KR20170132241A

KR20170132241A - 콜라겐 vi형 서열에 대한 면역검정

Info

Publication number: KR20170132241A
Application number: KR1020177030813A
Authority: KR
Inventors: 안데르스 네더가드; 제니 마리 샌드; 슈 선; 다이아나 줄리 리밍; 김 헨릭센
Original assignee: 노르딕 바이오사이언스 에이/에스
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2017-12-01
Also published as: CN107406501B; JP2018511601A; EP3277714A1; JP2023109755A; JP6914196B2; US20180088129A1; WO2016156526A1; JP2021176869A; GB201505654D0; KR102532943B1; CN107406501A

Abstract

본 발명은 콜라겐 6형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프와 반응성인 면역학적 결합 파트너, 및 C-말단 에피토프를 검출하고 정량하기 위해 면역학적 결합 파트너를 이용하는 면역검정 방법을 제공한다. 본 발명은 세포외 기질의 형성 속도의 조사 방법 및 인슐린 감수제를 이용한 치료에 적합한 대상체의 확인 방법을 또한 제공한다.

Description

콜라겐 VI형 서열에 대한 면역검정

본 발명은 콜라겐 VI형 α3 사슬의 C-말단에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체 및 상기 에피토프를 검출하는 면역검정에 관한 것이다.

근육량 및 기능은 나이, 다양한 병리, 및 비활동과 함께, 그리고 빈번하게는 이들 3가지의 조합으로 인해 소실된다. 개인은 50세 연령부터 매년 1~2% 골격근을 소실하며(Hughes), 부동 시 매주 2~3%의 근육량이 소실되고(Hortobagyi et al. 2000), 악액질을 갖는 경우 더 빠르게 소실된다고 보고된다. 노령 또는 입원 개인에서 손상된 근육 기능은 (공동)이환률 및 사망률과 연관된다(Cruz-Jentoft). 산업화된 사회에서의 집단 연령은 점점 더 증가하고 있으며, 이에 따라 기능적 독립성의 유지가 점점 더 중요해지고 있다. 근육 손실의 진단 및 관리 방법은 여전히 조영 검사, 예로 자기 공명 조영(MRI), 컴퓨터화 단층촬영(CT) 및 이중-에너지 X-선 흡수측정(DXA)에 의존한다(Cruz-Jentoft). 그러나, 이러한 검사는 일상적 임상 진료에서 이용되기에는 고가이거나 불편하다. 소변 및 혈청학적 바이오마커, 예컨대 크레아티닌 및 3-메틸히스티딘도 근육 손실의 관리를 보조하기 위해 이용된다. 그러나 이러한 검정의 높은 가변성 및 불량한 타당성은 이의 이용을 제한한다(Nedergaard 2013). 요약하면, 근육 기능의 진단 및 예진뿐만 아니라 항-이화대사 치료 결과의 모니터링에서 이용될 수 있는 바이오마커에 대한 시급한 필요성이 존재한다(Sharf).

근육량의 손실은 근육 세포외 단백질의 균형잡히지 못한 턴오버에 의해 유도된다(Rennie 2010 및 Welle 2002). 단백질, 특히 세포외 단백질이 턴오버함에 따라, 단백분해 단편이 순환 내로 탈출할 수 있게 되어, 단백질 대사에서의 정량적 또는 정성적 변화가 근육량 또는 기능의 모니터링에서 이용될 수 있는 바이오마커 프로필을 생성할 수 있다(Nedergaard 2013).

콜라겐은 골격근의 중요한 세포외 단백질로, 근육의 수동 긴장에 기여할 수 있다(Granzier).

III형 콜라겐은 뼈를 제외한 대부분의 I형 콜라겐 함유 조직에서 발현되며, 연결 조직, 근육 조직 및 피부 등의 중요 성분이다(Gelse). PIIINP는 콜라겐 III형의 N-말단 프로펩타이드이며, 이는 성숙 III형 콜라겐 합성 동안 제거된다(Niemela). 이는 호르몬 치료의 동화 반응에 관련된 것으로 보고되었다(Bhasin 2009 및 Chen 2011). 최근에, III형 콜라겐의 실제 합성을 평가할 수 있는, N-말단 프로콜라겐의 N-프로테아제 절단 부위를 표적화하는 모노클로날 항체를 적용함으로써 새로운 ELISA 키트가 개발되었다(Nielsen 2013).

콜라겐 VI형은 세포의 기저막에서 독립적인 마이크로섬유 네트워크를 형성할 수 있는 고유한 세포외 콜라겐이다. 이는 콜라겐, 바이글리칸 및 프로테오글리칸을 포함하는 다른 기질 단백질과 상호작용할 수 있다(Kuo 1997, Bidanset 1992 및 Stallcup 1990). 근육에서, VI형 콜라겐은 근육속막의 일부이며, 근섬유의 근육내 세포외 기질 내로의 부착에 관여되고, 이에 따라 힘 전파에 관여된다(Bonaldo 1990 및 Keene 1988). 또한, VI형 콜라겐에서의 돌연변이는 Bethlem 근육병증 및 Ullrich 선천성 근이영양증을 유도할 수 있다(Lampe). VI형 콜라겐 α3 사슬의 C-말단은 분비 후 성숙 VI형 마이크로섬유로부터 절단제거될 수 있음이 보고되었다(Aigner 2002 및 Lamande 2006).

그러나, VI형 콜라겐은 근육 및 근육 손실에만 관여되는 것은 아니다.

만성 폐색성 폐 질환(COPD)은 만성 염증, 구조 변화 및 소기도 협소화(세계적 이니셔티브...)로 생성되는 지속적 기류 제한을 특징으로 하는 이종성의, 서서히 진행하는 질환이다. 폐의 세포외 기질(ECM)의 주요 구조 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, 및 프로테오글리칸이다. ECM 리모델링은 건강한 조직 유지보수의 일환이며, 여기서 오래된 단백질은 분해되고 새로운 단백질이 형성된다(Cox). 그러나, 과도한 ECM 리모델링은 COPD에서 구조 변화를 유도하여 폐 기능의 손실을 촉진한다. COPD에서의 중요한 난제는 질환 진행 바이오마커의 확인이다(Vestbo). 폐 구조 단백질의 평가에 의한 ECM 연구는 질환 활성 및 예후의 바이오마커를 제공할 수 있다.

악화는 폐 기능 손실의 가속화(Donaldson 2002)), 삶의 질 감소(Seemungal), 및 사망률 유도(Sofer-Cataluna)에 의해 COPD 진행을 유도하는 증가된 질환 활성 기간이다. 모든 COPD 단계에서 환자는 악화를 경험할 수 있지만, 이들은 보다 빈번하게 증가하는 질환 중증도를 갖게 된다(Hurst). 이의 발생을 예측하는 것은 어려우며, 향후 악화에 대한 최고의 예측인자는 악화 이력이다(Hurst 2010 및 Donaldson 2006). 악화는 COPD 병리에서 중요한 이벤트이지만, 이러한 이벤트 동안 폐 조직에서의 구조 변화에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 기질 메탈로프로티나제 9(MMP-9) 수준은 상승되는 것으로 알려져 있는 반면, 메탈로프로티나제 1의 조직 저해제(TIMP-1) 수준은 안정기 COPD에 비해 악화 시 COPD 환자의 가래에서 감소되어, 파괴적인 환경임을 제시한다.

최근 연구에서는 ECM이 내분비 기관의 특성을 보유하며, 그 구조 단백질은 세포 이동, 분화, 및 혈관신생을 포함하는 원위 부위에서의 세포성 공정을 조정할 수 있는 신호전달 분자를 생성하는 것으로 드러났다. 이들 분자에는 XVIII형 콜라겐에서 유래되는, 강력한 항-혈관신생 펩타이드 엔도스타틴뿐만 아니라, 각각 IV형, VII형, 및 XV형 콜라겐으로부터 방출되는 툼스타틴, 바스타틴, 및 레스틴이 포함된다(Karsdal, 2015).

구성 사슬 α1(VI), α2(VI), 및 α3(VI)으로 이루어진 삼중 나선 분자, 마이크로필라멘트성 간질 VI형 콜라겐은 대부분의 연결 조직에서 그리고 주로 지방 조직에서 발현되며(Park, 2012), 여기서 다른 ECM 단백질과의 그 상호접속을 통해 세포를 부착시킨다(Mak, 2012). 마이크로필라멘트의 형성 동안, 그 삼중-나선 코어는 그 프로-펩타이드로부터 단백분해로 방출된다(Aigner, 2002; Lamande, 2006). 여기서, α3(VI) 사슬의 C-말단 프로-펩타이드의 추가 절단은, 새로 확인된 아디포카인인 엔도트로핀(본원에서 "Pro-C6"으로 불림)을 생성한다. 엔도트로핀은 주로 지방 조직에 의해 생성되며 전환 성장 인자 베타(TGF-β)의 상향조절, 지방 조직 섬유화, 혈관신생, 염증을 유도하며, 동물 모델에서는 인슐린 감수성, 음식 섭취, 에너지 밸런스 및 지방 조직 염증과 같은 몇몇 대사 기능을 바람직하지 못하게 조정하는 것으로 나타났다(Sun, 2014; Dankel, 2014; Park, 2013; Khan, 2009; Pasarica, 2009). 이들 발견은 혈중 엔도트로핀 수준이 대사 기능장애를 갖는 환자, 특히 2형 당뇨병 환자의 분류 및/또는 모니터링을 위해 유용할 수 있음을 제시한다.

