KR20170069699A - 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법 - Google Patents

폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리글루탐산이 증가된 청국장의 제조방법에 관한 것으로 (A) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계; 및 (B) 표면이 70 내지 80 인 상기 증숙된 대두에 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종시켜 발효시키는 단계;를 포함함으로써, 분자량이 200 kDa 이상인 고분자량 폴리글루탐산이 생성되며, 생성되는 폴리글루탐산의 함량이 종래에 비하여 1.5 내지 2.5배 증가한다.

Description

폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법{Preparation method of cheonggukjang for increasing poly glutamic acid}
본 발명은 고분자량의 폴리글루탐산이 생성되며, 생성되는 폴리글루탐산의 함량이 종래에 비하여 1.5 내지 2.5배 증가된 청국장의 제조방법에 관한 것이다.
우리나라 전통 대두 발효식품인 청국장은 미생물 발효를 통하여 2~3일에 완성되는 전통발효 식품으로서, 미생물의 효소작용에 의해 콩단백질이 분해되어 특유의 구수한 맛과 향을 내고 끈적한 점질물이 생성된다. 또한, 상기 청국장은 콩 유래의 단백질, 탄수화물 및 지방질 등의 영양성분 이외에도 식이섬유, 인지질, 이소플라본(isoflavone), 페놀린산, 사포닌, 트립신 저해제, 피틴산 등을 포함하고, 비타민, 필수아미노산 등의 필수 영양소 및 약효성분이 다량 함유되어 있다.
지금까지 알려진 청국장의 효능으로는 혈중 콜레스테롤 저하, 고혈압 예방, 항암, 항산화, 혈전용해, 골다공증 예방, 간 기능 개선 등이 있다.
한편, 청국장의 발효는 대두의 종류, 사용균주, 발효온도 및 습도 등에 의해 큰 영향을 받는다. 미생물을 이용하기 때문에 발효조건의 차이에 따른 특유의 풍미가 청국장의 품질에 큰 영향을 미치는 요인이 되고 있다.
종래의 청국장을 제조하는 방법은 대두를 세척하여 뜨거운 물에 넣고 삶은 후, 대두와 볏짚을 섞어 일정온도에서 발효시킨 것이다. 식생활의 변화와 주거문화의 서구화로 인하여 청국장의 소비는 점차 감소하고 있으며, 대두가 발효되는 과정에서 대두를 삶을 때 스며든 수분도 함께 발효됨으로 인해 역겨운 냄새가 발생하게 되고, 이로 인해 청국장 조리과정 중 발생하는 특유한 이취는 영양이 풍부하여 인체에 유익함에도 불구하고, 어린이나 젊은층에게는 기호도가 감소하여 대중화하는데 제한적이라는 문제점이 있어 왔다.
상기 끈적한 점질물은 폴리글루탐산(γ-PGA)이라고 하며, 면역력 증가와 항암효과가 보고되어 있고, 또한 흡수성이 뛰어나 식품, 화장품에 사용될 뿐만 아니라, 약물 전달 물질로도 사용되고 있다.
발효조건에 따라 γ-PGA의 수율이 영향을 받으며, γ-PGA의 수율이 제품 품질의 척도가 되고 있다.
청국장의 기호성과 품질 개선을 위한 종래기술로는 약용식물이나 천연소재를 첨가한 생약초 청국장, 홍삼 청국장, 녹차 청국장, 키토산 청국장 등이 보고되고 있으나, 청국장 제조공정에 따른 품질 및 관능적 특성에 대한 연구는 미미하고, 우리나라 청국장 생산업체에서는 표준화된 제조공정으로 청국장을 생산하는 업체가 거의 없는 실정이다.
따라서, γ-PGA의 함량이 증가하는 등의 품질이 향상된 청국장을 대량으로 제조하는 기술이 요구되고 있다.
