KR20170063944A - 인플루엔자 a 바이러스 변이체 - Google Patents

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KR20170063944A
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wild
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조슈아 로버트 리만
랜달 바이른
해밀턴 바로우 베넷
더글라스 존 바르텔스
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버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 변이체, 특히, 폴리머라제 억제제에 대해 내성인 변이체에 관한 것이다. 또한, 인플루엔자 A 바이러스 변이체에 관련된 조성물 및 방법도 제공된다. 환자로부터 다중 바이러스 변이체를 단리하고, 동정하고, 특성확인하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

인플루엔자 A 바이러스 변이체{INFLUENZA A VIRUS VARIANTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2014년 10월 2일에 출원된 U.S. 가특허 출원 일련번호 제62/058,961호의 이익을 주장한다. 본 문헌은 그 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
서열목록
본 출원은 2014년 10월 2일에 생성되어 함께 전자 제출되었던 파일명 "355615_ST25.txt"(8.06 킬로바이트)의 서열목록의 전문을 인용에 의해 포함한다.
본 발명의 배경
인플루엔자는 계절성 유행병으로 전 세계적으로 퍼져, 매년 수십만 - 전 세계적으로 유행성인 해에는 수백만 명의 사망을 초래한다. 예를 들면, 20세기에 3개의 인플루엔자 유행병이 발생하여 수천만명의 사람들을 사멸시켰고, 각각의 이들 유행병은 사람에서의 바이러스의 새로운 스트레인의 출현에 의해 야기되었다. 보통 이들 새로운 스트레인은 기존의 인플루엔자 바이러스가 다른 동물 종으로부터 사람에게 전염되어 초래된다.
인플루엔자는 주로 감염된 사람이 기침하거나 재채기할 때 생성되는 대형 바이러스가 적재된 액적(droplet)을 통해 사람으로부터 사람에게 전염되고; 이어서, 이들 대형 액적은 감염된 사람 가까이(예를 들면, 약 6 피트 내에) 있는 감수성 개체의 상기도의 점막 표면에 떨어질 수 있다. 또한, 전염은 호흡기 분비물과의 직접적 접촉 또는 간접적 접촉, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스로 오염된 표면을 만진 후에 눈, 코 또는 입을 만지는 것을 통해 발생할 수도 있다. 성인은 증상이 나타나기 1일 전으로부터 증상이 시작된지 대략 5일 후까지 타인에게 인플루엔자를 확신시킬 수도 있다. 면역계가 약해진 사람 및 유아는 증상의 개시 후 10일 이상 동안 감염성일 수도 있다.
인플루엔자 바이러스는 오르토믹소비리대과(family Orthomyxoviridae)의 RNA 바이러스이고 이는 5개의 속: 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 이사바이러스(Isavirus) 및 토고토 바이러스(Thogoto virus)를 포함한다.
인플루엔자 바이러스 A 속(genus)은 1종, 인플루엔자 A 바이러스를 갖는다. 야생형 물새는 매우 다양한 인플루엔자 A에 대한 천연 숙주이다. 때때로, 바이러스는 다른 종으로 전염되고, 이어서, 가금류에서의 치명적인 발생을 야기하거나 사람 인플루엔자 유행병을 일으킬 수 있다. A형 바이러스는 3개의 인플루엔자 유형들 중에서 가장 맹독성인(virulent) 사람 병원체이고, 가장 중증의 질환을 야기한다. 인플루엔자 A 바이러스는 이들 바이러스들에 대한 항체 반응에 기초하여 상이한 혈청형으로 세분될 수 있다. 공지의 사람 유행병 사망의 수로 정렬된, 사람에서 확인된 혈청형들은 하기와 같다: H1N1(이는 1918년에 스패인 인플루엔자를 야기하였다), H2N2(이는 1957년에 아시아 인플루엔자를 야기하였다), H3N2(이는 1968년에 홍콩 독감을 야기하였다), H5N1(2007 내지 2008년에 유행병 위협), H7N7(이는 비통상적 인수공통 감염 가능성(unusual zoonotic potential)을 갖는다), H1N2(사람 및 돼지에서 풍토성), H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7.
인플루엔자 바이러스 B 속은 1종, 인플루엔자 B 바이러스를 갖는다. 인플루엔자 B는 거의 전적으로 사람을 감염시키고 인플루엔자 A보다 덜 흔하다. 인플루엔자 B 감염에 감수성인 것으로 공지되어 있는 유일한 다른 동물은 바다표범이다. 이러한 유형의 인플루엔자는 A형보다 2 내지 3배 더 느린 속도로 돌연변이되고, 결과적으로 유전적으로 덜 다양하고, 단지 1개의 인플루엔자 B 혈청형을 갖는다. 이러한 항원 다양성 결여의 결과로서, 인플루엔자 B에 대한 면역성의 정도는 통상적으로 어린 나이에 획득된다. 그러나, 인플루엔자 B는, 지속적인 면역성이 가능하지 않도록 충분히 돌연변이된다. 이러한 감소된 항원 변화 속도는 이의 제한된 숙주 범위(교차 종 항원 대변이(cross species antigenic shift)를 억제함)와 함께 인플루엔자 B의 유행병이 발생하지 않음을 보장한다.
인플루엔자 바이러스 C 속은 1종, 인플루엔자 C 바이러스를 갖고, 이는 사람 및 돼지를 감염시키고 중증의 질병 및 지역적 유행병을 야기할 수 있다. 그러나, 인플루엔자 C는 다른 유형보다 덜 흔하고 통상적으로 어린이들에서 경미한 질환을 야기하는 것으로 보인다.
인플루엔자 A, B 및 C 바이러스는 구조에 있어서 매우 유사하다. 바이러스 입자는 직경 80 내지 120 나노미터이고, 섬유상 형태가 발생할 수 있지만 보통 대략 구형이다. 보통 바이러스의 경우, 이의 게놈은 단일 조각의 핵산이 아니고; 대신에 분절된 네거티브-센스 RNA(segmented negative-sense RNA)를 함유한다. 인플루엔자 A 게놈은 11개의 단백질들: 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 핵단백질(NP), M1, M2, NS1, NS2(NEP), PA, PB1, PB1-F2 및 PB2를 암호화한다.
HA 및 NA는 바이러스 입자의 외부 상의 대형 당단백질이다. HA는, 표적 세포에의 바이러스의 결합 및 표적 세포에의 바이러스 게놈의 진입을 매개하는 렉틴이고, 한편 NA는, 성숙한 바이러스 입자에 결합하는 당을 절단시킴으로써, 감염된 세포로부터의 후대(progeny) 바이러스의 방출에 관여한다. 따라서, 이들 단백질은 항바이러스 약물에 대한 표적이 되어 왔다. 또한, 이들은, 항원에 대해 항체가 생성될 수 있는 항원이다. 인플루엔자 A 바이러스는, HA 및 NA에 대한 항체 반응에 기초하여 아형(subtype)으로 분류되어, 예를 들면, H5N1에서 H 및 N 구별의 기초를 형성한다(상기 참조).
인플루엔자는 예방적 수단의 간접 비용뿐만 아니라 생산성 손실 및 관련 의료 조치로 인한 직접 비용을 발생시킨다. 미국에서, 인플루엔자는 연간 100억 달러 이상의 총 비용의 원인이 되는데, 장래의 유행병은 수천억 달러의 직접 비용과 간접 비용을 야기할 수 있음이 추정되어 왔다. 예방 비용 또한 높다. 전세계 정부는 수십억 U.S. 달러를 소비하여 잠재적 H5N1 조류 인플루엔자 유행병에 대해 준비하고 계획하여 왔고, 약물 및 백신 구매와 관련된 비용과 함께 국경 통제 개선을 위한 재난 훈련 및 전략 개발을 지원했다.