티아졸리딘디온(TZD)은 페록시좀 증식인자-활성화 수용체 감마(PPARγ) 작동제이며, 인슐린 감수성을 개선하고, 글루코스 수준을 낮추고, 인슐린에 대한 필요성을 감소시키는 이의 능력으로 인해 2형 당뇨병을 치료하기 위해 널리 이용되어 왔다(Cho, 2008; Charbonnel, 2010). 그러나, TZD, 예컨대 피오글리타존의 이용은 연관된 유해 사례(AE), 예컨대 심부전(Home, 2009), 체중 증가(Takada, 2007), 말초 부종(Karalliedde, 2007), 및 여성에서의 뼈 손실(Soroceanu, 2004)에 의해 실질적으로 제한되었다. PPARγ 작동제의 AE를 최소화하기 위한 시도에서, PPARγ 하류 신호의 하위세트만을 유발하는 PPARγ의 부분 활성화제, 예컨대 발라글리타존이 개발되었다(Berger, 2005; Agrawal, 2012). 이러한 부분적 작동제는 감소된 AE와 함께 우수한 혈당 제어를 달성한다(Larsen, 2008). 치료 반응체를 최적으로 정의하는 혈청 바이오마커는 이러한 글리타존의 유효성 및 안전성을 추가 개선할 수 있다.

본 발명자들은 이제 α3 사슬의 C-말단을 표적화하는 모노클로날 항체 및 ELISA 키트를 개발하였다. 본원에서는 상기 키트 및 이와 함께 측정되는 반응성을 'Pro-C6'으로 나타낸다.

본 발명자들은 Pro-C6의 수준이 근육 턴오버 속도를 반영하며, 또한 단백질 리모델링 단편의 바이오마커에 의해 체계적으로 평가되는 ECM 리모델링이 질환 활성이 높은 COPD의 악화 동안 가속화됨을 확립하였다.

또한 엔도트로핀(즉 "Pro-C6")의 상승된 혈청 수준은 2개의 인슐린 감수제(발라글리타존 및 피오글리타존)에 대한 반응을 예측하고 부작용을 낮추어, PPARγ 작동제 치료로부터 이익을 얻는 II형 당뇨병 환자를 확인시켜 줌을 확립하였다.

본 발명은 이제 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프와 반응성인 면역학적 결합 파트너를 제공한다.

바람직하게는 상기 면역학적 결합 파트너는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함되는 상기 C-말단 에피토프에 특이적으로 결합한다.

상기 면역학적 결합 파트너는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체이다. 면역학적 결합 파트너는 아래에서 추가 설명되는 바와 같은 결합 특이성을 갖는 항체 단편일 수 있다.

바람직하게는, 상기 면역학적 결합 파트너는 ...KPGVISVMGTA-COOH인 상기 C-말단 아미노산의 연장된 버전을 인식하거나 이에 결합하지 않는다.

바람직하게는, 상기 면역학적 결합 파트너는 ...KPGVISVMG-COOH인 상기 C-말단 아미노산 서열의 절단된 버전을 인식하거나 이에 결합하지 않는다(또는 또한 이를 인식하거나 이에 결합하지 않는다).

더욱 바람직하게는, 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 대한 상기 항체의 친화도 대 연장된 아미노산 서열 ...KPGVISVMGTA-COOH에 대한, 및 또는 절단된 아미노산 서열 ...KPGVISVMG-COOH에 대한 상기 항체의 친화도의 비는 10 대 1 초과이다.

보다 바람직하게는, 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도 대 상기 연장된 아미노산 서열에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도의 비는 바람직하게는 10 대 1 초과, 바람직하게는 50 대 1 초과, 바람직하게는 100 대 1 초과, 바람직하게는 500 대 1 초과, 바람직하게는 1000 대 1 초과, 및 가장 바람직하게는 10,000 대 1 초과이다.

또한 바람직하게는, 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도 대 상기 절단된 아미노산 서열에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도의 비는 10 대 1 초과, 바람직하게는 50 대 1 초과, 바람직하게는 100 대 1 초과, 바람직하게는 500 대 1 초과, 바람직하게는 1000 대 1 초과, 및 가장 바람직하게는 10,000 대 1 초과이다.

본 발명에는 샘플 중 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프를 검출하기 위한 면역검정 방법이 포함되며, 여기서 상기 방법은 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프를 포함하는 샘플을 상술된 바와 같은 면역학적 결합 파트너와 접촉시키는 단계, 및 상기 면역학적 결합 파트너의 결합량을 결정하는 단계를 포함한다.

바람직하게는 상기 C-말단 에피토프는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함된다.

상기 방법은 생물유체 중에서 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 양을 정량하기 위해 이용될 수 있다.

상기 생물유체는 예를 들어 혈청, 혈장, 소변 또는 양수일 수 있다.

상기 면역검정은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정, 예컨대 방사면역검정 또는 효소-연관 면역흡착 검정(ELISA)일 수 있다.

이러한 방법은 상기 방법에 의해 결정된 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 양을 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 표준 정상값과 연관시켜 정상 수준으로부터의 이의 변화를 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에는 상술된 바와 같은 방법에 의해 검정을 수행하여 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함된 에피토프를 포함하는 콜라겐 VI형 α3 단편의 생물유체 샘플 중 수준 측정을 수득하는 단계를 포함하는, 세포외 기질의 형성 속도를 조사하는 방법이 포함된다.

이러한 방법은 콜라겐 VI형 α3 단편의 상기 측정 수준을 콜라겐 VI형 분해의 바이오마커의 동일한 샘플 중 측정 수준과 비교하는 지수를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분해의 바이오마커는 MMP 분해된 콜라겐 VI형의 단편일 수 있다. 이러한 검정은 문헌[Veidal 2011 및 WO2010/115749]에 기재된 바와 같은 N-말단 서열 YRGPEGPQGP...에 대한 항체 반응성에 기반할 수 있다.

본 발명자들은 이제 침대 휴식 형태의 장기 언로딩 및 후속 리로딩에 반응하는 혈청학적 콜라겐 펩타이드 바이오마커의 조정을 조사하였으며, COPD 악화 이벤트에서 이들 바이오마커를 유사하게 연구하였다.

침대 휴식 조사에서, 대상체는 8주 동안 진동 장치 대책을 포함하거나 포함하지 않고 침대 휴식을 통해 부동화된 후 습관성 신체 활동을 통해 재가동화되었다. 2개 군 모두 부동화 동안 근육량 및 강도를 소실하였고, 휴식군에 비해 대조군에서 약간 더 소실이 컸다. 2개 군 모두 재가동화 동안 근육량 및 강도를 재획득하였다.

부동화 동안, 콜라겐 III형 프로-펩타이드(PRO-C3)의 바이오마커 및 본 발명의 콜라겐 VI형 바이오마커(PRO-C6) 다소 유사한 시간적 패턴을 나타낸다. 본 발명의 패턴은 부동화 개시 후 초기에 약간 감소하지만, PRO-C3 및 PRO-C6은 모두 결과적으로 부동화와 함께 경시적으로 증가한다. 재가동화의 개시 시, 다시 약간의 초기 감소에 이어 RVE군에서보다 CTRL에서 더 큰 PRO-C6 부분 상에서의 증가, 이어서 두 바이오마커에서 모두 기준선으로의 회복이 관찰될 수 있다.

C6M 바이오마커는 본질적으로 침대 휴식 언로딩에 비반응성이지만, 리로딩에 반응하여 짧게 스파이크를 나타내며, 군 간 유의차는 없다.

따라서 PRO-C6은 신체 활동에서의 변화 및 LBM(마른 체중)과 연관된 리모델링의 바이오마커인 것으로 볼 수 있다. 기준선에서 낮은 PRO-C6은 획득 및 손실 모두에 있어서, LBM에의 변화에 더 취약한 표현형과 연관된다. 따라서, 비자발적 부동화를 거치는, 예로 입원으로부터의 개인 중에서 근육 손실의 위험이 증가되고 이에 따라 LBM 소실에 대처하기 위한 치료 결정의 자격이 되는 개체를 확인하기 위해 상기 서열에 대한 검정을 이용할 수 있다.

또한, 검정은 연결 조직 리모델링, 특히 근육 턴오버의 속도를 모니터링하고, 그 속도를 조정하기 위한 후보 치료의 효과에 대한 정보를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

상기 바이오마커는 COPD 악화 이벤트의 진단을 보조하기 위해, 또는 이들 상태의 보다 신속한 저하를 겪기 쉬운 환자에 대한 예후를 제공하기 위해 이용될 수 있고, 이는 보다 관련된 환자들을 임상 시험에 고려하도록 할 수 있다.

상기 바이오마커는 또한 인슐린 감수제, 예컨대 화합물 티아졸리딘디온 클래스(예로, 발라글리타존 또는 피오글리타존)에 대한 반응을 예측하기 위해 이용될 수 있다. 이는 인슐린 감수제에 최적으로 반응할 환자의 확인 및 모니터링을 허용하며, 이는 2형 당뇨병 및/또는 비-알코올성 지방간염(NASH)의 치료에서 PPARγ 작동제의 유익 대 위험비를 개선한다. 이에 관해, 본 발명은 또한 인슐린 감수제를 이용한 치료에 적합한 대상체의 확인 방법을 제공하며, 이 방법은

i) 본 발명의 Pro-C6 검정 방법을 이용하여 대상체로부터 수득되는 생물유체 중 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프의 양을 정량하는 단계; 및

ii) 단계 i)에 의해 결정된 상승된 값을 인슐린 감수제를 이용한 치료에 적합한 대상체와 연관시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가 양태는 본 발명의 면역학적 결합 파트너 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 샘플 중 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프, 바람직하게는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함된 것의 양을 결정하기 위한 검정 키트를 제공한다:

- 스트렙타비딘 코팅된 96웰 플레이트

- 바이오틴화 펩타이드 바이오틴-L-KPGVISVMGT-COOH일 수 있는, 상기 항체와 반응성인 펩타이드(여기서 L은 선택적 링커임)

- 샌드위치 면역검정에서 이용하기 위한 선택적으로 바이오틴화 이차 항체

- C-말단 서열 ...KPGVISVMGT-COOH를 포함하는 교정인자 펩타이드

- 항체 HRP 표지 키트

- 항체 방사표지 키트

- 검정 가시화 키트

본원에서 이용되는 용어 '면역학적 결합 파트너'에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 또한 항체의 특이적 결합 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2가 포함된다. 따라서, 상기 면역학적 결합 파트너는 모노클로날 항체 또는 특이적 결합 친화도를 갖는 모노클로날 항체의 단편일 수 있다.

