KR20170123122A

KR20170123122A - 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제

Info

Publication number: KR20170123122A
Application number: KR1020160052374A
Authority: KR
Inventors: 김택중; 이명헌; 마사히로 이와사; 한권일; 김완재
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단; 니혼 베루무 가부시키가이샤; 한국베름 주식회사
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2017-11-07
Also published as: KR101800632B1

Abstract

본 발명은 엔테로코커스 패칼리스 그 중에서도 특히 엔테로코커스 패칼리스EF-2001, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제에 관한 것으로, 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는 산화스트레스(Oxidative stress)에 의한 근육세포의 손상을 억제하여 현저한 근육감퇴, 약화 및 근위축 치료 효과를 나타내므로, 본 발명의 유산균 사균체 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 또는 이의 배양액은 근위축, 근육감소예방을 위한 약학적 조성물, 식품 조성물 및 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제 {Pharmaceutical composition, food composition or food additives for prevention, improvement or treatment of muscle loss, weakening, and atrophy comprising Enterococcus faecalis, it culture broth or heat killed Enterococcus faecalis as an active ingredient}

본 발명은 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 (Enterococcus faecalis EF-2001), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 포함하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방 및 치료/개선용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품 첨가물에 관한 것이다.

근력의 약화를 유발하는 질환은 노화와 함께 진행되는 근감소증(sarcopenia), 단백질 대사의 불균형이나 근육사용 감소에서 유발되는 근위축증(muscle atrophy), 기아, 소모성질환(암 등), 노화와 함께 진행되는 심위축증(acardiotrophy) 등이 있다.

근감소증(sarcopenia)은 노화가 진행되는 동안 근육량(skeletal muscle mass) 감소에 따른 근력의 저하를 일컫는다. 근감소증의 가장 큰 특징인 근육량의 감소뿐만이 아니라, 근섬유의 종류 변화도 관찰된다. 나이가 들어가면 타입 1과 타입 2가 비슷한 비율로 감소하는데 반해, 근감소증이 오면 타입 2의 근섬유 두께에는 큰 변화가 없지만 타입 1 근섬유 두께는 눈에 띄게 감소한다. 이러한 근감소증은 노인들 사이에서 일어나는 노쇠와 기능 장애를 유발한다고 보고되고 있다(Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001).

근감소증은 다양한 요인에 의해 유발되나, 각각의 요인들에 대한 연구는 아직 미진하다. 성장 호르몬의 감소 또는 신경학적 변화(neurological change), 생리활성(physical activity)의 변화, 대사의 변화, 성호르몬의 양 또는 지방이나 카타볼릭 싸이토카인(catabolic cytokines)의 증가와 단백질의 합성과 분화의 균형 변화에 의해 유도된다(Roubenoff R. and Hughes V.A., J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 55, M716-M724, 2000). 근감소증의 가장 큰 특징인 근육량 감소의 원인으로는 위성 세포의 활성 (satellite cell activation) 감소가 중요한 원인으로 손꼽힌다. 위성 세포란, 기저막(basement membrane)과 근섬유의 근(sarcolemma) 사이에 위치하고 있는 작은 단핵 세포이다. 이들은 부상 또는 운동과 같은 자극에 의해 활성화되어 근원세포(myoblast)로 증식하며, 분화가 진행되면 다른 세포와 융합되어 다핵의 근섬유를 형성한다. 따라서 위성 세포의 활성이 감소함에 따라 손상된 근육을 재생하는 능력이나 분화 신호에 대한 반응이 떨어지게 되고 그 결과 근육 형성이 저하된다.