대한민국 공개특허 제2015-0123201호 대한민국 등록특허 제0521503호
본 발명의 목적은 고분자량의 폴리글루탐산이 생성되며, 생성되는 폴리글루탐산의 함량이 종래에 비하여 1.5 내지 2.5배 증가된 청국장의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장을 제조하는 방법은 (A) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계; 및 (B) 표면온도가 70 내지 80 ℃인 상기 증숙된 대두에 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종시켜 발효시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 (a) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계; (b) 상기 증숙된 대두와 볏짚을 혼합하여 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효된 대두에 70 내지 80 ℃로 3 내지 10분 동안 열충격을 가한 후 고체배지에서 배양하여 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 선별하는 단계;를 포함하는 과정을 통해 수득될 수 있다.
상기 수득된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 (d) 상기 수득된 바실러스 서브틸리스 균주를 LB(luria-bacteria) 배지에서 배양시키는 단계; (e) 상기 배양된 균주를 고체배지에 스트리킹하여 얻은 단일 클로닝을 LB(luria-bacteria) 배지에서 활성화시키는 단계; 및 (f) 상기 활성화된 균주가 함유된 LB배지에 대두열수 추출물에 첨가하여 배양시키는 단계;를 포함하는 과정을 거친 후 상기 (B)단계의 증숙된 대두에 접종될 수 있다.
상기 (b)단계에서 증숙된 대두와 볏짚은 1 : 0.2 내지 1의 부피비로 혼합하여 발효될 수 있다.
상기 (B)단계에서 증숙된 대두와 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 1 : 0.00001 내지 0.01의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명의 청국장은 분자량이 200 KPa 이상인 고분자량 폴리글루탐산이 생성되며, 생성되는 폴리글루탐산의 함량이 종래에 비하여 1.5 내지 2.5배 증가될뿐만 아니라, 대량 생산이 가능하다.
도 1은 증자된 대두와 볏짚을 혼합하여 발효시키는 과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 촬영한 사진(위) 및 상기 균주를 확대한 사진(아래)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 청국장으로부터 분리한 순수 γ-PGA를 촬영한 사진이다.
도 4A는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 청국장으로부터 분리한 순수 γ-PGA를 전기영동 후 CBB(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하고 탈색한 사진이다.
도 4B는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 청국장으로부터 분리한 순수 γ-PGA를 전기영동 후 MB(methylene blue)로 염색하고 탈색한 사진이다.
본 발명은 고분자량의 폴리글루탐산이 생성되며, 생성되는 폴리글루탐산의 함량이 종래에 비하여 1.5 내지 2.5배 증가된 청국장의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 폴리글루탐산 함량이 증가된 청국장을 제조하는 방법은 (A) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계; 및 (B) 표면온도가 70 내지 80 ℃인 상기 증숙된 대두에 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종시켜 발효시키는 단계;를 포함한다.
먼저, 상기 (A)단계에서는 대두를 수세한 후 증숙시킨다.
상기 대두를 증숙시키는 방법은 종래의 방법과 동일하며, 구체적으로는 물이 담긴 세척조에 대두를 넣고 세척한 후 15 내지 20 ℃의 물에 7 내지 8시간 동안 침지시켜 대두를 불린 후 상기 불린 대두를 스팀기에 넣어 100 내지 120 ℃의 온도로 5 내지 9시간 동안 삶아서 증숙시킨다.
다음으로, 상기 (B)단계에서는 상기 증숙된 대두에 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종시켜 발효시킨다.
상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 내성 포자를 형성한 균주로서, 증숙된 대두의 표면온도가 70 내지 80 ℃, 바람직하게는 75 내지 80 ℃일 때 대두에 접종시켜 고온 자극에 의해 포자가 발아자극을 받아 발효시간을 단축시킨다. 구체적으로, 종래 30시간이었던 발효시간을 22 내지 25시간으로 단축시킴으로써, 약 20 내지 36% 발효시간이 단축되었다.
접종 온도(대두의 표면온도)가 상기 하한치 미만인 경우에는 초기 다른 미생물의 오염이 발생되고 포자 상태에서 초기 미생물의 증식 속도가 느려 발효가 느리며, 상기 상한치 초과인 경우에는 발효가 수행되지 않을 수 있다.