도 1은 표준 펩타이드, 연장된 펩타이드 및 절단된 펩타이드의 연속 2-배 희석에 의해 생성된 OD 신호로서의 모노클로날 항체 10A3의 펩타이드 특이성 평가 결과를 나타낸다. STD 펩타이드 = KPGVISVMGT, 연장된 펩타이드 = KPGVISVMGTA 및 절단된 펩타이드 = KPGVISVMG. ELISA의 성질로 인해, 더 낮은 OD는 더 강한 반응성에 해당한다.
도 2는 모노클로날 항체 10A3과 인간 혈청 및 양수의 반응성 평가 결과를 나타낸다. 패널 A는 경쟁적 ELISA에서 측정되는 OD로서의 항체 결합이 인간 혈청 및 인간 양수에 의해 부분적으로 저해되었음을 나타낸다. 패널 B는 인간 혈청(레인 1, 2) 및 양수(레인 3, 4)에서 특이적 밴드를 나타내는 웨스턴 블롯을 나타내며, 밴드는 표준 펩타이드의 존재 하에 차단될 수 있다(레인 6~9).
도 3은 3가지 상이한 종류의 혈장 대 혈청에서 측정된 Pro-C6 수준의 선형 회귀 분석 결과를 나타내며, 혈청 수준 및 각 종류의 혈장 간 강한 연관성(P<0.0001)을 나타낸다.
도 4는 침대 휴식 및 재가동화(BBR) 연구에서의 경시적인 PRO-C3, PRO-C6 및 C6M 수준을 3개의 아래로 진행되는 패널에 나타낸다.
도 5는 실시예 3에서 측정된 바이오마커 수준을 아래로 진행되는 패널 A, B 및 C에 나타낸다.
도 6은 콜라겐 III형, 콜라겐 IV형 및 콜라겐 VI형의 분해/형성 마커 비의 실시예 3에서 측정된 수준을 패널 A, B 및 C에 나타낸다.
도 7은 공복 혈청 글루코스 및 혈액 HbA1c에 대한 효과를 나타낸다. 기준선 혈청 Pro-C6에 따른 하위군(삼분위)에서 공복 혈청 글루코스(왼쪽 패널) 및 혈액 HbA1c(오른쪽 패널)에서의 기준선으로부터 치료 말기(26주)까지의 경시적인 절대 변화.
도 8은 기준선 Pro-C6 대비 26주 치료 기간 동안 공복 혈청 글루코스(왼쪽 패널) 및 혈액 HbA1c(오른쪽 패널)에서의 평균 절대 변화를 나타낸다. 26주 치료 기간 이전(X/') 및 종료시('/X) 위약 대비 치료 유의성의 Dunnett-조정 수준. na: 이용할 수 없음; ns: 유의미하지 않음; *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001.
도 9는 상위 2개의 엔도트로핀 삼분위(>7.7 ng/mL) 대 하위 삼분위(≤7.7 ng/mL)에서 26주차에 반응체에 대한 승산비를 나타낸다. HBA1c에서 1%(3.83, 95% CI(1.62;9.04), p<0.002), 또는 0.5%(3.85, 95% CI(1.94;7.61), p<0.0001)의 임상적으로 유의미한 변화에 대한 승산비.
도 10은 26-주 치료 기간 동안 HOMA-IR에서의 평균 절대 변화를 나타낸다. 26주 치료 기간 이전(X/') 및 종료시('/X) 위약 대비 치료 유의성의 Dunnett-조정 수준. na: 이용할 수 없음; ns: 유의미하지 않음; *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001.
도 11, 왼쪽 패널: 혈청 Pro-C6 수준에 대한 치료 효과. 혈청 Pro-C6이 기준선 Pro-C6의 삼분위에 따라 치료 종료(26주)까지 기준선 대비 변화 백분율로 표시된다. 도면은 최소 자승 추산치(±표준 오차)를 나타낸다.
도 11, 오른쪽 패널: 26주 치료 기간 이전(X/') 및 종료시('/X) 위약 대비 치료 유의성의 Dunnett-조정 수준을 이용한 기준선 대비 Pro-C6에서의 평균 변화. na: 이용할 수 없음; ns: 유의미하지 않음; *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001.
도 12는 26-주 치료 기간 동안 하지 부피에서의 평균 절대 변화를 나타낸다. 26주 치료 기간 이전(X/') 및 종료시('/X) 위약 대비 치료 유의성의 Dunnett-조정 수준. na: 이용할 수 없음; ns: 유의미하지 않음; *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001.

실시예 1: Pro-C6에 대한 항체 개발

면역원성 펩타이드로서 VI형 콜라겐 α3 사슬(^3168'KPGVISVMGT^'3177)의 마지막 10개 아미노산을 이용하여 특이적 에피토프 모노클로날 항체를 생성하였다. 모노클로날 항체 개발을 위해 이용된 방법은 전술된 바와 같았다(Barascuk). 간략하게, 4~6-주령 Balb/C 마우스를 60 ㎍의 면역원성 펩타이드를 포함하는 200 ㎕의 유화된 항원으로 피하 면역화하였다. 안정한 혈청 역가 수준에 도달할 때까지, 프로인트 불완전 아주반트에서 2주 간격으로 연속 면역화를 수행하고, 마우스를 2차 면역화부터 채혈하였다. 각각의 채혈 시, 혈청 역가를 검출하고, 가장 높은 항혈청 역가 및 가장 우수한 원상태 반응성을 갖는 마우스를 융합을 위해 선택하였다. 선택된 마우스를 1개월 휴식시킨 후 세포 융합을 위한 비장 단리 3일 전에 100 ㎕ 0.9% 나트륨 클로라이드 용액 중 50 ㎍의 면역원성 펩타이드로 정맥내 추가접종하였다.

융합 절차는 다른 곳에 기재되어 있다(Gefter). 간략하게, 마우스 비장 세포를 SP2/0 골수종 융합 파트너 세포와 융합시켰다. 융합 세포를 96-웰 플레이트에서 키우고 CO2-인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 여기서 표준 제한 희석을 이용하여 모노클로날 성장을 촉진하였다. 선택 펩타이드에 특이적이고 연장된 펩타이드(KPGVISVMGTA, Chinese Peptide Company, China)나 절단된 펩타이드(KPGVISVMG, American Peptide Company, USA)에 대한 교차 반응성이 없는 세포주를 선택하여 서브클로닝하였다. 마지막으로 항체를 IgG 컬럼을 이용해서 정제하였다.

Pro-C6 검정 프로토콜:

검정 개발을 위해 이용된 ELISA-플레이트는 Roche의 스트렙타비딘-코팅 플레이트(cat.: 11940279)였다. 모든 ELISA 플레이트를 Molecular Devices, SpectraMax M, (CA, USA)로부터의 ELISA 판독장치로 분석하였다. 제조업체(Innovabioscience, Babraham, Cambridge, UK)의 지침에 따라 Lightning link HRP 표지화 키트를 이용해서 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)로 선택된 모노클로날 항체를 표지하였다. 96-웰 스트렙타비딘 플레이트를 코팅 완충액(40 mM Na₂HPO₄, 7 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% Tween 20, 1% BSA, pH 7.4) 중 용해된 바이오틴화 합성 펩타이드 바이오틴-KPGVISVMGT(Chinese Peptide Company, China)로 코팅하고 20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 완충액(40 mM Na₂HPO₄, 7 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.1% Tween 20, 1% BSA, 5% Liquid II, pH 7.4) 중에 희석된 20 ㎕의 표준 펩타이드 또는 샘플을 적절한 웰에 첨가한 후 100 ㎕의 HRP 접합 모노클로날 항체 10A3을 첨가하고, 4℃에서 21시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 100 ㎕ 테트라메틸벤지니딘(TMB)(Kem-En-Tec cat.438OH)을 첨가하고, 플레이트를 암소에서 20℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 모든 상기 인큐베이션 단계에는 300 rpm에서의 진탕이 포함되었다. 각각의 인큐베이션 단계 후, 플레이트를 세척 완충액(20 mM Tris, 50 mM NaCl) 중 5회 세척하였다. 100 ㎕의 정지 용액(1% H₂SO₄)을 첨가하여 TMB 반응을 정지시키고 650 nm를 참조로 하여 450 nm에서 측정하였다.

Pro-C6 기술적 평가:

검출 하한(LLOD)을 21개 0점 샘플(즉 완충액)로부터 결정하고 평균 + 3x 표준 편차로 계산하였다. 검정 내 가변성 및 검정 간 가변성을 8개 QC 샘플의 12회 독립 수행에 의해 결정하였고, 각각의 수행은 샘플의 이중 결정으로 구성되었다. 4개 혈청 샘플 및 4개 헤파린 혈장 샘플에서 희석 회수를 결정하였고 100% 샘플로부터 희석 샘플의 회수 백분율로 계산하였다.

실시예 2: 근육 손실 연구에서의 PRO-C6

베를린 침대 휴식 연구에서 Pro-C3, C6M 검정의 측정:

α3 사슬의 C-말단 수준은 새로 형성된 성숙 VI형 콜라겐의 수준을 반영하는 것으로 예상된다. VI형 콜라겐의 합성을 조사하기 위해, α3 사슬의 C-말단을 표적화하는 상술된 Pro-C6 ELISA 키트를 개발하였다. 또한, VI형 콜라겐은 또한 MMP의 기질이다(Veidal 2011). 이전 연구에서는 MMP-2 및 MMP-9가 모두 근육 위축에 관련됨을 나타내었다(Reznick 2003 및 Giannelli 2005). 따라서, MMP-2 및 MMP-9에 의해 생성된 VI형 콜라겐 분해 단편은 이러한 공정에서 관심의 대상이다.

상기 연구에서, 베를린 침대 휴식 연구 - 근육 위축 및 비대의 인간 모델로서 침대 휴식 부동화 및 재가동화를 이용함 - 에서 III형 및 VI형 콜라겐의 턴오버를 직접 측정하는, 3가지 바이오마커 Pro-C6(C-말단 α3(VI) 사슬을 측정함) 및 C6M(MMP-2 및 MMP-9에 의해 분해되는 VI형 콜라겐 단편을 측정함)(Veidal 2011), 및 Pro-C3(III형 콜라겐의 실제 합성을 측정함)(Nielsen)을 측정하였다.

