JP2023055878A - 配座異性体抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリンワクチン補助剤ベースのワクチンの製造およびその応用 - Google Patents
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Abstract
【課題】配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物および感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。【解決手段】(a)タウ(τ)タンパク質のRD(repeated domain);および(b)ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)由来のFlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物である。上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオン関連疾患からなる群から選択される疾患である。【選択図】図10
Description
新規性喪失の例外適用申請有り
本発明は、配座異性体抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリンワクチン補助剤ベースのワクチンの製造およびその応用に関する。
抗体は、抗原と特異的に結合して抗原-抗体反応を起こして免疫反応を起こす物質である。免疫系から細菌やウイルスなどの外部抗原だけでなく、癌とその他の自家由来の内部抗原を認識し特異的な結合をして、同時に中和またはオプソニンの食作用をする免疫グロブリンを免疫抗体というが、一般的に抗体と称するものは、特定抗原を特異的に認識し結合する免疫抗体を意味する。
抗体は、抗原提示細胞が、外因性または内因性抗原を貪食し消化して、Tリンパ球に伝えることで、その形成が開始される。最初感染を通じて当該抗原を認識する特定画分のB細胞クローンが選択および拡張された後、当該細胞は、形質細胞(plasma cell)に分化されて抗体を形成することになる。免疫反応の特性上、最初感染の時期に比べて再感染時の抗体形成の速度および量が爆発的に高くなり、これは現在の感染性疾患などの予防、または特定種類の癌(癌抗原を高く発現するタイプの癌)の免疫治療用のワクチン接種の理論的な基盤として知られている。
抗原-抗体結合を介して認識された抗原の除去機序は、現在、以下のように知られている。その中で最も広く知られているのは、貪食細胞による食作用を促進するオプソニンの食作用である。また、ナチュラルキラー細胞によるADCC(antigen dependent cell-mediated cytotoxicity)は、ウイルスおよび細胞内の感染病原菌の感染や特定抗原を標識する腫瘍の除去などに非常に重要な役割を果たすことが知られている。最後に、抗原-抗体結合によって誘導される代案的副補体経路(alternative complement activation pathway)は、病原菌の感染などに対して、人体の免疫系が対応する強力な対応法の一つである。
抗体の存在が明らかになった後、感染性疾患だけでなく、腫瘍などの複数の疾患群の治療に抗原-抗体反応を用いようとする努力があった。抗原-抗体反応は、これまで知られている生体内外の複数の生物学的な結合反応の中、非常に高い(~10-12mol/L)特異度(specificity)を有していることが知られており、これを用いて、より安全で、高い治療効果を有する治療法を開発することができると期待されているからである。1990年代の後半に至ってモノクローナル抗体を用いた腫瘍の治療技術が開発されながら、2006年以来、現在まで米国FDAから市販が許可されたTop 10薬物の80%以上がモノクローナル抗体ベースの薬物が占めている。特に、癌のような新生物疾患の新しい治療法として抗体治療をはじめ、複数の免疫治療法が脚光を浴びているが、2014年免疫チェックポイント阻害剤である抗PD-1モノクローナル抗体の市販が許可された後、癌治療の分野で最も脚光を浴びる分野として浮上している。
このような抗体ベースの免疫治療の成功のためには、適切な抗原の選定および最適化された抗体の製造が必須要件である。つまり、特定疾患において、高い選択性および特異度を有する標的抗原を発掘すべきことだけでなく、これを特異的に認識し結合する抗体の生産技術の開発は、抗体ベースの免疫治療の成否を左右する最も重要な段階とすることができる。
現在まで免疫学的に抗体が認識し結合することができる抗原の特性に応じて、大きく二つに分けることができる。一番目は、抗原提示細胞で消化されて提示されたオリゴペプチド(8-12個のアミノ酸)の配列を認識し結合する「線形エピトープ認識抗体」であり、二番目は、抗原が有している固有の3次元構造を認識し結合する「構造認識抗体または配座異性体認識抗体(conformer recognizing antibody)」である。特定抗原に対する抗体の生成が誘導されるとき、殆ど(~90%)の抗体は、一番目の抗体の分類である「線形エピトープ認識の抗体」が生成される。しかし、これまで知られているところによると、抗原の配列を認識し結合することができる配列認識抗体より抗原の構造自体を認識する抗体、すなわち配座異性体認識抗体の場合が、抗原に対してより高い特異性を有するだけでなく、特定構造的な特性を示す抗原に対して結合力を有することができるわけで、抗原-抗体反応に伴う免疫学的な機序をより高く誘導することができる長所がある。
現在、様々な感染性疾患に対する予防ワクチンが開発されたにもかかわらず、いまだにHIV(human immunodeficiency virus)とRSV(Respiratory syncytial virus)を含む複数の感染性疾患や癌などの新生物疾患、タウ病症によるアルツハイマー病およびパーキンソン病、プリオン関連疾患などの神経変性疾患の予防および治療ワクチンは未だはるかに遠い状態である。
また、既にワクチンが開発されたインフルエンザの場合には、誘発病原菌であるインフルエンザウイルス特有の頻繁な抗原変異によって毎年ワクチンを接種を受けないといけないだけでなく、当該年度の予測流行株と実際流行株が異なる場合、まったく予防効果を示すことができない大きな欠点が存在する。これは未だ現在のワクチン開発技術を用いて誘導する抗体の生産に大きな障害があることを示唆していると言える。
即ち、殆どの現在技術で生産される人工抗原を用いたワクチン接種で誘導される抗体は、「線形のエピトープ認識抗体」であるわけで、当該エピトープの変形がひどい場合や、抗原単独ではなく、抗原のポリマーによって形成された構造抗原に対する配座異性体認識が必ず要る場合には、現在の技術では解決できないわけである。
前述したHIVワクチンの場合、広範囲中和抗体(broadly neutralizing antibody)の誘導が成功的なワクチン療法の必須要件であると考えられる。即ち、AIDSワクチンの成功も、最終的には、外皮糖タンパク質三重体(envelope glycoprotein trimer)に対する構造認識抗体誘導の可否にかかっているといえる。それだけでなく、RSVワクチンも表面抗原に対する配座異性体認識が必須であり、一度の接種でインフルエンザAウイルス特有の抗原小変異(antigenic drift)を防ぐことができるユニバーサルインフルエンザワクチンも変異が多様で頻繁なヘマグルチニン(hemeagglutinin; HA)のヘッド構造ではない、比較的に変異が少ない茎(stalk)部位に対する配座異性体認識が必須だといえる。
感染性疾患だけではなく、新生物疾患および神経変性疾患などの内因性疾患に対する成功的な免疫治療のためにも効果的な配座異性体認識抗体の誘導が非常に重要である。
特に、内因性タンパクの病的変化によって誘発されるタウ病症性アルツハイマー病の場合、正常的に存在するタウ単量体は、ニューロン軸索の強健性を維持するに必須であるが、ある刺激などによって過剰リン酸化が誘発された場合、互いに凝集して形成されるPHF(paired helical filament)の形のタウ凝集体は、タウ病症を誘発し、周囲の他のニューロンの病的損傷を生じることと知られている。これはタウ病症だけでなく、アルファシヌクレインの病的過剰リン酸化および凝集によって発生することと知られているパーキンソン病だけではなく、プリオンによるクロイツフェルト-ヤコブ病など複数の神経変性および神経系疾患で現われる現象である。従って、このような神経変性疾患に対する成功的でありながら、安全な免疫治療を図るためには、病的な形態の内因性タンパク質凝集体のみを選択的に認識し結合するが、正常形態の単量体には結合しない配座異性体認識抗体の誘導が非常に必須的だということができる。