한편, 근위축(muscle atrophy)은 근육의 사용 감소와 같은 기계적 자극의 부재에 의한 근육 조직의 손상, 직접적인 상해나 물리적 요인에 의한 근육의 파괴, 노화에 의한 근육 세포의 회복력 장애, 그리고 근육의 작용을 조절하는 신경의 손상으로 인한 근육 사용의 장애와 같은 요인에 의해 발생한다(Booth FW., J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol., 1982). 일반적인 경우 장애나 사고에 의해 장기간 해당 부위와 주변부의 근육을 사용하지 않아 근육 강도의 소실로 인해 점차 근위축으로 진행되는 무용성근위축(disuse atrophy)이 나타나며, 근육 자체의 질병으로 인한 중증 근무력증(myasthenia gravis), 근이영양증(dystrophy): 진행성 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 듀센형, 베커형, 지대형, 안면견갑상완형, 근육 자체에 발생하는 염증, 근육을 지배하는 신경의 손상으로 인한 근위축인 척수성 근위축(spinal muscular amyotrophy) : 베라드니히-호프만형, 쿠겔베르그, 벨란더병, 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) : 루게릭병, 척수구근 근위축(sphinobulbar muscular atrophy) : 케네디병 등의 형태로도 발병된다.

오늘날 윤택해진 삶의 질과 생활을 토대로 사람들의 관심사는 의식주에 집중되었던 과거에 비해 점점 복지와 여가생활로 집중되고 있으며 운동을 통한 건강한 삶을 영위하려 노력하고 있다. 그리고 이러한 생활을 영위하기 위해서는 수의근의 자유로운 조절과 사용이 전제되어야 하며, 근육 기능 이상으로 인한 수의근의 사용이 불가능한 상황은 사람의 활동 범위를 한정시키고 이로 인한 삶의 질을 저하시키는 결과를 초래한다.

근감소증의 치료방법으로는 크게 3가지를 들 수가 있다. 첫 번째는 운동이다. 운동은 단기적으로 골격근의 단백질 합성 능력을 증가시키며, 노인들의 근육의 힘이나 운동성을 증가시킨다고 보고되고 있다. 그러나 장기적 치료방법에 부적절하다(Timothy J. Doherty, J. Appl. Physiol. 95, 1717-1727, 2003). 두 번째는 약물치료로서 테스토스테론(Testosterone) 또는 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid)의 사용이 가능하나 이는 여성에게는 남성화를 유도하며, 남성의 경우 전립선 증상(prostate symptoms) 등 부작용을 나타낸다. 다른 승인된 처방법으로 DHEA(dehydroepiandrosterone) 와 성장 호르몬이 있는데 SARMs(Selective Androgen Receptor Modulators)을 포함하는 부위에서 치료법으로 가능하다는 연구가 보고된 바 있다(D.D. Thompson, J. Musculoskelet Neuronal Interact 7, 344-345, 2007). 최근에는 위성 세포를 분리하여 체외에서 분화시킨 후 체내에 도입시키는 줄기세포치료법(stem cell therapy)과 직접 체내의 위성 세포를 활성화하여 근육 분화(myogenesis)를 촉진시켜 근육을 유지하거나 강화시키는 방법이 근감소증과 같은 근력약화를 치료할 수 있는 방법으로 대두되고 있다(Shihuan Kuang, and Michael A. Rudnicki, Trends in Molecular Medicine 14, 82-31, 2008).

일반적으로 일상에서 근위축의 발병을 예방하기 위해 할 수 있는 가장 좋은 방법은 지속적인 근육의 사용을 통한 근육의 소실 예방이지만 부상이나 장애 등과 같이 본인의 의지와 상관없이 근육의 사용이 불가능해지는 경우에도 근육의 퇴화에 의한 근위축이 발생할 수 있다. 이러한 경우에도 근육에 자극을 주거나 근육의 퇴화를 예방하여 근위축을 막을 수 있는 대응책과 그에 대한 연구가 필요하다.

