KR20170140646A - Ac-PGP 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물 및 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드는 혈관내피전구세포의 이동 및 튜브 형성능 증가를 유도하여 혈관 신생 촉진, 재상피화 및 면역 세포의 침윤 촉진에 효과적이므로, 허혈성 질환을 포함하는 혈관 신생 의존성 질환이나 상처 및 화상 치료에도 이용 가능하여, 이와 관련된 의료, 제약 및 화장품 관련 산업에서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Ac-PGP 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물{Composition for promoting angiogenesis comprising Ac-PGP peptide}

본 발명은 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 조성물 및 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

신생혈관형성(angiogenesis)은 기존 혈관의 내피세포가 세포 외 기질을 분해하고, 이동, 분열, 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상으로, 성장과 생식, 상처치유 등의 생리적 과정에서 나타난다. 또한, 신생혈관형성은 종양의 성장, 관절염, 당뇨병 등의 병리적 상태와도 연관이 있다. 혈관형성은 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화, 모세혈관 형성 등의 복잡한 일련의 과정이 필요하며, 이러한 과정에 관여하는 많은 혈관신생 촉진 인자와 혈관신생 억제인자들이 발견되었다. 혈관신생 억제인자들은 혈관신생이 생성될 때 필요한 혈관신생 촉진 인자들의 활성에 반대하여 활성화된다. 체내에 자연적으로 존재하는 혈관신생 억제제들은 독성이 적어 병리적인 혈관신생 억제에 사용될 수 있으므로 이와 관련된 많은 약물들이 개발 중에 있다. 특히, 혈관신생은 상처 조직이 재생되기 위한 필수적인 상처 회복 과정에 반드시 수반되어야 하며, 허혈성 질환의 치료를 위해서도 필수적이다.

상처 조직의 치유 과정은 면역반응(inflammation), 재상피화(re-epithelialization), 신생혈관 형성(angiogenesis), 육아조직의 형성(granulation), 섬유조직형성(fibroplasia), 상처조직의 수축(contraction)등 여러 가지 과정을 통해 이루어진다. 이러한 과정들은 내피 세포(endothelial cells), 염증 세포(inflammatory cells), 섬유아세포(fibroblasts) 및 케라티노사이트(keratinocytes) 등과 같은 여러 세포들의 이동, 증식, 분화, 침윤과 같은 과정을 통하여 이루어지며, 상기 과정은 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 혈관전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor), 혈관 표피 성장 인자(vascular endothelial growth factor), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor) 및 케라티노사이트 성장 인자(keratinocyte growth factor)등과 같은 다양한 성장인자와 사이토카인 및 케모카인의 의해서 조절된다{Singer AJ, Clark RA. (1999) The New England journal of medicine, 341, 738~46; Greaves NS et al. (2013) Journal of dermatological 7, 206~17}.

상처 회복을 위하여 이들 성장인자나, 사이토카인을 처리하는 방법이 기술이 전 세계적으로 많은 연구가 되고 있다{Braund R et al. (2007) Current drug delivery 4: 195-204; Roesel JF et al. (1995) The Journal of surgical research 58: 449-59}. 하지만 이러한 성장인자 및 사이토카인을 이용한 상처 치료기술 개발에 있어서 이들 단백질을 생산, 분리하는 데 많은 비용이 소요되며, 상처치유과정에 이러한 단백질들은 복합적으로 작용하기 때문에 한 가지 종류의 인자만을 사용할 경우 상처치료제로 비효과적인 점 때문에 실제 상용화 하는데 문제점이 있다. 따라서 상처치료에 있어서 상처 치유 과정을 촉진하는 합성 펩타이드의 개발은 시급한 실정이다.