또한, 상기 증숙된 대두 1 중량부에 대하여 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 0.00001 내지 0.01의 중량부로 접종되는데, 균주의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 폴리글루탐산의 함량이 증가되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 청국장의 관능성이 저하될 수 있다.
또한, 상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 에어스프레이건으로 에어로졸 분사되어 상기 증숙된 대두에 접종된다. 바실러스 서브틸리스 균주를 에어로졸 분사하면 증숙된 대두에 일정량을 골고루 접종시킬 수 있는데, 상기 에어로졸 분사가 아니라 주사기 또는 피펫 방법으로 액체 접종시키는 경우에는 증숙된 대두에 골고루 접종되지 않아 효과가 저하될 수 있다.
상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 접종된 대두는 35 내지 40 ℃, 습도 90 내지 95%에서 22 내지 26시간 동안 발효된다. 상기 발효를 대량을 실시하는 경우에는 다수개의 채반이 적층된 발효대차를 이용하는데, 상기 발효대차의 최하층의 채반은 지면으로부터 15 내지 20 cm 떨어진 위치에 구비되며, 적층된 채반끼리의 간격 역시 15 내지 20 cm를 유지함으로써 공기순환을 원활히 하여 상기 채반위에 올려진 청국장을 균일하게 발효시킨다. 상기 공기순환이 원활하다는 것은 발효 온도 및 습도가 각 채반에 위치한 모든 청국장에 균일하게 제공된다는 의미이다.
상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 볏짚을 이용하여 분리한 균주로서, 하기의 방법에 따라 제조된다.
상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 (a) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계; (b) 상기 증숙된 대두와 볏짚을 혼합하여 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효된 대두에 열충격(heat shock)을 가한 후 고체배지에서 배양하여 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 선별하는 단계를 통해 수득된다.
또한, 상기 수득된 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스 균주를 청국장 제조를 위해 대두에 접종시키기 위하여 (d) 상기 수득된 바실러스 서브틸리스 균주를 LB(luria-bacteria) 배지에서 배양시키는 단계; (e) 상기 배양된 균주를 고체배지에 스트리킹(streaking)하여 얻은 단일 클로닝(cloning)을 LB(luria-bacteria) 배지에서 활성화시키는 단계; 및 (f) 상기 활성화된 균주를 대두열수 추출물에 접종하여 배양시키는 단계;를 포함하는 과정을 수행한다.
먼저, 상기 (a)단계에서는 상기 (A)단계와 동일한 방법으로 대두를 수세한 후 증숙시킨다.
다음으로, 상기 (b)단계에서는 상기 증숙된 대두와 볏짚을 혼합하여 발효시킨다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상기 증숙된 대두와 볏짚은 1 : 0.2 내지 1의 부피비, 바람직하게는 1 : 0.3 내지 0.7의 부피비로 혼합된다. 증숙된 대두를 기준으로 볏짚의 부피가 상기 하한치 미만인 경우에는 폴리글루탐산의 함량을 증가시키기 위한 원하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 얻을 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 매우 소량으로 수득될 수 있다.
상기 발효는 35 내지 40 ℃의 온도, 90 내지 95%의 습도하에서 22 내지 26시간 동안 수행된다. 온도, 습도 및 시간의 발효조건이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 폴리글루탐산의 함량이 증가시키기 위해 원하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주가 얻어지지 않거나 소량으로 수득될 수 있다.
다음으로, 상기 (c)단계에서는 상기 발효된 대두에 열충격을 가한 후 고체배지에서 배양하여 폴리글루탐산의 함량이 증가시키기 위해 원하는 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 선별한다.
구체적으로, 상기 발효된 대두를 70 내지 80 ℃로 3 내지 10분, 바람직하게는 5 내지 7분 동안 열충격을 가하여 활성이 강한 포자를 선별한 후 상기 포자를 고체배지에서 35 내지 40 ℃로 45 내지 50시간 동안 배양하여 원하는 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 수득한다.
