KR20170127015A - 만능항체 매개 바이오센서 - Google Patents

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KR20170127015A
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단 슐츠
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유니버시티 오브 매릴랜드, 발티모어
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Abstract

샘플 중의 표적 인자를 검출하는데 사용될 수 있는 신규의 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 바이오센서 세포주를 포함하는 만능 항체-매개 바이오센서를 제공한다. 상기 융합 단백질은 그의 결합 특이성에 관계없이 항체와 결합하는 세포외 항체-결합 도메인 및 항원 결합시 세포 활성화를 유도하는 신호전달 도메인을 갖는다. 상기 융합 단백질은 임의의 항체의 Fc 영역에 결합하기 때문에, 세포외 신호전달과 세포내 활성화 사이에서 만능 경로로서 작용할 수 있다. 상기 바이오센서를, 샘플 중의 선택된 항원의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다.

Description

만능항체 매개 바이오센서
서열 목록
전자(ASCII 텍스트 파일) 포맷으로 나열된 서열을 본 출원과 함께 제출하며 이는 본 명세서에 참고로 인용된다. 상기 ASCII 텍스트 파일의 명칭은 "2016_0324A_ST25.txt"이며, 상기 파일은 2016년 3월 11일자로 생성되었고; 상기 파일의 크기는 74 KB이다.
배경 기술
식품 안전성, 건강 관리, 농작물 검사, 및 관심 샘플 중의 독소, 항원, 세균 및 바이러스를 포함한 환경 및 병원성 인자의 존재를 신속하고 정확하게 식별하는 적정하고 고도로 민감한 분석을 위한 생물방어 분야의 필요성이 증가하고 있다. 이 때문에, 다양한 바이오센서 제품들이 상업적으로 개발되고 방출되었다.
현재 사용중인 바이오센서 플랫폼의 구체적인 예는 패쓰센서스 인코포레이티드(PathSensors, Inc.)의 카나리(CANARY)(등록상표) 바이오센서 기술이다. 라이더(Rider) 등[1]의 연구에 기반한 상기 플랫폼은 특정한 공기운반 및 액체-기재 병원체의 신뢰할만한 식별을 가능하게 한다. 상기 카나리(등록상표) 바이오센서의 생물학적 주쇄는 그의 동족 항원 또는 병원성 인자와 결합할 수 있는, 세포외 결합된, 항원-특이성 항체를 발현하는 유전자 조작된 B 세포를 포함한다. 상기 시스템에서, 항원-함유 샘플이 상기 바이오센서의 세포외 표면상의 항체와 상호작용하는 경우, 세포내 신호전달 캐스케이드가 활성화되어 상기 B 세포내에 Ca2+의 방출을 생성시킨다. 상기 카나리(등록상표) 시스템에서, 상기 B 세포는 Ca2+-감수성 발광단백질인 에쿼린을 발현하며, 상기 단백질은 상승된 세포내 Ca2+ 수준의 존재하에서 세포 발광을 생성시킨다. 따라서, 상기 발광을 사용하여 항원 결합을 가리킬 수 있다.
상기 카나리(등록상표) 시스템을 사용하여 세균, 바이러스 및 독소로부터의 항원을 포함하여 다수의 특이적인 항원을 효율적으로 식별할 수 있다. 그러나, 상기 항원 검사 레퍼토리의 확대는 복잡하며 비용이 많이 든다. 상이한 항원- 또는 병원체-특이성 바이오센서는 모든 선택된 항원을 인식하도록 구성되어야 하며, 이는 하이브리도마 세포주의 생성, 항체를 암호화하는 핵산 서열의 클로닝, 및 클로닝된 항체를, 상기 항체에 의한 동족 항원(예를 들어 병원체)의 결합시 발광하도록 유전자 조작된 B 세포주의 표면상에 막관통 단백질로서 발현시킴을 포함하는 다수의 단계들을 필요로 한다.
따라서, 광범위한 환경 및 병원성 인자들에 걸쳐 다중 검사 플랫폼에 사용하기에 적합할 수 있는 만능(universal) 바이오센서를 개발할 필요가 있다. 본 발명은 상기 및 다른 중요한 목적에 관한 것이다.
본 명세서는 샘플 중 표적 인자(target agent)의 검출 및 정량분석에 사용될 수 있는 만능 항체-매개 바이오센서뿐만 아니라, 선택된 표적 인자로부터 샘플을 선별하기 위한 상기 바이오센서의 사용 방법을 제공한다.
본 발명의 바이오센서는 일반적으로 신규의 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 포함한다. 상기 융합 단백질은 신호전달 도메인(예를 들어 면역글로불린-알파(Igα)의 세포내 활성화 도메인)에 융합된 항체-결합 도메인(예를 들어 Fcγ 수용체(FcγR)의 세포외 도메인)을 함유한다. 상기 N-말단의 세포외 항체-결합 도메인은 항체의 Fc 영역에 결합하는 능력을 갖는 반면, C-말단의 세포내 신호전달 도메인은 세포 과정들, 예를 들어 Ca2+ 방출을 활성화시키는 능력을 갖는다. 상기와 같은 활성화는 상기 항체-결합 도메인에 결합된 항체가 그의 동족 항원에 의해 교차결합되는 경우 발생한다.
상기 키메릭 융합 단백질의 항체-결합 도메인은 항체의 Fc 영역과 결합하기 때문에, 상기 융합 단백질에 의해 결합될 수 있는 항체는 상기 항체의 항원 특이성에 의해 제한되지 않는다. 따라서, 상기 키메릭 융합 단백질은 선택된 표적(예를 들어 항원 또는 병원성 인자)을 인식하고 상기와 결합하는 임의의 이용 가능한 항체와 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명의 바이오센서는 각각의 선택된 표적 인자에 대한 별도의 키메릭 융합 단백질을 생성시킬 필요 없이, 동일한 플랫폼을 사용하여 광범위하게 상이한 표적 인자들의 존재에 대한 신속하고 경제적인 검사 수단을 제공한다. 상기 만능 바이오센서를 상업적으로 입수할 수 있는 항체뿐만 아니라 상기 바이오센서와 사용되도록 특이적으로 생산된 항체와 함께 사용할 수 있다.
융합 단백질
첫 번째 실시태양에서, 본 발명은 Fcγ 수용체(FcγR) 항체-결합 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 그의 항체-결합 도메인을 통해 항체의 Fc 영역을 인식하고 상기 영역과 결합하는 능력을 갖는다. 상기 융합 단백질은 또한 상기 융합 단백질을 발현하는 세포에서 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 능력을 갖는다. 몇몇 태양에서, 상기 세포내 신호전달 캐스케이드는 상기 세포내에 C2+의 방출을 생성시킨다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 FcγR 항체-결합 도메인은 서열번호 1 또는 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 1 또는 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체(variant)이다. 상기 실시태양의 몇몇 다른 태양에서, 상기 FcγR 항체-결합 도메인은 서열번호 2 또는 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 2 또는 4의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 서열 변이체는 상기가 기본으로 하는 항체-결합 도메인의 항체-결합 활성을 유지한다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 5에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 실시태양의 몇몇 다른 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 6에 제시된 부분 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 서열 변이체는 상기가 기본으로 하는 신호전달 도메인의 신호전달 활성을 유지한다.
선택된 태양에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 8에 제시된 FcγRI/Igα 융합 단백질, 서열번호 10에 제시된 FcγRIII/Igα 융합 단백질, 서열번호 22에 제시된 FcγRI/막 Ig 융합 단백질, 또는 서열번호 23에 제시된 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질, 또는 서열번호 8, 10, 22 또는 23의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체이다.
본 발명은 상기 다양한 실시태양들 및 본 명세서에 정의된 태양들에 제공된 각각의 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 그의 상보성 가닥을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 클로닝 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 상기와 같은 숙주 세포는 포유동물 또는 비-포유동물 세포일 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 정의된 융합 단백질의 생성 방법을 추가로 포함하며, 상기 방법은 상기 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터에 의해 암호화된 융합 단백질의 발현을 촉진하는 조건하에서 배양하고, 상기 세포 또는 세포 배양물로부터 상기 융합 단백질을 회수함을 포함한다.
바이오센서 세포
두 번째 실시태양에서, 본 발명은 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 바이오센서 세포에 관한 것이며, 여기에서 상기 키메릭 융합 단백질은 Fcγ 수용체(FcγR) 항체-결합 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 융합 단백질은 그의 항체-결합 도메인을 통해 항체의 Fc 영역을 인식하고 상기 영역과 결합하는 능력을 갖는다. 상기 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 발현하는 세포에서 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 능력을 갖는다. 몇몇 태양에서, 상기 세포내 신호전달 캐스케이드는 상기 세포내에 C2+의 방출을 생성시킨다. 상기 키메릭 융합 단백질은 내재막 단백질로서 상기 세포의 표면상에서 안정하게 발현된다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 바이오센서 세포는 B 세포, T 세포, 단핵세포, 대식세포, HEK293 세포, CHO 세포, P815, K562, 또는 Cos-1 세포이며, 이들은 각각 상기 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현한다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 FcγR 항체-결합 도메인은 서열번호 1 또는 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 1 또는 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 실시태양의 몇몇 다른 태양에서, 상기 FcγR 항체-결합 도메인은 서열번호 2 또는 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 2 또는 4의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 서열 변이체는 상기가 기본으로 하는 항체-결합 도메인의 항체-결합 활성을 유지한다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 5, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인이다. 상기 실시태양의 몇몇 다른 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 6에 제시된 부분 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 서열 변이체는 상기가 기본으로 하는 신호전달 도메인의 신호전달 활성을 유지한다.
인자의 검출 방법
세 번째 실시태양에서, 본 발명은 샘플 중 표적 인자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 샘플을 표적 인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 및 바이오센서 세포와 접촉시키고, (b) 상기 바이오센서 세포를 세포 활성화에 대해 분석함을 포함하며, 여기에서 상기 바이오센서 세포는 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하고, 상기 키메릭 융합 단백질은 Fcγ 수용체(FcγR) 항체-결합 도메인, 막관통 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다.
상기 융합 단백질은 그의 항체-결합 도메인을 통해 항체의 Fc 영역을 인식하고 상기 영역과 결합하는 능력을 갖는다. 상기 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 발현하는 세포에서 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 능력을 갖는다. 몇몇 태양에서, 상기 세포내 신호전달 캐스케이드는 상기 세포내에 C2+의 방출을 생성시킨다. 상기 키메릭 융합 단백질은 내재막 단백질로서 상기 세포의 표면상에서 안정하게 발현된다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 샘플은 공기 샘플, 액체 샘플, 건조 샘플, 식물성 샘플, 또는 생물학적 샘플이다. 바람직한 태양에서, 상기 샘플이 공기 샘플인 경우, 상기는 에어로졸, 대기 샘플, 통풍구 배출물, 및 엔진 배기가스로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 바람직한 태양에서, 상기 샘플이 액체 샘플인 경우, 상기는 식품, 음료수, 수 샘플, 약학 제형, 및 개인위생용품으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 바람직한 태양에서, 상기 샘플이 건조 샘플인 경우, 상기는 식품, 토양, 약학 제형, 용해된 면봉 샘플, 및 개인위생용품으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 바람직한 태양에서, 상기 샘플이 식물성 샘플인 경우, 상기는 잎, 열매, 견과류, 종자, 꽃 및 식물 조직으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 바람직한 태양에서, 상기 샘플이 생물학적 샘플인 경우, 상기는 혈액, 혈청, 땀, 뇨, 뇌척수액, 점액, 정액, 변, 기관지폐포세척액, 및 조직으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 인자는 환경 독소, 오염물질, 약물 또는 생물학적 인자이다. 바람직한 태양에서, 상기 인자가 생물학적 인자인 경우, 상기는 세균전 인자(bio-warfare agent), 알레르겐, 기생충 항원, 진균 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 세포 항원, 및 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 바이오센서 세포는 B 세포, T 세포, 단핵세포, 대식세포, HEK293 세포, CHO 세포, P815, K562, 또는 Cos-1 세포이며, 이들은 각각 상기 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현한다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 세포 활성화는 세포내 Ca2+ 수준의 증가이다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 FcγR 항체-결합 도메인은 서열번호 1 또는 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 1 또는 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 실시태양의 몇몇 다른 태양에서, 상기 FcγR 항체-결합 도메인은 서열번호 2 또는 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 2 또는 4의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 서열 변이체는 상기가 기본으로 하는 항체-결합 도메인의 항체-결합 활성을 유지한다.
상기 실시태양의 몇몇 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 5, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인이다. 상기 실시태양의 몇몇 다른 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 서열번호 6에 제시된 부분 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체이다. 상기 서열 변이체는 상기가 기본으로 하는 신호전달 도메인의 신호전달 활성을 유지한다.
