KR20180011841A - 포만 유도 및 포만감 지속을 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하고 포만감을 지속시키기 위한 약제학적 및 식품 조성물 - Google Patents

포만 유도 및 포만감 지속을 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하고 포만감을 지속시키기 위한 약제학적 및 식품 조성물 Download PDF

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조나단 브레톤
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유니베르시떼 드 루앙
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Abstract

본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하고 포만감을 지속시키기 위한 약제학적 및 식품 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

포만 유도 및 포만감 지속을 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하고 포만감을 지속시키기 위한 약제학적 및 식품 조성물
본 발명은 포만(satiation) 유도 및 포만감(satiety) 지속을 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하고 포만감을 지속시키기 위한 약제학적 및 식품 조성물에 관한 것이다.
장내 미생물총의 조성은 숙주 대사성 표현형과 연관되어 있으며 (Ley et al., 2006), '비만' 미생물총의 전이는 비만증 (Turnbaugh et al., 2006)과 과식증을 유발할 수 있고 (Vijay-Kumar et al., 2010), 이는 장내 미생물총이 숙주의 영양 공급 (feeding) 양상에 영향을 줄 수 있음을 시사한다. 비록 숙주 식욕에 대한 장내 세균 영향의 기저가 되는 메커니즘이 알려지지는 않았지만, 식품 섭취를 조절하는 숙주 분자 경로를 이용할 가능성이 있다.
현재의 식품 섭취 조절 모델은 장-유래 기아 및 포만감 호르몬이 영양공급의 항상성 및 쾌감을 조절하는 여러 뇌 신경회로 신호전달에 관련되어 있음을 보여준다 (Berthoud, 2011; Inui, 1999; Murphy and Bloom, 2006). 그 중에서도 주목할 만한 것은 뇌실결핵 (paraventricular nucleus: PVN)에서 전달되는, 각각 프로오피오멜라노코르틴 (proopiomelanocortin: POMC) 및 신경펩티드 Y (neuropeptide Y: NPY)/아구티-관련 단백질 (AgRP) 뉴런을 포함하는, 시상하부 궁상핵 (hypothalamic arcuate nucleus: ARC) 유래의 식욕 억제 및 식욕 생성 경로이다 (Atasoy et al., 2012; Cowley et al., 1999; Garfield et al., 2015; Shi et al., 2013). ARC와 PVN 경로는 식욕 억제 예측 (projection)을 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)를 발현하는 중추 편도체 (central amygdala: CeA)에 전달하는 가쪽 팔곁핵에 수렴한다 (Carter et al., 2013; Garfield et al., 2015).
숙주의 식욕 조절에 대한 장내 미생물총 효과의 추정 메커니즘은 에너지 수확 활성 (Turnbaugh et al., 2006) 및 신경 활성 전달물질과 대사산물의 생산을 포함할 수 있다 (Dinan et al., 2015; Forsythe and Kunze, 2013; Sharon et al., 2014). 본 발명자들은 장내에서 국소적으로 또는 전신적으로 식욕-조절 경로에 직접적으로 작용하는 세균 단백질의 영향을 입증하였다. 실제로, 여러 세균 단백질은 식욕을 조절하는 펩티드 호르몬과 서열 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며 (Fetissov et al., 2008), 최근에 장내 공생하는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli : E. coli)에 의해 생성된 ClpB 단백질은 α-멜라닌 세포-자극 호르몬 (α-MSH)의 항원-모방체로 확인되었다 (Tennoune et al., 2014). α-MSH는 멜라노코르틴 수용체 4 (MC4R)의 활성화에 의한 포만감 신호전달에서 중요한 역할을 하는 POMC-유래 신경펩티드이다 (Cone, 2005). 비록 MC4R-매개된 α-MSH의 식욕 억제 효과가 주로 작용의 중심부로 여겨졌지만 (Mul et al., 2013), 최근의 연구는 장내 장내분비 (enteroendocrine) 세포에서 MC4R의 활성화가 포만감 호르몬인 글루카곤-유사펩티드-1 (GLP-1) 및 펩티드 YY (PYY)의 방출을 자극한다는 것을 나타내었다 (Panaro et al., 2014). 따라서 장내 세균-유래 α-MSH-유사 분자는 포만감 호르몬을 합성하는 장내분비 세포에 직접 작용할 수 있다.
본 발명은 포만 유도 및 포만감 지속이 필요한 개체에서 포만 유도 및 포만감 지속을 위한 약제학적 및 식품 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 청구범위에 의하여 정의된다.
본 발명자들은 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균이 이를 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하고, 포만감을 지속하고, 식품 섭취를 감소시키고, 체중 증가를 조절하고, 체중 감소를 촉진하고/하거나 지방 질량을 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 본 발명자들은 실제로 놀랍게도 상기 세균에 의해 발현된 ClpB 단백질이 세균 투여로 유도될 수 있는 임의의 면역반응과는 독립적으로, 아마도 MCR 수용체를 통해, 포만, 포만감 및 식품 섭취에 직접적인 작용을 나타내었음을 보여주었다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 포만을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 포만 유도에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 개체, 특히 정상 체중 또는 단순한 (uncomplicated) 과체중을 갖는 개체에서 포만을 유도하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 미용적 비-치료학적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 추가 측면은 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 포만감을 지속시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 포만감 지속에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체, 특히 정상 체중 또는 단순한 과체중을 갖는 개체에서 포만감을 지속시키기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 미용적 비-치료학적 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 식사량 (meal size)을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 식사량 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 개체, 특히 정상 체중 또는 단순한 과체중을 갖는 개체에서 식사량을 감소시키기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 미용적 비-치료학적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 추가 측면은 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 식품 섭취를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 식품 섭취의 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 식품 섭취 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 추가 측면은 또한 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 체중 증가 조절, 특히 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 체중 증가 조절, 특히 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면에서 개체, 특히 정상 체중 또는 단순한 과체중을 갖는 개체에서 체중 증가 조절, 특히 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 미용적 비-치료학적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 추가 측면은 또한 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 체중 감소를 촉진하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 체중 감소 촉진에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 개체에서, 특히 정상 체중 또는 단순한 과체중을 갖는 개체에서 체중 감소 촉진에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 미용적 비-치료학적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 추가 측면은 ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 순수 질량비로 (lean mass ratio) 체지방을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 개체, 특히 비만 개체에서 순수 질량비로 체지방 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균에 관한 것이다.
본 발명의 추가 측면은 개체에서, 특히 정상 체중 또는 단순한 과체중을 갖는 개체에서 순수 질량비로 체지방 감소에 사용하기 위한 ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 미용적 비-치료학적 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 인간, 애완동물 또는 가축을 위한 것이며, 여기서 애완동물 또는 가축은 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 돼지, 소, 양, 염소, 말 및/또는 가금류로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 남성(male) 또는 여성(female)이다.
일부 실시양태에서, 개체는 비만이다. 본원에서 "비만"은 바람직하게는 개체가 >30의 BMI를 갖는 의학적 상태를 지칭한다. "BMI" 또는 "체질량 지수 (body mass index)"는 개체의 체중을 신장의 제곱으로 나눈 값으로 정의된다. 의학에서 보편적으로 사용되는 이 공식은 kg/m2의 측정 단위를 산출한다.
일부 실시양태에서, 개체는 적당히 비만이다. "적당히 비만인" 개체는 30과 35 사이의 BMI를 갖는 개체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 개체는 18.5와 30 사이의 체질량 지수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 개체는 비만이 아니다. 전형적으로, 비-비만 개체는 정상 체중을 갖는다. 본 발명에서 "정상 체중"은 18.5와 25 사이의 BMI를 초래하는 체중을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 개체는 과체중이다. 본 발명에서 "과체중"은 25와 30 사이의 BMI를 초래하는 체중을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 개체는 건강한 과체중 또는 단순한 (uncomplicated) 과체중 개체이다. "건강한 과체중" 또는 "단순한 과체중" 개체는 그/그의 체중과 연관된 임의의 질환 또는 상태를 나타내지 않는 과체중 개체를 의미한다.
일부 실시양태에서, 개체는 슬리밍 다이어트 (slimming diet) 중이고/이거나 체중 감소를 원한다. 다른 실시양태에서, 개체는 슬리밍 다이어트 중이 아니고/아니거나 체중 감소를 원하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포만감 (satiety)"은 자신의 욕구가 충족되거나 최소화되는 것으로 개인이 느끼는 본질적으로 항상성인 상태를 지칭하는 것을 의미한다. 다수의 생리학적 요인들이 개인의 포만감을 책임지는 것으로 생각된다. 예를 들어, 미각 또는 맛, 후각 또는 냄새뿐만 아니라, 위장 충만감은 개인이 "포만감"을 느끼는지 여부에 기여할 수 있다. 더 구체적으로, "포만감"은 더 먹는 것을 꺼리는 상태이며, 식사와 다음 식사에서 소비되는 음식의 양 사이의 시간을 결정한다. "포만감의 향상" 등은 대조 상황에 비해 포만감이 더 현저하고/하거나 더 연장된다는 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포만 (satiation)"은 식사 내에서 먹는 것을 종결하는 상태를 지칭하며, 전형적으로 식사를 소비하기 시작한 후 (예컨대, 20-30분)의 기간 내에 발생/관찰된다. 따라서, 본 명세서에서 "포만 유도" 등이 언급될 때마다, 이는 개체가 식사 도중에 식품 소비를 중단하는 경향을 유발한다는 의미를 갖는다. 포만에 대한 영향은 식사 종료 시점을 점수로 매김으로써 결정될 수 있다. 포만 효과는 식사 종결 시 소비된 칼로리의 양이 대조군보다 현저히 적은 경우, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 20%, 또는 그 이상일 때 나타난다. 더 긴 기간 동안 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5주 또는 그 이상)에, 대조 식이에 비해 체중 감량 또는 체중 변화를 점수로 매길 수 있다. 시험 화합물의 일정량이 (예컨대, 1일 1회, 1일 2회, 또는 그 이상) 투여되는 개체의 체중은 바람직하게는 대조 개체에 비해 유의미하게 조절 (감소 또는 덜 증가)된다. 본원에 사용된 바와 같이, "대조 개체"는 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주가 투여되지 않았던 개체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "ClpB"는 당해 분야에서 그의 일반적인 의미를 가지며, 또한 헥사머 AAA+-ATPase의 Hsp100/ClpB 패밀리의 일원인 열 충격 단백질 F84.1로도 알려져 있다. ClpB는 열내성 (thermotolerance) 획득 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 프란시셀라 투랄렌시스 (Francisella turalensis), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 및 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella thyphimurium)과 같은 몇몇 그람-음성 및 그람-양성 병원성 세균의 병독성 및 감염성에 필수 요소로 설명되었다. 또한, E. coli K12에서 열 충격 단백질 F84.1 또는 htpM으로 알려져 있는 샤페론 단백질 ClpB는 857개 아미노산의 단백질이다. 전형적으로, 샤페론 단백질 ClpB는 서열번호 1 (NCBI 참조 번호: NP_417083.1, 2013년 11월 6일 이용 가능 및/또는 UniProtKB/Swiss-Prot 번호: P63284, 2013년 11월 6일 이용 가능)을 갖는 E. c oli K12로부터의 샤페론 단백질 ClpB의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 전형적으로, 샤페론 단백질 ClpB의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열과 96 내지 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게는, ClpB의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열 540-550 (ARWTGIPVSR)에 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일하다. 본 출원의 맥락에서, 동일성의 백분율은 글로벌 정렬을 사용하여 계산된다 (즉, 2개의 서열은 이들 각각의 전체 길이에 걸쳐 비교된다). 2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 전체 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬 (갭 포함)을 찾기 위해 Needleman-Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하는 ≪needle≫프로그램이 예시로서 이용될 수 있다. needle 프로그램은, 예를 들어 ebi.ac.uk 월드 와이드 웹 사이트에서 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 동일성의 백분율은 바람직하게는 10.0에 해당하는 "갭 개방 (Gap Open)" 파라미터, 0.5에 해당하는 "갭 연장 (Gap Extend)" 파라미터, 및 Blosum62 매트릭스를 갖는 EMBOSS: needle (글로벌) 프로그램을 사용하여 계산된다. 본 발명에 따르면, ClpB 단백질은 포만을 유도하기 위해 알파-MSH 단백질을 모방한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ClpB 단백질은 항-알파-MSH 항체에 의해 인식된다. 일반적으로, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 토끼의 다중클론 항-α-MSH IgG (1:1000, Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, USA)와 같은 다중클론 항체이다. α-MSH의 아미노산 서열은 바람직하게는 아미노산 서열 SYSMEHFRWGKPV (서열번호 2) (Gen Pept 서열 ID, PRF: 223274, 2013년 12월 2일에 이용 가능)를 포함하거나 이로 구성된다.
서열번호 1:
MRLDRLTNKF QLALADAQSL ALGHDNQFIE PLHLMSALLN QEGGSVSPLL TSAGINAGQL RTDINQALNR LPQVEGTGGD VQPSQDLVRV LNLCDKLAQK RGDNFISSEL FVLAALESRG TLADILKAAG ATTANITQAI EQMRGGESVN DQGAEDQRQA LKKYTIDLTE RAEQGKLDPV IGRDEEIRRT IQVLQRRTKN NPVLIGEPGV GKTAIVEGLA QRIINGEVPE GLKGRRVLAL DMGALVAGAK YRGEFEERLK GVLNDLAKQE GNVILFIDEL HTMVGAGKAD GAMDAGNMLK PALARGELHC VGATTLDEYR QYIEKDAALE RRFQKVFVAE PSVEDTIAIL RGLKERYELH HHVQITDPAI VAAATLSHRY IADRQLPDKA IDLIDEAASS IRMQIDSKPE ELDRLDRRII QLKLEQQALM KESDEASKKR LDMLNEELSD KERQYSELEE EWKAEKASLS GTQTIKAELE QAKIAIEQAR RVGDLARMSE LQYGKIPELE KQLEAATQLE GKTMRLLRNK VTDAEIAEVL ARWTGIPVSR MMESEREKLL RMEQELHHRV IGQNEAVDAV SNAIRRSRAG LADPNRPIGS FLFLGPTGVG KTELCKALAN FMFDSDEAMV RIDMSEFMEK HSVSRLVGAP PGYVGYEEGG YLTEAVRRRP YSVILLDEVE KAHPDVFNIL LQVLDDGRLT DGQGRTVDFR NTVVIMTSNL GSDLIQERFG ELDYAHMKEL VLGVVSHNFR PEFINRIDEV VVFHPLGEQH IASIAQIQLK RLYKRLEERG YEIHISDEAL KLLSENGYDP VYGARPLKRA IQQQIENPLA QQILSGELVP GKVIRLEVNE DRIVAVQ
일부 실시양태에서, ClpB 단백질은 약제학적 조성물의 형태로 개체에 투여된다. 일부 실시양태에서, ClpB 단백질은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 및 생분해성 중합체와 같은 임의의 지속-방출 매트릭스와 조합되어 약제학적 조성물을 형성한다. 용어 "약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용 가능한"은 포유류, 특히 인간에 적절하게 투여될 때, 불리한 알러지성 또는 다른 부적당한 반응을 유발하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 무독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제의 임의의 유형을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물에서, 활성 성분은 단독으로 또는 다른 활성 성분과 조합하여, 단위 투여 형태로, 통상적인 약제학적 보조제와의 혼합물로서 동물 및 인간에게 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여 형태는 정제, 겔 캡슐, 분말, 과립 및 경구 현탁액 또는 용액과 같은 경구 경로 형태, 설하 및 협측 투여 형태, 에어로졸, 임플란트, 피하 (subcutaneous), 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하 (subdermal), 경피, 척수강내 및 비강내 투여 형태 및 직장 투여 형태가 있다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 주사할 수 있는 제형물에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균된, 염분 용액 (인산 모노나트륨 또는 인산나트륨, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이들 염의 혼합물), 또는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있으며, 경우에 따라, 멸균수 또는 멸균 생리식염수는 주사용 용액의 구성을 허용한다. 주사 가능한 사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말이다. 모든 경우에, 제제는 멸균되어야 하고 용이한 주사기가 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 유리 염기 또는 약제학적으로 허용 가능한 염으로서 본 발명의 화합물을 포함하는 용액은 히드록시프로필 셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 생장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다. 활성 성분은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 첨가 염 (단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함하고, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델린산, 등의 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철 등의 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 또한, 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산제의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항세균 및 항진균제에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 당류 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연 제제의 조성물을 사용함으로써 야기될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 활성 폴리펩티드를, 요구된 량에서 적절한 용매 내 상기 열거된 다양한 성분으로, 필요에 따라 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산제는 다양한 살균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 부형제에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말에 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가적으로 원하는 성분을 더하여 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 제형화 시, 용액은 투여 제제와 양립 가능한 방식으로, 그리고 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 위에서 기술한 대로 주사 가능한 용액의 유형과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 수용액에서의 비-경구 투여를 위해, 필요하다면 용액을 적절하게 완충시켜야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코오스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균수 매질은 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 용량을 1 ml의 등장성 NaCl용액에 용해시키고 1000 ml의 피하주사 용액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다. 용량의 일부 변화는 치료받는 개체의 상태에 따라 필연적으로 발생한다. 투여를 책임지는 사람은 어떠한 경우에도 개별 개체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "ClpB를 발현하는 세균"은 상기 정의된 바와 같은 샤페론 단백질 ClpB 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 96 내지 100% 동일한, 더 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드를 발현 또는 과발현하는 세균을 지칭한다.
