JP2021176869A - Vi型コラーゲン配列に関するイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
よび前記エピトープを検出するイムノアッセイに関する。
ばこの3つの組合せが原因で消失する。個体は50歳から1年あたり1〜2%の骨格筋を
消失すること(Hughes)、筋肉量の2〜3%が不動状態中1週間あたりで消失し(
Hortobagyi et al.2000)、悪液質ではさらに急速に消失すること
が報告されている。高齢者または入院中個体における筋肉機能の障害は(併存)疾患状態
および死亡率と関係がある(Cruz−Jentoft)。先進国における人口の年齢の
増大と共に、機能的自立の維持がそれ故ますます重要になっている。筋肉消失の診断法お
よび管理法は、画像検査、例えば磁気共鳴映像法(MRI)、コンピューター断層撮影法
(CT)および二重エネルギーX線吸収測定法(DXA)に未だ依存している(Cruz
−Jentoft)。しかしながら、このような検査は、通常の臨床試験で使用するには
高価または不便のいずれかである。クレアチニンおよび3−メチルヒスチジンなどの尿お
よび血清バイオマーカーも、筋肉消失の管理を手助けするのに使用される。しかしながら
、これらのアッセイの大きな変動性と低い確実性によって、それらの使用は制限される(
Nedergaard 2013)。要約すると、筋肉機能の診断および予後評価、なら
びにアンチカタボリック治療の結果のモニタリングにおいて使用することができるバイオ
マーカーが早急に必要である(Sharf)。
nnie 2010およびWelle 2002)。タンパク質、特に細胞外タンパク質
の代謝回転によってタンパク質分解断片が循環中に放出され得るので、タンパク質代謝の
定量的または定性的変化は、筋肉の量または機能のモニタリングにおいて使用することが
できるバイオマーカー概略を与え得る(Nedergaard 2013)。
る(Granzier)。
、筋肉組織および皮膚などの重要な成分である(Gelse)。PIIINPはIII型
コラーゲンのN末端プロペプチドであり、これは成熟III型コラーゲン合成中に除去さ
れる(Niemela)。それはホルモン治療のアナボリック応答と関係があることが報
告されている(Bhasin 2009およびChen 2011)。近年、N末端プロ
コラーゲンのN−プロテアーゼ切断部位を標的化したモノクローナル抗体を施用すること
による、新たなELISAキットが開発され、これはIII型コラーゲンの真の合成を評
価することが可能である(Nielsen 2013)。
な細胞外コラーゲンである。それは、コラーゲン、バイグリカン、およびプロテオグリカ
ンを含めた、他のマトリックスタンパク質と相互作用することができる(Kuo 199
7、Bidanset 1992およびStallcup 1990)。筋肉中では、V
I型コラーゲンは筋線維鞘の一部であり、筋肉内細胞外マトリックスへの筋線維の固定に
関与し、したがって力の伝達に関与する(Bonaldo 1990およびKeene
1988)。さらに、VI型コラーゲンの突然変異は、ベスレムミオパチーおよびウール
リッヒ型先天性筋ジストロフィーを引き起こす可能性がある(Lampe)。VI型コラ
ーゲンα3鎖のC末端は、分泌後に成熟VI型微小線維から切断除去されることが報告さ
れている(Aigner 2002およびLamande 2006)。
い。
永続的気流制限によって特徴付けられる、不均質にゆっくりと進行する疾患である(世界
的問題...)。肺の細胞外マトリックス(ECM)の主な構造タンパク質はコラーゲン
、エラスチン、およびプロテオグリカンである。ECM再編成は健常な組織維持の一部で
あり、この場合古いタンパク質は分解され新たなタンパク質が形成される(Cox)。し
かしながら、過度のECM再編成は、COPDにおいて肺機能の消失を促進する構造変化
を誘導する。COPDにおける重要な課題は、疾患進行のバイオマーカーの同定である(
Vestbo)。肺構造タンパク質の評価によるECMの研究によって、疾患活動性と予
後のバイオマーカーを与えることができる。
on 2002))、生活の質を低下させ(Seemungal)、死を引き起こす(S
ofer−Cataluna)まで、COPD進行が誘導される。全COPD段階の患者
が増悪を経験し得るが、彼らは疾患重症度の増大をより頻繁に経験する(Hurst)。
それらの発生を予測することは難しく、将来的増悪の最も確実な予測因子は増悪歴である
(Hurst 2010およびDonaldson 2006)。増悪はCOPD発病に
おける重要な事象であるが、これらの事象中の肺組織の構造変化に関してはほとんど知ら
れていない。安定状態のCOPDと比較して、増悪時にCOPD患者の喀痰中の組織メタ
ロプロテイナーゼ阻害物質1(TIMP−1)のレベルは低下し(Mercer)、破滅
的環境を示唆する一方で、マトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP−9)のレベル
は上昇することが知られている。
胞遊走、分化、および血管新生を含めた細胞プロセスを遠位で調節できるシグナル伝達分
子を生成することが明らかになった。これらの分子は、XVIII型コラーゲンに由来す
る強力な抗血管新生ペプチドエンドスタチン、ならびにそれぞれIV型、VII型、およ
びXV型コラーゲンから放出されるタムスタチン、バスタチン、およびレスチンを含む(
Karsdal、2015)。
であるマイクロフィラメント間質性VI型コラーゲンは、大部分の結合組織中、主に脂肪
組織中で発現され(Park、2012)、そこで他のECMタンパク質とのその相互作
用によって細胞を固定する(Mak、2012)。マイクロフィラメントの形成中、その
3重らせんコアはタンパク質分解によってそのプロペプチドから放出される(Aigne
r、2002;Lamande、2006)。ここで、α3(VI)鎖のC末端プロペプ
チドのさらなる切断によって、新たに同定されたアディポカインであるエンドトロフィン
が生成する(本明細書では「Pro−C6」と呼ぶ)。エンドトロフィンは、主に脂肪組
織によって生成され、形質転換増殖因子β(TGF−β)の上方制御、脂肪組織線維化、
血管新生、炎症を誘導し、動物モデルでは、インスリン感受性、食物摂取、エネルギー収
支、および脂肪組織炎症など幾つかの代謝機能を不都合に調節することが示されている(
Sun、2014;Dankel、2014;Park、2013;Khan、2009
;Pasarica、2009)。これらの発見は、血中エンドトロフィンのレベルは、
代謝機能障害を有する患者、特に2型糖尿病を有する患者を分類および/またはモニタリ
ングするのに有用であり得ることを示唆する。