상기 열충격을 수행하지 않는 경우에는 상기 (B)단계에서 표면온도가 70 내지 80 ℃인 대두에 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종시 균주가 대부분 사멸할 수 있다.
상기 고체배지로는 TSA(Trypticase soy agar)를 들 수 있다.
다음으로, 상기 (d)단계에서는 상기 수득된 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스 균주를 LB(luria-bacteria) 배지에서 배양시킨다.
상기 (c)단계에서 수득된 순수한 바실러스 서브틸리스 균주를 LB 배지에서 35 내지 40 ℃로 20 내지 25시간 동안 배양시켜 스토크(stock)를 제조한다.
상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스 균주를 장시간 보관하기 위해서는 50% 글리세롤 용액과 상기 LB 배양액을 1 : 3 내지 6의 비율로 혼합한 후 동결건조시킨다.
다음으로, 동결건조된 균주를 사용하기 위하여 상기 (e)단계에서는 상기 동결건조된 균주를 고체배지에 스트리킹하여 얻은 단일 클로닝을 LB 배지에서 35 내지 40 ℃하에서 10 내지 15시간 동안 활성화시킨다. 이때, 동결건조하는 과정을 생략하는 경우에는 (d)단계에서 배양된 균주를 고체배지에 바로 스트리킹할 수 있다.
균주를 활성화시 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 활성화가 이루어지지 않을 수 있다.
또한, 상기 고체배지로는 TSA(Trypticase soy agar)를 들 수 있다.
다음으로, 상기 (f)단계에서는 상기 활성화된 균주가 함유된 LB배지에 대두열수 추출물을 첨가하여 배양시킨다.
상기 대두열수 추출물은 대두를 증숙할 때 발생되는 물질로 본 발명에서는 희석시켜 종균배양용 영양원으로 사용함으로써, 버려지는 대두열수 추출물을 활용할 수 있을 뿐만 아니라 LB 배지 특유의 이취가 발생되지 않는다. 일반적으로 대두 100 kg을 증숙시 25 내지 40 L의 대두열수 추출물을 수득할 수 있으며, 증자 후 생성되는 대두열수 추출물을 원액 그대로 사용하면 고점성으로 인하여 종균처리시 에어로졸 형성이 어려우므로 10 내지 20%(v/v) 희석하여 종균배양용 영양원으로 사용한다.
상기 대두열수 추출물과 활성화된 균주가 함유된 LB배지를 1 : 0.001 내지 0.1의 부피부, 바람직하게는 1 : 0.01 내지 0.05의 부피부로 혼합시켜 35 내지 40 ℃, 습도 90 내지 95% 하에서 22 내지 26시간 동안 배양시킨다. 대두열수 추출물을 기준으로 활성화된 균주가 함유된 LB배지의 부피가 상기 하한치 미만인 경우에는 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장을 얻을 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 청국장에 쓴맛이 강하게 발생할 수 있다.
상기와 같이 대두열수 추출물에 배양된 균주는 상기에서 언급된 (B)단계의 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주로서, 에어로졸로 분사하여 증자된 대두에 접종시켜 발효시킴으로써 청국장을 제조한다.
본 발명에 따라 제조된 청국장에 함유된 폴리글루탐산은 분자량이 200 kDa 이상인 고분자량으로 수득되며, 청국장에 함유된 폴리글루탐산의 함량은 종래 청국장에 함유된 18 내지 22 mg/g의 함량보다 많은 30 내지 45 mg/g이다.
상기 제조된 청국장은 그 자체로 포장되어 제품화되거나, 분쇄한 후 환제로 성형된 후 포장되어 제품화될 수도 있는 등 제품화하기 위한 방법은 특별히 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1.
볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ) 균주의 제조
물이 담긴 세척조에 대두를 넣고 세척한 후 15 ℃의 물에 7시간 동안 침지시켜 대두를 불린 후 상기 불린 대두를 스팀기에 넣어 100 ℃의 온도로 7시간 동안 삶아서 증숙시킨다. 상기 증숙된 대두와 볏짚을 1 : 0.3의 부피부로 혼합하여 37 ℃, 93 %의 습도하에서 24시간 동안 발효시킨 후 발효된 대두 1 g을 생리식염수가 들어있는 플라스크에 넣고 80 ℃에서 5분 동안 열충격을 가한 후 TSA 플레이트(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 37 ℃, 93 %의 습도로 48시간 동안 배양하여 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 수득하였다.