일부 실시양태에서, ClpB를 발현하는 세균은 식품 등급 세균이다.
일부 실시양태에서, ClpB 단백질을 발현하는 세균은 프로바이오틱 세균 균주이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로바이오틱 (probiotic)"은 충분한 양으로 통합된 살아있는 미생물을 지정하여, 전통적인 영양 효과 이상으로 건강, 안락 및 복지에 긍정적인 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 프로바이오틱 미생물은 "적절한 양으로 투여하면 숙주에 건강상의 이익을 줄 수 있는 살아 있는 미생물"로 정의되어 있다 (FAO/WHO 2001). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로바이오틱 세균 균주"는 숙주의 건강 및 복지에 유익한 효과를 갖는 세균 균주를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주는 생존 가능한 프로바이오틱 세균 균주이다. 상기 "생존 가능한 프로바이오틱 세균 균주”라는 표현은 대사적으로 활성이며 개체의 위장관을 콜로니화 할 수 있는 미생물을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 세균 단편의 혼합물로 이루어진 비-생존 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 단편의 혼합물은 세균 균주 유래의 단백질로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주는 식품 등급 세균으로부터 선택된다. 상기 "식품 등급 세균"은 일반적으로 식품에 사용되기에 안전하다고 여겨지는 세균을 의미한다.
상기 세균 균주는 자연 발생적인 세균 균주 또는 유전적으로 조작된 세균 균주일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 ClpB 단백질을 구성적으로 발현하는 세균이다.
일부 실시양태에서, ClpB 단백질은 세균에서 과발현된다. 일반적으로 단백질은 표준 조건의 자연에서 발생하는 주어진 기준 수율보다 높은 양 또는 수율로 발현 또는 생산되어, 단백질 발현이 "상향-조절" 또는 단백질이 "과발현"된다. 단백질의 과발현은, 예를 들어 다음 중 하나 또는 그 이상을 변경함으로써 달성될 수 있다: (a) 숙주 세포의 성장 또는 생활 조건; (b) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (c) 폴리 뉴클레오티드의 발현 및 세포에서의 카피 수를 제어하는데 사용되는 프로모터; (d) 숙주 세포 자체.
일부 실시양태에서, 세균 균주는 상기 세균 내에서 ClpB 단백질의 발현이 상향-조절되도록 스트레스 조건에 놓였다. 스트레스는 열에 대한 노출, 온도 변화, 기계적 스트레스, 또는 장기 보존, 낮은 수분 저장 및/또는 동결 건조 또는 분무 건조로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 세균은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 동안 영양 공급을 받았다. 전형적으로, 영양소는 세균의 생장에 편리한 배양 배지이며, 예를 들어 실시예에 기재된 뮬러-힌튼 (Muller-Hinton; MH) 배지 등이 있다. 일부 실시양태에서, 세균은 상기 반복 영양 공급을 따르는 정체기에서 분리되는데, 이 단계 동안에 ClpB 단백질의 농도가 최대이기 때문이다.
일부 실시양태에서, 세균은 ClpB 단백질의 발현이 상향-조절되도록 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "점 돌연변이"는 핵산 치환 및/또는 결실을 의미한다. 대안적으로 또는 동시에, 적어도 하나의 돌연변이는 ClpB 유전자의 조절 DNA 서열 내에, 예를 들어 전사 및 번역 조절 서열 내에 위치하며, 이 돌연변이가 단백질의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 조절 DNA 서열 내의 돌연변이는 단백질의 발현을 상향-조절하는 역할을 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주는 ClpB 단백질을 발현하기 위해 유전적으로 조작된 세균이다. 전형적으로, 세균 균주는 ClpB 단백질을 코딩하는 핵산으로 형질전환되었다. 용어 "형질전환"은 "외부" (즉 외인성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 전형적으로는 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 발현할 수 있는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되어 있다. 핵산은 모체 미생물의 형질전환 시 염색체의 외부에 남아있거나 또는 미생물의 게놈에 통합되도독 조정될 수 있다. 따라서, 상기 핵산은 통합 (예를 들어, 숙주 게놈 내에 상동성 재조합 및 표적화된 통합을 가능하게 하는 영역) 또는 염색체의 외부 구조물의 안정한 발현 및 복제 (예를 들어, 복제 원점, 프로모터 및 다른 조절 서열)를 지지하도록 개조된 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 핵산은 구조물 또는 벡터이다. 일부 실시양태에서, 핵산 구조물 또는 벡터는 발현 구조물 또는 벡터이지만, 클로닝에 사용되는 것과 같은 다른 구조물 및 벡터도 본 발명에 포함된다. 일 실시 양태에서, 상기 발현 구조물 또는 벡터는 플라스미드이다. 전형적으로 발현 구조물/벡터는 전술한 바와 같은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 그의 제어 하에 유전자의 구성적 발현을 허용한다. 그러나, 유도성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 발현 구조물/벡터는 원한다면 ClpB 단백질 발현에 적합한 추가 유전자뿐만 아니라 프로모터에 추가로 임의의 수의 조절 요소를 포함할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 세균 세포를 세포외 핵산으로 형질전환시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 그람-음성 균주이다.
일부 실시양태에서, 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae)의 패밀리 멤버이다. 특히, 세균 균주는 엔테로박테리아세아에 패밀리의 비-병원성 멤버이다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 모든 엔테로박테리아세아에 균주의 ClpB 단백질이 서로 100% 동일성을 나타내었음을 보여주었다.
일부 실시양태에서, 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 E. coli 균주이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 교시에 따라 사용하기 위한 E. coli 균주, 특히 프로바이오틱 E. coli 균주는 프로바이오틱 활성을 나타내는 비-병원성 E. coli 균주를 포함한다. 프로바이오틱 E. coli 균주의 예시는 프로바이오틱 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 BU-230-98, ATCC 기탁번호 202226 (DSM 12799)이고, 이는 공지의, 상업적으로 이용가능한, 프로바이오틱 에스케리치아 콜라이 균주 M-17의 단리물이다. 비-병원성 E. coli 균주의 예시는 E. coli Nissle 1917이다. 프로바이오틱으로 알려지지 않았던 E. coli 균주의 예시는 실험실용 E. coli 균주 K12이다.
다른 실시양태에서, 세균 균주는 하피니아 알베이 (Hafnia alvei) 균주, 예컨대 Bioprox Company에 의해 상업화된 하피니아 알베이 균주 AF036이다. 또 다른 실시양태에서, 세균 균주는 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris) 균주이다.
또 다른 실시양태에서, ClpB 단백질을 발현하는 세균 균주의 조합이 사용된다.
전형적으로, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 당해 분야에 익히 알려진 임의의 적합한 배양 배지를 이용해 생산된다. 다양한 발효 배지가 본 발명에 적합하다. 예를 들면 (그러나 이에 제한되지 않는다), 가장 먼저 상업용 배지에서 균주가 배양되고, 이를 그대로 또는 농축 (예를 들어, 건조)시키거나, 또는 다른 식품 기반 또는 다른 제품에 첨가한 후에 사용한다. 대안적으로, 세균 세포, 또는 세균 세포와 배지 (예컨대, 발효액), 또는 이러한 세포를 포함하는 배지의 분획 (즉, 상기 세균 균주 함유 배지)이 사용된다. 세포 또는 세포를 포함하는 배지는 생균 또는 생존 세균 세포 및/또는 사균 또는 비-생존 균주(들)의 세균 세포를 포함한다. 배지는 가열 또는 초음파로 처리될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 동결 건조 또는 냉동, 세균 및/또는 무세포 배지 (농축 가능)는 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주를 제조하는 방법에 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주는 동결건조된 후, 바람직하게는 투여 전에 재현탁된다.
전형적으로, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 섭취 (즉, 경구 경로)에 의해 개체에 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 위로부터 보호되도록 캡슐화된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 생체 내 생존 시간을 현저하게 향상시키기 위해 캡슐화된 형태로 조성물로 제제화된다. 이 경우, 캡슐의 존재는 특히 위장관에서 미생물의 분해를 지연 또는 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물이 장용-코딩된 지속 방출형 캡슐 또는 정제 내로 캡슐화될 수 있음이 이해될 것이다. 장용 코팅은 캡슐/정제가 소장에 도달할 때까지 위장관을 통과할 때 손상되지 않은 (즉, 용해되지 않은) 상태로 유지되게 한다. 살아있는 세균 세포를 캡슐화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,723,358호, General Mills Inc.). 예를 들어, 알지네이트 및 Hi-Maize™ 전분으로 마이크로-캡슐화한 다음 동결-건조함으로써 유제품에서 세균 세포의 저장 수명을 연장시키는데 성공적이라는 것이 입증되었다 [Kailasapathy et al. Curr Issues Intest Microbiol. 2002 September; 3(2): 39-48]. 대안적으로, 캡슐화는 아모르포팔루스 콘자크 (Amorphophallus konjac)에서 추출한 것과 같은 글루코만난 섬유를 이용해 수행될 수 있다. 별법으로, 참기름 에멀젼 중의 살아있는 프로바이오틱의 포획이 사용될 수 있다 [Hou et al. J. Dairy Sci. 86: 424-428]. 일부 실시양태에서, 장용 코팅용 제제는 바람직하게는 Eudragit® 중합체와 같은 메타크릴산-알킬아크릴레이트 공중합체이다. 폴리(메트)아크릴레이트가 코팅 재료로서 특히 적합한 것으로 입증되었다. EUDRAGIT®는 아크릴 및 메타크릴산의 에스테르로부터 유도된 공중합체의 상표명이며, 그 특성은 작용기에 의해 결정된다. 개별적 EUDRAGIT® 등급은 중성, 알칼리성 또는 산성 그룹에 있어 이들의 비율이 상이하고 따라서 물리화학적 특성이 다르다. 다양한 EUDRAGIT® 중합체의 숙련된 사용 및 조합은 다양한 제약 및 기술 응용 분야에서 조절된 약물 방출을 위한 이상적인 해법을 제공한다. EUDRAGIT®은 지속-방출 정제 및 알약 코팅을 위한 기능성 막을 제공한다. Ph.Eur., USP/NF, DMF 및 JPE와 같은 국제 약전에 중합체가 기술되어 있다. EUDRAGIT® 중합체는 다음과 같은 가능성을 제공한다: 위장관 표적화 (위장 저항성, 결장 내 방출), 보호 코팅 (맛과 냄새 차단, 수분으로부터 보호) 및 약물 방출 지연 (지속-방출 제형). EUDRAGIT® 중합체는 수용액, 수 분산제, 유기 용매 및 고형 물질을 비롯한 다양한 농도 및 물리적 형태로 이용 가능하다. EUDRAGIT® 중합체의 약제학적 성질은 그 작용기의 화학적 특성에 의해 결정된다. 구분은 다음과 같이 이루어진다:
- (염 형성에 의해) 소화액에 용해되는 폴리(메트)아크릴레이트: EUDRAGIT® L (메타크릴산 공중합체), S (메타크릴산 공중합체), FS 및 E (염기성 부틸화 메타크릴레이트 공중합체) 산성 또는 알칼리성 그룹을 갖는 중합체는 활성 성분의 pH-의존적 방출을 가능하게 함. 응용: 단순히 위액으로부터 차단에서부터 장의 모든 부분에서의 조절된 약물 방출.
- 소화액에 용해되지 않는 폴리(메트)아크릴레이트: 알칼리인 EUDRAGIT® RL 및 RS (암모니오 메타크릴레이트 공중합체) 및 중성 그룹을 갖는 EUDRAGIT® NE 중합체는 pH-비의존적 팽창에 의해 활성제의 조절된 시간에 따른 방출을 가능하게 함.
EUDRAGIT® 장용 코팅은 위장에서의 약물 방출에 대항하여 보호를 제공하고, 장내 조절된 방출을 가능하게 한다. 방출에 대한 지배적인 기준은 위 (pH 1-5)보다 장의 특정 부분 (pH 5 내지 7 이상)에서 일어나는 코팅의 pH-의존적 용해이다. 이러한 적용을 위해, 카르복실기를 함유한 음이온 EUDRAGIT® 등급은 서로 혼합될 수 있다. 이로써 용출 pH를 미세하게 조정할 수 있고, 따라서 장내의 약물 방출 부위를 정의할 수 있다. EUDRAGIT® L 및 S 등급은 장용 코팅에 적합하다. EUDRAGIT® FS30D (메틸아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트 및 메타크릴산을 기본으로 하는 음이온성 공중합체의 수성 분산제)은 특히 결장에서 조절된 방출을 위해 사용된다.
전형적으로, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 식품 조성물의 형태로 개체에 투여된다. 따라서, 본 발명의 하나의 추가 측면은 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주의 양을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주을 포함하는 식품 조성물은 완전 식품 조성물, 식품 보조제, 식품의약 조성물 등으로부터 선택된다. 본 발명의 조성물은 식품 성분 및/또는 사료 성분으로 사용될 수 있다.
식품 성분은 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라서 액체 또는 고체의 형태일 수 있다.
본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주는 전형적으로 조성물의 생산 공정 동안 임의의 시점에 첨가되는데, 예를 들어 이들은 생산 공정의 초기에 식품 베이스에 첨가될 수 있거나 최종 식품 제품에 첨가될 수 있다.
"식품"은 추가의 영양소 섭취 또는 식품 보조제 조성물을 필요로 하지 않는 액체 (즉, 음료), 고체 또는 반고체 식이 조성물, 특히 총 식품 조성물 (식품 대체물)을 의미한다. 식품 보조제 조성물은 다른 수단에 의한 영양소 섭취를 완전히 대체하지 못한다. 식품 및 식품 보조제 조성물은, 예를 들어 발효 유제품 또는 낙농 제품이며, 바람직하게는 1일 1회 또는 그 이상 경구 투여되거나 섭취된다. 발효 유제품은 생산 공정에서, 예를 들면 공지된 방법을 사용하여 식품 베이스에 첨가함으로써, 본 발명에 따른 세균을 직접 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법에서, 본 발명의 균주(들)는 통상적으로 사용되는 미생물에 첨가하여 사용될 수 있고 및/또는 통상적으로 사용되는 미생물의 하나 또는 그 이상을 대체할 수 있다. 예를 들어, 요구르트 또는 요구르트-베이스 음료와 같은 발효 유제품의 제조에서, 본 발명의 세균은 스타터 배양물에 첨가되거나 스타터 배양물의 일부로 사용될 수 있거나 또는 이러한 발효 동안 적절하게 첨가될 수 있다. 선택적으로 세균은 생산 공정에서 나중에 비활성화되거나 사멸될 수 있다. 발효 유제품에는 디저트, 요구르트, 요구르트 음료, 쿼크 (quark), 케피어 (kefir), 발효 우유-베이스 음료, 버터 밀크, 치즈, 드레싱, 저지방 스프레드, 신선한 치즈, 콩(soy)-베이스 음료, 아이스크림 등의 우유 기반 제품을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 식품 및/또는 식품 보조제 조성물은 비-유제품 또는 비-발효 유제품 (예컨대, 비-발효 유제품 또는 다른 식품 배지 내의 균주 또는 세포 무함유 배지)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주는 식품 (예컨대, 우유) 또는 비-식품 배지에 캡슐화되고 분산된다. 비-발효 유제품에는 아이스크림, 영양바 및 드레싱 등이 포함될 수 있다. 비-유제품에는 분말 음료 및 영양바 등이 포함될 수 있다. 제품은 유효량의 균주(들) 및/또는 세포 무함유 배양 배지를 탈지유 또는 우유 또는 우유-베이스 조성물 및 발효액과 같은 식품 베이스에 첨가하는 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 세균 세포 및/또는 세포-무함유 배양 배지(를 포함하는 조성물)가 첨가될 수 있는 다른 식품 베이스는 육류, 육류 대체물 또는 식물-베이스이다.