상기는 하기의 본 발명의 상세한 기재가 보다 잘 이해될 수 있도록 본 발명의 특징 및 기술적 이점들을 다소 광범위하게 개략하였다. 본 발명의 특허청구범위의 주제를 형성하는 본 발명의 추가적인 특징 및 이점을 본 명세서에 기재할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 본 명세서에 개시된 임의의 개념 및 특정한 실시태양을 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조들을 변형시키거나 설계하기 위한 토대로서 쉽게 사용할 수 있음을 알 것이다. 또한, 당해 분야의 숙련가들은 상기와 같은 등가의 구성들이 첨부된 특허청구범위에 제시된 바와 같은 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈되지 않음을 알아야 한다. 본 발명의 특징인 것으로 여겨지는 신규의 특징들은 그의 구성 및 실행 방법 모두에 관하여 추가의 목적 및 이점과 함께 첨부되는 도면과 관련하여 고려할 때 하기의 기재로부터 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 임의의 기재, 도면, 실시예 등을 단지 예시 및 기재를 목적으로 제공하며 이는 결코 본 발명의 한계를 한정하고자 하는 것은 아님을 분명히 알아야 한다.
도 1. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 구조물의 밑그림 표현이다. 구조물 A는 FcγRI/Igα 융합 단백질을 암호화하고 구조물 B는 FcγRIII/Igα 융합 단백질을 암호화한다. 상기 융합 단백질들은, 상기 FcγRI/Igα 융합 단백질이 상기 FcγRI 항체-결합 및 막관통 도메인을 갖는 반면, 상기 FcγRIII/Igα 융합 단백질은 FcγRIII 항체-결합 및 막관통 도메인을 가짐을 제외하고, 동일하다. 구조물 C는 FcγRI/막 Ig 융합 단백질을 암호화하고 구조물 D는 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질을 암호화한다. 상기 융합 단백질들은, 상기 FcγRI/막 Ig 융합 단백질이 상기 FcγRI 항체-결합 도메인을 갖는 반면, 상기 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질은 FcγRIII 항체-결합 도메인을 가짐을 제외하고, 동일하다. 이들 융합 단백질의 막 Ig 부분은 막-관련 항체로부터의 힌지-CH2-CH3-막관통-세포내 도메인을 포함한다. 구조물 E 및 F는 또한 각각 FcγRI/Igα 및 FcγRIII/Igα 융합 단백질을 암호화하나, 이들 구조물은 2A 펩티드 및 FcRγ-쇄를 추가로 암호화한다.
도 2. 쥐 FcγRI(서열번호 15)의 서열. 세포외, 항체-결합 영역은 N 말단에 있고; 어두운 서열은 예측된 막관통 영역이며; 세포내 영역은 C 말단에 있다.
도 3. 쥐 FcγRIII(서열번호 16)의 서열. 세포외, 항체-결합 영역은 N 말단에 있고; 어두운 서열은 예측된 막관통 영역이며; 세포내 영역은 C 말단에 있다.
도 4. 쥐 면역글로불린 알파(Igα; CD79A; 서열번호 17)의 서열. 세포외, 항체-결합 영역은 N 말단에 있고; 어두운 서열은 예측된 막관통 영역이며; 세포내 영역은 C 말단에 있다.
도 5. FcγRI/Igα 융합 단백질(융합 단백질 A; 서열번호 7 및 8)의 서열. FcγRI의 항체-결합 도메인 및 막관통 도메인(어두운 서열)이 5'에서 3' 방향으로 Igα 신호전달 도메인(밑줄)에 융합된다.
도 6. FcγRIII/Igα 융합 단백질(융합 단백질 B; 서열번호 9 및 10)의 서열. FcγRIII의 항체-결합 도메인 및 막관통 도메인(어두운 서열)이 5'에서 3' 방향으로 Igα 신호전달 도메인(밑줄)에 융합된다.
도 7. 인간 IgG2 막 Ig(서열번호 18)의 부분 서열. 5'에서 3' 방향으로 힌지 영역에 이어서, CH2 도메인(밑줄), CH3 도메인(이중 밑줄), 막관통 도메인, 및 세포내 도메인(밑줄).
도 8. FcγRI/막 Ig 융합 단백질(융합 단백질 C; 서열번호 22)의 서열. FcγRI의 항체-결합 도메인이 5'에서 3' 방향으로 부분적인 인간 IgG2 막 Ig 도메인(밑줄)에 융합된다.
도 9. FcγRIII/막 Ig 융합 단백질(융합 단백질 D; 서열번호 23)의 서열. FcγRIII의 항체-결합 도메인이 5'에서 3' 방향으로 부분적인 인간 IgG2 막 Ig 도메인(밑줄)에 융합된다.
도 10. 2A 펩티드(서열번호 24)의 서열.
도 11. FcRγ-쇄(서열번호 25)의 서열.
I. 정의
달리 나타내지 않는 한, 기술 용어들을 통상적인 용법에 따라 사용한다. 분자 생물학에서 공통 용어의 정의를 예를 들어 하기의 문헌들 및 다른 유사한 기술 참고문헌들에서 찾을 수 있다: Benjamin Lewin, Genes VII, published by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew et al. (eds.); The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하나의"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "포함하는"이란 단어와 함께 사용될 때 "하나의"란 단어는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 더욱 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약"은, 명백히 지시되든지 지시되지 않든지 간에, 정수, 분수 및 백분율을 포함한 수치를 지칭한다. "약"이란 용어는 일반적으로 당해 분야의 통상적인 숙련가가 인용된 값과 균등한 것(예를 들어 동일한 기능 또는 결과를 갖는)으로 간주하는 일련의 수치(예를 들어 상기 인용된 값의 +/-5 내지 10%)를 지칭한다. 일부 예에서, "약"이란 용어는 반올림되는 수치를 포함할 수 있다.
II. 본 발명
상기에 간단히 요약된 바와 같이, 본 발명은 표면상에서 신규의 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 포함하는 만능 항체-매개 바이오센서에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 그의 항원-결합 특이성에 상관 없이 항체와 결합할 수 있으며, 표면상에서 상기 융합 단백질을 발현하는 세포는, 상기 결합된 항체의 그의 동족 항원에 의한 교차결합시 활성화될 수 있다. 상기 융합 단백질은 임의의 항체의 Fc 영역에 결합하기 때문에, 세포외 신호전달 및 세포내 활성화 사이에서 만능 경로로서 작용할 수 있다. 상기 바이오센서를, 샘플을 (i) 상기 바이오센서 세포 및 (ii) 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체와 접촉시킴으로써 상기 샘플 중 선택된 항원의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 상기 항체는 일단 첨가되었으면, 상기 키메릭 융합 단백질의 항체-결합 도메인에 의한 상기 항체의 Fc 영역의 결합을 통해, 상기 융합 단백질에 의해 결합된다. 상기 항체에 의한 항원 인식 및 결합은 항체 교차결합을 유도하고, 이는 상기 융합 단백질을 통해 신호로서 상기 바이오센서 세포내로 전파되며, 여기에서 상기 융합 단백질의 세포내 신호전달 도메인은 세포 활성화를 촉발한다. 이어서 상기와 같은 활성화를 분석하고, 목적하는 경우 정량분석할 수 있다. 세포 활성화의 수준을 근거로, 상기 샘플 중 항원의 존재에 관한 결론을 이끌어낼 수 있다. 매우 대략적으로 말하자면, 본 발명의 바이오센서 세포를 사용하여 세포 활성화가 발생하는 경우, 상기 샘플 중에 항원이 존재하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 만능 항체-매개 바이오센서가 내재막 단백질로서 신규의 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 포함하지만, 상기 바이오센서 세포의 개별적인 요소는 (i) 상기 융합 단백질의 세포외, 항체-결합 도메인, (ii) 상기 융합 단백질의 막관통 도메인, (iii) 상기 융합 단백질의 세포내 신호전달 도메인, 및 (iv) 내재막 단백질로서 표면상에서 상기 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 포함한다. 이들 요소는 하기의 단락들에서 논의된다.
항체-결합 도메인
본 발명의 키메릭 융합 단백질은 그의 아미노 말단에서 세포외, 항체-결합 도메인을 포함한다. 예시적인 항체-결합 도메인은 비제한적으로 Fcγ 수용체(FcγR), 예를 들어 FcγRI 또는 FcγRIII의 항체-결합 도메인을 포함한다. 상이한 FcγR 하위유형들은 상이한 항체 아이소타입(불변 영역)들에 따라 친화성이 달라지기 때문에, 본 발명의 바이오센서는 상기 융합 단백질 중의 항체-결합 도메인의 정체를 근거로 달라질 수 있다. 예를 들어, 쥐 FcγRI 항체-결합 도메인은 쥐 IgG2a뿐만 아니라 인간 IgG1, IgG3 및 IgG4 면역글로불린의 불변 영역에 대해 높은 친화성을 갖는다. 쥐 FcγRI의 항체-결합 도메인은 매우 높은 친화성(>108 M-1)으로 상기 쥐 IgG2a 아이소타입에 결합한다[2]. 이종간 결합 연구는 인간 FcγRI가 상업적으로 입수할 수 있는 인간 mAb와 결합할 수 있으며, 이때 IgG1 및 IgG3가 IgG4보다 더 강하게 결합함을 입증하였다[3]. 상기 쥐 FcγRIII 항체-결합 도메인은 쥐 IgG1, IgG2a, IgG2b의 불변 영역, 및 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 면역글로불린에 대해 보다 낮은 친화성(3x104 내지 6x105 M-1)을 갖지만[3], 또한 본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있다. FcγRI와 FcγRIII 사이에서, 모든 마우스 및 인간 Ig(쥐 IgG3 제외)는 상기 2개의 Fc 수용체 중 하나에 결합할 수 있다. 추가로, 다클론 항체는 상기 FcγR에 결합할 수 있다[4].
따라서 숙련가는 분석되는 특정 인자 및 특정한 실험 조건에 따라, 상이한 Fcγ 수용체의 항체-결합 도메인이 상이한 조건들에 바람직함을 알 것이다. 따라서 본 발명은 일반적으로 본 명세서에 정의된 Fcγ 수용체의 항체-결합 도메인을 포함하는 신규의 키메릭 융합 단백질뿐만 아니라 상기 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포주에 관한 것이다.
첫 번째 태양에서, 상기 키메릭 융합 단백질에 사용되는 Fcγ 수용체의 항체-결합 도메인은 Fcγ 수용체의 막관통 도메인 및 항체-결합 도메인을 모두 포함한다. 적합한 Fcγ 수용체 항체-결합/막관통 도메인은 비제한적으로 서열번호 1에 제시된 마우스 FcγRI의 항체-결합/막관통 도메인(여기에서 아미노산 287-319는 상기 예측된 막관통 도메인에 상응한다) 및 서열번호 2에 제시된 마우스 FcγRIII의 항체-결합/막관통 도메인(여기에서 아미노산 208-233은 상기 예측된 막관통 도메인에 상응한다)을 포함한다.
두 번째 태양에서, 상기 키메릭 융합 단백질에 사용되는 Fcγ 수용체의 항체-결합 도메인은, 예를 들어 상기 융합 단백질의 막관통 도메인이 또 다른 공급원으로부터의 것인 경우 막관통 도메인이 없다. 상기 키메릭 융합 단백질에 사용될 수 있는 막관통 도메인이 없는 적합한 Fcγ 수용체 항체-결합 도메인은 비제한적으로 서열번호 3에 제시된 마우스 FcγRI의 항체-결합 도메인 및 서열번호 4에 제시된 마우스 FcγRIII의 항체-결합 도메인을 포함한다.
신호전달 도메인
본 발명의 키메릭 융합 단백질은 그의 카복시 말단에 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 적합한 신호전달 도메인은 다른 상황들에서 세포 활성화를 유도하는 것으로 공지된 것들을 포함한다. 예를 들어, B 세포는 막관통 단백질 CD79와의 복합체 형성을 통해 항원의 B 세포 수용체(BCR) 결합을 선천적으로 형질도입시킨다. CD79는 B 세포의 표면상에서 이종이량체를 형성하는 2개의 별개의 쇄, 면역글로불린-알파(Igα) 및 면역글로불린-베타(Igβ)로 구성된다. Igα 및 Igβ는 세포외 도메인, 단일 막관통 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 갖는다. 상기 Igα 또는 Igβ 세포내 신호전달 영역에 융합된 CD8 단백질의 세포외 및 막관통 영역과의 융합 단백질은 신호전달 능력을 갖는 것으로 입증되었다[5]. 다른 연구들은 단백질 키나제가 상기 CD8/Igα 융합 단백질의 보다 효능 있는 활성제임을 입증한다. 동일한 연구가 Ca2+ 신호전달이 CD8 교차결합 후 CD8/Igα 융합 단백질에 대해 관찰될 수 있음을 추가로 입증하였다. 이러한 연구들을 근거로, 하나의 태양에서 본 발명의 융합 단백질은 Igα의 세포질 신호전달 도메인에 융합된 항체-결합 도메인을 포함한다[6].