상기 수득된 바실러스 서브틸리스 균주를 LB(luria-bacteria) 배지에서 37 ℃, 93 %의 습도로 24시간 동안 배양하여 스토크(stock)를 만들고, 50% 글리세롤 용액과 상기 LB 배양액을 1 : 4의 비율로 혼합하여 동결건조하였다. 동결건조시킨 배양액 중 일부를 분리하여 TSA 플레이트에 스트리킹시킨 후 여기서 얻은 단일 클로닝을 LB 배지에서 37 ℃, 93 %의 습도로 12시간 동안 활성화시킨다.
상기 활성화된 균주가 함유된 LB배지에 대두열수 추출물을 첨가(대두열수 추출물 : 활성화된 균주가 함유된 LB배지 = 1 : 0.01의 부피부)하여 37 ℃, 습도 93% 하에서 24시간 동안 배양하여 청국장 발효에 이용되는 최종 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 수득하였다(도 2).
상기 대두열수 추출물은 상기 대두 증숙시 얻어진 물질을 10%(v/v)로 희석한 것이다.
청국장 제조
상기와 동일한 방법으로 대두를 증숙시킨 후 증숙된 대두의 표면의 온도가 75 ℃인 상태에서 상기 얻어진 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 에어로졸로 분사하여 접종(증숙된 대두 : 균주 = 1 : 0.00001의 중량부)시킨 후 37 ℃, 습도 93% 하에서 24시간 동안 발효하여 청국장을 제조하였다.
비교예 1. 볏짚 추출물
대두를 증숙시킨 후 증숙된 대두와 볏짚 추출물을 1 : 0.5의 중량비로 혼합한 후 37 ℃, 습도 93% 하에서 24시간 동안 발효하여 청국장을 제조하였다.
상기 볏짚 추출물은 볏짚과 증류수를 1 : 1의 부피비로 혼합한 후 100 ℃에서 15시간 동안 끓여 얻어진 갈색의 추출물이다.
비교예 2. 종래 청국장
대두를 증숙시킨 후 볏짚을 깔고 그 위에 증숙된 대두를 구비하여 37 ℃, 습도 93% 하에서 24시간 동안 발효하여 청국장을 제조하였다.
비교예 3. 열충격 생략
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 수득시 열충격을 수행하지 않았다.
< 시험예 >
실시예 1은 발효를 수행한지 24시간이면 발효가 완료되었으나, 비교예 1 및 2는 30시간이 지나야 발효가 완료되었다. 폴리글루탐산의 분자량(시험예 1) 및 함량(시험예 2)은 실시예 및 비교예 모두 발효가 완료되는 시간인 24시간(실시예 1) 및 30시간(비교예 1, 2) 발효 후 측정하였으며, 관능검사(시험예 3)는 실시예 및 비교예 모두 24시간 발효 후 측정하였다. 비교예 3은 30시간 발효 후에도 발효가 완료되지 않았지만, 시험을 위하여 30시간까지만 발효를 수행하여 시험을 실시하였다.
시험예 1. 폴리글루탐산(γ-PGA)의 분자량 측정
실시예 1에 따라 제조된 청국장에 함유된 γ-PGA의 분자량을 SDS-PAGE 방법으로 측정하였다.
실시예 1에 따라 제조된 청국장을 증류수로 처리하여 수용성 단백질을 획득한 후 갈색을 띠는 천연상태의 γ-PGA를 정제하여 멜라노이딘 성분 및 대두 단백질을 제거함으로써 백색 또는 연한 노란색의 순수한 γ-PGA를 수득하였다(도 3).
