CN110312524B - 基于诱导生产构象异构体抗原识别抗体的鞭毛蛋白疫苗辅助剂的疫苗的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供构象异构体抗原识别抗体诱导用神经退行性疾病疫苗组合物及感染性病毒疫苗组合物。本发明的疫苗组合物诱导生成构象异构体抗原识别抗体。这种构象异构体抗原识别抗体对抗原具有高特异性，因此能够有效地利用于疾病的改善、预防或治疗。

Description

基于诱导生产构象异构体抗原识别抗体的鞭毛蛋白疫苗辅助 剂的疫苗的制备及其应用
技术领域
本发明涉及基于诱导生产构象异构体抗原识别抗体的鞭毛蛋白疫苗辅助剂的疫苗的制备及其应用。
背景技术
抗体是指与抗原特异性地结合引起抗原-抗体反应免疫反应的物质。在免疫体系中包括病毒等外部抗原识别癌症和其他自身来源的内部抗原，并进行特异性结合来同时起到中和或者调理素吞噬作用的免疫球蛋白被称为免疫抗体，通常所谓的抗体是指特异性地识别特定抗原并结合的免疫抗体。
抗体由抗原呈递细胞吞噬并消化外源性或内源性抗原，并传递至T淋巴瘤细胞来开始其形成。在通过最初感染选择用于识别相应的抗原的特定分馏的B细胞克隆以及扩大后，该细胞分化成原生质细胞(plasma cell)而形成抗体。众所皆知，在免疫反应的特性上，与最初感染时期相比，再次感染时抗体形成的速度及量爆发性地高，当前，这是用于预防传染性疾病等或免疫治疗特定种类的癌症(高表达癌症抗原的种类的癌症)的疫苗接种的理论基础。
当前，通过抗原-抗体识别的抗原的去除机制如下公知。其中最广为人知的是促进基于吞噬细胞的吞噬作用的调理素吞噬作用。此外，公知基于自然杀伤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC，antigen dependent cell-mediated cytotoxicity)在病毒及细胞内感染病原菌病原菌的感染或在标记特定抗原的肿瘤的去除等中起到非常重要的作用。最后，由抗原-抗体结合诱导的补体替代激活途径(alternative complementactivation pathway)是针对病原菌的感染等人体的免疫系对应的强势的对应法之一。
在发现抗体存在后，努力在包括传染性疾病的肿瘤等各种疾病组的中利用抗原-抗体反应。是因为公知抗原-抗体反应为在当前为止公知的生物体内外的各种生物学结合反应中具有非常高的(～10-12mol/L)特异性(specificity)，并且期待利用其可开发进一步安全且具有高治疗效果的治疗法。到1990年代后半，随着开发利用单克隆抗体的肿瘤治疗技术，2006年以来，到当前为止由美国食品和药物管理局(FDA)许可市场上销售的前10药物中基于单克隆抗体的培养药物占80％以上。尤其，作为如癌症等新生物疾病的新治疗法以抗体治疗为首的免疫治疗法受到瞩目，2014年许可作为免疫检查点抑制剂的抗程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)单克隆抗体的市场上销售后，成为在癌症治疗领域中最受瞩目的领域。
为了如上所述的基于抗体的免疫治疗的成功，适当的抗原的选定及最优化的抗体制备为必须要件。即，在特定疾病中不仅需要发掘具有选择性及特异性的靶抗原，而且对其特异性地进行识别并结合的抗体的生产技术的开发可称为左右基于抗体的免疫治疗的成败的最重要的步骤。
当前为止，在免疫学上按抗体可识别并结合的抗原的特性大致可分为两种。第一种为“线性表位识别抗体”，识别在抗原递呈细胞中消化而解吸的寡核苷酸(8-12个氨基酸)的序列并结合，第二种为“结构识别抗体或者构象异构体识别抗体(conformerrecognizingantibody)”，识别抗原具有的固有的三维结构并结合。当诱导对特定抗原的抗体的生成时，大部分(～90％)的抗体生成作为属于第一种抗体分类的“线性表位识别抗体”。但是，众所周知，与可识别抗原的序列并结合的序列识别抗体相比，识别抗原的结构本身的抗体，即，针对于抗原在构象异构体识别抗体的情况下，不仅具有高特异性，而且对于呈现特定结构特性的抗原可具有结合力，因此具有可更高地诱导伴随抗原-抗体反应的免疫学机制的优点。
当前，虽然开发了多种与传染性疾病相关的预防疫苗，但是目前为止包括人类免疫缺陷病毒(HIV，human immunodeficiency virus)及呼吸道合胞病毒(RSV，Respiratorysyncytial virus)的多种传染性疾病和癌症等的新生物疾病、基于tau病症的阿尔茨海默病及帕金森病、朊病毒相关疾病等的与神经退行性疾病相关的预防及治疗疫苗尚处于遥远的状态。在已经开发疫苗的流感的情况下，由于作为诱发病原菌的流感病毒的特有的频繁抗原，不仅每年都需要接种疫苗，而且在相应年度的预测流行株和实际流行株不同的情况下，存在毫无呈现预防效果的大缺点。这表示在利当前的疫苗开发技术诱导的抗体生产中存在大障碍。即，因大部分的由利用通过当前的技术生产的人工抗原的疫苗接种诱导的抗体为“线性表位识别抗体”的原因，在相应的表位的变形严重或必须需要与由不是独立抗原的抗原的聚合物形成的结构抗原的构象异构体识别的情况下，无法利用当前的技术解决。
在前面所涉及的人类免疫缺陷病毒疫苗的情况下，视为广范中和抗体(broadlyneutralizing antibody)的诱导为成功的疫苗疗法的必须要件。即，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)疫苗的成功也最终在于是否诱导与包膜糖蛋白三聚体(envelope glycoproteintrimer)相关的结构识别抗体。而且，呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗也必须进行与表面抗体相关的构象异构体识别，以一次接种可预防流感A病毒特有的抗原漂移(antigenic drift)的普遍的流感疫苗也对相对地变异少的茎部(stalk)，而不是变异多样且频繁的血凝素(hemeagglutinin；HA)的头部结构的构象异构体识别是必须的。
还为了对包括传染性疾病的新生物疾病、神经退行性疾病等内源性疾病成功地进行治疗，有效的诱导构象异构体识别抗体是非常重要的。众所皆知，尤其，在由内原性蛋白的浓度病变诱发的tau病症性阿尔茨海默病的情况下，正常存在的tau单体在保持神经细胞轴索的强健性中是必须的，但是由一些刺激等诱发过磷酸化的情况下，相互聚合而形成的双股螺旋纤维(PHF，paired helical filament)形态的tau聚合体诱发tau病症，并且导致周围的其他神经细胞的病变性损伤。这是不仅在发生在公知的由包括tau病症的α-突触核蛋白的病变性过磷酸化及聚合引起的帕金森病中，已知由于病理性过磷酸化及聚合α-突触核蛋白而发生，而且还发生在各种神经退行性及神经系统疾病中，如基于朊病毒的克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病等。因此，为了谋求如上所述的与神经退行性疾病相关的成功且安全的免疫治疗，可称为仅选择性地识别病变形态的内原性蛋白聚合体并结合，但是不与正常形态的单体相结合的构象异构体识别抗体的诱导是非常必要的。
发明内容
技术问题
本发明人努力制备基于诱导生产构象异构体(conformer)抗原识别抗体的鞭毛蛋白的疫苗组合物。其结果，Tau蛋白疾病的介入部位，即，通过制备作为诱发过磷酸化的部位的重复结构域(repeated domain)及作为创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的鞭毛构成因子的FlaB蛋白的重组蛋白，来抑制作为诱发阿尔茨海默病的内原性蛋白的tau(τ)蛋白的过磷酸化及聚合，从而制备可改善、预防及治疗阿尔茨海默病的疫苗组合物，并且通过制备作为诺如病毒(norovirus)的膜蛋白的P结构域(P domain)及作为创伤弧菌的鞭毛构成因子的FlaB蛋白的重组蛋白，来制备诺如病毒疫苗组合物，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于提供由tau(τ)蛋白的重复结构域及来源于创伤弧菌的FlaB蛋白构成的重组蛋白。
本发明的再一目的在于，提供用于预防或免疫治疗神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)的疫苗组合物。
本发明的另一目的在于，提供对tau(τ)蛋白的重复结构域进行编码的密码子优化的核苷酸。
本发明的再一目的在于，提供由诺如病毒的P结构域及来源于创伤弧菌的FlaB蛋白构成的重组蛋白。
本发明的还一目的在于，提供诺如病毒预防用疫苗组合物。
本发明的再一目的在于，提供构象异构体识别抗体诱导用疫苗组合物的制备方法，
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供构象异构体抗原识别抗体诱导用神经退行性疾病疫苗组合物，包含：(a)Tau蛋白的重复结构域(repeated domain)；以及(b)由来源于创伤弧菌的FlaB蛋白构成的重组蛋白作为有效成分。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供构象异构体抗原识别抗体诱导用感染性病毒疫苗组合物，包含由(a)感染性病毒的衣壳蛋白；以及(b)来源于创伤弧菌的FlaB蛋白构成的重组蛋白。
本发明人努力制备诱导生产构象异构体(conformer)抗原识别抗体的基于鞭毛蛋白的疫苗组合物。其结果，通过制备作为Tau蛋白疾病的介入部位的重复结构域(repeateddomain)及来源于创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的FlaB蛋白的重组蛋白，来抑制作为诱发阿尔茨海默病的内原性蛋白tau(τ)蛋白的过磷酸化及聚合，从而制备可改善、预防及治疗阿尔茨海默病的疫苗组合物，通过制备作为诺如病毒(norovirus)的膜蛋白的P结构域(Pdomain)及来源于创伤弧菌的FlaB蛋白的重组蛋白，来制备诺如病毒疫苗组合物。
本发明中包含(a)tau(τ)蛋白的重复结构域；以及(b)由来源于创伤弧菌的FlaB蛋白构成的重组蛋白作为有效成分的神经退行性疾病疫苗组合物诱导构象异构体抗原识别抗体的生产。
在本说明书中，术语“Tau蛋白”作为表达于中枢神经类，尤其主要表达于神经细胞的轴突的微管结合蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，起到稳定微管的作用。
对于包括阿尔茨海默病的神经退行性疾病的病因存在多种学说，但是当前最受到瞩目的学说为内原性蛋白的异常发生(过磷酸化，hyperphosphorylation等)及它们的聚合(aggregation)引起的神经细胞(neuron)的凋亡及神经胶质细胞(glial cell)等的过度激活(overactivation)等引起的慢性炎症反应的诱发及基于此的脑组织的破坏。
表明位于Tau蛋白的第二百六十二至第三百五十六氨基酸之间的重复结构域(repeated domain；以下为RD)为与Tau蛋白的磷酸化相关的结构域。在正常状态下，由细胞内的激酶(kinase)及磷酸酶(phosphatase)的均衡的调节，调节过磷酸化，但是由几个内原性及外原性刺激，对此操作机制产生问题的情况下，诱导Tau蛋白的过磷酸化。过磷酸化的Tau蛋白从对水的溶解度非常高的原来的性质溶解度极其降低，并自身形成聚合(aggregation)。在阿尔茨海默病患者的尸检脑试样中以神经细胞纤维缠结(neurofibrillary tangle；以下NFT)观察到聚合且过磷酸化的上述Tau蛋白。聚合的Tau蛋白初期主要分布在神经细胞的轴索部分，来导致轴索微管的稳定性的抑制等，从而妨碍细胞的正常活动，并且引起神经细胞的凋亡。但是，中等以上的Tau蛋白的聚合传播至周边神经细胞及胶质细胞，从而诱发包括相关事件的细胞的周围其他细胞的凋亡及基于小神经胶质细胞(microglia)的浓度活性的慢性炎症等脑组织的广泛的破坏，由此呈现神经退行性疾病。
本发明针对于位于Tau蛋白的第二百六十二至第三百五十六氨基酸之间的重复结构域，通过制备重组蛋白来确认作为其的抗原(或免疫原)的功能。
