CN109310736A - 用于诱导饱足感和延长饱腹感的基于蜂房哈夫尼菌的药物组合物和食品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在有需要的对象中诱导饱足感和延长饱腹感的药物组合物和食品组合物。具体来说，本发明涉及一种在有需要的对象中诱导饱足感的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。

Description

用于诱导饱足感和延长饱腹感的基于蜂房哈夫尼菌的药物组 合物和食品组合物

技术领域

本发明涉及用于在有需要的对象中诱导饱足感和延长饱腹感的药物组合物和食品组合物。

背景技术

肠道微生物群的组成已经与宿主代谢表型相关(Ley等,2006)并且“肥胖性”微生物群的转移可以诱发肥胖(Turnbaugh等,2006)和过食症(Vijay-Kumar等,2010)，这表明肠道微生物群可以影响宿主摄食行为。尽管肠道细菌对宿主食欲的影响的潜在机制是未知的，但是很可能它们可以使用控制食物摄入的宿主分子途径。

当前的食物摄入控制模型牵涉到向调节摄食的稳态和快感方面的几个脑回路进行信号转导的肠源性饥饿感和饱腹感激素(Berthoud,2011；Inui,1999；Murphy和Bloom,2006)。这些当中突出的是源自于下丘脑弓状核(ARC)的食欲减退途径和促进食欲途径，所述途径分别包括阿黑皮素原(POMC)神经元和神经肽Y(NPY)/刺鼠相关蛋白(AgRP)神经元，在室旁核(PVN)中中继(Atasoy等,2012；Cowley等,1999；Garfield等,2015；Shi等,2013)。ARC途径和PVN途径在臂旁外侧核中会聚，所述臂旁外侧核向中央杏仁核(CeA)发送食欲减退投射，所述中央杏仁核进而表达降钙素基因相关肽(CGRP)(Carter等,2013；Garfield等,2015)。

肠道微生物群对宿主食欲控制的影响的推定机制可能涉及它的能量收集活动(Turnbaugh等,2006)以及神经活性递质和代谢物的产生(Dinan等,2015；Forsythe和Kunze,2013；Sharon等,2014)。本申请的发明人证实了细菌蛋白质的参与，细菌蛋白质直接在肠道中局部作用于或全身作用于食2欲控制途径。实际上，几种细菌蛋白质已经被证实与调节食欲的肽激素显示出序列同源性(Fetissov等,2008)，并且最近，由肠道共生大肠杆菌(E.coli)产生的ClpB蛋白质被鉴定为α-黑色素细胞刺激激素(α-MSH)的抗原模拟物(Tennoune等,2014)。α-MSH是POMC衍生的神经肽，其通过激活黑皮质素受体4(MC4R)在转导饱足感信号中起关键作用(Cone,2005)。尽管MC4R介导的α-MSH的食欲减退作用已经主要归因于它的中枢作用位点(Mul等,2013)，但是最近的研究证实肠道肠内分泌细胞中的MC4R的激活刺激饱腹感激素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和肽YY(PYY)的释放(Panaro等,2014)。因此，源自于肠道细菌的α-MSH样分子可以直接作用于合成饱腹感激素的肠内分泌细胞。

发明内容

本发明涉及用于在有需要的对象中诱导饱足感和延长饱腹感的药物组合物和食品组合物。具体来说，本发明由权利要求书限定。

本发明涉及在有需要的对象中诱导饱足感的方法，其包括向对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。

本发明还涉及在有需要的对象中延长饱腹感的方法，其包括向对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

本发明还涉及在有需要的对象中减少进餐量的方法，其包括向对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

本发明的另一个目的是提供在有需要的对象中减少食物摄入量的方法，其包括向对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

本发明还涉及在有需要的对象中控制体重增加的方法，其包括向对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

本发明的另一个目的是提供在有需要的对象中刺激体重减轻的方法，其包括向对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

在一个实施方案中，对象是不肥胖的。在另一个实施方案中，对象是肥胖的。

在一个实施方案中，以药物组合物的形式向对象施用蜂房哈夫尼菌。在另一个实施方案中，以食品组合物的形式向对象施用蜂房哈夫尼菌。

在一个实施方案中，食品组合物选自完整食品组合物、食品补充剂和营养保健组合物。

在一个实施方案中，蜂房哈夫尼菌是益生菌。在另一个实施方案中，蜂房哈夫尼菌是灭活的。

在一个实施方案中，食品组合物包含至少一种益生元。在一个实施方案中，至少一种益生元是膳食纤维。

具体实施方式

本申请的发明人已经证实ClpB蛋白质或表达ClpB蛋白质的细菌能够在有需要的对象中诱导饱足感、延长饱腹感、减少食物摄入量、控制体重增加、刺激体重减轻和/或降低脂肪质量/瘦体质量比。本申请的发明人实际上已经惊人地证实由所述细菌表达的ClpB蛋白质对饱足感、饱腹感以及食物摄入量具有直接作用，这很可能是经由MCR受体，而与可以由细菌施用所诱导的任何免疫反应无关。

因此，本发明的一个方面涉及一种在有需要的对象中诱导饱足感的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中诱导饱足感的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中诱导饱足感的美容非治疗用途。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的对象中延长饱腹感的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中延长饱腹感的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中延长饱腹感的美容非治疗用途。

因此，本发明的一个方面涉及一种在有需要的对象中减少进餐量的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中减少进餐量的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中减少进餐量的美容非治疗用途。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的对象中减少食物摄入量的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中减少食物摄入量的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中减少食物摄入量的美容非治疗用途。

本发明的另一个方面还涉及一种在有需要的对象中控制，特别是减少体重增加的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中控制，特别是减少体重增加的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中控制，特别是减少体重增加的美容非治疗用途。

本发明的另一个方面还涉及一种在有需要的对象中刺激体重减轻的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中刺激体重减轻的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中刺激体重减轻的美容非治疗用途。

本发明的另一个方面涉及一种在有需要的对象中降低脂肪质量/瘦体质量比的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的ClpB蛋白质或其变体、或有效量的表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及用于在有需要的对象中，特别是在肥胖对象中降低脂肪质量/瘦体质量比的ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌。

本发明的另一个方面涉及ClpB蛋白质或其变体、或表达所述ClpB蛋白质或其变体的细菌用于在对象中，特别是在具有正常体重或无并发症的超重的对象中降低脂肪质量/瘦体质量比的美容非治疗用途。

如本文所用，术语“对象”是指温血动物，优选人、宠物或牲畜。如本文所用，术语“宠物”和“牲畜”包括但不限于狗、猫、豚鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、马、和家禽。在一些实施方案中，对象是雄性对象或雌性对象。在一些实施方案中，对象是成年对象(例如，18岁以上的人类对象)。在另一个实施方案中，对象是幼年对象(例如，18岁以下的人类对象)。在一些实施方案中，对象可以是“患者”，即等待接受或正在接受医疗护理的对象，或过去作为/现在作为/将作为根据本发明方法的医疗程序对象的对象，或被监测疾病发展的对象。

在一些实施方案中，所述对象是肥胖的。“肥胖症”在本文指的是其中对象优选地具有BMI>30的医学病况。“BMI”或“身体质量指数”被定义为对象的身体质量除以他的身高的平方。所述普遍用于医学的公式产生kg/m²的度量单位。

在一些实施方案中，所述对象是中度肥胖的。“中度肥胖的”对象指的是具有30至35的BMI的对象。

在一些实施方案中，对象具有18.5至30的身体质量指数。

在一些实施方案中，对象不肥胖。通常，非肥胖对象具有正常的体重。“正常体重”在本文指的是产生18.5至25的BMI的体重。

在一些实施方案中，对象是超重的。“超重”在本文指的是产生25至30的BMI的体重。在一些实施方案中，所述对象是健康的超重或无并发症的超重对象。“健康的超重”或“无并发症的超重”对象在本文意指没有显示出与他/她的体重直接相关的任何疾病或病况的超重对象。

在一些实施方案中，所述对象正在接受减肥饮食和/或希望减轻体重。在其它实施方案中，所述对象没有接受减肥饮食和/或不希望减轻体重。

如本文所用的术语“饱腹感”意在指的是其中个体感觉他们的渴望被满足或减到最低限度的基本上稳态的状态。许多生理因素被认为会影响个体的饱腹感。举例来说，味觉或味道、嗅觉或气味、以及胃的饱满感都可能会促成个体是否感觉“饱足”。更具体来说，“饱腹感”是其中进一步进食受到抑制的状态并且决定了进餐之间的时间和下次进餐时食用的食物量。“饱腹感增强”等，这具有与对照情况相比，饱腹感更加显著和/或时间更长的含义。

如本文所用的术语“饱足感”指的是在进餐中终止进食的状态，这通常在开始食用膳食之后一段时间(例如20分钟-30分钟)内发生/被观测到。因此，当在本文件中提到“诱导饱足感”等时，这具有引起对象在进餐期间停止食用食物的倾向的含义。对饱足感的影响可以通过对进餐终止的时间点进行评分来确定。如果在进餐终止时食用的卡路里的量显著少于对照，例如至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％或更多，那么观测到饱足感作用。在更长的时间段(如1周、2周、3周、4周、5周或更长时间)内，也可以对与对照饮食相比体重的减轻或体重的变化进行评分。与对照对象相比，接受规律量的测试组合物的施用(例如每天一次、每天两次、或更多)的对象的体重优选地受到显著控制(减轻或更低程度地增加)。如本文所用的“对照对象”指的是没有接受本发明的益生菌细菌菌株的施用的对象。

如本文所用的术语“ClpB”具有它在本领域中的一般含义，并且也被称为热休克蛋白F84.1，它是六聚体AAA+-ATP酶的Hsp100/ClpB家族的成员。ClpB已经被描述为对于几种革兰氏阴性病原性细菌和革兰氏阳性病原性细菌的获得性耐热性以及毒力和感染性来说必要的因子，所述细菌诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella turalensis)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、以及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellathyphimurium)。在大肠杆菌K12中，伴侣蛋白ClpB也被称为热休克蛋白F84.1或htpM并且是具有857个氨基酸的蛋白质。通常，伴侣蛋白ClpB包含来自大肠杆菌K12的具有SEQ ID NO:1(NCBI参考编号：NP_417083.1，如可在2013年11月6日获得；和/或UniProtKB/Swiss-Prot编号：P63284，如可在2013年11月6日获得)的伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。通常，伴侣蛋白ClpB的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列96％至100％同一的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。优选的是，ClpB的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列540-550(ARWTGIPVSR)96％、97％、98％、99％或100％同一。在本申请的背景下，同一性百分比是使用全局比对(即将两个序列在它们的整个长度上进行比较)来计算的。用于比较两个或更多个序列的同一性的方法是本领域公知的。可以例如使用“needle”程序，所述程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)以在考虑它们的整个长度时找到两个序列的最佳比对(包括空位)。needle程序是例如可在ebi.ac.uk万维网网站上获得的。根据本发明的同一性百分比优选地使用EMBOSS来计算：needle(全局)程序，其中“空位开放”参数等于10.0，“空位延伸”参数等于0.5，以及使用Blosum62矩阵。

根据本发明，ClpB蛋白质模拟α-MSH蛋白质来诱导饱足感。因此，在一些实施方案中，本发明的ClpB蛋白质由抗α-MSH抗体识别。通常，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体，如多克隆兔抗α-MSH IgG(1:1000，美国加利福尼亚州圣卡洛斯的半岛实验室公司(Peninsula Laboratories,San Carlos,CA,USA))。α-MSH的氨基酸序列优选地包含氨基酸序列SYSMEHFRWGKPV(SEQ ID NO:2)(Gen Pept序列ID，PRF：223274，如可在2013年12月2日获得)或由所述氨基酸序列组成。

SEQ ID NO:1：

如本文所用的“氨基酸”由如本领域所公知的它们的全名、它们的三字母密码或它们的单字母密码表示。肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；异亮氨酸是Ile还是I；甲硫氨酸是Met或M；缬氨酸是Val或V；丝氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；苏氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；组氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；赖氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；和甘氨酸是Gly或G。

如本文所用的术语“氨基酸”包括天然氨基酸和合成氨基酸，以及D和L氨基酸。“标准氨基酸”或“天然存在的氨基酸”是指天然存在的肽中常见的20种标准L-氨基酸中的任何氨基酸。“非标准氨基酸残基”是指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是衍生自天然来源。例如，萘基丙氨酸可以取代色氨酸以促进合成。可被取代的其他合成氨基酸包括但不限于L-羟丙基，L-3,4-二羟基苯丙氨酰，α-氨基酸，如L-α-羟基赖氨酰和D-α-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰，β-氨基酸和异喹啉基。

如本文所用的“氨基酸”还包括经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和取代物。包含在本发明的多肽中并且特别是在羧基或氨基末端的氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化或被其他化学基团取代来修饰，所述化学基团可以改变多肽的循环半衰期而不会对它们的活性产生不利影响。另外，在本发明的多肽中可以存在或不存在二硫键。

本发明的ClpB蛋白或其变体可以包含天然标准氨基酸或非标准氨基酸。多肽模拟物包括具有以下修饰的多肽：

i)其中一个或多于一个的肽基-C(O)NR-键已被非肽键取代的多肽，例如被-CH₂-氨基甲酸酯键(-CH₂OC(O)NR-)、膦酸酯键、-CH₂-磺酰胺(-CH₂-S(O)₂NR-)键、脲(-NHC(O)NH-)键、-CH₂-仲胺键、或被烷基化的肽键(-C(O)NR-)取代的多肽，其中R为C₁至C₄烷基；

ii)其中N末端被衍生为-NRR₁基团、-NRC(O)R基团、-NRC(O)OR基团、-NRS(O)₂R基团、-NHC(O)NHR基团的多肽，其中R和R₁是氢或C₁至C₄烷基且条件为R和R₁不都是氢；

iii)其中C末端被衍生为-C(O)R₂和-NR₃R₄的多肽，其中R₂选自C₁至C₄烷氧基，R₃和R₄独立地选自氢和C₁至C₄烷基。

在一个实施方案中，ClpB蛋白或其变体包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或其变体或由氨基酸序列SEQ ID NO：1或其变体组成。在一个实施方案中，ClpB蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成。

在一个实施方案中，如本文所用的“ClpB变体”包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1呈现出至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的序列或由该序列组成。

当在两个或多于两个氨基酸序列的序列之间的关系中使用时，如本文所用的术语“同一性”或“同一”是指氨基酸序列之间的序列相关性程度，其由两个或多于两个氨基酸残基串之间的匹配数确定。“同一性”度量两个或多于两个序列中较小的序列之间的同一匹配的百分比，其中空位比对(如果有的话)由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决。用于比较两个或多于两个序列的同一性的方法是本领域公知的。这些方法包括但不限于Arthur M.Lesk，Computational Molecular Biology：Sources and Methods forSequence Analysis(序列分析的来源和方法)(New-York:Oxford University Press(纽约：牛津大学出版社)，1988)；Douglas W.Smith，Biocomputing：Informatics and GenomeProjects(信息学和基因组计划)(New-York：Academic Press(纽约：学术出版社)，1993)；Hugh G.Griffin和Annette M.Griffin，Computer Analysis of Sequence Data，Part 1(序列数据的计算机分析，第一部分)(New Jersey：Humana Press(新泽西州：胡玛纳出版社)，1994)；Gunnar von Heinje，Sequence Analysis in Molecular Biology：TreasureTrove or Trivial Pursuit(Academic Press(学术出版社)，1987)；Michael Gribskov和John Devereux，Sequence Analysis Primer(序列分析入门)(纽约：M.Stockton出版社，1991)；和Carillo等，1988.SIAM J.Appl.Math.48(5)：1073-1082中描述的那些。设计用于确定同一性的优选方法以给出所测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在公开可用的计算机程序中描述。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序的方法包括GCG程序包，其包括GAP(Devereux等，1984.Nucl.Acid.Res.12(1Pt 1)：387-395；威斯康星州麦迪逊威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机研究组(Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI))、BLASTP、BLASTN、TBLASTN和FASTA(Altschul等，1990.J.Mol.Biol.215(3)：403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))和其他来源(BLAS指南，Altschul等，NCB/NLM/NIH贝塞斯达软件公司，马里兰州(Bethesda，Md.)，20894；Altschul等，1990.J.Mol.Biol.215(3)：403-410)公开获得。可以优选使用“针”程序(“needle”program)，所述程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman S.B.和Wunsch C.D.(1970).J Mol Biol,48,443-453)以在考虑它们的全长时找到两个序列的最佳比对(包括空位)。针程序例如可在ebi.ac.uk万维网站上获得。优选使用“空位开放(Gap Open)”参数等于10.0且“空位延伸(Gap Extend)”参数等于0.5的EMBOSS：针(全局)程序和Blosum62矩阵来计算根据本发明的同一性百分比。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

