KR20180000034A - 이형태체 항원인식 항체 생산을 유도하는 플라젤린 백신보조제 기반의 백신의 제조 및 그 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이형태체 항원인식 항체 유도용 신경퇴행성 질환 백신 조성물 및 감염성 바이러스 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 이형태체 항원인식 항체의 생성을 유도한다. 이러한 이형태체 항원인식 항체는 항원에 대하여 높은 특이도를 갖으므로, 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

이형태체 항원인식 항체 생산을 유도하는 플라젤린 백신보조제 기반의 백신의 제조 및 그 응용{Manufacturing and Applications of flagellin-Adjuvanted Vaccine which induces Conformer recognizing Antibodies}

본 발명은 이형태체 항원인식 항체 생산을 유도하는 플라젤린 백신보조제 기반의 백신의 제조 및 그 응용에 관한 것이다.

항체는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체반응을 일으키는 물질이다. 면역체계에서 세균이나 바이러스같은 외부 항원들과 특이적 결합을 하여 항원을 인식하게하고 동시에 무력화시키는 작용을 하는 면역글로불린은 면역항체라고 하는데 보통 항체라고 하면 면역항체를 의미한다. 항체와 면역글로불린은 동일한 의미로서 면역글로불린은 항체로서 작용하는 당단백질이다.

항체는 항원제시세포가 외인성 또는 내인성 항원을 탐식하고 소화하여 T 림프구에 전하는 것으로 그 형성이 시작된다. 최초감염을 통해 해당 항원을 인식하는 특정 파퓰레이션의 B세포 클론이 선택 및 확장된 후, 해당 세포는 형질세포(plasma cell)로 분화되어 항체를 형성하게 된다. 면역반응의 특성상, 최초감염 시기에 비해 재감염시 항체형성의 속도 및 양이 폭발적으로 높아지게 된다. 이는 현재 감염성 질환의 예방을 위한 백신 접종의 이론적 기반이 된다.

항원-항체 결합을 통해 인식된 항원의 제거는 몇가지 잘 알려진 기전에 의해 이루어진다. 그 중 가장 대표적인 것은 탐식세포에 의한 탐식작용을 촉진하는 옵소닉탐식작용이다. 또한, 자연살해세포에 의한 ADCC(antigen dependent cell-mediated cytotoxicity)는 바이러스 및 세포 내 감염 병원균 감염이나 특정 항원을 표지하는 종양의 제거에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 마지막으로 항원-항체 결합에 의해 유도되는 대안적 보체경로(alternative complement activation pathway)는 병원균의 감염 등에 대해 인체의 면역계가 대응하는 강력한 대응 법 중 하나이다.

항체의 존재가 밝혀진 후, 감염성 질환 뿐 아니라 종양 등 여러 질환군의 치료에 항원-항체 반응을 이용하고자 하는 노력이 있어왔다. 이는 매우 높은 (~10^{- 12} mol/L) 특이도(specificity)를 갖는 항원-항체반응의 특성을 이용하여 높은 특이도를 통한 안전성 및 효능을 기대할 수 있었기 때문이다. 1990년대 후반에 이르러 단클론항체를 이용한 종양 치료기술이 개발되면서, 현재 2006년 이래 미국 FDA에서 시판이 허가된 Top 10 약물 중 80%를 단클론항체 기반 약물이 차지하고 있다. 특히, 암과 같은 신생물 질환의 새로운 치료법으로 항체치료를 위시한 여러 면역치료법이 각광받고 있는데, 2014년 면역 체크포인트 저해제인 항 PD-1 단클론 항체의 시판이 허가된 후 암치료 분야에서 가장 각광받는 분야로 떠오르고 있다.

이와 같은 항체기반의 면역치료의 성공을 위해서는 적절한 항원의 선정 및 최적화된 항체 제조가 반드시 수반되어야 한다. 즉, 타겟 항원에 대해 높은 특이도를 갖는 항체의 개발이 필수적이다.

면역학적으로 인식하는 항원의 구조적 특성에 따라 항체는 크게 두가지로 나눌 수 있다. 첫번째로 항원제시세포에서 소화되어 제시된 올리고펩타이드(8-12개의 아미노산)를 인식하고 결합하는 ‘선형 에피토프 인식 항체’와 두번째는 항원 고유의 3차원 구조를 인식하고 결합하는 ‘구조인식 항체 또는 이형태체 인식 항체 (conformer recognizing antibody)’이다. 특정 항원에 대한 항체의 생성이 유도될 때, 대부분(~90%)의 항체는 첫번째인 ‘선형 에피토프 인식 항체’이다. 그러나 항원의 구조 자체를 인식하는 항체의 경우 보다 높은 특이성을 가질 뿐 아니라, 특정 구조적 특성을 보이는 항원에 대해 결합력을 갖을 수 있는 까닭에 항원-항체 반응에 수반한 면역학적 기전을 더 높게 유도할 수 있는 장점이 있다.

현재 다양한 감염성 질환에 대한 예방백신이 개발되었음에도 불구하고, 아직까지 HIV(human immunodeficiency virus) 및 RSV(Respiratory syncytial virus)를 포함한 여러 감염성 질환 및 신생물 질환 및 타우병증에 의한 알츠하이머병 등의 신경퇴행성 질환에 대한 예방 및 치료백신은 아직 요원한 상태이다. 또한 이미 백신이 개발된 독감의 경우, 유발 병원균인 인플루엔자 바이러스 특유의 잦은 항원 변이로 인해 매년 백신을 접종받아야 할 뿐 아니라, 해당 년도의 예측 유행주와 실제 유행주가 상이할 경우 전혀 예방효과를 나타낼 수 없는 큰 단점이 존재한다. 이는 여전히 현재의 백신개발 기술을 이용하여 유도하는 항체 생산에 큰 장애가 있음을 시사한다고 할 수 있다. 즉, 대부분의 현재의 기술로 생산되는 인공항원을 이용한 백신접종으로 유도되는 항체는 ‘선형의 에피토프 인식 항체’인 까닭에 해당 에피토프의 변형이 심하거나 항원 단독이 아닌 항원의 중합체에 의해 형성된 구조항원에 대한 이형태체 인식이 반드시 필요한 경우에는 현재의 기술로는 해결할 수 없는 까닭이다.

앞서 언급한 HIV 백신의 경우, 광범위 중화항체(broadly neutralizing antibody) 유도가 성공적인 백신요법의 필수요건일 것으로 사료된다. 즉, AIDS 백신의 성공도 결국은 외피당단백삼중체(envelope glycoprotein trimer)에 대한 구조인식 항체 유도 여부에 달려 있다고 할 수 있을 것이다. 뿐만, 아니라 RSV 백신 역시 표면 항원에 대한 이형태체 인식이 필수적이며, 유니버설 인플루엔자 백신 역시 변이가 다양하고 빈번한 헤마글루티닌(hemeagglutinin; HA)의 헤드 구조가 아닌 상대적으로 변이가 적은 스토크(stalk) 부위에 대한 이형태체 인식이 필수적이라 할 수 있을 것이다.

감염성 질환 뿐 아니라, 성공적인 면역치료를 위해서도 효과적인 이형태체 인식 항체의 유도가 매우 중요하다. 특히, 내인성 단백의 병적 변화로 인해 유발되는 타우병증성 알츠하이머병의 경우, 정상적으로 존재하는 타우단량체는 뉴런 축삭의강건성을 유지하는데 필수적이나 서로 응집되어 형성하는 PHF(paired helical filament) 형태의 타우응집체는 타우병증을 유발하고 주위의 다른 뉴런의 병적손상을 유래하는 것으로 알려져 있다. 이는 타우병증 뿐 아니라 알파 시뉴클레인의 병적 과인산화 및 응집으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있는 파킨슨병 등 많은 신경퇴행성 질환에서 나타나는 현상이다. 그러므로 이와 같은 신경퇴행성 질환에 대한 성공적이며 안전한 면역치료를 도모하기 위해서는 병적인 형태의 내인성 단백질 응집체만을 선택적으로 인식하고 결합하나 정상형태의 단량체에는 결합하지 않는 이형태체 인식 항체의 유도가 매우 필수적이라 할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 이형태체(conformer) 항원인식 항체의 생산을 유도하는 플라젤린-기반 백신 조성물을 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 타우 단백질의 질환 매개 부위인 RD(repeated domain) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 FlaB 단백질의 재조합 단백질을 제조하여, 알츠하이머 질환을 유발하는 내인성 단백질인 타우(τ) 단백질의 과인산화 및 응집을 억제하여 알츠하이머 질환을 개선, 예방 및 치료할 수 있는 백신 조성물을 제조하였고, 노로바이러스(norovirus)의 막 단백질인 P 도메인(P domain) 및 비브리오 불니피쿠스 유래 FlaB 단백질의 재조합 단백질을 제조하여 노로바이러스 백신 조성물을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경퇴행성 질환(Neurodegenerative disease)의 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 타우(τ) 단백질의 RD를 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 감염성 바이러스 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 타우(τ) 단백질의 RD(repeated domain); 및 (b) 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 이형태체 항원인식 항체 유도용 신경퇴행성 질환 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 감염성 바이러스의 캡시드 단백질; 및 (b) 비브리오 불니피쿠스 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 포함하는 이형태체 항원인식 항체 유도용 감염성 바이러스 백신 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 본 발명자는 이형태체(conformer) 항원인식 항체의 생산을 유도하는 플라젤린-기반 백신 조성물을 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 타우 단백질의 질환 매개 부위인 RD(repeated domain) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 FlaB 단백질의 재조합 단백질을 제조하여, 알츠하이머 질환을 유발하는 내인성 단백질인 타우(τ) 단백질의 과인산화 및 응집을 억제하여 알츠하이머 질환을 개선, 예방 및 치료할 수 있는 백신 조성물을 제조하였고, 노로바이러스(norovirus)의 막 단백질인 P 도메인(P domain) 및 비브리오 불니피쿠스 유래 FlaB 단백질의 재조합 단백질을 제조하여 노로바이러스 백신 조성물을 제조하였다.