본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 조성물은 고체, 반-고체 또는 액체일 수 있다. 이는 정제, 겔, 분말, 캡술, 음료, 바 등의 형태와 같은 식품 또는 식품 보조제의 형태일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 물, 과일주스, 우유 또는 다른 음료에 용해될 수 있는 향낭 (sachet)에 포장된 분말의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "식품 성분 (food ingredient)" 또는 "사료 성분 (feed ingredient)"은 건강 보조제로서 기능성 식품 또는 식품에 첨가되거나 첨가될 수 있는 제제를 포함한다.
"영양 식품" 또는 "식품의약 (nutraceutical food)" 또는 "기능성 식품"이라 함은 건강에 유익한 효과가 있거나 생리적 기능을 향상시킬 수 있는 성분을 함유한 식품 재료를 의미한다.
"식품 보조제"는 정상적인 식품 섭취를 목적으로 하는 식품이다. 상기 식품 보조제는 영양적 또는 생리학적 효과가 있는 영양소 또는 기타 물질의 농축된 공급원으로서, 단독으로 또는 소량의 조합물로서 복용하는 것이다.
본 발명에 따르면, "기능성 식품"은 식품으로 요약되며, 최근 개발된 상응하는 제품으로, 그 중요성은 영양 및 맛뿐만 아니라 특정 성분 물질로 인해 가치가 있기 때문이다. 본 발명에 따르면, 중장기 또는 장기간의 건강 유지 및 증진이 중요하다. 이러한 맥락에서 비-치료 용도가 선호된다. 용어 "의약식품", "식품 보조제 (foodsceuticals)" 및 "디자이너 식품"이라는 용어는 본 발명의 실시양태에도 나타나며, 일부 동의어로 사용되나, 차별화된 방식으로 사용된다. 그러나, 제품의 식품 특성뿐만 아니라 예방 측면 및 건강 증진은 기능성 식품이라는 용어로 명확하게 밝혀졌다. 다수의 경우에, 이들은 분류 및 선택 (본 발명의 경우도 그러함), 정제, 농축, 또한 첨가에 의한 증가로 축적된 생성물과 관련된다. 분리된 효과적인 물질, 특히 정제나 알약 형태는 포함되지 않는다. 비록 기능성 식품에 대한 법적 정의는 없지만, 이 분야에 관심 있는 당사자 대부분은 시판되는 식품에 기본 영양 효과 이상으로 특정한 건강상의 영향을 미치는 것으로 동의한다. 따라서, 기능성 식품은 식품에 순전히 영양적인 효과 이외의 의학적 또는 생리적 이익 같은 특정 기능을 부여하는 성분 또는 요소 (예를 들어, 본원에 기술된 것과 같은)를 혼입한 통상적인 식품이다.
일부 실시양태에서, 음료는 기능성 음료 또는 치료 음료, 갈증 해소제 또는 통상적인 음료이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 유청 단백질, 건강 차, 코코아 음료, 우유 음료 및 유산균 음료, 요구르트 및 드링킹 요구르트, 치즈, 아이스크림, 빙과디저트, 제과류, 비스킷 케이크 및 케이크 믹스, 스낵 식품, 균형 잡힌 음식 및 음료, 과일 충전제, 보호 유약 (care glaze), 초콜릿 빵 충전제, 치즈 케이크맛 충전제, 과일맛 케이크 충전제, 케이크 및 도넛형 아이스크림, 인스턴트 제과점 충전 크림, 쿠키 충전제, 즉시 사용 가능한 베이커리 충전제, 감소된 칼로리 충전제, 성인 영양 음료, 산성 콩/쥬스 음료, 무균/레토르트 초콜렛 음료, 바믹스, 음료 분말, 칼슘 강화 콩/플레인 및 초콜릿 우유, 칼슘 강화 커피 음료를 포함하는 청량음료, 과일주스 또는 음료의 성분으로 사용될 수 있다.
조성물은 미국 치즈 소스, 갈리고 조각난 치즈 (grated & shredded cheese)를 위한 고결 방지제, 칩 딥, 크림치즈, 건식 블렌딩된 휩 토핑 무지방 사워 크림, 냉동/해동 유제품 휘핑 크림, 냉동/해동 안정한 휘핑된 티핑, 저지방 및 경성 자연 체다 치즈, 저지방 스위스 스타일 요구르트, 탄산 냉동 디저트, 하드 팩 아이스크림, 라벨 친화적, 개선된 경제성 및 하드 팩 아이스크림, 저지방 아이스크림: 소프트 서브, 바베큐 소스, 치즈 딥 소스, 코티지 치즈 드레싱, 드라이 믹스 알프레도 소스, 믹스 치즈 소스, 드라이 믹스 토마토 소스 및 기타로서 식품 내의 성분으로서 첨가하여 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 조성물은 발효 요구르트 음료, 요구르트, 드링킹 요구르트, 치즈, 발효 크림, 우유 베이스 디저트 및 기타 요구르트 생산에 사용된다. 적합하게는, 조성물은 치즈용, 육류용 또는 보호 배양용 중 하나 이상에서 성분으로서 포함되어 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 식품 조성물은 식사 대용 제품(meal replacement product)을 제조하기에 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 특정되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "식사 대용 제품"은 단백질, 탄수화물, 지질, 비타민 및 미네랄을 함유하는 임의의 영양 제품을 포함하며, 이들의 조합은 식사를 위한 단독 또는 주요 영양 공급원으로 적합하다. 전형적으로, 식사 대용 제품은 적어도 하나의 탄수화물 공급원, 적어도 하나의 지질 공급원 및/또는 적어도 하나의 단백질 공급원을 포함한다. 단백질 공급원으로서, 임의의 적합한 식이 단백질, 예를 들어 동물성 단백질 (우유 단백질, 육류 단백질 및 계란 단백질); 식물성 단백질 (콩 단백질, 밀 단백질, 쌀 단백질 및 완두 단백질과 같은); 유리 아미노산의 혼합물; 또는 이들의 조합물이 사용된다. 카제인, 유청과 같은 우유 단백질, 및 콩 단백질이 특히 바람직하다. 단백질은 손상되지 않거나, 가수분해될 수 있거나, 손상되지 않은 단백질과 가수분해된 단백질의 혼합물 일 수 있다. 젖소 우유 알러지를 일으킬 위험이 있다고 여겨지는 동물에 대해서는 부분 가수분해 단백질 (2 내지 20%의 가수분해도)을 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 가수분해된 단백질이 요구되는 경우, 가수분해 과정은 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 유청 단백질 가수분해물은 하나 또는 그 이상의 단계에서 유청 분획을 효소적으로 가수분해함으로써 제조될 수 있다. 출발 물질로 사용된 유청 분획이 실질적으로 유당이 없는 경우, 단백질은 가수분해 공정 동안 리신 차단을 훨씬 덜 받는 것으로 밝혀졌다. 이는 리신 차단 정도를 총 리신의 약 15 중량%에서 리신의 약 10 중량% 미만으로 감소시킬 수 있게 한다; 예를 들어 약 7 중량%의 리신이 단백질 공급원의 영양 품질을 크게 향상시킨다. 조성물이 지방 공급원을 포함하는 경우, 지방 공급원은 조성물의 에너지의 5 내지 40%를 제공하는 것이 바람직하며; 예를 들어 에너지의 20 내지 30%를 제공한다. 캐놀라 오일, 옥수수 오일 및 하이올레산 해바라기 오일을 혼합하여 적절한 지방 프로파일을 얻을 수 있다. 탄수화물의 공급원은 조성물의 에너지의 40 내지 80%를 제공하는 것이 바람직하다. 임의의 적합한 탄수화물, 예를 들어 수크로스, 락토오스, 글루코스, 프럭토스, 옥수수 시럽 고형물, 말토덱스트린 및 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 전형적으로 식사 대체물로 에너지 제한 식단으로 1일 식사를 대체하면 체중 감량 후 체중 유지에 기여한다.
본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 식품 조성물은 전형적으로 담체 또는 부형제를 포함한다. "담체" 또는 "부형제"는 투여에 적합한 물질을 의미하며, 예를 들어 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 용해제 등과 같은 당업계에 공지된 임의의 물질을 포함하며, 이는 무독성이고, 유해한 방식으로 조성물의 성분과 상호작용하지 않는다. 영양학적으로 허용가능한 담체의 예로는 물, 염 용액, 알콜, 실리콘, 왁스, 석유젤리, 식물성 오일, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 리포좀, 당류, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세라이드, 페트로트랄 지방산 에스테르, 하이드록시메틸-셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 식품 조성물은 상당량의 식이 섬유를 포함한다. 식이 섬유는 효소에 의해 소화되지 않고 소장을 통과하여 자연 팽창제와 완화제 역할을 한다. 식이 섬유는 용해성이거나 불용성일 수 있으며, 일반적으로 두 유형의 혼합물이 선호된다. 식이 섬유의 적절한 공급원은 대두(soy), 완두, 귀리, 펙틴, 구아 검, 아라비아 고무(gum Arabic), 프럭토올리고당류, 갈락토-올리고당류, 시알릴-락토오스 및 동물 유청에서 유래된 올리고당류을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식이 섬유는 만난 중에서 선택된다. 구아 검, 로커스트 빈 검, 콘자크 (konjac), 잔탄 검과 같은 만난 (예컨대, 글루코만난 및 갈락토만난)은 일부 식물 세포벽에 존재한다. 글루코만난은 일반적으로 (1-4)-β-결합 글루코스 및 만노스 단위로 구성되는 반면, 갈락토만난은 일반적으로 (1-6)-α-갈락토스의 단일 단위로 치환된 (1-4)-β-만난 골격 (backbone)으로 구성된다. 구아 및 로커스트 빈과 같은 많은 내피 콩과 식물은 종자 발달 과정에서 내피 속에 갈락토만난을 포함하고 있다. 글루코만난은 또한 시리얼 곡물의 미량 성분으로도 발견되었다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 식품 조성물은 USRDA와 같은 정부 기관의 권고에 따라 미네랄 및 미량 영양소, 예컨대 미량 원소 및 비타민을 함유한다. 예를 들어, 조성물은 주어진 범위의 하기 미량 영양소 중 하나 또는 그 이상을 일일량으로 함유할 수 있다: - 300 내지 500 mg의 칼슘, 50 내지 100 mg의 마그네슘, 150 내지 250 mg의 인, 5 내지 20 mg의 철, 1 내지 7 mg의 아연, 0.1 내지 0.3 mg의 구리, 50 내지 200 μg의 요오드, 5 내지 15 μg의 셀레늄, 1000 내지 3000 μg의 베타카로틴, 10 내지 80 mg의 비타민 C, 1 내지 2 mg의 비타민 B1, 0.5 내지 1.5 mg의 비타민 B6, 0.5 내지 2 mg의 비타민 B2, 5 내지 18 mg의 니아신, 0.5 내지 2.0 μg의 비타민 B12, 100 내지 800 μg의 엽산, 30 내지 70 μg의 비오틴, 1 내지 5 μg의 비타민 D, 3 내지 10 μg의 비타민 E.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 조성물은 유화제를 함유한다. 식품 등급 유화제의 예는 전형적으로 모노- 및 디-글리세라이드의 디아세틸타르타르산 에스테르, 레시틴, 및 모노- 및 디-글리세라이드를 포함한다. 유사하게 적합한 염 및 안정화제가 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 식품 조성물은 적어도 하나의 프리바이오틱을 함유한다. "프리바이오틱 (Prebiotic)"은 장내에서 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주의 생장을 촉진시키는 것을 목적으로 하는 식품 물질을 의미한다. 프리바이오틱은 올리고당류로 이루어지며, 선택적으로 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 대두 및/또는 이눌린; 및/또는 식이 섬유를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 조성물은 보호용 하이드로콜로이드 (예컨대, 검, 단백질, 변형된 전분), 결합제, 막 형성제, 캡슐화제/물질, 벽/쉘 물질, 매트릭스 화합물, 코팅제, 유화제, 계면활성제, 가용화제 (오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 공-화합물, 분산제, 습윤제, 가공 보조제 (용제), 유동화제, 맛 차단제, 중량제, 젤화제, 겔 형성제, 항산화제 및 항미생물제를 포함한다. 조성물은 또한 통상의 약제학적 첨가제 및 보조제, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있으며, 물, 임의 기원의 젤라틴, 식물성 검, 리그닌 술폰산염, 탈크, 당류, 전분, 아라비아 고무, 식물성 오일, 폴리알킬렌글리콜, 방향제, 보존제, 안정제, 유화제, 완충제, 윤활제, 착색제, 습윤제, 충전제 등을 함유할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 모든 경우에, 그러한 추가 구성 요소는 의도된 피험자에 대한 적합성을 고려하여 선택될 것이다.
일부 실시양태에서, ClpB 단백질 또는 이 단백질을 발현하는 세균 균주, 특히 프로바이오틱 세균 균주의 투여는 1일 2 내지 3회, 1일 또는 그 이상 동안, 그리고 일반적으로 적어도 4일의 지속기간 동안, 또는 심지어 4 내지 15주간 반복되었고 적절한 경우, 하나 이상의 중단 기간이 있었다. 일부 실시양태에서, 상기 ClpB 단백질은 개체의 1회 식사와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, ClpB 단백질은 개체의 식사 전에 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 유익한 효과 (예컨대, 포만 자극, 포만감 지속, 식품 섭취 감소, 체중 증가 억제 및/또는 체중 감소 촉진)를 달성하기에 충분한 ClpB 단백질의 양을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 개체에 투여되는 ClpB 단백질의 양은 일반적 건강, 나이, 성별, 체중 등과 같은 개체의 특성에 의존할 것이다. 숙련된 기술자는 이 요인들 및 다른 요인들에 의존하는 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 예를 들어, ClpB 단백질이 프로바이오틱 형태로 개체에게 투여되는 경우, 본 발명의 균주는 개체에 유익한 효과를 발생시키기에 충분한 콜로니를 생성할 수 있어야 한다. 프로바이오틱 세균 균주가 식품 제품의 형태로 투여되는 경우, 이는 전형적으로 식품 조성물의 건조 중량 g당 본 발명의 상기 프로바이오틱 세균 균주에서 103 내지 1012 cfu를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나 이 실시예 및 도면은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1: 정상 C57Bl6 성체 마우스에서 E. coli K12 야생형 (WT) 또는 ClpB 유전자 (ClpB)가 결실된 E. coli의 매일 위내 (intragastric) 전달의 효과에 관한 것으로, 위관영양의 시작 및 3주의 말기에 체중, 24시간 식품 섭취 및 식사 패턴을 분석한 결과이다. 대조군 마우스 (Ctr)는 위관영양을 받지 않았다. 식사 패턴은 단일 식사 중에 섭취된 음식의 평균 양에 상응하는 식사량과, 적어도 5분 이상 분리된 24시간당 식사의 수에 상응하는 식사 빈도로 측정되었다. 감소된 식사량은 더 빠른 포만을 반영하고 감소된 식사 빈도는 더 긴 포만감을 반영한다. A. 양방향 반복 측정 ANOVA, 본페로니 (Bonferroni) 사후-검정 *p<0.05. B,D,G,H, ANOVA, 터키 (Tukey) 사후-검정, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. E. 스튜던츠 t-검정, *p<0.05.
도 2: ARC POMC 뉴런의 전기적 활성에 대한 ClpB의 효과. 변화의 백분율로 표시되는 활동 전위 빈도 대 기저 수준; 평균 ± SEM. 본페로니 사후-검정 *p < 0.05,**p < 0.01.
도 3: 둘 다 뮬러-힌튼 (Mueller-Hilton, MH) 배지 중인 E. coli K12, E. coli K12 ΔClpB, 또는 대조군 (Ctr)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양 전 및 도중 (0-21일째)에 비만 ob/ob 마우스에서의 체중 역학. 양방향 ANOVA, 치료 효과: p=0.01, 본페로니 사후-검정 Ctr. vs. E. coli K12, * p<0.05 및 **p<0.01. 평균 ±SEM.