허혈은 출혈, 색전 및 경색 등에 의해 조직으로의 혈류공급이 중단되어 세포손상이 일어나 국부적으로 조직의 괴사가 일어난 상태를 의미한다. 허혈의 대표적인 질병으로는 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 심장질환이 있으며, 상기 질병들은 심각한 후유증을 유발하거나 사망을 초래할 수 있다. 특히, 급성 심근경색 또는 중증 협심증 등과 같은 허혈성 심혈관 질환은 급속하게 증가하고 있고 이 질환으로 인한 사망자는 전 세계적으로 높은 수치를 보인다. 따라서, 허혈성 질환의 효과적인 치료제 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 상처 및 허혈성 질환의 치료에 효과적인 유효성분을 연구하던 중, Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드는 혈관 신생 촉진, 재상피화 및 면역 세포의 침윤 촉진에 효과적임을 확인하여, 허혈성 질환을 포함하는 혈관 신생 의존성 질환이나 상처 및 화상 치료에도 이용 가능함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 목적은 Ac-PGP 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Ac-PGP 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드는 혈관 신생 촉진, 재상피화 및 면역 세포의 침윤 촉진에 효과적이므로, 허혈성 질환을 포함하는 혈관 신생 의존성 질환이나 상처 및 화상 치료에도 이용 가능하여, 이와 관련된 의료, 제약 및 화장품 관련 산업에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 실험군(0.1 μM 농도의 Ac-PGP 처리)을 대조군과 비교하여 Hematoxylin&Eosin(H&E) 염색을 수행하여 분석한 결과(A), 면역형광염색법을 수행한 결과를 현미경으로 관찰한 결과(B) 및 신생 혈관 형성 정도 결과(C)를 나타낸 도이다.
도 2는 실험군(0.1, 1, 10 μM 농도의 Ac-PGP 처리)을 대조군과 비교하여 면역형광염색법을 수행한 결과를 공초점 현미경으로 관찰한 결과(A), 모세혈관(capillary) 표지 항체인 CD31 폴리클노날 항체를 처리한 결과(B) 및 성숙 혈관(artery) 표지 항체인 a-SMA(C)를 반응시킨 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 실험군 4군의 상처 부위에 0.01, 0.1, 1 및 10 μM 농도의 Ac-PGP를 처리한 결과를 대조군과 비교하여 육안으로 관찰하고(A), 상처 면적을 측정한 결과(B)를 나타낸 도이다.
도 4는 대조군 및 실험군(0.1 μM 농도의 Ac-PGP 처리)에 대한 상처 면적을 육안으로 관찰하고 (A), 상처의 면적을 측정한 결과(B), 재상피화 정도 측정 결과(C) 및 상피층 양 끝단 사이의 간격을 현미경으로 촬영한 결과(D)를 나타낸 도이다.
도 5는 실험군(0.1 μM 농도의 Ac-PGP 처리)을 대조군과 비교하여 면역형광염색법을 수행한 결과를 공초점 현미경으로 관찰한 결과(A) 및 CD68 폴리클로날 항체와 반응 결과(B)를 나타낸 도이다.
도 6은 동물 허혈 모델에 실험군 3군에 Ac-PGP(0.1, 1 및 10 μM 농도)를 처리한 결과를 대조군과 비교하여 괴사 정도(A) 및 LDPI율을 통한 혈류 흐름 정도(B)을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 골수세포(혈액세포)를 마우스에 이식한 후 상기 마우스 허혈 유도 후 Ac-PGP를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군의 혈류 정도(A), LDPI율을 통한 혈류 흐름 정도(B), 혈액 세포의 이동 정도(C) 및 골수세포(혈액세포)의 이동 촉진 정도(D)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 골수세포(혈액세포)를 허혈 마우스 모델에 골수 이식한 후 Ac-PGP를 처리한 군과 처리하지 않은 대조군의 모세혈관 표지 항체인 ILB4 및 성숙 혈관 표지 항체인 a-SMA의 발현을 공초점 현미경으로 확인한 결과(A 및 C) 및 이식한 세포의 혈관 생성 기여 정도를 확인한 결과 이를 구체적인 지수로 나타낸 결과(B 및 D)를 나타낸 도이다.

본 발명은 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro)"는 프롤린(Proline, Pro), 글리신(Glycine, Gly) 및 프롤린(Proline, Pro)의 3개의 아미노산으로 이루어진 아세틸화된 저분자 펩타이드이다. 이는 생체 내 존재하는 콜라겐이 분해되어 만들어 진다. 상기 Ac-PGP는 다양한 세포의 표면에 존재하는 IL-8 chemoattractant receptor 2(CXCR2)를 매개로하여 작용하는 펩타이드로, 상기 CXCR2는 호중구(neutrophil) 및 대식세포(macrophage) 등 면역세포의 주화성 및 활성에 관여하며, 호스트 방어작용, 염증 반응 및 신생 혈관 형성에 중요한 역할을 나는 것으로 알려져있다. Ac-PGP는 이러한 CXCR2를 통해 호중구를 활성화 시켜 폐혈증, 염증성 장 질환 등과 같은 호중구 염증 질환에 중요한 역할을 한다.