如本文所用的术语“变体”是指通常与本文具体公开的多肽的区别在于一个或多于一个的置换、缺失、添加和/或插入的多肽。可以天然存在此类变体或可以例如，通过修饰一种或多于一种的上述多肽序列和评估如本文所述的多肽的一种或多于一种生物活性和/或使用在本领域中公知的众多技术中的任何一种来合成产生此类变体。可以在多肽的结构中进行修饰，并且仍然获得编码具有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。

当需要改变多肽的氨基酸序列以产生本发明的配体的等同物或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多于一个密码子。例如，与具有序列SEQ ID NO：1的ClpB蛋白相比，某些氨基酸可以被蛋白质结构中的其他氨基酸置换而没有明显的功能丧失。

某些氨基酸序列置换可以在蛋白质序列中进行，当然，也可以在其基础的DNA编码序列中进行，并仍然获得具有相似性质的蛋白质。因此，考虑可以在肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中进行各种改变而不会明显丧失其生物学效用或活性。在许多情况下，多肽变体将含有一个或多于一个保守置换。“保守置换”是一种氨基酸被具有相似性质的另一种氨基酸置换，使得肽化学领域的技术人员将会预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。如上所述，氨基酸置换因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员公知的并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸置换。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以表示保守变化的其他氨基酸组包括：(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；、(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；和(5)Phe、Tyr、Trp、His。

如本文所用的术语“保守氨基酸置换”可进一步限定为以下五组之一内的氨基酸交换：

(i)小的脂肪族非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

(ii)极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

(iii)极性带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

(iv)大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys；

(v)大的芳香族残基：Phe、Tyr、Trp。

变体还可以包含或替代地包含非保守变化。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的不同之处在于置换、缺失或添加1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸。变体也可以(或替代地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小限度影响的氨基酸缺失或氨基酸添加来进行修饰。

在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的变体能够在有需要的对象中诱导饱足感、延长饱腹感、减少食物摄入量、控制体重增加、刺激体重减轻和/或降低脂肪质量/瘦体质量比，同时具有至少等同于SEQ ID NO：1的一种功效的功效。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO：1的序列相比，SEQ ID NO：1的变体包含保守氨基酸置换，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个的保守氨基酸置换。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO：1的变体是其中来自SEQ ID NO：1序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸不存在或由任何氨基酸置换的多肽，或是其中添加了1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸(连续或不连续)的多肽。

在本发明的一个实施方案中，如本文所述的ClpB蛋白或其变体通过本领域公知的方法进行修饰，例如通过添加一个或多于一个官能团，例如磷酸基团、乙酸基团、脂质基团或碳水化合物基团，和/或通过添加一个或多于一个保护基团进行修饰。

例如，可以通过添加一个或多于一个官能团，例如磷酸基团、乙酸基团或各种脂质基团和碳水化合物基团来修饰ClpB蛋白或其变体。ClpB蛋白或其变体也可以作为多肽衍生物存在。

术语“多肽衍生物”是指具有氨基(-NH-)、以及更特别地具有肽键的化合物。多肽可以被认为是取代的酰胺。与酰胺基团一样，肽键显示出高度的共振稳定性。肽键中的C-N单键通常具有约40％的双键特征并且C＝O双键具有约40％的单键特征。“保护基团”是指防止涉及未受保护的官能团的不期望反应(例如蛋白水解)的那些基团。氨基保护基团的具体实例包括甲酰基；三氟乙酰基；苄氧羰基；经取代的苄氧羰基，例如(邻-或对-)氯苄氧羰基和(邻-或对-)溴苄氧羰基；和脂族氧基羰基，例如叔丁氧基羰基和叔氨基氧基羰基。氨基酸的羧基可以通过转化成酯基来保护。酯基包括苄基酯；经取代的苄基酯，例如甲氧基苄基酯；烷基酯，例如环己基酯、环庚基酯或叔丁基酯。胍基部分可以被硝基；或芳基磺酰基，例如甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基保护，即使其不需要保护基团。咪唑的保护基团包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基。色氨酸的吲哚基团可以被甲酰基保护或可以不保护。

ClpB蛋白或其变体的修饰特别旨在改善它们在体内的寿命。一种类型的修饰是向ClpB蛋白或其变体的N末端或C末端添加聚乙二醇(PEG)。本领域技术人员已知PEG具有许多使其成为多肽的理想载体的性质，例如高水溶性、溶液中的高流动性和低免疫原性。该修饰还保护多肽免于被外肽酶降解并且因此增加它们在体内的整体稳定性。

用于防止多肽被内肽酶或外肽酶降解的其他修饰包括多肽内特定位点处的N末端修饰如乙酰化或糖基化，多肽内特定位点处的C末端修饰如酰胺化，以及包括使用非天然氨基酸(β-氨基和α-三氟甲基氨基酸)。

增加多肽分子大小的另一种替代方案是多肽与人免疫球蛋白(包括例如IgA、IgM和IgG)的Fc结构域的遗传融合或多肽与白蛋白的融合。

本文所述的ClpB蛋白或其变体可以通过如本领域所公知的化学合成或酶促合成进行合成产生。或者，编码本发明多肽的核苷酸序列可以被引入蛋白表达载体中，并在合适的宿主生物体(例如细菌、昆虫细胞等)中产生，然后纯化。在一个实施方案中，ClpB蛋白或其变体通过克隆方法，例如使用本领域已知的任何产生系统，例如大肠杆菌、酵母、杆状病毒-昆虫细胞、或哺乳动物细胞例如HEK或CHO表达系统获得。

可以添加额外的多肽(“标签”)以供纯化或者鉴定或纯化多肽。例如，蛋白质标签使得多肽例如能够以高亲和力吸附到基质上，然后用合适的缓冲液严格洗涤基质，同时不会将复合物洗脱至任何显著程度，并且随后选择性洗脱已吸附的复合物。本领域技术人员已知的蛋白质标签的实例是(His)₆标签、Myc标签、FLAG标签、血凝素标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、具有几丁质结合亲和性的内含肽标签或麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。这些蛋白质标签可位于N末端、C末端和/或内部。

在一些实施方案中，以药物组合物的形式向所述对象施用ClpB蛋白质。在一些实施方案中，ClpB蛋白质与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质，如可生物降解的聚合物组合以形成药物组合物。

术语“药学上”或“药学上可接受的”指的是当在适当时向哺乳动物，特别是人类施用时不会产生不利的、过敏性的或其它不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂指的是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或配制辅剂。在本发明的药物组合物中，活性成分可以单独或与另外的活性成分组合以单位施用形式，作为与常规的药物载体的混合物向动物和人类施用。合适的单位施用形式包括经口途径形式，如片剂、凝胶胶囊、粉剂、颗粒剂以及经口悬浮液或溶液；舌下和颊面施用形式、气溶胶、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、真皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式以及直肠施用形式。优选的是，药物组合物含有用于能够被注射的制剂的药学上可接受的媒介物。这些可能特别是等渗的、无菌的、盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)、或干的，特别是冷冻干燥的组合物，所述组合物在根据情况添加无菌水或生理盐水时容许构成可注射的溶液。适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体以达到容易注射的程度。它在制造和储存的条件下必须是稳定的并且必须经过防腐处理以防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。包含作为游离碱或药理学上可接受的盐的本发明的化合物的溶液可以在适当地与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇、和其混合物中以及在油中制备分散液。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。活性成分可以中性形式或盐形式被配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基所形成)，并且所述酸加成盐是与例如像盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成的。与游离羧基所形成的盐也可以由无机碱，例如像氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等产生。载体也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选的是，包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来使可注射组合物的吸收延长。通过将所需量的活性多肽，根据需要连同上文所列举的各种其它成分一起并入到适当的溶剂中，继而过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种经过灭菌的活性成分并入到含有基本分散介质和上文所列举的那些成分中的所需的其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，这些技术产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所期望的成分的粉末。在配制后，将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效量施用溶液。所述制剂容易以多种剂型施用，如上文所述的可注射溶液的类型，但是也可以使用药物释放胶囊等。对于以例如水溶液形式肠胃外施用，如果需要的话，所述溶液应当被适当地缓冲并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下以及腹膜内施用。在这方面，鉴于本公开，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。举例来说，可以将一个剂量溶解在1mL的等渗NaCl溶液中并且添加到1000mL的皮下灌注流体中或在建议的输注部位处注射。剂量的一定变化将必然发生，这取决于正治疗的对象的病况。负责施用的人员在任何情况下将确定用于单个对象的适当剂量。

如本文所用，表述“表达ClpB的细菌”指的是表达或过表达如上文所定义的伴侣蛋白ClpB或其变体或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的多肽的细菌，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列96％至100％同一，更优选地与SEQ ID NO:1的氨基酸序列96％、97％、98％、99％或100％同一。

在一些实施方案中，表达ClpB蛋白质或其变体的细菌是食品级细菌。

在一些实施方案中，表达ClpB蛋白质或其变体的细菌是益生菌细菌菌株。

如本文所用，术语“益生菌”意在表示活微生物，所述活微生物在它们以足够的量整合时对健康、舒适以及健身发挥了超越传统营养作用的积极作用。益生菌微生物已经被定义为“在以足够的量施用时对宿主赋予健康益处的活微生物”(FAO/WHO 2001)。如本文所用的表述“益生菌细菌菌株”表示对宿主的健康和福利具有有益作用的细菌菌株。

在一些实施方案中，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是活的细菌菌株，特别是活的益生菌细菌菌株。表述“活的细菌菌株”意指代谢活跃的并且能够定殖于对象的胃肠道的微生物。

在一些实施方案中，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是由细菌碎片的混合物组成的非存活的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株。在一些实施方案中，本发明的细菌碎片的混合物由来自细菌菌株的蛋白质组成。

在一些实施方案中，本发明的益生菌细菌菌株选自食品级细菌。“食品级细菌”意指被使用并且一般被认为对于在食品中使用来说是安全的细菌。

所述细菌菌株可以是天然存在的细菌菌株或它可以是遗传工程细菌菌株。

在一些实施方案中，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是组成型表达ClpB蛋白质或其变体的细菌。

在一些实施方案中，ClpB蛋白质或其变体在所述细菌中过表达。一般来说，当蛋白质以比在自然界中在标准条件下存在的给定基线产量高的量或产量表达或产生时，所述蛋白质的表达是“上调的”或所述蛋白质是“过表达的”。蛋白质的过表达可以例如通过改变以下各项中的任何一种或多种来实现：(a)宿主细胞的生长条件或生存条件；(b)编码蛋白质的多核苷酸；(c)用于控制细胞中多核苷酸的表达和它的拷贝数的启动子；以及(d)宿主细胞本身。

在一些实施方案中，使细菌经受应激条件以使得ClpB蛋白质或其变体的表达在所述细菌中上调。应激可以选自由以下各项组成的组：暴露于热、温度变化、机械应力、或长期储存、低水分储存和/或冷冻干燥或喷雾干燥。

在一些实施方案中，使所述细菌经受营养素供应至少5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、或20次。通常，营养素是借助于便于细菌生长的培养基，例如如实施例中所述的穆勒-海顿(Muller-Hinton)来供应的。在一些实施方案中，在所述重复的营养素供应之后的稳定期的阶段将细菌分离，这是因为在该阶段期间，ClpB蛋白质或其变体的浓度是最大的。

在一些实施方案中，所述细菌包含至少一个点突变以使得ClpB蛋白质或其变体的表达上调。如本文所用的术语“点突变”意指核酸取代和/或核酸缺失。或者或同时，至少一个突变位于ClpB基因的调节性DNA序列内，例如位于转录序列和翻译控制序列中，优选的是，该突变调节蛋白质的表达。调节性DNA序列内的突变可以用来上调蛋白质的表达。

在一些实施方案中，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是已经被遗传工程化以表达ClpB蛋白质或其变体的细菌。通常，将细菌菌株用编码ClpB蛋白质或其变体的核酸转化。术语“转化”意指将“外来”(即外在或细胞外)基因、DNA序列或RNA序列引入到宿主细胞中，以使得所述宿主细胞将表达所引入的基因或序列以产生所期望的物质，通常是由所引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受和表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”。核酸可以在使亲本微生物转化后保持在染色体外或可以适合于整合到微生物的基因组中。因此，核酸可以包括另外的核苷酸序列，所述核苷酸序列适合于帮助整合(例如允许同源重组和靶向整合到宿主基因组中的区域)或染色体外构建体的稳定表达和复制(例如复制起点、启动子以及其它调节序列)。在一些实施方案中，所述核酸是核酸构建体或载体。在一些实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而，其它构建体和载体，如用于克隆的那些构建体和载体也由本发明所涵盖。在一些实施方案中，表达构建体或载体是质粒。通常，表达构建体/载体进一步包含启动子，如本文先前所述。在一些实施方案中，所述启动子允许所述基因在它的控制下进行组成型表达。然而，也可以使用诱导型启动子。应当了解的是，除了启动子之外，本发明的表达构建体/载体还可以含有多种调节元件并且如果需要的话，还可以含有适用于表达ClpB蛋白质或其变体的另外的基因。用于用细胞外核酸转化细菌细胞的方法是本领域公知的。

在一些实施方案中，细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是革兰氏阴性菌株。

在一些实施方案中，细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员。具体来说，所述细菌菌株是肠杆菌科的非病原性成员。

有趣的是，本申请的发明人证实了所有肠杆菌科细菌的ClpB蛋白质彼此显示出100％的同一性。

在一些实施方案中，细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是大肠杆菌菌株。在一些实施方案中，根据本发明的教导使用的大肠杆菌菌株，特别是益生菌大肠杆菌菌株包括发挥益生菌活性的非病原性大肠杆菌菌株。益生菌大肠杆菌菌株的实例是益生菌大肠杆菌菌株BU-230-98，ATCC保藏号202226(DSM 12799)，它是已知的可商购获得的益生菌大肠杆菌菌株M-17的分离株。非病原性大肠杆菌菌株的实例是大肠杆菌Nissle 1917。不被称为益生菌的大肠杆菌菌株的实例是实验室大肠杆菌菌株K12。

在其它实施方案中，所述细菌菌株是蜂房哈夫尼菌菌株，如由Bioprox公司商业化的蜂房哈夫尼菌菌株AF036。在另外的其它实施方案中，所述细菌菌株是普通变形杆菌(Proteus vulgaris)菌株。

在另外的其它实施方案中，使用表达ClpB蛋白质或其变体的细菌菌株的组合。

通常，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是用本领域公知的任何适当的培养基产生的。根据本发明，各种发酵培养基是合适的，诸如(但不限于)例如首先是其中培养一种或多种菌株并且原样使用或在浓缩(例如干燥)之后或在添加到另外的食品基质或产品中之后使用的工业培养基。或者，可以使用细菌细胞、或具有培养基(例如发酵液)的细菌细胞、或包含这样的细胞的培养基(即具有所述一种或多种细菌菌株的培养基)的级分。所述细胞或所述包含细胞的培养基包含所述一种或多种菌株的活的或存活的细菌细胞和/或死的或非存活的细菌细胞。因此可以通过但不限于加热或超声处理来处理培养基。冻干的、或冷冻的细菌和/或无细胞培养基(其可以被浓缩)也被涵盖在用于制备本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的方法中。