베를린 침대 휴식 연구는 다른 곳에 기재되었다(Rittweger 2006 및 Belavy 2009). 간략하게, 20명의 건강한 젊은 남성을 모집하여 엄격한 8-주 침대 휴식 연구를 거쳤다. 이어서 20명의 젊은 남성을 2개 군으로 무작위 구분하였다. 저항 진동 운동(RVE)군은 주 당 11회 저항 진동 운동을 할당받았다. 침대 말단부에서 진동 운동 장치에 의해 및 허리 및 어깨 스트랩 및 플레이트를 향해 대상체를 스스로 당기기 위해, 이들을 위한 핸들을 갖는 진동판을 향해 대상체를 당겨서 저항 진동 운동을 수행하였다. 대조군(CTRL)은 8-주 침대 휴식 동안 어떠한 운동도 수행하도록 두지 않았다. 혈청 샘플을 연구 2일 전(BDC-2), 침대 휴식기(BR+) 및 후속 회복기(R+)에 수득하였다. 추가 측정 전까지 혈청 샘플을 -80℃에 보관하였다. 2개 군 모두의 근육량을 3 기간 동안 MRI 및 DXA에 의해 평가하였다.

Pro-C3 및 C6M 검정 프로토콜은 다른 곳에 기재되었다(Nielsen 2013 및 Kuo 1997). Pro-C3 검정은 콜라겐 III형의 프로-펩타이드 단편 수준을 측정한다. C6M 검정은 성숙 콜라겐 VI형의 MMP 분해 단편을 측정한다. 간략하게, Pro-C3 검정에서, 96-웰 스트렙타비딘 플레이트를 바이오틴화 합성 펩타이드로 코팅하고 20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 20 ㎕의 표준 펩타이드 또는 1:2 희석 혈청 샘플을 적절한 웰로 첨가한 뒤 100 ㎕의 HRP 접합 모노클로날 항체 NB61N-62를 첨가하고, 4℃에서 20시간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 100 ㎕ TMB를 첨가하고 플레이트를 암소에서 20℃에서 15분 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 정지 용액(1% H₂SO₄)을 첨가하여 TMB 반응을 정지시키고 650 nm를 참조로 하여 450 nm에서 측정하였다. C6M 검정에서, 바이오틴화 합성 펩타이드를 96-웰 스트렙타비딘 플레이트로 코팅한다. 20 ㎕의 표준 펩타이드 또는 1:2 희석 혈청 샘플을 첨가한 뒤 100 ㎕의 HRP 접합 모노클로날 항체를 첨가하고, 20℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 TMB에 의한 발색 후 판독하였다.

결과:

선택된 항체 10A3은 C-말단 COL6A3 3168'KPGVISVMGT'3177의 마지막 10개 아미노산을 특이적으로 인식하였으나, 연장된 펩타이드 KPGVISVMGTA 또는 절단된 펩타이드 KPGVISVMG는 인식하지 않았다(도 1). 선택된 항체의 원상태 반응성을 인간 혈청 풀 및 인간 양수 풀을 이용하여 평가하였다. 경쟁적 ELISA에서, 신호는 혈청 및 양수 모두에 의해 부분 저해되었다(도 2, 패널 A). 결과는 웨스턴 블롯에 의해 항체가 약 10 kD 밴드를 인식한 반면, 신호가 표준 펩타이드의 존재 하에 완전 차단됨을 확인시켜 주었다(도 2, 패널 B).

Pro-C6 경쟁적 ELISA의 측정 범위를 LLOD 및 ULOD에 의해 결정하여, 0.15 ng/ml 내지 58.39 ng/ml 범위를 제공하였다. 검정-간 및 검정-내 변동성은 각각 15.2% 및 4.8%이다. 인간 혈청 및 헤파린 혈장 중 희석 회수는 둘 다 100±20% 내였다(표 1). 인간 혈청 및 각각의 헤파린 혈장, 시트레이트 혈장 및 EDTA 혈장 중 연관성이 비교적 높아서(도 3, p<0.0001), 상이한 혈액 제조 방법에도 불구하고 Pro-C6 수준이 일정함을 나타내었다.

희석 회수를 표시하는 표.

혈청 샘플	희석 회수	헤파린 혈장 샘플	희석 회수
미희석	100	미희석	100
희석 1:2	91	희석 1:2	105
희석 1:4	91	희석 1:4	100
희석 1:8	80	희석 1:8	109

샘플을 연속 2-배 희석 단계로 희석하고, 농도를 이러한 연속 희석에서 측정하였다. 측정 농도를 희석 인자로 곱해서 희석 회수를 수득하고 미희석(출발) 샘플의 농도 백분율로 표시하였다. 표는 8-배 희석 범위 및 이내에서 신호가 선형 희석되고 +/- 20% 이내로 유지됨을 나타낸다.

베를린 침대 휴식 연구에서의 바이오마커 프로필:

베를린 침대 휴식 연구(BBR)에서 측정된 상기 나타낸 3개의 바이오마커의 수준을 도 4에 나타낸다. "BR" 시점은 침대 휴식 부동화 시점을 표시하며 "R" 시점은 재가동화 시점을 표시한다. 번호 접미사는 침대 휴식 또는 재가동화 기간으로의 일수를 표시한다. "a"는 기준선으로부터의 유의차를 표시하고 "b"는 부동화 기간의 마지막 시점으로부터의 유의차를 표시한다. 데이터는 평균 +/- SEM으로 표시한다.

도 4에 나타낸 바와 같이, PRO-C3은 부동화 시 대략 20%의 초기 감소(BR3부터 BR12에 걸쳐 기준선으로부터 유의미하게 상이함, 모든 시점에 있어서 p<0.004)에 이어 부동화 종료 시 증가(BR40은 기준선으로부터 유의미하게 상이함, p=0.05) 형태인 유의미한 시간 효과를 나타내었다. 흥미롭게도, 재가동화 개시 시, 초기 감소에 이어 증가를 갖는 유사한 패턴을 관찰할 수 있었다(시점 R3부터 R28에 걸쳐 기준선보다 유의미하게 더 높음, 모든 시점에 있어서 p<0.03, 및 R3은 마지막 부동화 시점, BR56에서보다 유의미하게 더 높음, p=0.02). 마지막 두 시점에, 부동화 개시 13주 후, 바이오마커 수준이 기준선으로 복귀하였다. 유의미한 군 간 차이나 유의미한 시간*치료 상호반응 효과는 존재하지 않았다.

PRO-C3의 개별 바이오마커 수준을 LBM 및 여기에서의 변화와 비교했을 때, PRO-C3의 개별 수준이 기준선에서의 LBM과 유의미하게 연관됨을 확인하였다(R²=0.2869, R=0.536, p=0.0149). 또한, BR47에서 그 피크에서의 바이오마커 수준이 부동화 동안 LBM 손실량과 유의미하게 연관됨을 확인하였다(R²=0.2056, R=0.453, p=0.0447).

PRO-C6 바이오마커는 대략 1주의 부동화 후 증가 형태로 부동화 과정 동안 경시적으로 변화하였고(유의미한 시간 효과, p<0.0001), 마지막 2주의 부동화 동안 기준선보다 대략 30% 더 높은 피크에 도달하였다(BR19에서부터 R28까지 기준선보다 유의미하게 더 높음, BR47에서 피크 형성, p=0.0002). 부동화 기간 동안 군-간 차이는 존재하지 않았다(유의미한 치료 효과 또는 치료*시간 상호작용 없음).

재-가동화 동안, 시간 및 시간*치료 상호작용 효과가 모두 발현되었다. 이는 재가동화로의 1주차에 피크를 형성하는 증가(마지막 부동화일, BR56, 대비 20% 증가 p=0.011)에 이어 기준선 값으로의 점진적 회복 형태였다. R7 시점에서의 높은 가변성으로 인해, 임의의 포스트 혹(post hoc) 평가에서 상호작용 효과는 발현되지 않았다.

PRO-C6의 개별 바이오마커 수준을 LBM 및 여기에서의 변화와 비교했을 때, PRO-C6의 수준이 LBM과 전혀 관련되지 않았으나, 부동화 동안 LBM에서의 변화와 양으로 관련됨을 확인하여(R²=0.2794, R=0.529, p=0.0166) 더 높은 PRO-C6 수준이 더 적은 LBM 손실과 연합됨을 의미하였다. 또한, PRO-C6이 재가동화 동안 (재)획득된 LBM양과 음으로 관련됨을 확인하여(R²=0.3365, R=0.580, p=0.0073), 더 높은 수준이 재가동화 동안 더 적은 LBM (재)획득과 연합됨을 의미하였다.

C6M 바이오마커는 본질적으로 부동화에 의해 영향받지 않았으나(부동화 시기 동안 시간 효과 없음), 재가동화 시작 시 짧게 30~40% 증가하였다(부동화 기간 동안 p<0.0001에서 유의미한 시간 효과). 부동화 동안 치료 효과가 없었으며 C6M 신호에서의 증가가 RVE군에서보다 CTRL군에서 더 큰 것처럼 보일 수 있지만, 이는 유의성에 도달하지 않았다(시간*치료 상호작용이 유의성에 도달하지 않았고 이에 따라 포스트 혹 평가를 수행하지 않았음). 군 간 차이는 존재하지 않았다.

PRO-C6의 개별 바이오마커 수준을 LBM 및 여기에서의 변화와 비교했을 때, PRO-C6의 수준이 LBM과 전혀 관련되지 않았으나, 부동화 동안 근육 손실과 양으로 관련되었고(R²=0.2794, R=0.529, p=0.0166) 재가동화 동안 (재)획득된 근육량과 음으로 관련됨을 확인하였다(R²=0.3365, R=0.580, p=0.0073).

바이오마커 대 인체계측 변수에 대한 연관성 매트릭스. BioM(바이오마커), 마른 체중(LBM), 다리 근육 부피(LMV, MRI 유래), 손실은 부동화 동안 절대 LBM 변화이다, 즉 음의 값이 클수록 손실이 크다; 획득은 재가동화 동안 총 LBM 재획득이다.