본 발명에 있어서, "혈관신생(angiogenesis)"은 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉, 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생하는 것을 의미한다. 이러한 혈관신생 과정은 1) 혈관생성 성장인자(angiogenic growth factor)가 기존 혈관에 휴지상태로 존재하는 혈관내피세포에 존재하는 수용체를 활성화시키고, 2) 활성화된 혈관 내피세포가 주변의 기저막 및 세포외기질을 분해하는 단백질분해효소를 분비하기 시작하여, 3) 혈관내피세포가 기존 혈관벽으로부터 벗어나서 혈관생성인자(angiogenic factor)를 분비하는 조직을 향해 이동하고 증식함으로써, 이루어질 수 있다.

상기 Ac-PGP 펩타이드는 0.001 내지 100 μM 의 농도를 포함하고, 바람직하게는 0.001 내지 50 μM 의 농도를 포함하고, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 30 μM 의 농도를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 혈관 신생 촉진용은 혈관 신생 의존성 질환 예방 및 치료용; 상처 또는 화상의 개선 및 치료용; 인공 피부 이식용; 피부판 재생용; 및 이식용 혈관 제조용으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 용도이나, 바람직하게는 혈관 신생 의존성 질환 예방 및 치료용; 또는 상처 또는 화상의 개선 및 치료용이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "혈관신생 의존성 질환"은 혈액 공급이 원활하게 이루어지지 않거나 혈관 신생이 제대로 이루어지지 않는 증상을 수반하는 질환이다. 본 발명의 Ac-PGP 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 혈관 신생 촉진 효과에 의하여 예방 또는 치료될 수 있는 질환이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 만성궤양, 허혈성 질환, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 허혈성 질환은 뇌허혈, 심장허혈, 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전, 심근비대증, 망막허혈, 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중, 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 "상처"는 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다.

상기 상처는 비-치유 외상성 상처, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 열상(laceration), 결출상(avulsion), 관통상(penetrated wound), 총상(gunshot wound), 절상, 동상, 타박상(contusion or bruise), 피부궤양, 피부건조, 피부 각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부 사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 상처, 각막창상 등의 상처, 욕창, 와창, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 상처, 부인과적 상처, 화학적 상처 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin)등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 일 예로, 상기 약학적 조성물은 상처에 직접 적용될 수 있으며, 즉, 상처부위에 산포될 수 있다. 시트의 형태인 경우는 상처 부위에 도포하는데 이때 도포한 부위에 적절히 드레싱하여 상처를 보호하면서 활성 성분의 치료 효과가 감소하는 것을 방지한다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필(Compeel), 듀우덤(Duoderm), 타가덤(Tagaderm) 및 옵사이트(Opsite)를 들 수 있다.

본 발명의 외용제에서, 약제학상 허용되는 담체로는 그의 제형에 따라 다르나, 바셀린, 유동 파라핀, 겔화 탄화 수소 (별명: 플라스티베이스) 등의 탄화수소류; 중쇄지방산트리글리세라이드, 돈지, 하드 팻트, 카카오지 등의 동식물성 오일; 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아린산, 팔미틴산이소프로필 등의 고급지방산 알코올 및 지방산 및 그의 에스테르류; 마크로골 (폴리에틸렌글리콜), 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤, 젤라틴, 백당, 당알코올 등의 수용성 기제; 글리세린 지방산에스테르, 스테아린산폴리옥실, 폴리옥시에틸렌경화 피마자유 등의 유화제; 아크릴산에스테르, 알긴산나트륨 등의 점착제; 액화석유가스, 이산화탄소 등의 분사제; 파라옥시벤조산에스테르류 등의 방부제 등을 들 수 있으며, 본 발명의 외용제는 이들을 사용하여 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 이들 이외에도 안정제, 향료, 착색제, pH 조정제, 희석제, 계면활성제, 보존제, 항산화제 등을 필요에 따라 배합할 수도 있다. 본 발명의 외용제는 사용은 통상의 방법에 의해 국소 상처부에 도포 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 외용제는 통상적인 반창고의 상처 박리 커버 등과 같은 고체 지지체상에 점착되어 사용될 수 있다. 본 발명의 일 예로서, 고체 지지체를 먼저 점착층으로 피복하여 고체 지지체에 배양액의 부착을 향상시킨다. 점착제의 예로는 폴리아크릴레이트 및 시아노아크릴레이트가 포함될 수 있다.