在一个具体的实施方案中，将本发明的细菌菌株冻干，然后优选地在施用之前重悬。

通常，通过摄入(即经口途径)向对象施用本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株。

在一些实施方案中，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株被封装以免于受到胃的影响。因此，在一些实施方案中，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株以封装形式被配制成组合物以显著地延长它们的存活时间。在这样的情况下，胶囊的存在可以特别延迟或防止微生物在胃肠道中的降解。应当了解的是，本发明的实施方案的组合物可以被封装到包肠溶衣的控时释放胶囊或片剂中。肠溶包衣允许胶囊/片剂在它通过胃肠道时保持完整(即未溶解)，直到它到达小肠之时为止。封装活细菌细胞的方法是本领域公知的(参见例如通用磨坊公司(General Mills Inc.)的美国专利，如美国专利号6,723,358)。举例来说，使用藻酸盐和Hi-MaizeTM淀粉进行微封装，继而进行冷冻干燥已经被证实成功地延长乳制品中细菌细胞的保存期[参见例如Kailasapathy K.(2002)Curr Issues IntestMicrobiol.3(2),39-48]。或者，封装可以使用葡甘露聚糖纤维，如从魔芋(Amorphophalluskonjac)中提取的那些来进行。或者，也可以使用在芝麻油乳液中包封活细菌[参见例如HouR.C.,Lin M.Y.,Wang M.M.,Tzen J.T.(2003)J Dairy Sci 86,424-428]。在一些实施方案中，用于肠溶包衣的试剂优选地是甲基丙烯酸-丙烯酸烷基酯共聚物，如聚合物。聚(甲基)丙烯酸酯已经被证实特别适合作为包衣材料。是衍生自丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物的商品名，它的特性由官能团决定。单独的牌号在它们的中性基团、碱性基团或酸性基团的比例方面并且因此在物理化学特性方面不同。不同的聚合物的巧妙使用和组合为在各种药物应用和技术应用中受控的药物释放提供了理想的解决方案。提供了用于持续释放片剂和丸粒包衣的功能性膜。所述聚合物描述于国际药典中，如Ph.Eur.、USP/NF、DMF以及JPE。聚合物可以为受控的药物释放提供以下可能：胃肠道靶向(抗胃液性、在结肠中释放)、保护性包衣(味道和气味掩蔽、针对水分加以保护)以及延迟药物释放(持续释放制剂)。聚合物存在许多范围的不同浓度和物理形式，包括水溶液、水性分散液、有机溶液、以及固体物质。聚合物的药物特性是由它们的官能团的化学特性决定的。在以下各项之间有区别：

-聚(甲基)丙烯酸酯，可溶于消化液中(通过形成盐)：L(甲基丙烯酸共聚物)、S(甲基丙烯酸共聚物)、FS以及E(碱性丁基化甲基丙烯酸酯共聚物)聚合物，它们具有酸性基团或碱性基团，使得活性成分能够进行pH值依赖性释放。应用：从仅经由抵抗胃液的简单的味道掩蔽，到在肠的所有段中受控的药物释放。

-聚(甲基)丙烯酸酯，不可溶于消化液中：具有碱性基团的RL和RS(季铵基甲基丙烯酸酯共聚物)聚合物以及具有中性基团的NE聚合物使得活性物质能够通过非pH值依赖性溶胀来进行受控的定时释放。

肠溶包衣提供了防止药物在胃中释放的保护并且使得能够在肠中受控释放。主要的释放标准是包衣的pH值依赖性溶解，这是在肠的某一段(pH 5至高于7)中发生，而不是在胃(pH 1-5)中发生。对于这些应用，含有羧基的阴离子牌号可以彼此混合。这使得有可能精细地调节溶解pH值，并且因此限定肠中的药物释放部位。L和S牌号适用于肠溶包衣。FS 30D(基于丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯以及甲基丙烯酸的阴离子共聚物的水性分散液)专门用于结肠中的受控释放。

通常，本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株以食品组合物的形式向对象施用。因此，本发明的另一个方面涉及一种食品组合物，所述食品组合物包含一定量的本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株。

在一些实施方案中，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的食品组合物选自完整的食品组合物、食品补充剂、营养保健组合物等。本发明的组合物可以用作食品成分和/或饲料成分。

所述食品成分可以呈溶液或固体的形式，这取决于用途和/或应用方式和/或施用方式。

本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株通常在组合物的生产过程期间的任何时间被添加，例如它们可以在生产过程开始时被添加到食品基质中或它们可以被添加到最终的食物产品中。

“食品”指的是液体(即饮料)、固体或半固体饮食组合物，特别是不需要另外的营养素摄入或食品补充剂组合物的完全食品组合物(食物替代物)。食品补充剂组合物不能通过其它方式完全替代营养素摄入。食品和食品补充剂组合物是例如发酵的乳制品或基于乳制品的产品，它们优选地每天经口施用或摄入一次或多次。发酵的乳制品可以在生产过程中直接使用根据本发明的细菌来制备，例如使用本身已知的方法，通过添加到食品基质中。在这样的方法中，除了通常使用的微生物之外，还可以使用本发明的一种或多种菌株和/或本发明的一种或多种菌株可以代替通常使用的微生物中的一种或多种或一部分。举例来说，在制备发酵的乳制品，如酸奶或基于酸奶的饮料时，本发明的细菌可以被添加到起子培养物中或用作起子培养物的一部分或可以在这样的发酵期间适当地添加。任选地，细菌可以在生产过程的后期被灭活或杀灭。发酵的乳制品包括基于奶的产品，诸如(但不限于)甜品、酸奶、酸奶饮料、凝乳、酸乳酒、基于发酵乳的饮料、酪乳、奶酪、调味品、低脂涂抹食品、新鲜奶酪、基于大豆的饮料、冰淇淋等。或者，食品和/或食品补充剂组合物可以是非乳制品或乳制品非发酵产品(例如于非发酵乳或另外的食品介质中的菌株或无细胞培养基)。在一些实施方案中，本发明的益生菌细菌菌株被封装和分散于食品介质(例如奶)或非食品介质中。非发酵乳制品可以包括冰淇淋、营养棒以及调味品等。非乳制品可以包括粉状饮料和营养棒等。所述产品可以使用已知的方法来制备，如将有效量的一种或多种菌株和/或无细胞培养基添加到食品基质，如脱脂奶或奶或基于奶的组合物中以及发酵，如已知的那样。可以添加细菌细胞和/或无细胞培养基(包含细菌细胞和/或无细胞培养基的组合物)的其它食品基质是肉类、肉类替代物或植物基质。

包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的组合物可以是固体、半固体或液体。它可以呈食物产品或食品补充剂的形式，例如呈片剂、凝胶、粉末、胶囊、饮料、棒等形式。举例来说，所述组合物可以呈被包装在小袋中的粉末的形式，所述粉末可以溶解在水、果汁、奶或另外的饮料中。

如本文所用的术语“食品成分”或“饲料成分”包括这样的制剂，其作为营养补充剂的功能性食物或食品或可以作为营养补充剂添加到功能性食物或食品中。

“营养食品”或“营养保健性”或“功能性”食品意指含有对健康具有有益作用或能够改善生理功能的成分的食品。

“食品补充剂”意指具有完善正常食物饮食的目的的食品。食品补充剂是浓缩的营养素或其它物质的来源，在它们被单独采用或以少量作为组合采用时，具有营养或生理作用。

根据本发明，“功能性食品”概括了最近开发的食品和相应产品，它们不仅由于在营养学和味道方面是有价值的，而且还由于特定的成分物质而被赋予重要性。根据本发明，中期或长期维持和促进健康是重要的。在这种背景下，非治疗用途是优选的。术语“营养品”、“药用食品”以及“设计食品”也代表了本发明的实施方案，作为同义词使用，然而也部分地以不同的方式使用。然而，术语功能性食品最好地明确了产品的预防方面和促进健康以及食品特征。在很多情况下，这些涉及通过分类和选择(本发明也是如此)、纯化、浓缩、越来越多地还通过添加所积累的产品。不包括分离的有效物质，特别是呈片剂或丸剂的形式。尽管功能性食品没有法定的定义，但是对该领域有兴趣的大部分当事方同意它们是由于具有超出基本营养作用的特定健康作用而被销售的食品。因此，功能性食品是普通食品，它们具有被并入到它们中的赋予食品以除纯粹的营养作用以外的特定功能益处，例如医疗益处或生理益处的组分或成分(如本文所述的那些)。

在一些实施方案中，所述饮料是功能性饮料或治疗性饮料、止渴饮料或普通饮料。举例来说，本发明的组合物可以用作以下各项的成分：软饮料、果汁或包含乳清蛋白的饮料、健康茶类、可可饮料、乳饮料和乳酸菌饮料、酸奶和饮用酸奶、奶酪、冰淇淋、水冰和甜品、糖果、饼干、蛋糕和蛋糕粉、点心食品、平衡食品和饮料、水果馅料、保健糖衣、巧克力面包馅料、奶酪蛋糕调味馅料、水果味蛋糕馅料、蛋糕和甜甜圈糖霜、速食面包夹心用稀奶油、曲奇饼馅料、即用面包馅料、低卡路里馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、无菌/蒸馏巧克力饮料、棒混合物、饮料粉、钙强化大豆/普通和巧克力奶、钙强化咖啡饮料。

所述组合物可以进一步用作食物产品中的成分，如美国奶酪酱、磨碎和切丝奶酪的抗结块剂、蘸酱切片、奶油奶酪、干混搅打裱花用无脂酸奶油、冷冻/解冻乳制品搅打奶油、冷冻/解冻稳定打发裱花奶油、低脂和轻天然切达奶酪、低脂瑞士风格酸奶、充气冷冻甜品、硬包装冰淇淋、标签友好型、经济实惠的硬包装冰淇淋、低脂冰淇淋：软冰淇淋、烧烤酱、奶酪蘸酱、农家奶酪调味品、干混阿尔弗雷多酱(dry mix Alfredo sauce)、混合奶酪酱、干混番茄酱等。

在一些实施方案中，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的组合物被用于酸奶生产，如发酵酸奶饮料、酸奶、饮用酸奶、奶酪、发酵奶油、基于奶的甜品等。适当地，所述组合物可以进一步用作奶酪应用、肉类应用、或包含保护性培养物的应用中的一种或多种中的成分。

在一些实施方案中，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的食品组合物适用于制备餐替代产品。如本文所用，除非另外说明，否则术语“餐替代产品”包括含有蛋白质、碳水化合物、脂质、维生素以及矿物质的任何营养产品，这些物质的组合则适合作为餐的唯一或主要的营养来源。通常，餐替代产品包含至少一种碳水化合物来源、至少一种脂质来源和/或至少一种蛋白质来源。作为蛋白质来源，可以使用任何合适的膳食蛋白，例如动物蛋白(如乳蛋白、肉类蛋白以及卵蛋白)；植物蛋白(如大豆蛋白、小麦蛋白、水稻蛋白、以及豌豆蛋白)；游离氨基酸的混合物；或其组合。诸如酪蛋白和乳清的乳蛋白以及大豆蛋白是特别优选的。所述蛋白质可以是完整的或水解的或完整蛋白和水解蛋白的混合物。可能期望供应部分水解的蛋白质(2％至20％的水解度)，例如对于被认为有发生牛奶过敏的风险的动物来说。如果需要水解蛋白，那么可以如所期望和如本领域已知的那样进行水解过程。举例来说，乳清蛋白水解产物可以通过在一个或多个步骤中酶促水解乳清级分来制备。如果用作起始材料的乳清级分基本上不含乳糖，那么发现蛋白质在水解过程期间经受少得多的赖氨酸阻断。这使得赖氨酸阻断的程度能够从总赖氨酸的约15重量％降低到少于赖氨酸的约10重量％；例如赖氨酸的约7重量％，这极大地提高了蛋白质来源的营养质量。如果所述组合物包括脂肪来源，那么所述脂肪来源优选地提供所述组合物的能量的5％至40％；例如能量的20％至30％。可以使用低芥酸菜籽油、玉米油以及高油酸葵花籽油的共混物获得合适的脂肪谱。碳水化合物的来源优选地提供所述组合物的能量的40％至80％。可以使用任何合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、以及其混合物。通常，通过能量限制饮食用餐替代物代替每日一餐有助于在体重减轻之后维持体重。

包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的食品组合物通常包含载体或媒介物。“载体”或“媒介物”意指适用于施用的材料并且包括本领域已知的任何这样的材料，例如像任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，它是无毒的并且不会以有害的方式与组合物的任何组分，特别是细菌菌株相互作用。营养学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、有机硅、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

在一些实施方案中，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的食品组合物包含一定量的膳食纤维。膳食纤维以未被酶消化的形式通过小肠并且充当天然的增量剂和轻泻剂。膳食纤维可以是可溶的或不可溶的并且一般来说，这两种类型的共混物是优选的。膳食纤维的合适来源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液酸乳糖以及源自于动物乳汁的低聚糖。在一些实施方案中，膳食纤维选自甘露聚糖。甘露聚糖(如葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖)，如瓜尔胶、刺槐豆胶、魔芋、以及黄原胶存在于一些植物细胞壁中。葡甘露聚糖一般包含(1-4)-β-连接的葡萄糖单元和甘露糖单元，而半乳甘露聚糖一般包含被(1-6)-α-半乳糖的单一单元取代的(1-4)-β-甘露聚糖主链。许多胚乳豆科植物，如瓜尔豆和刺槐豆在种子发育期间在胚乳中含有半乳甘露聚糖。还已经发现葡甘露聚糖是谷物的微量组分。

在一些实施方案中，根据诸如USRDA的政府机构的建议，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的食品组合物含有矿物质和微量营养素，如痕量元素和维生素。举例来说，所述组合物每日剂量可以含有所给出的范围内的以下微量营养素中的一种或多种：300mg至500mg的钙、50mg至100mg的镁、150mg至250mg的磷、5mg至20mg的铁、1mg至7mg的锌、0.1mg至0.3mg的铜、50μg至200μg的碘、5μg至15μg的硒、1000μg至3000μg的β-胡萝卜素、10mg至80mg的维生素C、1mg至2mg的维生素B1、0.5mg至1.5mg的维生素B6、0.5mg至2mg的维生素B2、5mg至18mg的烟酸、0.5μg至2.0μg的维生素B12、100μg至800μg的叶酸、30μg至70μg的生物素、1μg至5μg的维生素D、3μg至10μg的维生素E。

在一些实施方案中，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的组合物含有乳化剂。食品级乳化剂的实例通常包括二乙酰酒石酸甘油一酯和二乙酰酒石酸甘油二酯、卵磷脂以及甘油一酯和甘油二酯。类似地，可以包括合适的盐和稳定剂。

在一些实施方案中，包含本发明的益生菌细菌菌株的食品组合物含有至少一种益生元。“益生元”意指旨在促进本发明的益生菌细菌菌株在肠中生长的食物物质。益生元可以选自由低聚糖组成的组并且任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纤维。

在一些实施方案中，包含本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的组合物含有保护性水胶体(如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、封装剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、掩味剂、加重剂、胶凝剂、凝胶形成剂、抗氧化剂以及抗微生物剂。所述组合物还可以含有常规的药物添加剂和佐剂、赋形剂以及稀释剂，包括但不限于水、任何来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑石粉、糖、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。在所有情况下，这些另外的组分将在考虑它们对于预期接受者的适合性的情况下来选择。

在一些实施方案中，ClpB蛋白质或其变体、或表达ClpB蛋白质或其变体的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株的施用重复进行，例如每天2次至3次，持续一天或更长时间并且一般持续至少4天、或甚至4周至15周的持续时间段，在适当的情况下，其中有一个或多个中断时间段。在一些实施方案中，ClpB蛋白质或其变体或表达ClpB蛋白质或其变体的细菌菌株与对象的一次进餐同时施用或依次施用。在一些实施方案中，ClpB蛋白质或其变体或表达ClpB蛋白质或其变体的细菌菌株在对象进餐之前施用。