인플루엔자에 대한 현재 치료 옵션으로는 백신접종(vaccination), 항-바이러스성 의약을 이용한 화학 치료요법 또는 화학적 예방법(chemoprophylaxis)이 포함된다. 인플루엔자 백신을 이용한 인플루엔자에 대한 백신접종은 흔히 고-위험 그룹, 예를 들면, 어린이 및 노인에 대해 또는 천식, 당뇨병 또는 심장 질환을 갖는 사람들에서 권고된다. 그러나, 백신접종을 받고도 여전히 인플루엔자에 걸릴 수 있다. 백신은 몇몇의 특정 인플루엔자 균주에 대해 계절마다 재처방되지만(reformulated), 해당 계절 동안 전세계 사람들을 활발하게 감염시키는 모든 균주를 포함할 수는 없다. 제조업자들이 계절성 유행병에 대처하는데 필요한 수백만 개의 용량(dose)을 제형화하고 생산하는데에는 약 6개월이 걸리고; 때때로 새롭거나 간과된 균주가 해당 기간 동안 현저해지고 백신접종을 받았음에도 불구하고 사람들을 감염시킨다(2003년 내지 2004년 인플루엔자 계절에 H3N2 푸젠성 독감(Fujian flu)에 의한 것과 같음). 백신접종 직전에 감염되어 백신이 유효하게 되는데 약 2주가 걸리므로 백신이 예방할 예정인 바로 그 균주로 병에 걸릴 수도 있다.
추가로, 이들 인플루엔자 백신의 유효성은 가변적이다. 바이러스의 돌연변이 비율이 높기 때문에, 특정 인플루엔자 백신은 통상 단지 수년 동안 보호를 부여한다. 인플루엔자 바이러스가 시간이 지남에 따라 급속하게 변하기 때문에 1년 동안 처방된 백신은 다음해에는 비효율적일 수 있고, 다른 균주들이 우세하게 된다.
또한, RNA 교정(proofreading) 효소의 부재로 인하여, 인플루엔자 vRNA의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제는 인플루엔자 vRNA의 대략적인 길이인 약 10,000개의 뉴클레오타이드마다 대략적으로 단일 뉴클레오타이드 삽입 오류(error)를 제조한다. 따라서, 거의 모든 새로 제조된 인플루엔자 바이러스는 돌연변이체 ― 항원 대변이이다. 게놈을 vRNA의 8개의 개별 분절(segment)들로 분리하는 것은 1개 초과의 바이러스 라인(line)이 단일 세포를 감염시킨 경우 vRNA의 혼합 또는 재분류(reassortment)를 가능하게 한다. 그 결과로 초래된 바이러스 유전학의 신속한 변화는 항원 대변이를 생성하고 바이러스가 새로운 숙주 종을 감염시키고 신속하게 방어 면역을 극복하도록 한다.
또한, 항바이러스성 약물은 특히 효과적인 뉴라미니다제 억제제와 함께 사용하여 인플루엔자를 치료할 수 있지만, 바이러스는 표준 항바이러스 약물에 대해 내성을 발달시킬 수 있다.
따라서, 인플루엔자 감염을 치료하기 위한 약물, 예를 들면, 확장된 치료 윈도우(treatment window) 및/또는 감소된 바이러스 역가에 대한 민감성을 갖는 약물에 대한 요구는 여전히 존재한다.
따라서, 돌연변이된 인플루엔자 A 바이러스 또는 약물 또는 다른 치료요법에 대해 내성을 나타내는 다른 바이러스들을 동정하고 이들 돌연변이된 바이러스들에 대해 효과적인 새로운 바이러스 치료제를 개발할 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
따라서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 변이체 및 관련 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 인플루엔자 A 바이러스 변이체 및 하나 이상의 폴리머라제 억제제에 대한 민감성이 감소된 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제가 제공된다.
한 양상에서, 본 발명은, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 유전자에 돌연변이를 포함하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편으로서, 상기 돌연변이는, 야생형 인플루엔자 A 바이러스의 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기들에 상응하는 적어도 1개의 아미노산 치환을 초래하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편을 제공한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 Q를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 306에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 H 또는 L을 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 F를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 323에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 S 또는 Y를 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 S를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 324에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 G, I, N 또는 R을 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 S를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 337에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 L 또는 P를 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 F를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 363에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 L을 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 K를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 376에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 N, Q 또는 R을 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 F를 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 404에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 Y를 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 M을 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 431에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 I 또는 T를 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 상기 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드는 N을 암호화하지 않는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 510에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정 실시형태들에서, 상기 뉴클레오타이드는 K 또는 T를 암호화한다.
소정 실시형태들에서, 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 2개의 아미노산들에 상응하는 뉴클레오타이드들이 돌연변이되어, 상기 뉴클레오타이드들은, 상응하는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산과 상이한 아미노산을 암호화하게 된다. 소정 실시형태들에서, 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 3개의 아미노산들에 상응하는 뉴클레오타이드들이 돌연변이되어, 상기 뉴클레오타이드들은, 상응하는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산과 상이한 아미노산을 암호화하게 된다.
추가의 실시형태들에서, 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 발현 시스템이 제공되고, 이러한 발현 시스템은, 프로모터에 작동가능하게 링크된 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 벡터를 포함할 수 있고; 또한, 상기 벡터로 형질감염되거나, 형질전환되거나, 또는 형질도입된 숙주 세포도 제공된다. 대안으로, 본 발명의 발현 시스템은 mRNA 디스플레이 기술, 예를 들면, U.S. 특허 제6,258,558호에 기술된 RNA-단백질 융합 기술 또는 U.S. 특허 제6,361,943호에 기술된 시험관내 "바이러스" 기술에 기초한다.
다른 양상에서, 본 발명은, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 변이체로서, 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 적어도 1개의 아미노산이 돌연변이되어 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 아미노산과 상이한 아미노산을 암호화하게 되는, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 제공한다. 본 발명의 추가의 실시형태들은 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 복제를 억제할 수 있는 화합물을 확인하는 방법이 제공되고; 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 변이체에 의해 감염되는 세포가 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한, 아미노산을 포함하는 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 제공한다. 몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 생물학적 활성 유사체를 포함한다. 몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한, 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 인식하는, 항-인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 항체를 제공한다. 본 발명의 추가의 실시형태들은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 항체를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 포함하는 진단학적 키트, 및 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
다른 양상에서, 본 발명은 엄격한 조건 하에 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 제공한다. 본 발명의 추가의 실시형태들은 프로브 또는 프라이머를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단학적 또는 검출 키트가 제공되고, 상기 키트는 예를 들면, 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 변이체 또는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제가 샘플 중에 존재하는지를 측정하는데 유용하다.
추가의 양상에서, 본 발명은, a) 인플루엔자 A 바이러스 감염된 환자로부터 생물학적 샘플을 수집하는 단계; 및 b) 상기 샘플이, 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 각각의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 핵산을 포함하는지를 평가하는 단계를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염의 폴리머라제 억제제에 대한 약물 내성 또는 민감성을 평가하는 방법을 제공한다.
또한, a) 제23항의 방법에 따른 환자의 폴리머라제 억제제에 대한 약물 내성 또는 민감성을 평가하는 단계; 및 b) a)에서 평가된 약물 내성 또는 민감성에 기초하여 상기 환자에 대해 치료 용법을 최적화하는 단계를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염용 치료를 안내하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 약물 내성이 예측되거나 검출되는(예를 들면, 폴리머라제 억제제에 대한 민감성이 감소되는) 경우, 1개 이상의 다른 화합물 또는 제제(agent)가 환자 치료 계획 또는 치료학적 용법에 포함될 수 있다. 상기 방법은 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 서열 측정(예를 들면, 유전형질 분석(genotyping)), 폴리머라제 억제제에 대한 민감성 측정(예를 들면, 표현형질 분석(phenotyping)), 또는 환자의 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 적응 수준(fitness level) 측정의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 표현형질 분석은 세포-불포함 시스템(예를 들면, 시험관내 프로테아제 검정에서) 그리고 세포-기반 시스템(예를 들면, 레플리콘 검정 또는 바이러스 감염 또는 복제 검정)에서 수행할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, a) 인플루엔자 A 바이러스 변이체로 감염된 샘플을 제공하는 단계; 및 b) 상기 샘플 중의 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 활성의 억제시 상기 후보 화합물의 능력을 검정하는 단계를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 샘플은 환자의 세포 또는 혈장으로부터 수득될 수 있다. 또한, 인플루엔자 A 바이러스 변이체로 감염됨 샘플은 배양된 세포일 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 활성은 감염되고/되거나, 복제되고/되거나, 방출되는 이의 능력에 의해 측정될 수 있다.