따라서, 첫 번째 태양에서, 본 발명의 키메릭 융합 단백질에 사용될 수 있는 신호전달 도메인은 비제한적으로 서열번호 5에 제시된 마우스 Igα의 신호전달 도메인을 포함한다.
상기 융합 단백질과 항체간의 결합 친화성은 매우 가변적일 수 있으므로, 상기 융합 단백질에 사용되는 항체-결합 도메인 및 항체의 정체에 따라, 상기 항체에 대한 상기 융합 단백질의 결합활성에 추가적인 미묘한 차이를 제공할 수 있는 선택적인 신호전달 도메인을 갖는 것이 중요하다. 예를 들어, 상기 신호전달 도메인은 교차결합 및 이량체화를 도울 수 있다. 2개의 항체-결합 도메인을 가깝게 놓는 것은 최대 교차결합 확률을 증가시킬 것으로 생각된다. 항체-결합 도메인들이 신호전달 도메인으로서 변형된 막-관련 IgG 분자에 결합하는 경우, 2개의 항체-결합 도메인의 근접이 성취될 수 있다. 따라서, 및 두 번째 태양에서, 상기 신호전달 도메인은 IgG 항체의 힌지 영역에 이어서 CH2, CH3, 막관통 및 세포내 영역을 포함하는 부분 막 Ig 펩티드이다(도 1의 융합 단백질 C 및 D 참조). 특정한 예에서, 상기와 같은 신호전달 도메인을 서열번호 6에 제시한다. 상기 신호전달 도메인은 막관통 영역을 포함하므로, 상기를 막관통 도메인이 없는 항체-결합 도메인, 예를 들어 서열번호 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인 또는 서열번호 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인과 함께 사용할 수 있다.
키메릭 융합 단백질
항체-결합 도메인 및 신호전달 도메인의 상이한 조합들을 사용함으로써, 특정 항체에 대한 융합 단백질의 친화성을 조절할 수 있고 세포 활성화 수준을 조절할 수 있음은 자명할 것이다. 본 발명의 범위에 포함되는 키메릭 융합 단백질의 특정한 예는 표 1에 제공된 것들을 포함한다. 6개 융합 단백질 각각의 표현을 도 1에 도시한다.
융합 단백질 항체-결합 도메인의 공급원 막관통 도메인의 공급원 신호전달 도메인의 공급원 핵산 서열에 대한 서얼변호: 아미노산 서열에 대한 서열번호:
FcγRI/Igα FcγRI FcγRI Igα 7 8
FcγRIII/Igα FcγRIII FcγRIII Igα 9 10
FcγRI/막 Ig FcγRI 막 Ig 막 Ig 11 12
FcγRIII/막 Ig FcγRIII 막 Ig 막 Ig 13 14
따라서 본 발명은 서열번호 8에 제시된 FcγRI/Igα 융합 단백질, 서열번호 10에 제시된 FcγRIII/Igα 융합 단백질, 서열번호 22에 제시된 FcγRI/막 Ig 융합 단백질, 및 서열번호 23에 제시된 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질을 포함한다.
상이한 항체-결합 도메인은 상이한 신호전달 도메인과 짝을 이룰 수 있기 때문에, 본 발명이 또한 서열번호 1 또는 3에 제시된 바와 같은 FcγRI의 항체-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 서열번호 2 또는 4에 제시된 바와 같은 FcγRIII의 항체-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함함은 물론이다. 유사하게, 본 발명은 서열번호 5에 제시된 바와 같은 Igα의 신호전달 도메인을 포함하는 융합 단백질, 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 막 Ig의 신호전달 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
숙련가는 본 발명의 융합 단백질의 결합 또는 신호전달 활성에 영향을 미치지 않으면서 상기 단백질의 아미노산 서열에 부수적인 변경을 수행할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 상기 융합 단백질의 결합 활성을 유지시키면서 상기 융합 단백질의 항체-결합 도메인에 부수적인 변경을 수행할 수 있다. 유사하게, 상기 융합 단백질의 신호전달 활성을 유지시키면서 상기 융합 단백질의 신호전달 도메인에 부수적인 변경을 수행할 수 있다. 추가로, 상기 융합 단백질의 결합 및 신호전달 활성을 유지시키면서 상기 융합 단백질의 항체-결합 및 신호전달 도메인에 부수적인 변경을 수행할 수 있다. 상기와 같은 부수적인 변경을 사용하여, 일부의 경우에 특정한 결합 친화성(예를 들어, 낮은, 중간 또는 높은)이 바람직할 수 있으므로 항체에 대한 항체-결합 도메인의 친화성을 변경시킬 수 있다. 유사하게, 상기와 같은 부수적인 변경을 사용하여, 일부의 경우에 특정한 유형 또는 수준의 세포 활성화(예를 들어, 낮은, 중간 또는 높은)가 바람직할 수 있으므로 세포에서 상기 신호전달 도메인의 신호전달 활성을 변경시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 변이체가 기본으로 하는 융합 단백질의 결합 및 신호전달 활성을 또한 유지하는, 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 갖는 본 명세서에 개시된 융합 단백질의 상기 서열 변이체를 포함한다. 특히, 본 발명은 서열번호 8, 10, 22 또는 23에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 FcγRI의 항체-결합 도메인을 포함하는 서열 변이체를 포함하며, 여기에서 상기 도메인은 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 3과 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 또한 FcγRIII의 항체-결합 도메인을 포함하는 서열 변이체를 포함하며, 여기에서 상기 도메인은 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 4와 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 또한 Igα의 신호전달 도메인을 포함하는 서열 변이체를 포함하며, 여기에서 상기 도메인은 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 5와 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 또한 막 Ig의 신호전달 도메인을 포함하는 서열 변이체를 포함하며, 여기에서 상기 도메인은 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6과 적어도 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 명세서에 제공된 각각의 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 그의 상보성 가닥을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 클로닝 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 상기와 같은 숙주 세포는 포유동물 또는 비-포유동물 세포, 예를 들어 비제한적으로 이 콜라이 및 곤충 세포일 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 융합 단백질의 생성 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 숙주 세포를 상기 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터에 의해 암호화된 융합 단백질의 발현을 촉진하는 조건하에서 배양하고, 상기 세포 또는 세포 배양물로부터 상기 융합 단백질을 회수함을 포함한다.
융합 단백질을 암호화하는 구조물
쥐 FcγRI(서열번호 15) 및 FcγRIII(서열번호 16)에 대한 서열들이 클로닝되고 확인되었다. 상기 키메릭 융합 단백질을 암호화하는 핵산 구조물을, 상기 항체-결합, 막관통, 및 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 발현 벡터내에 조작함으로써 상기 융합 단백질의 발현을 위해 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 FcγR 수용체의 항체-결합 및 막관통 도메인을, 예를 들어 PCR을 사용하여 "SOEing"을 통해 신호전달 도메인을 암호화하는 서열과 인프레임 융합시킬 수 있다[15]. 상기 FcR-γ 쇄가 필요한 경우(하기에 논의됨)에 상기 구조물을 완성시키기 위해서, 상기 신호전달 도메인의 C-말단 및 상기 FcR-γ 쇄의 N-말단을 PCR에 의해 2A 펩티드를 암호화하는 서열에 부착시킬 것이다. 상기 FcγR-막 Ig 구조물의 구성을 위해서, 상기 FcγR 서열의 C-말단에 제한 부위를, 상기 N-말단에 양립성 제한 부위를 함유하는 Ig 불변 영역에의 결합에 사용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구조물을 선택된 세포주에서 일시적으로 또는 안정하게 발현시킬 수 있다. 상기 구조물을 숙련가에게 주지된 기법들, 예를 들어 비제한적으로 표준 형질감염 키트(예를 들어 퓨진(Fugene)(등록상표) 또는 네온(Neon)(상표) 시스템 일렉트로포레이션) 또는 레트로바이러스 형질도입 방법을 사용하여 선택된 세포주내에 형질감염시킬 수 있다.
상기 세포 표면상의 융합 단백질의 발현을 또한 숙련가에게 주지된 표준 기법, 예를 들어 FcγRI 또는 FcγRIII에 대한 형광-표지된 항체에 의한 염색, 및 유식 세포측정을 사용하는 분석을 사용하여 확인할 수 있다.
적합한 발현 벡터는 비제한적으로 플라스미드 pcDNA 3.1+ 또는 -(하이그로), pcDNA 3.1 + 또는 -(네오마이신), pdisplay(퓨로), pIRES(네오마이신), pIRES Puro2, pQCXIP(퓨로), pQCXIN(네오마이신), 및 pQCXIH(하이그로)를 포함한다.
상기 발현 벡터는 융합 단백질 및 FcRγ 쇄를 하나의 연속적인 서열에서 함께 암호화할 수 있기 때문에, 상기 암호화 서열은 단일 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 한편으로, 상기 발현 벡터는 상기 융합 단백질 및 FcRγ 쇄를 별도의 프로모터의 조절하에서 암호화할 수 있다.
세포
본 발명의 융합 단백질을 발현하고 따라서 본 발명의 바이오센서 세포로서 작용하는데 사용될 수 있는 세포주는, 단지 상기 세포주가 내재막 단백질로서 상기 세포의 표면상에서 상기 융합 단백질을 안정하게 발현할 수 있고 상기 신호전달 도메인의 활성화를 검출할 수 있다는 것만이 제한된다. 적합한 세포주는 비제한적으로 림프구 및 비-림프구성 세포를 포함한다.
따라서 본 발명은 표면상에서 본 명세서에 정의된 융합 단백질 중 하나 이상을 안정하게 발현하는 세포를 포함한다. 일부 예에서 상기 세포를 본 명세서에서 "바이오센서 세포"라 칭한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 서열번호 8에 제시된 FcγRI/Igα 융합 단백질, 서열번호 10에 제시된 FcγRIII/Igα 융합 단백질, 서열번호 22에 제시된 FcγRI/막 Ig 융합 단백질, 서열번호 23에 제시된 바와 같은 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질, 및 서열번호 8, 10, 22 또는 23의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체 중 하나 이상을 표면상에서 안정하게 발현하는 바이오센서 세포를 포함한다. 상기 바이오센서 세포의 제조에 사용되는 세포는 본 명세서에 정의된 세포 중 어느 하나일 수 있다.
림프구
CD8/Igα 융합 단백질을 발현하는 림프구를 사용하여, 항-CD8 항체와의 교차결합이 B 및 T 세포에서의 세포내 Ca2+의 방출 및 Igα의 인산화를 자극함을 입증하였다[5,6,10]. 마우스 및 인간 B 세포주(내인성 Igα/Igβ 경로를 사용하여 통상적으로 신호를 전달한다)가 본 명세서에 기재된 융합 단백질의 발현에 특히 유용하다. 상기 바이오센서 세포의 생성에 사용될 수 있는 적합한 B 세포주는 비제한적으로 라모스(Ramos), 라지(Raji), IIAI.6 및 C604 세포주를 포함한다. 다른 적합한 B 세포주는 A20 및 LK 35.2를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 구조물의 적합한 발현을 형광-표지된 항체 및 유식 세포측정을 사용하여 확인할 수 있다. 세포를 제한 희석을 사용하여 클로닝하고, 후속 연구를 위해 그의 유식 세포측정 발현 프로파일을 근거로 선택할 수 있다.
일부 B 세포주는 상기 FcγIIb 억제 수용체를 발현하지만, 다른 것들, 예를 들어 라모스 및 IIA1.6 B 세포는 그의 세포 표면상에서 상기 단백질을 발현하지 않는다[11,12]. 상기 FcγIIb 수용체의 억제 활성이 특정한 세포주에서 문제가 있는 경우, siRNA 구조물을 사용하여 상기 세포에서 FcγRIIb의 발현을 안정하게 억제하거나[13] 또는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 상기 세포주에서 FcγRIIb 유전자를 녹아웃시킬 수 있다[14].