本発明者は、配座異性体(conformer)抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリン-ベースのワクチン組成物を製造しようと努力した。その結果、タウタンパク質の疾患媒介部位、即ち、過剰リン酸化が誘発される部位であるRD(repeated domain)と敗血症ビブリオ菌(Vibrio vulnificus)の鞭毛構成因子であるFlaBタンパク質の組み換えタンパク質を製造して、アルツハイマー病を誘発する内因性タンパク質であるタウ(τ)タンパク質の過剰リン酸化および凝集を抑制して、アルツハイマー病を改善、予防および治療することができるワクチン組成物を製造し、ノロウイルス(norovirus)の膜タンパク質であるPドメイン(P domain)と敗血症ビブリオ菌の鞭毛構成因子であるFlaBタンパク質の組み換えタンパク質を製造してノロウイルスワクチン組成物を製造することにより、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、タウ(τ)タンパク質のRDとビブリオバルニフィカス由来FlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を提供することにある。
本発明の他の目的は、神経変性疾患(Neurodegenerative disease)の予防または免疫治療用のワクチン組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、タウ(τ)タンパク質のRDをコードするコドン-最適化されたヌクレオチドを提供することにある。
本発明の他の目的は、ノロウイルスのPドメインおよびビブリオバルニフィカス由来FlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ノロウイルスの予防用のワクチン組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、配座異性体認識抗体誘導用のワクチン組成物の製造方法を提供することにある。
本発明の一様態によると、本発明は、(a)タウ(τ)タンパク質のRD(repeated domain);および(b)敗血症ビブリオ菌(Vibrio vulnificus)鞭毛構成因子であるFlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物を提供する。
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)感染性ウイルスのカプシドタンパク質;および(b)ビブリオバルニフィカス由来FlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を含む配座異性体抗原認識抗体誘導用の感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
本発明者らは配座異性体(conformer)抗原認識抗体の生産を誘導するフラジェリン-ベースのワクチン組成物を製造しようと努力した。その結果、タウタンパク質の疾患媒介部位であるRD(repeated domain)およびビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)由来FlaBタンパク質の組み換えタンパク質を製造して、アルツハイマー病を誘発する内因性タンパク質であるタウ(τ)タンパク質の過剰リン酸化および凝集を抑制して、アルツハイマー病を改善、予防および治療することができるワクチン組成物を製造し、ノロウイルス(norovirus)の膜タンパク質であるPドメイン(P domain)およびビブリオバルニフィカス由来FlaBタンパク質の組み換えタンパク質を製造してノロウイルスワクチン組成物を製造した。
本発明の特徴および利点を要約すると次の通りである:
(a)本発明は、配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物および感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
(b)本発明のワクチン組成物は、配座異性体抗原認識抗体の生成を誘導する。
(c)これらの配座異性体抗原認識抗体は、抗原に対して高い特異度を有するので、疾患の改善、予防または治療に有効に用いることができる。
(a)本発明は、配座異性体抗原認識抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物および感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
(b)本発明のワクチン組成物は、配座異性体抗原認識抗体の生成を誘導する。
(c)これらの配座異性体抗原認識抗体は、抗原に対して高い特異度を有するので、疾患の改善、予防または治療に有効に用いることができる。
本発明は、(a)タウ(τ)タンパク質のRD;および(b)ビブリオバルニフィカス由来FlaB タンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む神経変性疾患のワクチン組成物は、配座異性体抗原認識抗体の生産を誘導する。
本明細書において、用語、「タウタンパク質」は、中枢神経系、特に神経細胞の軸索突起に主に発現される微小管結合タンパク質(microtubule-associated protein, MAP)として微小管を安定化させる役割を果たす。
アルツハイマー病をはじめとする複数の神経変性疾患の病因に対して様々な学説が存在するが、現在、最も脚光を浴びている学説は、内因性タンパク質の異常発生(過剰リン酸化、hyperphosphorylationなど)及びこれらの凝集(aggregation)による神経細胞(neuron)の枯死(apoptosis)および神経膠細胞(glial cell)などの過剰活性(overactivation)などによる慢性炎症反応の誘発およびそれに伴う脳組織の破壊である。
タウタンパク質の262番目ないし356番目のアミノ酸の間に位置する反復ドメイン(repeated domain;以下RD)がタウタンパク質のリン酸化と関連したドメインに明らかになった。定常状態では、細胞内のリン酸化酵素(kinase)および脱リン酸化酵素(phosphatase)のバランスの取れた調節によりタウタンパクの過剰リン酸化が調節されるが、いくつかの内因性および外因性の刺激によってこの調節メカニズムに問題が生じた場合、タウタンパクの過剰リン酸化誘導される。過剰リン酸化されたタウタンパクは、水に対する溶解度が高かった本来の性質で溶解度が極めて低下することになり、自ら凝集(aggregation)を形成することになる。この凝集された過剰リン酸化されたタウタンパク質は、アルツハイマー病患者の剖検脳試料から神経原線維変化(neurofibrillary tangle;以下NFT)で観察される。凝集されたタウタンパク質は、初期には神経細胞の軸索部分に主に分布して軸索の微小管の安定性の阻害などを起こして、細胞の正常な活動を妨害し、神経細胞の枯死を引き起こすことになる。しかし、中等度以上のタウタンパク質の凝集は、周辺神経細胞および膠細胞にまで伝播されて、当該事件が起こった細胞だけでなく、周辺の他の細胞の枯死および小膠細胞(microglia)の活性による慢性炎症を誘発するなど、脳組織の広範囲な破壊を誘発することになり、これにより、神経変性疾患を示すことになる。
本発明は、タウタンパク質の262番目ないし356番目のアミノ酸の間に位置しているRDを組み換えタンパク質を製造して、これの抗原(または免疫原)としての機能を確認する。
本明細書において、用語「配座異性体抗原認識抗体」は、抗原固有の3次元構造を認識し結合する構造認識抗体を意味する(A K Abbas & A H Lichtman, Cellular and molecular immunology, 6th edition, 2003, Elsevier, p.59)。
本明細書において、用語「抗原(antigen)」は、上述したタウタンパク質から由来されたRDタンパク質で、免疫系を刺激して生体に特異的な免疫反応を誘導する物質を意味し、本発明において、用語「免疫原(immunogen)」と混用して使用されることができる。
上記組み換えタンパク質は、当業界に公知された様々な方法によって製造することができる。例えば、遺伝子クローニングの方法を通じて製造することができる。
本発明の一具現例によると、上記RDは、配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなる。