도 4: 둘 다 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 E. coli K12 (n=8), E. coli K12 ΔClpB (n=8), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양의 3주 후에 비만 ob/ob 마우스에서의 평균 체중 변화 (무작위화 당일부터 = 100%)의 백분율. ANOVA p=0.01, 터키 사후-검정 * p<0.05. 평균 ±SEM.
도 5: 둘 다 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 E. coli K12 (n=8), E. coli K12 ΔClpB (n=8), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양의 3주 후에 EchoMRI에 의해 측정된 비만 ob/ob 마우스에서의 지방 함량. ANOVA p=0.005, 터키 사후-검정 **p<0.01. 평균±SEM.
도 6: 둘 다 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 E. coli K12 (n=8), E. coli K12 ΔClpB (n=8), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양의 3주 후에 EchoMRI에 의해 측정된 비만 ob/ob 마우스에서의 근육 대 체지방 비율. ANOVA p=0.05, 스튜던츠 t-검정 *p<0.05. 평균±SEM.
도 7: 둘 다 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 E. coli K12 (n=8), E. coli K12 ΔClpB (n=8), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양의 3주 동안에 비만 ob/ob 마우스에서의 평균 일일 식품 섭취량. ANOVA p<0.0001, 터키 사후-검정 ***p<0.001. 평균±SEM.
도 8: 둘 다 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 E. coli K12 (n=8), E. coli K12 ΔClpB (n=8), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양의 3주 동안에 비만 ob/ob 마우스에서의 평균 일일 식사 횟수. ANOVA p<0.0001, 터키 사후-검정 ***p<0.001. 평균±SEM.
도 9: 모두 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인, E. coli K12, E. coli Niessle 1917, 동결건조된 E. coli Niessle 1917 (lyo), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양 동안에 비만 ob/ob 마우스에서의 일일 체중 증가. 양방향 ANOVA, p=0.02, 본페로니 사후-검정 a, Ctr. vs. E. coli Niessle 1917 lyo 및 b, Ctr. vs. E. coli Niessle 1917, * p<0.05 및 **p<0.01. 평균±SEM.
도 10: 모두 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인, E. coli K12, E. coli Niessle 1917, 동결건조된 E. coli Niessle 1917 (lyo), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양 2주 후에 비만 ob/ob 마우스에서의 평균 체중 변화 (무작위화 당일부터 = 100%)의 백분율. 클라우스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) p<0.01, Dunn 사후-검정 *p<0.05, 만-휘트니 (Mann-Whitney) 검정 ##p<0.01. 평균±SEM.
도 11: 모두 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인, E. coli K12, E. coli Niessle 1917, 동결건조된 E. coli Niessle 1917 (lyo), 또는 대조군 (Ctr., n=7)으로서 MH 배지 단독을 이용한 위내 위관영양 2주 후에 EchoMRI로 측정된 비만 ob/ob 마우스에서의 지방 함량. 스튜던츠 t-검정 **p<0.01. 평균±SEM.
도 12: 래트의 식품 섭취에 있어서 상이한 용량의 ClpB의 뇌실내 (intracerebroverticular) 직접 주입의 효과.
실시예
실시예 1:
재료 및 방법
정기적인 영양 공급 후 시험관 내 E. coli 성장
E. coli K12 세균을 50 ml Falcon 바이알 내에 25℃에서 pH 7.3인 30% 소고기 침출물, 1.75% 카제인 가수분해물 및 0.15% 전분을 함유하는 40 mL의 MH 배지 (Becton, Dickinson, MD) 중에서 37℃로 배양하였다. 예정된 2종의 일일 식사를 인간에서 모델링하기 위해, 세균은 연속 5일간 12시간 마다 새로운 MH 배지를 공급 받았다. 세균 성장을 MH 배지의 제1 공급 후 2시간 마다, 제3 공급 후 1시간 마다, 그리고 제5 공급 후 10분 마다 분광광도계로 λ = 600 nm에서의 OD로서 측정하였다. 매 12시간 주기의 말기에, 세균을 실온 (RT)에서 6,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고 동일 부피 (~40 ml)의 새로운 MH 배지로 교체하였다. MH 배지의 마지막 보충 후, 대수기 및 이후의 정체기에서 단백질 추출을 위해 세균을 샘플링하였다.
단백질 추출
E. coli K12 세균을 4℃에서 4,000 g로 30분간 원심분리하였다. 세균 잔여물을 2 ml의 트리히드록시메틸아미노메탄 (TRIS) 완충제 (pH 7.4)에 용해시키고 RT에서 3분간 초음파 처리하여 균질화하였다. 용해되지 않은 세포 단편으로부터 단백질을 분리하기 위해, 세균 균질액을 4℃에서 10,000 g로 30분간 원심분리하였다. 상청액을 회수한 후 4℃에서 60,000 g로 45분간 원심분리하여 단백질을 세포질 (상청액)과 막 (잔여물) 분획으로 더 분리하였다. 막 단백질을 TRIS 완충제 (pH 7.4)에 용해시켰다. 단백질 농도를 2-D Quant 키트 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 측정하였다.
2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
2D-PAGE를 위해, 300 μg의 E. coli 단백질 추출물을 사용하여 고정된 pH 구배 (IPG) 스트립 (pH 4-7; 18 cm; BIO-RAD, Hercules, CA)을 재수화하였다. 그 후에 단백질을 IPGphor 등전위 포커싱 시스템 (GE Healthcare)을 사용한 등전점 포커싱을 통해 총 85,000 V-h의 단백질을 1차원에서 분석하였다. 포커싱 후, IPG 스트립을 평형 완충제 [우레아 6 mol/L, 30% (vol:vol) 글리세롤, 2% (wt:vol) 소듐 도데실 설페이트 (SDS), Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.8, 및 2% (wt:vol) 디티오트레이톨 함유 0.25% (wt:vol) 브로모페놀 블루] 중에서 15분간 인큐베이션한 후 4% (wt:vol) 이오도아세트아미드 함유 평형 완충제 중에서 15분간 알킬화하였다. 이어서 IPG 스트립을 SDS-PAGE용 10% 폴리아크릴아미드 구배 겔 (20 cm · 18 cm · 1 mm) 위에 고정시켰다. 2차원은 25℃에서 12 mA/gel로 Ettan Daltsix 수직 전기영동 시스템 (GE Healthcare)에서 밤새 수행하였다. SDS-PAGE 후, 2D 겔을 RT에서 2% (vol:vol) 오르토인산 및 50% (vol:vol) 메탄올 중에서 2시간 동안 고정하였다. 그 후에 겔을 물로 세정하고, 단백질 스팟을 CBB G-250 (BIO-RAD) 염색 [34% (vol:vol) 메탄올, 17% (wt:vol) 암모늄 설페이트, 2% (vol:vol) 오르토인산, 및 0.66 g CBB G-250/L]으로 시각화하였다.
차등적 단백질 발현의 분석
염색된 2D 겔의 이미지를 그레이 스케일 마커 (grey scale marker, Kodak, Rochester, NY)로 보정된 ImageScanner II (GE Healthcare)로 스캔하고 Labscan 6.0 소프트웨어 (GE Healthcare)로 디지털화하였다. 스팟 검출, 정량, 매칭 및 비교 분석을 포함하는 차등적 단백질 발현의 분석을 ImageMaster 2D Platinum 5.0 소프트웨어 (GE Healthcare)를 이용하여 수행하였다. 각각의 단백질 샘플을 런-투-런 (run-to-run) 변이를 최소화하기 위해 적어도 3회 (막 단백질) 및 4회 (세포질 단백질) 2D-PAGE에 적용하였고, 3개 (또는 4개) 겔의 각 세트를 ImageMaster를 이용해 비교하여 겔 세트 내에서 통계적으로 구별되는 스팟의 비-출현을 확인하였다. 각 세포의 가장 대표적인 겔 (겔 이동, 스팟 선명도, 및 스팟 개수)을 사용하여 지수기와 정체기 사이의 E. coli 단백질을 비교하였다. 겔에서 각 스팟의 상대적 부피에 의해 발현 수준을 결정하고 %부피로 표시하였으며, 겔에서 용해된 모든 스팟의 스팟 부피/Σ부피로 계산하였다. 이렇게 표준화된 스팟 부피는 겔에 존재하는 모든 스팟에 대한 전체 부피를 고려함으로써 단백질 로우딩 및 염색에 의한 변화를 고려하였다. 풍부도 (abundance)의 변화를 2단계 사이의 스팟 그룹에 대한 %부피의 평균값의 비율로 계산하였다. 부피비가 1.5를 초과하는 스팟만이 관련성이 있는 것으로 간주되었다. 겔 내에 스팟의 부재는 선택된 실험 조건하에서 단백질에 대해 검출가능한 발현이 보고될 수 없음을 나타내었다. 상응하는 p값은 스팟 부피의 로그 변환 후 스튜던트 t-검정 (유의 수준 p<0.05)에 의해 결정되었다.
액체 크로마토그래피 - 전기분무 이온화 MS/MS에 의한 단백질 확인
관심 단백질 스팟을 Ettan Spot Picker (GE Healthcare)를 사용하여 CBB G-250 염색된 2D 겔에서 잘라내고, 단백질의 자동화된 젤-내 분해를 Ettan Digester (GE Healthcare)에서 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Goichon et al., 2011). 그 다음에 단백질 추출물을 5% (vol:vol) 아세토니트릴/0.1% (vol:vol) 포름산 10 μL에 재현탁시키고, 나노분무 공급원이 장착된 6340 이온 트랩 질량분석기에 결합된 나노-LC1200 시스템 및 HPLC-칩 큐브 인터페이스 (Agilent Technologies, Courtaboeuf, France)로 분석하였다. 간략히, 펩타이드를 40 nL RP-C18 트랩 칼럼에서 농축 및 탈염시키고, Zorbax (30 nm 공극 크기, 5-μm 입자 크기) C18 칼럼 (43 mm 길이×75 μm 내경, Agilent Technologies)에서 분리하였다. 400 nL/분의 유속에서 9-분 선형 구배 (0.1% 포름산을 함유하는 3% 내지 80% 아세토니트릴)를 사용하였고, 용리액을 이온 트랩 질량분석기로 분석하였다.
단백질 확인을 위해, MASCOT Daemon 버전 2.2.2 (Matrix Science) 검색 엔진을 사용하여 MS/MS 피크 목록을 발췌하고 단백질 데이터베이스와 비교하였다. 이들 검색은 다음의 특정 파라미터에 의해 수행되었다: 효소 특이성, 트립신; 1회 빗나간 개열 허용; 고정된 변형 없음; 가변적 변형, 메티오닌 산화, 시스테인 카바미도메틸화, 세린, 티로신 및 트레오닌 인산화; 단일 동위 원소; 펩티드 전하, 2+ 및 3+; 전구체 이온에 대한 질량 내성, 1.5 Da; 단편 이온에 대한 질량 내성, 0.6 Da; 기기로서 ESI-TRAP; 분류학, E. coli; NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스 [NCBInr 20120531 (18280215 서열, 6265275233 잔기)] (Bethesda, MD). 단백질 적중은 다음 기준 중 하나를 만족하는 경우 자동으로 검증되었다: 각각 54 이상의 MASCOT 점수 (p <0.01)를 갖는 최소한 2개의 최상위 펩티드 (굵은 및 적색), 또는 각각 47 이상의 MASCOT 점수 (p <0.05)를 갖는 최소한 2개의 최상위 펩티드로 확인하였다. 위-양성률을 평가하기 위해, 모든 초기 데이터베이스 검색은 MASCOT의 "미끼" 옵션을 사용하여 수행되었다. 결과는 위-양성률이 1%를 초과하지 않으면, 유관한 것으로 고려되었다.
ATP 어세이
시험관 내 ATP 생산은 제조사의 지시 (BioVision, CA)에 따라 ATP 비색/형광 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 간략히, 대수기 또는 정체기의 세균 단백질을 각 농도 (ATP 어세이 완충액에서 1, 10 및 25 μg/mL)에 대해 일련의 웰에 넣고 ATP 어세이 완충액으로 50 μL/웰로 조정했다. 그 다음, 10 μL의 다른 영양액, 15% 수크로스 또는 MH 배지를 상응하는 웰에 첨가하고 ATP 어세이 완충액으로 50 μL/웰로 조정하였다; 대조군 웰에는 50 μL/웰의 ATP 완충액만을 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 진탕하였다. 진탕 후, 50 μL의 ATP 반응 혼합물 (ATP 어세이 완충액, ATP 프로브, ATP 변환기 및 개발자의 혼합물 포함)을 각 웰에 첨가하였다. 흡광도 (OD)는 빛을 차단하고, 실온에서 30분간 진탕 후, 570 nm에서 측정하였다.
ClpB 면역어세이의 개발 및 검증
ClpB 검출 어세이의 설계는 선형 농도 범위에서 특이적이고 민감한 검출과 같은 몇 가지 기준에 기반을 두었다. 특별한 조건은 α-MSH 교차-반응성이 없는 ClpB 검출이었는데, 이는 ClpB 분자에서 α-MSH-유사 에피토프(들)의 존재로 인해 발생할 수 있다. 절차 및 신호 검출의 단순화를 위해, 표준 96-웰 ELISA 플레이트와 분광광도계로 OD 판독 옵션을 사용하였다. ClpB ELISA와 웨스턴 블랏 (WB)의 상세한 프로토콜은 별도의 항목에 나타내었다.
포획 항체에 대한 표시 (Revelation) 항체의 결합을 막기 위해, 각각 토끼 및 마우스의 다른 종에서 ClpB 포획 항체와 ClpB 검출 항체를 생산하였다. 복잡한 생물학적 샘플에서 ClpB 단백질을 가장 효율적으로 포획하기 위해, 본 발명자들은 ELISA 플레이트를 다중 항-ClpB 에피토프를 갖는 토끼의 다중클론 항체로 코팅하였다. ClpB와 α-MSH 사이의 교차-반응성을 회피하기 위해, 몇몇 항체 클론의 ELISA 스크리닝에 의해 미리 선택된 ClpB를 인식하는 높은 민감도와 특이성을 특징으로 하지만 α-MSH를 인식하지 않는, 마우스 단일클론 항-ClpB 항체를 검출 항체로 사용하였다. 알칼리성 포스파타제가 결합된 항-마우스 표시 항체는 일반적인 ELISA 도구로 사용되어 분석물 농도에 비례하여 OD로 판독 가능한 발색 효소 반응을 얻을 수 있다. 정점에 도달하지 않고 OD 신호의 포화 없이 2 pM 내지 150 pM 범위의 재조합 E. coli ClpB 단백질의 7회 연속 희석의 검출 결과로부터 OD 값의 선형 변화가 얻어졌다.
개발된 ClpB 어세이의 특이성을 검증하기 위해 E. coli K12 WT의 10가지 다른 배양액과 ΔClpB 돌연변이 E. coli 세균의 배양액에서 추출한 단백질 샘플에서 ClpB 농도를 측정하였다. ΔClpB 돌연변이체 및 해당 야생형 (WT) 균주는 Axel Mogk 박사 (ZMBH, Heidelberg University, Germany)로부터 친절하게 제공되었다. 또한, 토끼의 항-ClpB 다중클론 항체를 사용하고 WB에 의해 세균 단백질 샘플에서 ClpB 존재를 분석하고, ELISA에서 WB 밴드와 ClpB 농도 사이의 신호 강도 값을 비교하였다. 모든 WT E. coli 배양물에서 ClpB가 검출되었으며, 7가지 배양물은 ClpB 농도가 1000 pM 이상이었고, ΔClpB E. coli에서 추출한 단백질 샘플에서 ClpB는 검출되지 않았다. WB는 WT에서는 예상되는 96 KDa 크기의 중요한 밴드를 나타내지만 ΔClpB E. coli에서는 그렇지 않았다. 이 들 밴드의 OD 강도는 개별 샘플들 사이에서 다양하였고 E. coli 배양물의 동일한 샘플에서 ELISA에 의해 측정된 ClpB 농도와 양의 상관관계가 있다. 따라서, ΔClpB E. coli의 단백질 제조물에서 ClpB 검출의 부재는 분석의 특이성을 확인하였고, ELISA와 WB 사이의 우수한 일치는 ClpB 면역검출 기법의 교차-검증을 제공하였다.
