合し、２４ウェルプレート（Code No. TR5002, TrueLine, 日本ジェネティクス(株)）に４×１０４細胞／４００μＬ／ウェルの細胞密度で播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT）の添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_DMTを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyrvate）（Code No. 045-32245, 和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Code No. G7513, Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。TMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、前培養培地を除去したウェルに各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。また、TMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、TMP-CiKD_DMT及びボルテゾミブを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。TMP-CiKD_DMT、又はTMP-CiKD_DMT及びボルテゾミブの添加１２時間後に、タンパク質合成阻害剤であるシクロへキシミドを５０μｇ／ｍＬの濃度となるように培地中に添加した。
なお、コントロールとしては、TMP-CiKD_DMTを含有するＤＭＳＯ溶液の代わりに、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（ウェスタンブロット解析によるTMP-CiKD_DMTの標的分解（ノックダウン）の評価）
TMP-CiKD_DMT、又はTMP-CiKD_DMT及びボルテゾミブの添加２４時間後、培地を除去し、４℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free (REF 11 836 170 001), Roche）との混合溶液を各ウェル当たり５５μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップ（P1000）を用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（８ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり４０μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１５０Ｖで５０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、４０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を１０００倍希釈して用いた。室温にて１時間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
次に、同一のメンブレンを用いて、コントロールであるＧＡＰＤＨの検出反応を行った。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）で洗浄し、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, BETHYL）を２００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。
TMP-CiKD_DMT、又はTMP-CiKD_DMT及びボルテゾミブを添加したＨｅＬａ細胞において、強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析により検出されたバンドの定量結果を図１５Ａに示し、検出されたバンドを図１５Ｂに示す。
図１５Ａ及び図１５Ｂに示すとおり、TMP-CiKD_DMT（１１２μＭ）を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）を基準とした分解効率が約６０％であった。一方、TMP-CiKD_DMT（１１２μＭ）及びボルテゾミブ（１μＭ）を添加した場合には、標的タンパク質の分解が阻害された。この結果は、TMP-CiKD_DMTによって、標的タンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていたことを示唆している。
＜実施例２３：タンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、及びTMP-CiKD_Bortezomib）を添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析）＞
実施例２３では、TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、又はTMP-CiKD_Bortezomibを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
（培養細胞の準備）
実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞を準備した。
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質である大腸菌ＤＨＦＲ（詳細には、ＨＡタグを介した大腸菌ＤＨＦＲとＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄを一過的に過剰発現させ、TMP-CiKD_DMTの標的タンパク質への作用を評価した。
プラスミド（pMIR DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）は、ブランダイス大学（米国）のLizbeth Hedstrom教授より提供を受けた（Long, M.J. et al., "Inhibitor mediated protein degradation.", Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）。このプラスミドを大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（Code No. 27106, QIAGEN）で精製した。
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入には、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（Code No. 297-73201, 和光純薬工業(株)）を用いた。ScreenFectAのDilution Bufferを２本の１．５ｍＬチューブに４００μＬずつ加えた。そして、一方のチューブにはScreenFectAのTransfection Reagentを２０μＬ添加し（溶液Ａ）、他方のチューブにはプラスミドを１０．３μｇ添加し（溶液Ｂ）、それぞれを軽くピペッティングした後、室温にて２分間静置した。溶液Ａと溶液Ｂとを軽く混ぜ合わせ、室温にて３０分間静置した（溶液Ｃ）。トリプシン処理により回収した８×１０５細胞／１６ｍＬの細胞溶液に溶液Ｃを混合し、２４ウェルプレート（Code No. TR5002, TrueLine, 日本ジェネティクス(株)）に４×１０４細胞／８００μＬ／ウェルの細胞密度で播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
（ＨｅＬａ細胞へのタンパク質分解誘導分子（TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、又はTMP-CiKD_Bortezomib）の添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にTMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、又はTMP-CiKD_Bortezomibを添加した。培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyrvate）（Code No. 045-32245, 和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ−グルタミン溶液（Code No. G7513, Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ−グルタミン溶液は使用直前に添加した。TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、又はTMP-CiKD_Bortezomibを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、前培養培地を除去したウェルに各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。
なお、コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
（ウェスタンブロット解析による標的分解（ノックダウン）の評価）
TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、又はTMP-CiKD_Bortezomibの添加２４時間後、培地を除去し、４℃のＰＢＳ（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free (REF 11 836 170 001), Roche）との混合溶液を各ウェル当たり３０μＬ添加した。４℃にて１０分間静置した後、ピペットチップ（P1000）を用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３５００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２ウェル）は、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２−メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、各ウェル当たり２０μＬずつアプライした。泳動マーカーとしては、Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad）を用いた。電気泳動は１６０Ｖで４５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、３５分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を５００倍希釈して用いた。室温にて２時間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
次に、同一のメンブレンを用いて、コントロールであるＧＡＰＤＨの検出反応を行った。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）で洗浄し、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz、１００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, BETHYL）を２００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。
TMP-CiKD_DMT、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、又はTMP-CiKD_Bortezomibを添加したＨｅＬａ細胞における強制発現標的タンパク質（大腸菌ＤＨＦＲ）のウェスタンブロット解析結果を図１６に示す。
図１６に示すとおり、８０μＭ又は１６０μＭのTMP-CiKD_DMTを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）を基準とした分解効率が、それぞれ７２％、９１％であった。また、TMP-CiKD_MLN、TMP-CiKD_ALLN、及びTMP-CiKD_Bortezomibの１６０μＭでの分解効率は、それぞれ８２％、４５％、２８％であった。
２０１５年６月１９日に出願された日本出願２０１５−１２３７４０及び２０１６年４月８日に出願された日本出願２０１６−０７８３２４の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的且つ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (22)