대안으로, 이러한 방법은 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 레플리콘 RNA를 제공하는 단계 및 적합한 검정에서 상기 후보 화합물이 레플리콘 RNA의 복제를 억제하는지를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 대안의 방법은 본 발명의 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 및 폴리머라제 기질을 제공하는 단계, 및 상기 후보 화합물의 존재 하에 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 활성이 감소되는지를 측정하는 단계를 포함할 수 있고; 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 및/또는 폴리머라제 기질은 세포-기반 시스템 내에 존재할 수 있거나, 예를 들면, 배양된 세포 내에서 발현될 수 있거나, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 및/또는 폴리머라제 기질은 세포-불포함 시스템, 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 및 펩타이드 기질을 포함하는 반응 혼합물 내에 존재할 수 있다.
환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 평가하는 추가의 대안의 방법은 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드 및 지표를 암호화하는 지표 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계 및 후보 화합물의 존재 하에 그리고 후보 화합물의 부재 하에 상기 지표를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 본 발명의 방법에 의해 확인되는 화합물의 약제학적 또는 치료학적 유효량을 단독으로 또는 다른 항-바이러스 제제와 병용하여 투여함을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 기기-판독가능한 데이터로 암호화된 데이터 보관 물질을 포함하는 기기-판독가능한 데이터 보관 매체를 제공하는 컴퓨터 도구에 관한 것이고, 여기서, 상기 기기-판독가능한 데이터는 인플루엔자 A 바이러스 변이체 또는 생물학적 샘플과 관련된 적어도 2개의 특징에 관한 지수 값을 포함한다.
상기 특징들은 하기로부터 선택된다: a) 폴리머라제 억제제에 대해 감소된 민감성을 위한 내성을 나타내는 능력; b) 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제; c) 환자의 이환율 또는 회복 가능성; 및 d) 상기 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 변경된 복제 능력(증가되거나 감소됨).
본 발명의 추가의 양상은 인플루엔자 A 바이러스-감염된 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 프로파일을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자로부터 샘플(예를 들면, 혈장 샘플)을 수득하는 단계 및 상기 샘플로부터 적어도 2, 20, 50, 100, 200, 500 또는 그 이상의 인플루엔자 A 바이러스 비리온 유래의 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 유전형질 분석하고/하거나 표현형질 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 유전형질 분석은 혈장 샘플로부터 적어도 2, 20, 50, 100, 200, 500 또는 그 이상의 인플루엔자 A 바이러스 비리온 유래의 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
소정 실시형태들에서, 이러한 프로파일링이 행해진 환자는 폴리머라제 억제제로 치료되어 왔거나 폴리머라제 억제제로 치료되도록 선택될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 혈장 샘플은 2개 이상의 상이한 시점에서 이러한 프로파일링이 행해진 환자로부터 수득된다.
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 변이체에 관한 것이다. 특히, 폴리머라제 억제제에 대한 내성을 나타내는 인플루엔자 A 바이러스 변이체가 제공된다. 또한, 인플루엔자 A 바이러스 변이체에 관련된 방법 및 조성물도 제공된다. 상기 방법 및 조성물은, 인플루엔자 A 바이러스 및 다른 바이러스의 변이체를 포함하는 바이러스 변이체를 확인하고, 항-바이러스 화합물을 평가하고 확인하고, 바이러스 감염에 대한 치료제를 개발하고 최적화하는데 유용하다.
인플루엔자 A 바이러스 변이체 및 관련 폴리뉴클레오타이드 및 폴리머라제
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 제공한다. 특정 실시형태들에서, 인플루엔자 A 바이러스 변이체는, 폴리머라제 억제제(또한 "변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제"라고도 명명함), 예를 들면, 화합물 1에 대해 감소된 민감성을 갖는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 야생형 인플루엔자 A 바이러스는, 폴리머라제 억제제에 대해 정상의 또는 바람직한 민감성을 갖는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또한 "야생형 폴리뉴클레오타이드"라고도 명명함)를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스를 말하고, 특정 실시형태들에서 상기 폴리머라제 억제제는 화합물 1이다. 유사하게, 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제는 폴리머라제 억제제에 대한 정상의 또는 바람직한 민감성을 갖는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 말하고, 특정 실시형태들에서 상기 폴리머라제 억제제는 화합물 1이다.
몇몇의 실시형태들에서, 야생형 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 실시형태들에서, 야생형 인플루엔자 A 바이러스는 서열번호 1과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 또는 99% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 매개된 병태", "인플루엔자 감염", "인플루엔자" 또는 "독감"은 인플루엔자 바이러스로의 감염에 의해 야기된 질환을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다.
인플루엔자는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 조류 및 포유동물에 영향을 미치는 감염성 질환이다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소비리대과의 RNA 바이러스이고, 이는 5개의 속: 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 이사바이러스 및 토고토 바이러스를 포함한다. 인플루엔자 바이러스 A 속은 1종, 이들 바이러스에 대한 항체 반응에 기초하여 상이한 혈청형(serotype): H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7으로 세분될 수 있는 인플루엔자 A 바이러스를 갖는다. 인플루엔자바이러스 B 속은 1종, 인플루엔자 B 바이러스를 갖는다. 인플루엔자 바이러스 C 속은 1종, 인플루엔자 C 바이러스를 갖고, 이는 사람 및 돼지를 감염시키고 중증의 질병 및 지역적 유행병을 야기할 수 있다. 그러나, 인플루엔자 C는 다른 유형보다 덜 흔하고 통상적으로 어린이들에서 경미한 질환을 야기하는 것으로 보인다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 또는 인플루엔자 바이러스들은 인플루엔자 바이러스 A 또는 B와 관련되어 있다. 본 발명의 몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 또는 인플루엔자 바이러스들은 인플루엔자 바이러스 A와 관련되어 있다. 본 발명의 몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 바이러스 A는 H1N1, H2N2, H3N2 또는 H5N1이다.
사람에서, 인플루엔자의 공통 증상들은 오한, 발열, 인후염, 근육 통증, 중증의 두통, 기침, 쇠약, 및 전반적 불편감이다. 보다 심각한 경우에는, 인플루엔자는 특히 어린이 및 노인에서 치명적일 수 있는 폐렴을 야기한다. 이는 주로 보통의 감기와 혼동되지만, 인플루엔자는 훨씬 더 중증의 질환이고 상이한 유형의 바이러스에 의해 야기된다. 인플루엔자는 특히 어린이에서 구역 및 구토를 생성시킬 수 있지만, 이들 증상은 "위 독감(stomach flu)" 또는 "24-시 독감(24-hour flu)"이라고 칭하는 경우가 있는 비관련(unrelated) 위장염이 보다 특징적이다.