	PRO-C3		PRO-C6		C6M
	R	p	R	p	R	p
BioM_기준선 대 LBM_기준선	0.536	0.0149*	0.022	0.9270	0.595	0.0057*
BioM_BR47 대 다리 LBM_손실	0.453	0.0447*	0.529	0.0166*	0.102	0.6684
BioM_R3 대 다리 LBM_획득	-0.171	0.4705	-0.580	0.0073*	-0.269	0.2509

PRO-C6은 신체 활동에서의 변화 및 LBM에서의 변화와 연관된 리모델링의 바이오마커인 것으로 나타난다. 기준선에서의 낮은 PRO-C6은 획득 및 손실 모두에서, LBM에서의 변화에 더 취약한 표현형과 연관된다.

실시예 3: COPD에서의 PRO-C6

연구 설계:

2011년 및 2012년 동안 의료 상담자에 의해 COPD 악화로 간주되어 입원된 환자를 입원 24시간 내에 모집하였다. 혈액 샘플을 악화 시 및 회복 시 수집하고: 입원 후 30(IQR 28~34)일 중간값으로 4주 추적 방문을 수행하였다. 추적 방문 시, 환자는 표준 기관지확장제-이후 폐활량측정을 거쳤으며, 6분 보행 거리(6MWD)를 수행하였다. 환자-보고 측정에는 추적 방문 시 MRC(Medical Research Council) 호흡곤란 척도를 이용한 호흡곤란 평가, 및 흡연 이력이 포함되었다.

포함 기준은 상담의에 의해 작성된 입원 시 급성 COPD 악화의 임상 진단이었다. 폐렴의 의사 진단 또는 방사선학적 증거는 제외 기준이었다. 연구는 페어링된 샘플을 포함하고 추적 방문 시 기류 폐색(1초에 강제 날숨 부피(FEV1) 대 강제 폐활량(FVC)의 비 <0.7)이 확인된 69명 환자로 이루어졌다.

ECM 리모델링 바이오마커:

혈청 및 헤파린 혈장 샘플을 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. C3M, C4M, Pro-C3, P4NP 7S, ELM7, 및 EL-NE는 혈청 중에 측정한 반면, C6M, Pro-C6, 및 VCANM은 헤파린 혈장 중에 측정하였다. 세포외 기질 리모델링을 평가하기 위해 본 연구에서 이용된 검정의 개요를 표 4에 나타낸다.

검정	표적	검출 범위(ng/ml)	검정-내 및 검정-간 가변성(%)	참조 수준(ng/ml), 평균(SD)	참고문헌
C3M	MMP에 의해 분해된 콜라겐 III형	5.52 ~ 177	3.4 및 9.8	15.3(3.8)	[28]
C4M	MMP에 의해 분해된 콜라겐 IV형	22.8 ~ 748	4.2 및 18.5	55.4(17.8)	[29]
C6M	MMP에 의해 분해된 콜라겐 VI형	4.88 ~ 420	8.0 및 11.0	8.85(5.1)	[30]
ELM7	MMP-7에 의해 분해된 엘라스틴	1.16 ~ 36.6	8.1 및 9.1	2.23(0.74)	예비 데이터
EL-NE	호중구 엘라스타제에 의해 분해된 엘라스틴	1.76 ~ 167	8.6 및 12.9	4.09(2.24)	예비 데이터
VCANM	MMP에 의해 분해된 베르시칸	0.78 ~ 7.13	3.0 및 7.6	1.20(0.23)	[31]
Pro-C3	콜라겐 III형 프로펩타이드(N-말단)	5.32 ~ 96.4	6.5 및 12.4	12.3(4.4)	[32]
P4NP 7S	콜라겐 IV형 7S 도메인(내부)	32.9 ~ 3460	9.4 및 14.2	263(91.3)	[33]
Pro-C6	콜라겐 VI형 프로펩타이드(C-말단)	2.81 ~ 117	4.8 및 15.2	4.37(0.69)	예비 데이터

참조 수준은 제조업체(Nordic Bioscience)에 의해 제공되었으며, 관련 기질 중 건강한 집단의 바이오마커 수준, 즉 혈청(C3M, C4M, Pro-C3, P4NP 7S, ELM7, EL-NE) 또는 헤파린 혈장(C6M, Pro-C6, VCANM)을 나타낸다. SD, 표준 편차; MMP, 기질 메탈로프로티나제.

환자 인구통계 및 임상 특징을 표 5에 요약한다. 환자는 대부분 남성(71%) 및 과거-흡연자(55%)였다. 이들은 3[2~6]일의 중앙값[IQR] 동안 입원하였고, 추적 방문은 입원 30[28~34]일 후에 수행하였다.

악화 개시 4주 후 추적 방문 시 COPD 집단의 기본 특징.

변수	환자(n=69)
연령(세), 중앙값(IQR)	67(61 ~ 75)
여성 성별, n(%)	20(29)
BMI(kg/m²)	25.7(6.3)
현재 흡연자, n(%)	31(45)
흡연 팩 년수(년)	52(26)
입원 길이(일), 중앙값(IQR)	3(2 ~ 6)
FEV₁(리터)	1.19(0.50)
FEV₁(예측%)	45.8(16.1)
FVC(리터)	2.55(0.81)
FVC(예측%)	77.5(19.0)
FEV₁/FVC비	0.46(0.11)
6MWD(미터)	166(119)
MRC 호흡곤란 스코어, 중앙값(IQR)	4(3 ~ 4)

변수는 달리 언급되지 않는 한 평균(표준 편차)으로 기재한다. IQR, 사분위간 범위; BMI, 체질량 지수; FEV₁, 1초에서의 강제 날숨 부피; FVC, 강제 폐활량; 6MWD, 6 분 보행 거리; MRC, Medical Research Council.

악화 시 및 30일 추적 시의 임상적으로 안정한 질환 기간에 방출된 단백질 단편의 순환 수준을 표 6에 제시한다.

악화 시 및 30일 추적 시 순환 단백질 단편의 수준.

	악화(ng/ml)	추적(ng/ml)	P값
C3M	29.24 [26.32　~　32.49]	22.64 [20.78　~　24.67]	< 0.0001
C4M	95.96 [85.83　~　107.28]	73.30 [66.59　~　80.69]	< 0.0001
C6M	19.78 [16.82　~　23.27]	13.27 [11.56　~　15.23]	< 0.0001
ELM7	4.50 [3.91　~　5.17]	3.79 [3.37　~　4.27]	< 0.0001
EL-NE	7.79 [6.30　~　9.63]	5.23 [4.41　~　6.21]	< 0.0001
VCANM	1.69 [1.58　~　1.80]	1.87 [1.78　~　1.97]	0.0001
Pro-C3	12.10 [10.60　~　13.81]	12.79 [11.35　~　14.42]	0.2549
P4NP 7S	510.99 [440.91　~　592.21]	359.20 [312.28　~　413.17]	< 0.0001
Pro-C6	5.36 [4.81　~　5.99]	6.38 [5.71　~　7.14]	< 0.0001

결과를 악화 및 추적 시 단백질 단편의 순환 수준을 비교하는 기하 평균[95% 신뢰도 구간] 및 대응하는 P값으로 나타낸다.

콜라겐 III형(C3M), 콜라겐 IV형(C4M), 콜라겐 VI형(C6M), 및 엘라스틴(ELM7 및 EL-NE)의 분해 단편은 추적 대비 악화 시 유의미하게 상승되었다(모두 P<0.0001; 도 5, 패널 A 및 B). 대조적으로, 베르시칸 분해 단편(VCANM)은 악화 시 유의미하게 감소된 평균 수준을 나타내었다(P<0.0001; 도 5, 패널 B). 단백질 형성에 관련된 단편 수준은 추적 대비 악화 시 콜라겐 III형에 있어서 유의미하게 변화하지 않았으나, 콜라겐 IV형에 있어서 증가하였고(P<0.0001) 콜라겐 VI형에 있어서 감소하였다(P<0.0001)(도 5, 패널 C). 단백질 단편의 순환 수준에 대한 흡연의 효과를 조사하기 위해, 현재 및 과거-흡연자에 대해 개별적으로 분석을 수행하였고, 유사한 결과를 가졌다(데이터는 나타내지 않음).

콜라겐 III, IV, 및 VI형에 대한 분해 및 형성 단편 간 비를 계산하여 콜라겐의 분해 및 형성 간 밸런스를 조사하였다(도 6). 평균 분해/형성비[95% CI]는 콜라겐 III형(2.33[2.03~2.66] 대 1.72[1.51~1.96], P<0.0001) 및 콜라겐 VI형(3.61[2.86~4.56] 대 2.00[1.64~2.44], P<0.0001)에 있어서 악화 시 유의미하게 상승하였다. 대조적으로, 콜라겐 IV형 분해/형성비는 악화 시 0.18[0.17~0.20]이었고 추적 시 0.20[0.19~0.22]까지 증가하였다(P=0.0008).

추적 시, BMI는 C3M(ρ=-0.271, P=0.029), Pro-C3(ρ=-0.357, P=0.010), 및 Pro-C6(ρ=-0.338, P=0.017)과 음으로 연관되었다. 연령은 C6M(ρ=-0.249, P=0.039) 및 Pro-C6(ρ=-0.310, P=0.026)과 음으로 연관되었다. 흡연 팩 년수, MRC 스코어, 입원 길이, 객담 생성, 또는 백혈구수와는 연관성이 나타나지 않았다. Pro-C3 수준은 FEV1의 예측값%(pred%) 및 FVC pred%과 양으로 연관되었으며, 이들은 연령, 성별, BMI, 흡연 팩 년수, 및 흡연 상태에 대한 보정 후 유의미하게 유지되었다(표 4). 6MWD는 C3M, C4M, C6M, 및 P4NP 7S와 음으로 연관되었다(표 4). 연령, 성별, BMI, 흡연 팩 년수, 및 흡연 상태에 대한 교정 후, C3M 및 C6M과의 연관성은 유의미하게 유지되었으나, C4M은 유의성 경계에 있었고 P4NP 7S는 유의미하지 않았다(표 7).