在本说明书中，术语“构象异构体抗原识别抗体”是指识别抗原固有的三维结构并结合的结构识别抗体(A K Abbas&A H Lichtman,Cellular and molecular immunology,6th edition,2003,Elsevier,p.59)。
在本说明书中，术语“抗原(antigen)”是指来作为源于上述的Tau蛋白的重复结构域蛋白，通过刺激免疫系统来对生物体诱导特异性免疫反应的物质，在本发明中可以与术语“免疫原(immunogen)”混用。
上述重组蛋白可根据本发明中公知的多种方法制备。例如，可通过基因克隆方法制备。
根据本发明的一实例，上述RD由SEQ ID NO:3的氨基酸序列形成。
上述RD由密码子优化(codon optimized)的SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码，从而在大肠杆菌中表达。
为了利用大肠杆菌制备上述重组蛋白，对Tau蛋白的RD的核苷酸序列进行适合于大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达的密码子优化(codon optimization)。转换为适合于大肠杆菌的密码子，使得来源于人类的RD在大肠杆菌中高表达。若经过密码子优化过程，则仅转换基因序列中的碱基序列，不转换氨基酸序列。
本发明中所利用的核苷酸序列解释为除了在上述中所涉及的序列之外，还包含对于上述核苷酸序列呈现实质上同一性的核苷酸序列，上述实质上同一性是指比对成本发明的核苷酸序列和任一其他序列在最大的范围内对应，在利用本领域中通常利用的算法分析比对的序列的情况下，呈现最少80％的同源性，更优选为最少90％的同源性，最优选地，呈现最少95％的同源性的核苷酸序列。用于比较序列的比对方法在本领域中公知。对比对的多种方法及算法在Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)Needleman andWunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins and Sharp,Gene 73:237-44(1988)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)；Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)and Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)中公开。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990))可以在NBCI(National Center for BiologicalInformation)等中访问，在因特网上可以与如blastp、blasm、blastx、tblastn、tblastx等序列分析程序联动利用。BLAST可访问www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。利用此程序的序列同源性比较方法可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html中确认。
构成上述重组蛋白的FlaB蛋白为来源于创伤弧菌的免疫辅助剂(adjuvant)。
根据本发明的一实例，上述FlaB蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
如在以下实施例中证明，上述重组蛋白由SEQ ID NO:7的氨基酸序列形成，并由SEQ ID NO:6的核苷酸序列编码。
本发明的组合物可包含其他药物或其他免疫抑制剂，以提供额外的免疫刺激作用。例如，铝盐(Al(OH)3，AlPO4)、角鲨烯(squalene)、山梨糖醇(sorbitane)、聚山梨醇酯80(polysorbate 80)、CpG、脂质体(liposome)、胆固醇(cholesterol)、单磷酰脂质(MPL，monophosphoryl lipid A)、表面活性物质、来源于细菌的物质、细胞因子、激素、聚阴离子(polyanion)、聚丙烯酸(polyacryl)、载体(carrier)、活载体(living vector)、矿物油(mineral oil)、来源于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素(cholera toxin)以及吡喃葡萄糖基脂质A(GLA，glucopyranosyl lipid A)，但不限定于此。
如在以下实施例中证明，本发明的包含：(a)tau(τ)蛋白的RD；以及(b)由来源于创伤弧菌的FlaB蛋白构成的重组蛋白作为有效成分的神经退行性疾病的疫苗组合物为口服给药或非口服给药用疫苗组合物。
根据本发明的一实例，上述组合物为粘膜、皮下、皮内、透皮或肌肉内接种用组合物。
本发明的再一实例，上述组合物为粘膜接种用组合物。
上述粘膜给药包括口服给药(oral immunization)、鼻腔给药(intranasalimmunization)、舌下给药(sublingual immunization)、直肠给药(rectal immunization)以及阴道内给药(vaginal immunization)，并不限定于此。
上述Tau蛋白的过磷酸化形成聚合体(aggregate)，在阿尔茨海默病患者的尸检脑试样中以神经细胞纤维缠结(neurofibrillary tangle)观察到聚合且过磷酸化的上述Tau蛋白。聚合的上述Tau蛋白主要分布在神经细胞的轴索部分，来对轴索微管的稳定性产生抑制等，从而妨碍细胞的正常活动，并引起神经细胞的凋亡。在严重的情况下，诱发周围的其他细胞的凋亡及脑组织的广泛的破坏，如诱发基于小神经胶质细胞(microglia)的活性的慢性炎症等，由此表达神经退行性疾病的症状。
根据本发明的一实例，上述疫苗组合物诱导生成对Tau蛋白聚合体(aggregate)特异性的抗体。
根据本发明的再一实例，上述抗体抑制Tau蛋白的聚合(aggregation)。
将本发明的疫苗组合物给药到客体生成的抗体抑制Tau蛋白的聚合。
根据本发明的再一实例，上述抗体促进调理素吞噬作用(opsonicphagocytosis)。
在本说明书中，术语“调理素吞噬作用”指基于有助于白细胞的食菌作用的调理素(opsonin)的吞噬(或者食菌)作用。
本发明的疫苗组合物为用于改善、预防或治疗神经退行性疾病的疫苗组合物。
根据本发明的一实例，上述神经退行性疾病为选自由阿尔茨海默病、tau病症、痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、记忆力下降、重症肌无力症及基于朊病毒的疾病等组成的组中的疾病。
根据本发明的再一实例，上述tau性病症包括嗜银颗粒痴呆(argyrophilic graindementia)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、拳击员痴呆(dementiapugilistica)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)、伴有17号染色体的帕金森综合征的额颞叶痴呆(Frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome17)、哈勒沃登-施帕茨病(HallervoRDen-Spatz disease)、肌强直性营养不良(Myotonicdystrophy)、尼曼匹克症C型(Niemann-Pick disease type C)、皮克氏病(Pick'sdisease)、脑炎后帕金森综合征(Postencephalitic parkinsonism)、进行性皮质下胶质细胞增生症(Progressive subcortical gliosis)、进行性核上性麻痹(Progressivesupranuclear palsy)、亚急性硬化性全脑炎(Subacute sclerosing panencephalitis)以及克-雅病等由朊病毒引起的疾病。
包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上认可的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等。适合的药剂学上认可的载体及制剂详细地记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)。
本发明的药剂学组合物的适合的给药量可以通过如制剂方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、患病状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄率以及反应感应性性等因素进行多样地处方。另一方面，优选地，本发明药剂学组合物的口服给药量为每天0.001-100mg/kg(体重)。
本发明的药剂学组合物通过本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上认可的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位容量的形态制备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液的形态，或可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、薄膜或胶囊剂的形态，还可包含分散剂或稳定剂。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供对tau(τ)蛋白的RD进行编码的密码子优化的SEQ ID NO:5的核苷酸。
本发明的核苷酸为构成上述重组蛋白的核苷酸，为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。
根据本发明的再一实施方式，提供感染性病毒疫苗组合物，包含：(a)感染性病毒的浓度衣壳蛋白；以及(b)由作为创伤弧菌(Vibrio vulnificus)鞭毛构成因子的FlaB蛋白构成的重组蛋白作为有效成分。
根据本发明的一实例，上述感染性病毒为诺如病毒(norovirus)、人类免疫缺陷病毒(human inmmunodeficiency virus)或呼吸道合胞病毒(resiratory syncytialvirus)。
根据本发明的再一实例，上述感染性病毒的衣壳蛋白为诺如病毒的P结构域。
据报告，上述诺如病毒作为诱发肠炎的病毒，食物中毒发生的原因中，大约50％是由诺如病毒引起的，96％的病毒性胃肠炎是由诺如病毒引起的(Centers for DiseaseControl and Prevention,Surveillance for Norovirus Outbreaks)。诺如病毒的衣壳基因的碱基序列与病毒抗原具有密切关系。众所周知，诺如病毒的衣壳蛋白大致由S、P1、P2的3个蛋白质结构域构成，S结构域为保守区(conserved region)，由P1和P2的蛋白质序列的变化发生抗原多样性(antigenic diversity)(HaRDy,M.E.,2005)。
上述P结构域包含包含诺如病毒VLP(virus like particle)的P1及P2的第二百二十二至第五百三十九的氨基酸，这是由SEQ ID NO:13的氨基酸序列形成，上述氨基酸由SEQID NO:12的核苷酸序列编码。
如在以下实施例中证明，上述重组蛋白由SEQ ID NO:15的氨基酸序列形成，并由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码。
上述疫苗组合物诱导生成特异性地识别诺如病毒的结构的抗体。
上述疫苗组合物为口服给药或非口服给药用疫苗组合物。
根据本发明的一实例，上述组合物为粘膜、皮下、皮内、经皮或肌肉内接种用组合物。
根据本发明的再一实例，上述组合物为粘膜接种用组合物。