ClpB 플라스마 어세이가 장내 세균에서 유래된 ClpB를 검출하는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 3주간 위관영양으로 WT 또는 ΔClpB E. coli를 매일 보충한 마우스의 혈장에서 ClpB를 측정하기 위해 ClpB ELISA를 사용하였다. 혈장 샘플은 이전에 발표된 연구 (Tennoune et al., 2014)로부터 이용 가능하였다. 본 발명자들은 대조군과 세균 부재의 배양 브로쓰로 위관영양된 마우스 둘 다를 포함하는 마우스 혈장에서 ClpB가 정상적으로 존재하였음을 발견하였다. 중요하게, 혈장 ClpB 수준은 WT E. coli를 투여 받은 마우스에서는 증가하였지만, ClpB-결핍 E. coli가 보충된 마우스에서는 변화가 없었으며, 이로부터 혈장 ClpB가 장내 세균 기원임을 확인하였다.
ClpB ELISA
토끼의 다중클론 항-E. coli ClpB 항체를 4℃에서 12시간 동안 100 mM NaHCO3 완충액, pH 9.6에서 100 μL 및 2 μg/ml 농도를 이용하여 96-웰 Maxisorp 플레이트 (Nunc, Rochester, NY) 위에 코팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20을 포함하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 pH 7.4에서 세척 (5분×3)하였다. 재조합 E. coli ClpB 단백질 (Delphi Genetics에서 상업적으로 제작)을 표본 완충액 (PBS, 아지드화 나트륨 0.02%, pH 7.4)에서 5, 10, 25, 50, 70, 100 및 150 pM으로 연속적으로 희석하고, 웰에 2중으로 첨가하였다. 분석 대상 샘플은: 마우스 및 래트로부터의 결장 점막 및 혈장 샘플 또는 E. coli K12 배양물에서 추출한 단백질을 포함하였다. 분석 샘플을 나머지 웰에 2중으로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20, pH 7.4를 갖는 PBS로 세척 (5분×3)하였다. 마우스 단일클론 항-E. coli ClpB 항체 (표준 완충액에서 1:500, Delphi Genetics에서 상업적 제작)를 웰에 첨가하고 90분간 실온에서 진탕하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20, pH 7.4를 갖는 PBS로 세척 (5분×3)하였다. Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)의 알칼라인 포스파타제 (표준 완충액에서 1:2000)와 결합된 염소 항-마우스 IgG를 웰에 첨가하고 90분간 실온에서 진탕하였다. 플레이트를 0.05% Tween 20, pH 7.4를 갖는 PBS로 세척 (5분×3)하고, 알칼라인 포스파타제의 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트 용액 (Sigma, St. Louis, MO) 100 μL를 첨가하였다. 실온에서 40분간 진탕한 후, 3 N NaOH 50 μL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. OD를 마이크로 플레이트 판독기 Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwan)을 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 혈장 샘플 또는 ClpB 단백질 표준 희석액을 첨가하지 않고 플레이트를 판독하여 얻은 블랭크 OD 값을 샘플 OD 값으로부터 감산하였다.
ClpB 웨스턴 블랏
E. coli K12에서 추출한 단백질을 사용하여 WB를 수행하였다. 단백질 샘플 (10 μg)을 트리스-글리신 완충액 중에서 20% 아크릴아미드 SDS 겔로부터 분리하였고, 적어도 1시간 동안 실온에서 TBS (Tris 10 mmol/L, pH 8, NaCl 150 mmol/L)와 0.05% (w/v) Tween 20과 5% (w/v) 탈지분유로 차단된 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare, Orsay, France)으로 이전시켰다. 이후, 막을 4℃에서 토끼 다중클론 항-E. coli ClpB 항체 (1:2000, Delphi Genetics)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. TBS/0.05% Tween 20 중의 5% (w/v) 탈지분유의 차단 용액으로 3회 세척한 후, 막을 퍼옥시다아제-접합된 항-토끼 IgG (1:3000, SantaCruz Biotechnology)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척 후, ECL 검출 키트 (GE Healthcare)를 사용하여 퍼옥시다아제 반응을 표출시켰다. 단백질 밴드를 분자량 표준 (Precision Plus, BioRad)과 비교하고 ImageScanner III (GE Healthcare)를 사용하여 필름을 스캔하고 ImageQuant TL 소프트웨어 7.0 (GE Healthcare)을 사용하여 밴드 픽셀 밀도를 분석하였다.
래트에서 E. coli 단백질의 장 투여
동물
동물 관리 및 실험은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 확립된 지침에 따라 이루어졌으며, 프랑스와 유럽공동체 규정 [유럽공동체 공식저널 (Official Journal of the European Community) L358, 18/12/1986]을 준수하였다. 체중 200 내지 250 g의 암컷 Sprague-Dawley 래트 (Janvier, Genest-Saint-Isle, France)를 사육 환경에 순응시키기 위해 완전히 갖춰진 동물 실험 시설에서 조절된 환경 조건 (22±1℃, 12시간의 명암주기, 오전 7시 30분 점등)에서 1주일간 케이지 (케이지 당 3마리 래트)에서 유지시켰다. 래트는 표준 펠렛화된 설치류 사료 (RM1 사료, SDS, UK) 및 음료수를 마음대로 (ad libitum) 이용 가능하였다.
실험 #1
본 실험은 E. coli 생장의 시험관 내 모델과 생체 내 상황에서 장내 세균 증식의 관련성을 평가하기 위해 설계되었다. 래트를 케타민 (75 mg/kg, Virbac, Carros, France)/자일라진 (5 mg/kg, Bayer, Leverkusen, France) 용액 (3:1 vol.)을 0.1 mL/체중 100 g으로 복강 내 주입하여 래트를 마취시켰다. 복강경 수술 후, 결장은 2개의 결찰을 배치하여 고정시켰다: 첫 번째는 결장 연결점에, 두 번째는 그로부터 4 cm 아래에 배치하였다. 상행 결장 내로 삽입되고 첫 번째 결찰로 고정된 폴리프로필렌 카테터를 사용하여 결장 주입 및 관강 (luminal) 내용물 샘플링을 수행하였다. 2 ml의 MH 배지 또는 물을 결장 내로 부드럽게 주입한 후, OD 측정을 위해 즉시 회수하였다. OD 측정 후, 결장 내용물의 전체 샘플을 결장으로 되돌려 보냈다. 새로운 MH 배지 또는 물을 첨가하지 않고, 결장 내용물의 이러한 샘플링을 처음 20분간은 5분마다, 그 후에는 30분 및 60분에 반복하였다. 세균 밀도를 분광광도계에 의해 λ=600 nm에서의 OD로 측정하였다. 혈액 샘플을 1차 주입 후 30분과 60분 사이에 문맥으로부터 채취하였다. 대변 샘플을 ClpB의 DNA 추출 및 PCR에 대한 실험 종료 시 결장으로부터 채취하였다.
실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응
CFX 96 q-PCR 장치 (BioRad, CA)를 사용하여 ClpB DNA 발현 세균의 세균 밀도를 분석하기 위해 정량적 PCR (qPCR)을 수행하였다. 총 DNA를 QAMP DNA 스툴 미니 키트 (QAMP DNA stool mini kit, QIAGEN Venlo, Netherlands)를 사용하여 래트의 배설물에서 추출하였다. qPCR 혼합물은 SYBR Green Master (QIAgen, West Sussex, UK) 5 μL, 순방향 및 역방향 프라이머 각각 0.5 μm, 샘플에서 추출한 DNA 및 물을 포함하여 10 μL의 총 부피가 되었다. 프라이머를 Invitrogen (Cergy-Pontoise, France)에서 구입하였다. 3단계 PCR을 40주기 동안 수행하였다. 샘플을 95℃에서 10분간 변성시키고, 60℃에서 2분간 어닐링시키고, 95℃에서 15초간 신장시켰다.
실험 #2
본 실험은 체순환계에서 장내 펩타이드 (GLP-1 및 PYY) 방출에 대한 E. coli 단백질의 효과를 평가하기 위한 것이다. 래트를 마취시키고 결장을 상기에 기술된 바와 같이 고정시켜, 대수기 (n=6) 또는 정체기 (n=6)에서 추출된 E. coli 단백질 (PBS 2 mL에 0.1 ㎍/kg의 단백질)의 결장 주입을 20분간 1회 수행하였다. GLP-1, PYY 및 ClpB의 어세이를 위해 혈액 샘플을 결장 주입 전과 20분 후에 문맥으로부터 채취하였다. 결장 점막 샘플을 ClpB 어세이를 위한 실험의 말기에 취하였다. 제조사의 지침에 따라 형광 효소 면역 측정법 키트 (Phoenix Pharmaceutical inc., CA)를 사용하여, GLP-1 및 PYY 분석을 수행하였다. 형광은 마이크로 플레이트 판독기 Chameleon (HIDEX Inc., Turku, Finland)을 사용하여 여기 325 nm 및 방출 420 nm에서 측정하였다.
래트에 E. coli 단백질의 투여, 식품 섭취 및 뇌 c- fos 연구
동물
체중 200 내지 250 g의 Wistar 수컷 래트 (Janvier, Genest-Saint-Isle, France)를 상기에 기술된 바와 같은 수용 조건에 순화시키고 사육하였다. 실험 3일 전에, 래트를 가루 형태 (SDS)이지만 동일한 RM1 사료가 마음대로 제공되는 개별 대사 케이지 (Tecniplast, Lyon France)로 옮겼다. 음료수는 항상 가용하였다. 래트를 순화 기간 동안 매일 몇 분씩 부드럽게 다루어 조작에 익숙해지게 하였다. 순화의 말기에, 래트를 유사한 평균 체중을 달성하도록 세 그룹으로 나누었고 실험 1 내지 3으로 사용하였다. 4일 간격으로 같은 래트에서 사료 제한을 포함한 두 가지 실험을 수행하였다. 자유 식이하는 래트에 대한 세 번째 실험은 그들의 새로운 시리즈를 포함하였다.
실험 #1
첫 번째 실험은 대수기 및 정체기에서 추출된 E. coli 막 단백질의 효과를 비교하기 위한 것이다. 래트를 밤새도록 (18시에서 10시 사이) 금식시켰고, 음료수는 항상 가용하였다. 금식 후 다음날, E. coli 단백질을 10시에 복강 내 주입하였고, 래트는 즉석에서 미리 칭량된 양의 식품이 담긴 대사 케이지로 돌아갔다. 식품 섭취를 1시간, 2시간 및 4시간째에 측정하였다. 제1군의 래트 (n=6)는 대수기의 E. coli로부터 추출된 0.1 mg/kg의 막 단백질을 포함한 300 μL의 PBS를 투여 받았고; 제2군의 래트 (n=6)는 정체기의 E. coli로부터 추출된 0.1 mg/kg의 막 단백질을 투여 받았으며, 대조군 (n=6)은 300 μL의 PBS를 투여 받았다.
실험 #2
두 번째 실험은 대수기 및 정체기에서 추출된 E. coli 세포질 단백질의 효과를 비교하기 위한 것이다. 유사한 실험 프로토콜이 실험 #1과 동일하게 사용되었다.
실험 #3
본 실험은 자유 식이하는 래트에서 총 E. coli 단백질이 식품 섭취에 미치는 영향을 평가하도록 고안되었다. 대수기 (n=6) 또는 정체기 (n=6)에서 추출된 E. coli 단백질 (0.1 mg/kg의 단백질을 포함한 300 μ의 PBS, 복강 내) 또는 PBS만 함유한 대조군 (n=6)의 주입을 19시 30분에 실시하였고, 동물은 미리 칭량된 양의 식품이 담긴 대사 케이지로 돌아갔다. 누적된 식품 섭취를 2시간 후에 측정하였다. 그 직후에, 래트를 소듐 펜토바르비탈 (0.2 mg/kg, 복강 내)로 마취시키고, 뇌에서 c-fos 발현의 면역조직화학 연구를 위해 관류하였다.
조직 준비 및 면역조직화학
뇌를 4% 파라포름알데히드로 관류/침지하여 고정시키고, 저온유지장치 (cryostat, Leica Microsystems, Nanterre, France)에서 동결 및 절단하고, 티라미드 신호 증폭 (tyramide signal amplification, TSA) 플러스 형광 키트 (plus fluorescein kit) (NEN, Boston, MA)를 이용하여 면역조직화학을 수행하였다. 단일 염색을 위해 c-fos에 대한 토끼의 다중클론 항혈청 (1:4,000, 항체-5, Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 이중 염색을 위해, TSA에 이어서 β-엔도르핀 (β-end)에 대한 토끼 단일클론 항체로서, 항-토끼 시아닌-3 항체 1:200 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 의해 발색되는 항체 1:1,000 (Life Technologies, Frederick, MD) 또는 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP)에 대한 마우스 단일클론 IgG로서, 항-마우스 로다민 레드-결합 항체 1:200 (Jackson ImmunoResearch)에 의해 발색되는 항체 1:1,000 (Santa Cruz Biotechnology, inc., TX)을 사용하는 직접 면역형광 기법을 적용하였다. 시상하부의 아치형 및 복내측 핵과 편도체의 중심핵에서, 양성 세포를 6개의 연속 섹션으로부터 20배 배율에서 계수하였다. 래트당 평균 양성 세포 수를 사용하여 그룹 평균을 계산하였다. 디지털 이미지를 Adobe Photoshop 6.0 소프트웨어 (Adobe Systems, San Jose, CA)에서 밝기와 대비를 위해 최적화하였다.
마우스에서 E. coli 단백질의 만성 투여
2개월령의 수컷 마우스 C57Bl6 (n=32)를 Janvier Labs에서 구입하고, 동물 실험 시설에서 1주간 12시간의 명암 주기, 8시 점등으로 순화시켰다. 그 후에, 마우스를 BioDAQ 마우스 케이지 (Research Diets, Inc. New Brunswick, NJ)에 개별적으로 넣었고, 이들 각각은 자동 사료공급 모니터가 설치되어 있다. BioDAQ 케이지에서 3일간 순화시킨 후, 마우스를 3개의 그룹 (n=8)으로 나누었고, 이들 각각은 매일 2회의 복강 내 주입으로 이루어진 상이한 처리를 받았다: (i) PBS, (ii) 대수기에서 추출된 세균 단백질 (0.1 mg/체중 kg), (iii) 정체기에서 추출된 세균 단백질 (0.1 mg/체중 kg). 사료 (SERLAB, Montataire, France)와 음료수는 마음대로 이용 가능하였고, 체중을 매일 측정하였다. 사료 공급 데이터를 일주일 동안 지속적으로 모니터링하였고 BioDAQ 데이터 뷰어 2.3.07 (Research Diets)을 사용하여 분석하였다. 식사 패턴 분석을 위해, 식사-간 간격은 300초로 설정하였다. 포만감 비율을 식사 후 시간의 간격 (초)을 이전 식사에서 섭취한 음식의 양 (g)으로 나눈 값으로 계산하였다. 실험 후, 래트를 참수에 의해 희생시키고; 뇌를 제거하고 신경펩타이드 mRNA 마이크로어레이를 위하여 시상하부를 해부하였다.
시상하부 신경펩티드 mRNA 마이크로어레이
제조사의 프로토콜에 따라 NucleoSpin ® RNA II 키트 (Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 E. coli 단백질의 만성 투여를 받은 마우스의 시상하부로부터 총 RNA를 추출하였다. 절단된 RNA를 ImProm-II™ 역전사 시스템 키트 (Promega, Madison, WI)를 사용하여 42℃에서 60분간 역전사시켰다. 수득된 cDNA를 실시간 PCR 반응에 사용하였다. Primer express 소프트웨어 (Life Technologies, Saint-Aubin, France)를 사용하여 9가지 프라이머 쌍 패널을 고안하고 효율성과 특이성을 검증하였다. PCR 반응은, 6 μL의 cDNA 및 100 nM 농도의 특정 역방향 및 순방향 프라이머를 함유하는 6 μL의 Fast SYBR Green Master Mix (Life Technologies)로 구성된, Bravo 액체 핸들링 시스템 (Agilent)으로 96-웰 플레이트에 분배되었고 QuantStudio 12K Flex (Life Technologies)로 증폭되었다. 표적 유전자에 대한 cDNA-생성 신호를 투입 mRNA 양의 변화에 대한 참조 유전자 신호로 내부적으로 보정하였다. 이어서, 유전자 발현 수준을 상응하는 대조군 샘플과 비교하였고, 2-△△Cq 방법으로 보정을 결정하였다.