上記RDは、大腸菌発現のためにコドン最適化された(codon optimized)配列表の配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる。
上記組み換えタンパク質を大腸菌を用いて製造するために、タウタンパク質のRDのヌクレオチド配列を大腸菌(Escherichia coli)での発現に適したコドン最適化(codon optimization)する。上記ヒト由来RDが大腸菌で高発現されることができるように、大腸菌に適したコドンに転換した。コドン最適化プロセスを経ると遺伝子配列は、塩基配列のみ転換されるだけで、アミノ酸配列は転換されない。
本発明で用いられるヌクレオチド配列は、前述された配列の以外に、上記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。上記の実質的な同一性は、本発明のヌクレオチド配列と、任意の他の配列を最大限に対応されるようにアライン(align)し、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いて、アライメントされた配列を分析した場合に、少なくとも80%の相同性、より好ましくは少なくとも90%の相同性、最も好ましくは少なくとも95%の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。アライメントに対する様々な方法およびアルゴリズムは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24:307-31(1988);Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988);Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992)and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)に開示されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., Mol. Biol. 215:403-10(1990))は、NBCI(National Center for Biological Information)などでアクセス可能であり、インターネット上でblastp, blasm, blastx, tblastnおよびtblastxのような配列分析プログラムと連動されて用いることができる。BLASTはwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性の比較方法は、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlで確認することができる。
上記組み換えタンパク質を構成するFlaBタンパク質はビブリオバルニフィカス由来の免疫補助剤(adjuvant)である。
本発明の一具現例によると、上記FlaBタンパク質は配列番号の配列番号2のアミノ酸配列からなる。
下記実施例で立証されたように、上記組み換えタンパク質は、配列表の配列番号7のアミノ酸配列によってなり、配列表の配列番号6のヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の組成物には、他の薬物または他の免疫補助剤が含まれて追加的な免疫刺激効果を提供することができる。例えば、アルミニウム塩(Al(OH)3, AlPO4)、スクアレン(squalene)、ソルビタン(sorbitane)、ポリソルベート80(polysorbate 80)、CpG、リポソーム(liposome)、コレステロール(cholesterol)、MPL(monophosphoryl lipid A)、界面活性物質、細菌由来物質、サイトカイン、ホルモン、多価陰イオン(polyanion)、ポリアクリル(polyacryl)、担体(carrier)、生ベクター(living vector)、ミネラルオイル(mineral oil)、ビブリオコレラ(Vibrio cholerae)由来コレラ毒素(cholera toxin)とGLA(glucopyranosyl lipid A)を含むが、これに限定されない。
下記実施例で立証されたように、本発明の(a)タウ(τ)タンパク質のRD;および(b)ビブリオバルニフィカス由来FlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む神経変性疾患のワクチン組成物は、経口または非経口投与用のワクチン組成物である。
本発明の一具現例によると、上記組成物は、粘膜、皮下、皮内、経皮または筋肉内接種用である。
本発明の他の具現例によると、上記組成物は粘膜接種用である。
上記粘膜投与は、経口投与(oral immunization)、鼻腔投与(intranasal immunization)、舌下投与(sublingual immunization)、直腸投与(rectal immunization)および膣内投与(vaginal immunization)を含み、これに限定されない。
上記タウタンパク質の過剰リン酸化は凝集体(aggregate)を形成するようにし、上記凝集された過剰リン酸化されたタウタンパク質は、アルツハイマー病患者の剖検脳試料から神経原線維変化(neurofibrillary tangle)で観察される。上記凝集されたタウタンパク質は、神経細胞の軸索部分に主に分布して軸索の微小管の安定性に阻害などを起こして、細胞の正常な活動を妨害し、神経細胞の枯死を引き起こす。ひどい場合に周辺の他の細胞の枯死および小膠細胞(microglia)の活性による慢性炎症を誘発するなど、脳組織の広範囲な破壊を誘発することになり、これにより、神経変性疾患の症状が発現することになる。
本発明の一具現例によると、上記ワクチン組成物は、タウタンパク質凝集体(aggregate)に特異的な抗体の生成を誘導する。
本発明の他の具現例によると、上記抗体は、タウタンパク質の凝集(aggregation)を抑制する。
本発明のワクチン組成物を対象に投与して生成される抗体は、タウタンパク質の凝集を抑制する。
本発明の他の具現例によると、上記抗体は、オプソニンの食作用(opsonic phagocytosis)を促進する。
本明細書において、用語「オプソニンの食作用」は、白血球の食作用を助けるオプソニン(opsonin)による貪食(または食菌)作用を意味する。
本発明のワクチン組成物は、神経変性疾患に対する改善、予防または治療用ワクチンの組成物である。
本発明の一具現例によると、上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオンによる疾患などで構成された群から選択される疾患である。
本発明の他の具現例によると、上記タウ性病症は嗜銀顆粒性認知症(argyrophilic grain dementia)、大脳皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、ボクサー認知症(dementia pugilistica)、神経原線維のもつれ(neurofibrillary tangles)、17番染色体関連前頭側頭型認知症(Frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17)、ハレルフォルデン‐スパッツ症候群(Hallervorden-Spatz disease)、筋緊張性ジストロフィー(Myotonic dystrophy)、ニーマン-ピック病C型(Niemann-Pick disease type C)、ピック病(Pick’s disease)、脳炎後パーキンソニズム(Postencephalitic parkinsonism)、進行性皮質下グリオーシス(Progressive subcortical gliosis)、進行性核上麻痺(Progressive supranuclear palsy)、亜急性硬化性全脳炎(Subacute sclerosing panencephalitis)とクロイツフェルト-ヤコブ病などのプリオンによって誘発される疾患を含む。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分ら以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食品、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因らによって多様に処方されることができる。一方、本発明の薬剤学的組成物の経口投与量は、好ましくは、1日あたりの0.001-100mg/kg(体重)である。