上述粘膜给药包括口服给药(oral immunization)、鼻腔给药(intranasalimmunization)、舌下给药(sublingual immunization)、直肠给药(rectal immunization)及阴道内给药(vaginal immunization)，并不限定于此。
如在以下实施例中证明，上述疫苗组合物使血清内抗原特异性免疫球蛋白G及免疫球蛋白A(IgA)的生成增加。并且，确认使粪便中抗原特异性免疫球蛋白G的生成增加。
在本发明的感染性病毒疫苗组合物中，构成上述神经退行性疾病的疫苗组合物的FlaB蛋白、作为药剂学组合物的用途等类似，因而为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。
发明的效果
对本发明的特征及优点进行概括如下：
(a)本发明提供构象异构体抗原识别抗体诱导用神经退行性疾病疫苗组合物及感染性病毒疫苗组合物。
(b)本发明的疫苗组合物诱导构象异构体抗原识别抗体的生成。
(c)这种构象异构体抗原识别抗体对抗原具有高特异性，因此可有效地利用与疾病的改善、预防或治疗。
附图说明
图1以图示化的方式示出tau(τ)蛋白的RD(重复结构域)的克隆过程。
图2示出确认上述Tau蛋白的RD的克隆的结果。左侧板为通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认RD的表达的结果，右侧板为通过蛋白质印迹法确认的结果。RD示出13kDa的大小。
图3示出确认FlaB-TauRD重组蛋白的克隆的结果。
图4示出确认基于FlaB-TauRD重组蛋白的给药的构象异构体结构识别抗体的生成的结果。是示出通过对鞭毛蛋白和使Tau蛋白的一部分表达的Tau-Ag进行免疫来取得的抗血清诱导生成与作为Tau病理构象异构体(Tau pathologic conformer)的双股螺旋纤维(paired helical filament)进行反应的“结构识别抗体”的实验结果。
图5示出确认FlaB、TauRD及FlaB-TauRD对TOLL样受体5(toll like receptor 5)的刺激能力的结果。
图6示出FlaB-TauRD重组蛋白的免疫计划。
图7a及图7b示出包含tauRD及FlaB-tauRD重组蛋白的疫苗的免疫次数及基于浓度的免疫球蛋白G(IgG)的生成能力。
图8示出FlaB-TauRD重组蛋白形成双股螺旋纤维形态的聚合体的图像。
图9示出确认基于给药FlaB-TauRD重组蛋白的结构识别抗体的生成的结果。是确认双股螺旋纤维分子(PHF molecule)形成类似神经元纤维缠结(neurofibrillarytangle)的结构的状态下，使选择性地结合的硫磺素S(Th-S，thioflavin S)和抗血清同时起到作用来生成的抗体共定位(colocalization)的结果。
图10示出基于对FlaB-TauRD重组蛋白的抗血清的Tau蛋白的聚合抑制效果。
图中11示出对FlaB-TauRD重组蛋白的抗血清的调理素吞噬作用(opsonicphogocytosis)的促进效果。
图12示出诺如病毒的P结构域的表达纯化结果。
图13示出Pd-FlaB重组蛋白对表达纯化、Pd抗血清及FlaB抗血清特异性结合。
图14示出确认与FlaB及Pd-FlaB的TOLL样受体5(toll like receptor 5)相关的刺激能力的结果。
图15示出Pd-FlaB重组蛋白的免疫计划。
图16示出通过蛋白质工学诱导生成结构识别抗体的结果。与tau抗原不同，在诺如病毒P结构域(Pd)抗原的情况下，仅与鞭毛蛋白简单混合给药生成结构识别抗体(左侧)，在仅利用Pd-鞭毛蛋白融合抗原进行免疫的情况下，未识别单体，在仅利用斑点杂交(dotblot)实验法对保持抗原结构的细胞溶解物进行试验的情况下，生成进行反应的结构域(右侧)。
图17示出Pd-FlaB重组蛋白的电子显微镜观察图像。
图18示出基于Pd-FlaB重组蛋白的免疫的血清免疫球蛋白G的效价。
图19示出基于Pd-FlaB重组蛋白的免疫的血清分析免疫球蛋白A的效价。
图20示出基于Pd-FlaB重组蛋白的免疫的粪便免疫球蛋白G的效价。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例只用于更详细地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不限制于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例1：阿尔茨海默病免疫疫苗的制备
实验材料
各个菌株的培养及储存
本发明中使用的大肠杆菌菌株在LB(Luria Bertani)培养基(Difco Co.)中培养。培养后，加入使用的菌株，使油含量为30％，然后储存在-80℃的超低温冷冻库。
在本发明中利用的菌株和质粒整理于表1。
表1
实验方法及实验结果
1.蛋白质表达及纯化
a.来源于创伤弧菌的FlaB重组蛋白的表达及纯化
利用创伤弧菌CMCP6的鞭毛构成因子FlaB的培养基因序列(SEQ ID NO:1)制备了flaB重组蛋白。使用记载于序列8和序列9中的FlaB-N及FlaB-C引物扩增了包含用于融合N-末端或用于融合C-末端的FlaB基因的1.1kbp的DNA片段，以获得用于融合鞭毛蛋白基因flaB的N-末端或C-末端融合的DNA片段。即，使用各个引物对的聚合酶链式反应(PCR)以如下条件实施，即，在95℃的温度下预变性5分钟，然后进行30个循环的95℃变性30秒钟，60℃退火30秒钟以及72℃延伸1分钟，最后在72℃的温度下反应10分钟。
用于在大肠杆菌菌株中表达的表达系统利用NEB公司的Intein-CN系统，利用EcoRI和PstI对相应系统的pTYB12质粒进行限制酶处理后，对扩增的flaB聚合酶链式反应产物进行连接处理(pCMM11101)。连接的质粒通过电转化转化于E.coli ER2566表达菌株，并仅选出在含有作为pTYB12质粒的选择标记的氨苄青霉素的LB琼脂板上存活的菌株，来利用SEQ ID NO:8及序列9的聚合酶链式反应引物确认了是否含有相应基因产物(CMM11101)。
对于CMM11101大肠杆菌菌株，通过加入0.5mM的5-溴-吲哚3-氯异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。根据制备公司(新英格兰生物实验室有限公司)的指南利用几丁质珠柱和1，4-二硫苏糖醇(1，4DTT)从内含肽融合蛋白取得SEQ ID NO:2的FlaB蛋白。利用AffinityPakTMDetoxi GelTM内毒素去除凝胶(Pierece公司)去除了包含于所分离的蛋白质内的内毒素(endotoxin)。
b.重组tau RD(重复结构域)的表达及纯化
作为抗原利用大肠杆菌对于人类τ(tau)蛋白中的过磷酸化具有高相关性的整个RD(repeated domain；RD)制备了重组蛋白。为了生产重组蛋白，将相应的基因(SEQ ID NO:4)对于大肠杆菌进行了密码子优化及基因合成(SEQ ID NO:5)。为了克隆的容易性，当合成基因时，在N-末端及C-末端分别追加EcoRI及XhoI限制酶识别基因序列。为了获得用于融合的DNA片段，通过使用记载的tauRD-N(SEQ ID NO:10)及tauRD-C(SEQ ID NO:11)引物对扩增了包含用于融合N-末端或用于融合C-末端的tauRD基因的1.1kbp的DNA片段。即，使用各个引物对的聚合酶链式反应(PCR)以如下条件实施，即，进行30个循环的95℃变性30秒钟，60℃退火30秒钟以及72℃延伸1分钟，最后在72℃的温度下反应10分钟。用于在大肠杆菌菌株中表达的表达系统利用NEB公司的IMPACT-CN系统，利用EcoRI和PstI对相应系统的pTYB12质粒进行限制酶处理后，对扩增的tauRD聚合酶链式反应产物进行连接处理(pCMM11102)。连接处理的质粒通过电转化转化于E.coli ER2566表达菌株，并仅选出在含有作为pTYB12质粒的选择标记的氨苄青霉素的LB琼脂板上存活的菌株，来利用SEQ ID NO:10及序列9的聚合酶链式反应引物确认了是否含有相应基因产物(CMM11102)。
对于CMM11102大肠杆菌菌株，通过加入0.5mM的5-溴-吲哚3-氯异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。根据制备公司(新英格兰生物实验室有限公司)的指南利用几丁质珠柱和1，4二硫苏糖醇(1，4DTT)从内含肽融合蛋白取得具有SEQ ID NO:3的TauRD蛋白。利用AffinityPakTMDetoxi GelTM内毒素去除凝胶(Pierece公司)去除了包含于所分离的蛋白质内的内毒素(endotoxin)。
为了确认重组融合蛋白的表达，确认利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的重组融合蛋白的分子量，结果确认了制备大小为13KDa的重组融合蛋白(图2)。
为了确认重组融合蛋白是否正确的Tau蛋白的片段，利用抗-tau抗体施行蛋白质印迹法，结果确认了对抗-tau抗体特异性的条带。
c.用于制备重组FlaB-TauRD融合蛋白质的培养基因克隆
利用EcoRI和PstI限制酶处理pCMM11101的flaB基因，并对pCMM11102也进行相同的限制酶处理后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化flaB基因片段和pCMM11102质粒。通过连接上述两个基因来制备了pTYB12::flaB-tauRD基因融合质粒(pCMM11103)。连接的质粒通过电转化转化于E.coli ER2566表达菌株，并仅选出在含有作为pTYB12质粒的选择标记的氨苄青霉素的LB琼脂板上存活的菌株，来利用SEQ ID NO:8及序列11的聚合酶链式反应引物确认了是否含有相应基因产物(CMM11104)。
对于CMM11103大肠杆菌菌株，通过加入0.5mM的5-溴-吲哚3-氯异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。根据制备公司(新英格兰生物实验室有限公司)的指南利用几丁质珠柱和1，4二硫苏糖醇(1，4DTT)从内含肽融合蛋白取得SEQ ID NO:6的FlaB-TauRD蛋白。利用AffinityPakTMDetoxi GelTM内毒素去除凝胶(Endotoxin Removing gel)(Pierece公司)去除了包含于所分离的蛋白质内的内毒素。
为了确认纯化的FlaB-TauRD的准确性，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及FlaB特异性小鼠抗血清施行免疫印迹。其结果，纯化的FlaB-TauRD融合蛋白呈现大小为57KDa的正常大小的条带，在免疫印迹上还确认了与FlaB抗血清结合(图3)。
图4示出通过对使FlaB和一部分Tau蛋白表达的Tau-Ag进行免疫来取得的抗血清诱导生成与作为Tau病理构象异构体的双股螺旋纤维进行反应的“结构识别抗体”的实验结果。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离使用于免疫的Tau-Ag后，转移到尼龙膜上并利用丽春红S染色，结果确认了单体蛋白。在对于利用相同的方法准备的膜，利用进行FlaB及Tau-Ag来取得的抗血清免疫印迹的情况下，几乎未识别单体条带，并强烈地识别在丽春红S中根本观察不到的极少量的多量体结构物。为了对其进行反证，在保持多量体结构的状态下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)后，进行免疫印迹，结果确认了免疫血清对标准血根本检测不到的多量体结构体强烈地反应。这是说明利用本发明诱导的抗血清对诱发阿尔茨海默病的tau聚合体呈现高得多的结合能力。
d.重组FlaB-TauRD蛋白的特性确认
①.重组FlaB-TauRD蛋白的TOLL样受体5的刺激能力的确认