전기생리학적 기록
이전에 기술된 바와 같이 (Fioramonti et al., 2007), 성체 POMC-eGFP 마우스 (5 내지 7주령, Ref: C57BL/6J-Tg (Pomc-EGFP)1Low/J, The Jackson Laboratory)로부터 뇌 절편 (250 μm)을 제조하였다. 절편을 실온에서, 118 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 1.5 mM CaCl2, 5 mM Hepes, 2.5 mM D-포도당 (수크로스로 310 mOsM로 조정된 삼투압, pH 7.4)를 함유하는 산소화된 세포 외 배지에서 회복기 동안 적어도 60분간 배양하였다. 기록 챔버에서 1회, 절편을 동일한 세포 외 배지로 2 내지 3 mL/분에서 관류하였다. 절편을 형광 장비 (fluorescein filter)를 구비한 Nikon 현미경 EF600 (Nikon France, Champigny sur Marne) 및 IR-DIC 비디오 현미경으로 관찰하였다. 생존 가능한 ARC POMC 뉴런을 형광 비디오 카메라 (Nikon)가 장착된 X40 워터 액침 대물렌즈 (water immersion objective, Nikon)를 사용하여 가시화하였다. 보로실리케이트 피펫 (4 내지 6 MΩ; 1.5 mm OD, Sutter Instruments, Novato, CA)을 여과된 세포 외 배지로 채웠다. 세포-부착 기록은 Multidlamp 700B 증폭기를 사용하여 만들고, Digidata 1440A 인터페이스를 사용하여 디지털화하고, pClamp 10.3 소프트웨어 (Axon Instruments, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 3 kHz에서 획득하였다. 피펫과 세포 용량은 완전히 보상되었다. 안정적인 기준선을 확립한 후, 1 nM의 ClpB (Delphi Genetics)를 5 내지 10분간 관류하였다. POMC 뉴런의 발화 속도 (firing rate)를 관류 7 내지 10분 후에 ClpB 관류의 마지막 3분에 걸쳐서 측정하였고, 관류 3분 전에 측정된 발화 속도와 비교하였다.
통계학적 분석
데이터를 분석하였고 GraphPad Prism 5.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 그래프를 플롯팅하였다. 정상성 (normality)을 콜모고르프 스머노프 (Kolmogorov-Smirnov) 검증으로 평가하였다. 그룹 차이를 정상성 결과에 따라 터키 또는 Dunn 사후 검증과 함께 분산 분석 (ANOVA) 또는 비-파라미터 크러스칼 왈리스 (Kruskal-Wallis, K-W) 검증에 의해 분석하였다. 적절한 경우, 개별 그룹은 정상성 결과에 따라 스튜던트 t-검증과 피어슨의 상관관계 또는 만-휘트니 (M-W) 검증을 이용하여 비교하였다. 연속 실험의 효과를 반복된 계측 (RM) ANOVA 및 본페로니 사후 검증으로 분석하였다. 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차 (s.e.m.)로서 도시하였고, 모든 시험에 대해, p<0.05는 통계학적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
결과
정기적인 영양 공급 후 E. coli 성장
E. coli 배양액에 Mueller-Hinton (MH) 영양 배지의 1차 공급 후, 세균 생장의 3단계를 관찰하였다: 1) 2시간의 지연 단계; 2) 4시간의 대수기 및 3) 6시간 동안 0.35 광학 밀도 (OD)로 6시간 동안 안정하게 유지되는 정체기. 3차 및 5차 MH 배지 공급 후에는, 단지 두 가지 성장 단계만이 발견되었다: 대수기 및 정체기, 1단계는 영양 공급 직후에 시작되었다. 새로운 영양 공급 주기는 대수기의 지속 기간이 짧은 것을 특징으로 하였다: 3차 공급 2시간 후 및 5차 공급 20분 후, 세균 단백질을 추출하고 막과 세포질 분획으로 분리하여 절식된 래트의 단백질 분석과 생체 내 실험에 사용하였다. 새로운 실험에서 정기적이고 계속적인 영양 공급이 세균 성장의 역학을 가속화시킬 수 있는지 확인하기 위해, E. coli K12에 9회 영양을 공급하였다. 그 결과, 7차와 9차 영양 공급 후에 대수기가 더는 변하지 않았으며, OD에서의 동일한 상대적 증가 (Δ0.3)로 20분간 지속하였고, 이는 각 영양 공급 후 동일한 세균 성장을 반영하였다. McFarland 표준에 따르면 OD값 0.3의 증가는 세균의 108 내지 109 증가에 해당한다. 9차 영양 공급 후, 대수기 및 정체기에서 세균 단백질을 추출하였으며, 총 단백질 농도는 각각 0.088 mg/ml 및 0.15 mg/ml이었다. 추출된 단백질을 ClpB 수준에 대해 실험하였으며, ATP 생산 분석 및 자유 식이 마우스 및 래트에서 결장 내 주입 및 전신 주사를 비롯한 생체 내 실험에 사용되었으며, 이어서 뇌에서 cfos 검출을 수행하였다.
프로테옴 ( Proteomic ) 분석
단백질 발현 양상이 영양-유도성 세균 성장 단계에 따라 달라지는지 여부를 분석하기 위해, MH 배지의 5차 첨가로부터 10분 및 2.3시간 후, 각각 대수기 및 정체기에 상응하는, E. coli K12 단백질의 막 및 세포질 분획물을 각각 추출하여 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (2D-PAGE)을 수행하였다. 검출된 단백질 스팟의 총 수는 2895개 (막 1367개 및 세포질 1528개)였다.
대수기 및 정체기 사이의 막 단백질의 2D-PAGE의 비교는 20개의 차등적으로 (적어도 1.5배) 발현된 단백질을 나타내었다. 이들 중에서, 17개 단백질은 대수기에 증가된 발현을 보였고 15개를 질량 분석법으로 동정하였다. 세포질 단백질의 2D-PAGE의 비교는 20개의 차등적으로 (적어도 1.5배) 발현된 단백질을 나타내었다. 막 단백질과 달리, 세포질 단백질의 대다수 (19개)는 정체기 동안 증가된 발현을 나타내었다. 플라젤린 (flagellin)에 상응하는 단 하나의 단백질 스팟만이 대수기에서 더 높은 발현을 보였다. 확인된 단백질의 대부분은 두 성장 단계 모두에서 전반적인 혼합 대사적 특성을 보여주는 동화 또는 이화 과정에 연관되어 있었다.
시험관 내에서 E. coli 단백질에 의한 APT 생산
성장 단계에서 세균 프로테옴 변화가 에너지 추출 능력에 영향을 미칠 수 있는지를 여부를 연구하기 위해, 시험관 내에서 대수기 및 정체기의 E. coli K12 단백질에 의한 영양분으로부터 ATP 생산을 시험하였다. 그 결과, 두 성장 단계의 단백질이 서로 다른 에너지원으로부터 ATP 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. ATP 농도는 수크로스 용액에 비해, MH 배지와 같은, 단백질-함유 혼합 에너지원이 사용되었을 때 더 높았다. ATP 생산은 세균 단백질의 농도에 따라 용량 의존적으로 증가하였으나, 대수기 또는 정체기로부터 단백질의 ATP 생산 효과 사이에 유의미한 차이는 발견되지 않았다.
시험관 내 E. coli 에 의한 ClpB 생산
본 연구에서 사용된 E. coli ClpB의 검출을 위해 효소-결합 면역흡착 측정법 (ELISA)을 개발 및 검증하였다. ClpB 단백질 생산이 세균 성장 단계 간에 다른지 여부를 구분된 4종의 E. coli K12 배양물에서 연구하였다. 웨스턴 블랏에서 정체기 동안 모든 단백질 제조물에서 ClpB에 상응하는 96 kDa 밴드를 증가된 수준으로 검출하였다. 이러한 변화는 동일한 세균 단백질 제조물에서 ClpB ELISA를 사용하여 더욱 확인되었으며, ClpB 농도가 정체기에서 거의 두 배가 되었음을 보여준다.
영양소 및 E. coli 단백질의 장 주입
시험관 내에서 영양-유도 E. coli 성장 모델이 생체 내에서 세균 성장 역학과 관련이 있는지 여부를 확인하기 위해, 마취된 래트의 결장에 MH 배지 또는 물을 주입하였다. 그 결과, 장에서 물이 아닌 MH 배지의 주입이 20분간 지속되는 대수적 성장 단계를 갖는 세균 증식을 유도함을 발견하였으며, 이는 시험관 내 데이터와 일치한다. 문맥에서 측정된 혈장 ClpB 수준은 MH주입 후 30분 또는 60분에서 유의미한 차이가 없었다. 그럼에도 불구하고, 혈장 ClpB 농도는 대변에서의 ClpB DNA 함량과 양의 상관관계를 보였다.
이어서, E. coli 프로테옴의 성장-의존적 변화가 국지적으로 장에서 식욕 조절의 숙주 메커니즘에 영향을 줄 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 별도의 실험에서, 마취된 래트에게 대수기 또는 정체기로부터의 E. coli 단백질을 0.1 mg/kg로 20분간 결장에 주입하였다. 주입 20분 후에 측정된 결장 점막에서의 ClpB 농도는 정체기 단백질을 투여한 래트에서 더 높았지만, 혈장 ClpB 수준은 대수기 또는 정체기로부터의 세균 단백질에 의해 영향을 받지 않았다. E . coli 단백질이 숙주 식욕 신호전달에 미치는 영향은 세균 성장 단계에 의존한다는 가정과 일관되게, 정체기가 아닌 대수기로부터 E. coli 단백질의 결장 주입은 GLP-1의 혈장 수준을 자극하며, 대조적으로, PYY의 증가된 혈장 수준은 대수기가 아닌 정체기로부터 단백질의 주입 후에 검출되었다.
래트에 급성 E. coli 단백질 투여 후 식품 섭취 및 뇌 c- fos
시험된 모든 래트와 마우스에서 ClpB가 혈장에 존재했기 때문에, 혈장의 E. coli 단백질이 전신 작용을 통해 식욕에 영향을 미칠 수 있으며 이러한 효과가 세균 성장 단계와 관련된 단백질에 따라 다를 수 있을 가능성이 있다. 밤새도록 금식시킨 래트에서 이 가능성을 시험함으로써, 정체기에서 추출된 E. coli 단백질의 막 분획의 단일 복강 내 투여 (0.1 mg/체중 kg, 복강 내)가 대조군과 비교할 때 재-급식 동안 식품 섭취를 1시간 및 2시간 감소시키는 것을 확인하였다. 대조적으로, 대수기에서 추출된 E. coli 단백질의 세포질 분획의 투여 (0.1 mg/체중 kg, 복강 내)는 재-급식 동안 식품 섭취를 4시간 증가시켰다.
E. coli 총 단백질이 성장 단계-의존적 방식으로 자발적인 식품 섭취에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위하여, 그리고 ARC와 같은 중심 부위를 활성화시키기 위하여, 자유 급식 래트에 암기 (dark phase) 시작 전에 세균 단백질을 투여 (0.1 mg/체중 kg, 복강 내)하였다. 식품 섭취를 투여하고 2시간 후에 측정하였고, 뇌에서 c-fos 발현을 분석하기 위해 래트를 희생시켰다. 본 발명자들은 정체기로부터 세균 단백질을 주입한 래트는 대조군보다 적게 먹는 반면, 식품 섭취는 대수기로부터 세균 단백질을 주입함으로써 유의미하게 영향을 받지 않음을 발견하였다.
자유 급식 래트에게의 E. coli 단백질의 복강 내 주입 2시간 후에, c-fos 발현을 시상하부 궁상핵 (ARC)과 복내 측핵 (VMN) 및 CeA에서 면역조직화학적으로 분석하였다. c-fos-양성세포의 증가된 수가 정체기로부터 세균 단백질을 투여 받은 마우스의 ARC 및 VMN에서 발견되었다. ARC에서 c-fos를 발현하는 세포의 대다수는 β-엔돌핀을 함유한 (대조군 71.31±12.81%, 대수기 E. coli 73.56±10.45%, 정체기 E. coli 80.50±9.68%, ANOVA p=0.36), 식욕억제 (anorexigenic) POMC 뉴런으로 확인되었다. 따라서, ARC에 잔존하는 c-fos 뉴런의 비율은 그룹 간 유의미한 차이를 나타내지 않았다 (대조군 28.69±12.81%, 대수기 E. coli 26.44±10.45%, 정체기 E. coli 19.5±9.68%, ANOVA p=0.36). 비록 β-엔돌핀-양성 세포의 총 수는 그룹 간 유의미한 차이를 나타내지 않았으나 (대조군 54.82±10.67 세포, 대수기 E. coli 66.03±11.43 세포, 정체기 E. coli 66.03±5.06 세포, ANOVA p=0.09), 활성화된 β-엔돌핀 뉴런의 상대적 수는, 대조군 및 대수기의 단백질을 투여 받은 래트에 비해, 정체기의 단백질을 투여 받은 래트에서 증가하였다. 또한, 활성화된 β-엔돌핀 뉴런의 수는 식품 섭취와 역의 상관관계가 있었다 (피어슨 r=-0.57, p=0.018).
CeA에서, c-fos-양성 세포의 수는, 두 개의 다른 그룹에 비해, 정체기의 단백질을 주입한 래트에서 증가하였다. CeA에서 거의 모든 c-fos-양성 세포는 CGRP-발현 뉴런으로 표현형화되었다 (대조군 100±0.01%, 대수기 E. coli 100±0.01%, 정체기 E. coli 100±0.01% ANOVA p=0.92). 비록 CeA에서 CGRP-양성 뉴런의 총 수는 그룹 간 유사하지만 (대조군 123.8±13.15 세포, 대수기 E. coli 118.3±25.59 세포, 정체기 E. coli 126.1±6.64 세포, ANOVA p=0.85), c-fos 활성화된 CGRP 뉴런의 백분율은 정체기 단백질을 투여한 래트에서만 증가하였다. CGRP 뉴런의 활성화는 식품 섭취량과 역의 상관관계가 있었다 (피어슨 r=-0.89, p=0.001).
마우스에서 만성 E. coli 단백질 주입 후 급식 양상 및 시상하부 신경펩티드
세균 단백질이 급식 양상에 영향을 미칠지를 결정하기 위해, E. coli 총 단백질을 자유 급이하는 마우스에게 1일 2회 투여 (0.1 mg/체중 kg, 복강 내)하였다. 투여 후 1일째에는 정체기의 세균 단백질을 주입한 마우스에서 체중과 식품 섭취량이 유의하게 낮아진 것을 특징으로 하였으나, 대조군과 비교하여 대수기에서는 그렇지 않았다. 비록 하루 식사량은 그룹 간에 유의미한 차이가 없었지만, 1주일 후에 정체기의 단백질을 투여 받은 마우스에서 투여 전날과 비교하여 감소가 관찰되었다. 식사 빈도는 정체기의 세균 단백질을 투여 받는 마우스에서 증가 경향이 관찰되었지만, 그룹 간에 유의미한 차이는 없었다. 비록 3개 그룹 간의 총 식품 섭취량은 주입 6일 동안 유의미한 차이는 보이지 않았지만, 명기와 암기로 분리하여 분석한 결과, 대수기의 단백질을 투여 받은 마우스는 명기 동안 식품 섭취량이 증가했지만 암기 동안은 감소하였다. 대조적으로, 정체기의 단백질을 투여 받은 마우스는 명기에 아무런 영향을 받지 않으면서 암기에 대조군에 비해 식품 섭취량이 적었다. 주입 후 1일 동안, 정체기의 단백질을 투여 받는 마우스에서 포만율이 증가하였고, 동일한 그룹은 1주 후에 감소 경향을 보였다.
6일간의 세균 단백질 주입 후에 관찰된 변화된 식이 양상의 분자적 변화에 대한 통찰을 얻기 위해, 식욕 조절에 관여하는 여러 신경펩티드의 시상하부 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 정체기로부터 단백질을 투여 받은 마우스는 대조군과 비교하여 뇌-유래 신경영양인자 (BDNF)와 오렉신 (orexin)의 전구체 mRNA 수준이 상승하였고, 대수기로부터 단백질을 투여 받은 마우스와 비교하여 코르티코트로핀-방출 호르몬 (CRH)의 전구체 mRNA 수준이 상승한 것으로 나타났으며, BDNF의 수치는 증가했지만 QRFP는 감소하였다.