상기 정제된 γ-PGA는 10% 농도의 SDS-PAGE상에서 고분자량 마커와 함께 전기영동을 실시하였으며, 전기영동 후 Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB)로 염색하였다. 염색후 10% 아세트산 및 10% 메탄올로 이루어진 탈염색 용액으로 탈색하고, 0.5% 메틸렌블루(MB) 및 3% 아세트산으로 이루어진 염색용액으로 다시 염색한 후 증류수를 사용하여 탈색하였다.
도 4A는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 청국장으로부터 분리한 순수 γ-PGA를 전기영동 후 CBB(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하고 탈색한 사진이며; 도 4B는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 청국장으로부터 분리한 순수 γ-PGA를 전기영동 후 MB(methylene blue)로 염색하고 탈색한 사진이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 순수 γ-PGA는 CBB에서는 염색되지 않았으며, MB에서만 염색되는 것을 확인하였다. MB로 염색된 순수 γ-PGA를 확인한 결과, 순수 γ-PGA의 분자량은 200 kDa 이상, 바람직하게는 200 내지 250 kDa인 고분자량의 γ-PGA를 수득하는 것을 확인하였다.
시험예 2. 폴리글루탐산(-PGA)의 함량 측정
표준용액
표준물질 글루탐산(CAS No. 56-86-0) 10 mg을 칭량하여 100 mL 부피 플라스크에 놓고 증류수를 표선까지 맞추어 표준원액으로 하고, 상기 표준원액을 0.02 N 염산용액으로 적정농도로 희석하여 표준용액으로 하였다.
시험용액
식품의약품 안전처 식품첨가물 공전의 시험방법에 따라 실시예 1 청국장 2000 mg을 칭량하여 물에 녹인 후 10분 동안 초음파 추출하고 추출한 용액을 원심분리기를 이용하여 15000 rpm에서 15분 동안 4 ℃하여 A용액으로 제조하고, 상기 A용액의 상등액 1 mL를 취하여 6N 염산 10 mL를 첨가한 후 110 ℃에서 24시간 가수분해하고 상기 용액을 50 mL 부피 플라스크에 옮겨 증류수로 정용한 다음 1 mL를 덜어 50 mL 부피 플라스크에 옮겨 증류수로 정용함으로써 0.02N 농도의 시험용액을 제조하였다.
상기 시험용액 일정량을 취하여 아래의 조작조건에 따라 기기분석 장치를 이용하여 글루탐산 함량을 구한다. 또한, 별도로 산으로 가수분해 하지 않은 상기 A용액 일정량을 취하여 기기분석 장치를 이용하여 유리글루탐산 함량(%)을 구한 다음 하기 [수학식 1]에 따라 폴리글루탐산 함량(%)을 구하였다. 상기의 방법과 동일하게 비교예 1 및 2의 청국장에 함유된 폴리글루탐산 함량(%)도 구하였다.
본 시험법은 시료 중 폴리글루탐산을 산분해한 후 HPLC-UV(컬럼: Agilent ZORBAX Eclipse AAA 4.6X150 mm, 5 um; 이동상(mobile phase) 용매 A: 40 mM Sodiumphosphate(Di-basic), 0.1% Phosphoric acid, 용매 B: Acetonitrile / Methanol / DW = 45/45/10) 또는 FLD를 이용하여 분석하는 방법으로 338 nm(UV) 또는 Ex 230 nm, Em 450 nm (Fluorescence)에서 정량 분석하였다.
[수학식 1]
폴리글루탐산 함량(mg/g) = (총 글루탐산 함량 X 0.88) - 유리 글루탐산 함량
상기 [수학식 1]에서 총 글루탐산 함량은 하기 [수학식 2], 유리 글루탐산 함량은 하기 [수학식 2] 및 0.88값은 하기 [수학식 3]에 따라 구하였다.