为了确认重组tau-RD肽本身对作为鞭毛蛋白的作用点的TOLL样受体5是否保留刺激能力，在孔平板培养基中以每次1×105细胞的方式接种293-T细胞，并培养一宿后，利用Effectene(凯杰公司(QIAGEN))向细胞内同时导入NF-κ-Luc质粒(从汉阳大学医科大学微生物教师的金政目教授获得)、克隆有TLR-5基因的p3xFlag-hTLR-5质粒(从美国WakeForest University School of Medicine,Department of Microbiology andImmunology的Steven B.Mizel的Steven B.Mizel公司获得)及β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达对照组质粒(Clontech)。追加培养24小时后，更换为新培养基，并将利用IMPACT系统分离的FlaB及tau-RD肽处理规定时间后，利用发光分析仪(发光计(Luminometer)，伯托公司(Berthold))检测荧光素酶(luciferase)活性，并确认NF-κB的转录程度，在图5示出其结果。在图5的结果中用作抗原的重组tau-RD肽未呈现TOLL样受体5刺激能力，但是相对于FlaB，FlaB-TauRD融合蛋白呈现显著的TOLL样受体5刺激能力。
②基于给药重组FlaB-TauRD混合疫苗的tau抗原特异性抗体形成能力的比较
将通过本发明的鞭毛蛋白tau-RD肽混合疫苗以1周的间隔向6周龄的雌性Balb/c小鼠(韩国东方生物公司)的鼻腔内免疫3次、5次及6次后，取得血清，来比较了tau-RD肽特异性的抗体的形成(图6)。通过比较将重组鞭毛蛋白tau-RD蛋白涂敷于96孔平板酶联免疫吸附测定(ELISA)板后，对取得的抗血清进行2倍连续稀释处理，并利用酶联免疫吸附测定法确认了。
其结果与tau-RD肽独立免疫组相比，鞭毛蛋白tau-RD肽混合疫苗呈现在血清内形成的免疫球蛋白G多。在分别处理不同用量的抗原时，在进行3次免疫时，呈现在统计学上不显著的用量-反应关系，但是免疫5次后的情况下，在6μg的抗原处理组与10μg的处理组之间可确认在统计学上显著的抗原特异性抗体的形成能力。在10μg处理组与14μg处理组之间无法确认抗原特异性抗体形成能力的差异(图7a)。
在比较免疫3次、5次及6次后的抗原特异性抗体形成能力的结果中，在3次给药组和5次给药组中可确认作为在统计学上显著的抗原特异性的抗体形成能力的差异，但是在5次给药组与6次给药组之间无法确认统计学上显著的差异(图7b)。
③重组FlaB-TauRD蛋白聚合体的形成
就利用本发明诱导的抗血清而言，通过电子显微镜确认了脑部的特异性抗原自身形成聚合体，来在纯化5天后形成如图8的双股螺旋纤维形态的聚合体。
④重组FlaB-TauRD蛋白聚合体的诱导
利用与蛋白质β折叠(sheet)结构特异性地结合的硫黄素S(绿色(Green))
对Tau蛋白聚合体(对纯化的tau-RD肽处理肝素(heparin)来诱导聚合)进行染色，对于通过本发明品的免疫取得的抗血清，利用Alexa fluor 633(分子探针(Molecularprobe))染色抗-小鼠免疫球蛋白G兔子免疫球蛋白G，然后利用共聚焦显微镜比较了是否Tau蛋白和抗血清结合及结合程度。
实验结果，利用本发明诱导的抗血清呈现与聚合诱导第二天相比，第五天(聚合地更多)与Tau蛋白结合的趋势(图9)。
⑤重组FlaB-TauRD蛋白的聚合抑制效果
为了确认利用本发明诱导的抗Tau血清的Tau聚合抑制效果，对重组tau-RD肽预处理利用本发明诱导的抗血清，去除后利用肝素诱导tau肽的聚合，并通过透射电子显微镜确认了聚合体的形成程度。
在预处理利用食盐水进行免疫而获得的对照血清的情况下，观察到Tau蛋白的聚合，但是在预处理利用本发明诱导的抗血清的情况下，观察到Tau蛋白的聚合降低的现象(图10)。
⑥.重组FlaB-TauRD蛋白的情况下吞噬活性
施行了确认利用本发明诱导的抗血清是否促进作为脑部的特异性抗原递呈细胞的小神经胶质细胞细胞株(BV2细胞株，全南大学医学院文昌钟教授研究室销售)的tau聚合体的调理素吞噬作用(opsonic phagocytosis)。对于重组tau-RD肽，利用肝素诱导三天的聚合后，利用FNR 488(绿色、韩国Bioacts公司)进行了染色。通过10秒钟的超声波破碎破碎tau聚合体后，与由本发明引起的抗Tau血清一同对培养的BV2细胞株进行处理。作为对照组使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)免疫获得的对照血清。培养30分钟后，去除培养基，利用苯基吲哚(DAPI，绿色)染色，并利用麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin；WGA，红色(Red))进行染色后，利用共聚焦显微镜比较破碎tau聚合体是否吞噬以及吞噬程度。
其结果，利用通过本发明诱导的抗血清处理的破碎tau聚合体被BV2细胞吞噬，但是在对照血清处理组中未发现如上所述的现象。这是说明利用本发明诱导的抗血清对作为脑部特异性的抗原递呈细胞提供高的调理素吞噬能力(图11)。
实施例2：诺如病毒免疫疫苗的制备
a.诺如病毒P结构域的抗原序列及密码子优化
用于制备用于制备诺如病毒疫苗的抗原的DNA利用从全南大学赵京吴教授获得的克隆有诺如病毒P结构域的pGEX-4T-1::VAxxx。插入基因序列如SEQ ID NO:12。
b.用于制备重组Pd抗原的基因克隆
为了获得用于抗原的Pd基因的N-末端或用于融合C-末端的产物DNA片段，通过使用记载于SEQ ID NO:16级序列17的Pd-N及Pd-C引物对，来以包含SEQ ID NO:12的Pd的质粒为模板扩增了1.1kbp的DNA片段。即，使用各个引物对的聚合酶链式反应以如下条件实施，即，在95℃的温度下预变性5分钟，然后进行30个循环的95℃变性30秒钟，60℃退火30秒钟以及72℃延伸1分钟，最后在72℃的温度下反应10分钟。
用于在大肠杆菌菌株中表达的表达系统利用NEB公司的IMPACT-CN系统，利用EcoRI和PstI对相应系统的pTYB12质粒进行限制酶处理后，对扩增的flaB聚合酶链式反应产物进行连接处理(pCMM11105)。连接的质粒通过电转化转化于E.coli ER2566表达菌株，并仅选出在含有作为pTYB12质粒的选择标记的氨苄青霉素的LB琼脂板上存活的菌株，来利用SEQ ID NO:16及序列17的聚合酶链式反应引物确认了是否含有相应基因产物(pCMM11105)。
对于pCMM11105大肠杆菌菌株，通过加入0.5mM的5-溴-吲哚3-氯异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。根据制备公司(新英格兰生物实验室有限公司)的指南利用几丁质珠柱和1，4二硫苏糖醇(1，4DTT)从内含肽融合蛋白取得SEQ ID NO:15的FlaB-Pd蛋白。利用AffinityPakTMDetoxi GelTM内毒素去除凝胶(Pierece公司)去除了包含于所分离的蛋白质内的内毒素。
为了确认纯化的重组Pd蛋白的准确性，施行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(图12)。其结果，纯化的重组Pd蛋白呈现大小为44KDa的正常大小的条带。
c.用于制备重组FlaB-Pd融合蛋白的基因克隆
利用EcoRI和PstI限制酶处理pCMM11101的flaB基因，并对pCMM11105也进行相同的限制酶处理后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化各个flaB基因片段和pCMM11104质粒。通过连接上述两个基因来制备了pTYB12::flaB-tauRD基因融合质粒(pCMM11106)。连接的质粒通过电转化转化于E.coli ER2566表达菌株，并仅选出在含有作为pTYB12质粒的选择标记的氨苄青霉素的LB琼脂板上存活的菌株，来利用SEQ ID NO:8及序列17的聚合酶链式反应引物确认了是否含有相应基因产物(CMM11106)。
对于CMM11105大肠杆菌菌株，通过加入0.5mM的5-溴-吲哚3-氯异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。根据制备公司(新英格兰生物实验室有限公司)的指南利用几丁质珠柱和1，4二硫苏糖醇(1，4DTT)从内含肽融合蛋白取得SEQ ID NO:15的FlaB-Pd融合蛋白。利用AffinityPakTMDetoxi GelTM内毒素去除凝胶(Pierece公司)去除了包含于所分离的蛋白质内的内毒素。
为了确认纯化的重组FlaB-Pd蛋白的准确性，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳及FlaB或Pd特异性小鼠抗血清施行免疫印迹。其结果，纯化的FlaB-Pd融合蛋白呈现大小为44KDa的正常大小的条带，在免疫印迹上，还确认了与FlaB及Pd特异性抗血清结合(图13)。
d.重组FlaB-Pd蛋白的特性确认
①.重组flaB-Pd蛋白的TOLL样受体5的刺激能力
为了确认FlaB-Pd融合的生物体功效，在24孔平板培养基中以每次1×105细胞的方式接种293-T细胞，并培养一宿后，利用Effectene(凯杰公司(QIAGEN))向细胞内同时导入NF-κ-Luc质粒(从汉阳大学医科大学微生物教师的金政目教授获得)、克隆有TLR-5基因的p3xFlag-hTLR-5质粒(从美国Wake Forest University School of Medicine,Department of Microbiology and Immunology的Steven B.Mizel的Steven B.Mizel公司获得)及β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达对照组质粒(Clontech)。追加培养24小时后，更换为新培养基，并在上述中制备，利用IMPACT系统分离的FlaB及tau-RD肽处理规定时间后，利用发光分析仪(发光计，伯托公司)检测荧光素酶(luciferase)活性，并确认NF-κB的转录程度，在图14示出其结果。
②.重组FlaB-Pd蛋白的结构识别
为了验证制备的Pd及FlaB-Pd蛋白的疫苗功效，利用从东方公司购买的6周龄的雌性Balb/c小鼠。
按照图15的计划混合给药磷酸盐缓冲溶液(阴性对照组)、Pd(1μg)、FlaB(1.2μg)+Pd(1.2μg)，分别通过小鼠的鼻腔将FlaB-Pd(2.2μg)融合蛋白给药3次。然后，最后给药7天后获得小鼠的全血后分离了血清。
图16中，在诺如病毒Pd抗原的情况下，仅与FlaB混合给药未生成结构识别抗体，但是仅在将重组FlaB-Pd蛋白作为抗原进行免疫的情况下未识别单体，在利用保持有抗原结构的细胞溶解物的斑点杂交(dot blot)中生成与抗原反应的结构识别抗体。这是说明有必要根据抗原通过蛋白质工学具备特殊的抗原结构。
③.电子显微镜观察
分别纯化重组诺如病毒P结构域蛋白和FlaB-P结构域融合蛋白后，利用乙酸铀(uranyl acetate)染色试样后，在碳网格(carbon grid)中滴落2μl，干燥后利用JEOL JEM-2100F透射电子显微镜以30kV的加速电压进行观察。其结果，在诺如病毒P结构域重组蛋白中观察到形成病毒样颗粒(VLP，virus like particle)结构。在FlaB-P结构域融合蛋白的情况下，观察到病毒样颗粒的形态，可观察到将这些作为亚单位(subunit)相互聚合的结构(图17)。
④.免疫球蛋白G及免疫球蛋白A的效价观察
利用图15的免疫计划，对6周龄的雌性BalB/c小鼠通过小鼠的鼻腔给药独立抗原、FlaB和P结构域混合、FlaB-P结构域融合蛋白疫苗。免疫3次后回收小鼠的全血(图18：血清免疫球蛋白G，图19血清免疫球蛋白A)以及粪便(图20检测粪便内分泌性免疫球蛋白A的效价)后，分离血清，然后利用酶联免疫吸附测定法确认了将重组P结构域蛋白作为抗原的抗原特异性抗体效价(二次免疫球蛋白G抗体；Goat Anti-Mouse IgG,Human ads-HRPCat.No.1030-05,SouthernBiotech,Birmingham,AL 35260,USA:二次免疫球蛋白A抗体；Goat Anti-Mouse IgA-HRP Cat.No.1040-05,SouthernBiotech,Birmingham,AL 35260,USA利用)(图18至图20)。其结果，与P结构域独立给药组相比，FlaB+P结构域混合给药及FlaB-P结构域融合疫苗给药组中均可确认到显著的抗原特异性抗体效价的上升。