如本文所用的术语“有效量”指的是足以实现有益作用(例如刺激饱腹感、延长饱足感、减少食物摄入量、控制，特别是减少体重增加、刺激体重减轻、和/或降低脂肪质量/瘦体质量比)的ClpB蛋白质或其变体或表达ClpB蛋白质或其变体的细菌的量。在本发明的背景下，向对象施用的ClpB蛋白质或其变体或表达ClpB蛋白质或其变体的细菌的量将取决于个体的特征，如一般健康情况、年龄、性别、体重。本领域技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。举例来说，当以益生菌的形式向对象施用ClpB蛋白质或其变体时，本发明的菌株应当能够产生足以对对象产生有益作用的菌落。如果所述细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株是以食物产品的形式施用的，那么它通常可以包含每克食品组合物的干重10³cfu至10¹²cfu的本发明的细菌菌株，特别是益生菌细菌菌株。

将进一步通过以下附图和实施例来说明本发明。然而，这些实施例和附图不应当以任何方式被解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：在正常C57Bl6成年小鼠中每天胃内递送大肠杆菌K12野生型(WT)或ClpB基因缺失型大肠杆菌(ΔClpB)对在灌胃开始和灌胃3周结束时分析的体重(A、E)、24小时食物摄入量(B、F)以及膳食模式的作用(C、D、G、H)。对照小鼠(Ctr)不接受任何灌胃。膳食模式被测量为进餐量(C、G)，这对应于在单次进餐期间进食的平均食物量；以及进餐频率(D、H)，这对应于每24小时相隔至少5分钟的进餐数。进餐量减少反映了更快的饱足感并且进餐频率降低反映了更长时间的饱腹感。A：双因素重复测量ANOVA(方差分析)，邦费罗尼事后检验(Bonferroni post-test)，*p<0.05。B、D、G、H：方差分析，图凯氏事后检验(Tukey's post-test)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。E：司图顿氏t检验(Student's t-test)，*p<0.05。

图2：ClpB对ARC POMC神经元的电活动的作用。动作电位频率是以相对于基础水平的变化百分比来表示的；平均值±SEM。邦费罗尼事后检验，*p≤0.05，**p≤0.01。

图3：在用大肠杆菌K12、大肠杆菌K12ΔClpB(这两者均于米勒-希尔顿(Mueller-Hilton，MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr))胃内灌胃之前和期间(第0天-第21天)肥胖ob/ob小鼠的体重动态。双因素方差分析，处理作用：p＝0.01，邦费罗尼事后检验，对照相比于大肠杆菌K12，*p<0.05和**p<0.01。平均值±SEM。

图4：在用大肠杆菌K12(n＝8)、大肠杆菌K12ΔClpB(n＝8)(这两者均于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr.，n＝7))胃内灌胃3周之后肥胖ob/ob小鼠的平均体重变化百分比(随机化日＝100％)。方差分析，p＝0.01，图凯氏事后检验，*p<0.05。平均值±SEM。

图5：在用大肠杆菌K12(n＝8)、大肠杆菌K12ΔClpB(n＝8)(这两者均于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr.，n＝7))胃内灌胃3周之后通过EchoMRI测量的肥胖ob/ob小鼠的脂肪含量。方差分析，p＝0.005，图凯氏事后检验，**p<0.01。平均值±SEM。

图6：在用大肠杆菌K12(n＝8)、大肠杆菌K12ΔClpB(n＝8)(这两者均于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr.，n＝7))胃内灌胃3周之后通过EchoMRI测量的肥胖ob/ob小鼠的瘦体质量/脂肪质量比。方差分析，p＝0.05，司图顿氏t检验，*p<0.05。平均值±SEM。

图7：在用大肠杆菌K12(n＝8)、大肠杆菌K12ΔClpB(n＝8)(这两者均于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr.，n＝7))胃内灌胃3周期间肥胖ob/ob小鼠的平均每日食物摄入量。方差分析，p<0.0001，图凯氏事后检验，***p<0.001。平均值±SEM。

图8：在用大肠杆菌K12(n＝8)、大肠杆菌K12ΔClpB(n＝8)(这两者均于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr.，n＝7))胃内灌胃3周期间肥胖ob/ob小鼠的平均每日进餐数。方差分析，p<0.0001，图凯氏事后检验，***p<0.001。平均值±SEM。

图9：在用大肠杆菌K12、大肠杆菌Niessle 1917、冻干的大肠杆菌Niessle1917(lyo)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr))胃内灌胃期间肥胖ob/ob小鼠的每日体重增加。双因素方差分析，p＝0.02，邦费罗尼事后检验，a：对照相比于大肠杆菌Niessle 1917lyo并且b：对照相比于大肠杆菌Niessle 1917，*p<0.05和**p<0.01。平均值±SEM。

图10：在用大肠杆菌K12、大肠杆菌Niessle 1917、冻干的大肠杆菌Niessle1917(lyo)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr))胃内灌胃2周之后肥胖ob/ob小鼠的平均体重变化百分比(对于随机化日＝100％)。克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis)，p<0.01，邓恩氏事后检验(Dunn's post-test)，*p<0.05，曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)，##p<0.01。平均值±SEM。

图11：在用大肠杆菌K12、大肠杆菌Niessle 1917、冻干的大肠杆菌Niessle1917(lyo)(全部都于蜂房哈夫尼菌(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctr))胃内灌胃2周之后通过EchoMRI测量的肥胖ob/ob小鼠的脂肪含量。司图顿氏t检验，**p<0.01。平均值±SEM。

图12：直接脑室内注射不同剂量的ClpB对大鼠的食物摄入量的作用。

图13：在用大肠杆菌Niessle 1917(Nissle)(n＝15)、大肠杆菌K12(K12Δ-ClpB)(n＝15)或蜂房哈夫尼菌AF036(Hafnia)(n＝15)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl)(n＝12))胃内灌胃17天之后肥胖ob/ob小鼠的体重增加(以g计)。

图14：在用大肠杆菌Niessle 1917(Nissle)(n＝15)、大肠杆菌K12(K12Δ-ClpB)(n＝15)或蜂房哈夫尼菌AF036(Hafnia)(n＝15)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl)(n＝12))胃内灌胃17天之后肥胖ob/ob小鼠的累积食物摄入量(以g计)。

图15：在用大肠杆菌Niessle 1917(Nissle)(n＝15)、大肠杆菌K12(K12ΔClpB)(n＝15)或蜂房哈夫尼菌AF036(H.alveri)(n＝15)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl)(n＝12))胃内灌胃17天之后通过EchoMRI测量的肥胖ob/ob小鼠的脂肪质量和瘦体质量增加。A.脂肪质量增加(以g计)。B.瘦体质量增加(以g计)。C.瘦体与脂肪的质量比。

图16：在用大肠杆菌Niessle 1917(大肠杆菌Nissle)(n＝15)、大肠杆菌K12(大肠杆菌K12)(n＝15)或蜂房哈夫尼菌AF036(Hafnia alveri)(n＝15)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl)(n＝12))胃内灌胃17天之后肥胖ob/ob小鼠的相对激素敏感性脂肪酶蛋白(pHSL)表达率(以肌动蛋白表达率为标准)。通过蛋白质印迹法测量HSL和肌动蛋白表达率。

图17：高脂饮食验证。A.喂以高脂/高碳水化合物饮食(HFD)的小鼠(n＝48)和喂以对照饮食(Ctrl)的小鼠(n＝8)的体重(以g计)。B.脂肪质量(以g计)。C.瘦体质量(以g计)。

图18：在用大肠杆菌K12(K12Δ-ClpB)或蜂房哈夫尼菌AF036(H.alvei)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl))胃内灌胃14天之后高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠相对于第0天的体重增加的减少。

图19：在用大肠杆菌K12(K12Δ-ClpB)或蜂房哈夫尼菌AF036(H.alvei)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl))胃内灌胃14天之后高脂饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠相对于第0天的脂肪和瘦体质量增加。

A.脂肪质量增加(以g计)。B.瘦体质量增加(以g计)。

图20：在用大肠杆菌Niessle 1917(Nissle)、大肠杆菌K12(K12ΔClpB)或蜂房哈夫尼菌AF036(H.alvei)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl))胃内灌胃21天之后肥胖fa/fa小鼠的体重增加(以AUC-曲线下面积计)。

图21：在用大肠杆菌Niessle 1917(Nissle)、大肠杆菌K12(K12ΔClpB)或蜂房哈夫尼菌AF036(H.alvei)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl))胃内灌胃21天之后肥胖fa/fa小鼠的累积食物摄入量(以AUC计)。

图22：在用大肠杆菌Niessle 1917(Nissle)、大肠杆菌K12(K12ΔClpB)或蜂房哈夫尼菌AF036(H.alvei)(全部都于米勒-希尔顿(MH)培养基中)或仅用MH培养基(作为对照(Ctrl))胃内灌胃21天之后肥胖fa/fa小鼠的脂肪质量增加(以g计)。

实施例

实施例1

材料和方法

在定期营养素供应之后的体外大肠杆菌生长

在37℃在50mL Falcon小瓶中在含有30％牛肉浸液、1.75％酪蛋白水解物以及0.15％淀粉的在25℃具有pH 7.3的40mL的MH培养基(马里兰州的Becton Dickinson公司(Becton,Dickinson,MD))中培养大肠杆菌K12细菌。为了模拟人类的每日两次预定的进餐，在连续5天期间细菌每12小时接受新的MH培养基。在第1次提供MH培养基之后每2小时、在第3次提供MH培养基之后每1小时以及在第5次提供MH培养基之后每10分钟通过分光光度计将细菌生长测量为在λ＝600nm处的OD。在每一个12小时周期结束时，在室温(RT)将细菌以6,000rpm离心5分钟。将上清液弃去并且用等体积(约40mL)的新MH培养基代替。在最后一次补充MH培养基之后，在指数期和随后的稳定期对细菌进行取样以用于蛋白质提取。

蛋白质提取

在4℃将大肠杆菌K12细菌以4,000g离心30分钟。将细菌残余物溶解在2mL的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液(pH 7.4)中并且通过在室温超声处理3分钟来匀浆。为了从未溶解的细胞碎片中分离蛋白质，在4℃将细菌匀浆物以10,000g离心30分钟。将上清液回收，然后在4℃以60,000g超速离心45分钟以将蛋白质进一步分离成细胞质级分(上清液)和膜级分(残余物)。将膜蛋白溶解在TRIS缓冲液(pH 7.4)中。使用2-D Quant试剂盒(新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗公司(GE Healthcare,Piscataway,NJ))测量蛋白质浓度。

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳

对于2D-PAGE，使用300μg的大肠杆菌蛋白质提取物来再水化固定的pH值梯度(IPG)条(pH 4-7；18cm；加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BIO-RAD,Hercules,CA))。然后通过使用IPGphor等电聚焦系统(通用电气医疗公司)通过等电聚焦总共85,000V-h将蛋白质在第一维度上拆分。在聚焦之后，将IPG条在平衡缓冲液[6mol/L的尿素、30％(v/v)甘油、2％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、50mmol/L的Tris-HCl(pH 8.8)、以及含有2％(w/v)二硫苏糖醇的0.25％(w/v)溴酚蓝]中孵育15分钟，然后在含有4％(w/v)碘乙酰胺的平衡缓冲液中烷基化15分钟。随后将IPG条贴附到10％聚丙烯酰胺梯度凝胶(20cm×18cm×1mm)上以进行SDS-PAGE。在Ettan Daltsix垂直电泳系统(通用电气医疗公司)中以12mA/凝胶在25℃将第二维度进行过夜。在SDS-PAGE之后，在室温将二维凝胶在2％(v/v)正磷酸和50％(v/v)甲醇中固定2小时。然后将凝胶用水冲洗，并且通过CBB G-250(伯乐公司)染色[34％(v/v)甲醇、17％(w/v)硫酸铵、2％(v/v)正磷酸、以及0.66g CBB G-250/L]将蛋白质点可视化。

差异蛋白质表达分析

通过用灰度标记(纽约州罗彻斯特的柯达公司(Kodak,Rochester,NY))校准的ImageScanner II(通用电气医疗公司)扫描染色的二维凝胶的图像并且用Labscan 6.0软件(通用电气医疗公司)数字化。使用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件(通用电气医疗公司)进行包括点检测、定量、匹配、以及比较分析在内的差异蛋白质表达分析。对每一个蛋白质样品进行2D-PAGE至少3次(膜蛋白)和4次(细胞质蛋白)以使运行间变异减到最低限度，并且使用ImageMaster比较每一组3个(或4个)凝胶以确认该组凝胶内不出现统计学上有差异的点。使用每一组的最具代表性的凝胶(凝胶迁移、点定义、以及点数)在指数期与稳定期之间比较大肠杆菌蛋白质。通过凝胶中每一个点的相对体积来确定表达水平并且表示为体积％，被计算为点体积/凝胶中拆分的所有点的Σ体积。该归一化的点体积通过考虑凝胶中存在的所有点上的总体积而将由于蛋白质上样和染色所造成的变异考虑在内。丰度的变化被计算为2个阶段之间一组点的体积％的平均值的比率。只有体积变化比率>1.5的点才被认为是相关的。凝胶内点的不存在表示在所选择的实验条件下没有报告蛋白质的可检测的表达。在点体积对数变换之后，通过司图顿氏t检验(显著性水平p<0.05)确定相应的p值。

通过液相色谱-电喷雾电离MS/MS进行的蛋白质鉴定

使用Ettan挑点仪(通用电气医疗公司)从CBB G-250染色的二维凝胶切下所关注的蛋白质点，并且在Ettan消化器(通用电气医疗公司)上，如先前所述(Goichon等,2011)对蛋白质进行自动化凝胶内消化。然后将蛋白质提取物重悬在10μL的5％(v/v)乙腈/0.1％(v/v)甲酸中，然后用与配备有纳米喷雾源和HPLC-芯片立方体界面的6340离子阱质谱仪联用的nano-LC1200系统(法国科塔布夫的安捷伦科技公司(Agilent Technologies,Courtaboeuf,France))分析。简单地说，将肽在40nL RP-C18捕集柱上富集和脱盐并且在Zorbax(30nm孔径，5μm粒度)C18柱(43mm长×75μm内径；安捷伦科技公司)上分离。以400纳升/分钟的流速使用9分钟线性梯度(于0.1％甲酸中3％-80％乙腈)并且使用离子阱质谱仪分析洗脱液。

对于蛋白质鉴定，提取MS/MS峰列表并且通过使用MASCOT Daemon2.2.2版(矩阵科技公司(Matrix Science))搜索引擎与蛋白质数据库相比较。使用以下特定参数进行搜索：酶特异性：胰蛋白酶；容许一个遗漏酶切位点；无固定修饰；可变修饰：甲硫氨酸氧化、半胱氨酸脲甲基化、丝氨酸、酪氨酸以及苏氨酸磷酸化；单同位素；肽电荷：2+和3+；前体离子的质量公差：1.5Da；碎片离子的质量公差：0.6Da；ESI-TRAP作为仪器；分类学：大肠杆菌；国家生物技术信息中心(NCBI)数据库[NCBInr 20120531(18280215个序列，6265275233个残基)](马里兰州的贝塞斯达(Bethesda,MD))。如果蛋白质命中满足以下标准之一，那么它们被自动地验证：用各自具有大于54的MASCOT分数的至少两种排序最高的肽(粗体和红色)(p＜0.01)、或各自具有大于47的MASCOT分数的至少两种排序最高的肽(粗体和红色)(p＜0.05)鉴定。为了评价假阳性率，使用MASCOT的“诱饵(decoy)”选项进行所有初始数据库搜索。如果假阳性率从未超过1％，那么结果被认为是相关的。

ATP测定

使用ATP比色/荧光测定试剂盒，根据制造商的说明书(加利福尼亚州的BioVision公司(BioVision,CA))测量体外ATP产生。简单地说，将来自指数期或稳定期的每一种浓度(于ATP测定缓冲液中1μg/mL、10μg/mL以及25μg/mL)的细菌蛋白质按一式两份放入一系列孔中并且使用ATP测定缓冲液调节到50微升/孔。然后，将10μL的不同营养素溶液、15％蔗糖或MH培养基添加到相应的孔中并且使用ATP测定缓冲液调节到50微升/孔；仅将50微升/孔的ATP缓冲液添加到对照孔中。在37℃将板孵育2小时。在孵育之后，在每一个孔中添加50μL的ATP反应混合物(含有ATP测定缓冲液、ATP探针、ATP转化剂以及显色剂混合物)。在室温在避光下孵育30分钟之后在570nm处测量OD。