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体および/または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に内入れて製造されることができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
本発明の別の様態によると、本発明は、タウ(τ)タンパク質のRDをコードするコドン-最適化された配列表の配列番号5のヌクレオチドを提供する。
本発明のヌクレオチドは、上記組み換えタンパク質を構成するヌクレオチドで、このふたつの間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明の別の様態によると、本発明は、(a)感染性ウイルスのカプシドタンパク質;および(b)敗血症ビブリオ菌(Vibrio vulnificus)鞭毛構成因子であるFlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む感染性ウイルスワクチン組成物を提供する。
本発明の一具現例によると、上記感染性ウイルスは、ノロウイルス(norovirus)、ヒト免疫不全ウイルス(human inmmunodeficiency virus)または呼吸器多核体ウイルス(resiratory syncytial virus)である。
本発明の他の具現例によると、上記感染性ウイルスのカプシドタンパク質は、ノロウイルスのPドメインである。
上記ノロウイルスは、腸炎誘発ウイルスで、食中毒発生原因の約50%がノロウイルスによるものであり、ウイルス性胃腸炎の96%がノロウイルスによるものだと報告されたことがある(Centers for Disease Control and Prevention, Surveillance for Norovirus Outbreaks)。ノロウイルスのカプシド遺伝子の塩基配列は、ウイルス抗原と密接な関係を有している。ノロウイルスのカプシドタンパク質は大きくS、P1、P2の3タンパク質ドメインで構成されており、Sドメインは保存的部位(conserved region)であり、P1とP2のタンパク質配列の変化によって、抗原の多様性(antigenic diversity)が発生することが知られている(Hardy, M. E., 2005)。
上記PドメインはノロウイルスVLP(virus like particle)のP1およびP2を含む222番目から539番目までのアミノ酸を含み、これは、配列表の配列番号13のアミノ酸配列からなり、上記アミノ酸は配列表の配列番号12のヌクレオチド配列によってコードされる。
下記実施例で立証されたように、上記組み換えタンパク質は、配列表の配列番号15のアミノ酸配列によってなり、配列表の配列番号14のヌクレオチド配列によってコードされる。
上記ワクチン組成物は、ノロウイルスの構造を特異的に認識する抗体の生成を誘導する。
上記ワクチン組成物は、経口または非経口投与用のワクチン組成物である。
本発明の一具現例によると、上記組成物は、粘膜、皮下、皮内、経皮または筋肉内接種用である。
本発明の他の具現例によると、上記組成物は粘膜接種用である。
上記粘膜投与は、経口投与(oral immunization)、鼻腔投与(intranasal immunization)、舌下投与(sublingual immunization)、直腸投与(rectal immunization)および膣内投与(vaginal immunization)を含み、これに限定されない。
下記実施例で立証されたように、上記ワクチン組成物は、血清中の抗原特異的IgGおよびIgAの生成を増加させる。また、糞便内の抗原特異的IgGの生成を増加させることを確認した。
本発明の感染性ウイルスワクチン組成物は、上記の神経変性疾患のワクチン組成物を構成するFlaBタンパク質、薬剤学的組成物としての用途などが似ているので、このふたつの間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に応じて、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例1:アルツハイマー病の免疫ワクチンの製造
実験材料
各菌株の培養および保管
本発明で使用した大腸菌菌株らは、LB(Luria Bertani)培地(Difco Co.)で培養した。使用した菌株らは、培養後、グリセロールが30%になるように添加した後-80℃超低温冷凍庫で保管した。本発明に用いられた菌株とプラスミドは、表1にまとめた。
実験材料
各菌株の培養および保管
本発明で使用した大腸菌菌株らは、LB(Luria Bertani)培地(Difco Co.)で培養した。使用した菌株らは、培養後、グリセロールが30%になるように添加した後-80℃超低温冷凍庫で保管した。本発明に用いられた菌株とプラスミドは、表1にまとめた。
実験方法および実験結果
1. タンパク質の発現と精製
a. 敗血症ビブリオ菌由来FlaB組み換えタンパク質の発現および精製
敗血症ビブリオ菌CMCP6の鞭毛構成因子FlaBの遺伝子配列(配列表の配列番号1)を用いて、flaB組み換えタンパク質を製造した。フラジェリン遺伝子flaBのN-末端またはC-末端融合用のDNA断片を得るために配列表の配列番号8および配列番号9に記載されたFlaB-NおよびFlaB-Cプライマー対を使用してN-末端融合用の、またはC-末端融合用のFlaB遺伝子が含まれている1.1kbpのDNA断片を増幅した。即ち、それぞれのプライマー対を用いたPCR反応は、95℃で5分間の初期変性させた後、95℃で30秒間変性、60℃で30秒間のアニーリング、および2℃で1分間伸長するサイクルを30回繰り返した後、最後に2℃で10分間反応させる条件で実施した。
1. タンパク質の発現と精製
a. 敗血症ビブリオ菌由来FlaB組み換えタンパク質の発現および精製
敗血症ビブリオ菌CMCP6の鞭毛構成因子FlaBの遺伝子配列(配列表の配列番号1)を用いて、flaB組み換えタンパク質を製造した。フラジェリン遺伝子flaBのN-末端またはC-末端融合用のDNA断片を得るために配列表の配列番号8および配列番号9に記載されたFlaB-NおよびFlaB-Cプライマー対を使用してN-末端融合用の、またはC-末端融合用のFlaB遺伝子が含まれている1.1kbpのDNA断片を増幅した。即ち、それぞれのプライマー対を用いたPCR反応は、95℃で5分間の初期変性させた後、95℃で30秒間変性、60℃で30秒間のアニーリング、および2℃で1分間伸長するサイクルを30回繰り返した後、最後に2℃で10分間反応させる条件で実施した。
大腸菌株発現のための発現システムは、NEB社のIntein-CNシステムを用い、当該システムのpTYB12プラスミドをEcoRIとPstIで制限酵素処理した後、増幅されたflaB PCR産物をライゲーション処理した(pCMM11101)。ライゲーションしたプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号8および配列番号9のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(CMM11101)。
CMM11101大腸菌株を5ブロモ-インドール3-クロロイソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)0.5mMを加えて発現を誘導した。メーカー(New England Biolabs Inc.)の指針に従って、キチン質ビーズコラムと1,4-ジチオトレイトール(1,4-DTT)を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号2のFlaBタンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素(endotoxin)はAffinityPakTMDetoxi GglTM Endotoxin Removing gel(Pierece社)を用いて除去した。
b. 組み換えタウ反復ドメイン(repeated domain)の発現および精製