본 발명은 (a) 타우(τ) 단백질의 RD; 및 (b) 비브리오 불니피쿠스 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 백신 조성물은 이형태체 항원인식 항체의 생산을 유도한다.

본 명세서에서 용어, ‘타우 단백질’은 중추신경계 특히 신경세포의 축색돌기에 주로 발현되는 미세소관 결합 단백질(microtubule-associated protein, MAP)로서 미세소관을 안정화 시키는 역할을 한다.

알츠하이머 병을 비롯한 여러 신경퇴행성 질환의 병인에 대해서 다양한 학설이 존재하나, 현재 가장 각광받고 있는 학설은 내인성 단백질의 이상 발생(과인산화, hyperphosphorylation 등) 및 이들의 응집(aggregation)으로 인한 신경세포(neuron)의 고사(apoptosis) 및 신경교세포(glial cell) 등의 과잉활성(overactivation) 등으로 인한 만성 염증 반응의 유발 및 이에 따른 뇌조직의 파괴이다.

타우 단백질의 262번째 내지 356번째 아미노산 사이에 위치하는 반복 도메인(repeated domain; 이하 RD)이 타우 단백질의 인산화와 관련된 도메인으로 밝혀졌다. 정상상태에서는 세포내의 인산화효소(kinase) 및 탈인산화효소(phosphatase)의 균형 잡힌 조절로 인해 타우 단백의 과인산화가 조절되나 몇몇 내인성 및 외인성 자극에 의해 이 조절기작에 문제가 생길 경우 타우단백의 과인산화가 유도된다. 과인산화된 타우단백은 물에 대한 용해도가 높았던 본디의 성질에서 용해도가 극히 떨어지게되며 스스로 응집(aggregation)을 형성하게 된다. 이 응집된 과인산화된 타우 단백질은 알츠하이머병 환자의 부검뇌시료에서 신경섬유반(neurofibrillary tangle; 이하 NFT)으로 관찰된다. 응집된 타우 단백질은 초기에는 신경세포의 축삭 부분에 주로 분포하여 축삭의 미세소관의 안정성의 저해 등을 일으켜 세포의 정상적인 활동을 방해하고 신경세포의 고사를 일으키게 된다. 그러나 중등도 이상의 타우 단백질의 응집은 주변 신경세포 및 교세포에까지 전파되어 해당사건이 일어난 세포뿐 아니라 주변의 다른 세포의 고사 및 소교세포(microglia)의 활성에 의한 만성염증을 유발하는 등 뇌조직의 광범위한 파괴를 유발하게 되며 이에 따라 신경퇴행성 질환을 나타내게 된다.

본 발명은 타우 단백질의 262번째 내지 356번째 아미노산 사이에 위치하는 RD를 재조합 단백질을 제조하여, 이의 항원(또는 면역원)으로서의 기능을 확인한다.

본 명세서에서 용어 “이형태체 항원인식 항체”는 항원 고유의 3차원 구조를 인식하고 결합하는 구조인식 항체를 의미한다(A K Abbas & A H Lichtman, Cellular and molecular immunology, 6^th edition,2003, Elsevier, p.59 ).

본 명세서에서 용어 “항원(antigen)”은 상술한 타우 단백질로부터 유래된 RD 단백질으로, 면역계를 자극하여 생체에 특이적 면역반응을 유도하는 물질을 의미하며, 본 발명에서 용어 “면역원(immunogen)”과 혼용되어 사용될 수 있다.

상기 재조합 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 유전자 클로닝 방법을 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RD는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진다.

상기 RD는 대장균 발현을 위해 코돈최적화된(codon optimized) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.

상기 재조합 단백질을 대장균을 이용하여 제조하기 위해, 타우 단백질의 RD의 뉴클레오타이드 서열을 대장균(Escherichia coli)에서의 발현에 적합한 코돈 최적화(codon optimization)한다. 상기 인간 유래 RD가 대장균에서 고발현 될 수 있도록, 대장균에 적합한 코돈으로 전환하였다. 코돈 최적화 과정을 거치면 유전자 서열은 염기서열만 전환될 뿐, 아미노산 서열은 전환되지 않는다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오티드 서열은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

상기 재조합 단백질을 구성하는 FlaB 단백질은 비브리오 불니피쿠스 유래의 면역보조제(adjuvant)이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 FlaB 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진다.

하기 실시예에서 입증된 바과 같이, 상기 재조합 단백질은 서열목록 제7서열의 아미노산 서열에 의해 이루어지며, 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.

본 발명의 조성물에는 기타 약물 또는 다른 면역보조제가 포함되어 추가적인 면역 자극 효과를 제공할 수 있다. 예컨대, 알루미늄염(Al(OH)₃, AlPO₄), 스쿠알렌(squalene), 소르비탄(sorbitane), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), CpG, 리포좀(liposome), 콜레스테롤(cholesterol), MPL(monophosphoryl lipid A), 계면활성 물질, 세균 유래 물질, 사이토카인, 호르몬, 다가음이온(polyanion), 폴리아크릴(polyacryl), 담체(carrier), 생 벡터(living vector), 미네랄 오일(mineral oil), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 유래 콜레라 독소(cholera toxin) 및 GLA(glucopyranosyl lipid A)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 (a) 타우(τ) 단백질의 RD; 및 (b) 비브리오 불니피쿠스 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 백신 조성물은 경구 또는 비경구투여용 백신 조성물이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 점막, 피하, 피내, 경피 또는 근육 내 접종용이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 점막 접종용이다.

상기 점막 투여는 경구 투여(oral immunization), 비강 투여(intranasal immunization), 설하 투여(sublingual immunization), 직장 투여(rectal immunization) 및 질내 투여(vaginal immunization)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

상기 타우 단백질의 과인산화는 응집체(aggregate)를 형성하게 하고, 상기 응집된 과인산화된 타우 단백질은 알츠하이머 병 환자의 부검 뇌시료에서 신경섬유반(neurofibrillry tangle)로 관찰된다. 상기 응집된 타우 단백질은 신경세포의 축삭 부분에 주로 분포하여 축삭의 미세소관의 안정성에 저해 등을 일으켜 세포의 정상 활동을 방해하고, 신경세포의 고사를 일으킨다. 심한 경우에 주변의 다른 세포의 고사 및 소교세포(microglia)의 활성에 의한 만성염증을 유발하는 등 뇌조직의 광범위한 파괴를 유발하게 되며 이에 따라 신경퇴행성 질환의 증상이 발현하게 된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물은 타우 단백질 응집체(aggregate)에 특이적인 항체의 생성을 유도한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 항체는 타우 단백질의 응집(aggregation)을 억제한다.

본 발명의 백신 조성물을 객체에 투여하여 생성되는 항체는 타우 단백질의 응집을 억제한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 항체는 옵소닉 탐식작용(opsonic phagocytosis)을 촉진한다.

본 명세서에서 용어 ‘옵소닉 탐식작용’은 백혈구의 식균작용을 돕는 옵소닌(opsonin)에 의한 탐식(또는 식균) 작용을 의미한다.