Igα 신호전달 도메인에 융합된 CD8을 발현하는 T 세포는 항 CD8 항체와 교차결합 후 Ca2+를 방출하며[5], 이는 T 세포 중 신호전달 기구가 또한 상기 Igα를 통해 작동함을 암시한다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 또한 마우스 또는 인간 T 세포에서 발현시킬 수 있다. 상기 바이오센서 세포의 생성에 사용될 수 있는 적합한 T 세포주는 비제한적으로 주르캣(Jurkat), DO-11.10 및 BW5147 세포주를 포함한다. 상기 융합 단백질을 발현하는 단핵세포(예를 들어 U937 세포주), 대식세포, 근아세포(예를 들어 KG! 세포주), 및 적아세포(예를 들어 K562 세포주)를 또한 바이오센서 세포로서 사용할 수 있다. 이들 세포는 FcγR을 자연적으로 발현하지 않기 때문에, 억제성 FcγRIIb에 의해 야기되는 어떠한 억제도 없을 것이다. 적합한 발현을 또한 유식 세포측정을 사용하여 상기 FcγR에 대한 형광-표지된 mAb를 사용하여 측정할 수 있다.
비-림프계 세포
선택된 단백질의 세포 표면 발현을 수반하는 분석에 통상적으로 사용되는 다수의 확립되고 충분히-특성화된 비-림프계 세포주, 예를 들어 HEK293, CHO, P815, K562 및 Cos-1 세포가 존재한다. 이들 세포주는 상기 세포에서 안정한 발현을 확립시키기 용이하고 충분히 한정된 생육 특징을 갖기 때문에 외래 단백질을 발현하는데 통상적으로 사용된다. 그러나, 비-림프계 세포는 Fcγ 수용체 발현 세포에서 발현되는 2차 단백질인 FcR 감마 쇄(FcRγ-쇄)를 발현하지 못한다. 상기 FcRγ-쇄는 Fcγ 수용체 신호전달에 필요하다[7]. 비-림프계 세포는 상기 FcR-γ 쇄를 발현하지 않지만, 상기와 같은 세포는 여전히 융합 단백질 발현에 탁월한 후보로서 작용할 수 있으며 상기 세포가 상기 FcR-γ 쇄를 동시-발현하도록 조작되는 경우 본 발명의 바이오센서 세포로서 사용될 수 있다.
비-림프계 세포를, 숙련가에게 주지된 기법을 통해 상기 FcR-γ 쇄를 발현하도록 조작할 수 있다. 하나의 편리한 기법은 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 구조물상에 상기 FcR-γ 쇄를 암호화하는 유전자를 포함시키는 것이며, 여기에서 상기 2개의 암호화 서열은 동일하거나 별도의 프로모터의 조절하에 있다. 또 다른 편리한 기법은 상기 융합 단백질 및 상기 FcR-γ 쇄의 발현을 동일한 프로모터의 조절하에 두는 것이다. 특히, 2개의 추가적인 요소를 상기 융합 단백질을 암호화하는 구조물에 가할 수 있다. 첫 번째 요소는 상기 FcR-γ 자체(서열번호 25)이다. 상기 FcR-γ 쇄는 세포막 중 정확한 확인을 채용할 수 있을 필요가 있으므로, 상기 융합 단백질의 일부일 수 없다. 두 번째 요소는 구제역 바이러스에 최초로 기재된 쉽게 절단가능한 펩티드인 조작된 2A 펩티드이므로 상기 문제를 다룬다[8]. 시험된 광범위하게 다양한 세포에서 보다 효율적으로 절단하는, 돼지 테스초바이러스에서 발견된 최초의 2A 펩티드의 변이체[9]가 여기에 사용된다(서열번호 24). 따라서 상기 FcR-γ 쇄를, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 구조물을 상기 신호전달 도메인의 2A 펩티드 서열 C-말단에 이어서 상기 FcR-γ 쇄를 포함하도록 조작함으로써 비-림프계 세포에 제공할 수 있다(도 1에서 구조물 E 및 F 참조).
본 발명의 바이오센서 세포의 생성에 사용될 수 있는 비-림프계 세포주는 비제한적으로 HEK293, CHO, P815, K562 및 Cos-1 세포주를 포함한다.
항체
본 명세서의 논의로부터 자명한 바와 같이, 표적 인자의 검출에서 본 발명의 바이오센서 세포와 함께 사용될 수 있는 항체의 정체는 단지 (i) 상기 항체가 본 발명의 융합 단백질에 의해 결합될 수 있고 (ii) 상기 항체가 표적 인자에 결합할 수 있다는 점만이 제한된다. 일단 특정한 표적 인자가 검출을 위해 선택되면, 상기 인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체를 상업적으로 입수할 수 있는지의 여부를 쉽게 판정할 수 있다. 그렇지 않다면, 필요한 결합 특이성을 갖는 항체를 통상적인 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다.
자명한 바와 같이, 상기 항체는 단클론 또는 다클론일 수 있다. 상기 항체는 재조합체일 수 있다. 적합한 항체는 또한, 유래되는 항체의 결합 특이성을 유지하는 단편, 예를 들어 비제한적으로 Fab 단편, F(ab')2 단편, 및 단쇄 Fv(scFv) 항체를 포함한다.
상기 항체를 검출성 표지, 예를 들어 비제한적으로 효소(예를 들어 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제), 금속(예를 들어 전자 현미경검사용 금), 형광 마커(예를 들어 면역형광 및 유식 세포측정용, 예를 들어 CYE 염료, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 및 플루오레스카민), 형광-방출 금속(예를 들어 152Eu), 방사성 마커(예를 들어 진단용 방사성 동위원소, 3H, 131I, 35S, 14C 및 125I 포함), 화학발광 마커(예를 들어 루미놀, 루시페린, 이소루미놀, 써로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르), 및 단백질 태그(예를 들어 비오틴, 피코빌리단백질, c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5 또는 HIS)에 접합시킬 수 있다.
상기 항체를 또한 표적 인자에 노출 후 샘플로부터 항체의 단리/분리에 사용될 수 있는 부분에 접합시키거나 또는 상기 부분상에 코팅시킬 수 있다. 상기와 같은 부분은 비제한적으로 자기 비드, 아가로스 비드, 및 다양한 직경의 폴리스티렌 비드를 포함한다.
샘플
표적 인자의 존재에 대해 선별될 수 있는 샘플은 단지 상기 샘플이 항체에 의해 상기 샘플 중에 존재하는 표적 인자의 결합을 허용한다는 점만이 유사하게 제한된다. 적합한 샘플은 비제한적으로 공기 샘플, 액체 샘플, 건조 샘플, 식물성 샘플, 및 생물학적 샘플을 포함한다. 적합한 공기 샘플은 비제한적으로 에어로졸, 대기 샘플, 통풍구 배출물, 및 엔진 배기가스를 포함한다. 적합한 액체 샘플은 비제한적으로 식품, 음료수, 수 샘플, 약학 제형, 및 개인위생용품을 포함한다. 적합한 건조 샘플은 비제한적으로 식품, 토양, 약학 제형, 용해된 면봉 샘플, 및 개인위생용품을 포함한다. 적합한 식물성 샘플은 비제한적으로 잎, 열매, 견과류, 종자, 꽃 및 식물 조직을 포함한다. 적합한 생물학적 샘플은 비제한적으로 혈액, 혈청, 땀, 뇨, 뇌척수액, 점액, 정액, 변, 기관지폐포세척액, 및 조직을 포함한다.
인자
본 발명의 바이오센서를 사용하여 광범위하게 상이한 표적 인자를 검출할 수 있다. 숙련가에게 자명한 바와 같이, 상기 표적 인자에 대한 유일한 제한은 항체에 의한 상기 인자의 결합이 가능해야 한다는 것이다. 표적 인자는 생물 기원의 것들, 예를 들어 비제한적으로 세균전 인자, 알레르겐, 기생충 항원, 진균 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 세포 항원, 및 항체를 포함한다. 예시적인 세균전 인자는 비제한적으로 리신, 탄저균 포자, 보툴리늄 독소, 클로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium perfringens) 독소, 삭시톡신, 및 트리코테센 마이코톡신을 포함한다. 예시적인 알레르겐은 비제한적으로 나무 견과류, 땅콩 및 동물 인설을 포함한다. 예시적인 세포 항원은 비제한적으로 피실험자, 예를 들어 인간, 영장류 또는 다른 포유동물, 예를 들어 비제한적으로 가축 또는 반려동물, 예를 들어 개나 고양이의 질병 또는 질환과 관련된 항원을 포함한다. 표적 인자는 또한 식물 및 작물 인자, 수생 병원체 또는 질병 원인 인자, 약물 및 다른 화학적 화합물, 및 환경에서 발견되는 분자, 예를 들어 비제한적으로 독소 및 오염물질을 포함한다.
세포 활성화 검출
본 발명의 바이오센서 세포를 샘플 중 표적 인자의 검출을 위한 분석, 및 일부의 경우에 상기 인자의 정량분석에 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이, 항체에 의한 상기 인자의 결합 및 상기 바이오센서 세포에 의해 발현된 융합 단백질에 의한 항체 결합시, 상기 세포의 표면에서 교차결합이 일어나며 상기 융합 단백질의 신호전달 도메인은 상기 결합을 상기 세포내 활성화 신호로서 전송한다. 일례로서, 항원-함유 샘플이 상기 바이오센서의 세포외 표면상의 항체와 상호작용할 때, 세포내 신호전달 캐스케이드가 활성화된다.
생체내에서, B 세포의 항원 수용체(막-결합된 Ig)는 Igα 및 Igβ 단백질의 디설파이드-결합된 막관통 이종이량체와 비-공유적으로 회합된다[16]. 항원 결합시 상기 B 세포 수용체의 교차결합 후, Igα 및 Igβ를 포함하여 다수의 단백질이 단백질 키나제에 의해 티로신 잔기상에서 인산화된다[17,18]. 인산화 후 첫 번째 하류 사건 중 하나는 세포내 저장소로부터 Ca2+ 방출에 이은 세포막 중 Ca2+ 채널을 통한 외인성 Ca2+의 유입이다[19]. 상기와 같은 세포내 칼슘 수준의 변화는, 분석될 수 있는, 본 발명에서 고려되는 세포 활성화 중 하나의 유형이다. 세포내 Ca2+ 수준의 변화는 세포내로 효율적으로 부하될 수 있는 다양한 화학적 형광 화합물에 의해 세포에서 쉽게 검출될 수 있다.
생물학에서 Ca2+의 중요성으로 인해, 세포 Ca2+ 활성의 다수의 분석 기법들이 확립되었으며, 이를 본 발명의 바이오센서 세포의 세포 활성화 분석에 사용할 수 있다. 인기있는 방법은 형광 화학 Ca2+ 지표 탐침의 사용이며, 그 이유는 상기의 신호가 다른 지표 유형들에 비해 세포내 Ca2+ 농도에서 주어지는 변화에 대해 매우 크기 때문이다[20]. 예를 들어, 세포 활성화를, 살아있는 세포내부의 Ca2+ 농도를 측정하는데 사용되는 민감성 비-비율계량 화합물인 플루오-4AM, 플루오-4의 메틸 에스테르를 상기 바이오센서 세포에 부하함으로써 본 발명의 바이오센서 세포에서 모니터하고 분석할 수 있다[21]. 대부분의 화학 형광 지표는 막 투과성이 아니다. 그러나, 상기 플루오-4의 메틸 에스테르 형태는 원형질막을 가로질러 능동 확산할 수 있으며, 일단 세포내 있으면 세포내 에스테라제가 상기 메틸 에스테르기를 상기 탐침으로부터 절단하여 막-불투과성 탐침이 되게 한다. 본 발명의 세포와 함게 사용하기 위한 또 다른 탐침 대안은 퓨라(Fura) 2이며, 이는 비율계량식 Ca2+ 측정을 허용하는 UV-여기된 Ca2+ 지표이다. 항체에 의한 상기 표적 인자의 결합시, 신호가 상기 바이오센서 세포의 신호전달 도메인에 전달되어 상기 보고된 Ca2+ 수준의 변화를 촉발시키고, 차례로 상기 변화를 분광계를 사용하여 분석 및/또는 정량분석하여 세포 형광의 변화를 측정한다.
또한, Ca2+ 결합 발광단백질은 생물발광을 발생시킬 수 있으며, 상기 발광은 생물학적 과정으로부터 빛의 생성이다. 여러가지 Ca2+-결합 발광단백질(예를 들어 에쿼린, 오벨린, 미트로코민, 및 클리틴)을 사용하여 세포내 Ca2+ 농도를 측정하였으며[24], 이들을 각각 본 발명의 바이오센서 세포와 함께 사용하여 세포 활성화의 변화를 분석할 수 있다. Ca2+ 결합시 상기 발광단백질의 발광은 가시 스펙트럼 중에 있으며(이는 계측 또는 검출에 관하여 간편성을 제공한다), 광표백에 의해 영향을 받지 않는다.