抗原としてヒトτ(タウ)タンパク質の過剰リン酸化に対する高い関連性を有している反復ドメイン(repeated domain; RD)全体を大腸菌を用いて組み換えタンパク質を製造した。組み換えタンパク質の生産のために、その遺伝子(配列表の配列番号4)を大腸菌に対してコドン最適化および遺伝子合成を行った(配列表の配列番号5)。クローニングの容易性のために、遺伝子合成時N-末端およびC-末端にそれぞれEcoRIおよびXhoI制限酵素認識遺伝子配列を追加した。融合用のDNA断片を得るために記載されたtauRD-N(配列表の配列番号10)およびtauRD-C(配列表の配列番号11)プライマー対を使用してN-末端融合用またはC-末端融合用のtauRD遺伝子が含まれてある1.1kbpのDNA断片を増幅した。つまり、それぞれのプライマー対を用いたPCR反応は、95℃で5分間の初期変性させた後、95℃で30秒間変性、60℃で30秒間のアニーリング、および72℃で1分間伸長するサイクルを30回繰り返した後、最後に72℃で10分間反応させる条件で実施した。大腸菌株の発現のための発現システムは、NEB社のIMPACT-CNシステムを用い、当該システムのpTYB12プラスミドをEcoRIとPstIで制限酵素処理した後、増幅されたtauRD PCR産物をライゲーション処理した(pCMM11102)。ライゲーション処理したプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号10及び配列番号11のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(CMM11102)。
抗原としてヒトτ(タウ)タンパク質の過剰リン酸化に対する高い関連性を有している反復ドメイン(repeated domain; RD)全体を大腸菌を用いて組み換えタンパク質を製造した。組み換えタンパク質の生産のために、その遺伝子(配列表の配列番号4)を大腸菌に対してコドン最適化および遺伝子合成を行った(配列表の配列番号5)。クローニングの容易性のために、遺伝子合成時N-末端およびC-末端にそれぞれEcoRIおよびXhoI制限酵素認識遺伝子配列を追加した。融合用のDNA断片を得るために記載されたtauRD-N(配列表の配列番号10)およびtauRD-C(配列表の配列番号11)プライマー対を使用してN-末端融合用またはC-末端融合用のtauRD遺伝子が含まれてある1.1kbpのDNA断片を増幅した。つまり、それぞれのプライマー対を用いたPCR反応は、95℃で5分間の初期変性させた後、95℃で30秒間変性、60℃で30秒間のアニーリング、および72℃で1分間伸長するサイクルを30回繰り返した後、最後に72℃で10分間反応させる条件で実施した。大腸菌株の発現のための発現システムは、NEB社のIMPACT-CNシステムを用い、当該システムのpTYB12プラスミドをEcoRIとPstIで制限酵素処理した後、増幅されたtauRD PCR産物をライゲーション処理した(pCMM11102)。ライゲーション処理したプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号10及び配列番号11のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(CMM11102)。
CMM11102大腸菌株を5-ブロモインドール3-クロロイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド(IPTG)0.5mMを加えて発現を誘導した。メーカー(New England Biolabs Inc.)の指針に従って、キチン質ビーズコラムと1,4-ジチオトレイトール(1,4-DTT)を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号3のアミノ酸配列を有するTauRDタンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素(endotoxin)はAffinityPakTMDetoxi GelTM Endotoxin Removing gel(Pierece社)を用いて除去した。
精製した組み換え融合タンパク質の発現を確認するためにSDS-PAGEを用いた組み換え融合タンパク質の分子量を確認した結果、13KDaサイズの組み換え融合タンパク質が製造されることを確認した(図2)。
精製した組み換え融合タンパク質が、適切なタウタンパク質の断片であるかを確認するために抗-タウ抗体を用いてウエスタンブロットを実施した結果、抗-タウ抗体に特異的なバンドを確認した(図2)。
c. 組み換えFlaB-TauRD融合タンパク質製造用の遺伝子クローニング
pCMM11101のflaB遺伝子をEcoRIとPstI制限酵素を用いて処理し、pCMM11102も同じ制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれのflaB遺伝子切片とpCMM11102プラスミドを精製した。この二つの遺伝子をライゲーションしてpTYB12::flaB-tauRD遺伝子融合プラスミドを製造した(pCMM11103)。ライゲーションしたプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号8及び配列番号11のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(pCMM11104)。
pCMM11101のflaB遺伝子をEcoRIとPstI制限酵素を用いて処理し、pCMM11102も同じ制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれのflaB遺伝子切片とpCMM11102プラスミドを精製した。この二つの遺伝子をライゲーションしてpTYB12::flaB-tauRD遺伝子融合プラスミドを製造した(pCMM11103)。ライゲーションしたプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号8及び配列番号11のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(pCMM11104)。
pCMM11103大腸菌株を5ブロモインドール3-クロロイソプロピルβ-D-ガラクトピラノシド(IPTG)0.5mMを加えて発現を誘導した。メーカー(New England Biolabs Inc.)の指針に従って、キチン質ビーズコラムと1,4-ジチオトレイトール(1,4-DTT)を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号6のFlaB-TauRD融合タンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素はAffinityPakTMDetoxi GelTM Endotoxin Removing gel(Pierece社)を用いて除去した。
精製したFlaB-TauRDの的確性を確認するために、SDS-PAGEおよびFlaB特異的マウス抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、精製したFlaB-TauRD融合タンパク質は、57KDaサイズの諸サイズのバンドを見せ、ウェスタンブロット上でもFlaB特異的抗血清と結合することを確認した(図3)。
図4は、FlaBと一部のTauタンパク質を発現させたTau-Agを免疫して得た抗血清がTau pathologic conformerのPHFと反応する「構造認識抗体」の生成を誘導することを示す実験結果を示す。免疫に使用したTau-AgをSDS-PAGE方法で分離した後、ナイロン膜にトランスファーしポンソーS染色した結果、単量体タンパク質を確認した。同じ方法で準備した膜をFlaBとTau-Agを免疫して得た抗血清で免疫ブロットした場合には、単量体バンドは殆ど認識できず、ポンソーS 染色では全く観察されなかった極少量の多量体構造体を強力に認識した。これを反証するために、多量体構造を維持させた状態で、native PAGEした後、免疫ブロットした結果、標準血清は全く感知できない多量体構造体を免疫血清は強く反応することを確認した。これは、本発明で誘導された抗血清は、アルツハイマー病を誘発するタウ凝集体に対して、はるかに高い結合力を示すものである。
d. 組み換えFlaB-TauRDタンパク質の特性確認
(1)組み換えFlaB-TauRDタンパク質のTLR5刺激能の確認