순환 단백질 단편 수준 및 임상 파라미터 간 연관성.

	FEV1 pred%	FVC pred%	6MWD
C3M	0.020	-0.182	-0.370*(-0.311)
C4M	-0.002	-0.148	-0.313*(-0.252￡)
C6M	-0.012	-0.224	-0.354(-0.354)
ELM7	-0.041	-0.175	-0.125
EL-NE	-0.016	-0.125	-0.189
VCANM	0.021	-0.084	-0.096
Pro-C3	0.391*(0.320)	0.312(0.305)	-0.009
P4NP 7S	0.042	-0.186	-0.278*(-0.230)
Pro-C6	0.058	-0.013	-0.188

결과를 각각의 마커에 대한 Spearman 연관성 계수(ρ)로 나타낸다. 괄호 안에 유의미한 ρ를 나타내는 마커에 대한 다변수 연관성 계수를 제공한다. 다변수 선형 회귀 분석에는 연령, 성별, BMI, 흡연 팩 년수, 및 흡연 상태가 추가적인 설명 변수로서 포함되었다. 유의성 수준:

P<0.07, *P<0.05, **P<0.01. FEV1, 1초에서의 강제 날숨 부피; pred%, 예측값 백분율; FVC, 강제 폐활량; 6MWD, 6분 보행 거리.

모든 검정은 분해 또는 형성 동안 MMP 절단에 의해 생성된 단백질 단편 또는 내부 단백질 서열에 대해 유도된 모노클로날 항체를 채택하였다. 상기 연구 및 이의 기술적 사양에서 이용된 검정의 개요를 표 4에 제공한다. 모든 샘플을 각 검정의 정량 범위 내에서 측정하고, 검출 하한(LLOD) 미만의 값을 갖는 모든 샘플에는 LLOD 값을 할당하였다.

상기 결과는 단백질 리모델링 단편의 바이오마커에 의해 체계적으로 평가되는 ECM 리모델링이 질환 활성이 높은 COPD의 악화 동안 가속화됨을 나타낸다.

실시예 4: 당뇨병 II형에서의 Pro-C6

페록시좀 증식인자-활성화 수용체 감마(PPARγ)의 완전 작동제를 이용한 당뇨병 환자의 치료는 인슐린 감수성을 개선하지만, 체중 증가, 심부전, 말초 부종 및 뼈 손실과 연관된다. 프로콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 단편(Pro-C6으로도 불림), 엔도트로핀은 지방 조직 기질 리모델링 및 대사 제어에 모두 관여된다. 본 발명자들은 상기 신규한 아디포카인이 PPARγ 작동제에 최적 반응하는 2형 당뇨병(DM2) 환자를 확인할 수 있어서 위험 대 이익비를 개선하는지를 평가하기 위해 엔도트로핀에 대한 혈정 검정을 확립하였다.

연구 설계

BALLETS(버밍엄 및 램버스 간 평가 시험 전략) 연구는 안정한 인슐린 치료법에 대한 2형 당뇨병 대상체에서 발라글리타존 또는 피오글리타존의 6개월 치료 유효성 및 안전성을 결정하기 위한 III상, 무작위화, 이중-맹검, 병렬-군, 위약 및 활성 비교인자-제어 임상 연구였다. 기준선 인구통계, CONSORT 다이어그램뿐만 아니라 유효성 및 안전성 데이터는 이전에 공개되었다(Henriksen, 2011). 현재 연구에서, 전술된 바와 같이(Henriksen, 2011) 4개 군(위약, 2개 용량의 발라글리타존 및 1개 용량의 피오글리타존)에 걸쳐 균일 분포된 299명 대상체로 구성된 BALLETS 연구 집단을 프로토콜에 따라 이용하였고, 모두 치료법 하의 혈당 제어 및 Pro-C6 결정에 관련된 기준선 및 최대 6개 추적 파라미터를 포함하였다.

통계 분석

분석에는 혈청 Pro-C6의 기준선 측정을 갖는 프로토콜에 따른 집단으로부터의 대상체가 포함되었다. 대상체를 이의 기준선 Pro-C6값에 기반하여 3개 삼분위 중 하나로 그룹화하였다. 삼분위 1에는 6.2 ng/mL 이하의 기준선 혈청 Pro-C6을 갖는 대상체가 포함되었고; 삼분위 2는 6.3 ng/mL 내지 7.7 ng/mL의 기준선 혈청 Pro-C6을 가졌고, 삼분위 3은 7.8 ng/mL 이상의 기준선 혈청 Pro-C6을 가졌다. 3개 하위군 간 기준선 특징을 분산 분석(ANOVA)에 의해 비교하였고, 각각의 삼분위에서 성별 비율의 비교는 Fisher의 정확 평가에 의해 비교하였다.

Spearman의 순위 연관성을 혈청 Pro-C6, 공복 혈청 글루코스(FSG), 혈액 HbA1c, 체질량 지수(BMI), 및 인슐린 내성(HOMA-IR) 및 지방 간 지수(FLI)의 유도된 파라미터의 기준선 수준에서 수행하였다. HOMA-IR을 혈청 글루코스 및 인슐린을 포함하는 항상성 모델 평가에 따라 계산하였고(Feigh, 2011) FLI를 다음 공식을 이용하여 계산하였다(문헌[Bedogni et al, 2006]에 기재된 바와 같음):

FSG, 혈액 HbA1c, 및 혈청 Pro-C6에서 기준선으로부터의 변화를 3개 삼분위 각각에서 시간 및 치료의 함수로 연구하였다. 최소 자승 평균(LS 평균) 및 표준 오차를 혼합-효과 반복 측정 모델로부터 의존적 변수로서 기준선으로부터의 변화로; 고정 효과로서 기준선 수준, 방문(치료 12주 후) 및 치료 종료(26주 후), 및 기준선 수준 대 방문 및 치료 종료 대 방문 상호작용으로, 및 대상체에 대해 구조화되지 않은 공분산 구조로 산정하였다.

각각의 대상체에 있어서, 기준선으로부터의 평균 변화를 사다리꼴 방법에 의해 곡선 하 면적으로 계산하였고, 평균 변화를 의존적 변수로, 기준선 수준을 공변량으로, 및 치료를 고정 효과로 하여 공분산 모델 분석(ANCOVA)으로부터 LS 평균 및 표준 오차를 산정하였다. Dunnett 방법에 의한 다중 비교에 대해 조정된 유의성 수준과 함께 각각의 활성 치료군 내의 각각의 삼분위를 위약군과 비교하였다. 기준선으로부터의 평균 변화가 0과 상이한지 여부의 평가는 LS 평균의 표준 오차에 기반하였다.

모든 통계적 계산은 SAS 소프트웨어 패키지를 이용하여 수행하였다. 본 연구는 ClinicalTrials.gov 식별자 NCT00515632로 등록된다.

결과

혈청 엔도트로핀은 대사 파라미터와 연관된다. BALLET 시험에서 대사 파라미터 및 안전성 데이터에 의해 평가된 치료 유효성은 이전에 공개되었다(Henriksen, 2011). 대사 증후군과 연관된 파라미터에 대한 엔도트로핀의 기준선 연관성을 표 8에 나타낸다.

기준선 PRO-C6의 하위군에서 인구통계 및 기준선 특징

	엔도트로핀 (2.4~6.2 ng/mL) n=96	엔도트로핀 (6.3~7.7 ng/mL) n=101	엔도트로핀 (7.8~16 ng/mL) n=100	p-값
치료	Bala 10 mg: n=27 Bala 20 mg: n=22 Pio 45 mg: n=24 위약 n=23	Bala 10 mg: n=21 Bala 20 mg: n=21 Pio 45 mg: n=29 위약 n=30	Bala 10 mg: n=25 Bala 20 mg: n=25 Pio 45 mg: n=31 위약 n=19	-
연령(세)	57.6(8.1)	60.6(8.3)	63.4(8.0)	<0.0001
성별	여성: 21(22%) 남성: 75(78%)	여성: 32(32%) 남성: 69(68%)	여성: 43(43%) 남성: 57(57%)	p=0.007
BMI(kg/m²)	32.0(3.9)	33.6(4.7)	34.9(6.3)	0.0005
허리 둘레(cm)	110(10)	114(12)	117(14)	0.001
엉덩이 둘레(cm)	109(8)	111(10)	115(12)	0.0002
DXA 총 체지방량(kg)	30.8(8.4)	33.86(8.9)	36.1(9.8)	0.0006
DXA 몸통 지방량(kg)	18.3(5.2)	20.0(5.0)	21.7(5.6)	0.0001
혈액 HbA1C(%)	8.7(1.4)	8.4(1.3)	8.8(1.5)	ns
혈청 글루코스(mmol/L)	9.4(3.3)	9.2(3.2)	9.8(3.4)	Ns
혈청 AST(U/L)	28(12)	32(13)	32(12)	Ns
혈청 ALT(U/L)	31(15)	34(19)	33(17)	Ns
혈청 GGT(U/L)	45(38)	55(56)	54(47)	Ns
혈청 ALP(U/L)	163(49)	172(46)	187(56)	0.004
혈청 빌리루빈(μmol/L)	9(3.3)	9(5.1)	9(3.7)	Ns
혈청 트리글리세라이드(mmol/L)	1.52(0.94)	1.85(1.16)	2.05(1.07)	0.002
혈청 콜레스테롤(mmol/L))	4.34(0.96)	4.28(0.85)	4.45(1.04)	Ns
혈청 HDL Chol(mmol/L)	1.31(0.35)	1.23(0.29)	1.25(0.27)	Ns
혈청 LDL Chol(mmol/L)	2.61(0.90)	2.54(0.76)	2.61(0.97)	Ns

엔도트로핀 수준은 HOMA-IR, FLI, 트리글리세라이드, 및 BMI에 대해 유의미하게 연관되었지만, FSG 및 HbA1c에 대해서는 연관되지 않아서, 엔도트로핀이 실제로 지방세포 기능, 지방량, 및 인슐린 감수성의 일부 양태와 관련된 아디포카인임을 뒷받침하였다. 엔도트로핀 수준은 콜레스테롤 수준 또는 간 효소에 연관되지 않았다.