활성 산소 종(reactive oxygen species)은 화학적으로 반응성이 큰 분자 집단으로써 주변 물질들과 전자를 주고받으려는 산화 환원 반응에 대한 성질이 강하여 높은 반응성을 나타내는 물질이다. 이러한 활성 산소 종의 반응성으로 인해 세포 내 단백질분자나 DNA와 같은 주위 물질들은 전자를 잃고 산화되어 변이를 나타내게 되고 올바른 기능을 수행하지 못하게 되며 올바른 기능을 수행할 수 없게 된 세포는 생존이 불가능해져 세포사멸이 유도될 수 있다. 이와 같은 스트레스의 여러 요인 중 활성 산소 종에 의한 산화 스트레스는 근육세포에서도 나타나며 이러한 산화 스트레스에 의해 근육 세포의 소실과 근위축이 유도될 수 있다. 다양한 스트레스 요인들은 근육 조직의 손상뿐만 아니라 생체 내 여러 조직에 영향을 주는 것으로 보여져 여러 가지 질병의 요인들로 주목받고 있다(MCKinnell IW., and Rudnicki MA., Cell, 2004).

엔테로코커스 패칼리스 EF-2001(Enterococcus faecalis EF-2001)은 2세 여아의 장내 세균총 스크리닝을 통하여 동정되었다. 이러한 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 열처리하여 사멸시키고 균체 성분을 회수한 것이 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체이다.

엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 생리활성에 대해 보고된 연구들에 따르면 DSS(Dextran sulfate sodium)로 유도된 대장염을 앓고 있는 마우스의 경우 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 섭취한 마우스에서 DSS 완화 효과를 보였으며 이식한 육종암세포(Sarcoma-180)의 증식이 감소되고 NK세포가 활성화됨이 보고되었다(Tadano et al., J. Japan Mibyou System association, 2011). 또한, 생화학적으로는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 섭취시킨 마우스의 경우 고지방 식이를 섭취한 후에도 총 콜레스테롤 및 중성지방의 비율이 저하됨이 보고되었다(Ku et al., Medicine and biology, 2007). 또한, 유해균의 억제 및 정장 작용에 관해서, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001은 백태의 원인인 Candida albican의 활동성을 억제하여 증세 개선 및 예방 효과를 나타내며(Ishijima et al., Med. Mycol. J, 2014), 항생제를 투여한 마우스에서 장내 대조군에 비해 유익균은 빠르게 증식하고 유해균은 억제시키는 효능이 개시되어 있다(Simohashi et al., Medicine and biology, 2002). 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 다양한 생리활성은 사균체의 특성상 열과 pH에 영향을 받지 않아 다양한 형태의 제제로 가공이 가능한 장점이 있다(Kan, Food industry, 2001). 또한 그램당 7조 5천억 마리의 균체 함량으로 적은 양으로도 다량의 유산균체 섭취가 가능하다.

한편, 근위축증 치료제에 관한 선행문헌으로, 한국등록특허 제1,560,799호에는 hnRNP M(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M) 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 척수성 근위축증 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1,468,123호에는 포유동물 탯줄 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1,385,191호에는 치커리(Cichorium intybus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근위축 예방 및 치료용 의약 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1,349,361호에는 등골나물(Eupatorium chinensis var. simplicifolium) 추출물을 유효성분으로 포함하는 근위축 예방 및 치료용 의약 조성물이 개시되어 있을 뿐, 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체의 근위축에 대한 효과에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 세포독성이 없고, 인체에 안전성이 확보된 신규한 근육감퇴, 약화 및 근위축증 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체가 세포독성이 없고, 인체에 안정성이 확보되어 있으며, 산화스트레스(Oxidative stress)에 의한 근육세포의 손상 및 세포사멸을 억제하여 현저한 근육감퇴, 약화 및 근위축 치료효과를 나타냄을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제1560799호 (등록일 2015.10.08) 한국등록특허 제1349361호 (등록일 2014.01.02)