γ)のアゴニストであり、これらは広く使用され、インスリン感受性を改善し、グルコー
スレベルを低下させ、インスリンの需要を減らすそれらの能力によって2型糖尿病を治療
する(Cho、2008;Charbonnel、2010)。しかしながら、ピオグリ
タゾンなどのTZDの使用は、心不全(Home、2009)、体重増加(Takada
、2007)、末梢性浮腫(Karalliedde、2007)、および女性における
骨消失(Soroceanu、2004)などの関連有害事象(AE)によって実質上制
限されている。PPARγアゴニストのAEを最少にするための試みでは、一部のPPA
Rγ下流シグナルのみを誘発するPPARγの部分的活性化剤であるバラグリタゾンなど
が開発されている(Berger、2005;Agrawal、2012)。このような
部分的アゴニストによって、少ないAEで優れた糖制御が実現する(Larsen、20
08)。治療応答者を最適に定義し得る血清バイオマーカーは、このようなグリタゾンの
有効性と安全性をさらに改善する可能性がある。
この度開発した。本発明者らは、このキット、およびそれを用いて測定する反応性を本明
細書において「Pro−C6」と呼ぶ。
ク質再編成断片のバイオマーカーにより全身で評価したECM再編成は、疾患活動性が高
いCOPDの増悪中に加速されることも立証した。
よって2つのインスリン増感剤(バラグリタゾンとピオグリタゾン)に対する応答を予測
し、副作用を低減し、PPARγアゴニスト治療の恩恵を受ける2型糖尿病を有する患者
を特定できることも立証した。
応性がある免疫学的結合パートナーを提供する。
OOH中に含まれる前記C末端エピトープと特異的に結合することが好ましい。
疫学的結合パートナーは、以下でさらに説明するような結合特異性を有する抗体断片であ
ってよい。
C末端アミノ酸配列が伸長されたもの(伸長型のアミノ酸配列)を認識しないかまたはそ
れと結合しないことが好ましい。
端アミノ酸配列が切り詰められたもの(切断型のアミノ酸配列)を認識しないかもしくは
それと結合しない(またはさらに認識しないかもしくはそれと結合しない)ことが好まし
い。
和性および/または切断型のアミノ酸配列...KPGVISVMG−COOHに対する
前記抗体の親和性に対する、アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOHに対す
る前記抗体の親和性の比は、1に対して10より大きいことがさらに好ましい。
和性に対する、アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOHに対する前記免疫学
的結合パートナーの親和性の比は、好ましくは1に対して10より大きく、好ましくは1
に対して50より大きく、好ましくは1に対して100より大きく、好ましくは1に対し
て500より大きく、好ましくは1に対して1000より大きく、最も好ましくは1に対
して10,000より大きい。
親和性に対する、アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOHに対する前記免疫
学的結合パートナーの親和性の比は、1に対して10より大きく、好ましくは1に対して
50より大きく、好ましくは1に対して100より大きく、好ましくは1に対して500
より大きく、好ましくは1に対して1000より大きく、最も好ましくは1に対して10
,000より大きい。
のイムノアッセイの方法であって、前記VI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトープを
含む試料と前に記載した免疫学的結合パートナーを接触させるステップと、前記免疫学的
結合パートナーの結合の量を決定するステップを含む方法を含む。
中に含まれることが好ましい。
定量化するために使用してもよい。
疫吸着アッセイ(ELISA)などのサンドイッチアッセイであってよい。
エピトープの量と前記VI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトープの標準正常値を関連
付けて、正常レベルからのその変化を評価するステップをさらに含むことができる。
末端アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOH中に含まれるエピトープを含む
VI型コラーゲンα3断片のレベルの測定値を得るために、前に記載した方法によりアッ
セイを実施するステップを含む方法を含む。
型コラーゲンの分解のバイオマーカーの測定レベルと比較する指標を作成するステップを
さらに含むことができる。このような分解のバイオマーカーは、MMP分解VI型コラー
ゲンの断片であってよい。Veidal 2011中およびWO2010/115749
中に記載されたように、このようなアッセイはN末端配列YRGPEGPQGP...に
対する抗体反応性に基づくものであってよい。
ラーゲンペプチドバイオマーカーの調節を調べており、COPD増悪事象においてこれら
のバイオマーカーを同様に試験した。
固定し、次に通常の身体活動により再可動させた。両群共に固定状態中に筋肉の量と強度
が消失し、安静群より対照群において、よりわずかに消失した。両群共に再可動中に筋肉
の量と強度が回復した。
発明のVI型コラーゲンバイオマーカー(PRO−C6)は、一時的にある程度類似した
パターンを示す。本発明のそれは固定開始後当初はわずかに下降する一方で、PRO−C
3とPRO−C6はいずれも経時的に固定期間と共に最終的に増大する。
いてRVE群より対照において高い増大、次に両バイオマーカーにおけるベースラインへ
の回復を観察することができる。
てわずかに上昇し、群間で有意な差はない。
した再編成のバイオマーカーであるとみなすことができる。ベースラインでの低いPRO
−C6は、回復と消失両方のLBMの変化の影響をより受けやすい表現型と関連がある。
したがって、この配列に関するアッセイを使用して、不本意な固定状態、例えば入院の影
響を特に受けやすい個体、筋肉消失のリスクが高い個体を確認することができ、したがっ
てLBM消失に対処する治療決定をすることができる。
する治療薬候補の有効性に関する情報を与えるために、このアッセイを使用することがで
きる。
患者がその状態のより急速な悪化を被る可能性があるかに関して予後予測を与えるために
使用してもよく、それによって彼らは臨床試験に移行するのにより適した患者となり得る
。
ゾンまたはピオグリタゾン)などのインスリン増感剤に対する応答を予測するために使用
することもできる。本発明のバイオマーカーはインスリン増感剤に最適に応答し得る患者
の確認およびモニタリングを可能にし、これによって2型糖尿病および/または非アルコ
ール性脂肪性肝炎(NASH)の治療におけるPPARγアゴニストのベネフィットリス