본 발명의 백신 조성물은 신경퇴행성 질환에 대한 개선, 예방 또는 치료용 백신 조성물이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 타우성병증, 치매, 헌팅턴 질환, 파킨슨씨 질환, 근위축성 측삭 경화증, 기억력저하 및 중증근무력증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 타우성병증은 은친화성 그레인 치매(argyrophilic grain dementia), 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 권투 선수 치매(dementia pugilistica), 신경원섬유엉킴(neurofibrillary tangles), 다운증후군(Down's syndrome), 17번 염색체 관련 전두엽 치매(Frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17), 할러포르덴-스파츠 질환(Hallervorden-Spatz disease), 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy), 니만-피크병 C형(Niemann-Pick disease type C), 픽 병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 퇴행성 피질 하부 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 퇴행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy) 및 아급성 경화성 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis)을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 타우(τ) 단백질의 RD를 코딩하는 코돈-최적화된 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 뉴클레오타이드는 상기 재조합 단백질을 구성하는 뉴클레오타이드로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 감염성 바이러스의 캡시드 단백질; 및 (b) 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 감염성 바이러스 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 감염성 바이러스는 노로바이러스(norovirus), 인간면역결핍 바이러스(human inmmunodeficiency virus) 또는 호흡기 세포융합 바이러스(resiratory syncytial virus)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 감염성 바이러스의 캡시드 단백질은 노로바이러스의 P 도메인이다.

상기 노로바이러스는 장염 유발 바이러스로, 식중독 발생 원인의 약 50%가 노로바이러스에 의한 것이며, 바이러스성 위장염의 96%가 노로바이러스에 의한 것이라고 보고된 바 있다(Centers for Disease Control and Prevention, Surveillance for Norovirus Outbreaks). 노로바이러스의 캡시드 유전자의 염기서열은 바이러스 항원과 밀접한 관계를 가지고 있다. 노로바이러스의 캡시드 단백질은 크게 S, P1, P2의 3 단백질 도메인으로 구성되어있으며 S 도메인은 보존적 부위(conserved region)이고, P1과 P2의 단백질서열의 변화에 따라 항원다양성(antigenic diversity)이 발생하는 것으로 알려져있다(Hardy, M. E., 2005).

상기 P 도메인은 노로바이러스 VLP(virus like particle)의 P1 및 P2를 포함하는 222번째 부터 539번째 까지의 아미노산을 포함하고, 이는 서열목록 제13서열의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산은 서열목록 제12서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.

하기 실시예에 입증된 바와 같이 상기 재조합 단백질은 서열목록 제15서열의 아미노산 서열에 의해 이루어지며, 서열목록 제14서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.

상기 백신 조성물은 노로바이러스의 구조를 특이적으로 인식하는 항체의 생성을 유도한다.

상기 백신 조성물은 경구 또는 비경구투여용 백신 조성물이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 점막, 피하, 피내, 경피 또는 근육 내 접종용이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 점막 접종용이다.

상기 점막 투여는 경구 투여(oral immunization), 비강 투여(intranasal immunization), 설하 투여(sublingual immunization), 직장 투여(rectal immunization) 및 질내 투여(vaginal immunization)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 백신 조성물은 혈청 내 항원 특이적 IgG 및 IgA의 생성을 증가시킨다. 또한, 분변 내 항원 특이적 IgG의 생성을 증가시킴을 확인하였다.

본 발명의 감염성 바이러스 백신 조성물은 상깁 신경퇴행성질환 백신 조성물을 구성하는 FlaB 단백질, 약제학적 조성물로서의 용도 등이 유사하므로 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 이형태체 항원인식 항체 유도용 신경퇴행성 질환 백신 조성물 및 감염성 바이러스 백신 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 백신 조성물은 이형태체 항원인식 항체의 생성을 유도한다.

(c) 이러한 이형태체 항원인식 항체는 항원에 대하여 높은 특이도를 갖으므로, 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 타우(τ) 단백질의 RD(repeated domain)의 클로닝 과정을 도식화하여 나타낸다.
도 2는 상기 타우 단백질의 RD의 클로닝을 확인한 결과를 나타낸다. 왼쪽 패널은 RD의 발현을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 오른쪽 패널은 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과이다. RD는 13 kDa의 크기를 나타낸다.
도 3은 FlaB-TauRD 재조합 단백질의 클로닝을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 FlaB-TauRD 재조합 단백질의 투여에 의한 이형태체 구조인식 항체의 생성을 확인한 결과를 보여준다. 플라젤린과 Tau 단백질의 일부를 발현 시킨 Tau-Ag을 면역하여 얻은 항혈청이 Tau pathologic conformer인 PHF(paired helical filament)와 반응하는 ‘구조인식 항체’생성을 유도함을 보여주는 실험 결과이다.
도 5는 FlaB, TauRD 및 FlaB-TauRD의 TLR5(toll like receptor 5)에 대한 자극능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6는 FlaB-TauRD 재조합 단백질의 면역 스케줄을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 tauRD 및 FlaB-tauRD 재조합 단백질을 포함하는 백신의 면역 횟수 및 농도에 따른 IgG 생성능을 나타낸다.
도 8은 FlaB-TauRD 재조합 단백질의 PHF 형태의 응집체를 형성하는 이미지를 나타낸다.
도 9는 FlaB-TauRD 재조합 단백질의 투여에 의한 구조인식 항체의 생성을 확인한 결과를 나타낸다. PHF molecule들이 neurofibrillary tangle 유사 구조를 형성한 상태에서 beta sheet에 선택적으로 결합하는 thioflavin S (Th-S)와 항혈청을 동시에 작용시켜 생성된 항체가 colocalization 하는 것을 확인한 결과이다.
도 10은 FlaB-TauRD 재조합 단백질에 대한 항혈청에 의한 타우 단백질의 응집 억제 효과를 나타낸다.
도 11은 FlaB-TauRD 재조합 단백질에 대한 항혈청의 옵소닉 탐식작용(opsonic phogocytosis) 촉진 효과를 나타낸다.
도 12는 노로바이러스의 P 도메인 발현 정제 결과를 나타낸다.
도 13은 Pd-FlaB 재조합 단백질의 발현 정제, 및 Pd 항혈청 및 FlaB 항혈청에 대하야 특이적으로 결합함을 보여준다.
도 14는 FlaB 및 Pd-FlaB의 TLR5(toll like receptor 5)에 대한 자극능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 Pd-FlaB 재조합 단백질의 면역 스케줄을 나타낸다.
도 16은 단백질공학을 통해 구조인식 항체의 생성을 유도한 결과를 나타낸다. 타우 항원과는 달리 노로바이러스 P 도메인(Pd) 항원의 경우에는 플라젤린과 단순히 혼합 투여하기만 해서는 구조인식 항체가 생성되지 않았으나(왼쪽), Pd-플라젤린 융합 항원으로 면역하였을 경우에만 단량체는 인식하지 못하고 닷블럿(dot blot) 실험법으로 항원구조가 유지된 세포 융해물을 시험하였을 경우에만 반응하는 구조인식 항체를 생성시켰다(오른쪽).
도 17은 Pd-FlaB 재조합 단백질의 전자현미경 관찰 이미지를 나타낸다.
도 18은 Pd-FlaB 재조합 단백질의 면역에 의한 혈청 IgG 역가를 나타낸다.
도 19는 Pd-FlaB 재조합 단백질의 면역에 의한 혈청 IgA 역가를 나타낸다.
도 20은 Pd-FlaB 재조합 단백질의 면역에 의한 분변 IgG 역가를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 알츠하이머병 면역 백신 제조

실험재료

각 균주의 배양 및 보관

본 발명에서 사용한 대장균 균주들은 LB(Luria Bertani) 배지(Difco Co.)에서 배양하였다. 사용한 균주들은 배양후 글리세롤이 30%가 되도록 첨가한 다음 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.

본 발명에 이용된 균주와 플라스미드는 표 1에 정리하였다.

균주 또는 플라스미드	설명	출처
균주
DH5α	F-φ80dlacZM15(lacZYA-argF)U169deoR recA1 endA1 hsdR17(rK-mk+) phoA supE44 λ-thi-gryA96 relA1	ATCC
ER2566	F-λ-fhuA2[Ion]ompTlacZ::T7 gene1 gal sulA11(mcrC-mrr)114::IS10Rmcr-73::miniTn10-TetS)2R(zgb-210::Tn10)(TetS)endA1[dcm]	New England Biolabs, Inc.
플라스미드
pTYB12	N-말단 융합 발현 벡터로, 표적 단백질의 N 말단에 인테인(intein) tag:Apr 가 융합됨.	New England Biolabs, Inc.