  1. プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子であるタンパク質分解誘導タグ。
  2. プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造を有する請求項１に記載のタンパク質分解誘導タグ。
  3. 前記プロテアーゼがプロテアソームである請求項１に記載のタンパク質分解誘導タグ。
  4. プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有する請求項３に記載のタンパク質分解誘導タグ。
  5. 前記プロテアソーム阻害活性が、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性である請求項４に記載のタンパク質分解誘導タグ。
  6. 候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子を選抜する工程を含むタンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法。
  7. 前記プロテアーゼがプロテアソームである請求項６に記載のタンパク質分解誘導タグのスクリーニング方法。
  8. プロテアーゼ阻害剤の活性部位の構造を改変し、プロテアーゼ阻害活性を失活させる工程を含むタンパク質分解誘導タグの製造方法。
  9. 候補分子の中から、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する分子をプロテアーゼ阻害剤として選抜する工程を更に含む請求項８に記載のタンパク質分解誘導タグの製造方法。
  10. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグを２種以上含むタンパク質分解誘導タグライブラリー。
  11. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグと、タンパク質に結合する少なくとも１つのタンパク質結合分子とのコンジュゲートであるタンパク質分解誘導分子。
  12. 請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子を２種以上含むタンパク質分解誘導分子ライブラリー。
  13. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子を含む医薬組成物。
  14. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程を含む標的タンパク質の分解方法。
  15. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程を含む標的タンパク質の機能解析方法。
  16. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子を用いてタンパク質の分解を誘導する工程と、
    前記タンパク質分解誘導タグ又は前記タンパク質分解誘導分子によって分解が誘導されたタンパク質を同定する工程と、
    を含む標的タンパク質の同定方法。
  17. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、又は請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子を用いて標的タンパク質の分解を誘導する工程と、
    前記標的タンパク質以外の活性又は発現が変化したタンパク質を同定する工程と、
    を含む標的タンパク質を介した経路分子の同定方法。
  18. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、請求項１０に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子、又は請求項１２に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを標的タンパク質が存在する系に供給し、前記標的タンパク質の分解を誘導するタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程を含むタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子のスクリーニング方法。
  19. 前記標的タンパク質が疾患原因物質であり、前記標的タンパク質の分解を誘導するタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を疾患の予防又は治療成分候補として選抜する請求項１８に記載のタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子のスクリーニング方法。
  20. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、請求項１０に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子、又は請求項１２に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を改善させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を選抜する工程を含む疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法。
  21. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、請求項１０に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子、又は請求項１２に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を悪化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜する工程を含む疾患の予防又は治療成分候補のスクリーニング方法。
  22. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のタンパク質分解誘導タグ、請求項１０に記載のタンパク質分解誘導タグライブラリー、請求項１１に記載のタンパク質分解誘導分子、又は請求項１２に記載のタンパク質分解誘導分子ライブラリーを疾患モデル系に供給し、疾患の症状を変化させるタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子を抽出し、抽出されたタンパク質分解誘導タグ又はタンパク質分解誘導分子により分解が誘導されるタンパク質を選抜する工程を含む疾患関連タンパク質の特定方法。
JP2017525270A 2015-06-19 2016-06-15 タンパク質分解誘導タグ及びその用途 Active JP6954619B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015123740 2015-06-19
JP2015123740 2015-06-19
JP2016078324 2016-04-08
JP2016078324 2016-04-08
PCT/JP2016/067852 WO2016204197A1 (ja) 2015-06-19 2016-06-15 タンパク質分解誘導タグ及びその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2016204197A1 true JPWO2016204197A1 (ja) 2018-05-31
JP6954619B2 JP6954619B2 (ja) 2021-10-27