序列表
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> 基于诱导生产构象异构体抗原识别抗体的鞭毛蛋白疫苗辅助剂的疫苗的制备及其应用
<130> PP160083
<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1134
<212> DNA
<213> 创伤弧菌（Vibrio vulnificus）
<400> 1
atggcagtga atgtaaatac aaacgtagca gcaatgacag cacagcgtta cctgaataac 60
gcaaacagcg cacaacaaac ttcgatggag cgtctgtctt caggtttcaa aatcaacagt 120
gcaaaagatg acgcagccgg tctgcaaatc tctaaccgct tgaacgtaca aagtcgcggt 180
ctagacgttg cggtacgtaa cgccaacgac ggtatctcaa tcgcacaaac cgcagaaggt 240
gcgatgaacg agaccaccaa catcctacaa cgtatgcgtg acctatctct acaatccgcg 300
aacggctcaa actcaaaatc agagcgcgtg gcgattcaag aagaagtgac agcattgaat 360
gacgagctaa accgtattgc agaaaccacg tcttttggtg gtaacaagct gctaaacggt 420
acttacggca cgaaagcaat gcaaattggt gcggataacg gtgaagcggt catgctttca 480
ctgaaagaca tgcgctctga caacgtgatg atgggcggcg tgagctacca agctgaagaa 540
ggcaaagaca agaactggaa tgtggccgca ggcgacaacg acttgacgat tgcactgaca 600
gacagctttg gtaacgagca agagatcgaa atcaacgcga aagcgggtga tgacatcgaa 660
gagctagcga cgtacatcaa cggtcaaact gaccttgtaa aagcgtcagt gggtgaaggc 720
ggcaagctac agatctttgc tggtaacaac aaagttcaag gtgaaattgc tttctcaggt 780
agcctagctg gtgaacttgg cctaggcgaa ggcaaaaacg tcacggtaga cacgattgac 840
gtgacaaccg tacaaggtgc gcaagagtcg gtagcgattg tggatgcggc actgaaatac 900
gtagacagcc accgtgcaga gctgggtgca ttccagaacc gtttcaacca tgcaatcagc 960
aacttggaca acatcaacga aaacgtgaac gcgtcgaaga gccgaatcaa agataccgac 1020
ttcgcgaaag aaacgactca gttgaccaag acacaaattc tatcgcaagc atcaagttcc 1080
attcttgcgc aagcgaaaca agcgccaaac tcagcgctaa gtctactagg ctaa 1134
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 创伤弧菌（Vibrio vulnificus）
<400> 2
Asn Val Asp Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr
1 5 10 15
Ala Gln Arg Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met
20 25 30
Glu Arg Leu Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala
35 40 45
Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu
50 55 60
Asp Val Ala Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr
65 70 75 80
Ala Glu Gly Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg
85 90 95
Asp Leu Ser Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg
100 105 110
Val Ala Ile Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg
115 120 125
Ile Ala Glu Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr
130 135 140
Tyr Gly Thr Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val
145 150 155 160
Met Leu Ser Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly
165 170 175
Val Ser Tyr Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala
180 185 190
Ala Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn
195 200 205
Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu
210 215 220
Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val
225 230 235 240
Gly Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln
245 250 255
Gly Glu Ile Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly
260 265 270
Glu Gly Lys Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln
275 280 285
Gly Ala Gln Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val
290 295 300
Asp Ser His Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His
305 310 315 320
Ala Ile Ser Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys
325 330 335
Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr
340 345 350
Lys Thr Gln Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala
355 360 365
Lys Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly
370 375 380
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 3
Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser
1 5 10 15
Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys
20 25 30
Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys
35 40 45
Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val
50 55 60
Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys
65 70 75 80
Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu
85 90 95
Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile
100 105 110
Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
115 120 125
<210> 4
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 4
ctgcagacag cccccgtgcc catgccagac ctgaagaatg tcaagtccaa gatcggctcc 60
actgagaacc tgaagcacca gccgggaggc gggaaggtgc agataattaa taagaagctg 120
gatcttagca acgtccagtc caagtgtggc tcaaaggata atatcaaaca cgtcccggga 180
ggcggcagtg tgcaaatagt ctacaaacca gttgacctga gcaaggtgac ctccaagtgt 240
ggctcattag gcaacatcca tcataaacca ggaggtggcc aggtggaagt aaaatctgag 300
aagcttgact tcaaggacag agtccagtcg aagattgggt ccctggacaa tatcacccac 360
gtccctggcg gaggaaat 378
<210> 5
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的TauRD
<400> 5
ctgcagacag cccccgtgcc catgccagac ctgaagaatg tcaagtccaa gatcggctcc 60
actgagaacc tgaagcacca gccgggaggc gggaaggtgc agataattaa taagaagctg 120
gatcttagca acgtccagtc caagtgtggc tcaaaggata atatcaaaca cgtcccggga 180
ggcggcagtg tgcaaatagt ctacaaacca gttgacctga gcaaggtgac ctccaagtgt 240
ggctcattag gcaacatcca tcataaacca ggaggtggcc aggtggaagt aaaatctgag 300
aagcttgact tcaaggacag agtccagtcg aagattgggt ccctggacaa tatcacccac 360
gtccctggcg gaggaaat 378