ク比を改善する。これに関連して、本発明は、インスリン増感剤で治療するのに適した対
象を確認するための方法であって、
i)本発明のPro−C6アッセイ法を使用して対象から得た生体液におけるVI型コ
ラーゲンα3鎖のC5ドメインのC末端エピトープの量を定量化するステップと、
ii)ステップi)により決定した上昇値とインスリン増感剤で治療するのに適した対
象を関連付けるステップと
を含む方法をさらに提供する。
C末端エピトープ、好ましくはC末端アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COO
H中に含まれるC末端エピトープの量を決定するためのアッセイキットであって、本発明
の免疫学的結合パートナー、および、以下の少なくとも1つ:
ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレート
前記抗体と反応性があるペプチド、これは、ビオチニル化ペプチドであるビオチン−L
−KPGVISVMGT−COOH(Lは任意選択のリンカー)であってよい、
任意選択的に、サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するためのビオチニル化二次
抗体
C末端配列...KPGVISVMGT−COOHを含むキャリブレーターペプチド
抗体HRP標識キット
抗体放射標識キット
アッセイ視覚化キット
を含む、アッセイキットを提供する。
ローナル抗体、ならびにFabまたはF(ab’)2などの抗体の特異的結合断片も含む
。したがって、前記免疫学的結合パートナーは、特異的結合親和性を有するモノクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体の断片であってよい。
本発明者らは、免疫原性ペプチドとしてVI型コラーゲンα3鎖の末尾10アミノ酸(
3168’KPGVISVMGT’3177)を使用して特定のエピトープに対するモノ
クローナル抗体を作製した。モノクローナル抗体開発に使用した方法は以前に記載された
通りであった(Barascuk)。簡単に言うと、4〜6週齢のBalb/Cマウスを
、200μlの乳化抗原および60μgの免疫原性ペプチドを用いて皮下免疫処置した。
安定した血清力価レベルに達するまで、連続免疫処置を2週間間隔でフロイント不完全ア
ジュバントにおいて実施し、2回目の免疫処置マウスから採血した。それぞれの採血時に
、血清力価を検出し、最大抗血清力価および最良天然反応性を有するマウスを融合用に選
択した。選択したマウスは1カ月間休養させ、次いで細胞融合用の脾臓を単離する3日前
に、100μlの0.9%塩化ナトリウム溶液に溶かした50μg免疫原性ペプチドを用
いて静脈内追加抗原刺激した。
をSP2/0ミエローマ融合パートナー細胞と融合させた。融合細胞は96ウェルプレー
ト中で培養し、CO2インキュベーター中でインキュベートした。ここで、標準限界希釈
法を使用してモノクローナル抗体の増殖を促進した。選択ペプチドに特異的であり伸長型
のペプチド(KPGVISVMGTA、Chinese Peptide Compan
y、中国)または切断型のペプチド(KPGVISVMG、American Pept
ide Company、米国)のいずれとも交差反応性がない細胞株を選択しサブクロ
ーニングした。最後に、IgGカラムを使用して抗体を精製した。
アッセイ開発に使用したELISAプレートは、Roche製のストレプトアビジンで
コーティングされたプレート(cat.:11940279)であった。全てのELIS
Aプレートは、Molecular Devices製(CA、米国)の、Spectr
aMax M、ELISAリーダーで分析した。本発明者らは、製造者(Innovab
ioscience、Babraham、Cambridge、英国)の説明書に従い、
Lightning link HRP標識キットを使用して、選択したモノクローナル
抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)により標識した。96ウェルのス
トレプトアビジンプレートは、コーティングバッファー(40mMのNa2HPO4、7
mMのKH2PO4、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、0.1%のTwee
n20、1%のBSA、pH7.4)中に溶かしたビオチニル化合成ペプチド:ビオチン
−KPGVISVMGT(Chinese Peptide Company、中国)で
コーティングし、20℃で30分間インキュベートした。20μLの標準ペプチドまたは
インキュベーションバッファー(40mMのNa2HPO4、7mMのKH2PO4、1
37mMのNaCl、2.7mMのKCl、0.1%のTween20、1%のBSA、
5%のLiquidII、pH7.4)中に希釈した試料を適切なウェルに加え、次いで
、100μLのHRP結合モノクローナル抗体10A3を加え、4℃で21時間インキュ
ベートした。最後に、100μLのテトラメチルベンジニジン(TMB)(Kem−En
−Tec cat.438OH)を加え、プレートは暗所において20℃で15分間イン
キュベートした。前述の全てのインキュベーションステップは300rpmでの振とうを
含んでいた。それぞれのインキュベーションステップ後、プレートは洗浄バッファー(2
0mMのTris、50mMのNaCl)により5回洗浄した。TMB反応は100μL
の停止溶液(1%H2SO4)を加えることによって停止させ、450nmおよび参照と
しての650nmで測定した。
検出下限(LLOD)を21のゼロ試料(すなわちバッファー)から決定し、平均+3
×標準偏差として計算した。アッセイ内変動とアッセイ間変動は、各実験が試料の二重測
定からなる、8QC試料の12の個別の実験により決定した。希釈回収率は4血清試料お
よび4ヘパリン血漿試料において決定し、100%試料から希釈した試料の回収率として
計算した。
<ベルリン床上安静試験におけるPro−C3、C6Mアッセイの測定>
α3鎖のC末端のレベルは、新たに形成される成熟VI型コラーゲンのレベルを反映す
ると予想される。VI型コラーゲンの合成を調べるため、本発明者らは、α3鎖のC末端
を標的化する前述のPro−C6−ELISAキットを開発した。さらに、VI型コラー
ゲンはMMPの基質でもある(Veidal 2011)。以前の試験は、MMP−2と
MMP−9の両方が筋萎縮と関係があることを示した(Reznick 2003および
Giannelli 2005)。したがって、MMP−2およびMMP−9によって生
成するVI型コラーゲン分解断片がこのようなプロセスにおける関心対象となる。
び再可動を使用し、ベルリン床上安静試験でIII型およびVI型コラーゲンの代謝回転