Roubenoff R., Can. J. Appl. Physiol. 26, 78-89, 2001 Roubenoff R. and Hughes V.A., J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 55, M716-M724, 2000 D.D. Thompson, J. Musculoskelet Neuronal Interact 7, 344-345, 2007 Shihuan Kuang, and Michael A. Rudnicki, Trends in Molecular Medicine 14, 82-31, 2008 Timothy J. Doherty, J. Appl. Physiol. 95, 1717-1727, 2003 Tadano et al., J. Japan Mibyou System association, 2011 Ku et al., Medicine and biology, 2007 Ishijima et al., Med. Mycol. J, 2014 Simohashi et al., Medicine and biology, 2002 Kan, Food industry, 2001

종래 엔테로코커스 패칼리스의 근육의 근력 약화 관련 질환 치료용도에 대해서 알려진 바가 없었다. 따라서 본 발명은 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 인체에 대한 안정성을 입증하고, 산화스트레스(Oxidative stress)를 원인으로 하는 근육세포의 손상을 억제하여 현저한 근육감퇴, 약화 및 근위축 치료 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 목적은 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 및 이의 배양액의 근육감퇴, 약화 및 근위축 질환 치료효능을 입증하고 새로운 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방 및 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 첨가물을 제공한다.

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001(Enterococcus faecalis EF-2001) 사균체는 세포 독성이 없고, 산화 스트레스(Oxidative stress)에 의한 근육세포의 손상을 억제하여 현저한 근육감퇴, 약화 및 근위축 치료 효과를 나타내므로, 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분, 식품 조성물 및 식품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 (Enterococcus faecalis EF-2001)의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 2는 산화 스트레스(Oxidative stress)로 유도된 근육세포 손상에 대한 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 효과를 확인한 도이다. NAC는 양성대조군인 N-아세틸 시스테인 처리군이다.
도 3은 산화 스트레스 환경에서 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 근육 세포 내 HSP70(Heat Shock Protein) 단백질의 발현 변화 비교를 확인한 도이다.
도 4는 쥐의 우측 뒷다리 궁둥 신경을 절제하여 근육의 움직임을 제한해 근위축을 유도하는 수술 후 2 mg/kg과 30 mg/kg 두 개의 서로 다른 농도의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 경구 투여하는 시기 및 실험 계획을 나타낸 도이다.
도 5는 쥐의 우측 뒷다리 궁둥 신경을 절제하여 근육의 움직임을 제한해 근위축을 유도하는 수술을 한 후 수술 1주 전부터 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 매일 섭취시킨 예방군과 수술 후 3주간 매일 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 섭취시킨 치료군의 근육을 수술 3주 후 미세 단층 촬영 장치를 이용하여 촬영한 근육 영상을 나타낸 도이다.
도 6은 도 5에 나타낸 촬영된 영상을 기반으로 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 섭취여부에 따라 근위축에 미치는 영향과 차이를 비교 분석하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 엔테로코커스 속 미생물은 자연계에 널리 존재하며 탄수화물을 호기적으로 이용한다. 일반적으로 엔테로코커스 속 미생물과 같은 세균은 생체내 길항작용이나 분비 항균성 물질에 의하여 병원성 미생물에 의한 피해를 예방한다고 알려져 있다.

상기 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체는 시판되는 것, 또는 공지된 사균체 제조법으로 제조된 것 중 어느 것을 이용하여도 무방하며, 독성을 나타내지 않고, 인체에 무해하다.

상기 배양액은 엔테로코커스 패칼리스를 배양 배지에서 배양하여 수용한 배양액, 농축 배양액, 배양액 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하는 것으로 상기 균주를 포함하는 것, 배양한 후 균주를 제거한 배양여액일 수 있다.