精製した組み換えタウ-RDペプチド自体がフラジェリンの作用点であるTLR5に対して刺激能を保持しているかどうかを確認するために、ウェル平板培養基に293-T細胞を1×105細胞ずつ分注して一夜培養した後、EFFECTENE(Effectene、QIAGEN)を用いて、NF-κ-Lucプラスミド(漢陽大学校医学部微生物学教室のKim Jeongmok教授から取得)、TLR-5遺伝子がクローニングされたp3xFlag-hTLR-5プラスミド(米国Wake Forest University School of Medicine、Department of Microbiology and ImmunologyのSteven B. Mizelから取得)およびβ-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)発現対照群ラスミド(Clontech)を同時に細胞内に導入させた。24時間追加培養した後、新しい培地に交換し、IMPACTシステムで分離したFlaBおよびタウ-RDペプチドを一定時間処理した後、ルシフェラーゼ(luciferase)活性を発光分析器(Luminometer、Berthold社)を用いて測定してNF-κBの転写精度を確認し、その結果を図5に示した。図5の結果から抗原として用いた遺伝子組み換えタウ-RDペプチドはTLR5刺激能を見せなかったが、FlaB-TauRD融合タンパク質は、FlaB対比の有意なTLR5刺激能を示した。
(1)組み換えFlaB-TauRDタンパク質のTLR5刺激能の確認
精製した組み換えタウ-RDペプチド自体がフラジェリンの作用点であるTLR5に対して刺激能を保持しているかどうかを確認するために、ウェル平板培養基に293-T細胞を1×105細胞ずつ分注して一夜培養した後、EFFECTENE(Effectene、QIAGEN)を用いて、NF-κ-Lucプラスミド(漢陽大学校医学部微生物学教室のKim Jeongmok教授から取得)、TLR-5遺伝子がクローニングされたp3xFlag-hTLR-5プラスミド(米国Wake Forest University School of Medicine、Department of Microbiology and ImmunologyのSteven B. Mizelから取得)およびβ-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)発現対照群ラスミド(Clontech)を同時に細胞内に導入させた。24時間追加培養した後、新しい培地に交換し、IMPACTシステムで分離したFlaBおよびタウ-RDペプチドを一定時間処理した後、ルシフェラーゼ(luciferase)活性を発光分析器(Luminometer、Berthold社)を用いて測定してNF-κBの転写精度を確認し、その結果を図5に示した。図5の結果から抗原として用いた遺伝子組み換えタウ-RDペプチドはTLR5刺激能を見せなかったが、FlaB-TauRD融合タンパク質は、FlaB対比の有意なTLR5刺激能を示した。
(2)組み換えFlaB-TauRD混合ワクチン投与によるタウ抗原特異的抗体形成能の比較
本発明によるフラジェリンタウ-RDペプチド混合ワクチンを6週齢の雌Balb/cマウス(オリエントバイオ、韓国)の鼻腔内へ1週間間隔で3回、5回および6回免疫した後、血清を得てタウ-RDペプチド特異的な抗体の形成を比較した(図6)。比較のために、組み換えフラジェリンタウ-RDタンパク質を96ウェル平板ELISAプレートにコーティングした後、免疫で得られた抗血清を2倍連続-希釈して処理して間接ELISA法を通じて確認した。
本発明によるフラジェリンタウ-RDペプチド混合ワクチンを6週齢の雌Balb/cマウス(オリエントバイオ、韓国)の鼻腔内へ1週間間隔で3回、5回および6回免疫した後、血清を得てタウ-RDペプチド特異的な抗体の形成を比較した(図6)。比較のために、組み換えフラジェリンタウ-RDタンパク質を96ウェル平板ELISAプレートにコーティングした後、免疫で得られた抗血清を2倍連続-希釈して処理して間接ELISA法を通じて確認した。
その結果、フラジェリンタウ-RDペプチド混合ワクチンは、タウ-RDペプチド単独免疫群に比べて高い血清内のIgG形成を示した。それぞれ異なる容量の抗原処理時、3回免疫時には、統計的に有意ではない容量-反応関係を示したが、5回免疫後の場合には、抗原6μg処理群と10μg処理群の間で統計的に有意な抗原特異的抗体形成能を確認することができた。10μg処理群と14μg処理群の間で抗原特異的抗体形成能の差は確認することができなかった(図7a)。
3回、5回および6回の免疫後の抗原特異的抗体形成能を比較した結果では、3回投与群と5回投与群の間で統計的に有意な抗原特異的な抗体形成能の違いを確認することができたが、5回投与群と6回投与群の間では、統計的に有意な差を確認することができなかった(図7b)。
(3)組み換えFlaB-TauRDタンパク質の凝集体形成
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原が自ら凝集体を形成して精製5日後に、図8のようにPHFの形態の凝集体を形成することを、電子顕微鏡を介して確認した。
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原が自ら凝集体を形成して精製5日後に、図8のようにPHFの形態の凝集体を形成することを、電子顕微鏡を介して確認した。
(4)組み換えFlaB-TauRDタンパク質の凝集体誘導
タンパク質のβシート(sheet)の構造に特異的に結合するチオフラビンS(thioflavin S; Green)でタウタンパク質凝集体(精製したタウ-RDペプチドにヘパリン(heparin)を処理して凝集を誘導)を染色し、本発明品の免疫で得られた抗血清を抗-マウスIgGラビットIgGをAlexa fluor 633(Molecular probe)で染色した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてタウタンパク質と抗血清の結合可否および程度を比較した。
タンパク質のβシート(sheet)の構造に特異的に結合するチオフラビンS(thioflavin S; Green)でタウタンパク質凝集体(精製したタウ-RDペプチドにヘパリン(heparin)を処理して凝集を誘導)を染色し、本発明品の免疫で得られた抗血清を抗-マウスIgGラビットIgGをAlexa fluor 633(Molecular probe)で染色した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてタウタンパク質と抗血清の結合可否および程度を比較した。
実験の結果、本発明で誘導された抗血清は、凝集誘導2日目に比べて5日目(より多く凝集された)タウタンパク質に結合する様相を見せた(図9)。
(5)組み換えFlaB-TauRDタンパク質の凝集阻害効果
本発明で誘導された抗タウ血清のタウ凝集阻害効果を確認するために、本発明で誘導された抗血清を、組み換えタウ-RDペプチドに前処理して除去した後、ヘパリンを用いてタウペプチドの凝集を誘導し凝集体の形成程度を透過電子顕微鏡を介して確認した。
本発明で誘導された抗タウ血清のタウ凝集阻害効果を確認するために、本発明で誘導された抗血清を、組み換えタウ-RDペプチドに前処理して除去した後、ヘパリンを用いてタウペプチドの凝集を誘導し凝集体の形成程度を透過電子顕微鏡を介して確認した。
生理食塩水を免疫して獲得した対照血清を前処理した場合には、タウタンパク質の凝集が観察されるが、本発明で誘導された抗血清を前処理した場合には、タウタンパク質の凝集が低下する現象を観察した(図10)。
(6)組み換えFlaB-TauRDタンパク質の貪食活性
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原提示細胞である小膠細胞細胞株(BV2細胞株、全南大学校医学部のMoon Changjong教授研究室の分譲)のタウ凝集体のオプソニンの食作用(opsonic phagocytosis)の促進可否を確認する実験を行った。組み換えタウ-RDペプチドをヘパリンを用いて、3日間凝集を誘導した後、FNR 488(Green、BioActs、韓国)を用いて染色した。10秒間超音波破砕を通じてタウ凝集体を分けた後、培養したBV2細胞株に、本発明による抗タウ血清と一緒に処理した。対照群としてはPBS免疫を通じて取得した対照血清を用いた。培養30分後、培地を除去し、BV2細胞の核はDAPI(Blue)で染色し、BV2細胞の細胞膜は、麦芽凝集素(Wheat germ agglutinin; WGAは、Red)を用いて染色した後、共焦点顕微鏡を用いて破砕タウ凝集体の貪食可否および程度を比較した。
本発明で誘導された抗血清が脳の特異的抗原提示細胞である小膠細胞細胞株(BV2細胞株、全南大学校医学部のMoon Changjong教授研究室の分譲)のタウ凝集体のオプソニンの食作用(opsonic phagocytosis)の促進可否を確認する実験を行った。組み換えタウ-RDペプチドをヘパリンを用いて、3日間凝集を誘導した後、FNR 488(Green、BioActs、韓国)を用いて染色した。10秒間超音波破砕を通じてタウ凝集体を分けた後、培養したBV2細胞株に、本発明による抗タウ血清と一緒に処理した。対照群としてはPBS免疫を通じて取得した対照血清を用いた。培養30分後、培地を除去し、BV2細胞の核はDAPI(Blue)で染色し、BV2細胞の細胞膜は、麦芽凝集素(Wheat germ agglutinin; WGAは、Red)を用いて染色した後、共焦点顕微鏡を用いて破砕タウ凝集体の貪食可否および程度を比較した。