표적 인자 결합(즉 세포 활성화)을 세포 중 Ca2+ 수준 변화의 측정을 기본으로 예시하지만, 발광단백질을 사용하는 발광을 포함하여, 표적 인자 결합의 변화에 대한 분석에 다른 수단을 사용할 수 있음을 알아야 한다.
III. 실시예
실시예 1: 융합 단백질을 암호화하는 구조물의 생성 및 발현
상업적으로 입수할 수 있는 쥐 FcγRI 및 Igα DNA를 수득하였다. 상기 2개 유전자의 중복 서열을 제공하는 PCR 프라이머를 사용하여 상기 2개 서열을 함께 재단하여 FcγRI/Igα 인프레임 융합을 생성시키고 이를 서열 분석에 의해 확인하였다. 한편으로, FcγRI의 항체-결합 및/또는 막관통 도메인을, 상기 수용체를 암호화하는 cDNA로부터 프라이머로 증폭시키고, Igα의 세포내 신호전달 도메인을 유사하게 증폭시킨다.
증폭된 단편을 젤-정제시킨다. 증폭 생성물(예를 들어 FcγRI 및 Igα)을 함께 혼합하고 5분 동안 비등에 의해 변성시키고 증폭 30분 전에 실온에 두어 완전길이 융합 단백질을 암호화하는 서열을 생성시킨다. 상기 서열을 젤-정제시키고 적합한 프로모터를 함유하는 발현 벡터(예를 들어 포유동물 세포에서 cDNA를 발현하기 위한 플라스미드)내로 클로닝시키고, 리포펙타민 LX 또는 다른 적합한 형질감염 시약을 사용하여 선택된 세포주내로 형질감염시키고, 적합한 선택성 마커를 사용하여 선택한다. 개별적인 클론을 서열분석하여 적합한 융합 단백질이 발현되고 있는지를 확인한다. 상기 융합 단백질의 적합한 표면 발현을 표지된 항-Fc 수용체 항체(예를 들어 항-CD64 항체 염색) 및 유식 세포측정을 사용하여 판정한다. 상기 FcγRI-Igα 융합 단백질을 암호화하는 예시적인 구조물은 5'에서 3' 방향으로 FcγRI(서열번호 19)의 항체-결합 및 막관통 도메인을 암호화하는 것 및 Igα 신호전달 도메인(서열번호 21)을 암호화하는 서열이다.
상기 FcγRIII-Igα 융합 단백질을 암호화하는 또 다른 예시적인 구조물은 5'에서 3' 방향으로 FcγRIII(서열번호 20)의 항체-결합 및 막관통 도메인을 암호화하는 것 및 Igα 세포내 신호전달 도메인(서열번호 21)을 암호화하는 서열이다. 상기 2개 유전자의 중복을 제공하는, 상업적으로 수득되는 쥐 FcγRIII cDNA 및 Igα cDNA PCR 프라이머를 사용하여 상기 2개 유전자를 함께 재단하였다. 상기 생성물은 FcγRIII/Igα 인프레임 융합을 생성시켰으며 이는 서열 분석에 의해 확인되었다.
또 다른 접근법을 사용하여 상기 FcγR 수용체를 상기 2A 펩티드 및 FcR-γ 쇄와 함께 두어 도 1에서 E 및 F로서 도시된 구조물을 생성시켰다. 중복 연장과 함께 PCR 증폭을 사용하여 2A 서열을 상기 FcR-γ 쇄와 융합시키고 제한 부위를 상기 2A 및 FcRγ-쇄 cDNA의 단부에 놓았다. PCR을 사용하여 상기 FcγRI 및 FcγRIII cDNA를 모두 단부상에 제한 부위를 함유하는 프라이머(상기 FcγR의 상기 2A 부위에의 결합 및 발현 벡터내로의 후속 클로닝에 사용될 수 있다)로 증폭시켰다. DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 생성물을 젤로부터 용출시켰다. 단편들을 결찰시키고 발현 벡터내로 클로닝하며 서열분석하였다.
하기의 실시예들은 본 발명의 만능 바이오센서 세포가 실제로 사용될 수 있는 경우들 중 일부를 제공한다. 이들 실시예는 상기 바이오센서가 사용될 수 있는 가능한 방식들 중 단지 작은 부분집합일 뿐이다. 상기 바이오센서를 단일 또는 다중-웰 분석 포맷에 쉽게 적응시킬 수 있다. 세포주, 구조물 및 Ca2+ 지표의 조합이, 연구되는 인자, 항원 또는 병원체 및 항체 아이소타입의 유효성에 따라 변할 수 있고 실험적으로 측정하는데 필요할 수 있음을 알아야 한다.
실시예 2: 잎 또는 뿌리 샘플로부터 식물 바이러스의 검출
식물 병원체는 바이러스성이든 세균성이든 감염으로서 큰 우려를 가지며 발생되는 잎 및 사료작물의 손실은 경제 및 식품 안전성에 영향을 미친다. 따라서 작물 관리 및 수입 작물의 모니터링에 도움이 되도록 통상적일뿐만 아니라 새로운 식물 병원체를 검출할 수 있는 분석을 준비하는 것이 중요하다. 농가에서의 국내 작물 검사를 기재한다.
잎 또는 뿌리 샘플을 의심되는 식물로부터 채집한다. 상기 샘플을 철저히 분쇄하여 상기 샘플내에 함유된 임의의 바이러스 입자를 방출시킨다. 이어서 상업적으로 입수할 수 있는 바이러스-특이성 항체로 코팅된 자기 비드를 상기 샘플 기질과 혼합하여 바이러스 입자(즉 표적 인자)를 포획한다. 상기 비드를 상기 식물 샘플로부터 자기에 의해 분리시키고, 철저히 세척하고, 본 발명의 만능 바이오센서 세포와 배양할 수 있다.
예를 들어, 상기 FcR-γ 쇄를 또한 암호화하는 구조물(즉 도 1의 구조물 E 및 F)로부터의 FcγRI/Igα 또는 FcγRIII/Igα 융합 단백질을 발현하는 라모스 B 세포를 사용할 수 있다. 선택된 바이오센서 세포를 고밀도(대략 106 세포/㎖)로 생육시키고 생육 배지를 페놀레드-없는 삼투-균형 염 용액(즉 HBSS, PBS)으로 대체시킨다. 상기 세포를 프로베네시드(대략 1 내지 2.5 mM)의 존재하에 플루오-4 AM 용액(대략 2 내지 9 μM) 중에서 대략 30 내지 60분 동안 부하한다. 프로베네시드를 사용하여 세포로부터 누출되는 지표를 최소화한다. 세포를 철저히 세척하여 잔류 Ca2+ 지표를 제거한다. 프로베네시드와 함께 작은 부피의 HBSS 중의 약 1 내지 5x106 플루오-4 AM-부하된 세포를 어두운 면을 갖는 96-웰 플레이트의 다중 웰로 옮긴다. 이어서 상기 세포를 함유하는 플레이트를 형광 플레이트 판독기에 삽입한다.
부하된 세포를 함유하는 다수의 웰을 짧은 기간 동안 535 ㎚에서 광학적으로 측정하여 기준선 배경 형광 수준을 확립시킨다. 상기 세포에 플루오-4 AM이 확실히 부하되도록 하기 위해서, 상기 웰에 약물학적 화합물(즉 대략 100 내지 200 μM의 ATP, 대략 30 내지 60 μM의 카바콜, 또는 대략 0.1 내지 2 μM의 이오노마이신)을 가하여 세포내 Ca2+ 수준의 증가를 자극한다. 다른 대조용, 예를 들어 교차결합성 2차 항체와 함께 FcγR 항체의 사용을 또한 지표 부하를 확인하기 위해서 사용한다.
플루오-4 부하를 확인한 후에, 부하된 세포를 함유하는 웰들을 대략 30 내지 60분 동안 상업적으로 입수할 수 있는 바이러스-특이성 항체(사용된 구조물과 양립성인 아이소타입을 가지며 이상적으로는 상기 포획 비드에 사용된 것과 상이한)와 함께 배양한다. 이어서 상기 바이러스-코팅된 포획 비드의 일련의 희석물을 상기 세포에 가하고 형광 변화를 수분의 기간에 걸쳐 측정한다. 세포를 또한 양성 대조용(한정된 바이러스-함유 용액의 첨가) 및 음성 대조용(바이러스가 없는 유사한 용액의 첨가, 또는 교차 반응하지 않는 상관없는 항원 용액의 첨가) 모두로 시험하여 신호의 특이성을 보장한다. 세포 형광의 증가는 선택된 바이러스가 샘플 중에 존재함을 가리킨다. 일부 예에서, 세포 형광의 변화량을 샘플 중에 존재하는 선택된 바이러스의 양과 상관지어, 상기 샘플 중 상기 바이러스의 양의 정량분석을 허용한다.
실시예 3: 면봉 샘플로부터 살모넬라의 검출
살모넬라 스페시즈는 가장 흔한 식품-매개 병원체 중 하나이며 어린이, 노인, 및 약한 면역계를 갖는 사람들에서 심한, 때로는 치명적인 살모넬라증을 유발할 수 있다. 살모넬라 오염은 부패한 동물 또는 인간 배설물과의 접촉으로부터 발생하므로, 계란 및 육류에서부터 소산물 및 심지어 물에 이르는 광범위한 식품들이 오염되어질 수 있다. 현행 살모넬라 검출 방법은 PCR 또는 세균 배양을 수반하며, 이는 시간 소모적이고 전문 지식을 필요로 한다. 따라서 간단하고 신속한 검출 분석이, 발병 및 제품 리콜을 방지하기 위해 식품 품질 모니터링에 바람직할 수 있다. 계란 가공 설비에서의 살모넬라에 대한 검사를 기재한다.
면봉 샘플을 상기 설비내 작업대 및 외부 난각 표면으로부터 채취한다. 이어서 상기 면봉을 생체적합성 용액에 담가 상기 살모넬라를 샘플 기질내에 추출하고, 상기 기질을 상기 만능 바이오센서로 직접 검사할 수 있다. 본 실시예에서, FcγRI/막 Ig 또는 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질(도 1의 구조물 C 및 D 참조)을 발현하는 C604B 세포를 본 발명의 바이오센서 세포로서 사용한다. B 세포인 C604 세포는 내인성 Igα 및 Igβ를 가져서 신호전달 능력을 제공할 것이다.
상기 C604 세포를 고밀도(대략 106 세포/㎖)로 생육시키고 배지를 페놀레드-없는 HBSS로 대체시킨다. 상기 세포를 프로베네시드(대략 1 내지 2.5 mM)의 존재하에 플루오-4 AM 용액(대략 1 내지 5 μM) 중에서 대략 30 내지 60분 동안 부하한다. 세포를 철저히 세척하여 잔류 Ca2+ 지표를 제거한다. 프로베네시드와 함께 작은 부피의 HBSS 중의 1 내지 5x106 플루오-4 부하된 세포를 96-웰 플레이트의 다중 웰로 옮긴다. 상기 플레이트를 형광 플레이트 판독기내에 삽입하고 기준선 배경 형광을 확립시킨다. 세포-함유 웰의 부분집합내에, 항-마우스 IgM(대략 5 내지 7 ng/㎕)을 가하여 양성 대조용으로서 Ca2+ 반응을 자극한다. 2차 교차결합제 항체와 항-FcγRI 항체의 사용과 같은 다른 대조용을 사용하여 부하를 확인한다.
상업적으로 입수할 수 있는 항-살모넬라 항체(FcγRI 또는 FcγRIII와 양립성인 아이소타입의)를 30 내지 60분의 기간 동안 상기 세포와 배양한다. 이어서 상기 살모넬라-함유 샘플의 일련의 희석물을 상기 세포에 가하고 형광 변화를 1 내지 2분의 기간에 걸쳐 측정한다. 세포를 또한 양성 대조용 및 음성 대조용 모두로 시험하여 신호의 특이성을 보장한다. 세포 형광의 증가는 상기 샘플 중에 살모넬라가 존재함을 가리킨다. 일부 예에서, 세포 형광의 변화량을 샘플 중에 존재하는 살모넬라의 양과 상관지어, 상기 샘플 중 상기 살모넬라의 양의 정량분석을 허용한다.
실시예 4: 식품 샘플로부터 리스테리아의 검출
리스테리아(즉 엘 모노사이토게네스(L. monocytogenes))는 대략 20% 치사율을 갖는 심각한 세균성 질병인 리스테리아증의 원인 인자이며 임신한 여성, 유아, 및 약한 면역계를 갖는 사람들에게 가장 위험한 식품-매개 병원체이다. 리스테리아는 날고기, 소산물 및 유제품, 및 가공식품을 오염시킬 수 있다. 따라서 병원체 발생 및 제품 리콜을 방지하기 위해서 세균을 검출하고 그의 존재를 모니터하는 능력이 바람직할 수 있다. 바로 먹을 수 있는 식품(즉 델리 고기 및 핫도그)을 생산하는 육류 가공 플랜트에서 리스테리아의 검출을 위한 만능 바이오센서 세포의 용도를 기재한다.