인플루엔자의 증상은 감염 후 1 내지 2일째에 갑자기 시작될 수 있다. 일반적으로, 첫번째 증상은 오한이나 오한감이지만, 38 내지 39℃(약 100 내지 103℉) 범위의 체온의 발열 또한 감염 초기에 흔하다. 많은 사람들이 너무 아파서 며칠 동안 침대에 누워있고, 몸 전체에 동통과 통증이 있으며, 이는 이들의 등 및 다리에서 더 심하다. 인플루엔자의 하기를 포함할 수 있다: 신체의 동통, 특히 관절 및 인후, 극심한 추위와 고열, 피로, 두통, 자극된 눈물이 나는 눈(irritated watering eye), 붉어진 눈, 피부(특히 얼굴), 입, 목과 코, 복통(B형 인플루엔자 를 갖는 어린이). 인플루엔자의 증상은 비-특이적이고, 많은 병원체("인플루엔자-유사 질병")와 겹친다. 일반적으로, 진단을 확인하기 위해서는 실험실 데이터가 필요하다.
용어 "질환", "장애" 및 "병태"는 여기에서 인플루엔자 바이러스 매개된 의학적 또는 병리학적 병태를 나타내는 것으로 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 동물(예를 들면, 닭, 메추리 또는 칠면조와 같은 조류, 또는 포유동물), 특히 비-영장류(예를 들면, 소, 돼지, 말, 양, 토끼, 기니아 피그, 래트, 고양이, 개 및 마우스) 및 영장류(예를 들면, 원숭이, 침팬지 및 사람)를 포함하는 "포유동물"을 말하고, 보다 구체적으로는 사람을 말한다. 한 실시형태에서, 상기 대상체는 비-사람 동물, 예를 들면, 가축(예를 들면, 말, 소, 돼지 또는 양), 또는 애완동물(예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피그 또는 토끼)이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 대상체는 "사람"이다.
본원에 사용되는 용어 "생물학적 샘플"로는 세포 배양물 또는 이의 추출물; 포유동물로부터 수득된 생검 물질 또는 이의 추출물; 혈액, 타액, 뇨, 분변, 정액, 눈물 또는 다른 체액 또는 이들의 추출물이 제한 없이 포함된다.
본원에 사용되는 "감염의 다중도(multiplicity of infection)" 또는 "MOI"는 감염 표적(예를 들면, 세포)에 대한 감염성 제제(infectious agent)(예를 들면, 파지 또는 바이러스)의 비이다. 예를 들면, 감염성 바이러스 입자로 접종된 세포의 그룹에 관한 경우, 감염의 다중도 또는 MOI는 웰에 존재하는 표적 세포의 수로 나눈 웰에 침전된 감염성 바이러스 입자의 수로 정의된 비이다.
본원에 사용된 용어 "인플루엔자 바이러스의 복제의 억제"는 바이러스 복제의 양의 감소(예를 들면, 적어도 10% 만큼의 감소) 및 바이러스 복제의 완전한 저지(즉, 바이러스 복제 양의 100% 감소) 둘 다를 포함한다. 몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 바이러스의 복제는 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 만큼 억제된다.
인플루엔자 바이러스 복제는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플(예를 들면, 감염된 세포 배양물) 중의 또는 사람(예를 들면, 환자에서의 폐 바이러스 역가)에서의 인플루엔자 바이러스 역가를 측정할 수 있다. 보다 구체적으로, 세포 기반 검정의 경우, 각각의 역우에 세포는 시험관내에서 배양되고, 바이러스는 시험 제제(test agent)의 존재 또는 부재 하에 배양물에 부가되고, 적합한 길이의 시간 후 바이러스-의존성 종점이 평가된다. 전형적인 검정의 경우, 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 세포(MDCK) 및 표준 조직 배양물 적응된 인플루엔자 균주, A/Puerto Rico/8/34를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 제1 유형의 세포 검정은 세포병변 효과(CPE: cytopathic effect)라고 칭하는 프로세스인 감염된 표적 세포의 사멸에 의존하고, 여기서, 바이러스 감염은 세포 재료(resource)의 소진 및 세포의 궁극적 용해를 야기한다. 제1 유형의 세포 검정에서, 미세적정 플레이트의 웰에서의 세포의 저분획이 감염되고(전형적으로 1/10 내지 1/1000), 바이러스는 48 내지 72시간에 걸쳐 수회의 복제를 겪게 되고, 이어서, 세포 사멸의 양은 비감염 대조군에 비하여 세포의 ATP 함량의 감소를 이용하여 측정된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 제2 유형의 세포 검정은 감염된 세포에서의 바이러스-특이적 RNA 분자의 증대(multiplication)에 의존하고, RNA 수준은 분지-쇄 DNA 하이브리드화 방법(bDNA)을 이용하여 직접적으로 측정된다. 제2 유형의 세포 검정에서, 적은 수의 세포들이 초기에 미세적정 플레이트의 웰에 감염되고, 바이러스는 감염된 세포 내에서 복제되고 세포의 추가의 라운드(round)로 확장되게 되고, 이어서, 세포는 용해되고 바이러스 RNA 함량이 측정된다. 이러한 검정은 일반적으로 18 내지 36시간 후에 조기에 중단되고, 한편, 모든 표적 세포는 여전히 실행가능하다. 바이러스 RNA는 검정 플레이트의 웰에 고정된 특정 올리고뉴클레오타이드 프로브에의 하이브리드화, 이어서, 리포터 효소에 링크된 추가의 프로브와의 하이브리드화에 의한 신호의 증폭에 의해 정량된다.
본원에서 사용되는 "바이러스 역가"(또는 역가)는 바이러스 농도의 측정값이다. 역가 시험은 일련의 희석을 사용하여 본질적으로 단지 양성 또는 음성으로서 평가하는 분석적 절차로부터 대략적 정량 정보를 수득할 수 있다. 역가는 여전히 양성 판독값을 수득하는 가장 높은 희석 배율에 해당하고; 예를 들면, 처음 8개의 일련의 2배 희석에서의 양성 판독값은 1:256의 역가로 표현된다. 구체예는 바이러스 역가이다. 역가를 측정하기 위해서, 몇몇의 희석물 예를 들면, 10-1, 10-2, 10-3, ... 10-8이 제조될 것이다. 세포를 여전히 감염시키는 바이러스의 최저 농도는 바이러스 역가이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 치료학적 및 예방학적 처치 둘 다를 말한다. 예를 들면, 치료학적 처치는 하나 이상의 치료요법(예를 들면, 본 발명의 화합물 또는 조성물과 같은 하나 이상의 치료학적 제제)의 투여로부터 초래되는, 인플루엔자 바이러스 매개된 병태의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선, 또는 인플루엔자 바이러스 매개된 병태의 하나 이상의 증상(구체적으로, 하나 이상의 식별할 수 있는 증상)의 개선을 포함한다. 특정 실시형태들에서, 치료학적 처치는 인플루엔자 바리어스 매개된 병태의 적어도 하나의 측정가능한 물리적 파라미터의 개선을 포함한다. 다른 실시형태들에서, 치료학적 처치는 물리적으로 예를 들면, 식별할 수 있는 증상의 안정화에 의한 또는 생리학적으로 예를 들면, 물리적 파라미터의 안정화에 의한, 또는 둘 다에 의한 인플루엔자 바이러스 매개된 병태 진행의 억제를 포함한다. 다른 실시형태들에서, 치료학적 처치는 인플루엔자 바이러스 매개된 감염의 감소 또는 안정화를 포함한다. 항바이러스성 약물은 이미 인플루엔자를 갖고 있는 사람들을 치료하여 증상의 중증도를 감소시키고 병이 걸린 일수를 감소시키기 위해 공동체 환경에서 사용할 수 있다.