실험방법 및 실험결과

1. 단백질 발현 및 정제

a. 패혈증 비브리오균 유래 FlaB 재조합 단백질 발현 및 정제

패혈증 비브리오균 CMCP6의 편모구성인자 FlaB의 유전자 서열(서열목록 제1서열)을 이용하여 flaB 재조합 단백질을 제조하였다. 플라젤린 유전자 flaB의 N-말단 또는 C-말단 융합용 DNA 조각을 얻기 위하여 서열목록 제8서열 및 제9서열에 기재된 FlaB-N 및 FlaB-C 프라이머쌍을 사용하여 N-말단 융합용 또는 C-말단 융합용 FlaB 유전자를 포함하고 있는 1.1 kbp의 DNA 조각을 증폭하였다. 즉 각각의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 반응은 95℃에서 5분간 초기변성한 후 95℃에서 30초간 변성 60℃에서 30초간 어닐링 및 2℃에서 1분간 확장하는 사이클을 30회 반복한 다음 마지막에 2℃에서 10분 동안 반응시키는 조건으로 실시하였다.

대장균주 발현을 위한 발현시스템은 NEB사의 Intein-CN 시스템을 이용하였으며 해당 시스템의 pTYB12 플라스미드를 EcoRI과 PstI으로 제한효소처리한 후 증폭된 flaB PCR 산물을 라이게이션 처리하였다(pCMM11101). 라이게이션한 플라스미드는 E. coli ER2566 발현균주에 전기적 형질전환을 통해 형질전환시켰으며 pTYB12 플라스미드의 선택마커인 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에서 생존한 균주만을 골라내어 서열목록 제8서열 및 제9서열의 PCR 프라이머를 이용하여 해당 유전자 산물의 함유 여부를 확인하였다(CMM11101).

CMM11101 대장균주를 5-브로모-인돌3-클로로이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5 mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴비드 칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합 단백질로부터 서열목록 제2서열의 FlaB 단백질을 얻었다. 분리된 단백질 내에 함유되어있는 내독소(endotoxin)는 AffinityPak™Detoxi Gel™ Endotoxin Removing gel(Pierece社)을 이용하여 제거하였다.

b. 재조합 타우 반복 도메인(repeated domain)의 발현 및 정제

항원으로서 사람 τ(타우) 단백질 중 과인산화에 대한 높은 연관성을 갖고 있는 반복 도메인(repeated domain; RD) 전체를 대장균을 이용하여 재조합 단백질을 제조하였다. 재조합 단백질의 생산을 위하여 해당 유전자(서열목록 제서열)를 대장균에 대해 코돈최적화 및 유전자 합성을 진행하였다(서열목록 제5서열). 클로닝의 용이성을 위하여 유전자 합성시 N-말단 및 C-말단에 각각 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식 유전자 서열을 추가하였다. 융합용 DNA 조각을 얻기 위하여 기재된 tauRD-N(서열목록 제10서열) 및 tauRD-C(서열목록 제11서열) 프라이머 쌍을 사용하여 N-말단 융합용 또는 C-말단 융합용 tauRD 유전자를 포함하고 있는 1.1 kbp의 DNA 조각을 증폭하였다. 즉, 각각의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 반응은 95℃에서 5분 동안 초기 변성한 후 95℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 확장하는 사이클을 30회 반복한 다음 마지막에 72℃에서 10분 동안 반응시키는 조건으로 실시하였다. 대장균주 발현을 위한 발현 시스템은 NEB사의 IMPACT-CN 시스템을 이용하였으며 해당 시스템의 pTYB12 플라스미드를 EcoRI과 PstI으로 제한효소처리한 후 증폭된 tauRD PCR 산물을 라이게이션 처리하였다(pCMM11102). 라이게이션 처리한 플라스미드는 E. coli ER2566 발현균주에 전기적 형질전환을 통해 형질전환시켰으며 pTYB12 플라스미드의 선택마커인 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에서 생존한 균주만을 골라내어 서열목록 제10서열 및 제11서열의 PCR 프라이머를 이용하여 해당 유전자 산물의 함유 여부를 확인하였다(CMM11102).

CMM11102 대장균주를 5-브로모인돌3-클로로이소프로필β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5 mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴비드칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합단백질로부터 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 갖는 TauRD 단백질을 얻었다. 분리된 단백질 내에 함유되어있는 내독소(endotoxin)는 AffinityPak™Detoxi Gel™ Endotoxin Removing gel(Pierece社)을 이용하여 제거하였다.

정제한 재조합 융합단백질의 발현을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 이용한 재조합 융합 단백질의 분자량을 확인한 결과, 13 KDa 크기의 재조합 융합 단백질이 제조됨을 확인하였다(도 2).

정제한 재조합 융합 단백질이 올바른 타우 단백질의 조각인지 확인하기 위하여 항-타우 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 시행한 결과 항-타우 항체에 특이적인 밴드를 확인하였다(도 2).

c. 재조합 FlaB-TauRD 융합 단백질 제조용 유전자클로닝

pCMM11101의 flaB 유전자를 EcoRI과 PstI 제한효소를 이용하여 처리하고 pCMM11102 역시 같은 제한효소 처리한 후 아가로즈 겔 전기영동을 통해 각각의 flaB 유전자 절편과 pCMM11102 플라스미드를 정제하였다. 이 두 유전자를 라이게이션 하여 pTYB12 :: flaB - tauRD 유전자 융합 플라스미드를 제조하였다(pCMM11103). 라이게이션한 플라스미드는 E. coli ER2566 발현균주에 전기적 형질전환을 통해 형질전환시켰으며 pTYB12 플라스미드의 선택마커인 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에서 생존한 균주만을 골라내어 서열목록 제8서열 및 제11서열의 PCR 프라이머를 이용하여 해당 유전자 산물의 함유여부를 확인하였다(pCMM11104).

pCMM11103 대장균주를 5-브로모인돌3-클로로이소프로필β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5 mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴비드칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합단백질로부터 서열목록 제6서열의 FlaB-TauRD 융합 단백질을 얻었다. 분리된 단백질 내에 함유되어있는 내독소는 AffinityPak™Detoxi Gel™ Endotoxin Removing gel (Pierece社)을 이용하여 제거하였다.

정제한 FlaB-TauRD의 적확성을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 FlaB 특이적 마우스 항혈청을 이용 웨스턴 블랏을 시행하였다. 그 결과 정제한 FlaB-TauRD 융합단백질은 57 KDa 크기의 제 크기의 밴드를 보였으며 웨스턴 블랏 상에서도 FlaB 특이적 항혈청과 결합함을 확인하였다(도 3).

도 4는 FlaB과 일부의 Tau 단백질을 발현시킨 Tau-Ag를 면역하여 얻은 항혈청이 Tau pathologic conformer인 PHF와 반응하는 ‘구조인식항체’생성을 유도함을 보여주는 실험결과를 나타낸다. 면역에 사용한 Tau-Ag를 SDS-PAGE 방법으로 분리한 후, 나일론 막에 트랜스퍼 하고 폰슈 S 염색한 결과, 단량체 단백질을 확인하였다. 동일한 방법으로 준비한 막을 FlaB 및 Tau-Ag를 면역하여 얻은 항혈청으로 면역블럿한 경우에는 단량체 밴드는 거의 인식하지 못하고 폰슈 S 염색에서는 전혀 관찰되지 않았던 극소량 다량체 구조체를 강력하게 인식하였다. 이를 반증하기 위해 다량체 구조를 유지시킨 상태에서 native PAGE한 후 면역블랏한 결과, 표준 혈청은 전혀 감지하지 못하는 다량체 구조체를 면역혈청은 강력하게 반응함을 확인하였다. 이는 본 발명으로 유도된 항혈청은 알츠하이머병을 유발하는 타우 응집체에 대해 훨씬 높은 결합력을 보이는 것이다.

d. 재조합 FlaB-TauRD 단백질의 특성 확인

① 재조합 FlaB-TauRD 단백질의 TLR5 자극능 확인

정제한 재조합 타우-RD 펩타이드 자체가 플라젤린의 작용점인 TLR5에 대해 자극능을 보유하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 웰 평판 배양기에 293-T 세포를 1⁵ 세포씩 분주하여 하룻 저녁 배양한 후 이펙틴(Effectene, QIAGEN)을 이용하여 NF-κ-Luc 플라스미드(한양대학교 의과대학 미생물학교실의 김정목 교수로부터 획득), TLR-5 유전자가 클로닝된 p3xFlag-hTLR-5 플라스미드(미국 Wake Forest University School of Medicine, Department of Microbiology and Immunology의 Steven B. Mizel로부터 획득) 및 β-갈락토사다아제(β-galactosidase) 발현대조군 플라스미드(Clontech)를 동시에 세포 내로 도입시켰다. 24시간 추가 배양 후 새로운 배지로 교체하고 IMPACT 시스템으로 분리한 FlaB 및 타우-RD 펩타이드를 일정시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 발광분석기(Luminometer, Berthold社)를 이용, 측정하여 NF-κB의 전사정도를 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과에서 항원으로 이용한 재조합 타우-RD 펩타이드는 TLR5 자극능을 보이지 않았지만, FlaB-TauRD 융합단백질은 FlaB 대비 유의한 TLR5 자극능을 나타내었다.