Family

ID=57545313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017525270A Active JP6954619B2 (ja) 2015-06-19 2016-06-15 タンパク質分解誘導タグ及びその用途

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10976306B2 (ja)
EP (2) EP3312273A4 (ja)
JP (1) JP6954619B2 (ja)
KR (1) KR20180021080A (ja)
CN (1) CN107922927A (ja)
AU (1) AU2016279493B2 (ja)
BR (1) BR112017027246A2 (ja)
CA (1) CA2988379A1 (ja)
HK (1) HK1249546A1 (ja)
IL (1) IL256217A (ja)
SG (1) SG11201710272VA (ja)
WO (1) WO2016204197A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3312273A4 (en) 2015-06-19 2019-07-03 Tokyo University of Science Foundation LABEL INDUCING DEGRADATION OF PROTEINS AND USE THEREOF
AU2017361157A1 (en) 2016-11-15 2019-06-06 Tokyo University Of Science Foundation p53 degradation inducing molecule and pharmaceutical composition
CA3043806A1 (en) * 2016-11-15 2018-05-24 Tokyo University Of Science Foundation Molecular kinetics evaluation method and screening method
MY195945A (en) * 2016-11-15 2023-02-27 Univ Tokyo Science Found Ras Protein Degradation Inducing Molecule and Pharmaceutical Composition
JP2021527137A (ja) 2018-06-13 2021-10-11 アンフィスタ セラピューティクス リミテッド Ｒｐｎ１１を標的化するための二機能性分子
CN109761970B (zh) * 2019-01-26 2020-06-09 中国药科大学 一种蛋白靶向降解嵌合分子、制备方法及应用
CN114644682A (zh) * 2022-03-30 2022-06-21 海南双成药业股份有限公司 一种硼替佐米的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012003281A2 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Brandeis University Small-molecule-targeted protein degradation
US20120115232A1 (en) * 2009-04-30 2012-05-10 Osaka University Method for inducing degradation of protein in mammalian cell
WO2013106643A2 (en) * 2012-01-12 2013-07-18 Yale University Compounds & methods for the enhanced degradation of targeted proteins & other polypeptides by an e3 ubiquitin ligase