を直接測定する以下の3つのバイオマーカー:(C末端α3(VI)鎖を測定する)Pr
o−C6、および(MMP−2およびMMP−9によって分解されるVI型コラーゲン断
片を測定する)C6M(Veidal 2011)、および(III型コラーゲンの真の
合成を測定する)Pro−C3(Nielsen)を測定した。
びBelavy 2009)。簡単に言うと、20人の健康な若い男性を動員し、厳密な
8週間の床上安静試験を施した。次いで20人の若い男性をランダムに2群に分けた。抵
抗性振動療法エクササイズ群(RVE)群には、1週間毎に11回の抵抗性振動療法エク
ササイズを割り当てた。抵抗性振動療法エクササイズは、ベッド端で振動療法エクササイ
ズ器具により、ウエストおよびショルダーストラップ、ならびにプレートに対象を引き寄
せるためのハンドルを備える振動プレートに対象を引き寄せることによって実施した。対
照群(CTRL)には、8週間の床上安静中いかなるエクササイズも実施させなかった。
試験2日前(BDC−2)、床上安静期間中(BR+)および後の回復期(R+)に血清
試料を得た。血清試料は、さらなる測定まで−80℃で保存した。両群の筋肉量は、この
3期間中にMRIとDXAによって評価した。
lsen 2013およびKuo 1997)。Pro−C3アッセイは、III型コラ
ーゲンのプロペプチド断片のレベルを測定する。C6Mアッセイは、成熟VI型コラーゲ
ンのMMP分解断片を測定する。簡単に言うと、Pro−C3アッセイでは、96ウェル
のストレプトアビジンプレートをビオチニル化合成ペプチドでコーティングし、20℃で
30分間インキュベートした。20μLの標準ペプチドまたは1:2に希釈した血清試料
を適切なウェルに加え、次いで、100μLのHRP結合モノクローナル抗体NB61N
−62を加え、4℃で20時間インキュベートした。最後に、100μLのTMBを加え
、プレートは暗所において20℃で15分間インキュベートした。TMB反応は100μ
Lの停止溶液(1%H2SO4)を加えることによって停止させ、450nmおよび参照
としての650nmで測定した。C6Mアッセイでは、ビオチニル化合成ペプチドを96
ウェルのストレプトアビジンプレートにコーティングする。20μLの標準ペプチドまた
は1:2に希釈した血清試料、次いで、100μLのHRP結合モノクローナル抗体を加
え、20℃で1時間インキュベートした。TMBによる発色後、プレートを読み取った。
選択した抗体10A3は、C末端のCOL6A3の末尾の10アミノ酸:3186’K
PGVISVMGT’3177を特異的に認識したが、伸長型のペプチドKPGVISV
MGTAも切断型のペプチドKPGVISVMGも認識しなかった(図1)。選択した抗
体の天然反応性は、ヒト血清プールおよびヒト羊水プールを使用して評価した。競合EL
ISAでは、血清と羊水の両方によりシグナルが部分的に阻害された(図2、パネルA)
。この抗体が10kD付近のバンドを認識し、一方で標準ペプチドの存在下でシグナルが
完全に遮断された結果を、ウエスタンブロットにより確認した(図2、パネルB)。
LISAの測定範囲をLLODおよびULODによって決定した。アッセイ間変動とアッ
セイ内変動はそれぞれ15.2%と4.8%である。ヒト血清およびヘパリン血漿におけ
る希釈回収率はいずれも100±20%内であった(表1)。ヘパリン血漿、クエン酸血
漿およびEDTA血漿のそれぞれとヒト血清間の相関関係は比較的高く(図3、p<0.
0001)、これは異なる血液調製法にもかかわらずPro−C6レベルが一定であった
ことを示した。
た。測定した濃度と希釈倍率とをかけることにより希釈回収率を得て、非希釈(開始)試
料の濃度の割合として表した。この表は、シグナルは直線的に弱まり+/−20%内およ
び8倍希釈範囲内に留まることを示す。
ベルリン床上安静試験(BBR)において測定した前述の3バイオマーカーのレベルは
図4中に見られる。時間地点「BR」は床上安静固定の時間地点を表し、時間地点「R」
は再可動の時間地点を表す。接尾の数字は床上安静または再可動期間までの日数を表す。
「a」はベースラインとの有意差を表し、「b」は固定期間の最終時間地点との有意差を
表す。データは平均+/−SEMとして表す。
らBR12までベースラインと有意に異なる、全時間地点に関してp<0.004)、次
に固定の最後の増大(BR40がベースラインと有意に異なる、p=0.05)という形
での有意な時間効果を示した。興味深いことに、再可動の開始時に、初期減少(時間地点
R3〜R28がベースラインより有意に高い、全時間地点に関してp<0.03、かつR
3が固定の最終時間地点、BR56より有意に高い、p=0.02)、次に増大で同様の
パターンを観察することができた。最後の2箇所の時間地点、再可動開始後13週で、バ
イオマーカーレベルはベースラインに戻った。有意な群間の差も、有意な時間*治療相互
作用効果もなかった。
比較したところ、本発明者らは、PRO−C3の個々のレベルはベースラインでLBMと
有意に相関関係があったことを発見した(R2=0.2869、R=0.536、p=0
.0149)。さらに本発明者らは、BR47におけるそのピークでのバイオマーカーの
レベルは、固定状態中に失われたLBMの量と有意に相関関係があったことを発見した(
R2=0.2056、R=0.453、p=0.0447)。
増大し(有意な時間効果、p<0.0001)、固定の最後の数週間にはベースラインよ
り約30%高いピークレベルに達した(BR19からR28までベースラインより有意に
高かった、BR47でピーク、p=0.0002)。固定期間中、群間の差はなかった(
有意な治療効果または治療*時間相互作用もなかった)。
でピークに達した増大(固定最終日、BR56と比較して20%の増大、p=0.011
)、次にベースライン値への段階的回復の型であった。R7時間地点での大きな変動が原
因で、相互作用効果は如何なる事後検定においても表面化しなかった。
比較したところ、本発明者らは、PRO−C6のレベルはLBMと全く関係なかったが、
固定中のLBMの変化とプラスの関係があり、PRO−C6の高レベルはLBMの消失の
少なさと関連があることを意味することを発見した(R2=0.2794、R=0.52
9、p=0.0166)。本発明者らは、PRO−C6は再可動中に(再)回復するLB
Mの量とマイナスの関係があり、高レベルは再可動中のLBMの(再)回復の少なさと関
連があることを意味することも発見した(R2=0.3365、R=0.580、p=0
.0073)。
の時間効果なし)、再可動の初期に30〜40%一時的に増大した(p<0.0001で
固定期間中に有意な時間効果)。固定中に治療効果はなく、C6Mシグナルの増大はRV
E群中よりCTRL群中で大きかったようであるが、これが有意な状態に達することはな