ClpB에 의한 시상하부 POMC 뉴런의 전기생리학적 활성화
정체기 생장에서 상향-조절된 E. coli 단백질의 마커인 ClpB와 α-MSH의 모방물이 ARC POMC 뉴런을 활성화시키는지 여부를 결정하기 위해, ClpB 효과를 POMC-eGFP 마우스의 뇌 조각에서 세포-부착 패치-클램프 전기생리학을 이용하여 실험하였다. ClpB (1 nM)의 바스 (bath) 적용은, 도 2에 나타난 바와 같이, ARC POMC 뉴런 (n=7/13)의 ~50%의 활동 전위 빈도를 229±109% 증가시켰다 (기저: 2.02±0.78Hz vs. ClpB: 3.82±1.36Hz). 일반적으로 POMC 뉴런은 ClpB 적용 후 적어도 10분이 경과할 때까지 기저 발화 속도로 완전히 회복되지 않았다.
따라서 이들 결과는 포만과 포만감에 대한 ClpB 단백질의 직접적인 효과를 시사한다.
논의
본 연구는 세균 단백질이 장내 세균을 숙주의 식욕 조절에 생리학적으로 연관시킬 수 있는 것을 비롯해 장내 영양-유도 세균의 증식 및 전신 효과와 관련된 단기 및 장기 메커니즘을 각각 보여준다. 다음의 주요 결과는 이 결론을 뒷받침한다: 1) 영양소의 규칙적인 공급은 생체 내 자료와 일치하여, 20분간 지속되는 E. coli의 대수적 생장을 촉진 및 안정화시킨다; 2) E. coli 정체기는 증가된 총 세균 단백질 함량과 증가된 ClpB를 포함하는 다른 프로테옴 프로필을 특징으로 한다; 3) 두 성장 단계의 E. coli 단백질은 시험관 내에서 ATP 생산을 용량-의존적으로 자극하였다; 4) ClpB의 혈장 수준은 장내에서 영양-유도 세균의 증식 후에는 변하지 않았으나, 장내 미소생물에서 ClpB DNA와 상관관계가 있었다; 5) 대수기 및 정체기로부터 E. coli 단백질의 장내 주입은 각각 혈장 GLP-1과 PYY를 자극하였다; 6) E. coli 단백질의 전신 주입은 식욕억제의 ARC 및 CeA 뉴런에서 c-fos 활성화를 동반한 정체기의 단백질에 의해서만 식품 섭취를 현저하게 감소시켰고, 마지막으로 7) ClpB는 ARC POMC 뉴런의 발화 속도를 자극하였다.
영양소 및 세균 성장의 정기적인 공급
인간의 위장관을 콜로니화하는 다양한 종류의 세균 중 E. coli는 가장 풍부한 조건 혐기성 균주이며, 공생 장내 세균의 모델 유기체로 정의된다 (Foucault et al., 2009). 본 명세서에서, E. coli가 규칙적인 영양 공급 동안, 성장의 역동성을 변화시키는 것을 확인하였고, 5차 급식 주기 이후에 즉각적인 지수적 성장이 20분 동안 지속되고, 이어서 정체기가 이어진다는 것을 확인하였다. 성장 주기는 영양소의 다음 공급 이후 동일하게 재현되며, 세균 메커니즘에 내재된 주도자 (pacemaker)의 역할을 할 수 있음을 시사한다. 래트 결장에서 영양 주입에 대한 반응으로 세균 성장의 유사한 동력이 관찰되었고, 이는 시험관 내 자료가 생체 내 상황, 예컨대 규칙적인 식사를 하는 인간의 상황과 관련될 수 있음을 뒷받침한다. 세균 수의 108 내지 109 증가는 각각의 새로운 공급 후에도 안정적이었으며, 장내 단백질 함량 증가를 포함하여, 세균 바이오매스의 안정적인 생산이 숙주에 대한 식사-유도 조절 인자의 역할을 할 수 있음을 시사한다. 인간의 평균 식사 단계가 규칙적으로 먹이는 세균의 대수기 기간과 비슷하다고 가정하면, 영양소와 장내에서 접촉하고 20분 후에 정체기에 도달하는 장내 세균에 의해 숙주 포만이 유발될 수 있다고 추측한다. 그러나 위장관의 세균 함유량은 위장에서 103 내지 결장에서 1012까지의 범위이다. 또한, 섭취한 영양물이 위장과 소장을 지나려면 약 2시간이 필요하고, 대장을 지나가려면 약 10시간이 필요하다. 대부분의 장내 세균에 이런 영양분 전달 지연으로 인해, 영양소와 직접 접촉하는 것 이외에도, 식사 단계에서 세균 성장은 파블로브식 두부 반사 (Pavlovian cephalic reflex)에 의해 소화관 내로 방출되는 영양분에 의해 시작될 수 있다.
성장 단계 및 장 감지 동안에 세균 단백질 발현
규칙적으로-급식된 E. coli의 성장 동력은 숙주의 식사 및 식사 후 단계와 연관될 수 있기 때문에, 세균 단백질의 발현이 잠재적으로 장내 세균과 숙주의 식욕 조절을 연결시킬 수 있는지를 연구하였다. 첫째, E. coli의 프로테옴을 대수기 대 정체기에서 비교하였다. 이 분석을 위해, E. coli 단백질을 대수기 중간, 즉 영양 공급 10분 후에서, 그리고 일반적으로 포만감을 특징으로 하는 시점인, 2시간 후 정체기에서 추출하였다. 두 가지 성장 단계 사이에서 적어도 40개의 차등적으로 발현된 단백질의 발견은, 단백질 함량에 의해, 세균 증식 후 거의 두 배, 정량적으로뿐만 아니라 정성적으로도 다른 것으로 확인되었다. 숙주의 식욕 조절에 대한 변형된 단백질 발현 프로파일의 가능한 관련성이: i) 세균 단백질이 에너지 기질을 생성하는 능력을 비교하고, ii) 식욕-조절 경로에 대한 세균 단백질의 가능한 직접 효과를 측정함으로써 연구되었다. 최근 가능성은 α-MSH의 입체 단백질 모방물인 E. coli ClpB의 최근 프로테옴 동정에 의해 뒷받침되고 (Tennoune et al., 2014); 장내 세균 단백질이, 식욕억제 또는 식욕유발 (orexigenic) 펩티드에 상응하는 항원 결정기를 보여줌으로써, 교차-반응성 자가항체의 생산을 유발할 수 있다는 이전의 가설을 입증한 데이터이다 (Fetissov et al., 2008). 따라서, 세균 성장 단계와 관련된 단백질 발현 프로파일에 따라, 이러한 세균 모방 단백질의 조합이 식욕에 직접 영향을 미칠 수 있다고 생각된다. E . coli 배양물과 장 점막을 분석함으로써 정체기와 관련된 증가된 ClpB 수준을 발견하였다. ClpB의 증가는, 영양-유도 E. coli 증식 및 세균 단백질 생산 증가에 따른 식욕 억제 경로의 활성화에 기여할 수 있다. 중요한 질문은 ClpB와 같은 세균 단백질이 식욕 조절 경로에 작용할 수 있는 장소이다.
세균 단백질이 장 점막에 존재하더라도 (Haange et al., 2012), 장 장벽을 가로지르는 통로는 광범위하게 연구되지 않았다 (Lim and Rowley, 1985). 이론상으로는, 장 내에서 자발적 및 유도된 세균 용해 후 (Rice and Bayles, 2008) 세균 성분은 장 신경계에 의해 조절되는 장세포에서의 흡수 및 간세포 확산에 의해 점막 상피 장벽을 통과할 수 있다 (Neunlist et al. 2012). 예를 들어, 그람 음성 세균의 용해 시 방출되는 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS)는 건강한 사람과 래트의 혈장에 고지방 식이를 섭취한 후 더 높은 기저 수준으로 자연스럽게 존재한다 (Cani et al., 2007). LPS 혈장 수준은 또한 식사 후에 증가하지만 (Harte et al., 2012), 세균 단백질에 대한 그러한 자료는 없다. 본 발명에서는 혈장 ClpB 수치가 래트에서 장 내에서 세균 증식 후에 또는 세균 단백질의 장내 주입 후 안정적으로 유지된다는 것을 보여준다. 혈장의 ClpB 및 혈장에 존재하는 다른 세균 단백질은 영양-유도된 세균 증식에 의해 급격하게 영향을 받지 않으므로, 뇌로의 단기 포만 신호 전달에 관여할 수 없음을 나타낸다.
그럼에도 불구하고, 혈청 ClpB 농도는 장내 미생물에서 ClpB DNA와 상관관계가 있어, 영양-유도 세균 성장과 관련된 변동과는 장기간에서 상대적으로 독립적이어야 하는, ClpB 생성 세균의 수가 혈청 ClpB 수준의 장기간 유지를 위한 주요 원인이 될 수 있음을 시사한다. 이 결론은 ClpB ELISA의 유효성 확인을 위해 얻어진 데이터에 의해 뒷받침되며, ClpB-돌연변이 E. coli를 투여한 마우스에서가 아닌 만성적으로 E. coli를 투여한 마우스에서 증가된 혈장 ClpB 농도를 나타내는, ClpB ELISA의 검증을 위해 수득된, 본 발명의 데이터에 의해 더욱 뒷받침된다. 따라서, ClpB를 포함하여, 혈장에 존재하는 장내 세균 단백질이 장내 미생물총의 구성을 에너지 대사의 장기간 조절과 체계적으로 연결시키는 작용을 할 수 있다.
시험관 내에서 ATP 생산에 대한 E. coli 단백질의 효과
먹이 사슬을 통한 에너지 교환은 모든 유기체 간의 보편적인 연결 고리를 나타낸다 (Yun et al., 2006). 세균과 동물 둘 다에서 영양분 이화작용에서 비롯되는 ATP는 동화 과정의 주요 에너지 기질 역할을 한다. 동물은 아데노신-5'-모노포스페이트-활성화 단백질 키나아제 (AMPK)의 활성을 통해 ATP의 변화를 감지할 수 있어, ATP 수준이 낮거나 그 반대의 경우도 식품 섭취가 증가한다 (Dzamko and Steinberg, 2009). 따라서, 본 발명에서는 시험관 내에서 ATP를 생성하기 위해 대수기 및 정체기에서 E. coli 단백질의 능력을 비교하였다. 실제로, 확인된 많은 단백질은 동화 또는 이화 특성을 보였다. 본 발명자들은 E. coli 단백질이 시험관 내에서 ATP 생산을 자극할 수 있다는 것을 확인하였고, 이는 장내 세균 용해 후 ATP 생산을 계속 촉매할 수 있음을 시사한다. 비록 대수기 및 정체기로부터의 단백질간에 ATP를 생성하는 능력에 차이는 없지만, 세균 단백질의 농도-의존적 ATP 생성은 영양-유도 세균 증식 후, 증가된 세균 단백질 함량이 보다 높은 ATP 합성을 야기함을 나타낸다. 장내 미생물의 효능이 숙주 신진 대사를 위한 에너지를 얻는 것의 관련성은 비만 및 마른 사람과 래트를 비교함으로써 명백히 확립되었다 (Turnbaugh et al., 2006). 본 발명의 데이터는 E. coli 단백질이 ATP를 생성하는 능력을 보여줌으로써 이러한 결과를 뒷받침한다. 또한, 식사-유도된 세균의 증식이 장내 ATP의 증가로 이어질 수 있으며, 이는 에너지 이용 가능성 및 장의 이완에 대한 관내 (luminal) 감지에 기여해야 한다고 제안하였다 (Glasgow et al., 1998).
포만감 호르몬에 대한 E. coli 단백질의 장내 효과
이어서, 본 발명자들은 E. coli 단백질이 장내에서 GLP-1과 PYY와 같은 장 포만감 호르몬의 전신 방출을 자극할 수 있는지 연구하였다 (Adrian et al., 1985; Batterham et al., 2002; Beglinger and Degen, 2006; Flint et al., 1998). 실제로, 두 호르몬은 장내에 존재하고 결장에 풍부하며, 동일하거나 또는 별개의 장관내분비 (enteroendocrine) L-세포에 의해 생성되며 (Eissele et al., 1992), 따라서 L-세포는 세균 단백질에 직접 노출된다. 본 발명자들은 GLP-1 및 PYY 방출에 E. coli 단백질의 차등적인 효과를 발견했으며, 대수기의 단백질에 의한 PYY의 자극 및 정체기의 단백질에 의한 GLP-1의 자극을 보여주었다. 이러한 결과는 영양-유도 세균 성장과 GLP-1 및 PYY의 식사-유도 방출의 알려진 역동성 사이의 유사점을 지적한다. 실제로, 인간에서 나타난 바와 같이, 혈장 GLP-1의 급성 피크는 액체 식사의 위내 주입 15분 후에 나타나고, 오래 지속되는 상승된 혈장 PYY는 식사 후 15분에서 30분 사이에 시작된다 (Edwards et al., 1999; Gerspach et al., 2011). GLP-1의 더 긴 방출은 지방 섭취량과 관련이 있다 (van der Klaauw et al., 2013). 따라서 정기적으로-급식된 장내 세균의 성장 동력은 일시적으로 GLP-1 및 PYY 분비의 역학에 부합하며, 이는 식사-유도된 장 포만의 신호전달에서, 장내 세균, 특히 E. coli 단백질의 유도적 역할을 암시한다. GLP-1을 자극하는 대수기로부터 E. coli 단백질의 구별된 효과는, 혈당 조절에서 GLP-1의 인크레틴 (incretin)으로서의 역할을 반영할 수 있다 (Edwards et al., 1999; Steinert et al., 2014). L-세포에 의해 발현된 기능적 MC4R의 최근 시연은 (Panaro et al., 2014), α-MSH-모방물 세균 단백질에 의한 가능한 활성화에 대한 배경을 제공한다. E. coli 정체기 동안 ClpB의 증가된 생산뿐만 아니라, 증가된 혈장 PYY 수준과 관련된, 장 점막의 ClpB 수준의 상승은, 결장에서 PYY-생성 L-세포의 활성화에서 ClpB의 직접적인 역할을 제안한다. 다른 한편으로, 대수기 동안 상향-조절된 미지의 E. coli 단백질은, 아마도 우선적으로 GLP-1 분비를 자극할 것이다.
식품 섭취 및 식욕-조절 뇌 경로에 대한 E. coli 단백질의 전신 효과
본 발명자들은 기아 또는 자유 급식 래트 및 자유 급식 마우스에 대한 E. coli 단백질의 말초 주입이 E. coli의 성장 단계에 따라 식품 섭취를 변화시켰음을 보여주었다. 혈장 ClpB가 영양소의 장내 주입에 영향을 받지 않지만 단시간에 안정적이라는 것을 고려하면, 세균 단백질의 전신 작용은 식욕에 대한 장기간의 조절 효과와 관련이 있다고 해석되어야 한다. 또한, 대수기의 지속 시간이 짧기 때문에 오래 지속되는 정체기 상향-조절된 세균 단백질이 혈장에서 지배적이어야 하고, 따라서 이들의 전신 투여는 생리적 상황을 보다 잘 나타낼 수 있다. 이들 실험에 사용된 E. coli 단백질의 0.1 mg/kg 농도는 인간 또는 설치류에서 말초 투여 후, 렙틴 또는 PYY와 같은 펩티드 호르몬의 효과적인 포만생성 용량과 유사하였다 (Batterham et al., 2002; Halaas et al. 1995, Heymsfield et al., 1999).
기아 래트에서 대수기로부터의 세포질 단백질을 투여하고, 정체기로부터의 막 단백질에 의한 감소 후, 명기에서 재-급식 동안 식품 섭취의 증가가 관찰되었다. 이 실험은 동일한 세균으로부터 서로 다른 단백질 혼합물이 전신 작용에 의해 식품 섭취를 증가 또는 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나 더 생리적인 환경에서는, 암기에서 자유 급식 래트에 E. coli 총 단백질의 영향을 시험함에 의해서, 정체기로부터 단백질에 의해 유도된 식품 섭취의 감소만이 관찰되었다.