② 재조합 FlaB-TauRD 혼합 백신 투여에 따른 타우 항원 특이적 항체형성능 비교

본 발명을 통한 플라젤린 타우-RD 펩타이드 혼합 백신을 6주령 암컷 Balb/c 마우스(오리엔트바이오, 한국)의 비강 내로 1주 간격으로 3회, 5회 및 6회 면역한 후 혈청을 얻어 타우-RD 펩타이드 특이적인 항체의 형성을 비교하였다(도 6). 비교를 위하여 재조합 플라젤린 타우-RD 단백질을 96 웰 평판 ELISA 플레이트에 코팅한 후 면역으로 얻어진 항혈청을 2배 연속-희석하여 처리하여 간접 ELISA법을 통해 확인하였다.

그 결과, 플라젤린 타우-RD 펩타이드 혼합 백신은 타우-RD 펩타이드 단독 면역군에 비해 높은 혈청내 IgG 형성을 보였다. 각기 다른 용량의 항원처리 시 3회 면역 시에는 통계적으로 유의하지 않은 용량-반응 관계를 보였으나, 5회 면역 후의 경우에는 항원 6 ㎍ 처리군과 10 ㎍ 처리군 사이에서 통계적으로 유의한 항원특이적 항체형성능을 확인할 수 있었다. 10 ㎍ 처리군과 4 ㎍ 처리군 사이에서 항원특이적 항체형성능의 차이는 확인할 수 없었다(도 7a).

3회, 5회 및 6회 면역후의 항원특이적 항체형성능을 비교한 결과에서는 3회 투여군과 5회 투여군 사이에서 통계적으로 유의한 항원특이적인 항체형성능의 차이를 확인할 수 있었으나, 5회 투여군과 6회 투여군 사이에서는 통계적으로 유의한 차이를 확인할 수 없었다(도 7b).

④ 재조합 FlaB-TauRD 단백질의 응집체 형성

본 발명으로 유도된 항혈청이 뇌의 특이적 항원이 스스로 응집체를 형성하여 정제 5일 후에 도 8과 같이 PHF 형태의 응집체를 형성함을 전자현미경을 통해 확인하였다.

⑤ 재조합 FlaB-TauRD 단백질의 응집체 유도

단백질의 β 시트(sheet) 구조에 특이적으로 결합하는 티오플라빈 S(thioflavin S; Green)로 타우 단백질 응집체(정제한 타우-RD 펩타이드에 헤파린(heparin)을 처리하여 응집을 유도함)를 염색하고 본 발명품 면역으로 얻어진 항혈청을 항-마우스 IgG 래빗 IgG를 Alexa fluor 633(Molecular probe)로 염색한 후 공촛점레이저 현미경을 이용하여 타우 단백질과 항혈청의 결합 여부 및 정도를 비교하였다.

실험결과, 본 발명으로 유도된 항혈청은 응집유도 2일째에 비해 5일째(더 많이 응집된) 타우 단백질에 결합하는 양상을 보였다(도 9).

⑥ 재조합 FlaB-TauRD 단백질의 응집 저해 효과

본 발명으로 유도된 항타우 혈청의 타우 응집 저해 효과를 확인하기 위하여 본 발명으로 유도된 항혈청을 재조합 타우-RD 펩타이드에 전처리하고 제거한 후 헤파린을 이용하여 타우 펩타이드의 응집을 유도하고 응집체의 형성 정도를 투과전자현미경을 통하여 확인하였다.

식염수를 면역하여 획득한 대조혈청을 전처리한 경우에는 타우 단백질의 응집이 관찰되나, 본 발명으로 유도된 항혈청을 전처리한 경우에는 타우 단백질의 응집이 저하되는 현상을 관찰하였다(도 10).

⑦ 재조합 FlaB-TauRD 단백질의 탐식 활성

본 발명으로 유도된 항혈청이 뇌의 특이적 항원 제시 세포인 소교세포 세포주(BV2 세포주, 전남대학교 의과대학 문창종 교수연구실 분양)의 타우 응집체의 옵소닉 탐식작용(opsonic phagocytosis)의 촉진 여부를 확인하는 실험을 시행하였다. 재조합 타우-RD 펩타이드를 헤파린을 이용하여 3일 동안 응집을 유도한 후, FNR 488(Green, 바이오액츠, 한국)을 이용하여 염색하였다. 10초 동안 초음파 파쇄를 통해 타우 응집체를 쪼갠 후, 배양한 BV2 세포주에 본 발명으로 인한 항타우 혈청과 함께 처리하였다. 대조군으로는 PBS 면역을 통해 획득한 대조혈청 이용하였다. 배양 30분 후, 배지를 제거하고 BV2 세포의 핵은 DAPI(Blue)로 염색하고 BV2 세포의 세포막은 맥아응집소(Wheat germ agglutinin; WGA, Red)를 이용하여 염색한 후 공촛점 현미경을 이용하여 파쇄 타우 응집체의 탐식 여부 및 정도를 비교하였다.

그 결과, 본 발명으로 유도된 항혈청으로 처리한 파쇄 타우 응집체는 BV2 세포에 의해 탐식되었으나, 대조 혈청 처리군에서는 이와 같은 현상이 발견되지 않았다. 이는 본 발명으로 유도된 항혈청이 뇌의 특이적인 항원 제시 세포에게 높은 옵소닉 탐식능을 제공함을 의미한다(도 11).

실시예 2: 노로바이러스 면역 백신 제조

a. 노로바이러스 P 도메인 항원 서열 및 코돈최적화

노로바이러스 백신 제조를 위한 항원을 위한 DNA는 전남대학교 조경오 교수로부터 획득한 노로바이러스 P 도메인이 클로닝된 pGEX-4T-1::VAxxx를 이용하였다. 삽입유전자서열은 서열목록 제12서열과 같다.

b. 재조합 Pd 항원 제조용 유전자클로닝

항원용 Pd 유전자의 N-말단 또는 C-말단 융합용 DNA조각을 얻기 위하여 서열목록 제16서열 및 제17서열에 기재된 Pd-N 및 Pd-C 프라이머쌍을 사용하여 서열목록 제12서열의 Pd 포함 플라스미드를 주형으로 Pd 유전자를 포함하고 있는 1.1 kbp의 DNA 조각을 증폭하였다. 즉 각각의 프라이머 쌍을 사용한 PCR 반응은 95℃에서 5분간 초기변성한 후 95℃에서 30초간 변성 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 30회 반복한 다음 마지막에 72℃에서 10분간 반응시키는 조건으로 실시하였다.

대장균주 발현을 위한 발현시스템은 NEB사의 IMPACT-CN 시스템을 이용하였으며 해당 시스템의 pTYB12 플라스미드를 EcoRI과 PstI으로 제한효소 처리한 후 증폭된 Pd PCR 산물을 라이게이션 처리하였다(pCMM11105). 라이게이션한 플라스미드는 E. coli ER2566 발현균주에 전기적 형질전환을 통해 형질전환시켰으며, pTYB12 플라스미드의 선택마커인 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에서 생존한 균주만을 골라내어 서열목록 제16서열 및 제17서열의 PCR 프라이머를 이용하여 해당유전자 산물의 함유 여부를 확인하였다(pCMM11105).

pCMM11105 대장균주를 5-브로모인돌-3-클로로이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5 mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴비드칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합단백질로부터 서열목록 제15서열의 FlaB-Pd 융합단백질을 얻었다. 분리된 단백질 내에 함유되어 있는 내독소는 AffinityPak™ Detoxi Gel™ Endotoxin Removing gel(Pierece社)을 이용하여 제거하였다.