<210> 6
<211> 1519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FlaB-TauRD
<400> 6
tggcagtgaa tgtaaataca aacgtagcag caatgacagc acagcgttac ctgaataacg 60
caaacagcgc acaacaaact tcgatggagc gtctgtcttc aggtttcaaa atcaacagtg 120
caaaagatga cgcagccggt ctgcaaatct ctaaccgctt gaacgtacaa agtcgcggtc 180
tagacgttgc ggtacgtaac gccaacgacg gtatctcaat cgcacaaacc gcagaaggtg 240
cgatgaacga gaccaccaac atcctacaac gtatgcgtga cctatctcta caatccgcga 300
acggctcaaa ctcaaaatca gagcgcgtgg cgattcaaga agaagtgaca gcattgaatg 360
acgagctaaa ccgtattgca gaaaccacgt cttttggtgg taacaagctg ctaaacggta 420
cttacggcac gaaagcaatg caaattggtg cggataacgg tgaagcggtc atgctttcac 480
tgaaagacat gcgctctgac aacgtgatga tgggcggcgt gagctaccaa gctgaagaag 540
gcaaagacaa gaactggaat gtggccgcag gcgacaacga cttgacgatt gcactgacag 600
acagctttgg taacgagcaa gagatcgaaa tcaacgcgaa agcgggtgat gacatcgaag 660
agctagcgac gtacatcaac ggtcaaactg accttgtaaa agcgtcagtg ggtgaaggcg 720
gcaagctaca gatctttgct ggtaacaaca aagttcaagg tgaaattgct ttctcaggta 780
gcctagctgg tgaacttggc ctaggcgaag gcaaaaacgt cacggtagac acgattgacg 840
tgacaaccgt acaaggtgcg caagagtcgg tagcgattgt ggatgcggca ctgaaatacg 900
tagacagcca ccgtgcagag ctgggtgcat tccagaaccg tttcaaccat gcaatcagca 960
acttggacaa catcaacgaa aacgtgaacg cgtcgaagag ccgaatcaaa gataccgact 1020
tcgcgaaaga aacgactcag ttgaccaaga cacaaattct atcgcaagca tcaagttcca 1080
ttcttgcgca agcgaaacaa gcgccaaact cagcgctaag tctactaggc ttaagtcgac 1140
actgcaaaca gccccggttc ctatgcccga tctgaagaat gtgaaatcta aaataggctc 1200
gactgaaaat ctgaaacacc aacctggtgg tggtaaagtg cagattatca acaaaaaatt 1260
ggacctgtca aatgtacaga gtaagtgtgg ttccaaagat aacatcaaac atgttccggg 1320
gggcgggtcc gtacagattg tgtataagcc agtcgatctg agcaaagtca ccagcaaatg 1380
cgggtctctg ggcaacattc atcacaaacc aggcggtgga caggttgagg tcaagagcga 1440
aaagctggac tttaaggacc gtgttcagag taaaatcggc tcactcgata acattacgca 1500
tgtgccggga ggaggtaat 1519
<210> 7
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FlaB-TauRD
<400> 7
Asn Val Asp Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr
1 5 10 15
Ala Gln Arg Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met
20 25 30
Glu Arg Leu Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala
35 40 45
Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu
50 55 60
Asp Val Ala Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr
65 70 75 80
Ala Glu Gly Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg
85 90 95
Asp Leu Ser Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg
100 105 110
Val Ala Ile Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg
115 120 125
Ile Ala Glu Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr
130 135 140
Tyr Gly Thr Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val
145 150 155 160
Met Leu Ser Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly
165 170 175
Val Ser Tyr Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala
180 185 190
Ala Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn
195 200 205
Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu
210 215 220
Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val
225 230 235 240
Gly Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln
245 250 255
Gly Glu Ile Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly
260 265 270
Glu Gly Lys Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln
275 280 285
Gly Ala Gln Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val
290 295 300
Asp Ser His Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His
305 310 315 320
Ala Ile Ser Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys
325 330 335
Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr
340 345 350
Lys Thr Gln Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala
355 360 365
Lys Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly Leu Gln Thr Ala
370 375 380
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
385 390 395 400
Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile
405 410 415
Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys
420 425 430
Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr
435 440 445
Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly
450 455 460
Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu
465 470 475 480
Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp
485 490 495
Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
500 505
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于flaB的正向引物
<400> 8
gaattcatgg cagtgaatgt aaatacaa 28
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于flaB的反向引物
<400> 9
ctgcagttag cctagtagac ttagcgc 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TauRD的正向引物
<400> 10
gaattcctgc aaacagcccc ggttcc 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TauRD的反向引物
<400> 11
ctcgagatta cctcctcccg gcacat 26
<210> 12
<211> 957
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 诺如病毒
<400> 12
tcaagaacta aaccattcac cgtcccgatc ttaactgttg aggaaatgtc caactcaaga 60
ttccccattc ctttggaaaa gttgtacacg ggtcccagca gtgcttttgt tgtccaacca 120
caaaatggca ggtgcacgac tgatggcgtg ctcttaggca ctacccagct gtctgctgtc 180
aatatctgca ccttcagagg ggatgtcacc cacattgcag gcagtcatga ctatataatg 240
aatttggctt ctcaaaattg gaacaattat gacccaacag aagaaatccc agcccctctg 300
ggaactccag atttcgtggg aaagatccaa ggcatgctca cccaaaccac aagagaggat 360