かった(時間*治療相互作用が有意な状態に達することはなく、したがって事後検定は行
わなかった)。これらの群間に差はなかった。
比較したところ、本発明者らは、PRO−C6のレベルはLBMと全く関係なかったが、
固定中の筋肉消失とプラスの関係があり(R2=0.2794、R=0.529、p=0
.0166)、再可動中の筋肉量の(再)回復とマイナスの関係があったことを発見した
(R2=0.3365、R=0.580、p=0.0073)。
ーであるとみなされる。ベースラインでの低いPRO−C6は、回復と消失両方のLBM
の変化の影響をより受けやすい表現型と関連がある。
<試験設計>
医療コンサルタントによって2011年および2012年中にCOPD増悪であるとみ
なされた病院に入院中の患者を、入院の24時間以内に動員した。血液試料を増悪時と回
復時に回収し、4週間のフォローアップ往診を入院後平均30日実施した(IQR28〜
34)。フォローアップ往診時に、標準的な気管支拡張後肺活量測定を患者に施し、6分
間歩行距離(6MWD)試験を実施した。患者の報告された測定値は、フォローアップ往
診時の、医学研究審議会(Medical Research Council)(MR
C)の呼吸困難スケールを使用した呼吸困難のアセスメント、および喫煙歴を含んでいた
。
結果を用いた。肺炎に関する医師の診断結果または放射線痕跡は除外基準であった。この
試験は、フォローアップ往診時に確認した気道閉塞(0.7未満の1秒間努力呼気量(F
EV1)と努力肺活量(FVC)の比)を有する69の患者をペア試料で含んでいた。
血清およびヘパリン血漿試料は分析するまで−80℃において保存した。C3M、C4
M、Pro−C3、P4NP7S、ELM7、およびEL−NEを血清において測定し、
一方C6M、Pro−C6、およびVCANMをヘパリン血漿において測定した。細胞外
マトリックス再編成を評価するためこの試験において使用した、アッセイの概要を表4中
に表す。
り、関連マトリックス、すなわち血清(C3M、C4M、Pro−C3、P4NP7S、
ELM7、EL−NE)またはヘパリン血漿(C6M、Pro−C6、VCANM)にお
ける健常集団のバイオマーカーレベルを指す。SD、標準偏差。MMP、マトリックスメ
タロプロテイナーゼ。
)で以前の喫煙者であった(55%)。彼らは平均[IQR]3[2〜6]日入院し、フ
ォローアップ往診は入院後30[28〜34]日で実施した。
質断片の循環レベルを表6中に表す。
平均[95%信頼区間]および対応するP値として表す。
6M)、およびエラスチン(ELM7とEL−NE)の分解断片は、フォローアップ時と
比較して増悪時に有意に増大した(全てP<0.0001、図5、パネルAとB)。対照
的に、ベルシカン分解の断片(VCANM)は有意に減少した平均レベルを増悪時に示し
た(P<0.0001、図5、パネルB)。タンパク質形成と関係した断片のレベルは、
フォローアップ時と比較して増悪時に、III型コラーゲンに関しては有意に変化しなか
ったが、IV型コラーゲンに関しては増大し(P<0.0001)VI型コラーゲンに関
しては減少した(P<0.0001)(図5、パネルC)。タンパク質断片の循環レベル
に対する喫煙の影響を調べるため、現在および以前の喫煙者に分析を個別に実施し、結果
は類似していた(データ示さず)。
関する断片の分解と形成の間の比を計算することによって調べた(図6)。平均分解/形
成比[95%CI]は、III型コラーゲン(2.33[2.03〜2.66]対1.7
2[1.51〜1.96]、P<0.0001)およびVI型コラーゲン(3.61[2
.86〜4.56]対2.00[1.64〜2.44]、P<0.0001)に関して増
悪時に有意に増大した。対照的に、IV型コラーゲンの分解/形成比は増悪時に0.18
[0.17〜0.20]であり、フォローアップ時は0.20[0.19〜0.22]に
増大した(P=0.0008)。
−C3(ρ=−0.357、P=0.010)、およびPro−C6(ρ=−0.338
、P=0.017)とマイナスの関連があった。年齢はC6M(ρ=−0.249、P=
0.039)およびPro−C6(ρ=−0.310、P=0.026)とマイナスの関
連があった。喫煙年数、MRCスコア、入院の長さ、喀痰生成、または白血球細胞数との
関連は見られなかった。Pro−C3のレベルはFEV1予想値%(予想%)およびFV
C予想%とプラスの関連があり、これらは年齢、性別、BMI、喫煙年数、および喫煙状
態の補正後依然として有意であった(表4)。6MWDはC3M、C4M、C6M、およ
びP4NP7Sとマイナスの関連があった(表4)。年齢、性別、BMI、喫煙年数、お
よび喫煙状態の補正後、C3MおよびC6Mとの関連は依然有意であったが、一方C4M
はボーダーラインでは有意であり、P4NP7Sは有意ではなかった(表7)。
すマーカーに関する多変量相関係数を括弧内に記載する。多変量線形回帰解析は、他の注
釈変数として年齢、性別、BMI、喫煙年数、および喫煙状態を含んでいた。有意性レベ
ル:ΣP<0.07、*P<0.05、**P<0.01。FEV1、1秒間努力呼気量
。%pred、予想値の割合。FVC、努力肺活量。6MWD、6分間歩行距離。
または内部タンパク質配列のいずれかを対象とするモノクローナル抗体を利用した。この
試験中で使用したアッセイの概要およびそれらの技術仕様は表4中に与える。全ての試料
は各アッセイの定量化範囲内で測定し、検出下限(LLOD)未満の値を有する任意の試
料にLLODの値を割り当てた。
編成は、疾患活動性が高いCOPDの増悪中に加速されることを立証する。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ(PPARγ)の完全アゴニストを用いた糖尿
病患者の治療は、インスリン感受性を改善するが、体重増加、心不全、末梢性浮腫、およ
び骨消失と関連がある。VI型プロコラーゲンのα3鎖のC末端断片(Pro−C6とも
呼ばれる)であるエンドトロフィンは、脂肪組織マトリックス再編成と代謝制御の両方に
関与する。本発明者らは、この新規なアディポカインがPPARγアゴニストに最適に応
答する2型糖尿病(DM2)患者を確認することができ、リスクベネフィット比を改善し
得るかどうか評価するための、エンドトロフィンに関する血清アッセイを確立した。
BALLETS(Birmingham and Lambeth Liver Ev
aluation Testing Strategies)試験は、安定的インスリン
療法での2型糖尿病を有する対象における6カ月のバラグリタゾンまたはピオグリタゾン
治療の有効性と安全性を決定するための、フェーズIIIの、ランダムな、二重盲検、並
行群、プラセボおよび活性コンパレーター対照臨床試験であった。そのベースライン統計
データ、CONSORTダイアグラム、ならびに有効性および安全性データは以前に公開