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5882941A (en) 1994-05-04 1999-03-16 Massachusette Institute Of Technology Programmable genotoxic agents and uses therefor
WO2000045165A1 (en) * 1999-02-01 2000-08-03 Cytovia, Inc. Methods of identifying therapeutically effective antineoplastic agents with cultured cells having intact cell membranes and corresponding products
US7208157B2 (en) 2000-09-08 2007-04-24 California Institute Of Technology Proteolysis targeting chimeric pharmaceutical
US7371539B2 (en) * 2003-12-03 2008-05-13 President And Fellows Of Harvard College Targeted polypeptide degradation
JP2008533986A (ja) 2005-03-25 2008-08-28 ラモト アット テル アヴィヴ ユニヴァーシティ リミテッド 変異型ｐ５３の共通エピトープに対するヒト合成単鎖抗体およびその使用
JP2009149524A (ja) 2006-03-16 2009-07-09 Kyushu Univ アルツハイマー病の予防・治療剤
WO2008123266A1 (ja) 2007-03-19 2008-10-16 Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. 創薬標的タンパク質及び標的遺伝子、並びにスクリーニング方法
US20100292129A1 (en) * 2007-05-24 2010-11-18 Daniel Finley Methods and Compositions for Enhancing Proteasome Activity
CA2823837A1 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 Yale University Small-molecule hydrophobic tagging of fusion proteins and induced degradation of same
JP5934986B2 (ja) 2011-09-07 2016-06-15 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 アポトーシス阻害タンパク質リガンド−エストロゲン受容体リガンドハイブリッド化合物並びにそれを利用したエストロゲン受容体分解誘導剤及び乳癌、子宮頚癌又は卵巣癌の予防及び治療剤
JP2013177444A (ja) 2013-05-18 2013-09-09 Isao Kajisa ヒトｉＰＳのＴ細胞再分化テロメア若返り炎症老化止めｐ５３とＲｂ分解経口不老不死薬５
JP2015123740A (ja) 2013-12-27 2015-07-06 キヤノン株式会社 インクセット及びインクジェット記録方法
JP6406970B2 (ja) 2014-10-16 2018-10-17 株式会社呉竹 ペン及びペン用リフィル
US10017540B2 (en) 2015-03-11 2018-07-10 California Institute Of Technology Cyclic peptide binder against oncogenic K-Ras
EP3312273A4 (en) 2015-06-19 2019-07-03 Tokyo University of Science Foundation LABEL INDUCING DEGRADATION OF PROTEINS AND USE THEREOF
CA3043806A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Tokyo University Of Science Foundation Molecular kinetics evaluation method and screening method
AU2017361157A1 (en) 2016-11-15 2019-06-06 Tokyo University Of Science Foundation p53 degradation inducing molecule and pharmaceutical composition

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120115232A1 (en) * 2009-04-30 2012-05-10 Osaka University Method for inducing degradation of protein in mammalian cell
WO2012003281A2 (en) * 2010-06-30 2012-01-05 Brandeis University Small-molecule-targeted protein degradation
WO2013106643A2 (en) * 2012-01-12 2013-07-18 Yale University Compounds & methods for the enhanced degradation of targeted proteins & other polypeptides by an e3 ubiquitin ligase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
伊野部智由: "プロテアソームによる蛋白質分解の分子機構", 公益財団法人アステラス病態代謝研究会 平成２４年度 第４４回助成研究報告集, JPN6016035912, 2012, ISSN: 0004583443 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016279493A1 (en) 2017-12-14
IL256217A (en) 2018-02-28
AU2016279493B2 (en) 2022-08-11
SG11201710272VA (en) 2018-01-30
JP6954619B2 (ja) 2021-10-27
US20180164289A1 (en) 2018-06-14
WO2016204197A1 (ja) 2016-12-22
CN107922927A (zh) 2018-04-17
BR112017027246A2 (ja) 2018-08-28
EP3868878A3 (en) 2022-01-05
CA2988379A1 (en) 2016-12-22
KR20180021080A (ko) 2018-02-28
HK1249546A1 (zh) 2018-11-02
EP3312273A1 (en) 2018-04-25
US10976306B2 (en) 2021-04-13
EP3868878A2 (en) 2021-08-25
US20210088504A1 (en) 2021-03-25
EP3312273A4 (en) 2019-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6954619B2 (ja) タンパク質分解誘導タグ及びその用途
McClellan et al. Cellular functions and molecular mechanisms of non-lysine ubiquitination
JP7061801B2 (ja) ｐ５３分解誘導分子及び医薬組成物
Kawakami et al. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics
TWI811197B (zh) Ras蛋白分解的誘導分子及醫藥組成物
JP7093110B2 (ja) 分子動態評価方法及びスクリーニング方法
Wang et al. Biochemical tools for tracking proteolysis
Wang et al. Kinetics of ribosome-catalyzed polymerization using artificial aminoacyl-tRNA substrates clarifies inefficiencies and improvements
US20150273010A1 (en) High-throughput assays for hiv-1 envelope maturation and novel peptide inhibitors against hiv-1
WO2007140471A2 (en) Ribosome and rna display of biologically active small molecules
Björk Grimberg The p97 ATPase and the Drosophila Proteasome: Protein Unfolding and Regulation
Tsirigotis Mutational analysis of mammalian ubiquitin
Edelmann et al. Biochemical characterization of a novel deubiquitinating enzyme otubain 1 and investigation into its role in Yersinia infection

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190423

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190423

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190423

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200407

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200605

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200804

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210119

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210312

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210831

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210922

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6954619

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150