6개월의 치료 기간 종료 시, 위약군에서, 엔도트로핀 및 이러한 대사 파라미터 간 연관성이 유지되었다(표 9, 10A). 그러나, PPARγ 작동제로 치료받은 대상체에서는, HOMA-IR 및 엔도트로핀 간 연관성이 제거된 반면, 엔도트로핀 및 BMI 또는 FLI 간 연관성은 지속되었고, 심지어 더 강해지는 경향을 나타내었다(표 10B~C).

기준선에서의 Spearman 연관성 계수(Rho)

	엔도트로핀	혈청-글루코스	기준선- HbA1c	HOMA-IR	FLI	BMI
PRO-C6	1	0.07	0.06	0.16**	0.32***	0.24***
혈청-글루코스	-	1	0.47***	0.27***	0.20***	0.17**
기준선-HbA1c	-	-	1	0.15**	0.17**	0.10
HOMA-IR	-	-	-	1	0.42***	0.33***
FLI	-	-	-	-	1	0.86***
BMI	-	-	-	-	-	1

[표 10a]

[표 10b]

엔도트로핀은 글리타존 치료법에 대한 반응체를 확인함

체중 및 BMI는 하위 삼분위에 비해 모든 4개 치료군에서 상위 삼분위들에서 더 높았다(표 1). 치료군 간 글루코스 항상성에서는 차이가 나타나지 않았다.

FSG 및 HbA1c의 절대 수준은 위약 대비 모든 3개 치료군에서 감소했으나, 기준선 대비 엔도트로핀의 2 상위 삼분위들에서만 연구 동안 0으로 설정되었다(도 7a~f).

FSH에서 기준선으로부터 치료 종료(26주)까지 경시적인 평균 절대 변화의 평가 시(도 8, 왼쪽 패널), FSG의 감소가 더 컸으며(약 2.5 mM), 기준선 대비 감소가 모든 치료군에 걸쳐 유의미하지 않은 하위 삼분위와 비교되는 경우 상위 2개 삼분위들에서 통계적으로 유의미하였다. HbA1c에 대해 유사하게(도 8, 오른쪽 패널), 26-주 치료 기간 동안 엔도트로핀 수준에서의 평균 절대 변화는 위약과 및 기준선 수준과 비교하는 경우 모두, 상위 2개 삼분위에서만 유의미했으며 하위 삼분위는 유의미하지 않았다. 치료법에 대한 반응을 조사한 경우, 기준선 혈청 엔도트로핀의 상위 2개 삼분위의 환자는 글리타존 치료법에 대해 임상적으로 유의미한 반응을 나타낼 가능성이 더 높았다. 이들 환자에서, HbA1c에 대해 1% 및 0.5% 초과 감소에 대한 승산비는 각각 4.1(p<0.001) 및 4.3(p<0.001)이었다(도 9). 치료법 하에서의 인슐린 감수성 변화의 평가(HOMA-IR에 의해) 시, 다시 엔도트로핀의 상위 삼분위들에서의 대상체는 가장 우수한 개선을 나타내었고(도 10A~C), 가장 높은 삼분위는 통계적 유의성을 경계에서 손실하였다. 흥미롭게도, 치료법의 변이체 유효성에도 불구하고, 엔도트로핀 수준의 삼분위 간 체중 증가에서는 현저한 차이가 존재하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

기준선 대비 변화 백분율로 표시되는, 치료 및 시간의 함수로서의 혈청 엔도트로핀의 효과(중간점 및 치료 종료를 연구하기 위해)를 도 11에 나타낸다. 엔도트로핀 수준은 가장 높은 삼분위에서는 증가하지 않았으나 낮은 2개 삼분위들에 있어서 위약 및 치료군 모두에서 증가하였다.

유해 사례

수분 변위로 인한 부피 증가로 측정되는 경우, 하지 부종은 기준선 혈청 엔도트로핀 삼분위와 연관되었다. 글리타존 치료법은 하위 및 중위 삼분위에서 증가된 하지 부피를 야기한 반면, 상위 삼분위에서는 치료군 및 위약군 간 차이가 존재하지 않았다(도 12). 혈청 엔도트로핀의 상이한 삼분위들에서의 AE 및 중증 AE(SAE)를 표 11에 나타낸다. 엔도트로핀 수준에 따라 계층화된 경우 3개의 상이한 치료군에서는 AE 또는 SAE 발생에서 유의차가 존재하지 않았다. 표 11에서의 SAE 및 도 12에서 보고된 하지 부종 간 차이는 정량적 측정인 하지 부피 및 환자 보고 결과인 부종 보고의 함수이다(도 10).

각각의 치료군에서 기준선 엔도트로핀의 하위군에서의 유해 사례 프로필

N( % )E	위약	발라글리타존 10 mg	발라글리타존 20 mg	피오글리타존 45 mg
삼분위1 : AE
대상체 수	n=23	n=27	n=22	n=24
모든 AE	16(70%) 30	20(74%) 38	17(77%) 33	19(79%) 45
심각한 AE	0(0%) 0	1(4%) 1	1(5%) 1	1(4%) 1
삼분위2 : AE
대상체 수	n=30	n=21	n=21	n=29
모든 AE	23(77%) 51	17(81%) 35	15(71%) 36	17(59%) 37
심각한 AE	3(10%) 3	1(5%) 1	0(0%) 0	2(6%) 3
삼분위3 : AE
대상체 수	n=19	n=25	n=25	n=31
모든 AE	14(74%) 41	20(60%) 55	20(60%) 43	25(81%) 66
심각한 AE	0(0%) 0	1(4%) 1	6(24%) 6	4(13%) 6
삼분위1 : 중증 AE
심부전	0(0%) 0	0(0%) 0	0(0%) 0	0(0%) 0
심장 허혈	1(4%) 1	0(0%) 0	2(9%) 2	0(0%) 0
말초 부종	0(0%) 0	2(7%) 2	2(9%) 2	5(21%) 5
총 중증 AE	1(4%) 1	2(7%) 2	4(18%) 4	5(21%) 5
삼분위2 : 중증 AE
심부전	0(0%) 0	0(0%) 0	0(0%) 0	0(0%) 0
심장 허혈	1(3%) 1	1(5%) 1	0(0%) 0	1(3%) 1
말초 부종	1(3%) 1	3(14%) 3	2(10%) 2	5(17%) 5
총 중증 AE	2(7%) 2	4(19%) 4	2(10%) 2	5(17%) 6
삼분위3 : 중증 AE
심부전	0(0%) 0	0(0%) 0	0(0%) 0	1(3%) 1
심장 허혈	1(5%) 1	0(0%) 0	1(4%) 1	3(10%) 4
말초 부종	1(5%) 2	1(8%) 1	1(4%) 1	2(6%) 2
총 중증 AE	2(11%) 3	1(8%) 1	2(8%) 2	6(19%) 7

토의

혈청 엔도트로핀(Pro-C6)은 2형 당뇨병 환자에서 인슐린 감수제, 피오글리타존 및 발라글리타존에 대한 반응을 예측하였다. 따라서, 2개의 상위 삼분위들에서의 Pro-C6 혈청 수준을 갖는 환자는 하위 삼분위에서의 환자에 비해 치료 반응을 가질 가능성이 4배 더 높았다. 글리타존은 안전성 우려, 예컨대 비-치사 심부전 및 뼈 골절과 연관되므로, 가장 적은 AE를 가지며 가장 큰 치료 이익을 획득할 최적 반응체의 확인은 여전히 고도로 효과적인 인슐린 감수제로 간주되는 이러한 약물의 계속 사용을 위해 중추적이다. 직접 일치하여, FPG 감소를 가지며 반응한 기준선 Pro-C6의 상위 삼분위들 및 HbA1c 삼분위에서의 환자에서는 글리타존 치료의 주요 AE 중 하나인 하지 부종 증가가 발생하지 않았다. 조합된 이러한 유효성 및 안전성 데이터는 글리타존으로 치료받은 환자에 있어서 개선된 유익 대 부작용 예측과 고도로 관련되었다; 이는 또한 다른 적응증에 대한 이들에 대해 용도 변경 시, 특히 비-알코올성 지방간염(NASH)의 치료가 고려되는 경우에도 적용된다.