정제한 재조합 Pd 단백질의 적확성을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 시행하였다(도 12). 그 결과 정제한 재조합 Pd 단백질은 44 KDa 크기의 제 크기의 밴드를 보였다.

c. 재조합 FlaB-Pd 융합단백질 제조용 유전자 클로닝

pCMM11101의 flaB 유전자를 EcoRI과 PstI 제한효소를 이용하여 처리하고 pCMM11105 역시 같은 제한효소 처리한 후 아가로오즈 겔 전기영동을 통해 각각의 flaB 유전자 절편과 pCMM11104 플라스미드를 정제하였다. 이 두 유전자를 라이게이션하여 pTYB12 :: flaB -Pd 유전자융합 플라스미드를 제조하였다(pCMM11106). 라이게이션한 플라스미드는 E. coli ER2566 발현균주에 전기적 형질전환을 통해 형질전환시켰으며, pTYB12 플라스미드의 선택마커인 암피실린 함유 LB 아가 플레이트 상에서 생존한 균주만을 골라내어 서열목록 제8서열 및 제17서열의 PCR 프라이머를 이용하여 해당 유전자 산물의 함유 여부를 확인하였다(pCMM1106).

pCMM11105 대장균주를 5-브로모인돌-3-클로로이소프로필-β-D-갈락토피라노시드(IPTG) 0.5 mM을 가하여 발현을 유도하였다. 제조사(New England Biolabs Inc.)의 지침에 따라 키틴비드칼럼과 1,4-디티오트레이톨(1,4-DTT)을 이용하여 인테인 융합단백질로부터 서열목록 제15서열의 FlaB-Pd 융합단백질을 얻었다. 분리된 단백질 내에 함유되어있는 내독소는 AffinityPak™Detoxi Gel™ Endotoxin Removing gel(Pierece社)을 이용하여 제거하였다.

정제한 FlaB-Pd의 적확성을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 FlaB 또는 Pd 특이적 마우스 항혈청을 이용하여 웨스턴 블랏을 시행하였다. 그 결과, 정제한 FlaB-Pd 융합단백질은 44 KDa 크기의 제 크기의 밴드를 보였으며 웨스턴 블랏 상에서도 FlaB 및 Pd 특이적 항혈청과 결합함을 확인하였다(도 13).

d. 재조합 FlaB-Pd 단백질의 특성 확인

① 재조합 flaB-Pd 단백질의 TLR5 자극능

FlaB-Pd 융합단백질의 생체효능을 유추하기 위하여 24 웰 평판 배양기에 293-T 세포를 1X10⁵세포씩 분주하여 하룻저녁 배양한 후 Effectene(QIAGEN)을 이용하여 NF-κB-Luc 플라스미드(한양대학교 의과대학 미생물학교실의 김정목 교수로부터 획득)와 TLR-5 유전자가 클로닝된 p3xFlag-hTLR-5 플라스미드(미국 Wake Forest University School of Medicine, Department of Microbiology and Immunology의 Steven B. Mizel로부터 획득) β-갈락토사다아제(β-galactosidase) 발현 대조군 플라스미드(Clontech)를 동시에 세포 내로 도입시켰다. 24시간 추가배양 후 새로운 배지로 교체하고 상기에서 제조하고 IMPACT 시스템으로 분리한 FlaB-Pd 융합단백질을 일정 시간 처리한 후 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 발광분석기(Luminometer, Berthold社)를 이용, 측정하여 NF-κB 전사정도를 확인하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

② 재조합 FlaB-Pd 단백질의 구조인식

제조한 Pd 및 FlaB-Pd 단백질의 백신 효능검증을 위하여 오리엔트사로부터 구입한 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 이용하였다.

도 15의 스케줄로 PBS(음성대조군), Pd(1 ㎍), FlaB(1.2 ㎍)+Pd(1.2 ㎍) 혼합 투여, FlaB-Pd(2.2 ㎍) 융합단백질을 각각 마우스의 비강을 통하여 3회 투여하였다. 그리고 마지막 투여 7일 후, 마우스의 전혈을 획득한 후, 혈청을 분리하였다.

도 16은 노로바이러스 Pd 항원의 경우에 FlaB와 혼합 투여하기만해서는 구조인식 항체가 생성되지 않았으나, 재조합 FlaB-Pd 단백질을 항원으로 면역하였을 경우에만 단량체는 인식하지 못하고, 항원구조가 유지된 세포 용해물을 이용한 닷블럿(dot blot)에서 항원하고 반응하는 구조인식항체를 생성시켰다. 이는 항원에 따라서 단백질공학을 통해 특수한 항원 구조를 갖출 필요가 있음을 의미한다.

③ 전자현미경 관찰

재조합 노로바이러스 P 도메인 단백질과 FlaB-P 도메인 융합 단백질을 각각 정제한 후 시료들을 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색한 후, 탄소 그리드(carbon grid)에 2 ㎕ 떨어뜨리고 건조한 후, JEOL JEM-2100F 투과전자현미경을 이용 30kV의 가속전압으로 관찰하였다. 그 결과, 노로바이러스 P 도메인 재조합 단백에서 VLP (virus like particle) 구조의 형성이 관찰되었다. FlaB-P 도메인 융합단백질의 경우, VLP 형태가 관찰되나, 이들을 아단위(subunit)으로 하여 서로 응집된 구조를 관찰할 수 있었다(도 17).