이러한 형태의 제형은 시판되고 있는 것이 많으며 예로는 천공된 플라스틱 필름 형태의 비부착성 상처 박리 커버를 갖는 반창고 (Smith & Nephew Ltd.), Johnson & Johnson의 얇은 스트립 (strip), 패취 (patch), 스포트(spot), 가소성 스트립 형태의 밴드-에이드 (BAND-AID*); Colgate-Palmolive Co. (Kendall)의 큐리티 큐러드(Curity CURAD, 오우취리스(Ouchless)) 반창고; 및 American WhiteCross Laboratories, Inc.의 스틱-타이트*(STIK-TITE*) 탄성 스트립 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 유효량은 환자의 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량은 세포 배양액을 상처에 적용시 1 내지 50 ㎕/cm²일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20㎕/cm² 일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 (數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

그러나, 본 발명의 약학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 상처 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 동물 상처 모델에 Ac-PGP를 농도별로 처리 시, Ac-PGP를 처리한 군에서 상처 재생 효과를 확인하였다. 상기 농도의 Ac-PGP를 처리한 결과, 재-상피화, 신생 혈관 형성 및 면역 세포의 침윤 촉진을 유도함을 확인하였다. 또한, 동물 허혈 모델에 Ac-PGP를 농도별로 처리 시, Ac-PGP를 처리한 군에서 하지 재생 및 혈류 증가 효과를 확인하였다. 상기 농도의 Ac-PGP를 처리한 결과, 신생 혈관 형성에 효과적임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드는 허혈성 질환을 포함하는 혈관 신생 의존성 질환이나 상처 및 화상 치료에도 이용 가능함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 Ac-PGP 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "피부 재생"은 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대해 피부 조직의 회복 과정을 의미한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 Ac-PGP 펩타이드 이외에 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 확스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 때에는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오르히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탄액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 실험 준비

본 발명의 저분자 펩타이드 Ac-PGP는 Ac-Pro-Gly-Pro-OH Sequence로써 Anaspec에서 합성되었으며 합성된 Ac-PGP의 순도는 ≥ 95% 이다. 동물 실험은 부산대학교 의학전문대학원 동물윤리 위원회 규정 및 프로토콜에 의거하여 진행하였으며, 실험에 이용된 마우스는 오리엔트 바이오에서 구매하여 이용하였다.

실시예 1. Acetylated Pro- Gly -Pro(Ac- PGP ) 처리에 따른 신생 혈관 형성증가 확인

실시예 1-1. 동물 상처 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 신생 혈관 형성 증가 확인

동물 상처 모델에서 Ac-PGP 처리에 따른 신생 혈관 형성 증가 여부를 확인하였다.

상처 회복에 있어서 중요한 과정 중 하나인 혈관 생성 정도를 확인하기 위해 상처 유도 후 Hematoxylin&Eosin(H&E) 염색을 수행하여 분석하였다(도 1의 A). 또한 면역형광염색법을 통하여 상처 재생 효과가 있는 0.1 μM 농도의 Ac-PGP 와 대조군의 차이를 비교하였다(도 1의 B 및 C). 구체적으로, 면역형광염색법을 시행하기 위하여 파라핀 조직이 부착된 슬라이드의 파라핀을 제거한 후 혈관 표지 항체인 ILB4 폴리클로날 항체와 반응시켰다. 이를 관측할 수 있는 2차 항체(Strept avidin 488)을 결합시키고 공초첨 현미경을 이용하여 확인하였으며 이를 수치화하였다(도 1의 B 및 C). 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 0.1uM 농도의 Ac-PGP를 처리한 군에서 상처 유도 후 적혈구를 포함하는 혈관이 대조군에 비하여 증가됨을 확인하였다. 또한 0.1uM 농도의 Ac-PGP를 처리한 군이 대조군에 비하여 혈관 형성이 촉진됨을 확인하였으며, 특히, 상처 유도 후 6일차에서 혈관 형성이 가장 활발히 일어난 것을 알 수 있다. 따라서, 본 결과를 통하여 Ac-PGP를 처리한 군에서 상처 회복에 있어서 중요한 과정인 혈관 형성을 증가시킴을 확인하였다.