ClpB免疫测定的开发和验证

ClpB检测测定的设计基于几个标准，如在线性浓度范围内特异性的和灵敏的检测。特定的条件是没有α-MSH交叉反应性的ClpB检测，所述交叉反应性可能由于ClpB分子中一个或多个α-MSH样表位的存在而发生。为了简化程序和信号检测，我们使用标准96孔ELISA板和通过分光光度计进行OD读数的选择方案。ClpBELISA和蛋白质印迹法(WB)的详细方案呈现于单独的部分中。

为了防止揭示抗体(Ab)与捕捉Ab的结合，我们分别在不同的物种，即兔和小鼠中产生ClpB捕捉Ab和ClpB检测Ab。为了从复杂的生物样品中最高效地捕捉ClpB蛋白质，我们用具有多个抗ClpB表位的兔多克隆Ab包被ELISA板。为了避免ClpB与α-MSH之间的交叉反应性，我们使用通过ELISA筛选几种Ab克隆所预选的小鼠单克隆抗ClpBAb作为检测Ab，所述小鼠单克隆抗ClpBAb的特征在于对识别ClpB具有高灵敏度和特异性，而对α-MSH则没有。使用碱性磷酸酶缀合的抗小鼠揭示Ab作为常用的ELISA工具以获得可作为与分析物浓度成比例的OD读取的发色酶促反应。在没有达到平台和OD信号没有饱和的情况下获得由检测重组大肠杆菌ClpB蛋白质的2pM至150pM范围的7个连续稀释液所产生的OD线性变化。

为了验证所开发的ClpB测定的特异性，我们测量了从大肠杆菌K12WT的10个不同的培养物以及ΔClpB突变型大肠杆菌细菌的培养物中提取的蛋白质样品中ClpB的浓度。ΔClpB突变型菌株和相应的野生型(WT)菌株是由Axel Mogk博士(德国海德堡大学的ZMBH(ZMBH,Heidelberg University,Germany))友情提供的。此外，我们通过WB，使用抗ClpB多克隆兔Ab分析了这些细菌蛋白质样品中ClpB的存在并且比较了WB条带与ELISA中的ClpB浓度之间的信号强度值。在所有野生型大肠杆菌培养物中都检测到ClpB，其中7个培养物具有高于1000pM的ClpB浓度，而ClpB在从ΔClpB大肠杆菌中提取的蛋白质样品中是不可检测的。WB揭示了野生型中预期96 KDa尺寸的主要条带，而在ΔClpB大肠杆菌中则没有。这些条带的OD强度在单个样品之间变化并且与在大肠杆菌培养物的同一些样品中通过ELISA所测量的ClpB浓度呈正相关。因此，在ΔClpB大肠杆菌的蛋白质制品中没有检测到ClpB确认了测定的特异性，并且ELISA与WB之间的良好一致性提供了这两种ClpB免疫检测技术的交叉验证。

为了验证ClpB血浆测定检测源自于肠道细菌的ClpB，我们使用ClpB ELISA来测量小鼠血浆中的ClpB，所述小鼠已经经由每日胃内灌胃3周而被补充有野生型大肠杆菌或ΔClpB大肠杆菌。血浆样品可获自我们先前公开的研究(Tennoune等,2014)。我们发现ClpB通常存在于小鼠血浆中，包括对照和接受不含细菌的培养肉汤灌胃的小鼠这两者在内。重要的是，ClpB血浆水平在接受野生型大肠杆菌的小鼠中增加，但是在被补充以ClpB缺陷型大肠杆菌的小鼠中没有变化，这确认了血浆ClpB的肠道细菌来源。

ClpB ELISA

在4℃使用100μL和于100mM NaHCO₃缓冲液(pH 9.6)中2μg/mL的浓度将兔多克隆抗大肠杆菌ClpB抗体(由比利时哥斯利的Delphi Genetics公司(Delphi Genetics,Gosselies,Belgium)定制生产)包被到96孔Maxisorp板(纽约州罗彻斯特的Nunc公司(Nunc,Rochester,NY))上，持续12小时。将板在含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中洗涤(5分钟×3)。将重组大肠杆菌ClpB蛋白质(由Delphi Genetics公司定制生产)在样品缓冲液(PBS、叠氮化钠0.02％，pH 7.4)中连续稀释到5pM、10pM、25pM、50pM、70pM、100pM以及150pM并且按一式两份添加到孔中以制备标准品。分析物样品包括：来自小鼠和大鼠的结肠粘膜和血浆样品或从大肠杆菌K12培养物中提取的蛋白质。将分析物样品按一式两份添加到其余孔中并且在室温孵育2小时。将板在含有0.05％Tween 20的PBS(pH 7.4)中洗涤(5分钟×3)。将小鼠单克隆抗大肠杆菌ClpB抗体(于样品缓冲液中1:500，由Delphi Genetics公司定制生产)添加到孔中并且在室温孵育90分钟。将板在含有0.05％Tween 20的PBS(pH 7.4)中洗涤(5分钟×3)。将来自杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)(宾夕法尼亚州的西格罗夫(West Grove,PA))的与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(于样品缓冲液中1:2000)添加到孔中并且在室温孵育90分钟。将板在含有0.05％Tween 20的PBS(pH 7.4)中洗涤(5分钟×3)，然后添加100μL的对硝基苯基磷酸酯溶液(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO))作为碱性磷酸酶底物。在室温孵育40分钟之后，通过添加50μL的3N NaOH来停止反应。使用微孔板读数器Metertech 960(台湾台北的Metertech公司(Metertech Inc.,Taipei,Taiwan))在405nm处测定OD。将由没有添加血浆样品或ClpB蛋白质标准稀释液的板的读数所产生的空白对照OD值从样品OD值中减去。

ClpB蛋白质印迹法

使用从大肠杆菌K12中提取的蛋白质进行蛋白质印迹法。将蛋白质样品(10μg)在Tris-甘氨酸缓冲液中在20％丙烯酰胺SDS凝胶上分离并且转移到硝化纤维素膜(法国奥赛的通用电气医疗公司(GE Healthcare,Orsay,France))，在室温将所述硝化纤维素膜用于TBS(10mmol/L Tris(pH 8)；150mmol/L NaCl)加上0.05％(w/v)Tween 20中5％(w/v)的脱脂奶粉封闭至少1小时。然后，在4℃将膜与兔多克隆抗大肠杆菌ClpB抗体(1:2000，DelphiGenetics公司)一起孵育过夜。在5％(w/v)脱脂奶粉于TBS/0.05％Tween 20中的封闭溶液中洗涤三次之后，将膜与过氧化物酶缀合的抗兔IgG(1:3000，圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz Biotechnology))一起孵育1小时。在洗涤三次之后，使用ECL检测试剂盒(通用电气医疗公司)揭示过氧化物酶反应。将蛋白质条带与分子量标准(Precision Plus，伯乐公司)相比较并且使用ImageScanner III(通用电气医疗公司)扫描膜并且使用ImageQuantTL软件7.0(通用电气医疗公司)分析条带像素密度。

在大鼠中肠内施用大肠杆菌蛋白质

动物

动物护理和实验是根据由美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth,USA)确立的指南并且符合法国和欧洲共同体的规定(Official Journal of theEuropean Community(欧洲共同体官方公报)L 358,18/12/1986)。在设备齐全的动物设施中在受调节的环境条件(22℃±1℃，按12小时光-暗循环，在上午7:30时开灯)下将体重200g-250g的雌性斯普拉格-多雷大鼠(Sprague-Dawley rat)(法国勒热内斯圣伊斯尔的让维耶公司(Janvier,Genest-Saint-Isle,France))在笼舍中(每笼3只大鼠)饲养1周以使它们适应笼养条件。标准粒化啮齿类动物饲料(RM1饮食，英国的SDS公司)和饮用水可随意获得。

实验#1

该实验被设计成评价我们的大肠杆菌生长体外模型与肠道中细菌生长的体内情况的相关性。通过氯胺酮(ketamine)(75mg/kg，法国卡罗的维克公司(Virbac,Carros,France))/甲苯噻嗪(xylazine)(5mg/kg，法国勒沃库森的拜耳公司(Bayer,Leverkusen,France))溶液(3:1体积，0.1mL/100g体重，I.P.)使大鼠麻醉。在剖腹术之后，通过放置2个结扎线来移动结肠：第1个结扎线处于盲肠结肠连接部并且第2个结扎线处于下方4cm。使用插入升结肠中并且使用第1个结扎线固定的聚丙烯导管进行结肠输注和管腔内容物取样。将2mL的MH培养基或水平缓地输注到结肠中并且之后立即抽出以测量OD。在测量OD之后，使结肠内容物的整个样品返回到结肠中。在不添加新的MH培养基或水的情况下将这样的结肠内容物取样在前20分钟期间每5分钟重复一次，然后在30分钟和60分钟时重复一次。将细菌密度测量为通过分光光度计的在λ＝600nm处的OD。在第1次输注之前以及第1次输注后30分钟和60分钟从门静脉采集血液样品。在实验结束时从结肠采集粪便样品以用于ClpB的DNA提取和PCR。

实时定量聚合酶链反应

使用CFX 96 q-PCR仪器(加利福尼亚州的伯乐公司)进行定量PCR(qPCR)以分析表达ClpBDNA的细菌的细菌密度。使用QAMP DNA粪便小型试剂盒(荷兰芬洛的快而精公司(QIAGEN Venlo,Netherlands))从大鼠粪便中提取总DNA。qPCR混合物包括5μL的SYBR绿色主混合物(英国西萨塞克斯的QIAgen公司(QIAgen,West Sussex,UK))、0.5μM正向引物和反向引物中的每一种、来自样品的DNA以及水以得到10μL的总体积。所述引物购自英杰公司(Invitrogen)(法国的赛尔齐-蓬多瓦兹(Cergy-Pontoise,France))。将三步PCR进行40个循环。使样品在95℃变性10分钟，在60℃退火2分钟，并且在95℃延伸15秒。

实验#2

该实验旨在评价大肠杆菌蛋白质对体循环中肠肽(GLP-1和PYY)释放的影响。如上文所述使大鼠麻醉并且移动结肠，用在指数期(n＝6)中或在稳定期(n＝6)中提取的大肠杆菌蛋白质(0.1μg/kg蛋白质于2mL PBS中)进行一次结肠输注，持续20分钟。在结肠输注之前和之后20分钟从门静脉采集血液样品以用于GLP-1、PYY以及ClpB的测定。在实验结束时采集结肠粘膜的样品以用于ClpB测定。使用荧光酶免疫测定试剂盒(加利福尼亚州的菲尼克斯医药公司(Phoenix Pharmaceutical Inc.,CA))，根据制造商的说明书进行GLP-1测定和PYY测定。使用微孔板读数器Chameleon(芬兰土尔库的HIDEX公司(HIDEX Inc.,Turku,Finland))在325nm(激发)和420nm(发射)处测量荧光。

在大鼠中施用大肠杆菌蛋白质、食物摄入量以及脑c-fos研究

动物

如上文所述使体重200g-250g的雄性Wistar大鼠(法国勒热内斯圣伊斯尔的让维耶公司)适应笼养条件并且饲喂。在实验前三天，将大鼠转移到单个代谢笼(法国里昂的Tecniplast公司(Tecniplast,Lyon France))中，其中它们被随意饲喂相同的但是呈粉末形式的RM1饮食(SDS公司)。饮用水始终可获得。在适应期期间每日轻微处理大鼠几分钟以使它们习惯于操作。在适应结束时，将大鼠分成三组以达到相似的平均体重并且用于实验1-3中。在相同的大鼠中，以4天时间间隔进行包括食物限制在内的两个实验。在自由摄食大鼠中进行的第3个实验涉及它们的新系列。

实验#1

第一个实验旨在比较在指数期和稳定期中提取的大肠杆菌的膜蛋白的作用。大鼠被剥夺食物过夜(18.00点至10.00点)，而水可随意获得。在食物剥夺之后的第二天，在10.00点腹膜内注射大肠杆菌蛋白质并且大鼠立即回到它们的代谢笼，所述代谢笼容纳预先称重量的食物。在1小时、2小时以及4小时之时测量食物摄入量。第1组大鼠(n＝6)接受于300μL PBS中0.1mg/kg的从指数期中大肠杆菌提取的膜蛋白；第2组大鼠(n＝6)接受0.1mg/kg的从稳定期中大肠杆菌提取的膜蛋白并且对照组(n＝6)接受300μL的PBS。

实验#2

第2个实验旨在比较在指数期和稳定期中提取的大肠杆菌的细胞质蛋白质的作用。使用与实验#1的方案相似的实验方案。

实验#3

该实验被设计成评价总大肠杆菌蛋白质对自由摄食大鼠的食物摄入的作用。在19.30点用在指数期(n＝6)中或在稳定期(n＝6)中提取的大肠杆菌蛋白质(0.1mg/kg蛋白质于300μL PBS中，I.P.)或作为对照的单独的PBS(n＝6)进行注射并且使动物回到它们的代谢笼中，所述代谢笼容纳预先称重量的食物。在2小时之后测量累积食物摄入量。之后立即通过戊巴比妥钠(0.2mg/kg，I.P.)使大鼠麻醉并且灌注以进行脑中c-fos表达的免疫组织化学研究。

组织制备和免疫组织化学

将脑通过灌注/浸泡在4％多聚甲醛中固定，冷冻并且在低温恒温器(法国南泰尔的徕卡显微系统公司(Leica Microsystems,Nanterre,France))上切割(14μm)，然后使用酪胺信号放大(TSA)加上荧光素试剂盒(马萨诸塞州波士顿的NEN公司(NEN,Boston,MA))处理以用于免疫组织化学。对于单染色，使用针对c-fos的兔多克隆抗血清(1:4,000，Ab-5，Calbiochem，德国达姆施塔特的默克集团(Merck KGaA,Darmstadt,Germany))。对于双重染色，在TSA之后，使用以下各项来应用直接免疫荧光技术：针对β-内啡肽(β-end)的兔单克隆抗体(1:1,000，马里兰州弗雷德里克的生命技术公司(Life Technologies,Frederick,MD))，它是通过抗兔花菁-3抗体(1:200，宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究公司)揭示的；或针对降钙素基因相关肽(CGRP)的小鼠单克隆IgG(1:1,000，德克萨斯州的圣克鲁斯生物技术公司)，它是通过抗小鼠罗丹明红缀合的抗体(1:200，杰克逊免疫研究公司)揭示的。在下丘脑弓状核和腹内侧核中和在杏仁核的中央核中，以×20放大倍数从六个连续切片对阳性细胞进行计数。使用每只大鼠的平均阳性细胞数来计算组平均值。在AdobePhotoshop 6.0软件(加利福尼亚州圣荷西的Adobe系统公司(Adobe Systems,San Jose,CA))中将数字图像针对亮度和对比度进行优化。

在小鼠中长期施用大肠杆菌蛋白质

两个月大的雄性C57Bl6小鼠(n＝32)购自让维耶实验室公司(Janvier Labs)并且用12小时光-暗循环(在8:00开灯)使其适应动物设施1周。然后，将小鼠单独地放置在BioDAQ小鼠笼舍(新泽西州新不伦瑞克的研究饮食公司(Research Diets,Inc.,NewBrunswick,NJ))中，每一个笼舍配备有自动摄食监测器。在适应BioDAQ笼舍3天之后，将小鼠分成三组(n＝8)，每一组接受不同的处理，所述处理由在9:00和18:30时每日两次腹膜内注射以下任一项：(i)PBS；(ii)在指数期中提取的细菌蛋白质(每公斤体重0.1mg)；(iii)在稳定期中提取的细菌蛋白质(每公斤体重0.1mg)。食物(法国蒙塔泰尔的SERLAB公司(SERLAB,Montataire,France))和饮用水可随意获得并且每日测量体重。连续地监测饲喂数据一周并且使用BioDAQ数据查看器2.3.07(研究饮食公司)分析。对于膳食模式分析，进餐间时间间隔被设定为300秒。饱腹感比率被计算为进餐后时间间隔的时间(秒)除以在前一次进餐时食用的食物量(g)。在实验之后，通过断头处死小鼠；取出脑并且解剖下丘脑以用于神经肽mRNA微阵列。