④ IgG 및 IgA 역가 관찰

도 15의 면역스케줄을 이용하여 6주령 암컷 BalB/c 마우스에 재조합 P 도메인 항원 단독, FlaB와 P 도메인 혼합, FlaB-P 도메인 융합단백질 백신을 마우스 비강을 통하여 투여하였다. 3회 면역 후, 마우스의 전혈 (도 18: 혈청 IgG, 도 19혈청 IgA) 및 분변 (도20 분변 내 분비성 IgA 역가 측정) 을 회수한 후, 혈청을 분리한 후 재조합 P 도메인 단백질을 항원으로 하는 항원 특이적 항체역가를 ELISA를 이용하여 확인하였다(2차 IgG 항체; Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP Cat. No.1030-05 , SouthernBiotech, Birmingham, AL 35260, USA: 2차 IgA 항체; Goat Anti-Mouse IgA-HRP Cat. No.1040-05, SouthernBiotech, Birmingham, AL 35260, USA 이용)(도 18 내지 20). 그 결과 P 도메인 단독 투여군에 비해 FlaB + P 도메인 혼합 투여 및 FlaB-P 도메인 융합백신 투여군에서 모두 유의한 항원 특이적 항체역가의 상승을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> anufacturing and Applications of flagellin-Adjuvanted Vaccine which induces Conformer recognizing Antibodies <130> PN160074 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1134 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 1 atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac 60 gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt 120 gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt 180 ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt 240 gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg 300 aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat 360 gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt 420 acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctttca 480 ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa 540 ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca 600 gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa 660 gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc 720 ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt 780 agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac 840 gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac 900 gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc 960 aacttggaca acatcaacga aaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac 1020 ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc 1080 attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg ctaa 1134 <210> 2 <211> 380 <212> PRT <213> Vibrio vulnificus <400> 2 Asn Val Asp Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr 1 5 10 15 Ala Gln Arg Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met 20 25 30 Glu Arg Leu Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 35 40 45 Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu 50 55 60 Asp Val Ala Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Glu Gly Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg 85 90 95 Asp Leu Ser Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg 100 105 110 Val Ala Ile Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg 115 120 125 Ile Ala Glu Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr 130 135 140 Tyr Gly Thr Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val 145 150 155 160 Met Leu Ser Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly 165 170 175 Val Ser Tyr Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala 180 185 190 Ala Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn 195 200 205 Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu 210 215 220 Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val 225 230 235 240 Gly Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln 245 250 255 Gly Glu Ile Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly 260 265 270 Glu Gly Lys Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln 275 280 285 Gly Ala Gln Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val 290 295 300 Asp Ser His Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His 305 310 315 320 Ala Ile Ser Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys 325 330 335 Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr 340 345 350 Lys Thr Gln Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala 355 360 365 Lys Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly 370 375 380 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser 1 5 10 15 Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys 20 25 30 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 35 40 45 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val 50 55 60 Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys 65 70 75 80 Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu 85 90 95 Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile 100 105 110 Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 115 120 125 <210> 4 <211> 378 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 4 ctgcagacag cccccgtgcc catgccagac ctgaagaatg tcaagtccaa gatcggctcc 60 actgagaacc tgaagcacca gccgggaggc gggaaggtgc agataattaa taagaagctg 120 gatcttagca acgtccagtc caagtgtggc tcaaaggata atatcaaaca cgtcccggga 180 ggcggcagtg tgcaaatagt ctacaaacca gttgacctga gcaaggtgac ctccaagtgt 240 ggctcattag gcaacatcca tcataaacca ggaggtggcc aggtggaagt aaaatctgag 300 aagcttgact tcaaggacag agtccagtcg aagattgggt ccctggacaa tatcacccac 360 gtccctggcg gaggaaat 378 <210> 5 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized TauRD <400> 5 ctgcagacag cccccgtgcc catgccagac ctgaagaatg tcaagtccaa gatcggctcc 60 actgagaacc tgaagcacca gccgggaggc gggaaggtgc agataattaa taagaagctg 120 gatcttagca acgtccagtc caagtgtggc tcaaaggata atatcaaaca cgtcccggga 180 ggcggcagtg tgcaaatagt ctacaaacca gttgacctga gcaaggtgac ctccaagtgt 240 ggctcattag gcaacatcca tcataaacca ggaggtggcc aggtggaagt aaaatctgag 300 aagcttgact tcaaggacag agtccagtcg aagattgggt ccctggacaa tatcacccac 360 gtccctggcg gaggaaat 378 <210> 6 <211> 1519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaB-TauRD <400> 6 tggcagtgaa tgtaaataca aacgtagcag caatgacagc acagcgttac ctgaataacg 60 caaacagcgc acaacaaact tcgatggagc gtctgtcttc aggtttcaaa atcaacagtg 120 caaaagatga cgcagccggt ctgcaaatct ctaaccgctt gaacgtacaa agtcgcggtc 180 tagacgttgc ggtacgtaac gccaacgacg gtatctcaat cgcacaaacc gcagaaggtg 240 cgatgaacga gaccaccaac atcctacaac gtatgcgtga cctatctcta caatccgcga 300 acggctcaaa ctcaaaatca gagcgcgtgg cgattcaaga agaagtgaca gcattgaatg 360 acgagctaaa ccgtattgca gaaaccacgt cttttggtgg taacaagctg ctaaacggta 420 cttacggcac gaaagcaatg caaattggtg cggataacgg tgaagcggtc atgctttcac 480 tgaaagacat gcgctctgac aacgtgatga tgggcggcgt gagctaccaa gctgaagaag 540 gcaaagacaa gaactggaat gtggccgcag gcgacaacga cttgacgatt gcactgacag 600 acagctttgg taacgagcaa gagatcgaaa tcaacgcgaa agcgggtgat gacatcgaag 660 agctagcgac gtacatcaac ggtcaaactg accttgtaaa agcgtcagtg ggtgaaggcg 720 gcaagctaca gatctttgct ggtaacaaca aagttcaagg tgaaattgct ttctcaggta 780 gcctagctgg tgaacttggc ctaggcgaag gcaaaaacgt cacggtagac acgattgacg 840 tgacaaccgt acaaggtgcg caagagtcgg tagcgattgt ggatgcggca ctgaaatacg 900 tagacagcca ccgtgcagag ctgggtgcat tccagaaccg tttcaaccat gcaatcagca 960 acttggacaa catcaacgaa aacgtgaacg cgtcgaagag ccgaatcaaa gataccgact 1020 tcgcgaaaga aacgactcag ttgaccaaga cacaaattct atcgcaagca tcaagttcca 1080 ttcttgcgca agcgaaacaa gcgccaaact cagcgctaag tctactaggc ttaagtcgac 1140 actgcaaaca gccccggttc ctatgcccga tctgaagaat gtgaaatcta aaataggctc 1200 gactgaaaat ctgaaacacc aacctggtgg tggtaaagtg cagattatca acaaaaaatt 1260 ggacctgtca aatgtacaga gtaagtgtgg ttccaaagat aacatcaaac atgttccggg 1320 gggcgggtcc gtacagattg tgtataagcc agtcgatctg agcaaagtca ccagcaaatg 1380 cgggtctctg ggcaacattc atcacaaacc aggcggtgga caggttgagg tcaagagcga 1440 aaagctggac tttaaggacc gtgttcagag taaaatcggc tcactcgata acattacgca 1500 tgtgccggga ggaggtaat 1519 <210> 7 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FlaB-TauRD <400> 7 Asn Val Asp Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr 1 5 10 15 Ala Gln Arg Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met 20 25 30 Glu Arg Leu Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 35 40 45 Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu 50 55 60 Asp Val Ala Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Glu Gly Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg 85 90 95 Asp Leu Ser Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg 100 105 110 Val Ala Ile Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg 115 120 125 Ile Ala Glu Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr 130 135 140 Tyr Gly Thr Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val 145 150 155 160 Met Leu Ser Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly 165 170 175 Val Ser Tyr Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala 180 185 190 Ala Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn 195 200 205 Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu 210 215 220 Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val 225 230 235 240 Gly Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln 245 250 255 Gly Glu Ile Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly 260 265 270 Glu Gly Lys Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln 275 280 285 Gly Ala Gln Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val 290 295 300 Asp Ser His Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His 305 310 315 320 Ala Ile Ser Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys 325 330 335 Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr 340 345 350 Lys Thr Gln Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala 355 360 365 Lys Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly Leu Gln Thr Ala 370 375 380 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 385 390 395 400 Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile 405 410 415 Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys 420 425 430 Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr 435 440 445 Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly 450 455 460 Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu 465 470 475 480 Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp 485 490 495 Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 500 505 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for flaB <400> 8 gaattcatgg cagtgaatgt aaatacaa 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for flaB <400> 9 ctgcagttag cctagtagac ttagcgc 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TauRD <400> 10 gaattcctgc aaacagcccc ggttcc 26 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TauRD <400> 11 ctcgagatta cctcctcccg gcacat 26 <210> 12 <211> 957 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Norovirus <400> 12 tcaagaacta aaccattcac cgtcccgatc ttaactgttg aggaaatgtc caactcaaga 60 ttccccattc ctttggaaaa gttgtacacg ggtcccagca gtgcttttgt tgtccaacca 120 caaaatggca ggtgcacgac tgatggcgtg ctcttaggca ctacccagct gtctgctgtc 180 aatatctgca ccttcagagg ggatgtcacc cacattgcag gcagtcatga ctatataatg 240 aatttggctt ctcaaaattg gaacaattat gacccaacag aagaaatccc agcccctctg 300 ggaactccag atttcgtggg aaagatccaa ggcatgctca cccaaaccac aagagaggat 360 ggctcgaccc gcgcccacaa agctacagtg agcactggga gcgtccactt cactccaaag 420 ttgggcagtg ttcaatacac cactgacaca aacaatgatc ttcaaactgg ccaaaacacg 480 aaattcaccc cagtcggcgt catccaggat ggtaataacc accaaaatga accccagcaa 540 tgggtactcc caaattactc aggtagaact ggtcataatg tgcacctagc tcctgccgtt 600 gcccccactt tcccaggcga gcaacttctc ttctttaggt ccactatgcc cgggtgtagc 660 gggtatccca acatgaatct ggattgccta ctcccccagg aatgggtgca gcacttctac 720 caagaagcag ctccagcaca atctgatgtg gctctgctga gatttgtgaa tccagacaca 780 ggtagggttc tgtttgagtg caagctccat aaatcaggct atgtcacagt ggctcacact 840 ggcccgcatg atttggttat cccccccaat ggttatttta gatttgattc ctgggtcaac 900 cagttctaca cacttgcccc catgggaaat ggagcggggc gcagacgtgc attataa 957 <210> 13 <211> 319 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Norovirus <400> 13 Met Ser Arg Thr Lys Pro Phe Thr Val Pro Ile Leu Thr Val Glu Glu 1 5 10 15 Met Ser Asn Ser Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Tyr Thr Gly 20 25 30 Pro Ser Ser Ala Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr 35 40 45 Asp Gly Val Leu Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Ala Val Asn Ile Cys 50 55 60 Thr Phe Arg Gly Asp Val Thr His Ile Ala Gly Ser His Asp Tyr Ile 65 70 75 80 Met Asn Leu Ala Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu 85 90 95 Ile Pro Ala Pro Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly 100 105 110 Met Leu Thr Gln Thr Thr Arg Glu Asp Gly Ser Thr Arg Ala His Lys 115 120 125 Ala Thr Val Ser Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser 130 135 140 Val Gln Tyr Thr Thr Asp Thr Asn Asn Asp Leu Gln Thr Gly Gln Asn 145 150 155 160 Thr Lys Phe Thr Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Asn Asn His Gln 165 170 175 Asn Glu Pro Gln Gln Trp Val Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Gly 180 185 190 His Asn Val His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu 195 200 205 Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro 210 215 220 Asn Met Asn Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln His Phe 225 230 235 240 Tyr Gln Glu Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe 245 250 255 Val Asn Pro Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys 260 265 270 Ser Gly Tyr Val Thr Val Ala His Thr Gly Pro His Asp Leu Val Ile 275 280 285 Pro Pro Asn Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr 290 295 300 Thr Leu Ala Pro Met Gly Asn Gly Ala Gly Arg Arg Arg Ala Leu 305 310 315 <210> 14 <211> 2097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pd-flaB <400> 14 atgtcaagaa ctaaaccatt caccgtcccg atcttaactg ttgaggaaat gtccaactca 60 agattcccca ttcctttgga aaagttgtac acgggtccca gcagtgcttt tgttgtccaa 120 ccacaaaatg gcaggtgcac gactgatggc gtgctcttag gcactaccca gctgtctgct 180 gtcaatatct gcaccttcag aggggatgtc acccacattg caggcagtca tgactatata 240 atgaatttgg cttctcaaaa ttggaacaat tatgacccaa cagaagaaat cccagcccct 300 ctgggaactc cagatttcgt gggaaagatc caaggcatgc tcacccaaac cacaagagag 360 gatggctcga cccgcgccca caaagctaca gtgagcactg ggagcgtcca cttcactcca 420 aagttgggca gtgttcaata caccactgac acaaacaatg atcttcaaac tggccaaaac 480 acgaaattca ccccagtcgg cgtcatccag gatggtaata accaccaaaa tgaaccccag 540 caatgggtac tcccaaatta ctcaggtaga actggtcata atgtgcacct agctcctgcc 600 gttgccccca ctttcccagg cgagcaactt ctcttcttta ggtccactat gcccgggtgt 660 agcgggtatc ccaacatgaa tctggattgc ctactccccc aggaatgggt gcagcacttc 720 taccaagaag cagctccagc acaatctgat gtggctctgc tgagatttgt gaatccagac 780 acaggtaggg ttctgtttga gtgcaagctc cataaatcag gctatgtcac agtggctcac 840 actggcccgc atgatttggt tatccccccc aatggttatt ttagatttga ttcctgggtc 900 aaccagttct acacacttgc ccccatggga aatggagcgg ggcgcagacg tgcattagtc 960 gacatggcag tgaatgtaaa tacaaacgta gcagcaatga cagcacagcg ttacctgaat 1020 aacgcaaaca gcgcacaaca aacttcgatg gagcgtctgt cttcaggttt caaaatcaac 1080 agtgcaaaag atgacgcagc cggtctgcaa atctctaacc gcttgaacgt acaaagtcgc 1140 ggtctagacg ttgcggtacg taacgccaac gacggtatct caatcgcaca aaccgcagaa 1200 ggtgcgatga acgagaccac caacatccta caacgtatgc gtgacctatc tctacaatcc 1260 gcgaacggct caaactcaaa atcagagcgc gtggcgattc aagaagaagt gacagcattg 1320 aatgacgagc taaaccgtat tgcagaaacc acgtcttttg gtggtaacaa gctgctaaac 1380 ggtacttacg gcacgaaagc aatgcaaatt ggtgcggata acggtgaagc ggtcatgctt 1440 tcactgaaag acatgcgctc tgacaacgtg atgatgggcg gcgtgagcta ccaagctgaa 1500 gaaggcaaag acaagaactg gaatgtggcc gcaggcgaca acgacttgac gattgcactg 1560 acagacagct ttggtaacga gcaagagatc gaaatcaacg cgaaagcggg tgatgacatc 1620 gaagagctag cgacgtacat caacggtcaa actgaccttg taaaagcgtc agtgggtgaa 1680 ggcggcaagc tacagatctt tgctggtaac aacaaagttc aaggtgaaat tgctttctca 1740 ggtagcctag ctggtgaact tggcctaggc gaaggcaaaa acgtcacggt agacacgatt 1800 gacgtgacaa ccgtacaagg tgcgcaagag tcggtagcga ttgtggatgc ggcactgaaa 1860 tacgtagaca gccaccgtgc agagctgggt gcattccaga accgtttcaa ccatgcaatc 1920 agcaacttgg acaacatcaa cgaaaacgtg aacgcgtcga agagccgaat caaagatacc 1980 gacttcgcga aagaaacgac tcagttgacc aagacacaaa ttctatcgca agcatcaagt 2040 tccattcttg cgcaagcgaa acaagcgcca aactcagcgc taagtctact aggctaa 2097 <210> 15 <211> 699 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pd-flaB <400> 15 Asn Val Asp Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr 1 5 10 15 Ala Gln Arg Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met 20 25 30 Glu Arg Leu Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 35 40 45 Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu 50 55 60 Asp Val Ala Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Glu Gly Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg 85 90 95 Asp Leu Ser Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg 100 105 110 Val Ala Ile Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg 115 120 125 Ile Ala Glu Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr 130 135 140 Tyr Gly Thr Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val 145 150 155 160 Met Leu Ser Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly 165 170 175 Val Ser Tyr Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala 180 185 190 Ala Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn 195 200 205 Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu 210 215 220 Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val 225 230 235 240 Gly Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln 245 250 255 Gly Glu Ile Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly 260 265 270 Glu Gly Lys Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln 275 280 285 Gly Ala Gln Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val 290 295 300 Asp Ser His Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His 305 310 315 320 Ala Ile Ser Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys 325 330 335 Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr 340 345 350 Lys Thr Gln Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala 355 360 365 Lys Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly Met Ser Arg Thr 370 375 380 Lys Pro Phe Thr Val Pro Ile Leu Thr Val Glu Glu Met Ser Asn Ser 385 390 395 400 Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Tyr Thr Gly Pro Ser Ser Ala 405 410 415 Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu 420 425 430 Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Ala Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly 435 440 445 Asp Val Thr His Ile Ala Gly Ser His Asp Tyr Ile Met Asn Leu Ala 450 455 460 Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro 465 470 475 480 Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Met Leu Thr Gln 485 490 495 Thr Thr Arg Glu Asp Gly Ser Thr Arg Ala His Lys Ala Thr Val Ser 500 505 510 Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Val Gln Tyr Thr 515 520 525 Thr Asp Thr Asn Asn Asp Leu Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe Thr 530 535 540 Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Asn Asn His Gln Asn Glu Pro Gln 545 550 555 560 Gln Trp Val Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Gly His Asn Val His 565 570 575 Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe 580 585 590 Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asn Leu 595 600 605 Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu Ala 610 615 620 Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro Asp 625 630 635 640 Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr Val 645 650 655 Thr Val Ala His Thr Gly Pro His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn Gly 660 665 670 Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala Pro 675 680 685 Met Gly Asn Gly Ala Gly Arg Arg Arg Ala Leu 690 695 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P domain <400> 16 catatgtcaa gaactaaacc attcaccg 28 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P domain <400> 17 gtcgactaat gcacgtctgc gccccg 26