その結果、本発明で誘導された抗血清で処理した破砕タウ凝集体は、BV2細胞によって貪食されたが、対照血清処理群では、このような現象が発見されなかった。これは、本発明で誘導された抗血清が脳の特異的な抗原提示細胞に高いオプソニンの貪食能を提供することを意味する(図11)。
実施例2:ノロウイルス免疫ワクチンの製造
a. ノロウイルスPドメイン抗原配列及びコドン最適化
ノロウイルスワクチン製造のための抗原用のDNAは、全南大学校のCho Kyeongo教授から取得したノロウイルスPドメインがクローニングされたpGEX-4T-1::VAxxxを用いた。挿入遺伝子配列は、配列表の配列番号12と同一である。
a. ノロウイルスPドメイン抗原配列及びコドン最適化
ノロウイルスワクチン製造のための抗原用のDNAは、全南大学校のCho Kyeongo教授から取得したノロウイルスPドメインがクローニングされたpGEX-4T-1::VAxxxを用いた。挿入遺伝子配列は、配列表の配列番号12と同一である。
b. 組み換えPd抗原製造用の遺伝子クローニング
抗原用のPd遺伝子のN-末端またはC-末端融合用のDNA断片を得るために、配列表の配列番号16及び配列番号17に記載されたPd-NおよびPd-Cプライマー対を使用して配列表の配列番号12のPdを含むプラスミドを鋳型としてPd遺伝子が含まれている1.1kbpのDNA断片を増幅した。即ち、それぞれのプライマー対を用いたPCR反応は、95℃で5分間初期変性させた後、95℃で30秒間変性、60℃で30秒間のアニーリング、および72℃で1分間伸長するサイクルを30回繰り返した後、最後に72℃で10分間反応させる条件で実施した。
抗原用のPd遺伝子のN-末端またはC-末端融合用のDNA断片を得るために、配列表の配列番号16及び配列番号17に記載されたPd-NおよびPd-Cプライマー対を使用して配列表の配列番号12のPdを含むプラスミドを鋳型としてPd遺伝子が含まれている1.1kbpのDNA断片を増幅した。即ち、それぞれのプライマー対を用いたPCR反応は、95℃で5分間初期変性させた後、95℃で30秒間変性、60℃で30秒間のアニーリング、および72℃で1分間伸長するサイクルを30回繰り返した後、最後に72℃で10分間反応させる条件で実施した。
大腸菌株発現のための発現システムは、NEB社のIMPACT-CNシステムを利用し、当該システムのpTYB12プラスミドをEcoRIとPstIで制限酵素処理した後、増幅されたPd PCR産物をライゲーション処理した(pCMM11105)。ライゲーションしたプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号16及び配列番号17のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(pCMM11105)。
pCMM11105大腸菌株を5-ブロモインドール-3-クロロイソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)0.5mMを加えて発現を誘導した。メーカー(New England Biolabs Inc.)の指針に従って、キチン質ビーズコラムと1,4-ジチオトレイトール(1,4-DTT)を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号15のFlaB-Pd融合タンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素はAffinityPakTMDetoxi GelTM Endotoxin Removing gel(Pierece社)を用いて除去した。
精製した組み換えPdタンパク質の的確性を確認するために、SDS-PAGEを実施した(図12)。その結果、精製した組み換えPdタンパク質は44KDaサイズの諸サイズのバンドを示した。
c. 組み換えFlaB-Pd融合タンパク質製造用の遺伝子クローニング
pCMM11101のflaB遺伝子をEcoRIとPstI制限酵素を用いて処理し、pCMM11105も同じ制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれのflaB遺伝子切片とpCMM11104プラスミドを精製した。この二つの遺伝子をライゲーションしてpTYB12::flaB-Pd遺伝子融合プラスミドを製造した(pCMM11106)。ライゲーションしたプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号8及び配列番号17のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(pCMM1106)。
pCMM11101のflaB遺伝子をEcoRIとPstI制限酵素を用いて処理し、pCMM11105も同じ制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれのflaB遺伝子切片とpCMM11104プラスミドを精製した。この二つの遺伝子をライゲーションしてpTYB12::flaB-Pd遺伝子融合プラスミドを製造した(pCMM11106)。ライゲーションしたプラスミドは、E.coli ER2566発現菌株に電気的形質転換を介して形質転換させ、pTYB12プラスミドの選択マーカーであるアンピシリン含有LB寒天板上で生存した菌株のみを選び出して、配列表の配列番号8及び配列番号17のPCRプライマーを用いて、その遺伝子産物の含有可否を確認した(pCMM1106)。
pCMM11105大腸菌株を5-ブロモインドール-3-クロロイソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)0.5mMを加えて発現を誘導した。メーカー(New England Biolabs Inc.)の指針に従って、キチン質ビーズコラムと1,4-ジチオトレイトール(1,4-DTT)を用いて、インテイン融合タンパク質から配列表の配列番号15のFlaB-Pd融合タンパク質を得た。分離されたタンパク質内に含有されている内毒素はAffinityPakTMDetoxi GelTM Endotoxin Removing gel(Pierece社)を用いて除去した。
精製したFlaB-Pdの的確性を確認するためにSDS-PAGEおよびFlaBまたはPd特異的マウス抗血清を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、精製したFlaB-Pd融合タンパク質は、44KDaサイズの諸サイズのバンドを見せ、ウェスタンブロット上でもFlaBおよびPd特異的抗血清と結合することを確認した(図13)。
d. 組み換えFlaB-Pdタンパク質の特性確認
(1)組み換えflaB-Pdタンパク質のTLR5刺激能
FlaB-Pd融合タンパク質の生体効果を類推するために、24ウェル平板培養基に293-T細胞を1X105細胞ずつ分注して一夜培養した後、Effectene(QIAGEN)を用いて、NF-κB-Lucプラスミド(漢陽大学校医学部微生物学教室のKim Jeongmok教授から取得)とTLR-5遺伝子がクローニングされたp3xFlag-hTLR-5プラスミド(米国Wake Forest University School of Medicine, Department of Microbiology and ImmunologyのSteven B. Mizelから取得)β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)発現対照群プラスミド(Clontech)を同時に細胞内に導入させた。24時間追加培養した後、新しい培地に交換し、上記で製造しIMPACTシステムで分離したFlaB-Pd融合タンパク質を一定時間処理した後、ルシフェラーゼ(luciferase)活性を発光分析器(Luminometer、Berthold社)を用いて測定してNF-κB転写精度を確認し、その結果を図14に示した。
(1)組み換えflaB-Pdタンパク質のTLR5刺激能