비만에서 엔도트로핀 매개 대사성 기능장애는 에너지 소비 감소와 연관된 지방 조직에서의 전-염증성 상태 및 섬유증의 유도를 통해 유도될 가능성이 있다. 따라서, 그 억제는 인슐린 감수성을 개선하고 지방 조직 염증을 약화시켰으며(Sun, 2014), 이는 상승된 혈청 엔도트로핀 수준이 PPARγ 작동제에 대한 반응을 시사한다는 본 발명자들의 발견과 잘 연관된다. 또한, 엔도트로핀 전구체, 프로콜라겐 α3(VI)의 mRNA 수준은 또한 지방 조직 염증 및 섬유증과 병렬적으로, 비만 지방 조직에서 상향조절되어, 일반적으로 지방세포 및 지방 조직의 조정인자로서 프로콜라겐 VI형의 중요한 역할을 뒷받침한다(Dankel, 2014). ECM 및 특히 프로콜라겐 VI형 및 엔도트로핀은 지방간 질환 및 그 중증 발현인, 2형 당뇨병과 적어도 부분적 중복을 나타내는 간의 대사-섬유성 장애, NASH에서 특히 관련성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 상기 신규한 바이오마커가 또한 NASH 환자의 진단 및 관리를 보조할 것으로 예상하며, 여기서 인슐린 감수제는 인슐린 내성 및 간 섬유화의 치료 모두를 위해, 하위집단에 대해 유익할 수 있다. 여기서, ECM, 특히 콜라겐/콜라겐 VI형, 및 지방간으로부터 명백한 섬유성 NASH로의 전이에서 이의 기능적 역할은 추가 조사가 필요하다. 이에 따라, 본 연구에서, 본 발명자들은 NASH 염증 활성과 연관되고 보다 중증 간 섬유화를 예측하는 FLI 지수(Bedogni, 2006) 및 혈청 트리글리세라이드와 강한 연관성을 관찰하였다. NASH-관련 섬유화에서 VI형 콜라겐에 대한 역할을 뒷받침하여, 선행 연구는 활성 흉터 형성 영역에서 그 뚜렷한 발현을 나타내었고(Burt, 1990; Griffiths, 1992) 콜라겐 VI 코어 구조(엔도트로핀 도메인이 없음)의 상승된 혈청 수준이 설치류(Veidal, 2011) 및 환자(Lebensztejn, 2006; Stickel, 2001)에서 진행된 간 섬유화 및 상승된 문맥압(Leeming, 2013)과 연관된 것으로 나타났다. 프로콜라겐 α3(VI)의 발현은 본 발명자들의 발견과 직접 연관되는 PPARγ에 의해 조절된다. 실제로, 프로콜라겐 α3(VI) mRNA는 PPARγ에 대한 siRNA로 처리된 지방세포 배양에서 그 mRNA의 증가에 의해 그리고 PPARγ 작동제 피오글리타존으로 치료받는 2형 당뇨병 환자의 피하 지방 조직에서, 특히 프로콜라겐 α3(VI) mRNA의 높은 기준선 조직 수준을 갖는 환자에서 그 전사체의 감소에 나타난 바와 같이, PPARγ에 의해 억제된다. 이러한 데이터는 부분적으로 기준선으로부터 치료 종료까지, 엔도트로핀/Pro-C6 혈청 수준 및 HbA1c 또는 HOMA-IR 간 연관성에서의 변화, 특히 글리타존 치료 후 엔도트로핀 및 대사 파라미터 간 연관성 부재를 설명할 수 있다. 따라서 말초 지방 조직에서 (프로콜라겐 α3(VI) mRNA에 의해 측정되는) 엔도트로핀 전구체의 발현은 중증 비만, 인슐린-내성 환자에서 BMI 또는 총 지방량에 의존하지 않았다. 또 다른 임상 연구에서, 비만 대상체에서의 조직 엔도트로핀 수준은 만성 염증 및 전신 인슐린 내성과 연관되었다(Park, 2013). 프로콜라겐 VI, 지방 조직 섬유증 및 손상된 글루코스 감수성 간 직접적 연관의 추가 증명은 백색 지방 조직에서 콜라겐 VI의 부재 하에 ob/ob 마우스(기능적 렙틴 유전자가 없음)에서의 연구에 의해 제공된다. 이들 마우스는 지방 조직 섬유화 및 염증의 부재 하에 유의미하게 개선된 인슐린 감수성을 가졌다(Khan, 2009). 첫 번째 측면에서, 이러한 데이터는 본 발명의 연구에서 확인된 바와 같이, 혈청 엔도트로핀 및 BMI, FLI, 및 HOMA-IR 간의 강한 연관성과 상충되는 것으로 보인다. 그러나, 프로콜라겐 VI의 존재는 필요하지만 아디포카인 엔도트로핀의 단백분해 생성을 위해 충분한 사전조건은 아니다. 따라서, 엔도트로핀 생성 프로테아제를 확인하고 그 상류 조절을 특성규명하는 것이 관심의 대상이 될 것이다. 또한, 렙틴은 VI형 프로콜라겐의 발현을 유도하였고, 이는 렙틴 내성, 대사 기능부전, 및 엔도트로핀 간 연관성을 추가로 뒷받침한다.

전에 논의된 바와 같이, ECM은 현재까지 수동적 스캐폴드로서 가장 많이 고려되어 왔다. VI형 콜라겐은 근육 장애, 예컨대 Bethlem 근육병증, Ullrich 선천성 근이영양증, 지대근 이영양증, 및 상염색체 열성 근경화증을 유도하는, 그 3개 구성 사슬을 인코딩하는 유전자 COL6A1, COL6A2, 및 COL6A3에서의 돌연변이를 통해 가장 잘 인식되었다(Lampe, 2005; Bonaldo, 1998; Bushby, 2014). 근육은 인슐린 내성의 중요한 조절인자를 나타내므로, 이는 대사 기능장애와의 흥미로운 연관성을 제공한다. 따라서, 모든 이용 가능한 증거는 콜라겐 VI형이 수동적 ECM 성분을 능가하며, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 및 NASH에 관련된 지방조직(및 간) 대사 기능장애의 중요한 매개인자임을 강력히 제시한다.

결론적으로, 지방세포 및 지방 조직으로부터 두드러지게 유도되는 순환 엔도트로핀은 인슐린 내성에 관련되어 상승되며 인슐린 감수제에 대한 반응을 예측한다. 이는 인슐린 감수제에 최적 반응할 환자의 확인 및 모니터링을 허용하며, 이는 2형 당뇨병 및 가능하게는 NASH의 치료에서 PPARγ 작동제의 유익 대 위험 비를 개선한다.

본 명세서에서, 달리 나타내지 않은 한, 단어 '또는'은 하나의 조건만 충족될 것을 필요로 하는 연산자 '배타적으로 또는'과는 배치되게, 언급된 조건 중 어느 하나 또는 둘 다가 충족되는 경우 참의 값이 되는 연산자의 개념으로 이용된다. 단어 '포함하는'은 '로 구성되는'을 의미하는 것보다 '포함되는' 개념으로 이용된다. 상기 인식된 모든 선행 교시는 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 임의의 사전 공개된 문헌에 대한 인식은 이의 교시가 그 날짜에 호주 또는 다른 곳에서의 공통적인 일반 지식임을 인정하거나 나타내는 것으로 간주되어서는 안 된다.

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Claims

콜라겐 6형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프와 반응성인 면역학적 결합 파트너.
청구항 1에 있어서,
상기 면역학적 결합 파트너는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함되는 상기 C-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역학적 결합 파트너.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 면역학적 결합 파트너는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 면역학적 결합 파트너.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 면역학적 결합 파트너는 ...KPGVISVMGTA-COOH인 상기 C-말단 아미노산 서열의 연장된 버전을 인식하거나 이에 특이적으로 결합하지 않는 면역학적 결합 파트너.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나의 항에 있어서,
아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도 대 연장된 아미노산 서열 ...KPGVISVMGTA-COOH에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도의 비는 10 대 1 초과인 면역학적 결합 파트너.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 면역학적 결합 파트너는 ...KPGVISVMG-COOH인 상기 C-말단 아미노산 서열의 절단된 버전을 인식하거나 이에 특이적으로 결합하지 않는 면역학적 결합 파트너.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항에 있어서,
아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도 대 절단된 아미노산 서열 ...KPGVISVMG-COOH에 대한 상기 면역학적 결합 파트너의 친화도의 비는 10 대 1 초과인 면역학적 결합 파트너.
콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프를 포함하는 샘플을 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 하나의 항의 면역학적 결합 파트너와 접촉시키는 단계, 및 상기 면역학적 결합 파트너의 결합량을 결정하는 단계를 포함하는, 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프를 샘플에서 검출하기 위한 면역검정 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 C-말단 에피토프는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함되는 방법.
청구항 8 또는 청구항 9에 있어서,
상기 방법은 생물유체 중 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 양을 정량하기 위해 이용되는 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 생물유체는 혈청, 혈장, 소변 또는 양수인 방법.
청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 면역검정은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정인 방법.
청구항 12에 있어서,
상기 면역검정은 방사면역검정 또는 효소-연관 면역흡착 검정인 방법.
청구항 8 내지 청구항 14 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 방법에 의해 결정된 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 양을 상기 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 표준 정상값과 연관시켜 이의 정상 수준으로부터의 변화를 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 10 내지 청구항 13 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 검정을 수행하여 청구항 9에서 정의된 에피토프를 포함하는 콜라겐 VI형 α3 단편의 생물유체 샘플 중 수준의 측정을 수득하는 단계를 포함하는, 세포외 기질의 형성 속도의 조사 방법.
청구항 15에 있어서,
상기 콜라겐 VI형 α3 단편의 측정 수준을 동일한 샘플 중 콜라겐 VI형 분해의 바이오마커의 측정 수준과 비교하는 지수를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
i) 청구항 10의 방법에 따라 대상체로부터 수득된 생물유체 중 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프의 양을 정량하는 단계; 및
ii) 단계 i)에 의해 결정된 상승된 값을 인슐린 감수제를 이용한 치료에 적합한 대상체와 연관시키는 단계를 포함하는, 인슐린 감수제를 이용한 치료에 적합한 대상체의 확인 방법.
청구항 17에 있어서,
상기 인슐린 감수제는 티아졸리딘디온인 방법.
청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
상기 C-말단 에피토프는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함되는 방법.
청구항 17 내지 청구항 19 중 어느 하나의 항에 있어서,
단계 ii)의 상승된 값은 제2 또는 제3 삼분위 내에 속하는 값에 해당하는 방법.
청구항 17 내지 청구항 20 중 어느 하나의 항에 있어서,
단계 ii)의 상승된 값은 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C-말단 에피토프의 6.3 ng/mL 이상에 해당하는 방법.
본 발명의 면역학적 결합 파트너 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 생물학적 샘플에서 콜라겐 VI형의 α3 사슬의 C5 도메인의 C-말단 에피토프의 양을 결정하기 위한 검정 키트:
- 스트렙타비딘 코팅된 96웰 플레이트
- 상기 항체와 반응성인 펩타이드로서, 바이오틴화 펩타이드 바이오틴-L-KPGVISVMGT-COOH일 수 있고, 여기서 L은 선택적 링커인, 펩타이드
- 샌드위치 면역검정에서 이용하기 위한 선택적으로 바이오틴화된 이차 항체
- C-말단 서열 ...KPGVISVMGT-COOH를 포함하는 교정인자 펩타이드
- 항체 HRP 표지화 키트
- 항체 방사표지화 키트
- 검정 가시화 키트
청구항 22에 있어서,
상기 C-말단 에피토프는 C-말단 아미노산 서열 ...KPGVISVMGT-COOH에 포함되는 검정 키트.