실시예 3에 유사하게 기재된 바와 같이, 상기 플랜트의 작업대 및 장비를, 제품의 잠재 오염을 모니터하고 오염제거 과정의 유효성을 평가하기 위해서 육류 가공 전, 상기 가공 중 및 상기 가공 후에 면봉으로 시료를 채취한다. 추가로, 가공된 육류의 샘플을 검사할 수 있다. 상기 샘플을 PBS 중에서 균질화하고 상업적으로 입수할 수 있는 리스테리아-특이성 항체로 코팅된 미세한 자기 비드와 혼합한다. 상기 비드는 상기 샘플 중에 존재하는 임의의 리스테리아와 결합하며 상기 비드를 상기 샘플로부터 자기에 의해 분리시키고, 철저히 세척하고, 제조된 만능 바이오센서에 가한다.
상기 FcR-γ 쇄 및 생물발광 발광단백질 에쿼린과 함께 상기 FcγRI/Igα 또는 FcγRIII/Igα 융합 단백질을 안정하게 발현하는 COS-1 세포를 바이오센서 세포로서 사용하고 고밀도(대략 106 세포/㎖)로 생육시킨다. 상기 세포를 5 내지 16시간의 기간에 걸쳐 대략 2 내지 8 μM 코엘렌테라진(에쿼린의 필수 기질)과 함께 배양한다. 과잉의 코엘렌테라진을 제거하기 위해 철저히 세척한 후에, 세포를 96-웰 플레이트의 다중 웰내에 도말한다. 이어서 세포를 30 내지 60분 동안 상업적으로 입수할 수 있는 리스테리아-특이성 항체(사용된 구조물과 양립성인 아이소타입 및 바람직하게는 포획 비드에 사용되는 것과 상이한 항체)와 배양한다. 상기 플레이트를 발광 플레이트 판독기에 삽입하고 기준선 배경 발광 수준을 측정한다. 성공적인 코엘렌테라진 부하 및 Ca2+ 반응성의 확인을 0.15 내지 100 μM ATP의 첨가에 의해 획득한다. 그 후에, 상기 리스테리아-코팅된 포획 비드를 상기 세포에 상이한 희석비로 가하고 발광 신호의 변화를 1 내지 2분의 기간에 걸쳐 기록한다. 발광의 증가는 상기 샘플 중 리스테리아의 존재를 가리킨다. 일부 예에서, 발광의 변화량을 샘플 중에 존재하는 리스테리아의 양과 상관지어, 상기 샘플 중 상기 리스테리아의 양의 정량분석을 허용한다.
실시예 5: 공기 샘플로부터 비 안트라시스 ( B. anthracis ) 포자의 검출
탄저병은 바실러스 안트라시스 세균의 포자에 의해 유발되는, 빨리 개시되는 치사성 질병이다. 자생 토양 세균은 방목 사육된 동물로부터의 감염된 고기뿐만 아니라 가공되지 않은 동물 가죽 및 털과의 접촉을 통해 전염될 수 있다. 보다 최근에, 비 안트라시스는 세균전 및 테러리스트 공격에 사용하기 위해 무기화되었다. 이에 관하여, 비 안트라시스 포자의 신뢰할만한 신속한 검출이 중요하다. 의심되는 지역을 면봉으로 시료 채취하거나 용액 중 분석을 위해 의심되는 분말을 PBS에 바로 현탁하여 시험 샘플을 수득할 수 있다. 한편으로, 에어로졸 샘플을 의심되는 지역에서 채취하고 미립자를 표면상에 농축시키고 만능 바이오센서 세포에 노출시킬 수 있다. 적합한 에어로졸-샘플링 장치(바이오플래시(BioFlash) E)가 패쓰센서스 인코포레이티드(PathSensors, Inc)에 의해 생산된다.
본 실시예에서, FcγRI/Igα 또는 FcγRIII/Igα 융합 단백질 및 FcRγ-쇄를 발현하는 인간 T 세포주인 주르캣 세포를 바이오센서 세포로서 사용한다. 상기 세포에 30 내지 60분의 기간 동안 인도(Indo)-1 Ca2+ 지표(대략 1 내지 5 μM)를 부하한다. 철저한 세척 후에, 상기 세포를 상업적으로 입수할 수 있는 비 안트라시스-특이성 항체(사용된 구조물과 양립성인 아이소타입의)와 배양하고 에어로졸-샘플링 기계의 챔버 내부에 부하한다. 405 ㎚에서 기준선 배경 형광을 확립시킨다. 성공적인 Ca2+ 지표 부하의 확인을, 대략 1 내지 5 ㎍/㎖ 이오노마이신의 첨가에 의해 획득한다. 이어서 상기 모니터된 지역으로부터의 공기를 상기 기계에 통과시키고 미립자 물질을 내부 표면상에 농축시킨다. 이어서 상기 바이오센서를 시험 표면상에 방출하여, 존재할 수도 있는 임의의 비 안트라시스 포자에 결합시킨다. 405 ㎚에서의 형광 신호의 변화를 1 내지 2분의 기간에 걸쳐 기록한다. 세포 형광의 증가는 상기 샘플 중 탄저병의 존재를 가리킨다. 일부 예에서, 세포 형광의 변화량을 샘플 중에 존재하는 탄저병의 양과 상관지어, 상기 샘플 중 상기 탄저병의 양의 정량분석을 허용한다.
본 발명을 그의 몇몇 특정한 실시태양을 참조하여 기재하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 다양한 변형을 수행할 수 있음을 알 것이다. 첨부된 특허청구범위의 범위는 기재된 특정한 실시태양들로 제한되지 않는다.
참고 문헌
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 속하는 당업자의 숙련도를 나타낸다. 인용된 각각의 특허 및 공보는 그 전체가 본원에 참고로 인용되어있다. 이 출원서에는 다음과 같은 참고 문헌이 모두 인용되어 있다.
1. Rider, TH, Petrovick, MS, Nargi FE, et al., (2003) A B Cell-Based Sensor for Rapid Identification of Pathogens Science 301:213-215.
2. Unkless JC, Eisen HN,. 1975. Binding of monomeric immunoglobulin to Fc receptors of mouse macrophages. J Exp Med 142:1520-1533.
3. RavetchJV, Kinet J. Fc receptors. (1991) Ann Rev. Immunol 9:457-492.
4. Antonsson,A and Hugo PJ. (2001) Binding of human and animal immunoglobulins to the IgG Fc receptor induced by human cytomegalovirus J. Gen Virol 82:1137-1145.
5. Taddie, JA, Hurley, TR, Hardwick, BS, Sefton, BM. (1994) Activation of B- and T-cells by the cytoplasmic domains of the B-cell antigen receptor proteins Ig-α and Ig-β. J Biol. Chem. 269:13529-13535.
6. Kim, KM, Alber G, Weiser P, Reth M. (1993) Differential signaling through the Ig-alpha and Ig-beta components of the B cell antigen receptor. Eur. J. Immunol. 23:911.
7. Gibbins JM, Okuma M, Farndale R, Barnes, M, Watson, SP. (1997) Glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptor γ-chain. FEBS Lett. 413, 255 - 259.
8. Ryan, MD, King, AM, Thomas, GP. (1991) cleavage of the foot -and mouth- disease virus polyoprotein is mediated by residues within a 19 amino acid sequence. J. Gen Virol 72:2727-2732.
9. Kim, J-H, Lee, S-R, Li, L-H, Park, H-J et al. (2011) High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine Teschovirus in human cell lines, zebrafish and mice. PLoSONE 6:1:8.
10. Faswinkel, H and Reth M. (1994) Dual fole of the tyrosine activation motif of the Igaprotein during signal transduction via the B cell antigen receptor. EMBO J 13:83-89.
11 Walshe CA, Beers SA, French RR, et al. (2008) Induction of cytosolic calcium flux by CD20 is dependent upon B Cell antigen receptor signaling. J Biol Chem:28316971-16984.
12 Jones B, Tite JP, Janeway Jr CA (1986) Different phenotypic variants of the mouse B cell tumor A20/2J are selected by antigen and mitogen-triggered cytotoxicity of LST4-positive, IA-Restricted T cell clones. J. Immunol 136:348.
13. Hamilton A, Baulcombe D (1999). A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286: 950 -952.
14. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315:1709-1712.
15. Horton RM, Cai, ZL, Ho SN and Pease LR (1990) Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques 8:528-535.
16. Reth M (1992) Antigen receptors on B cells. Ann Rev. Immunol 10:97-121
17 Campbell MA and Sefton BM (1990) Protein tyrosine phosphorylation is induced in murine B lymphocytes in response to stimulation with anti-immunoglobulin EMBO J 9:2125-2132.
18. Gold, MR, Matsuuchi L, Kelly RB, DeFranco AL (1991) Tyrosine phosphorylation of components of the B-cell antigen receptors following receptor crosslinking. Proc. Natl, Acad Aci 883436-3440.
19 Premack BA, Gardner P (1992) Signal transduction by T cell receptors:mobilization by Ca and regulation of calcium dependent effector molecules. Am J. Physiol 263:C1119-1140.
20. Tsien RY, (1980) New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures. Biochemistry 19:2396-2404.
21. Gee KR, Brown KA, Chen WN, Bishop-Stewart J, Gray D, Johnson I (2000). Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes Cell Calcium 27:97-106.
22. Beeker PL, Fay FS (1987) Photobleaching of fura-2 and its effect on determination of calcium concentrations. Am. J. Physiol. 25:C613-C618.
23. Tsuji F, Ohmiya Y, Fagan TF, Toh H, Inouye S (1995) Molecular evolution of the Ca2+-binding photoproteins of the hydrozoa. Photochem. Photobiol. 62:657-661.
24. Akiyuki Takahashi, Patricia Camacho, James D. Lechleiter, Brian Herman (1999). Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews 79:1089-1125.