상기 사균체는 상응한 생균체를 열처리하거나 포르말린 또는 기타 살균제와 함께 처리하여 제조할 수 있으며 사균체는 실질적으로 죽어 있는 것이어도 사용가능하다. 또한, 본 발명에서 사용한 상기 사균체는 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:

1) 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis)를 종균배양한 후, 중성 또는 약산성에서 20~40 ℃의 온도범위에서 본 배양하는 단계;

2) 상기 1)의 본 배양한 후 열처리 후 건조하는 단계;

상기 근육의 "근력 약화"란 한 개 또는 그 이상의 근육의 힘이 감소된 상태를 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있다. 또한 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.

상기 근력 약화 관련 질환이란 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근감소증 또는 근위축증 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 근감소증은 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.

상기 근위축은 근육을 사용하지 않음으로써 발생하는 근육조직의 손실로 인한 근위축, 근육 자체의 병으로 인한 근위축 또는 근육을 지배하는 신경의 손상으로 인한 근위축인 것이 바람직하다. 상기 근육을 사용하지 않음으로써 발생하는 근육 조직의 손실로 인한 근위축은 무용성 근위축(disuse atrophy), 상기 근육 자체의 병으로 인한 근위축은 중증근무력증(myasthenia gravis) 또는 근이영양증(dystrophy), 근육을 지배하는 신경의 손상으로 인한 근위축은 척수성 근위축(spinal muscular amyotrophy), 근위축성 축삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 또는 척수구근 근위축(sphinobulbar muscular atrophy)인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실험예에서, 본 발명자들은 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체가 세포 독성이 없음을 확인하였으며(도1 참조) 산화 스트레스로 유도된 근육세포 손상에 있어서 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 처리시 농도에 따라 근육세포의 생존율이 회복되는 효과를 확인하였다(도2 참조). 또한 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 첨가한 세포에서 HSP70 단백질 양의 변화를 측정한 결과 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체가 근육세포의 HSP70 단백질의 발현양을 증가시켜 근위축 억제를 유도함을 알아내었으며, 근육감소를 유도한 마우스에 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 섭취시킨 후 감소된 근육량이 다시 회복됨을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는 세포 독성이 없고, 산화 스트레스로 유도된 근육세포의 손상을 억제하여 현저한 근위축 치료 효과를 나타내므로, 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 포함하는 근위축, 근육 감소 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.2 mg 내지 17 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 유산균 사균체 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸 렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 근육의 근력 약화 관련 질환이란 근력약화로 인해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미하며, 예를 들어 근감소증 또는 근위축증등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 근감소증은 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로써, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.

결론적으로, 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 또는 이의 배양액은 세포 독성이 없고, 산화 스트레스로 유도된 근육세포의 손상을 억제하여 현저한 근육감소 또는 근위축 예방 및 치료 효과를 나타내므로, 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 포함하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 유산균 사균체 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001이 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공 식품 및 건강 기능 식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 필수 성분이 지시된 비율로 상기 화합물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 10 g이다.

아울러, 본 발명은 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 식품 첨가제는 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 첨가 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 리놀레산 100 중량부당 0.1 내지 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로 건강기능식품 내 본 발명의 조성물의 양은 전체 식품 중량부당 0.1 내지 90 중량부로 할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체의 제조준비

본 발명에서 사용한 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 하기와 같이 제조 및 준비하였다.

구체적으로, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 일반적인 유산균 배양에 사용되는 배지에 호기 또는 혐기 배양을 하였으며 종균배양을 거친 후 본 배양을 하였다. pH는 중성 또는 약산성, 배양온도는 20~40 ℃를 유지하면서 1~3 일간 배양하였다. 최종 원료를 기준으로 g(그램)당 균체의 수가 7조 5천억 이상에 이르도록 발효가 진행되면 열 처리 후 건조 과정을 거쳐 분말화하였다.

<실시예 2> 세포의 배양

정상근육세포(C2C12)를 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 5 % 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 즉, 75 ㎠ 플라스틱 플라스크(SPL life science Co., Ltd. Korea)에 정상 골격 근육세포를 10 % FBS, 7.5 % NaHCO₃ 150 μg/ml, 글루타민 58.4 μg/ml 및 항생제(antibiotic)/항진균제(antimycotics) 4.4 μl/ml가 함유된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5 % CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 2~3일마다 한 번씩 2차 배양하여 세포주를 유지하였다.