下丘脑神经肽mRNA微阵列

使用RNA II试剂盒(德国迪伦的马歇雷-纳格尔公司(Macherey-Nagel,Düren,Germany))，遵循制造商的方案从接受大肠杆菌蛋白质的长期施用的小鼠的下丘脑中提取总RNA。使用ImProm-IITM逆转录系统试剂盒(威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))在42℃将消化的RNA逆转录60分钟。将所获得的cDNA用于实时PCR反应中。使用Primer express软件(法国圣欧班的生命技术公司(Life Technologies,Saint-Aubin,France))设计一组9个引物对并且验证效率和特异性。用Bravo液体处理系统(安捷伦公司)将PCR反应物分配在96孔板中并且用QuantStudio 12K Flex(生命技术公司)扩增，所述PCR反应物由6μL的cDNA和含有100nM浓度的特异性反向引物和正向引物的6μL快速SYBR绿色主混合物(生命技术公司)构成。使用参考基因信号，针对输入mRNA的量的变化，在内部校正靶基因的cDNA产生的信号。然后将基因表达水平与相应对照样品组相比较，并且使用2^-ΔΔCq法确定调节作用。

电生理记录

如先前所述(Fioramonti等,2007)，由成年POMC-eGFP小鼠(5周-7周大；Ref：C57BL/6J-Tg(Pomc-EGFP)1Low/J，杰克逊实验室公司)制备脑切片(250μm)。在室温将切片在含有以下各项(以mM为单位)的充氧细胞外培养基中孵育至少60分钟恢复期：118NaCl、3KCl、1MgCl₂、25NaHCO₃、1.2NaH₂PO₄、1.5CaCl₂、5HEPES、2.5D-葡萄糖(使用蔗糖将渗透压调节到310mOsM，pH7.4)。一旦处于记录室中，就用相同的细胞外培养基以2毫升/分钟至3毫升/分钟灌注切片。使用配备荧光(荧光素滤光片)和IR-DIC视频显微镜的Nikon显微镜EF600(马恩河畔尚皮尼的尼康法国公司(NikonFrance,Champigny sur Marne))观察切片。使用×40水浸物镜(尼康公司)和荧光摄像机(尼康公司)将活的ARC POMC神经元可视化。将硼硅酸盐吸管(4M-6M；1.5mm OD，加利福尼亚州诺瓦托的萨特仪器公司(SutterInstruments,Novato,CA))填充以过滤的细胞外培养基。使用Multiclamp 700B放大器进行细胞贴附式记录，使用Digidata 1440A接口数字化并且使用pClamp 10.3软件(AxonInstruments，加利福尼亚州桑尼维尔的分子装置公司(Molecular Devices,Sunnyvale,CA))以3kHz采集。吸管和细胞电容被充分补偿。在建立稳定基线之后，将1nM的ClpB(DelphiGenetics公司)灌注5分钟-10分钟。在ClpB灌注的最后3分钟内、在灌注之后7分钟-10分钟内测量POMC神经元的放电率并且与在灌注前3分钟测量的放电率相比较。

统计分析

分析数据并且使用GraphPad Prism 5.02(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA))绘制图表。通过柯尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)评价正态性。通过方差分析(ANOVA)或非参数克鲁斯凯-沃利斯(K-W)检验和图凯氏或邓恩氏事后检验，根据正态性结果来分析组间差异。在适当的情况下，使用司图顿氏t检验和皮尔森氏相关性(Pearson's correlations)或曼-惠特尼(M-W)检验，根据正态性结果比较单个组。使用重复测量(RM)方差分析和邦费罗尼事后检验分析连续实验的效果。数据被显示为平均值±平均值的标准误差(s.e.m)，并且对于所有检验，p≤0.05被认为具有统计显著性。

结果

在定期营养素提供之后的大肠杆菌生长在向大肠杆菌培养物第1次提供穆勒-海顿(MH)营养培养基之后，观测到细菌生长的三个阶段：1)2小时的滞后期；2)4小时的指数生长期；以及3)稳定期，其中0.35光密度(OD)保持稳定6小时。在第3次和第5次MH培养基供应之后，仅发现两个生长阶段：指数期和稳定期，第1阶段在提供营养素之后立即开始。每一个新的供养循环的特征在于指数生长期的持续时间更短：在第3次提供之后是2小时以及在第5次提供之后是20分钟。在第5次提供营养素之后，提取细菌蛋白质并且分离成用于蛋白质组学分析和在禁食大鼠中进行的体内实验的膜级分和细胞质级分。在新的实验中，为了验证持续的定期营养素提供是否可以进一步加速细菌生长的动力学，向大肠杆菌K12供应营养素9次。我们发现在第7次和第9次提供营养素之后，指数生长期没有进一步变化，持续20分钟，其中OD有相同的(Δ0.3)相对增加，这反映了在每一次供应营养素之后相同的细菌生长。根据麦克法兰标准(McFarland standard)，0.3OD的增加对应于10⁸个-10⁹个细菌的增量。在第9次提供营养素之后，在指数期和稳定期中提取细菌蛋白质，分别显示出0.088mg/mL和0.15mg/mL的总蛋白浓度。测试所提取的蛋白质的ClpB水平并且所述蛋白质已经被用于ATP产生测定和体内实验中，包括在自由摄食的小鼠和大鼠中进行结肠内输注和全身注射，继而在脑中进行c-fos检测。

蛋白质组学分析

为了分析蛋白质表达谱是否根据营养素诱导的细菌生长阶段而变化，单独地对在第5次添加MH培养基之后10分钟和2.3小时(分别对应于指数期和稳定期)提取的大肠杆菌K12蛋白质的膜级分和细胞质级分进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)。所检测的蛋白质点的总数是2895个(1367个膜和1528个细胞质)。

比较指数期与稳定期之间膜蛋白的2D-PAGE揭示了20种差异(相差至少1.5倍)表达的蛋白质。在它们当中，17种蛋白质在指数期中显示出表达增加并且15种是通过质谱鉴定的。比较细胞质蛋白质的2D-PAGE显示出20种差异(相差至少1.5倍)表达的蛋白质。与膜蛋白相反，大部分(19种)细胞质蛋白质在稳定期期间显示出表达增加。只有对应于鞭毛蛋白的一个蛋白质点在指数期中具有更高的表达。大部分所鉴定的蛋白质牵涉到合成代谢或分解代谢过程，这证实了在这两个生长阶段中总体混合代谢谱。

在体外大肠杆菌蛋白质的ATP产生

为了研究在生长阶段期间细菌蛋白质组变化是否可能影响它们的能量提取能力，在体外测试指数期和稳定期的大肠杆菌K12蛋白质的来自营养素的ATP产生。我们发现来自这两个生长阶段的蛋白质能够增加来自不同能量源的ATP产生。与蔗糖溶液相比，当使用含有蛋白质的混合能量源，如MH培养基时，ATP浓度更高。ATP产生以剂量依赖性方式随细菌蛋白质的浓度而增加，然而，在来自指数期或稳定期的蛋白质的ATP产生作用之间没有发现显著性差异。

大肠杆菌在体外的ClpB产生

我们开发和验证了用于检测大肠杆菌ClpB的酶联免疫吸附测定(ELISA)，它已经被用于该研究中。在4个单独的大肠杆菌K12培养物中研究在细菌生长阶段之间ClpB蛋白质产生是否是不同的。蛋白质印迹法在所有蛋白质制品中都检测到ClpB相应的96kDa条带，在稳定期期间水平增加。已经在相同的细菌蛋白质制品中使用ClpBELISA进一步确认了这些变化，这证实在稳定期中ClpB浓度几乎加倍。

营养素和大肠杆菌蛋白质的肠道输注

为了验证我们的营养素诱导的大肠杆菌生长的体外模型是否与体内肠道细菌生长动力学有关，将MH培养基或水输注到麻醉大鼠的结肠中。我们发现滴注MH培养基诱导肠道中的细菌增殖，而滴注水则不是这样，其中指数生长期持续20分钟，这与体外数据一致。在门静脉中测量的血浆ClpB水平在MH输注之后30分钟或60分钟没有显著差异。然而，血浆ClpB浓度与粪便中的ClpBDNA含量呈正相关。

随后，为了确定大肠杆菌蛋白质组的生长依赖性变化是否可能在肠道局部影响食欲控制的宿主机制，在单独的实验中，麻醉的大鼠接受来自指数期或稳定期的大肠杆菌蛋白质(均是0.1mg/kg)的20分钟结肠输注。在输注之后20分钟测量的结肠粘膜中ClpB的浓度在接受稳定期蛋白质的大鼠中是更高的，然而，ClpB的血浆水平不受来自指数期或稳定期的细菌蛋白质的影响。与我们的假设相一致，即大肠杆菌蛋白质对宿主食欲信号转导的作用可能取决于细菌生长阶段，我们发现结肠滴注来自指数期的大肠杆菌蛋白质刺激GLP-1的血浆水平，而来自稳定期的大肠杆菌蛋白质则不是这样，并且相反，在输注来自稳定期的蛋白质之后检测到PYY的血浆水平增加，而来自指数期的蛋白质则不是这样。

在大鼠中急性大肠杆菌蛋白质施用之后的食物摄入量和脑c-fos

由于ClpB存在于所有所测试的大鼠和小鼠的血浆中，因此有可能血浆大肠杆菌蛋白质可能经由它们的全身作用来影响食欲并且这样的作用对于与细菌生长阶段相关的蛋白质可能是不同的。通过在过夜禁食的大鼠中测试这种可能性，我们发现与对照组相比，单次腹膜内(I.P.)施用(每公斤体重0.1mg)在稳定期中提取的大肠杆菌蛋白质的膜级分减少了在重新饲喂期间1小时和2小时的食物摄入量。相反，施用在指数期中提取的大肠杆菌蛋白质的细胞质级分(每公斤体重0.1mg，I.P.)增加了在重新饲喂期间4小时的食物摄入量。

为了进一步研究大肠杆菌总蛋白是否可能以生长阶段依赖性方式影响自发的食物摄入并且激活中枢部位，如ARC，在黑暗阶段开始之前向自由摄食的大鼠注射细菌蛋白质(每公斤体重0.1mg，I.P.)。在注射后测量食物摄入量2小时，然后处死大鼠以分析脑中c-fos的表达。我们发现接受来自稳定期的细菌蛋白质注射的大鼠进食少于对照，而食物摄入量不受来自指数期的细菌蛋白质的注射的显著影响。

在向自由摄食的大鼠腹膜内注射大肠杆菌蛋白质之后两小时，在下丘脑的ARC和腹内侧核(VMN)中以及在CeA中免疫组织化学分析c-fos表达。在接受来自稳定期的细菌蛋白质的小鼠的ARC和VMN中发现c-fos阳性细胞数增加。ARC中大部分表达c-fos的细胞含有β-内啡肽(对照：71.31％±12.81％；大肠杆菌指数期：73.56％±10.45％；大肠杆菌稳定期：80.50％±9.68％，方差分析，p＝0.36)，即被鉴定为食欲减退型POMC神经元。因此，ARC中其余c-fos神经元的百分比在组间没有显著差异(对照：28.69％±12.81％；大肠杆菌指数期：26.44％±10.45％；大肠杆菌稳定期：19.5％±9.68％，方差分析，p＝0.36)。尽管β-内啡肽阳性细胞的总数在组间没有显著差异(对照：54.82个±10.67个细胞；大肠杆菌指数期：66.03个±11.43个细胞；大肠杆菌稳定期：66.03个±5.06个细胞，方差分析，p＝0.09)，但是与对照和接受指数期蛋白质的大鼠相比，在接受稳定期蛋白质的大鼠中激活的β-内啡肽神经元的相对数目增加。此外，激活的β-内啡肽神经元的数目与食物摄入量呈反相关(皮尔森氏r＝-0.57，p＝0.018)。

在CeA中，与其它两个组相比，c-fos阳性细胞的数目在接受来自稳定期的蛋白质注射的大鼠中增加。CeA中几乎所有的c-fos阳性细胞均被表型分析为表达CGRP的神经元(对照：100％±0.01％；大肠杆菌指数期：100％±0.01％；大肠杆菌稳定期：100％±0.01％，方差分析，p＝0.92)。尽管CeA中CGRP阳性神经元的总数在组间是相似的(对照：123.8个±13.15个细胞；大肠杆菌指数期：118.3个±25.59个细胞；大肠杆菌稳定期：126.1个±6.64个细胞，方差分析，p＝0.85)，但是c-fos激活的CGRP神经元的百分比仅在接受稳定期蛋白质的大鼠中增加。CGRP神经元的激活与食物摄入量呈反相关(皮尔森氏r＝-0.89，p＝0.001)。

在小鼠中长期大肠杆菌蛋白质注射之后的摄食模式和下丘脑神经肽

为了确定细菌蛋白质是否可能影响摄食模式，向自由摄食的小鼠施用大肠杆菌总蛋白(每公斤体重0.1mg，I.P.)的每日两次注射，持续一周。在注射后的第一天的特征在于与对照相比，接受来自稳定期的细菌蛋白质的小鼠的体重和食物摄入量显著更低，但是接受来自指数期的细菌蛋白质的小鼠不是这样。尽管每日进餐量在组间没有显著差异，但是在一周以后，在接受稳定期蛋白质的小鼠中观测到它相对于注射前一天减少。进餐频率在组间没有显著差异，尽管在接受来自稳定期的细菌蛋白质的小鼠中观测到增加的趋势。尽管在6天注射期间，在3个组之间总食物摄入量没有显著差异，但是单独地针对光照阶段和黑暗阶段对它进行分析显示接受指数期蛋白质注射的小鼠在光照阶段期间具有增加的食物摄入量，但是它在黑暗阶段期间减少。相反，接受稳定期蛋白质的小鼠在黑暗阶段显示出低于对照的食物摄入量，而在光照阶段中没有任何作用。在注射后的第一天，在接受来自稳定期的蛋白质的小鼠中饱腹感比率增加，并且同一组在一周以后显示出降低的趋势。

为了深入了解在细菌蛋白质注射6天之后观测到的改变的摄食模式的潜在分子变化，我们分析了涉及食欲控制的几种神经肽的下丘脑mRNA表达水平。我们发现接受稳定期蛋白质的小鼠显示出与对照相比脑源性神经营养因子(BDNF)和食欲素二者的前体mRNA水平升高，以及与接受指数期蛋白质注射的小鼠相比促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的前体mRNA水平升高，所述接受指数期蛋白质注射的小鼠也显示出BDNF的水平升高，但是QRFP的水平降低。

ClpB对下丘脑POMC神经元的电生理激活

为了确定ClpB作为在静止生长期中上调的大肠杆菌蛋白质标志物和α-MSH的模拟物是否激活ARC POMC神经元，使用细胞贴附式膜片钳电生理学在来自POMC-eGFP小鼠的脑切片上研究ClpB作用。ClpB(1nM)的浴槽施加使约50％的ARC POMC神经元(n＝7/13)的动作电位频率增加了229％±109％(基础：2.02Hz±0.78Hz相比于ClpB：3.82Hz±1.36Hz)，如图2中所示。一般来说，POMC神经元没有完全恢复到它们的基础放电率直到在施加ClpB之后至少10分钟为止。