されている(Henriksen、2011)。本発明の試験では、本発明者らは、以前
に記載されたように(Henriksen、2011)均一に4群に分散させた299対
象(プラセボ、2用量のバラグリタゾン、および1用量のピオグリタゾン)からなるBA
LLETS試験の集団をプロトコール毎に使用し、いずれもベースラインおよび最大6個
のフォローアップパラメーターは療法下で血糖制御およびPro−C6決定と関係があっ
た。
この統計解析は、血清中Pro−C6のベースライン測定値を有する集団由来の対象を
プロトコール毎に含んでいた。それらのベースラインPro−C6値に基づいて、3つの
三分位値の1つに対象を分類した。三分位値1は6.2ng/mL以下のベースライン血
清中Pro−C6を有する対象を含み、三分位値2は6.3ng/mL〜7.7ng/m
Lのベースライン血清中Pro−C6を有し、および、三分位値3は7.8ng/mL以
上のベースライン血清中Pro−C6を有していた。3つの小群間のベースライン特性は
分散分析(ANOVA)によって比較し、それぞれの三分位値における性別の割合の比較
はフィッシャーの正確検定によって比較した。
SG)、血中HbA1c、体格指数(BMI)、ならびにインスリン抵抗性(HOMA−
IR)および脂肪肝指数(FLI)の誘導パラメーターのベースラインレベルで実施した
。HOMA−IRは血清中グルコースおよびインスリンを含めた恒常性モデルアセスメン
ト(Feigh、2011)に従い計算し、FLIは(Bedogni et al、2
006によって記載されたように)以下の等式を使用して計算した。
つの三分位値のそれぞれにおいて時間と治療の関数として試験した。最小二乗平均(LS
平均)および標準誤差を、従属変数としてベースラインからの変化を用いた混合効果反復
測定モデル(ベースラインレベル、往診(治療12週後)および治療終了時(26週後)
、ならびに、ベースラインレベル対往診および治療終了時対往診の相互作用(固定された
効果)、ならびに、対象に対する無構造の共分散構造分析)から推測した。
下面積として計算し、LS平均および標準誤差は、従属変数として平均変化、共分散分析
値としてベースラインレベル、および一定効果として治療値を用いた共分散分析モデル(
ANCOVA)から推測した。各々の活性治療群内のそれぞれの三分位値をプラセボ群と
比較し、有意性のレベルはダネットの多重比較法で調節した。ベースラインからの平均変
化が0と異なったかどうかのアセスメントはLS平均の標準誤差に基づいた。
ClinicalTrials.govの識別番号NCT00515632で登録されて
いる。
血清中エンドトロフィンは代謝パラメーターと相関関係がある
BALLET試験における代謝パラメーターおよび安全性データによって評価した治療
の有効性は以前に公開されている(Henriksen、2011)。メタボリックシン
ドローム関連パラメーターとエンドトロフィンのベースライン相関関係は表8中に表す。
有意に相関関係があったが、FSGおよびHbA1cとは相関関係がなく、この結果は、
実際にエンドトロフィンが脂肪細胞機能、脂肪量、およびインスリン感受性の幾つかの態
様と関係があるアディポカインであることを支持した。エンドトロフィンレベルは、コレ
ステロールレベルまたは肝臓酵素とは相関関係がなかった。
ラメーターの間の相関関係が維持された(表9、10A)。しかしながら、いずれかのP
PARγアゴニストで治療した群では、HOMA−IRとエンドトロフィンの間の相関関
係は失われ、一方でエンドトロフィンとBMIまたはFLIの間の相関関係は継続し、さ
らに強くなる傾向さえ示した(表10B〜C)。
体重およびBMIは、全4治療群中で下部三分位値より上部三分位値において高かった
(表1)。治療群間でグルコース恒常性の差は見られなかった。
較したエンドトロフィンの2つの上部三分位値においてのみであるが、プラセボと比較し
て全3治療群中で低下した(図7A〜F)。
ると(図8、左側のパネル)、FSGの減少は大きく(約2.5mM)、下部三分位値と
比較すると2つの上部三分位値において統計的に有意であり、この場合ベースラインと比
較した減少は全治療群にわたり有意ではなかった。同様にHbA1cに関して(図8、右
側のパネル)、26週間の治療期間中のエンドトロフィンレベルの平均絶対変化は、いず
れもプラセボおよびベースラインレベルと比較したところ、下部三分位値ではなく2つの
上部三分位値においてのみ有意であった。療法に対する応答性を調べたところ、ベースラ
イン血清中エンドトロフィンの2つの上部三分位値における患者は、グリタゾン療法に対
して臨床上有意な応答を示す可能性が著しく高かった。これらの患者において、1%超お
よび0.5%超のHbA1cの減少に関するオッズ比はそれぞれ4.1(p<0.001
)および4.3(p<0.001)であった(図9)。療法下において(HOMA−IR
により)インスリン感受性の変化を評価したところ、エンドトロフィンの上部三分位値に
おける対象は最高の改善を再度示し(図10A〜C)、最大三分位値は統計的有意性をわ
ずかに欠いていた。興味深いことに、療法の様々な有効性にもかかわらず、エンドトロフ
ィンレベルの三分位値の間に体重増加の顕著な差はなかった(データ示さず)。
めの)治療と時間の関数としての血清中エンドトロフィンに対する影響を図11中に示す
。エンドトロフィンのレベルは2つの最低三分位値に関してプラセボ群と治療群の両方で
増大したが、最高三分位値では増大しなかった。
下肢浮腫は、水の移動が原因の体積増大として測定したところ、ベースライン血清中エ
ンドトロフィン三分位値と相関関係があった。グリタゾン療法は下部および中間三分位値
において下肢体積の増大をもたらしたが、一方で上部三分位値では治療群とプラセボ群の
間に差はなかった(図12)。血清中エンドトロフィンの異なる三分位値におけるAEお
よび重症AE(SAE)は表11中に表す。エンドトロフィンレベルに従い階層化したと
ころ、3つの異なる治療群においてAEまたはSAEの発生の有意な差はなかった。表1
1中のSAEと図12中に報告した下肢浮腫の間の差は、定量測定値である下肢体積と患
者の報告されたアウトプットである浮腫の報告値の関数である(図10)。
血清中エンドトロフィン(Pro−C6)によって、2型糖尿病患者において、インス
リン増感剤、ピオグリタゾンおよびバラグリタゾンに対する応答を予測した。したがって
、2つの上部三分位値におけるPro−C6血清中レベルを有する患者は、下部三分位値
における患者と比較したところ4倍を超える治療応答性を有する可能性がある。グリタゾ
ンは非致死性心不全および骨折などの安全問題と関連があるので、最少AEで最も治療効
果を得る最適応答者の確認は、依然として非常に有効なインスリン増感剤と考えられるこ