자유 급식 마우스에 반복된 주입의 결과는 부정적인 에너지 균형을 촉진시키는 E. coli 단백질의 역할을 지지한다. 실제로, 세균 단백질 주입 첫날에는 식품 섭취와 체중이 감소하였고, 이는 정체기의 단백질을 주입하고 증가된 포만율을 특징으로 하는 마우스에서 유의미하게 나타났다. 이들 마우스에서의 식품 섭취는 그 후에 정상화되었지만, 식사량의 점진적 감소가 식사 빈도 증가와 함께 나타났으며, 이는 식품 섭취를 유지하기 위한 보완적 메커니즘일 가능성이 높다 (Meguid et al., 1998). 또한, E. coli 단백질의 구별된 효과가 명기 및 암기 동안 관찰되었다. 따라서, 시상하부에서 식욕-조절 신경펩티드의 mRNA 발현 양상은 식욕억제 및 식욕유발 경로 둘 다의 활성화에 대한 혼합 반응을 나타내었다. 주목할 점은, E. coli 단백질을 투여 받은 두 그룹 모두 VMN에서 MC4R 하류의 식욕억제 경로인 BDNF mRNA의 증가를 보였다는 것이다 (Xu et al., 2003). 이 경로는 두 그룹 모두에서 관찰된 암기 동안 식품 섭취를 줄이는데 기저가 될 수 있으며, 식욕유발 QRFP (Chartrel et al., 2003) 및 NPY (Herzog, 2003)의 낮은 수준을 나타내는 대수기 단백질을 주입한 마우스에서 더 두드러지게 나타났다. 반대로, 정체기로부터 세균 단백질을 투여 받은 마우스는, CRH mRNA의 증가된 수치가 식욕 억제를 일으키며, MC4R-발현 PVN 뉴런과 관련이 있을 수 있다 (Lu et al., 2003). 이러한 변화는 식사 빈도를 자극하는 오렉신 (orexin) A의 mRNA 전구체의 증가된 발현과 결합되어 (Baird et al., 2009), 이들 마우스에 6일간의 주입 후, 각각 식사량 및 포만율의 감소에 기여할 수 있다.
정체기에 생성된 세균 단백질이 몇 가지 핵심적인 식욕억제 경로를 활성화시킬 수 있다는 가설과 일관되게, 본 발명자들은 자유 급식 래트에서 VMN 뿐만 아니라 오래 전부터 포만 중추로 알려지고 포만 중추로서 ARC POMC 뉴런과 상호 연결되는, 식욕억제 ARC POMC 뉴런에서도 c-fos 발현이 증가된다는 것을 확인하였다 (Sternson et al., 2005). 획득된 c-fos 양상은 식품 섭취 동안 포만생성 (satietogenic) 반응 (Johnstone et al., 2006) 또는 PYY나 췌장 폴리펩티드 같은 포만 호르몬에 의해 유도된 것 (Batterham et al., 2002; Challis et al., 2004; et al., 2009)과 유사하다. c-fos-활성화된 POMC 뉴런의 상대적으로 적은 수 (~10%)는 순환하는 E. coli 단백질이 시상하부 경로를 통해 작용하는 식욕 및 체중 조절 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 비록 NPY/AgRP 뉴런에 의한 c-fos 활성화를 결정하는 것이 불가하지만, 세균 단백질에 의한 신호 전달에 미치는 영향을 배제할 수는 없다; 이 뉴런들은 또한 MC3R 및 MC4R을 발현한다 (Mounien et al., 2005). 또한, CeA CGRP 뉴런 (~40%)에서 c-fos의 ARC POMC 활성화보다 강하면 ARC POMC와 NPY/AgRP 뉴런 및 가능한 다른 식욕-조절 뇌 영역으로부터 수렴하는 하류 작용을 나타낼 수 있으며, 이는 고립로 (solitary tract)의 핵 같은 것으로, 본원에서는 분석하지 않았다.
마지막으로, ARC POMC 뉴런과 같은 식욕-조절 뇌 부위의 활성화가 세균 단백질의 국소 작용에 의해 유발되는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 이들 뉴런에 ClpB의 적용이 전기적 활동을 활성화시킬 수 있는지 여부를 연구하였다. 본 발명의 결과는 연구된 뉴런의 약 절반이 활동 전위 빈도를 증가시켰으며, 적어도 10분간 활성화된 상태로 남아있음을 보여주었다. ClpB의 지속적인 효과는 기능적 MC3R 및 MC4R을 발현하는 POMC 뉴런에 대한 α-SH의 효과와 일치하며 (Smith et al., 2007), ClpB는 식욕유발의 PYY 및 렙틴과 유사한 시상하부의 POMC 뉴런의 생리적 활성자일 수 있음을 시사한다 (Batterham et al., 2002; Cowley et al., 2001). 그러나, ClpB가 POMC 뉴런을 직접 또는 국소적 네트워크를 통해 활성화시킬 수 있는지 여부는 알 수 없다.
종합하면, 이들 데이터는 뇌의 식욕억제 경로의 활성화를 통해 부정적인 에너지 균형을 촉진함에 있어서, ClpB와 같이 정체기에서 발현이 증가하는, 전신적으로 존재하는 E. coli 단백질의 역할을 지지한다. 또한, E. coli 및 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 과에 속하는 다른 세균의 풍부도가 낮거나 높아 유발된 미생물 조성 변화로 인하여 숙주 에너지 균형에 각각 긍정적 또는 부정적 방법으로 영향을 미칠 수 있다고 제안한다.
실시예 2
본 실시예는 식품 섭취에 대한 ClpB-발현 세균의 효과를 증명한다.
1개월령 수컷 마우스 C57B16 (Janvier Laboratories)를 동물 시설에 1주 동안 순화시키고, 전술한 바와 같이 유지시켰다. 마우스를 다음과 같이 세 군으로 나누었다: (i) 108개의 E. coli K12를 위관영양 투여; (ⅱ) ClpB가 결핍된 108개의 E. coli K12를 위관영양 투여; 및 (iii) 아무 처리도 받지 않은 대조군. ClpB 돌연변이 균주는 Bernd Bukau's Laboratory (ZMBH, Heidelberg University, Heidelberg, Germany)에서 생성되었으며 Axel Mogk 박사에 의해 상응하는 야생형 (WT) E. coli 세균과 함께 제공되었다. 마우스를 BioDAQ 케이지 (Research Diets)에 개별적으로 넣고, 세균 함유 LB 배지 0.5 ml를 21일간 매일 암기 전에 위내에 위관영양 투여하였다. 위관영양의 첫 번째 날에는 ClpB 단백질을 발현하지 않는 세균과 달리 WT E. coli를 투여한 마우스의 체중과 식품 섭취가 감소하였다 (도 1).
실시예 3
본 실시예는 비만 ObOb 마우스에 대한 ClpB-발현 세균의 효과를 증명한다.
유전적으로 비만인 ObOb 마우스를 1주 동안 동물 시설에 순화시키고, 전술한 바와 같이 유지시켰다. 마우스에 둘 다 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 (i) 108 E. coli K12 세균 (ClpB 발현); (ii) ClpB가 결손된 108 E. coli K12 세균, 또는 대조군으로서 MH 배지 단독을 위내로 위관영양 투여하였다. ClpB 돌연변이 균주는 Bernd Bukau's Laboratory (ZMBH, Heidelberg University, Heidelberg, Germany)에서 생성되었으며 Axel Mogk 박사에 의해 상응하는 야생형 (WT) E. coli 세균과 함께 제공되었다. 마우스를 BioDAQ 케이지 (Research Diets)에 개별적으로 넣고, 지시된 바와 같이 21일간 매일 위내에 위관영양 투여하였다.
본 발명자들은 E. coli K12 WT 세균으로의 위관영양은 체중 증가의 56% 감소 (도 3 및 4), 지방량/근육량 비율 감소 (도 5 및 6) 및 총 식품 섭취의 20% 감소 (도 7 및 8)를 유도하였음을 확인하였고, 이는 ClpB가 결손된 E. coli K12 세균에서는 관찰되지 않았다.
실시예 4
본 실시예 비만 ObOb 마우스에 대한 ClpB를 발현하는 다른 균주 세균의 효과를 증명한다.
유전적으로 비만인 ObOb 마우스를 1주 동안 동물 시설에 순화시키고, 전술한 바와 같이 유지시켰다. 마우스에 모두 뮬러-힌튼 (MH) 배지 중인 (i) 108 E. coli K12 세균 (ClpB 발현); (ii) 108 E. coli Niessle 1917 세균 (ClpB 발현); (iii) 동결건조된 형태로 108 E. coli Niessle 1917 세균 (ClpB 발현), 또는 (iv) 대조군으로서 MH 배지 단독을 위내로 위관영양 투여하였다. 마우스를 지시된 바와 같이 14일간 위내 위관영양 투여하였다.
본 발명자들은 임의의 균주의 E. coli ClpB-발현 세균으로의 위관영양이 체중 증가의 감소 (도 9 및 10) 및 지방 함량의 감소 (도 11)를 유도하였음을 확인하였다.
실시예 5
본 실시예는 ClpB의 직접적인 포만유발 (satietogenic) 작용을 확인한다.
시상하부 MCR 수용체 패밀리를 통한 급식 행위에 대한 ClpB의 가능한 효과가 ClpB의 뇌실내 (intracerebroventricular, ICV) 주입을 받은 래트에 대한 동물 연구에서 나타났다.
스프라그-다우리 (Sprague-Dawley) 웅성 래트 200-250 g (Janvier, L'Arbresle, France)를 특화된 에어-컨디션드 동물 시설에서 24℃, 12:12-시간 명암 주기 (명기 7-19시간)로 유지하였다. 래트에 표준 펠렛화된 사료 (RM1 식이, SDS, UK)를 공급하였다. 음료수는 항상 마음대로 (ad libitum) 이용 가능하였다.
스테인레스 스틸 캐뉼라 (C311 GA, 외경 0.9 mm, 내경 0.58 mm, Plastics One, Roanoke, VA)의 이식을 위해, 레트를 케타민 (75 mg/kg) / 자일라진 (5 mg/kg) 혼합물 (3:1 vol - 0.1 mL/100 g 체중)의 복강 내 주입에 의해 마취시키고 래트 및 마우스용 New Standard Stereotaxic Instrument (Stoelting Europe, Dublin, Ireland)에 배치시켰다. 캐뉼라를 수술용 현미경 (Carl Zeiss, Jena, Germany) 하에서 -3.3 mm의 절치 막대 (incisor bar) 설정으로 시상하부 방실핵 (paraventricular nucleus) (진정: +2.8 mm, 측면: 중심선으로부터 -0.4 mm, 및 앞면: 뇌척수 경막으로부터 8.2 mm) 내로 이식하였다. 캐뉼라를 고정 나사에 의해 지지되는 치과용 접착제를 사용하여 두개골에 고정시켰다. 깨어난 후, 래트를 개별적으로 1주 동안 대사 케이지 (Techniplast, Lyon, France) 에서 유지시켰고 물이 항상 이용 가능한 상태에서 동일한 표준 설치류 사료 (RM1, SDS)를 마음대로 공급하였다. 우수한 회복을 보장하기 위해 수술 후 기간 동안 매일 신체 상태 및 체중 증가를 모니터링하였다.
그 후에, 래트를 각각에 자동화된 급식 모니터가 장착된 BioDAQ 래트 케이지 (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)에 개별적으로 배치시켰다. BioDAQ 케이지에서 3일간의 순화 후, 주입 전 12시간 동안 래트로부터 사료를 박탈하고 3개 그룹 (n=3)으로 구분하였으며, 이들 각각은 상이한 용량의 ClpB의 단일 주입을 투여 받았다: 2 ml의 멸균 인공 뇌척수액 중에 희석된, 10 ng, 100 ng 및 1 mg. 주입은 암기가 시작되고 식품이 공급되기 15분 전에 수행하였다. 식품 섭취를 암기 동안에 측정하였다.
동물은 식품 섭취의 용량 의존적 감소를 나타내었다 (도 12 참고).
참고 문헌
본원 전체에 걸쳐, 다양한 참조문헌은 본 발명이 속하는 시점에서의 기술 수준을 기술한다. 이들 참고 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다.
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Claims (45)

  1. ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 포만 (satiation)을 유도하는 방법.
  2. ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 포만감 (satiety)을 지속시키는 방법.
  3. ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 식사량 (meal size)을 감소시키는 방법.
  4. ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 식품 섭취를 감소시키는 방법.
  5. ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 체중 증가를 조절하는 방법.
  6. ClpB 단백질의 유효량 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 체중 감소를 촉진하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 인간, 애완동물 또는 가축인 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 남성 또는 여성인 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 비만이 아닌 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 비만인 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 18.5와 30 사이의 체질량 지수 (body max index, BMI)를 갖는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질이 서열번호 1과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질이 서열번호 1과 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균이 약제학적 조성물의 형태로 개체에 투여되는 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균이 식품 조성물의 형태로 개체에 투여되는 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 약제학적 조성물이 정제, 겔 캡슐, 분말, 과립 및 경구 현탁액 또는 용액과 같은 경구-경로 형태, 설하 및 볼 투여 형태, 에어로졸, 임플란트, 직장, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피, 척수내 및 비강내 투여 형태로 구성된 군으로부터 선택된 단위 투여 형태인 것인, 방법.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질을 발현하는 세균이 프로바이오틱 세균 균주인 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 식품 등급 세균으로부터 선택되는 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 자연 발생적인 세균 균주이거나 유전적으로 조작된 세균 균주인 것인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 ClpB 단백질의 발현이 세균 내에서 상항 조절되도록 스트레스 조건에 놓였던 세균인 것인, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회의 영양 공급을 받았던 세균인 것인, 방법.
  22. 제22항에 있어서, 세균이 상기 반복된 영양 공급 후 정체기 (stationary phase)의 단계에서 단리되는 것인, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 ClpB 단백질의 발현이 상향 조절되도록 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는 것인, 방법.
  24. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 ClpB 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 세균인 것인, 방법.
  25. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 이. 콜라이(E. coli) 균주인 것인, 방법.
  26. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 위로부터 보호되기 위해 캡슐화되는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 장용-코팅된, 지속 방출형 (time-released) 캡슐 또는 정제 내로 캡슐화되는 것인, 방법.
  28. 제17항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 식품 조성물의 형태로 투여되는 것인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주를 포함하는 식품 조성물이 완전 식품 조성물, 식품 보조제, 식품의약 (nutraceutical) 조성물 및 기타로부터 선택되는 것인, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 프로바이오틱 세균 균주가 상기 식품 조성물 내에 식품 성분 또는 사료 성분으로 사용되는 것인, 방법.
  31. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 액체, 고체 또는 반-고체 식품 조성물인 것인, 방법.
  32. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 발효 유제품인 것인, 방법.
  33. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 기능성 식품인 것인, 방법.
  34. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 음료인 것인, 방법.
  35. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 식사 대용 제품 (meal replacement product)인 것인, 방법.
  36. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 소정량의 식이섬유를 포함하는 것인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 식이섬유가 대두, 완두콩, 귀리, 펙틴, 구아검, 아라비아 고무(gum Arabic), 프럭토올리고당류, 갈락토-올리고당류, 시알릴-락토스 및 동물 우유로부터 유래한 올리고당류로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 식이섬유가 글루코만난과 같은 만난 중에서 선택되는 것인, 방법.
  39. 제42항에 있어서, 식이섬유가 아모르포팔러스 콘자크 (Amorphophallus konjac)의 글루코만난과 같은 만난 중에서 선택되는 것인, 방법.
  40. 제28항에 있어서, 식품 조성물이 적어도 하나의 프리바이오틱 (prebiotic)을 포함하는 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 프리바이오틱이 올리고당류로 구성된 군으로부터 선택되고 선택적으로 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 대두 및/또는 이눌린; 및/또는 식이섬유를 함유하는 것인, 방법.
  42. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균의 투여가 1일 2 내지 3회 하루 또는 그 이상 동안 반복되는 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 투여가 적어도 4일, 또는 심지어 4 내지 15주, 또는 1 내지 3개월, 1 내지 3년, 또는 연속적인 지속 기간 동안에 수행되는 것인, 방법.
  44. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균이 개체의 한 끼 식사와 동시에 또는 연속적으로 투여되는 것인, 방법.
  45. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ClpB 단백질 또는 ClpB 단백질을 발현하는 세균이 개체의 식사 전에 투여되는 것인, 방법.
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