실시예 1-2. 동물 허혈 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 신생 혈관 형성 증가 확인

허혈 조직 재생 있어서 필수적 과정인 혈관 생성 정도를 확인하기 위하여, Ac-PGP 처리에 따라, 동물 허혈 모델에서 신생 혈관의 형성을 증가시킴을 확인하였다.

마우스에 하지 허혈 유도 후 면역형광염색법을 통하여 0.1, 1 및 10 μM 의 Ac-PGP 처리군 및 대조군의 차이를 비교하였다. 구체적으로, 면역형광염색법을 시행하기 위하여 파라핀 조직이 부착된 슬라이드의 파라핀을 제거한 후 모세혈관(capillary) 표지 항체인 CD31 폴리클노날 항체와 성숙 혈관(artery) 표지 항체인 a-SMA를 반응시키고, 이를 관측할 수 있는 2차 항체(각각 alexa 488 및 568)을 결합 시켜 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, Ac-PGP를 처리한 군에서 모세혈관의 형성 정도가 가장 촉진 되었으며, 성숙한 혈관의 형성 정도 또한 대조군에 비해 촉진되었음을 확인하였다.

실시예 2. 동물 상처 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 상처 치료 효과 확인

동물 상처 모델에서 Ac-PGP 농도별 처리에 따라, 상처 재생 및 재-상피화 및 면역세포의 침윤을 촉진 정도를 확인하여, 상기 Ac-PGP 처리에 따른 상처 치료 효과를 확인하였다.

실시예 2-1. 동물 상처 모델에서 Ac- PGP 농도별 처리에 따른 상처 재생 확인

동물 상처 모델에서 Ac-PGP를 농도 별로 처리하였을 때 상처 재생 정도를 확인하였다.

구체적으로, 6주령의 Sprague Dawley Rat를 대조군 및 실험군 4군(각 0.01, 0.1, 1 및 10 μM의 Ac-PGP 처리군)으로 나누어 2% 농도의 엔플루란(Enflurane)으로 호흡 마취 시킨 후 등허리 부위 털을 전기 클리퍼를 사용하여 제거하였다. 털이 제거된 노출된 부위를 70%의 에탄올로 소독하고, 8㎜ 바이옵시 펀치(biopsy punch)로 상처를 유도하였다. 대조군의 상처 부위에 HBSS(Hank's balanced salt solution)을 20 μl으로 처리하고, 4개의 실험군의 상처 부위 각각에 0.01, 0.1, 1 및 10 μM 농도의 Ac-PGP를 각 20 μl 용량으로 처리하였다. 이 후 3일, 6일, 9일 및 12일째에 상처 부위를 육안으로 관찰하고, 상처의 면적은 디지털 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, Ac-PGP를 0.01 μM 내지 10 μM 의 농도로 상처 조직 내에 도포하였을 때 상처 치료 효과가 나타남을 확인하였다. 특히, 0.1 μM 농도의 Ac-PGP를 처리한 실험군에서 상처 재생이 가장 활발히 이루어 진 것을 확인하였다.