용어 "화학 치료요법"은 장애 또는 질환을 치료하기 위한 의약, 예를 들면, ("백신"보다는 오히려) 소분자 약물의 사용을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방" 또는 "예방학적 사용" 및 "예방학적 처치"는 그 목적이 질환을 치료하거나 치유하기 위한 것이라기보다는 오히려 예방하는 것인 임의의 의학적 또는 공중 보건 절차를 말한다. 본원에서 사용되는 용어 "예방하다", "예방" 및 "예방하는"은 병에 걸리지 않았지만 질환을 갖는 사람 가까이에 있어왔거나 가까이에 있을 수 있는 대상체에서의 주어진 병태를 획득하거나 발병할 위험의 감소, 또는 재발 또는 상기 병태의 감소 또는 억제를 말한다. 용어 "화학적 예방법(chemoprophylaxis)"은 장애 또는 질환의 예방을 위한 의약, 예를 들면, ("백신"보다는 오히려) 소분자 약물의 사용을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 예방학적 사용은 중증의 인플루엔자 합병증의 위험이 높은 많은 사람들이 서로 밀접하게 접촉하여 사는 장소에서(예를 들면, 병원 병동, 탁아소, 교도소, 요양원 등에서) 감염의 전염 또는 확산을 방지하기 위해 대발병(outbreak)이 검출된 상황에서의 사용을 포함한다. 인플루엔자에 대한 보호가 필요하지만 백신접종 후 (예를 들면, 면역계 약화로 인해) 보호를 받지 못하거나, 백신을 입수할 수 없는 경우, 또는 부작용 때문에 백신을 접종할 수 없는 경우의 집단 사이에서의 사용도 포함한다. 또한, 백신접종 후 2주 동안의 사용도 포함하고, 그 이유는 상기 시간 동안 백신이 여전히 유효하지 않기 때문이다. 또한, 예방학적 사용은, 인플루엔자에 감염되어 그(예를 들면, 보건 종사자, 요양원 종사자 등)와 밀접하게 접촉하는 고-위험의 사람에게 전달시킬 기회를 감소시키기 위해, 인플루엔자에 걸리지 않았거나 합병증에 대한 위험이 높은 것으로 간주되지 않는 사람을 치료함을 포함할 수 있다.
US CDC에 따르면, 인플루엔자 "대발병(outbreak)"은 정상적인 배경 속도 이상으로 또는 분석된 집단에서의 임의의 대상체가 인플루엔자에 대해 양성인 것으로 시험되는 경우 서로 근접하게 존재하는 사람들의 그룹에서(예를 들면, 보조 생활 시설의 동일한 영역에서, 동일한 가정 내에서 등) 48 내지 72시간의 기간 내의 급성 열성 호흡기 질병(AFRI)의 갑작스러운 증가로서 정의된다. 임의의 시험 방법에 의해 확인된 인플루엔자의 한 사례는 대발병으로서 간주된다.
"클러스터"는 서로 근접하게 존재하는 사람들의 그룹에서(예를 들면, 보조 생활 시설의 동일한 영역에서, 동일한 가정 내에서 등) 48 내지 72시간의 기간 내d에 발생하는 AFRI의 3개 이상의 사례의 그룹으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지표 사례", "1차 사례" 또는 "환자 0(patient zero)"은 역학 조사의 집단 샘플에서의 초기 환자이다. 일반적으로 역학 조사에서 이러한 환자를 나타내기 위해 사용되는 경우, 상기 용어는 대문자로 표시되지 않는다. 특정 조사에 대한 보고서 내에서 해당 개인의 이름 대신에 특정 개인을 지칭하기 위해 상기 용어를 사용하는 경우, 상기 용어는 Patient Zero로 대문자로 표시된다. 종종 과학자들은 질환이 어떻게 확산되고 어떤 보균자(reservoir)가 대발병 사이에 질환을 보유하는지를 결정하기 위해 지표 사례를 연구한다. 지표 사례는 대발병의 존재를 나타내는 최초의 환자이다. 보다 이전의 사례가 발견 될 수 있고, 1차, 2차, 3차 등으로 표지된다.
한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 초래되는 합병증에 대한 소인(predisposition)을 갖는 환자, 구체적으로는 사람에 대한 예방학적 또는 "선제적(pre-emptive)" 척도이다. 예를 들면, 선제적 사용에서와 같이 본원에 사용된 용어 "선제적"은 나머지 공동체 또는 집단 그룹의 구성원들에서 감염의 확산을 방지하기 위한, "지표 사례" 또는 "대발병"이 확인된 상황에서의 예방학적 사용이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 감염 확산을 방지하기 위한, 공동체 또는 인구 집단의 구성원들, 구체적으로는 사람들에게 "선제적" 척도로서 적용된다.
본원에서 사용된 "유효량"은 원하는 생물학적 반응을 유발하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에서, 원하는 생물학적 반응은 인플루엔자 바이러스의 복제를 억제하는 것, 인플루엔자 바이러스의 양을 감소시키는 것, 또는 인플루엔자 바이러스 감염의 중증도, 지속기간, 진행 또는 개시를 감소시키거나 개선시키거나, 인플루엔자 바이러스의 감염의 진행을 예방하거나, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상의 재발, 발병, 개시 또는 진행을 예방하거나, 인플루엔자 감염에 대해 사용되는 다른 치료요법의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)를 향상시키거나 개선시키는 것이다. 대상체에게 투여되는 화합물의 정확한 양은 투여의 방식, 감염 유형 및 중증도에 따라, 그리고 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성과 같은 대상체의 특성에 따라 다를 것이다. 당업자는 이들 및 다른 요인에 따라 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다. 다른 항바이러스성 제제와 공동-투여되는 경우, 예를 들면, 항-인플루엔자 약물과 공동-투여되는 경우, 제2 제제의 "유효량"은 사용된 약물의 유형에 의존할 것이다. 적합한 용량은 승인된 제제에 대해 공지되어 있고, 대상체의 병태, 치료되는 병태(들)의 유형 및 사용되는 본원에 기술된 화합물의 양에 따라 당해 분야 기술자에 의해 조정될 수 있다. 명시적으로 금액을 명시하지 않은 경우 유효량은 추정되어야만 한다. 예를 들면, 본원에 기술된 화합물은 치료학적 또는 예방학적 치료를 위해 대략 0.01 내지 100mg/kg 체중/일의 용량 범위로 대상체에게 투여될 수 있다.
일반적으로, 용량 용법은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 화합물의 활성; 사용된 특정 조성; 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식이; 투여의 시간, 투여의 경로 및 사용된 특정 화합물의 배설 속도; 대상체의 신장 및 간 기능; 및 사용된 특정 화합물 또는 염, 치료의 지속기간; 사용된 특정 화합물과 병용되거나 동시에 사용되는 약물, 및 의학 분야에 익히 공지되어 있는 유사 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 따라 선택될 수 있다. 당해 분야 숙련가는 질환의 진행을 치료하거나, 방지하거나, (완전히 또는 부분적으로) 억제하거나 또는 저지하는데 필요한 본원에 기술된 화합물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본원에 기술된 화합물의 용량은 약 0.01 내지 약 100mg/kg 체중/일, 약 0.01 내지 약 50mg/kg 체중/일, 약 0.1 내지 약 50mg/kg 체중/일 또는 약 1 내지 약 25mg/kg 체중/일일 수 있다. 1일당 총량은 단일 용량으로 투여될 수 있거나 1일 2회(예를 들면, 12시간마다), 1일 3회(예를 들면, 8시간마다), 또는 1일 4회(예를 들면, 6시간마다)와 같이 다중 투약으로 투여될 수 있음이 이해된다.
치료학적 처치를 위해, 본원에 기술된 화합물은 환자에게 예를 들면, 증상(예를 들면, 코 막힘, 인후통, 기침, 동통, 피로, 두통 및 오한/발한)의 개시의 48시간(또는 40시간 이내, 또는 2일 미만, 또는 1.5일 미만, 또는 24시간 이내) 이내에 투여될 수 있다. 치료학적 처치는 임의의 지속기간, 예를 들면, 5일, 7일, 10일, 14일 등 동안 지속될 수 있다. 공동체 대발병 동안의 예방학적 처치를 위해, 본원에 기술된 화합물은 예를 들면, 지표 사례의 증상 개시 2일 이내에 환자에게 투여될 수 있고, 예를 들면, 7일, 10일, 14일, 20일, 28일, 35일, 42일 등 임의의 적합한 지속기간 동안 지속될 수 있다.