[수학식 2]
총 글루탐산 함량(mg/g)= (H X V X D)/(S X 1,000)
H : 가수분해한 시험용액의 총 글루탐산 농도(ug/mL)
V : 시험용액의 전량(mL)
D : 희석배수
S : 시료 채취량(g)
[수학식 3]
유리 글루탐산 함량(mg/g) = (C X V X D)/(S X 1,000)
C : (A)액의 유리 글루탐산 농도(ug/mL)
V : 시험용액의 전량(mL)
D : 희석배수
S : 시료 채취량(g)
[수학식 4]
0.88 = 129 (폴리글루탐산중의 글루탐산 잔기의 분자량)/147(글루탐산 분자량)
구분 총 글루탐산 함량
(mg/g)		 유리 글루탐산 함량(mg/g) 폴리글루탐산 함량 (mg/g)(%)
실시예 1 53.858 5.787 41.608(4.161)
비교예 1 23.881 1.461 19.554(1.955)
비교예 2 25.739 1.338 21.312(2.131)
비교예 3 7.560 0.312 6.341(0.634)
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 청국장은 비교예 1 및 2에 따라 제조된 청국장에 비하여 폴리글루탐산의 함량이 2배 이상 높은 것을 확인하였다.
시험예 3. 관능검사
실시예 및 비교예에서 제조된 청국장을 전문패널 10명에게 시식하게 한 후 9점 척도법으로 관능검사를 실시하여 평균값 구하였으며, 이를 하기 [표 2]에 나타내었다.
- 향, 색상, 맛, 풍미, 부드러움 및 종합적 기호도: 1점= 매우 나쁘다, 9점= 매우 좋다
구분 향 색상 맛 풍미 부드러움 종합적인 기호도
실시예 1 7.8 7.3 8.1 8.0 7.5 7.8
비교예 1 5.1 5.3 5.0 4.4 3.8 4.0
비교예 2 3.8 3.9 4.9 3.7 2.8 3.1
비교예 3 1.1 1.2 0.2 0.3 0.2 0.3
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 청국장은 비교예 1 내지 3에 따라 제조된 청국장에 비하여 향, 색상, 맛, 풍미, 부드러움 및 종합적 기호도 모두 우수한 것을 확인하였다.
특히, 24시간 동안 발효를 수행하는 동안 실시예 1은 발효가 완료되었으나, 비교예 1 내지 3은 발효가 완전히 완료되지 않았다. 그래서 비교예 1 및 2는 30시간 동안 발효 후 다시 관능검사를 수행하였는데, 그 결과 상기 [표 2]의 값에 비하여 20 내지 30% 증가하였다. 비교예 1 및 2의 30시간 발효 후의 값 역시 실시예 1의 청구장에 비해서 여전히 낮은 수치인 것을 확인하였다.

Claims (5)

  1. (A) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계; 및
    (B) 표면온도가 70 내지 80 ℃인 상기 증숙된 대두에 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 접종시켜 발효시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 (a) 대두를 수세한 후 증숙시키는 단계;
    (b) 상기 증숙된 대두와 볏짚을 혼합하여 발효시키는 단계; 및
    (c) 상기 발효된 대두에 70 내지 80 ℃로 3 내지 10분 동안 열충격을 가한 후 고체배지에서 배양하여 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 선별하는 단계;를 포함하는 과정을 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 수득된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 (d) 상기 수득된 바실러스 서브틸리스 균주를 LB(luria-bacteria) 배지에서 배양시키는 단계;
    (e) 상기 배양된 균주를 고체배지에 스트리킹하여 얻은 단일 클로닝을 LB(luria-bacteria) 배지에서 활성화시키는 단계; 및
    (f) 상기 활성화된 균주가 함유된 LB배지에 대두열수 추출물에 첨가하여 배양시키는 단계;를 포함하는 과정을 거친 후 상기 (B)단계의 증숙된 대두에 접종되는 것을 특징으로 하는 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 (b)단계에서 증숙된 대두와 볏짚은 1 : 0.2 내지 1의 부피비로 혼합하여 발효되는 것을 특징으로 하는 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (B)단계에서 증숙된 대두와 볏짚에서 분리한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 1 : 0.00001 내지 0.01의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 폴리글루탐산의 함량이 증가된 청국장의 제조방법.
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