실시예 2-2. 동물 상처 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 재- 상피화 확인

동물 상처 모델에서 Ac-PGP 처리 시 재-상피화 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 6주령의 Sprague Dawley Rat에 상처를 유도한 후, 대조군에는 HBSS를 처리하고, 실험군에는 0.1uM 농도의 Ac-PGP를 각각 20 μl씩 유도된 상처에 처리하였다. 처리 3일, 6일, 9일 및 12일 후에, 상처 부위를 육안으로 관찰하고(도 4의 A), 상처의 면적을 측정하였다(도 4의 B). 또한 CO₂ 가스를 이용하여 대조군 및 실험군의 마우스를 희생시킨 후 상처 주위의 조직을 채취하였다. 이 후, 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 4μM 두께의 절편을 만든 후 재상피화(re-epithelialization)정도를 확인하기 위하여, Hematoxylin&Eosin(H&E)으로 염색하여 분석하였다. 현미경으로 촬영하여 상피층 양 끝단 사이의 간격을 측정하였고(도 4의 C), 상기 염색한 결과를 통해 재상피화 정도는 상처 조직 양 끝단 사이의 간격을(흰 선) 촬영한 현미경 프로그램을 통하여 측정하였다(도 4의 D). 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, Ac-PGP를 0.1 μM 의 농도로 상처 조직 내에 도포하였을 때, 대조군과 비교하여 육안으로도 면적이 줄어들었고(A), 상처 면적(%)이 처리 후 시간이 지남에 따라 대조군보다 유의적으로 감소됨을 확인하였다(B). 또한, 상피층 양 끝단 사이의 간격을 측정한 결과, 시간이 지남에 따라 대조군보다 특이적으로 감소됨을 확인하였다(C). 또한, Hematoxylin&Eosin(H&E)으로 염색한 결과, Ac-PGP를 0.1 μM 의 농도로 처리 후 시간이 지날수록 재상피화가 촉진됨을 확인하였다(D).

따라서, Ac-PGP을 처리 시, 상처 조직의 재상피화가 대조군에 비하여 활발하여, 피부 상처의 재생을 촉진함을 확인하였다.

실시예 2-3. 동물 상처 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 면역세포의 침윤 촉진 정도 확인

상처 재생에 있어서 중요한 과정 중 하나인 면역 세포의 침윤 정도를 확인하기 위하여 동물 상처 모델에서 Ac-PGP 처리에 따른 면역세포의 침윤을 촉진 정도를 확인하였다.

구체적으로, 면역형광염색법을 통하여 상처 재생 효과가 가장 높은 0.1μM 농도의 Ac-PGP를 처리한 실험군과 대조군의 면역 침윤 정도를 비교하였다. 면역형광염색법을 시행하기 위하여 파라핀 조직이 부착된 슬라이드의 파라핀을 제거한 후 면역세포 표지 항체인 CD68 폴리클로날 항체와 반응시키고, 이를 관측할 수 있는 2차 항체(Alexa488-labeled anti-rabbit)을 결합시켜 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 0.1 μM 농도의 Ac-PGP를 처리한 군에서 면역세포의 침윤이 대조군에 비해 활발히 일어남을 확인하였으며, 이는 상처 유도 후 3일차에 가장 활발함을 확인하였다. 따라서, Ac-PGP는 상처 조직이나 염증 조직 재생의 중요한 과정 중 하나인 면역세포의 침윤을 증가시킴을 확인하였다

실시예 3. 동물 허혈 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 하지 재생 및 혈류 증가 확인

동물 허혈 모델에서 Ac-PGP 처리에 따른 하지 재생 및 혈류 증가를 확인하였다.

구체적으로, 7~8 주령의 C57BL/6 mice 대조군 및 실험군 3군(각 0.1μM, 1μM 및 10μM 의 Ac-PGP 처리군)으로 나누어 2% 농도의 엔플루란(Enflurane)으로 호흡 마취 시킨 후 마우스 다리 하지 혈관을 묶어 하지 허혈 모델을 유도하였다. 대조군에는 HBSS(Hank's balanced salt solution)를 허혈 유도 다리에 각각 60 μl 처리하였고, 실험군 3군에는 0.1, 1 및 10 μM 농도의 Ac-PGP를 각 20 μl씩 3군데로 나누어 총 60 μl를 허혈이 유도된 다리에 처리하였다. 처리 7일, 14일, 21일 및 28일 후에 마우스 허혈 부위의 괴사 정도를 육안으로 관찰 하였다(도 6의 A). 또한, 레이저 도플러 관류 이미지(laser doppler perfusion image, LDPI)를 통하여 처리 후 7일, 14일, 21일 및 28일의 혈류 흐름을 관찰하였다(도 6의 B). 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, Ac-PGP를 0.01, 1 및 10 μM 의 농도로 허혈 조직 내에 처리하였을 때, 하지 혈류가 증가함을 확인하였으며, 특히, 0.1μM 농도의 Ac-PGP를 처리한 군에서 혈류 증가가 가장 활발함을 확인하였다.