れらの薬剤を、継続して使用するのに重要である。ちょうど一致して、FPGおよびHb
A1c三分位値の減少に応答した上部三分位値におけるベースラインPro−C6の患者
は、グリタゾン治療に関する主要AEの1つである下肢浮腫の増大を発症しなかった。こ
れらの有効性と安全性を組合せたデータは、グリタゾンで治療した患者に関する副作用を
予想する改善利点と非常に関連があり、これは患者の他の徴候を再考慮する際にも当ては
まるはずであり、特に非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の治療が考えられる。
びついた脂肪組織における前炎症状態および線維症の誘導を介して誘導される可能性が高
い。したがって、その抑制によってインスリン感受性が改善され脂肪組織炎症を弱め(S
un、2014)、これは血清中エンドトロフィンレベルの上昇はPPARγアゴニスト
に対する応答を示すものであるという、本発明者らの発見とよく相関する。さらに、エン
ドトロフィン前駆体、プロコラーゲンα3(VI)のmRNAレベルは肥満脂肪組織にお
いて上方制御され、脂肪組織炎症と線維症が再度平行し、一般に脂肪細胞と脂肪組織のモ
ジュレーターとしてのVI型プロコラーゲンの重要な役割を支持する(Dankel、2
014)。ECMおよび特にVI型プロコラーゲンおよびエンドトロフィンは、脂肪性肝
疾患およびその重症型、NASH、2型糖尿病と少なくとも部分的な重複を示す肝臓の代
謝障害・線維症と非常に関連があり得る。したがって本発明者らは、この新規なバイオマ
ーカーは、インスリン抵抗性と肝臓線維症の両方の治療を要するサブ集団においてインス
リン増感剤が有用であり得、NASH患者の診断および管理においても役立つと予想する
。ここで、線維症NASHを明らかにするためには、ECM、特にコラーゲン/VI型コ
ラーゲン、および脂肪肝への移行におけるそれらの機能的役割をさらに調べる必要がある
。これと一致して、本発明の試験において本発明者らは、NASH炎症活性と相関があり
重症度の肝臓線維症を予測するFLI指標と、血清中トリグリセリドとの強い相関関係を
観察した(Bedogni、2006)。NASH関連線維症におけるVI型コラーゲン
の役割を支持するに際して、従来の試験は活性化瘢痕形成領域におけるその顕著な発現を
実証し(Burt、1990;Griffiths、1992)、(エンドトロフィンド
メインを欠く)VI型コラーゲンコア構造の血清中レベルの増大はげっ歯類(Veida
l、2011)および患者(Lebensztejn、2006;Stickel、20
01)における進行した肝臓線維症、および門脈圧の上昇と関連があることが示されてい
る(Leeming、2013)。プロコラーゲンα3(VI)の発現はPPARγによ
って制御され、これは本発明者らの発見とちょうど一致する。実際、プロコラーゲンα3
(VI)のmRNAは、PPARγに対するsiRNAで処理した脂肪細胞培養物におけ
るそのmRNAの増大、および、PPARγアゴニストであるピオグリタゾンで治療した
2型糖尿病患者(特に高いベースライン組織レベルのプロコラーゲンα3(VI)mRN
Aを有する患者)の皮下脂肪組織におけるその転写産物の減少により実証されたように、
PPARγによって抑制される。これらのデータによって、ベースラインから治療終了ま
での、エンドトロフィン/Pro−C6血清中レベルとHbA1cまたはHOMA−IR
の間の相関関係の変化、特にグリタゾン治療後のエンドトロフィンと代謝パラメーターの
間の相関関係の欠如を部分的に説明することができる。したがって、末梢脂肪組織におい
て(プロコラーゲンα3(VI)mRNAにより測定した)エンドトロフィン前駆体の発
現は、重度に肥満の、インスリン抵抗性患者においてBMIまたは全体脂肪量に依存しな
かった。別の臨床試験では、肥満対象における組織エンドトロフィンレベルは慢性炎症お
よび全身インスリン抵抗性と相関関係があった(Park、2013)。プロコラーゲン
VI、脂肪組織線維症およびグルコース感受性の低下の間の直接的関連のさらなる証拠は
、白色脂肪組織中コラーゲンVIの不在下での(機能性レプチン遺伝子を欠く)ob/o
bマウスにおける試験によって与えられる。これらのマウスは、脂肪組織線維症および炎
症の不在下で有意に改善されたインスリン感受性を有していた(Khan、2009)。
初見では、これらのデータは、本発明者らの試験において見られた血清中エンドトロフィ
ンとBMI、FLI、およびHOMA−IRの間の強い相関関係と矛盾するようである。
しかしながら、タンパク質分解によるアディポカインエンドトロフィンの生成に関する充
分な前提条件ではなく、プロコラーゲンVIの存在のみが必要である。したがって、エン
ドトロフィン生成プロテアーゼを同定すること、およびその上流制御を特徴付けることは
興味深い。さらに、レプチンはVI型プロコラーゲンの発現を誘導し、これはレプチン抵
抗性、代謝機能障害、およびエンドトロフィンの間の関連をさらに支持する。
I型コラーゲンは、ベスレムミオパチー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、手足
−肢帯筋ジストロフィー、および常染色体劣性筋硬化症などの筋肉障害を引き起こし、そ
の3構成鎖をコードする遺伝子COL6A1、COL6A2、およびCOL6A3の突然
変異によって大部分が認識されている(Lampe、2005;Bonaldo、199
8;Bushby、2014)。これは代謝機能障害との興味深い関連をもたらす。筋肉
はインスリン抵抗性の重要なレギュレーターとなるからである。したがって、全ての利用
可能な証拠は、VI型コラーゲンは不活化ECM成分を超えるものであり、インスリン抵
抗性と関連した脂肪(および肝臓)代謝機能障害、2型糖尿病、およびNASHの重要な
メディエーターであることを強く示唆する。
スリン抵抗性に対して上昇し、インスリン増感剤に対する応答性を予測するものである。
これによってインスリン増感剤に最適に応答し得る患者を確認およびモニタリングするこ
とができ、このことが2型糖尿病およびおそらくNASHの治療においてPPARγアゴ
ニストのベネフィットリスク比を改善する。
適合することを必要とする演算子「排他的論理和(exclusive or)」と対照的に、言及す
る条件の一方もしくは両方が適合するとき真の値に戻る演算子の意味で使用する。語句「
含む」は、「からなる」を意味することではなく「包含する」の意味で使用する。前で承
認した全ての従来の教示は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書中の如何な
る従来公開文書の承認も、それらの教示が本明細書の日付時点でオーストラリアまたは他
の国において共通の一般知識であったことを容認または描写するものであると考えるべき