SEQUENCE LISTING <110> University of maryland, baltimore <120> UNIVERSAL ANTIBODY-MEDIATED BIOSENSOR <130> IPA170907-US <150> US 62/132,729 <151> 2015-03-13 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 320 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala 20 25 30 Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn 35 40 45 Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr 50 55 60 Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln 85 90 95 Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn 100 105 110 Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125 Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn 130 135 140 Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 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Leu Asn Gly 290 295 300 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 305 310 315 320 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 325 330 335 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 340 345 350 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 355 360 365 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 370 375 380 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 385 390 395 400 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 405 410 415 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 420 425 430 Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu 435 440 445 Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu 450 455 460 Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Ile Thr Phe Phe Lys Val Lys Trp 465 470 475 480 Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Val Pro Asp Tyr 485 490 495 Arg Asn Met Ile Arg Gln Gly Ala 500 <210> 15 <211> 1215 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> exon <222> (1)..(1212) <400> 15 atg att ctt acc agc ttt gga gat gac atg tgg ctt cta aca act ctg 48 Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu 1 5 10 15 cta ctt tgg gtt cca gtc ggt ggg gaa gtg gtt aat gcc acc aag gct 96 Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala 20 25 30 gtg atc acc ttg cag cct cca tgg gtc agt att ttc cag aag gaa aat 144 Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn 35 40 45 gtc act tta tgg tgt gag ggg cct cac ctg cct gga gac agt tcc aca 192 Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr 50 55 60 caa tgg ttt atc aac gga aca gcc gtt cag atc tcc acg cct agt tat 240 Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 agc atc cca gag gcc agt ttt cag gac agt ggc gaa tac agg tgt cag 288 Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln 85 90 95 ata ggt tcc tca atg cca agt gac cct gtg cag ttg caa atc cac aat 336 Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn 100 105 110 gat tgg ctg cta ctc cag gcc tcc cgc aga gtc ctc aca gaa gga gaa 384 Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125 ccc ctg gcc ttg agg tgt cac gga tgg aag aat aaa ctg gtg tac aat 432 Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn 130 135 140 gtg gtt ttc tat aga aat gga aaa tcc ttt cag ttt tct tca gat tcg 480 Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 gag gtc gcc att ctg aaa acc aac ctg agt cac agc ggc atc tac cac 528 Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His 165 170 175 tgc tca ggc acg gga aga cac cgc tac aca tct gca gga gtg tcc atc 576 Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile 180 185 190 acg gtg aaa gag ctg ttt acc acg cca gtg ctg aga gca tcc gtg tca 624 Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser 195 200 205 tct ccc ttc ccg gag ggg agt ctg gtc acc ctg aac tgt gag acg aat 672 Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn 210 215 220 ttg ctc ctg cag aga ccc ggc tta cag ctt cac ttc tcc ttc tac gtg 720 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val 225 230 235 240 ggc agc aag atc ctg gag tac agg aac aca tcc tca gag tac cat ata 768 Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile 245 250 255 gca agg gcg gaa aga gaa gat gct gga ttc tac tgg tgt gag gta gcc 816 Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala 260 265 270 acg gag gac agc agt gtc ctt aag cgc agc cct gag ttg gag ctc caa 864 Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln 275 280 285 gtg ctt ggt ccc cag tca tca gct cct gtc tgg ttt cac atc ctg ttt 912 Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Val Trp Phe His Ile Leu Phe 290 295 300 tat ctg tca gtg gga ata atg ttt tcg ttg aac acg gtt ctc tat gtg 960 Tyr Leu Ser Val Gly Ile Met Phe Ser Leu Asn Thr Val Leu Tyr Val 305 310 315 320 aaa ata cac agg ctg cag aga gag aag aaa tac aac tta gaa gtc cct 1008 Lys Ile His Arg Leu Gln Arg Glu Lys Lys Tyr Asn Leu Glu Val Pro 325 330 335 ttg gtt tct gag cag gga aag aaa gca aat tcc ttt cag caa gtt aga 1056 Leu Val Ser Glu Gln Gly Lys Lys Ala Asn Ser Phe Gln Gln Val Arg 340 345 350 agc gat ggc gtg tat gaa gaa gta aca gcc act gcg agc cag acc aca 1104 Ser Asp Gly Val Tyr Glu Glu Val Thr Ala Thr Ala Ser Gln Thr Thr 355 360 365 cca aaa gaa gcg ccc gat gga cct cga agc tca gtg ggt gac tgt gga 1152 Pro Lys Glu Ala Pro Asp Gly Pro Arg Ser Ser Val Gly Asp Cys Gly 370 375 380 ccc gag cag cct gaa ccc ctt cct ccc agt gac agt act ggg gca caa 1200 Pro Glu Gln Pro Glu Pro Leu Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 act tcc caa agt tga 1215 Thr Ser Gln Ser <210> 16 <211> 804 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> exon <222> (1)..(801) <400> 16 atg act ttg gac acc cag atg ttt cag aat gca cac tct gga agc caa 48 Met Thr Leu Asp Thr Gln Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln 1 5 10 15 tgg cta ctt cca cca ctg aca att ctg ctg ctg ttt gct ttt gca gac 96 Trp Leu Leu Pro Pro Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp 20 25 30 agg cag agt gca gct ctt ccg aag gct gtg gtg aaa ctg gac ccc cca 144 Arg Gln Ser Ala Ala Leu Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro 35 40 45 tgg atc cag gtg ctc aag gaa gac atg gtg aca ctg atg tgc gaa ggg 192 Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly 50 55 60 acc cac aac cct ggg aac tct tct act cag tgg ttc cac aac tgg agt 240 Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Trp Ser 65 70 75 80 tcc atc cgg agc cag gtc caa tcc agc tac acg ttt aag gcc aca gtc 288 Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val 85 90 95 aat gac agt gga gaa tat cgg tgt caa atg gag cag acc cgc ctc agc 336 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser 100 105 110 gac cct gta gat ctg gga gtg att tct gac tgg ctg ctg ctc cag acc 384 Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr 115 120 125 cct cag cgg gtg ttt ctg gaa ggg gaa acc atc acg cta agg tgc cct 432 Pro Gln Arg Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys Pro 130 135 140 agc tgg agg aac aaa cta ctg aac agg atc tcg ttc ttc cat aat gaa 480 Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu 145 150 155 160 aaa tcc gtg agg tat cat cac tac aaa agt aat ttc tct atc cca aaa 528 Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys 165 170 175 gcc aac cac agt cac agt ggg gac tac tac tgc aaa gga agt cta gga 576 Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly 180 185 190 agt aca cag cac cag tcc aag cct gtc acc atc act gtc caa gac cca 624 Ser Thr Gln His Gln Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Pro 195 200 205 gca act aca tcc tcc atc tct cta gtc tgg cac cac act gct ttc tcc 672 Ala Thr Thr Ser Ser Ile Ser Leu Val Trp His His Thr Ala Phe Ser 210 215 220 cta gtg atg tgc ctc ctg ttt gca gtg gac acg ggc ctt tat ttc tat 720 Leu Val Met Cys Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr 225 230 235 240 gta cgg aga aat ctt caa acc ccg agg gat tac tgg agg aag tcc ctg 768 Val Arg Arg Asn Leu Gln Thr Pro Arg Asp Tyr Trp Arg Lys Ser Leu 245 250 255 tca atc aga aag cac cag gct cct caa gac aag tga 804 Ser Ile Arg Lys His Gln Ala Pro Gln Asp Lys 260 265 <210> 17 <211> 663 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> exon <222> (1)..(660) <400> 17 atg cca ggg ggt cta gaa gcc ctc aga gcc ctg cct ctc ctc ctc ttc 48 Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 ttg tca tac gcc tgt ttg ggt ccc gga tgc cag gcc ctg cgg gta gaa 96 Leu Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala Leu Arg Val Glu 20 25 30 ggg ggt cca cca tcc ctg acg gtg aac ttg ggc gag gag gcc cgc ctc 144 Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu 35 40 45 acc tgt gaa aac aat ggc agg aac cct aat atc aca tgg tgg ttc agc 192 Thr Cys Glu Asn Asn Gly Arg Asn Pro Asn Ile Thr Trp Trp Phe Ser 50 55 60 ctt cag tct aac atc aca tgg ccc cca gtg cca ctg ggt cct ggc cag 240 Leu Gln Ser Asn Ile Thr Trp Pro Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gln 65 70 75 80 ggt acc aca ggc cag ctg ttc ttc ccc gaa gta aac aag aac cac agg 288 Gly Thr Thr Gly Gln Leu Phe Phe Pro Glu Val Asn Lys Asn His Arg 85 90 95 ggc ttg tac tgg tgc caa gtg ata gaa aac aac ata tta aaa cgc tcc 336 Gly Leu Tyr Trp Cys Gln Val Ile Glu Asn Asn Ile Leu Lys Arg Ser 100 105 110 tgt ggt act tac ctc cgc gtg cgc aat cca gtc cct agg ccc ttc ctg 384 Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu 115 120 125 gac atg ggg gaa ggt acc aag aac cgc atc atc aca gca gaa ggg atc 432 Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile 130 135 140 atc ttg ctg ttc tgt gca gtg gtg cca ggg acg ctg ctg cta ttc agg 480 Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg 145 150 155 160 aaa cgg tgg caa aat gag aag ttt ggg gtg gac atg cca gat gac tat 528 Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr 165 170 175 gaa gat gaa aat ctc tat gag ggc ctg aac ctt gat gac tgt tct atg 576 Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met 180 185 190 tat gag gac atc tcc agg gga ctc cag ggc acc tac cag gat gtg ggc 624 Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly 195 200 205 aac ctc cac att gga gat gcc cag ctg gaa aag cca tga 663 Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gln Leu Glu Lys Pro 210 215 220 <210> 18 <211> 894 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (1)..(891) <400> 18 gag cgc aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg 48 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 gca gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 96 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 144 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 cac gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc atg gag 192 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu 50 55 60 gtg cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg 240 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 ttc cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc gtg cac cag gac tgg ctg aac 288 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg gag ctg caa ctg gag gag agc tgt gcg gag gcg cag gac ggg 720 Ser Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly 225 230 235 240 gag ctg gac ggg ctg tgg acg acc atc acc atc ttc atc aca ctc ttc 768 Glu Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe 245 250 255 ctg cta agc gtg tgc tac agt gcc acc atc acc ttc ttc aag gtg aag 816 Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Ile Thr Phe Phe Lys Val Lys 260 265 270 tgg atc ttc tcc tca gtg gtg gac ctg aag cag acc atc gtc ccc gac 864 Trp Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Val Pro Asp 275 280 285 tac agg aac atg atc agg cag ggg gcc 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accatatagc aagggcggaa 780 agagaagatg ctggattcta ctggtgtgag gtagccacgg aggacagcag tgtccttaag 840 cgcagccctg agttggagct ccaagtgctt ggtccccagt catcagctcc tgtctggttt 900 cacatcctgt tttatctgtc agtgggaata atgttttcgt tgaacacggt tctctatgtg 960 <210> 20 <211> 699 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 atgactttgg acacccagat gtttcagaat gcacactctg gaagccaatg gctacttcca 60 ccactgacaa ttctgctgct gtttgctttt gcagacaggc agagtgcagc tcttccgaag 120 gctgtggtga aactggaccc cccatggatc caggtgctca aggaagacat ggtgacactg 180 atgtgcgaag ggacccacaa ccctgggaac tcttctactc agtggttcca caactggagt 240 tccatccgga gccaggtcca atccagctac acgtttaagg ccacagtcaa tgacagtgga 300 gaatatcggt gtcaaatgga gcagacccgc ctcagcgacc ctgtagatct gggagtgatt 360 tctgactggc tgctgctcca gacccctcag cgggtgtttc tggaagggga aaccatcacg 420 ctaaggtgcc ctagctggag gaacaaacta ctgaacagga tctcgttctt ccataatgaa 480 aaatccgtga ggtatcatca ctacaaaagt aatttctcta tcccaaaagc caaccacagt 540 cacagtgggg actactactg caaaggaagt ctaggaagta cacagcacca gtccaagcct 600 gtcaccatca ctgtccaaga cccagcaact acatcctcca tctctctagt ctggcaccac 660 actgctttct ccctagtgat gtgcctcctg tttgcagtg 699 <210> 21 <211> 189 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 ttcaggaaac ggtggcaaaa tgagaagttt ggggtggaca tgccagatga ctatgaagat 60 gaaaatctct atgagggcct gaaccttgat gactgttcta tgtatgagga catctccagg 120 ggactccagg gcacctacca ggatgtgggc aacctccaca ttggagatgc ccagctggaa 180 aagccatga 189 <210> 22 <211> 1752 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric fusion protein construct comprising Fc-gammaRI and membrane Ig <220> <221> exon <222> (1)..(1749) <400> 22 atg att ctt acc agc ttt gga gat gac atg tgg ctt cta aca act ctg 48 Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu 1 5 10 15 cta ctt tgg gtt cca gtc ggt ggg gaa gtg gtt aat gcc acc aag gct 96 Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala 20 25 30 gtg atc acc ttg cag cct cca tgg gtc agt att ttc cag aag gaa aat 144 Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn 35 40 45 gtc act tta tgg tgt gag ggg cct cac ctg cct gga gac agt tcc aca 192 Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr 50 55 60 caa tgg ttt atc aac gga aca gcc gtt cag atc tcc acg cct agt tat 240 Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 agc atc cca gag gcc agt ttt cag gac agt ggc gaa tac agg tgt cag 288 Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln 85 90 95 ata ggt tcc tca atg cca agt gac cct gtg cag ttg caa atc cac aat 336 Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn 100 105 110 gat tgg ctg cta ctc cag gcc tcc cgc aga gtc ctc aca gaa gga gaa 384 Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125 ccc ctg gcc ttg agg tgt cac gga tgg aag aat aaa ctg gtg tac aat 432 Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn 130 135 140 gtg gtt ttc tat aga aat gga aaa tcc ttt cag ttt tct tca gat tcg 480 Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 gag gtc gcc att ctg aaa acc aac ctg agt cac agc ggc atc tac cac 528 Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His 165 170 175 tgc tca ggc acg gga aga cac cgc tac aca tct gca gga gtg tcc atc 576 Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile 180 185 190 acg gtg aaa gag ctg ttt acc acg cca gtg ctg aga gca tcc gtg tca 624 Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser 195 200 205 tct ccc ttc ccg gag ggg agt ctg gtc acc ctg aac tgt gag acg aat 672 Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn 210 215 220 ttg ctc ctg cag aga ccc ggc tta cag ctt cac ttc tcc ttc tac gtg 720 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val 225 230 235 240 ggc agc aag atc ctg gag tac agg aac aca tcc tca gag tac cat ata 768 Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile 245 250 255 gca agg gcg gaa aga gaa gat gct gga ttc tac tgg tgt gag gta gcc 816 Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala 260 265 270 acg gag gac agc agt gtc ctt aag cgc agc cct gag ttg gag gag cgc 864 Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Glu Arg 275 280 285 aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca gga 912 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 290 295 300 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 960 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 305 310 315 320 tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 1008 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 325 330 335 gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc atg gag gtg cat 1056 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val His 340 345 350 aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt 1104 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 355 360 365 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag 1152 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 370 375 380 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc gag 1200 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 385 390 395 400 aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1248 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 405 410 415 acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg 1296 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 420 425 430 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1344 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 435 440 445 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc atg 1392 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 450 455 460 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1440 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 465 470 475 480 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1488 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 485 490 495 gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1536 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 500 505 510 gag ctg caa ctg gag gag agc tgt gcg gag gcg cag gac ggg gag ctg 1584 Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu Leu 515 520 525 gac ggg ctg tgg acg acc atc acc atc ttc atc aca ctc ttc ctg cta 1632 Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu Leu 530 535 540 agc gtg tgc tac agt gcc acc atc acc ttc ttc aag gtg aag tgg atc 1680 Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Ile Thr Phe Phe Lys Val Lys Trp Ile 545 550 555 560 ttc tcc tca gtg gtg gac ctg aag cag acc atc gtc ccc gac tac agg 1728 Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Val Pro Asp Tyr Arg 565 570 575 aac atg atc agg cag ggg gcc tag 1752 Asn Met Ile Arg Gln Gly Ala 580 <210> 23 <211> 1515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric fusion protein construct comprising Fc-gammaRIII and membrane Ig <220> <221> exon <222> (1)..(1512) <400> 23 atg act ttg gac acc cag atg ttt cag aat gca cac tct gga agc caa 48 Met Thr Leu Asp Thr Gln Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln 1 5 10 15 tgg cta ctt cca cca ctg aca att ctg ctg ctg ttt gct ttt gca gac 96 Trp Leu Leu Pro Pro Leu Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp 20 25 30 agg cag agt gca gct ctt ccg aag gct gtg gtg aaa ctg gac ccc cca 144 Arg Gln Ser Ala Ala Leu Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro 35 40 45 tgg atc cag gtg ctc aag gaa gac atg gtg aca ctg atg tgc gaa ggg 192 Trp Ile Gln Val Leu Lys Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly 50 55 60 acc cac aac cct ggg aac tct tct act cag tgg ttc cac aac tgg agt 240 Thr His Asn Pro Gly Asn Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Trp Ser 65 70 75 80 tcc atc cgg agc cag gtc caa tcc agc tac acg ttt aag gcc aca gtc 288 Ser Ile Arg Ser Gln Val Gln Ser Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val 85 90 95 aat gac agt gga gaa tat cgg tgt caa atg gag cag acc cgc ctc agc 336 Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser 100 105 110 gac cct gta gat ctg gga gtg att tct gac tgg ctg ctg ctc cag acc 384 Asp Pro Val Asp Leu Gly Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr 115 120 125 cct cag cgg gtg ttt ctg gaa ggg gaa acc atc acg cta agg tgc cct 432 Pro Gln Arg Val Phe Leu Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys Pro 130 135 140 agc tgg agg aac aaa cta ctg aac agg atc tcg ttc ttc cat aat gaa 480 Ser Trp Arg Asn Lys Leu Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu 145 150 155 160 aaa tcc gtg agg tat cat cac tac aaa agt aat ttc tct atc cca aaa 528 Lys Ser Val Arg Tyr His His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys 165 170 175 gcc aac cac agt cac agt ggg gac tac tac tgc aaa gga agt cta gga 576 Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly 180 185 190 agt aca cag cac cag tcc aag cct gtc acc atc act gtc caa gac gag 624 Ser Thr Gln His Gln Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Glu 195 200 205 cgc aaa tgt tgt gtc gag tgc cca ccg tgc cca gca cca cct gtg gca 672 Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 210 215 220 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 720 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 225 230 235 240 atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 768 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 245 250 255 gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc atg gag gtg 816 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val 260 265 270 cat aat gcc aag aca aag cca cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc 864 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe 275 280 285 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc gtg cac cag gac tgg ctg aac ggc 912 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 290 295 300 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc cca gcc ccc atc 960 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile 305 310 315 320 gag aaa acc atc tcc aaa acc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1008 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 325 330 335 tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc 1056 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 340 345 350 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag 1104 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 355 360 365 tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aca cct ccc 1152 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 370 375 380 atg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1200 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 385 390 395 400 gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1248 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 405 410 415 cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct 1296 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 420 425 430 ccg gag ctg caa ctg gag gag agc tgt gcg gag gcg cag gac ggg gag 1344 Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ala Gln Asp Gly Glu 435 440 445 ctg gac ggg ctg tgg acg acc atc acc atc ttc atc aca ctc ttc ctg 1392 Leu Asp Gly Leu Trp Thr Thr Ile Thr Ile Phe Ile Thr Leu Phe Leu 450 455 460 cta agc gtg tgc tac agt gcc acc atc acc ttc ttc aag gtg aag tgg 1440 Leu Ser Val Cys Tyr Ser Ala Thr Ile Thr Phe Phe Lys Val Lys Trp 465 470 475 480 atc ttc tcc tca gtg gtg gac ctg aag cag acc atc gtc ccc gac tac 1488 Ile Phe Ser Ser Val Val Asp Leu Lys Gln Thr Ile Val Pro Asp Tyr 485 490 495 agg aac atg atc agg cag ggg gcc tag 1515 Arg Asn Met Ile Arg Gln Gly Ala 500 <210> 24 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A peptide sequence <220> <221> exon <222> (1)..(63) <400> 24 gga agc gga gct act aac ttc agc ctg ctg aag cag gcg gag acg gga 48 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Glu Thr Gly 1 5 10 15 gga gaa ccc tgg acc 63 Gly Glu Pro Trp Thr 20 <210> 25 <211> 261 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> exon <222> (1)..(258) <400> 25 atg atc tca gcc gtg atc ttg ttc ttg ctc ctt ttg gtg gaa caa gca 48 Met Ile Ser Ala Val Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala 1 5 10 15 gcc gcc ctg gga gag ccg cag ctc tgc tat atc ctg gat gct gtc ctg 96 Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Val Leu 20 25 30 ttt ttg tat ggt att gtc ctt acc cta ctc tac tgt cga ctc aag atc 144 Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile 35 40 45 cag gtc cga aag gca gct ata gcc agc cgt gag aaa gca gat gct gtc 192 Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Ala Ser Arg Glu Lys Ala Asp Ala Val 50 55 60 tac acg ggc ctg aac acc cgg agc cag gag aca tat gag act ctg aag 240 Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ser Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 65 70 75 80 cat gag aaa cca ccc cag tag 261 His Glu Lys Pro Pro Gln 85

Claims (34)

  1. 샘플 중 표적 인자의 검출 방법으로서,
    (a) 샘플을 표적 인자에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 및 바이오센서 세포와 접촉시키고,
    (b) 상기 바이오센서 세포를 세포 활성화에 대해 분석함
    을 포함하며, 상기 바이오센서 세포가 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하고, 상기 키메릭 융합 단백질이 Fcγ 수용체(FcγR) 항체-결합 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    샘플이 공기 샘플, 액체 샘플, 식물성 샘플, 또는 건조 샘플인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    샘플이 혈액, 혈청, 땀, 뇨, 뇌척수액, 점액, 정액, 변, 기관지폐포세척액, 및 조직으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 생물학적 샘플인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    인자가 환경 독소, 오염물질, 또는 약물인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    인자가 세균전 인자, 알레르겐, 기생충 항원, 진균 항원, 바이러스 항원, 세균 항원, 세포 항원, 및 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 생물학적 인자인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    바이오센서 세포가, 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 B 세포, T 세포, 단핵세포, 대식세포, HEK293 세포, CHO 세포, P815, K562, 또는 Cos-1 세포인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    세포 활성화가 세포내 Ca2+ 수준의 증가인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcγR 항체-결합 도메인이 서열번호 1 또는 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 1 또는 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcγR 항체-결합 도메인이 서열번호 2 또는 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 2 또는 4의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 5에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 5에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 6에 제시된 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 6에 제시된 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 방법.
  14. 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 바이오센서 세포로서, 상기 키메릭 융합 단백질이 Fcγ 수용체(FcγR) 항체-결합 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 바이오센서 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    바이오센서 세포가, 키메릭 융합 단백질을 안정하게 발현하는 B 세포, T 세포, 단핵세포, 대식세포, HEK293 세포, CHO 세포, P815, K562, 또는 Cos-1 세포인 바이오센서 세포.
  16. 제14항에 있어서,
    FcγR 항체-결합 도메인이 서열번호 1 또는 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 1 또는 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 바이오센서 세포.
  17. 제14항에 있어서,
    FcγR 항체-결합 도메인이 서열번호 2 또는 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 2 또는 4의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 바이오센서 세포.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 5에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 바이오센서 세포.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 6에 제시된 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 바이오센서 세포.
  20. Fcγ 수용체(FcγR) 항체-결합 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서,
    FcγR 항체-결합 도메인이 서열번호 1 또는 3에 제시된 FcγRI 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 1 또는 3의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  22. 제20항에 있어서,
    FcγR 항체-결합 도메인이 서열번호 2 또는 4에 제시된 FcγRIII 항체-결합 도메인, 또는 서열번호 2 또는 4의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 5에 제시된 면역글로불린 알파(Igα) 신호전달 도메인, 또는 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호전달 도메인이 서열번호 6에 제시된 막 Ig, 또는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 그의 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  25. 제20항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 8에 제시된 FcγRI/Igα 융합 단백질, 또는 서열번호 8의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  26. 제20항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 10에 제시된 FcγRIII/Igα 융합 단백질, 또는 서열번호 10의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  27. 제20항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 22에 제시된 FcγRI/막 Ig 융합 단백질, 또는 서열번호 22의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  28. 제20항에 있어서,
    융합 단백질이 서열번호 23에 제시된 FcγRIII/막 Ig 융합 단백질, 또는 서열번호 23의 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 변이체인 키메릭 융합 단백질.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항의 키메릭 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보성 가닥.
  30. 제29항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 클로닝 벡터.
  31. 제29항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포.
  32. 제30항의 클로닝 벡터를 포함하는 세포.
  33. 제31항의 세포를 키메릭 융합 단백질의 발현을 촉진하는 조건하에서 배양하고 상기 세포 또는 세포 배양물로부터 상기 키메릭 융합 단백질을 회수함을 포함하는, 상기 키메릭 융합 단백질의 생성 방법.
  34. 제32항의 세포를 키메릭 융합 단백질의 발현을 촉진하는 조건하에서 배양하고 상기 세포 또는 세포 배양물로부터 상기 키메릭 융합 단백질을 회수함을 포함하는, 상기 키메릭 융합 단백질의 생성 방법.

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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9752199B2 (en) 2015-03-31 2017-09-05 Fundamental Solutions Corporation Biosensor system for the rapid detection of analytes
WO2018119173A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Fundamental Solutions Corporation Universal biosensor system for analyte detection
US10613083B2 (en) 2016-12-22 2020-04-07 Fundamental Solutions Corporation Universal biosensor system for analyte detection
EP3729080B1 (en) * 2017-12-21 2023-04-19 F. Hoffmann-La Roche AG Universal reporter cell assay for specificity test of novel antigen binding moieties
WO2020188570A1 (en) * 2019-03-19 2020-09-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. T cell expressing an fc gamma receptor and methods of use thereof
IL299276A (en) 2020-06-22 2023-02-01 Univ Ramot Protein modules with cell subunits that express them and their uses

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020111474A1 (en) * 1990-12-14 2002-08-15 Capon Daniel J. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
MX9700800A (es) * 1994-08-02 1997-11-29 Gen Hospital Corp Células portadoras de receptores de señuelo cd4 y moléculas y métodos relacionados.
ES2371432T3 (es) 1998-05-13 2012-01-02 Epimmune Inc. Vectores de expresión para estimular una respuesta inmune y procedimientos de uso de los mismos.
US8216797B2 (en) * 2001-02-07 2012-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Pathogen detection biosensor
US20040009528A1 (en) 2002-07-11 2004-01-15 Shyh-Yu Shaw Protein chips
US7592188B2 (en) * 2004-03-12 2009-09-22 The Scripps Research Institute Live cell biosensors
TW200720439A (en) * 2005-03-25 2007-06-01 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
AU2006350038B2 (en) 2005-11-30 2011-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Pathogen detection biosensor
DE102009013748B4 (de) 2009-03-17 2012-01-26 Paul-Ehrlich-Institut Bestimmung von Interaktionen konstanter Antikörperteile mit Fc-gamma Rezeptoren
WO2011115583A1 (en) 2010-03-19 2011-09-22 National University Of Singapore A novel platform for retrovirus-like particle (vlp)-display of vaccine antigens
EP2558574B1 (en) 2010-04-13 2015-03-18 Sigma-Aldrich Co. LLC Use of endogenous promoters to express heterologous proteins
KR20150038511A (ko) * 2012-08-02 2015-04-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 불활성 면역글로불린 Ｆｃ-영역을 갖는 Ｆｃ-융합체로서의 가용성 ＦｃＲ 의 생산 방법 및 그의 용도

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