다양한 유형의 투여 방법이 본 발명에서 사용될 수 있고, 이하에 "투여 방법"이라는 제목의 섹션 하에 상세하게 기술된다.
본 발명은 또한 단리된 인플루엔자 A 바이러스 변이체, 단리된 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 및 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 용어 "단리된"은 일반적으로 대상체 바이러스, 프로테아제 또는 폴리뉴클레오타이드의 자연 환경의 구성성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것을 의미한다.
소정 실시형태들에서, 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제는, 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 위치 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로부터 1개 이상의 위치에서의 아미노산(들)이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 각각의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제일 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 제조하기위한 발현 시스템이 제공된다. 발현 시스템은 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드(또는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "핵산")를 포함하는 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 벡터(예를 들면, 발현 벡터)는 적합한 방법(예를 들면, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)에 의해 적합한 숙주 세포에게 도입되어 폴리뉴클레오타이드가 (예를 들면, 벡터 내의 또는 숙주 세포 게놈에 통합된) 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 링크되도록 할 수 있다. 생산을 위해, 숙주 세포는 발현에 적합한 조건 하에(예를 들면, 유도제, 적합한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충제 등이 보충된 적합한 매질의 존재 하에) 유지될 수 있고, 이로써 암호화된 폴리펩타이드가 생산된다. 원하는 경우, 암호화 된 단백질은 (예를 들면, 숙주 세포 또는 배지로부터) 회수되고/되거나 단리될 수 있다. 생산 방법은 형질전환 동물의 숙주 세포에서의 발현을 포함하는 것으로 이해될 것이다(예를 들면, WO 92103918을 참조한다). 발현 시스템은 미국 특허 제 6,258,558호에 기술된 RNA-단백질 융합 기술 또는 미국 특허 제 6,361,943호에 기술된 시험관내 "바이러스"와 같은 세포-불포함 시스템에 기초할 수 있다. 미국 특허 제 5,843,701호에 기술된 방법과 같은 리보솜 디스플레이 방법도 사용될 수 있다.
각종 검정, 예를 들면, 인플루엔자 A 바이러스의 표현형질 분석에 적합한 검정이 제공된다. 검정은 바이러스 활성(예를 들면, 바이러스 입자의 감염, 복제 및/또는 방출) 또는 효소적 활성(예를 들면, 폴리머라제 활성)을 측정하는 것에 관한 것일 수 있다. 바이러스 활성 검정은 활성을 측정할 바이러스 또는 바이러스 변이체로 감염된 세포 또는 샘플을 사용할 수 있다. 세포 또는 샘플은 사람 환자와 같은 환자로부터 수득될 수 있다. 대안으로, 세포 또는 샘플을 배양하고 시험관내에서 바이러스 또는 바이러스 변이체로 감염시킬 수 있다. 바이러스 활성 검정은 레플리콘-기반 시스템을 사용할 수 있다.
효소적 활성은 일반적으로 목적하는 효소 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유사체 및 목적하는 효소에 대한 기질을 포함하는 세포-불포함 또는 세포-기반 시스템에서 결정될 수 있다.
소정 실시형태들에서, 확인된 화합물은 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클을 포함하는 조성물로 제형화된다. 바람직하게, 상기 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 활성을 감소시키는데 유효한 양으로 상기 화합물을 함유한다. 더욱 더 바람직하게, 상기 조성물은 환자에의 투여를 위해 제형화된다. 상기 조성물은 또한 면역조절제; 항-바이러스성 제제; 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 제2 억제제; 인플루엔자 A 바이러스 생체 주기(life cycle)에서의 다른 표적의 억제제; 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 추가의 제제를 포함할 수 있다. 각종 조성물은 하기에 보다 상세하게 기술된다.
다른 양상에서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제, 특히, 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제와 비교하여 변경된 하나 이상의 아미노산들을 갖는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제에 대해 특이적인 항체를 제공한다. 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미에서 사용되고, 구체적으로는 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 적어도 2개의 온전한 항체들로 이루어진 다중특이적 항체(예를 들면, 이특이적 항체), 및 항체 단편을 제한없이 포함한다. 용어 "면역글로불린"은 반드시 항체일 필요는 없는 각종 구조적으로 관련된 단백질을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원-결합 또는 가변성 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로 이루어진 다중특이적 항체가 포함된다. "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 바람직하게, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에, scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 말하고, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)(VHVL)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인들 사이에 쌍을 이루는 것을 가능하게 하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들은 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다.
변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제에 대한 항체는 예를 들면 분자 진화를 통해 인플루엔자 A 바이러스 단백질에 대한 공지의 항체로부터 개발될 수 있다. 아미노산 서열 변이체는 공지의 항체의 DNA 내로 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변이체는 예를 들면, 공지의 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 도달하도록 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 항체의 번역-후 과정을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 항체는 진단학적 적용 및 치료학적 적용을 가질 수 있다. 소정 실시형태들에서, 본 발명의 항체는 표지된다. 본 개시의 각종 항체들은 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 발현을 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있으므로, 이들은 또한 진단학적 또는 연구 목적을 위한 세포 분류 및 영상화(예를 들면, 유동 세포측정법, 및 형광성 활성화된 세포 분류)와 같은 적용에 유용하다. 본원에 사용되는 용어 "표지" 또는 "표지된"은 항체 내의 다른 분자의 포함을 말한다. 한 실시형태에서, 상기 표지는 검출가능한 마커, 예를 들면, 방사성 표지된 아미노산의 포함 또는 표시된(marked) 아비딘(예를 들면, 형광성 마커 또는 광학적 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 효소적 활성를 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에의 부착이다. 다른 실시형태에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들면, 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩타이드 및 당단백질을 표지화하는 각종 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이를 사용할 수 있다. 폴리펩타이드용 표지의 예로는 하기가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들면, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 란탈라이드, 인), 효소 표지(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광성 마커, 비오티닐 그룹, 2차 리포터(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프, 자기성 제제, 예를 들면, 가돌리늄, 킬레이트, 독소, 예를 들면, 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀롤, 및 퓨로마이신, 및 이들의 유사체 또는 동족체. 몇몇의 실시형태들에서, 표지는 잠재적 입체 장해를 감소시키도록 각종 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착된다.
소정의 양상들에서, 생물학적 샘플 중의 인플루엔자 A 바이러스, 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드, 또는 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 키트도 제조할 수 있다. 이러한 키트는 본 발명의 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 인식하는 항체뿐만 아니라 항체와 변이체 폴리머라제 또는 이의 부분 사이의 복합체의 존재를 검출하기에 적합한 하나 이상의 보조 시약을 포함할 수 있다. 대안으로, 이러한 키트는 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 포함 할 수 있고, 이러한 프로브 또는 프라이머는 엄중한 조건 하에서 본 발명의 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화될 수 있다. 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 목적하는 대상체를 검출하는데 사용될 수 있는 PCR 또는 RT-PCR에 적합 할 수 있다. 대안으로, 이러한 키트는 상업적으로 입수가능한 PCR 또는 비-PCR 기반의 인플루엔자 A 바이러스 진단 키트에 기초할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 화합물, 예를 들면, 폴리머라제 억제제의 활성을 구할 수 있는 것으로 확인된 2차 화합물 또는 인플루엔자 A 바이러스 변이체에 대해 유효한(예를 들면, 바이러스 변이체의 복제를 감소시킬 수 있는) 및/또는 변이체 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제에 대해 유효한(예를 들면, 변이체 폴리머라제의 효소적 활성을 감소시킬 수 있는) 것으로 확인된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 의약과 같은 의약의 제조시의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 환자에게 본 발명의 화합물의 약제학적 또는 치료학적 유효량을 단독으로 또는 다른 항-바이러스성 제제와 병용하여 (순차적으로 또는 동시에) 투여함을 포함한다. 화합물 또는 제제의 "유효량"은 일반적으로 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 발현 또는 활성, 인플루엔자 A 바이러스 생산, 복제, 또는 맹독성(virulence), 인플루엔자 A 바이러스 감염을 번식적으로 감소시키거나 또는 이러한 화합물 또는 제제의 부재 하의 이들 파라미터의 수준과 비교하여 인플루엔자 A 바이러스 감염의 증상들 중 하나 이상의 개선 또는 완화를 생성시키는데 유효한 이들 양을 말한다.