ではない。
Claims (23)
- VI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのC末端エピトープと反応性がある免疫学的
結合パートナー。 - C末端アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOH中に含まれる前記C末端エ
ピトープと特異的に結合する、請求項1に記載の免疫学的結合パートナー。 - モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項1または2に記載の免疫学的
結合パートナー。 - 前記C末端アミノ酸配列の伸長型である...KPGVISVMGTA−COOHを認
識しないかまたはそれと特異的に結合しない、請求項1〜3のいずれか1項に記載の免疫
学的結合パートナー。 - 伸長型アミノ酸配列...KPGVISVMGTA−COOHに対する前記免疫学的結
合パートナーの親和性に対する、アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOHに
対する前記免疫学的結合パートナーの親和性の比が、1に対して10より大きい、請求項
1〜4のいずれか1項に記載の免疫学的結合パートナー。 - 前記C末端アミノ酸配列の切断型である...KPGVISVMG−COOHを認識し
ないかまたはそれと特異的に結合しない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の免疫学的
結合パートナー。 - 切断型アミノ酸配列...KPGVISVMG−COOHに対する前記免疫学的結合パ
ートナーの親和性に対する、アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOHに対す
る前記免疫学的結合パートナーの親和性の比が、1に対して10より大きい、請求項1〜
6のいずれか1項に記載の免疫学的結合パートナー。 - 試料におけるVI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのC末端エピトープを検出する
ためのイムノアッセイの方法であって、前記VI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトー
プを含む試料と請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫学的結合パートナーを接触させ
るステップと、前記免疫学的結合パートナーの結合の量を決定するステップとを含む方法
。 - 前記C末端エピトープがC末端アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOH中
に含まれる、請求項8に記載の方法。 - 生体液における前記VI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトープの量を定量化するた
めに使用される、請求項8または9に記載の方法。 - 前記生体液が血清、血漿、尿または羊水である、請求項10に記載の方法。
- 前記イムノアッセイが競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項8〜1
1のいずれか1項に記載の方法。 - 前記イムノアッセイがラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、
請求項12に記載の方法。 - 前記方法によって決定した前記VI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトープの量と前
記VI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトープの標準正常値を関連付けて、正常レベル
からの変化を評価するステップをさらに含む、請求項8〜14のいずれか1項に記載の方
法。 - 細胞外マトリックスの形成率を調べる方法であって、生体液試料における請求項9で定
義したエピトープを含むVI型コラーゲンα3断片のレベルの測定値を得るために、請求
項10〜13のいずれか1項に記載の方法によりアッセイを実施するステップを含む方法
。 - VI型コラーゲンα3断片の測定レベルを、同一試料におけるVI型コラーゲンの分解
のバイオマーカーの測定レベルと比較する指標を作成するステップをさらに含む、請求項
15に記載の方法。 - インスリン増感剤による治療に適した対象を同定するための方法であって、
i)請求項10の方法に従って、対象から得た生体液におけるVI型コラーゲンα3鎖
のC5ドメインのC末端エピトープの量を定量化するステップと、
ii)ステップi)により決定した上昇値とインスリン増感剤による治療に適した対象
とを関連付けるステップと
を含む方法。 - 前記インスリン増感剤がチアゾリジンジオンである、請求項17に記載の方法。
- 前記C末端エピトープがC末端アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOH中
に含まれる、請求項17または18に記載の方法。 - 前記ステップii)の上昇値が第2または第3の三分位値の範囲内の値に相当する、請
求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ステップii)の上昇値がVI型コラーゲンのα3鎖のC末端エピトープの6.3
ng/mL以上に相当する、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。 - 生物試料におけるVI型コラーゲンα3鎖のC5ドメインのC末端エピトープの量を決
定するためのアッセイキットであって、本発明の免疫学的結合パートナー、および、以下
の少なくとも1つ:
ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレート
前記抗体と反応性があるペプチド、これは、ビオチニル化ペプチドであるビオチン−L
−KPGVISVMGT−COOH(Lは任意選択のリンカー)であってよい
任意選択的に、サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するためのビオチニル化二次
抗体
C末端配列...KPGVISVMGT−COOHを含むキャリブレーターペプチド
抗体HRP標識キット
抗体放射標識キット
アッセイ視覚化キット
を含む、アッセイキット。 - 前記C末端エピトープがC末端アミノ酸配列...KPGVISVMGT−COOH中
に含まれる、請求項22に記載のアッセイキット。
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