<실시예 3> 세포 정량

세포가 자란 75 ㎠ 플라스틱 플라스크에서 배지액을 제거하고, CMF-PBS (calcium magnesium free-phosphate buffered saline, pH 7.2)로 세척한 후, 0.25 % 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떼어내고 세포 배양액으로 중화시킨 후 원심분리(1200 rpm, 5 min) 하였다. 남은 세포의 펠렛(pellet)에 배양액을 가한 다음, 멸균 피펫으로 반복 흡입하여 단일 세포 부유액을 제조하였다. 제조한 세포 부유액과 트립판 블루(trypan blue)를 1:1의 비율로 혼합하여 광학 현미경상에서 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 측정하였다.

<실험예 1> 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체의 세포 독성(Cell viability) 확인

엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체의 근육세포에 대한 독성 측정은 EzCytox 키트를 이용하였다. 구체적으로, 정상근육세포(C2C12)를 96 well plate에 2×10⁴cells/well이 되도록 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양한 후, 0, 25, 50, 100, 250, 500 μg/ml의 다양한 농도의 리놀레산을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 정상 근육 세포를 대상으로 EzCytox키트를 이용하여 세포 생존율을 계산함으로써 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체의 세포 독성을 결정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 첨가하지 않았을 경우 근육세포는 100 %의 생존률을 나타내었으며, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 여러 농도로 첨가한 군에서 역시 리놀레산을 첨가하지 않은 군과 비슷한 생존률을 보였다. 따라서 본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는 근육세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 1).

<실험예 2> 산화 스트레스로 유도된 근육세포 손상에 대한 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체의 효과 확인

H₂O₂로 유도된 세포사멸에 있어서 EF-2001 사균체의 농도별 효과를 확인하기 위하여, 먼저 96 well plate에 근육세포를 2×10⁴ cells/well이 되도록 넣고, 24시간동안 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 그런 다음, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 0, 25, 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 각각 첨가한후, 10 % FBS-DMEM 배지로 전체부피를 195 ㎕로 조절하여 37 ℃, 5 % CO₂의 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 이 배양액에 H₂O₂를 1 mM농도로 전체 부피가 200 ㎕가 되게 첨가한 다음, 이를 다시 120 분간 배양하였다. 배양 후, EzCytox kit 10 ㎕를 첨가하고, 1시간 후 흡광도를 측정하여 그 효과를 결정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, H₂O₂를 첨가하지 않았을 경우 근육세포는 100 %의 생존율을 나타내었으며, H₂O₂를 처리시 세포 생존율이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 처리시 농도에 따라 근육세포의 생존율이 회복되는 효과를 확인하였다(도 2). 따라서 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는 농도 의존적으로 산화 스트레스에 대한 근육 세포의 손상을 유의적으로 회복시킴을 확인하였다.

<실험예 3> HSP70(Heat Shock Proein) 단백질의 발현 변화 비교

엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 첨가한 첨가군 세포에서 HSP70(Heat Shock Proein) 단백질 양의 변화를 웨스텐 블롯(western blot)을 이용하여 측정하였다. 즉, 정상 근육 세포(C2C12)를 96 well plate에 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주한 후, 이를 37 ℃, 5 % CO₂조건의 배양기에서 배양하였다. 그 후, 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 25 μg/ml 첨가한후, 10 % FBS-DMEM 배지로 전체 부피를 2 ml로 조절하여 37 ℃, 5 % CO₂조건에서 24시간 배양하였다. 이 배양액에 H₂O₂를 1 mM 농도로 전체 부피가 2 ml이 되게 첨가한 다음, 이를 다시 60 분간 배양한 후, 세포를 파쇄하여 단백질을 획득하였다. 웨스턴 블롯을 이용하여 HSP70과 베타엑틴 항체를 사용해 HSP70 단백질의 발현량을 검출하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 첨가한 첨가군에서는 정상세포의 HSP70 단백질 발현 수준까지 회복하였다. 따라서 본 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는 근육세포의 HSP70 단백질의 발현 증가를 유발함으로써 근위축 억제를 예방할 수 있음을 알 수 있었다.(도 3 참조)