这些结果因此表明了ClpB蛋白质对饱足感和饱腹感的直接作用。

讨论

我们的研究揭示了细菌蛋白质可以在生理学上使肠道细菌与宿主对食欲的控制相关联，包括它分别与肠道中营养素诱导的细菌生长和它们的全身作用相关的短期机制和长期机制。以下主要结果支持了该结论：1)定期提供营养素加速和稳定了持续20分钟的大肠杆菌的指数生长，这与体内数据一致；2)大肠杆菌的静止生长期的特征在于总细菌蛋白质含量增加和不同的蛋白质组谱，包括ClpB增加；3)来自这两个生长阶段的大肠杆菌蛋白质剂量依赖性地刺激体外ATP产生；4)在肠道中营养素诱导的细菌生长之后ClpB的血浆水平没有变化，但是与肠道微生物群中的ClpB DNA具有相关性；5)肠道输注来自指数生长期和静止生长期的大肠杆菌蛋白质分别刺激血浆GLP-1和PYY。6)只有来自稳定期的蛋白质的大肠杆菌蛋白质的全身注射显著减少了食物摄入量，伴有食欲减退型ARC神经元和CeA神经元中的c-fos激活；以及最终7)ClpB刺激ARC POMC神经元的放电率。

定期提供营养素和细菌生长

在定殖人类胃肠道的多种细菌中，大肠杆菌是最丰富的兼性厌氧菌，这证明了它作为共生肠道细菌的模型生物体的合理性(Foucault等,2009)。在此，我们发现在定期营养素供应期间大肠杆菌改变了它们的生长动力学，在第5个供养循环之后，引起了持续20分钟的即时指数生长，继而是稳定期。然后在下次提供营养素之后，所述生长周期同样地再现，这表明它可以起到细菌机制内在设置的引发因素的作用。在大鼠结肠中观察到细菌生长响应于营养素输注的类似的动力学，这支持了我们的体外数据可以与体内情况有关，例如定期进餐的人类的体内情况。10⁸个-10⁹个的细菌数增量在每一次新的提供之后保持稳定，这表明细菌生物质相应的稳定产生，包括肠道中蛋白质含量增加，可以起到宿主的膳食诱导的调节因素的作用。鉴于人类的平均进餐阶段类似于定期供养的细菌的指数生长的持续时间，促使人推测宿主饱腹感可以由在与摄入的营养素接触之后20分钟达到稳定期的肠道细菌触发。然而，胃肠道中的细菌含量从胃中的10³个到结肠中的10¹²个变动。此外，摄入的营养素前进通过胃和小肠需要约2小时并且通过大肠需要约10小时。由于这样的向大部分肠道细菌递送营养素的延迟，因此很可能除了与营养素推注直接接触之外，在进餐阶段期间的细菌生长也可能由通过对摄入的巴甫洛夫(Pavlovian)头部反射而释放到肠道内腔中的营养素所引发。

在生长阶段期间的细菌蛋白质表达和肠道感受

由于定期供养的大肠杆菌的生长动力学可以与宿主进餐阶段和餐后阶段有关，因此我们研究了细菌蛋白质的表达是否可以潜在地使肠道细菌与宿主食欲的控制相关联。首先，我们比较了指数生长期与静止生长期中大肠杆菌的蛋白质组。对于该分析，在指数期的中间，即在提供营养素之后10分钟以及在2小时后的稳定期(通常以感到饱腹感为特征的时间)提取大肠杆菌蛋白质。在两个生长阶段之间发现至少40种差异表达的蛋白质确认了它们不仅在定量上在蛋白质含量方面不同，而且在定性上也不同，所述蛋白质含量在细菌增殖之后几乎加倍。然后研究改变的蛋白质表达谱与宿主食欲的控制的可能相关性：i)通过比较细菌蛋白质产生能量底物的能力；以及ii)通过确定细菌蛋白质对食欲调节途径的可能的直接作用。后一种可能性由最近蛋白质组学鉴定大肠杆菌ClpB为α-MSH的构象蛋白质模拟物所支持(Tennoune等,2014)；所述数据验证了我们早先的假设，即显示出与食欲减退肽或促进食欲肽同源的表位的肠道细菌蛋白质可能引起交叉反应性自身抗体的产生(Fetissov等,2008)。因此，可以设想的是，这样的细菌模拟蛋白质的组合可以直接影响食欲，这取决于与细菌生长阶段相关的蛋白质表达谱。通过分析大肠杆菌培养物和肠粘膜，我们发现ClpB水平增加与静止生长期相关。ClpB增加因此可以促进在营养素诱导的大肠杆菌增殖和细菌蛋白质产生增加之后食欲减退途径的激活。一个重要的问题是诸如ClpB的细菌蛋白质可能在何处作用于食欲调节途径。

尽管细菌蛋白质存在于肠粘膜中(Haange等,2012)，但是它们通过肠道屏障的途径尚未被充分研究(Lim和Rowley,1985)。在理论上，在肠道中自发和诱导的细菌裂解之后(Rice和Bayles,2008)，细菌组分可以通过在肠上皮细胞中吸收和通过细胞旁扩散(由肠神经系统调节)而穿过粘膜上皮屏障(Neunlist等,2012)。举例来说，在革兰氏阴性细菌裂解时释放的脂多糖(LPS)天然存在于健康人类和小鼠的血浆中，在食用高脂饮食之后具有更高的基础水平(Cani等,2007)。LPS血浆水平也在餐后增加(Harte等,2012)，但是关于细菌蛋白质不存在这样的数据。在此，我们证实在肠道中细菌增殖之后或在肠道输注细菌蛋白质之后大鼠的血浆ClpB水平保持稳定。这表明血浆ClpB和存在于血浆中的最有可能的其它细菌蛋白质不受营养素诱导的细菌增殖的急剧影响，并且因此，它们不能参与向脑的短期饱腹感信号转导。

然而，血浆ClpB浓度与肠道微生物群中的ClpBDNA具有相关性，这表明ClpB产生细菌的数目可能是引起血浆ClpB水平的长期维持的主要因素，所述数目在长期应当相对独立于它与营养素驱动的细菌生长相关的波动。该结论进一步得到了我们对于ClpBELISA的验证所获得的数据的支持，所述数据显示在接受大肠杆菌长期灌胃的小鼠中血浆ClpB浓度增加，而在接受ClpB突变型大肠杆菌的小鼠中则不是这样。因此，有可能的是，包括ClpB在内的存在于血浆中的肠道细菌蛋白质可以起全身作用，从而使肠道微生物群的组成与能量代谢的长期控制相关联。

大肠杆菌蛋白质对体外ATP产生的作用

通过食物链进行能量交换代表了所有生物体之间的普遍联系(Yun等,2006)。ATP源自于细菌和动物这两者的营养素分解代谢，用作合成代谢过程的主要能量底物。动物可以经由腺苷-5'-单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)的活性感受到ATP的变化，从而在ATP水平较低时，增加食物摄入量，并且反之亦然(Dzamko和Steinberg,2009)。因此，在本研究工作中，我们比较了指数期和稳定期中的大肠杆菌蛋白质在体外产生ATP的能力。实际上，许多所鉴定的蛋白质显示出合成代谢特性或分解代谢特性。我们发现大肠杆菌蛋白质能够在体外刺激ATP产生，这表明它们可以在肠道中细菌裂解之后继续催化ATP产生。尽管在来自指数期和稳定期的蛋白质之间没有发现产生ATP的能力的差异，但是细菌蛋白质浓度依赖性ATP产生表明在营养素诱导的细菌增殖之后细菌蛋白质含量增加应当引起更高的ATP合成。肠道微生物群的效率与收获能量以用于宿主代谢的相关性先前已经通过比较肥胖和消瘦的人类和小鼠来建立(Turnbaugh等,2006)。我们的数据通过证实大肠杆菌蛋白质产生ATP的能力进一步确证了这些结果。还表明了膳食诱导的细菌增殖可能引起肠道ATP增加，这应当有助于管腔感受能量可用性和肠道舒张(Glasgow等,1998)。

大肠杆菌蛋白质对饱腹感激素的肠道作用

随后，我们研究了肠道中的大肠杆菌蛋白质是否可以刺激诸如GLP-1和PYY的肠道饱腹感激素的全身释放(Adrian等,1985；Batterham等,2002；Beglinger和Degen,2006；Flint等,1998)。实际上，这两种激素是由存在于整个肠中并且在结肠中丰富的相同或不同的肠内分泌L-细胞产生(Eissele等,1992)，并且因此，L-细胞直接暴露于细菌蛋白质。我们发现大肠杆菌蛋白质对GLP-1释放和PYY释放的差异作用，显示来自指数生长期的蛋白质刺激GLP-1而来自静止生长期的蛋白质刺激PYY。这些结果表明了营养素诱导的细菌生长与膳食诱导的GLP-1和PYY释放的已知动力学之间的一些相似性。实际上，如在人类中所显示的那样，血浆GLP-1的急性峰值在胃内输注液体膳食之后15分钟出现，而持续时间更长的升高的血浆PYY在进餐之后15分钟与30分钟之间开始(Edwards等,1999；Gerspach等,2011)。GLP-1的更长时间释放与脂肪摄入有关(van der Klaauw等,2013)。因此，定期供养的肠道细菌的生长动力学在时间上符合GLP-1和PYY释放的动力学，这表明了肠道细菌，特别是大肠杆菌蛋白质在膳食诱导的肠道饱腹感信号转导中的诱导作用。来自指数期的大肠杆菌蛋白质刺激GLP-1的差异作用可能反映GLP-1在血糖控制中的肠促胰岛素作用(Edwards等,1999；Steinert等,2014)。最近对由L-细胞表达的功能性MC4R的证实(Panaro等,2014)为它们可能由α-MSH模拟细菌蛋白质激活提供了背景。在大肠杆菌稳定期期间ClpB的产生增加以及肠粘膜中的ClpB水平升高与血浆PYY水平增加相关，这表明了ClpB在激活结肠中的产生PYY的L-细胞中的直接作用。另一方面，在指数生长期期间可能上调的到目前为止未鉴定的大肠杆菌蛋白质可能优先刺激GLP-1分泌。

大肠杆菌蛋白质对食物摄入量和食欲调节脑途径的全身作用

我们在此证实了向饥饿的或自由摄食的大鼠和自由摄食的小鼠外周注射大肠杆菌蛋白质改变了它们的食物摄入量，这取决于大肠杆菌的生长阶段。考虑到血浆ClpB不受营养素的肠道输注的影响，但是在短时间内是稳定的，细菌蛋白质的全身作用应当被解释为与它们对食欲的长期调节作用有关。此外，由于指数期的持续时间较短，因此在持久的稳定期期间上调的细菌蛋白质应当在血浆中占优势，并且因此，它们的全身施用能更好地代表生理情况。在这些实验中使用的大肠杆菌蛋白质的0.1mg/kg浓度与在人类或啮齿类动物中外周施用之后诸如瘦素或PYY的肽激素的有效致饱腹感剂量相似(Batterham等,2002；Halaas等,1995；Heymsfield等,1999)。

在施用来自指数期的细胞质蛋白质之后观测到在光照阶段重新饲喂期间饥饿大鼠的食物摄入量增加并且来自稳定期的膜蛋白使食物摄入量减少。该实验确认了来自相同细菌的不同蛋白质混合物能够通过它们的全身作用增加或减少食物摄入量。然而，在更为生理的环境下，通过测试在黑暗阶段在自由摄食的大鼠中总大肠杆菌蛋白质的作用，仅观测到食物摄入量减少，这是由来自稳定期的蛋白质诱导的。

在自由摄食的小鼠中重复注射的结果进一步支持了大肠杆菌蛋白质促进负能量平衡的作用。实际上，细菌蛋白质注射的第一天伴随有食物摄入量和体重减少，这在接受稳定期蛋白质的小鼠中是显著的并且这些小鼠的特征还在于饱腹感比率增加。尽管这些小鼠的食物摄入量在之后恢复正常，但是进餐量逐渐减少，伴随进餐频率增加，这最有可能是维持食物摄入量的代偿机制(Meguid等,1998)。此外，在光照阶段和黑暗阶段期间观测到大肠杆菌蛋白质的差异作用。因此，在下丘脑中食欲调节神经肽的mRNA表达的模式显示出伴有食欲减退途径和促进食欲途径这两者的激活的混合响应。值得注意的是，这两组接受大肠杆菌蛋白质的小鼠显示出相似的BDNF mRNA增加，所述BDNF mRNA是VMN中MC4R下游的食欲减退途径(Xu等,2003)。该途径可能是在这两组中所观测到的在黑暗阶段期间食物摄入量减少的基础，并且所述食物摄入量减少在接受指数期蛋白质注射的小鼠中进一步加重，这显示出促进食欲的QRFP(Chartrel等,2003)和NPY(Herzog,2003)的水平更低。相反，接受来自稳定期的细菌蛋白质的小鼠显示出具有升高的CRH mRNA水平的增强的食欲减退谱，这最有可能牵涉到表达MC4R的PVN神经元(Lu等,2003)。这些变化与刺激进餐频率的食欲素A的mRNA前体表达增加(Baird等,2009)的组合可以在这些小鼠中在注射6天之后分别有助于进餐量和饱腹感比率减少。

与我们的假设一致，即在稳定期期间产生的细菌蛋白质可以激活一些关键的中枢食欲减退途径，我们发现在自由摄食的大鼠中，食欲减退型ARC POMC神经元中以及VMN中的c-fos表达增加，所述VMN一直以来被称为饱腹中枢并且与ARC POMC神经元相互连接(Sternson等,2005)。所获得的c-fos模式类似于在食物摄入期间(Johnstone等,2006)或由诸如PYY或胰多肽的饱腹感激素所诱导(Batterham等,2002；Challis等,2004；Lin等,2009)的致饱腹感响应的c-fos模式。相对少数量(约10％)的c-fos激活的POMC神经元表明循环大肠杆菌蛋白质可能经由这些下丘脑途径发挥作用对食欲和体重具有调节作用。尽管测定NPY/AgRP神经元对c-fos的激活是不可行的，但是它们对细菌蛋白质信号转导的影响不能被排除；这些神经元还表达MC3R和MC4R(Mounien等,2005)。此外，CeA CGRP神经元中c-fos的激活强于ARC POMC中c-fos的激活(强约40％)可能意味着来自ARC POMC神经元和NPY/AgRP神经元以及可能来自本文没有分析的其它食欲调节脑区域(如孤束核)的汇聚下游作用。

最终，为了确定细菌蛋白质对食欲调节脑部位，如ARC POMC神经元的激活是否可能由它们的局部作用所引起，我们研究了在这些神经元上施用ClpB是否可以激活它们的电活动。我们的结果显示约一半所研究的神经元增加了它们的动作电位频率，从而保持激活至少10分钟。ClpB的持续作用与α-MSH对表达功能性MC3R和MC4R的POMC神经元的作用是一致的(Smith等,2007)，这表明了ClpB可以是下丘脑POMC神经元的生理激活剂，有点类似于致饱腹感PYY和瘦素(Batterham等,2002；Cowley等,2001)。然而，我们不知道ClpB能够直接还是经由局部网络激活POMC神经元。

综上所述，这些数据支持了在静止生长期中表达增加的全身存在的大肠杆菌蛋白质，如ClpB在经由激活脑食欲减退途径来促进负能量平衡中的作用。还表明了产生低丰度或高丰度的大肠杆菌以及可能的来自肠杆菌科的其它细菌的微生物群组成变化可能分别以正向方式或负向方式影响宿主能量平衡。

实施例2

该实施例证实了表达ClpB的细菌对食物摄入量的作用。

如上文所述使一个月大的雄性C57Bl6小鼠(让维耶实验室公司)适应动物设施1周并且维持。如下将小鼠分成3组：(i)接受10⁸个大肠杆菌K12细菌(表达ClpB)灌胃；(ii)接受10⁸个ClpB缺陷型大肠杆菌K12细菌灌胃；(iii)以及没有接受任何处理的对照。ClpB突变株是在Bernd Bukau的实验室(德国海德堡的海德堡大学的ZMBH)中产生的并且连同相应的野生型(WT)大肠杆菌细菌一起由Axel Mogk博士友情提供。将小鼠单独地放置到BioDAQ笼舍(研究饮食公司)中并且在黑暗阶段开始之前用含有细菌的0.5mL LB培养基每日胃内灌胃21天。在接受野生型大肠杆菌的小鼠中，灌胃的前几天伴随有体重和食物摄入量的减少，这与不表达ClpB蛋白质的细菌相反(图1)。