다른 양상에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 폴리머라제 억제제 및 다른 항-바이러스성 제제, 바람직하게는 항-인플루엔자 A 바이러스 제제를 포함한다. 인플루엔자 A 바이러스를 표적으로 하는 병용 치료요법은 WO 2010/148197에도 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "병용하여" 또는 "공동-투여(co-administration)"는 1개 초과의 치료요법(예를 들면, 하나 이상의 예방학적 및/또는 치료학적 제제)의 사용을 나타내는 것으로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어의 사용은 치료요법들(예를 들면, 예방학적 및/또는 치료학적 제제)가 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다.
공동투여는 근본적으로 동시적 방식으로, 예를 들면, 단일 약제학적 조성물, 예를 들면, 제1 및 제2 양의 고정비를 갖는 캡슐 또는 정제로, 또는 각각에 대해 다중의 별개의 캡슐 또는 정제로 공동투여 방법의 화합물의 제1 및 제2 양의 투여를 포함한다. 또한, 이러한 공동투여는 각각의 화합물을 임의의 순서로 순차적 방식으로 사용하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "상승작용적(synergistic)"은 본 발명의 화합물 및 다른 치료요법(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제)의 병용을 말하고, 이는 치료요법들의 부가적 효과보다 더 효과적이다. 치료요법들의 병용(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제의 병용)의 상승작용적 효과는 치료요법들 중 하나 이상의 보다 낮은 용량의 사용 및/또는 대상체에게의 상기 치료요법들의 덜 빈번한 투여를 가능하게 할 수 있다. 저용량의 치료요법(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제)를 사용하고/하거나 상기 치료요법을 덜 빈번하게 투여할 수 있는 능력은 장애의 예방, 관리 또는 치료에 있어서 상기 치료요법의 효능을 감소시키지 않으면서 대상체에게의 상기 치료요법의 투여와 관련된 독성을 감소시킬 수 있다. 또한, 상승작용적 효과는 장애의 예방, 관리 또는 치료에 있어서 제제의 효능을 개선시킬 수 있다. 마지막으로, 치료요법들의 병용(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제의 병용)의 상승작용적 효과는 어느 하나의 치료요법 단독의 사용과 관련된 역효과 또는 원치 않는 부작용을 회피하거나 감소시킬 수 있다.
상승작용적 효과의 존재는 약물 상호작용을 평가하기에 적합한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 적합한 방법으로는 예를 들면, S자형-Emax 방정식(Holford, N.H.G. and Scheiner, L.B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), 로에베 덧셈 방정식(equation of Loewe additivity)(Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)) 및 중앙값-효과 방정식(Chou, T.C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984))이 포함된다. 상기 언급된 각각의 방정식은 약물 병용의 효과를 평가하는데 도움이 되는 해당 그래프를 생성하기 위한 실험적 데이터와 함께 적용될 수 있다. 상기 언급된 방정식과 관련된 해당 그래프는 각각 농도-효과 곡선, 아이소볼로그램(isobologram) 곡선 및 병용 지수 곡선이다.
본원에 기술된 화합물과 공동-투여될 수 있는 구체예로는 뉴라미니다제 억제제, 예를 들면, 오셀타미비르(Tamiflu®) 및 자나미비르(Rlenza®), 바이러스 이온 채널(M2 단백질) 차단제, 예를 들면, 아만타딘(Symmetrel®) 및 리만타딘(Flumadine®), 및 Toyama Chemical of Japan에 의한 개발 하의 T-705를 포함하는 WO 2003/015798에 기술된 항 바이러스성 약물이 포함된다. (또한, 문헌[Ruruta et al., Antiviral Research, 82: 95-102 (2009), "T-705 (flavipiravir) and related compounds: Novel broad-spectrum inhibitors of RNA viral infections"]을 참조한다). 몇몇의 실시형태들에서, 본원에 기술된 화합물은 종래 인플루엔자 백신과 공동-투여될 수 있다.
본원의 어떠한 방법도 본 발명의 방법 또는 배합물을 특정 투여형(dosage form) 또는 용법에 제한하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 배합물의 각각의 성분은 개별적으로, 함께, 순차적으로 또는 동시에 또는 이들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다.
상기 분자에 대한 제형, 용량 및 투여 경로는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 대안으로, 일단 인플루엔자 A 바이러스 항바이러스 활성, 특히 인플루엔자 A 바이러스의 약물-내성 균주에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 화합물이 확인되면, 이 화합물의 약제학적 유효량은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 따라서, 이러한 화합물의 적절한 제형, 용량(들) 범위, 및 투약 용법은 통상적인 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 병용 치료요법에 관련된 조성물은 동시에 또는 순차적으로 투여되는 별개의 약제학적으로 허용되는 제형, 하나 이상의 치료학적 제제를 함유하는 제형으로, 또는 단일 제제 및 다중 제제 제형의 종합(assortment)에 의해 세포 또는 세포들에 또는 사람 환자에게 제공될 수 있다. 투여 경로에 관계없이, 이들 약물 배합물은 약제학적으로 허용되는 제형의 구성성분들의 항-인플루엔자 A 바이러스 유효량을 형성한다.
면역 조절제 및 면역 자극제의 존재 하에서의 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 억제제의 인플루엔자 A 바이러스 항바이러스 효과가 증진된 경우, 감소된 양의 이들 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 억제제가 본원에서 고려되는 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 이러한 감소된 양은 치료요법을 경험하는 감염 환자에서 인플루엔자 A 바이러스 역가를 일상적으로 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 이것은 예를 들면, 슬롯-블롯(slot-blot), 도트-블롯(dot-blot) 또는 RT-PCR 기술에 의한 환자 혈청에서의 인플루엔자 A 바이러스 RNA 모니터링에 의해, 또는 인플루엔자 A 바이러스 표면 또는 다른 항원의 측정에 의해 수행될 수 있다. 환자는 병용 치료요법 동안, 본원에 개시된 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 억제제 및 항-인플루엔자 A 바이러스 활성을 갖는 다른 화합물을 사용하여 유사하게 모니터링되어 병용하여 사용될 때 각각의 최저 유효 용량을 결정할 수 있다.
환자의 병태가 개선되면, 필요에 따라, 본 발명의 화합물, 조성물 또는 배합물의 유지 용량(maintenance dose)을 투여할 수 있다. 후속적으로, 용량 또는 투여 빈도 또는 둘 다는 증상이 원하는 수준으로 완화되고 치료가 중단되어야 할 때 개선된 병태가 유지되는 수준으로 증상의 함수로서 감소될 수 있다. 그러나, 환자는 질환 증상의 임의의 재발시 장기간 간헐적인 치료를 필요로 할 수 있다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 및 치료 용법은 사용되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시점, 배설 속도, 약물 배합, 및 치료하는 의사의 판단 및 치료되는 특정 질환의 중증도를 포함하는 각종 인자들에 의존할 것이다. 활성 성분의 양은 또한 특정 기술된 화합물 및 조성물 중의 추가의 항-바이러스성 제제의 존재 또는 부재 및 특성에 의존할 것이다.