ggctcgaccc gcgcccacaa agctacagtg agcactggga gcgtccactt cactccaaag 420
ttgggcagtg ttcaatacac cactgacaca aacaatgatc ttcaaactgg ccaaaacacg 480
aaattcaccc cagtcggcgt catccaggat ggtaataacc accaaaatga accccagcaa 540
tgggtactcc caaattactc aggtagaact ggtcataatg tgcacctagc tcctgccgtt 600
gcccccactt tcccaggcga gcaacttctc ttctttaggt ccactatgcc cgggtgtagc 660
gggtatccca acatgaatct ggattgccta ctcccccagg aatgggtgca gcacttctac 720
caagaagcag ctccagcaca atctgatgtg gctctgctga gatttgtgaa tccagacaca 780
ggtagggttc tgtttgagtg caagctccat aaatcaggct atgtcacagt ggctcacact 840
ggcccgcatg atttggttat cccccccaat ggttatttta gatttgattc ctgggtcaac 900
cagttctaca cacttgcccc catgggaaat ggagcggggc gcagacgtgc attataa 957
<210> 13
<211> 319
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 诺如病毒
<400> 13
Met Ser Arg Thr Lys Pro Phe Thr Val Pro Ile Leu Thr Val Glu Glu
1 5 10 15
Met Ser Asn Ser Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Tyr Thr Gly
20 25 30
Pro Ser Ser Ala Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr
35 40 45
Asp Gly Val Leu Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Ala Val Asn Ile Cys
50 55 60
Thr Phe Arg Gly Asp Val Thr His Ile Ala Gly Ser His Asp Tyr Ile
65 70 75 80
Met Asn Leu Ala Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu
85 90 95
Ile Pro Ala Pro Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly
100 105 110
Met Leu Thr Gln Thr Thr Arg Glu Asp Gly Ser Thr Arg Ala His Lys
115 120 125
Ala Thr Val Ser Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser
130 135 140
Val Gln Tyr Thr Thr Asp Thr Asn Asn Asp Leu Gln Thr Gly Gln Asn
145 150 155 160
Thr Lys Phe Thr Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Asn Asn His Gln
165 170 175
Asn Glu Pro Gln Gln Trp Val Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Gly
180 185 190
His Asn Val His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu
195 200 205
Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro
210 215 220
Asn Met Asn Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln His Phe
225 230 235 240
Tyr Gln Glu Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe
245 250 255
Val Asn Pro Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys
260 265 270
Ser Gly Tyr Val Thr Val Ala His Thr Gly Pro His Asp Leu Val Ile
275 280 285
Pro Pro Asn Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr
290 295 300
Thr Leu Ala Pro Met Gly Asn Gly Ala Gly Arg Arg Arg Ala Leu
305 310 315
<210> 14
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pd-flaB
<400> 14
atgtcaagaa ctaaaccatt caccgtcccg atcttaactg ttgaggaaat gtccaactca 60
agattcccca ttcctttgga aaagttgtac acgggtccca gcagtgcttt tgttgtccaa 120
ccacaaaatg gcaggtgcac gactgatggc gtgctcttag gcactaccca gctgtctgct 180
gtcaatatct gcaccttcag aggggatgtc acccacattg caggcagtca tgactatata 240
atgaatttgg cttctcaaaa ttggaacaat tatgacccaa cagaagaaat cccagcccct 300
ctgggaactc cagatttcgt gggaaagatc caaggcatgc tcacccaaac cacaagagag 360
gatggctcga cccgcgccca caaagctaca gtgagcactg ggagcgtcca cttcactcca 420
aagttgggca gtgttcaata caccactgac acaaacaatg atcttcaaac tggccaaaac 480
acgaaattca ccccagtcgg cgtcatccag gatggtaata accaccaaaa tgaaccccag 540
caatgggtac tcccaaatta ctcaggtaga actggtcata atgtgcacct agctcctgcc 600
gttgccccca ctttcccagg cgagcaactt ctcttcttta ggtccactat gcccgggtgt 660
agcgggtatc ccaacatgaa tctggattgc ctactccccc aggaatgggt gcagcacttc 720
taccaagaag cagctccagc acaatctgat gtggctctgc tgagatttgt gaatccagac 780
acaggtaggg ttctgtttga gtgcaagctc cataaatcag gctatgtcac agtggctcac 840
actggcccgc atgatttggt tatccccccc aatggttatt ttagatttga ttcctgggtc 900
aaccagttct acacacttgc ccccatggga aatggagcgg ggcgcagacg tgcattagtc 960
gacatggcag tgaatgtaaa tacaaacgta gcagcaatga cagcacagcg ttacctgaat 1020
aacgcaaaca gcgcacaaca aacttcgatg gagcgtctgt cttcaggttt caaaatcaac 1080
agtgcaaaag atgacgcagc cggtctgcaa atctctaacc gcttgaacgt acaaagtcgc 1140
ggtctagacg ttgcggtacg taacgccaac gacggtatct caatcgcaca aaccgcagaa 1200
ggtgcgatga acgagaccac caacatccta caacgtatgc gtgacctatc tctacaatcc 1260
gcgaacggct caaactcaaa atcagagcgc gtggcgattc aagaagaagt gacagcattg 1320
aatgacgagc taaaccgtat tgcagaaacc acgtcttttg gtggtaacaa gctgctaaac 1380
ggtacttacg gcacgaaagc aatgcaaatt ggtgcggata acggtgaagc ggtcatgctt 1440
tcactgaaag acatgcgctc tgacaacgtg atgatgggcg gcgtgagcta ccaagctgaa 1500
gaaggcaaag acaagaactg gaatgtggcc gcaggcgaca acgacttgac gattgcactg 1560
acagacagct ttggtaacga gcaagagatc gaaatcaacg cgaaagcggg tgatgacatc 1620
gaagagctag cgacgtacat caacggtcaa actgaccttg taaaagcgtc agtgggtgaa 1680
ggcggcaagc tacagatctt tgctggtaac aacaaagttc aaggtgaaat tgctttctca 1740
ggtagcctag ctggtgaact tggcctaggc gaaggcaaaa acgtcacggt agacacgatt 1800
gacgtgacaa ccgtacaagg tgcgcaagag tcggtagcga ttgtggatgc ggcactgaaa 1860
tacgtagaca gccaccgtgc agagctgggt gcattccaga accgtttcaa ccatgcaatc 1920
agcaacttgg acaacatcaa cgaaaacgtg aacgcgtcga agagccgaat caaagatacc 1980
gacttcgcga aagaaacgac tcagttgacc aagacacaaa ttctatcgca agcatcaagt 2040
tccattcttg cgcaagcgaa acaagcgcca aactcagcgc taagtctact aggctaa 2097
<210> 15
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pd-flaB
<400> 15
Asn Val Asp Met Ala Val Asn Val Asn Thr Asn Val Ala Ala Met Thr
1 5 10 15
Ala Gln Arg Tyr Leu Asn Asn Ala Asn Ser Ala Gln Gln Thr Ser Met
20 25 30
Glu Arg Leu Ser Ser Gly Phe Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala
35 40 45
Ala Gly Leu Gln Ile Ser Asn Arg Leu Asn Val Gln Ser Arg Gly Leu
50 55 60
Asp Val Ala Val Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr
65 70 75 80
Ala Glu Gly Ala Met Asn Glu Thr Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg
85 90 95
Asp Leu Ser Leu Gln Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ser Lys Ser Glu Arg
100 105 110
Val Ala Ile Gln Glu Glu Val Thr Ala Leu Asn Asp Glu Leu Asn Arg
115 120 125
Ile Ala Glu Thr Thr Ser Phe Gly Gly Asn Lys Leu Leu Asn Gly Thr
130 135 140
Tyr Gly Thr Lys Ala Met Gln Ile Gly Ala Asp Asn Gly Glu Ala Val
145 150 155 160
Met Leu Ser Leu Lys Asp Met Arg Ser Asp Asn Val Met Met Gly Gly
165 170 175
Val Ser Tyr Gln Ala Glu Glu Gly Lys Asp Lys Asn Trp Asn Val Ala
180 185 190
Ala Gly Asp Asn Asp Leu Thr Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Gly Asn
195 200 205
Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asn Ala Lys Ala Gly Asp Asp Ile Glu Glu
210 215 220
Leu Ala Thr Tyr Ile Asn Gly Gln Thr Asp Leu Val Lys Ala Ser Val
225 230 235 240
Gly Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ile Phe Ala Gly Asn Asn Lys Val Gln
245 250 255
Gly Glu Ile Ala Phe Ser Gly Ser Leu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Gly
260 265 270
Glu Gly Lys Asn Val Thr Val Asp Thr Ile Asp Val Thr Thr Val Gln
275 280 285
Gly Ala Gln Glu Ser Val Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Lys Tyr Val
290 295 300
Asp Ser His Arg Ala Glu Leu Gly Ala Phe Gln Asn Arg Phe Asn His
305 310 315 320
Ala Ile Ser Asn Leu Asp Asn Ile Asn Glu Asn Val Asn Ala Ser Lys
325 330 335
Ser Arg Ile Lys Asp Thr Asp Phe Ala Lys Glu Thr Thr Gln Leu Thr
340 345 350
Lys Thr Gln Ile Leu Ser Gln Ala Ser Ser Ser Ile Leu Ala Gln Ala
355 360 365
Lys Gln Ala Pro Asn Ser Ala Leu Ser Leu Leu Gly Met Ser Arg Thr
370 375 380
Lys Pro Phe Thr Val Pro Ile Leu Thr Val Glu Glu Met Ser Asn Ser
385 390 395 400
Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Tyr Thr Gly Pro Ser Ser Ala
405 410 415
Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu
420 425 430
Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Ala Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly
435 440 445
Asp Val Thr His Ile Ala Gly Ser His Asp Tyr Ile Met Asn Leu Ala
450 455 460
Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro
465 470 475 480
Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Met Leu Thr Gln
485 490 495
Thr Thr Arg Glu Asp Gly Ser Thr Arg Ala His Lys Ala Thr Val Ser
500 505 510
Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Val Gln Tyr Thr
515 520 525
Thr Asp Thr Asn Asn Asp Leu Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe Thr
530 535 540
Pro Val Gly Val Ile Gln Asp Gly Asn Asn His Gln Asn Glu Pro Gln
545 550 555 560
Gln Trp Val Leu Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Gly His Asn Val His
565 570 575
Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe
580 585 590
Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asn Leu
595 600 605
Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu Ala
610 615 620
Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro Asp
625 630 635 640
Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr Val
645 650 655
Thr Val Ala His Thr Gly Pro His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn Gly
660 665 670
Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala Pro
675 680 685
Met Gly Asn Gly Ala Gly Arg Arg Arg Ala Leu
690 695
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于P结构域的正向引物
<400> 16
catatgtcaa gaactaaacc attcaccg 28
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于P结构域的反向引物
<400> 17
gtcgactaat gcacgtctgc gccccg 26

Claims (10)

1.一种构象异构体抗原识别抗体诱导用神经退行性疾病治疗用组合物，其包含重组蛋白作为有效成分，所述重组蛋白由以下(a)～(b)组成：
(a)Tau蛋白的重复结构域；以及
(b)来源于创伤弧菌的FlaB蛋白，
其中所述重复结构域由SEQ ID NO:3的氨基酸序列形成，
其中所述FlaB蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列形成，且
其中所述FlaB蛋白在所述重复结构域之前。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重复结构域由密码子优化的SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码，从而在大肠杆菌中表达。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述神经退行性疾病为选自tau病症、痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症及记忆力下降中的疾病。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中选自tau病症、痴呆和记忆力下降的神经退行性疾病由阿尔茨海默病导致。
5.重组蛋白用于制造对神经退行性疾病的诊断提供必要的信息的试剂的用途，其中所述重组蛋白由以下(a)～(b)组成：
(a)Tau蛋白的重复结构域；以及
(b)来源于创伤弧菌的FlaB蛋白，
其中所述重复结构域由SEQ ID NO:3的氨基酸序列形成，
其中所述FlaB蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列形成，
其中所述FlaB蛋白在所述重复结构域之前，且
其中所述神经退行性疾病为选自tau病症、痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症及记忆力下降中的疾病。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述重复结构域由密码子优化的SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码，从而在大肠杆菌中表达。
7.根据权利要求5所述的用途，其中选自tau病症、痴呆和记忆力下降的神经退行性疾病由阿尔茨海默病导致。
8.重组蛋白用于制造治疗神经退行性疾病的药物的用途，所述重组蛋白由以下(a)～(b)组成：
(a)Tau蛋白的重复结构域；以及
(b)来源于创伤弧菌的FlaB蛋白，
其中所述重复结构域由SEQ ID NO:3的氨基酸序列形成，
其中所述FlaB蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列形成，
其中所述FlaB蛋白在所述重复结构域之前，且
其中所述神经退行性疾病为选自tau病症、痴呆、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症及记忆力下降中的疾病。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述重复结构域由密码子优化的SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码，从而在大肠杆菌中表达。
10.根据权利要求8所述的用途，其中选自tau病症、痴呆和记忆力下降的神经退行性疾病由阿尔茨海默病导致。
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