实施例3

该实施例证实了表达ClpB的细菌对肥胖ob/ob小鼠的作用。

如上文所述使遗传肥胖ob/ob小鼠适应动物设施1周并且维持。用以下各项向小鼠胃内灌胃：(i)10⁸个大肠杆菌K12细菌(表达ClpB)；(ii)10⁸个ClpB缺陷型大肠杆菌K12细菌；这两者均于米勒-希尔顿(MH)培养基中；或(iii)单独的MH培养基作为对照。ClpB突变株是在Bernd Bukau的实验室(德国海德堡的海德堡大学的ZMBH)中产生的并且连同相应的野生型(WT)大肠杆菌细菌一起由Axel Mogk博士友情提供。将小鼠单独地放置到BioDAQ笼舍(研究饮食公司)中并且如所示每日胃内灌胃，历经21天。

本申请的发明人证实用大肠杆菌K12野生型细菌灌胃使得体重增加减少56％(图3和图4)、脂肪质量/瘦体质量比降低(图5和图6)以及总食物摄入量减少20％(图7和图8)，这在ClpB缺陷型大肠杆菌K12细菌的情况下没有被观测到。

实施例4

该实施例证实了表达ClpB的其它细菌菌株对肥胖ob/ob小鼠的作用。

如上文所述使遗传肥胖ob/ob小鼠适应动物设施1周并且维持。用以下各项向小鼠胃内灌胃：(i)10⁸个大肠杆菌K12细菌(表达ClpB)；(ii)10⁸个大肠杆菌Niessle 1917细菌(表达ClpB)；(iii)呈冻干形式的10⁸个大肠杆菌Niessle 1917细菌(表达ClpB)；所有都于米勒-希尔顿(MH)培养基中；或(iv)单独的MH培养基作为对照。如所示每日向小鼠胃内灌胃，历经14天。

本申请的发明人证实用表达ClpB的任何大肠杆菌细菌菌株灌胃均使得体重增加减少(图9和图10)以及脂肪含量减少(图11)。

实施例5

该实施例确认了ClpB的直接致饱腹感作用。

在对接受ClpB的脑室内(ICV)注射的大鼠进行的动物研究中表明了ClpB经由下丘脑MCR受体家族对摄食行为的可能的作用。

在专门的装有空调设备的动物设施中以12小时:12小时光-暗循环(光照阶段：7点-19点)将斯普拉格-多雷雄性大鼠(200g-250g)(法国拉尔布雷勒的让维耶公司(Janvier,L'Arbresle,France))维持在24℃。用标准粒化饲料(RM1饮食，英国埃塞克斯郡的SDS公司)饲喂大鼠。饮用水始终可随意获得。

为了植入不锈钢插管(C311GA，外径0.9mm，内径0.58mm，弗吉尼亚州罗阿诺克的Plastics One公司(Plastics One,Roanoke,VA))，通过腹膜内注射氯胺酮(75mg/kg)/甲苯噻嗪(5mg/kg)混合物(3:1体积，0.1mL/100g体重)使大鼠麻醉并且放入用于大鼠和小鼠的新标准立体定位仪(爱尔兰都柏林的Stoelting欧洲公司(Stoelting Europe,Dublin,Ireland))中。在手术显微镜(德国耶拿的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss,Jena,Germany))下将插管植入到下丘脑室旁核(前囟：+2.8mm，外侧：距中线-0.4mm，以及腹侧：距硬脑膜8.2mm)中，切牙棒被设定在-3.3mm。使用由锚固螺钉支撑的牙科粘固剂将插管固定到颅骨。在苏醒之后，将大鼠单独地在代谢笼(法国里昂的Techniplast公司)中饲养1周并且随意饲喂相同的标准啮齿类动物饲料(RM1，SDS公司)，水始终可获得。在手术后阶段每日监测身体状况和体重增加以确保良好的恢复。

然后，将大鼠单独地放置到BioDAQ大鼠笼(新泽西州新不伦瑞克的研究饮食公司)中，每一个大鼠笼均配备有自动摄食监测器。在适应BioDAQ笼舍3天之后，大鼠在注射前12小时期间被剥夺食物并且分成3组(n＝3)，每一组接受不同剂量的单次ClpB注射：10ng、100ng以及1mg，在2mL无菌人工脑脊髓液中稀释。在黑暗阶段开始和提供食物前15分钟进行注射。在黑暗阶段期间测量食物摄入量。

动物显示出食物摄入量的剂量依赖性减少(参见图12)。

实施例6

该实施例证实了表达ClpB的蜂房哈夫尼菌对肥胖ob/ob小鼠的作用。

如上文所述使遗传性肥胖的ob/ob小鼠适应动物设施1周并且维持。用以下各项向小鼠胃内灌胃：(i)10⁸个蜂房哈夫尼菌AF036细菌(表达ClpB)；(ii)10⁸个ClpB缺陷型大肠杆菌K12细菌；(iii)10⁸个大肠杆菌Niessle 1917细菌(表达ClpB)；所有都于米勒-希尔顿(MH)培养基中；或(iv)单独的MH培养基(作为对照)。

本发明人证实，与肥胖对照相组比，用蜂房哈夫尼菌处理诱导体重增加显著减少(图13)。此外，体重增加的减少与累积食物摄入量的减少相关(图14)，以及与脂肪质量和瘦体质量两者的减少相关，而不改变瘦体质量/脂肪质量比(图15)。

激素敏感性脂肪酶(HSL)是细胞内中性脂肪酶，其能够水解三酰基甘油、二酰基甘油、单酰基甘油、和胆固醇酯、以及其他脂质和水溶性底物。特别是，HSL的活化诱导脂解。通过使HSL磷酸化的环AMP依赖性蛋白激酶(PKA)来引发HSL的激素活化。因此，磷酸化形式的HSL蛋白(pHSL)的表达增加意味着脂解的激活。通过蛋白质印迹测量pHSL的表达。

本发明人证实，与对照和用大肠杆菌K12细菌灌胃相比，用大肠杆菌Niessle 1917细菌和蜂房哈夫尼菌灌胃增加了pHSL表达(图16)。因此，大肠杆菌Niessle 1917和蜂房哈夫尼菌激活脂解的机制。

实施例7

该实施例证实了表达ClpB的蜂房哈夫尼菌对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的作用。

用高脂/高碳水化合物饮食诱导1个月龄的雄性C57B16小鼠(让维耶实验室公司)2周。然后用以下各项向小鼠胃内灌胃：(i)10⁸个蜂房哈夫尼菌AF036细菌(表达ClpB)；(ii)10⁸个ClpB缺陷型大肠杆菌K12细菌；所有都于米勒-希尔顿(MH)培养基中；或(iii)单独的MH培养基(作为对照)。将小鼠单独地放置到BioDAQ笼舍(研究饮食公司)中，并如所示每日向小鼠胃内灌胃，历经21天。

通过测量诱导组和非诱导肥胖组的平均体重(图17A)、脂肪质量(图17B)和瘦体质量(图17C)来验证高脂饮食诱导的肥胖症。

发明人证实用任何表达ClpB的任何蜂房哈夫尼菌细菌菌株进行灌胃均使得体重增加减少(图18)以及脂肪含量减少(图19)。

实施例8

该实施例证明了表达ClpB的蜂房哈夫尼菌对肥胖的fa/fa Zucker大鼠的作用。

如上文所述使遗传性肥胖的fa/fa Zucker大鼠(让维耶实验室公司)适应动物设施1周并且维持。用以下各项向小鼠胃内灌胃：(i)10⁸个蜂房哈夫尼菌AF036细菌(表达ClpB)；(ii)10⁸个ClpB缺陷型大肠杆菌K12细菌；(iii)10⁸个大肠杆菌Niessle 1917细菌(表达ClpB)；所有都于米勒-希尔顿(MH)培养基中；或(iv)单独的MH培养基(作为对照)。将大鼠单独地放置到BioDAQ笼舍(研究饮食公司)中，并如所示每日向小鼠胃内灌胃，历经21天。

结果显示，与接受大肠杆菌K12Δ-ClpB细菌或大肠杆菌Niessle 1917细菌或对照的大鼠相比，蜂房哈夫尼菌组的体重增加大多减少(图20)。此外，与其他三组相比，在蜂房哈夫尼菌组中观察到最低的累积食物摄入量(图21)。

发明人还证实脂肪质量增加仅在蜂房哈夫尼菌组中减少(图22)。

参考文献

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的公开内容在此以引用的方式并入本公开中。

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序列表

<110> 国立卫生研究所

鲁昂大学医疗中心

塔基迪有限公司

鲁昂大学

谢尔盖·费特苏

皮埃尔·德彻乐特

乔纳森·布里顿

格雷戈里·兰伯特

<120> 用于诱导饱足感和延长饱腹感的基于蜂房哈夫尼菌的药物组合物和食品组合物

<130> CDM - 692/PCT/3

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 857

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Met Arg Leu Asp Arg Leu Thr Asn Lys Phe Gln Leu Ala Leu Ala Asp

1 5 10 15

Ala Gln Ser Leu Ala Leu Gly His Asp Asn Gln Phe Ile Glu Pro Leu

20 25 30

His Leu Met Ser Ala Leu Leu Asn Gln Glu Gly Gly Ser Val Ser Pro

35 40 45

Leu Leu Thr Ser Ala Gly Ile Asn Ala Gly Gln Leu Arg Thr Asp Ile

50 55 60

Asn Gln Ala Leu Asn Arg Leu Pro Gln Val Glu Gly Thr Gly Gly Asp

65 70 75 80

Val Gln Pro Ser Gln Asp Leu Val Arg Val Leu Asn Leu Cys Asp Lys

85 90 95

Leu Ala Gln Lys Arg Gly Asp Asn Phe Ile Ser Ser Glu Leu Phe Val

100 105 110

Leu Ala Ala Leu Glu Ser Arg Gly Thr Leu Ala Asp Ile Leu Lys Ala

115 120 125

Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Ile Thr Gln Ala Ile Glu Gln Met Arg

130 135 140

Gly Gly Glu Ser Val Asn Asp Gln Gly Ala Glu Asp Gln Arg Gln Ala

145 150 155 160

Leu Lys Lys Tyr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Arg Ala Glu Gln Gly Lys

165 170 175

Leu Asp Pro Val Ile Gly Arg Asp Glu Glu Ile Arg Arg Thr Ile Gln

180 185 190

Val Leu Gln Arg Arg Thr Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro

195 200 205

Gly Val Gly Lys Thr Ala Ile Val Glu Gly Leu Ala Gln Arg Ile Ile

210 215 220

Asn Gly Glu Val Pro Glu Gly Leu Lys Gly Arg Arg Val Leu Ala Leu

225 230 235 240

Asp Met Gly Ala Leu Val Ala Gly Ala Lys Tyr Arg Gly Glu Phe Glu

245 250 255

Glu Arg Leu Lys Gly Val Leu Asn Asp Leu Ala Lys Gln Glu Gly Asn

260 265 270

Val Ile Leu Phe Ile Asp Glu Leu His Thr Met Val Gly Ala Gly Lys

275 280 285

Ala Asp Gly Ala Met Asp Ala Gly Asn Met Leu Lys Pro Ala Leu Ala

290 295 300

Arg Gly Glu Leu His Cys Val Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg

305 310 315 320

Gln Tyr Ile Glu Lys Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Lys Val

325 330 335

Phe Val Ala Glu Pro Ser Val Glu Asp Thr Ile Ala Ile Leu Arg Gly

340 345 350

Leu Lys Glu Arg Tyr Glu Leu His His His Val Gln Ile Thr Asp Pro

355 360 365

Ala Ile Val Ala Ala Ala Thr Leu Ser His Arg Tyr Ile Ala Asp Arg

370 375 380

Gln Leu Pro Asp Lys Ala Ile Asp Leu Ile Asp Glu Ala Ala Ser Ser

385 390 395 400

Ile Arg Met Gln Ile Asp Ser Lys Pro Glu Glu Leu Asp Arg Leu Asp

405 410 415

Arg Arg Ile Ile Gln Leu Lys Leu Glu Gln Gln Ala Leu Met Lys Glu

420 425 430

Ser Asp Glu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Asp Met Leu Asn Glu Glu Leu

435 440 445

Ser Asp Lys Glu Arg Gln Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Glu Trp Lys Ala

450 455 460

Glu Lys Ala Ser Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ile Lys Ala Glu Leu Glu

465 470 475 480

Gln Ala Lys Ile Ala Ile Glu Gln Ala Arg Arg Val Gly Asp Leu Ala

485 490 495

Arg Met Ser Glu Leu Gln Tyr Gly Lys Ile Pro Glu Leu Glu Lys Gln

500 505 510

Leu Glu Ala Ala Thr Gln Leu Glu Gly Lys Thr Met Arg Leu Leu Arg

515 520 525

Asn Lys Val Thr Asp Ala Glu Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr

530 535 540

Gly Ile Pro Val Ser Arg Met Met Glu Ser Glu Arg Glu Lys Leu Leu

545 550 555 560

Arg Met Glu Gln Glu Leu His His Arg Val Ile Gly Gln Asn Glu Ala

565 570 575

Val Asp Ala Val Ser Asn Ala Ile Arg Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala

580 585 590

Asp Pro Asn Arg Pro Ile Gly Ser Phe Leu Phe Leu Gly Pro Thr Gly

595 600 605

Val Gly Lys Thr Glu Leu Cys Lys Ala Leu Ala Asn Phe Met Phe Asp

610 615 620

Ser Asp Glu Ala Met Val Arg Ile Asp Met Ser Glu Phe Met Glu Lys

625 630 635 640

His Ser Val Ser Arg Leu Val Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr

645 650 655

Glu Glu Gly Gly Tyr Leu Thr Glu Ala Val Arg Arg Arg Pro Tyr Ser

660 665 670

Val Ile Leu Leu Asp Glu Val Glu Lys Ala His Pro Asp Val Phe Asn

675 680 685

Ile Leu Leu Gln Val Leu Asp Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly

690 695 700

Arg Thr Val Asp Phe Arg Asn Thr Val Val Ile Met Thr Ser Asn Leu

705 710 715 720

Gly Ser Asp Leu Ile Gln Glu Arg Phe Gly Glu Leu Asp Tyr Ala His

725 730 735

Met Lys Glu Leu Val Leu Gly Val Val Ser His Asn Phe Arg Pro Glu

740 745 750

Phe Ile Asn Arg Ile Asp Glu Val Val Val Phe His Pro Leu Gly Glu

755 760 765

Gln His Ile Ala Ser Ile Ala Gln Ile Gln Leu Lys Arg Leu Tyr Lys

770 775 780

Arg Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Glu Ile His Ile Ser Asp Glu Ala Leu

785 790 795 800

Lys Leu Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Val Tyr Gly Ala Arg Pro

805 810 815

Leu Lys Arg Ala Ile Gln Gln Gln Ile Glu Asn Pro Leu Ala Gln Gln

820 825 830

Ile Leu Ser Gly Glu Leu Val Pro Gly Lys Val Ile Arg Leu Glu Val

835 840 845

Asn Glu Asp Arg Ile Val Ala Val Gln

850 855

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5 10

Claims (15)

1.一种在有需要的对象中诱导饱足感的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

2.一种在有需要的对象中延长饱腹感的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

3.一种在有需要的对象中减少进餐量的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

4.一种在有需要的对象中减少食物摄入量的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

5.一种在有需要的对象中控制体重增加的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

6.一种在有需要的对象中刺激体重减轻的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的蜂房哈夫尼菌。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对象是不肥胖的。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对象是肥胖的。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中以药物组合物的形式向所述对象施用蜂房哈夫尼菌。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中以食品组合物的形式向所述对象施用蜂房哈夫尼菌。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述食品组合物选自完整食品组合物、食品补充剂、和营养保健品组合物。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中蜂房哈夫尼菌是益生菌。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中蜂房哈夫尼菌是灭活的。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述食品组合物包含至少一种益生元。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种益生元是膳食纤维。