실시예 4. 동물 허혈 모델에서 Ac- PGP 처리에 따른 혈액 세포 이동 촉진, 혈류 증가 및 혈관 형성 촉진 효과 확인

동물 허혈 모델에서 Ac-PGP 처리에 따른 혈액 세포 이동 촉진, 혈류 증가, 혈관 형성 촉진 및 이식한 세포의 혈관 형성 정도 효과를 확인하였다.

구체적으로, 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein, GFP)를 포함한 마우스 골수세포(혈액세포)를 마우스에 골수 이식(bone marrow transplantation, BMT)한 후, 상기 마우스 허혈 모델에 Ac-PGP를 처리하여 28일 동안 허혈 마우스 모델의 혈류 정도를 확인하였다(도 7의 A). LDPI율을 통한 혈류 흐름 정도(도 7의 B)를 확인하였다. 또한, Ac-PGP를 처리한 군과 처리하지 않은 군의 녹색 형광 단백질의 발현 정도를 확인하여 혈액 세포의 이동 정도를 확인하였고(도 7의 C) 골수세포(혈액세포)의 이동 촉진 정도를 확인하였다(도 7의 D). 그 결과를 도 7에 나타내었다.

또한, 골수세포(혈액세포)를 마우스에 골수 이식한 허혈 마우스에 Ac-PGP 처리에 따른 모세 혈관 및 성숙 혈관의 형성 정도를 확인하였다. 또한, 이식한 세포가 혈관을 형성하였는지 확인하였다. 구체적으로, 상기 골수세포(혈액세포)를 마우스에 골수 이식한 허혈 마우스에 Ac-PGP를 처리한 군과 이를 처리하지 않은 대조군에 모세혈관(capillary) 표지 항체인 ILB4를, 성숙 혈관(artery) 표지 항체인 a-SMA를 GFP와 염색하였다. 이후 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 골수세포(혈액세포)를 이식 후 허혈 마우스 모델에 Ac-PGP를 처리한 군은 처리하지 않은 대조군에 비하여 허혈 조직으로 골수 세포(혈액 세포)의 이동을 촉진 시킴을 확인하였다. 또한, Ac-PGP를 처리한 마우스에서는 대조군에 비하여 혈류가 증가됨을 확인하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 골수세포(혈액세포)를 이식한 허혈 마우스 모델에 Ac-PGP를 처리한 군은 처리하지 않은 대조군에 비하여 모세혈관 표지 항체인 ILB4 및 성숙 혈관 표지 항체인 a-SMA가 발현됨을 확인하여, Ac-PGP는 모세혈관 및 성숙 혈관의 형성을 촉진시킴을 확인하였으며, Ac-PGP를 처리한 군에서 대조군에 비하여 이식한 세포의 혈관 생성 정도가 증가 하였다.

Claims (7)

1. Ac-PGP(Acetylated Pro-Gly-Pro) 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Ac-PGP 펩타이드를 0.001 내지 100 μM 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 혈관 신생 촉진용은 혈관 신생 의존성 질환 예방 및 치료용; 상처 또는 화상의 개선 및 치료용; 인공 피부 이식용; 피부판 재생용; 및 이식용 혈관 제조용으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 용도인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 혈관 신생 의존성 질환은 만성궤양, 허혈성 질환, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 치매로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 허혈성 질환은 뇌허혈, 심장허혈, 당뇨병성 혈관심장질환, 심부전, 심근비대증, 망막허혈, 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중, 뇌외상 및 신생아 저산소증으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
6. 제3항에 있어서,
   상기 상처는 비-치유 외상성 상처, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 열상 (laceration), 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 총상 (gunshot wound), 절상, 동상, 타박상 (contusion or bruise), 피부궤양, 피부건조, 피부 각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부 사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 상처, 각막상처 등의 상처, 욕창, 와창, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 상처, 부인과적 상처, 화학적 상처 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진용 약학적 조성물.
7. Ac-PGP 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물.
   

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