<실험예 4> 근육감소를 유도한 마우스에 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체를 섭취시킨 후 근육 감소 회복 능력 비교

엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체의 근위축 예방 및 회복 효과를 확인하기 위해 근위축 유발 전 초기 근육량 측정을 위해 미세 단층 촬영 장치를 이용하여 근육 영상을 획득하였다. 근위축을 유발하기 위하여 쥐의 우측 뒷다리 궁둥 신경을 절제하여 근육의 움직임을 제한해 근위축을 유도하였다. 도 4에 표시한 디자인으로 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 2 mg/kg 과 30 mg/kg 두개의 농도로 쥐에게 경구 투여 방법으로 섭취시켰다. 예방군은 근위축을 유도하는 수술 1주 전부터 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 매일 섭취시켰으며, 치료군은 근위축을 유도하는 수술 후 매일 3주간 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 섭취시켰다. 수술 3주 후 미세 단층 촬영 장치를 이용하여 근육 영상을 획득하여 도 5에 표시하였고, 촬영된 영상을 기반으로 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 섭취 여부에 따라 근위축에 미치는 영향과의 차이를 비교 분석하였다.

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 3주에서 4주 간 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001을 섭취시킨 결과 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 섭취군의 근육양이 근위축군(Denervation)에 비해 회복되었음을 확인하였다. (도 4 참조)

<제조예 1> 약제의 제조

1. 산제의 제조

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 1 mg ~ 10 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 1 mg ~ 10 g

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 1 mg ~ 10 g

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 주사제의 제조

엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 1 mg ~ 10 g

만니톨 180 mg

Na₂·HPO₄·2H₂O 26 mg

증류수 2974 mg

통상적인 주사제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

<제조예 2> 건강 식품의 제조

1. 건강 식품의 제조

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 1 mg ~ 10 g

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 mg

판토텐산칼슘 0.5 mg

무기질혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합조성 하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

본 발명의 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체 1 mg ~ 10 g

구연산 1000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가한 전체 900 ml

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001(Enterococcus fecalis EF-2001)인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 사균체인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는, 엔테로코커스 패칼리스를 종균 배양한 후, 중성 또는 약산성 및 20~40 ℃의 온도범위에서 본 배양 한 다음, 열처리를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 근육세포 내 HSP70 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 질환은 근감소증 또는 근위축증인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 근위축증은 무용성근위축(disuse atrophy), 중증근무력증(myasthenia gravis), 근이영양증(dystrophy), 척수성 근위축(spinal muscular amyotrophy), 근위축성 축삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 및 척수구근 근위축(sphinobulbar muscular atrophy)으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군에서 선택되는 형태의 제제인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 사균체인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001 사균체는, 엔테로코커스 패칼리스를 종균 배양한 후, 중성 또는 약산성, 및 20~40 ℃의 온도범위에서 본 배양 한 다음, 열처리를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 질환은 근감소증 또는 근위축증인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 근위축증은 무용성근위축, 중증근무력증, 근이영양증, 척수성 근위축, 근위축성 축삭 경화증 및 척수구근 근위축으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 식품에 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제, 천연 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산, 팩트산 염, 알긴산, 알긴산염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 및 과육 중 선택된 하나 이상의 첨가제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 첨가물.
제 16항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스는 엔테로코커스 패칼리스 EF-2001의 사균체인 것을 특징으로 하는 근육의 근력 약화 관련 질환의 예방 및 개선용 식품 첨가물.