Claims (20)

1. (a) 타우(τ) 단백질의 RD(repeated domain); 및 (b) 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 이형태체 항원인식 항체 유도용 신경퇴행성 질환 백신 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 RD는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 RD는 대장균 발현을 위해 코돈최적화된(codon optimized) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 FlaB 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 점막 투여(mucosal immunization) 피하, 피내, 경피 또는 근육 내 접종용인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 타우 단백질 응집체(aggregate)에 특이적인 항체의 생성을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 항체는 타우 단백질의 응집(aggregation)을 억제하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
8. 제 6 항에 있어서, 상기 항체는 옵소닉 탐식작용(opsonic phagocytosis)를 촉진하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 타우성병증, 치매, 헌팅턴 질환, 파킨슨씨 질환, 근위축성 측삭 경화증, 기억력저하 및 중증근무력증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
10. 타우(τ) 단백질의 RD(repeated domain)를 코딩하는 코돈-최적화된(codon-optimized) 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드.
    
11. (a) 감염성 바이러스의 캡시드 단백질; 및 (b) 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 FlaB 단백질로 구성된 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 이형태체 항원인식 항체 유도용 감염성 바이러스 백신 조성물.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 감염성 바이러스는 노로바이러스(norovirus), 인간면역결핍 바이러스(human inmmunodeficiency virus) 또는 호흡기 세포융합 바이러스(resiratory syncytial virus)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
13. 제 11 항에 있어서, 상기 감염성 바이러스의 캡시드 단백질은 노로바이러스의 P 도메인인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
14. 제 13 항에 있어서, 상기 P 도메인은 서열목록 제13서열의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
15. 제 13 항에 있어서, 상기 P 도메인은 서열목록 제12서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
16. 제 11 항에 있어서, 상기 FlaB 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
17. 제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 점막 투여(mucosal immunization), 피하, 피내, 경피 또는 근육내 접종용인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
18. 제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 혈청 내 항원 특이적 IgG의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
19. 제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 혈청 내 항원 특이적 IgA의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
20. 제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 분변 내 항원 특이적 IgG의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

Images