FlaB-Pd融合タンパク質の生体効果を類推するために、24ウェル平板培養基に293-T細胞を1X105細胞ずつ分注して一夜培養した後、Effectene(QIAGEN)を用いて、NF-κB-Lucプラスミド(漢陽大学校医学部微生物学教室のKim Jeongmok教授から取得)とTLR-5遺伝子がクローニングされたp3xFlag-hTLR-5プラスミド(米国Wake Forest University School of Medicine, Department of Microbiology and ImmunologyのSteven B. Mizelから取得)β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase)発現対照群プラスミド(Clontech)を同時に細胞内に導入させた。24時間追加培養した後、新しい培地に交換し、上記で製造しIMPACTシステムで分離したFlaB-Pd融合タンパク質を一定時間処理した後、ルシフェラーゼ(luciferase)活性を発光分析器(Luminometer、Berthold社)を用いて測定してNF-κB転写精度を確認し、その結果を図14に示した。
(2)組み換えFlaB-Pdタンパク質の構造認識
製造したPdおよびFlaB-Pdタンパク質のワクチン効能を検証するためにオリエント社から購入した6週齢の雌Balb/cマウスを用いた。
製造したPdおよびFlaB-Pdタンパク質のワクチン効能を検証するためにオリエント社から購入した6週齢の雌Balb/cマウスを用いた。
図15のスケジュールでPBS(陰性対照群)、Pd(1μg)、FlaB(1.2μg)+Pd(1.2μg)混合投与、FlaB-Pd(2.2μg)融合タンパク質をそれぞれマウスの鼻腔を介して3回投与した。そして、最後投与の7日後、マウスの全血を獲得した後、血清を分離した。
図16は、ノロウイルスPd抗原の場合に、FlaBと混合投与するだけでは、構造認識抗体が生成されなかったが、組み換えFlaB-Pdタンパク質を抗原として免疫した場合にのみ、単量体は認識できず、抗原構造が維持された細胞溶解物を用いたドットブロット(dot blot)で抗原と反応する構造認識抗体を生成させた。これは抗原によって、タンパク質工学を通じて特殊な抗原構造を備える必要があることを意味する。
(3)電子顕微鏡観察
組み換えノロウイルスPドメインタンパク質とFlaB-Pドメイン融合タンパク質をそれぞれ精製した後、試料らを酢酸ウラニル(uranyl acetate)で染色した後、炭素グリッド(carbon grid)に2μl落とし乾燥した後、JEOL JEM-2100F透過電子顕微鏡を用いて30kVの加速電圧で観察した。その結果、ノロウイルスPドメインの組み換えタンパクでVLP(virus like particle)構造の形成が観察された。FlaB-Pドメイン融合タンパク質の場合、VLPの形態が観察されるが、これらをサブウニット(subunit)にして、互いに凝集された構造を観察することができた(図17)。
組み換えノロウイルスPドメインタンパク質とFlaB-Pドメイン融合タンパク質をそれぞれ精製した後、試料らを酢酸ウラニル(uranyl acetate)で染色した後、炭素グリッド(carbon grid)に2μl落とし乾燥した後、JEOL JEM-2100F透過電子顕微鏡を用いて30kVの加速電圧で観察した。その結果、ノロウイルスPドメインの組み換えタンパクでVLP(virus like particle)構造の形成が観察された。FlaB-Pドメイン融合タンパク質の場合、VLPの形態が観察されるが、これらをサブウニット(subunit)にして、互いに凝集された構造を観察することができた(図17)。
(4)IgGおよびIgAの力価を観察
図15の免疫スケジュールを用いて、6週齢の雌BalB/cマウスに、組み換えPドメイン抗原単独、FlaBとPドメインの混合、FlaB-Pドメイン融合タンパク質ワクチンをマウス鼻腔を介して投与した。3回の免疫後、マウスの全血(図18:血清IgG、図19の血清IgA)および糞便(図20糞便内の分泌性IgAの力価測定)を回収した後、血清を分離した後、組み換えPドメインタンパク質を抗原とする抗原特異的抗体力価をELISAを用いて確認した(2次IgG抗体; Goat Anti-Mouse IgG、Human ads-HRP Cat. No.1030-05、SouthernBiotech、Birmingham、AL 35260、USA:2次IgA抗体; Goat Anti-Mouse IgA-HRP Cat. No.1040-05, SouthernBiotech, Birmingham, AL 35260, USA利用)(図18~20)。その結果、Pドメイン単独投与群に比べてFlaB-Pドメインの混合投与およびFlaB-Pドメインの融合ワクチン投与群の両方で有意な抗原特異的抗体力価の上昇を確認することができた。
図15の免疫スケジュールを用いて、6週齢の雌BalB/cマウスに、組み換えPドメイン抗原単独、FlaBとPドメインの混合、FlaB-Pドメイン融合タンパク質ワクチンをマウス鼻腔を介して投与した。3回の免疫後、マウスの全血(図18:血清IgG、図19の血清IgA)および糞便(図20糞便内の分泌性IgAの力価測定)を回収した後、血清を分離した後、組み換えPドメインタンパク質を抗原とする抗原特異的抗体力価をELISAを用いて確認した(2次IgG抗体; Goat Anti-Mouse IgG、Human ads-HRP Cat. No.1030-05、SouthernBiotech、Birmingham、AL 35260、USA:2次IgA抗体; Goat Anti-Mouse IgA-HRP Cat. No.1040-05, SouthernBiotech, Birmingham, AL 35260, USA利用)(図18~20)。その結果、Pドメイン単独投与群に比べてFlaB-Pドメインの混合投与およびFlaB-Pドメインの融合ワクチン投与群の両方で有意な抗原特異的抗体力価の上昇を確認することができた。
Claims (10)
- (a)タウ(τ)タンパク質のRD(repeated domain);および(b)ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)由来のFlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、病的タウ(τ)タンパク質の凝集を認識する抗体誘導用の神経変性疾患のワクチン組成物。
- 上記RDは、配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
- 上記RDは、大腸菌発現のためにコドン最適化された(codon optimized)配列表の配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
- 上記FlaBタンパク質は、配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
- 上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオン関連疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
- 神経変性疾患の診断に必要な情報を提供する方法であって、
前記方法は、対象由来の採取済の試料における抗体の生成程度を測定する段階を含み、
前記抗体が、(a)タウ(τ)タンパク質のRD(repeated domain);および(b)ビブリオバルニフィカス(Vibrio vulnificus)由来のFlaBタンパク質で構成された組み換えタンパク質を有効成分として含む組成物を前記対象に投与して生成された抗体である、方法。 - 上記RDは、配列表の配列番号3のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記RDは、大腸菌発現のためにコドン最適化された(codon optimized)配列表の配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記FlaBタンパク質は、配列表の配列番号2のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 上記神経変性疾患は、アルツハイマー病、タウ性病症、認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、記憶力低下、重症筋無力症およびプリオン関連疾患からなる群から選択される疾患であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240130 |
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A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240903 |