다른 실시형태에 따르면, 본 발명은, 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물을 상기 환자에게 투여함으로써 바이러스의 생체 주기에 필요한 바이러스 암호화된 인플루엔자 폴리머라제에 의해 특성확인되는 바이러스로 감염된 환자를 치료하거나 상기 바이러스에 의한 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 인플루엔자 A 바이러스 감염을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용된다. 이러한 치료는 바이러스성 감염을 완전히 없애거나 이의 중증도를 감소시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 바이러스 암호화된 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 단리를 돕기 위한 실험실 도구로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고체 지지체에 부착된 본 발명의 화합물을 제공하는 단계; 상기 폴리머라제가 상기 고체 지지체에 결합하도록 하는 조건 하에 상기 고체 지지체를 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 함유하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 상기 고체 지지체로부터 상기 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 용출시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 이러한 방법에 의해 단리된 바이러스성 폴리머라제는 PB2 폴리머라제이다. 보다 구체적으로, 이는 폴리머라제 억제제에 의한 치료에 내성인 돌연변이체 PB2 폴리머라제이다. 예시의 이러한 폴리머라제로는 위치 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및/또는 510에서 돌연변이체(즉, 비-야생형) 잔기를 갖는 것으로서 본원에 기술된 것들이 포함된다.
본 발명의 화합물
몇몇의 실시형태들에서, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 억제제는 상기 명시된 용도들 중 임의의 것을 위한 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
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또 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 생물학적 샘플(예를 들면, 감염된 세포 배양물) 중의 또는 사람에서의 바이러스 역가(예를 들면, 환자에서의 폐 바이러스 역가)를 감소시키는데 사용될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 포접 화합물( clathrate ), 프로드럭(Prodrug) 및 기타 유도체
본원에 기술된 화합물은 유리 형태, 또는 적절한 경우 염으로서 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 이들 염은 의학적 목적으로 하기에 기술된 화합물을 투여하는데 유용하기 때문에 특히 중요하다. 약제학적으로 허용되지 않는 염은 제조 공정, 단리 및 정제 목적, 및 몇몇의 경우에 본 발명의 화합물의 입체 이성질체 형태 또는 이의 중간체의 분리에 사용하기에 유용하다.
본원에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 독성, 자극, 및 알레르기 반응 등과 같은 과도한 부작용없이 사람 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물의 염을 말하고, 합리적인 이익/위험 비율에 비례한다.
약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들면, S. M. 베르게(Berge) 등은 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에 약제학적으로 허용되는 염을 상세하게 기술한다. 본원에 기술된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염으로는 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것들이 포함된다. 이들 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안에 동일 반응계 내에서(in situ) 제조될 수 있다.
본원에 기술된 호합물이 염기성 그룹 또는 충분히 염기성인 생체 등배전자체(bioisostere)를 함유하는 경우, 산 부가염은 1) 이의 유리-염기 형태로의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기산과 반응시키고 2) 이로써 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 실제로, 산 부가염은 유리 염기 형태의 사용하기 보다 편리한 형태일 수도 있고, 염의 사용은 유리 염기 형태의 사용에 해당한다.
약제학적으로 허용되는 비-독성 산 부가염의 예로는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산으로 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산과 같은 유기산으로 이루어진 또는 이온 교환과 같은 당해 분야에서 사용되는 다른 방법을 이용함에 의한 아미노 그룹의 염이 있다. 다른 약제학적으로 허용되는 염으로는 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 글리콜레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 및 발러레이트 염 등이 포함된다.
본원에 기술된 화합물이 카르복시 그룹 또는 충분히 산성인 생체 등배전자체를 함유하는 경우, 염기 부가염은 1) 이의 산 형태로의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 염기와 반응시키고 2) 이로써 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 실제로, 염기 부가염의 사용은 보다 편리한 형태일 수도 있고, 염 형태의 사용은 본질적으로 유리 산 형태의 사용에 해당한다. 적절한 염기로부터 유도된 염으로는 알칼리 금속(예를 들면, 나트륨, 리튬 및 칼륨), 알칼리 토금속(예를 들면, 마그네슘 및 칼슘), 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염이 포함된다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 화합물의 임의의 염기성 질소-함유 그룹의 4급화(quaternization)를 고려한다. 이러한 4급화에 의해 물 또는 유용성 또는 분산성 제품을 얻을 수 있다.
염기성 부가염으로는 약제학적으로 허용되는 금속 및 아민염이 포함된다. 적합한 금속염으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 바륨, 아연, 마그네슘, 및 알루미늄이 포함된다. 나트륨 및 칼륨염이 일반적으로 바람직하다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염으로는 적절한 경우 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할라이드, 하이드록시드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 카운터이온(counterion)을 이용하여 형성된 아민 양이온이 포함된다. 적합한 무기 염기 부가염은 수소화 나트륨, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 수산화 알루미늄, 수산화 리튬, 수산화 마그네슘, 및 수산화 아연을 포함하는 금속 염기로부터 제조된다. 적합한 아민 염기 부가염은 이들의 낮은 독성 및 의학적 용도에의 용인가능성(acceptability) 때문에 의학적 화학에서 빈번하게 사용되는 아민으로부터 제조된다. 암모니아, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, 디에틸아민, 피페라진, 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 수산화 테트라메틸암모늄, 트리에틸아민, 디벤질아민, 에펜아민, 데하이드로아비에틸아민, N-에틸피페리딘, 벤질아민, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민, 염기성 아미노산, 및 디사이클로헥실아민 등.
다른 산 및 염기는 본질적으로 약제학적으로 허용되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용되는 산 또는 염기 부가염을 수득하는데 있어서 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 상이한 약제학적으로 허용되는 염의 혼합물/배합물 및 또한 유리 형태의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 염의 혼합물/배합물을 포함함을 이해해야한다.
본원에 기술된 화합물 이외에, 약제학적으로 허용되는 용매화물(예를 들면, 수화물) 및 이들 화합물의 포접 화합물은 또한 본원에서 확인된 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 조성물에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 용매화물"은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 용매 분자와 본원에 기술된 화합물 중 하나와의 회합으로부터 형성된 용매화물이다. 용어 용매화물은 수화물(예를 들면, 반수화물, 1수화물, 2수화물, 3수화물, 및 4수화물 등)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "수화물"은 비-공유 분자간 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적 양의 물을 추가로 포함하는 본원에 기술된 화합물 또는 이의 염을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "포접 화합물(clathrate)"은 내부에 포획된 게스트(guest) 분자(예를 들면, 용매 또는 물)를 갖는 공간(예를 들면, 채널)을 함유하는 결정 격자 형태의 본원에 기술된 화합물 또는 이의 염을 의미한다.
본원에 기술된 화합물 이외에, 이들 화합물의 약제학적으로 허용되는 유도체 또는 프로드럭은 또한 본원에서 확인된 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 조성물에 사용될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 유도체 또는 프로드럭"은, 수용체(recipient)에게 투여시 본원에 기술된 화합물 또는 이의 억제 활성 대사물질 또는 잔기를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는, 본원에 기술된 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 에스테르, 에스테르의 염 또는 이의 다른 유도체 또는 염을 포함한다. 특히 바람직한 유도체 또는 프로드럭은 이러한 화합물이 환자에게 투여될 때 (예를 들면, 경구 투여된 화합물이 혈액 내로 보다 쉽게 흡수되도록 함으로써) 화합물의 생체 이용률(bioavailability)을 증가시키는 화합물 또는 모 종(parent species)에 비하여 생물학적 구획(예를 들면, 뇌 또는 림프계)에의 모 화합물의 전달을 향상시키는 화합물이다.
본원에서 사용되는 바와 같고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "프로드럭"은 새물학적 조건(시험관내 또는 생체내) 하에 가수분해하거나, 산화되거나, 또는 그렇지 않으면 반응하여 본원에 기술된 화합물을 제공할 수 있는 화합물의 유도체를 의미한다. 프로드럭은 생물학적 조건 하에 이러한 반응에 의해 활성이 될 수 있거나, 이들은 이들의 미반응 형태로 활성을 가질 수 있다. 본 발명에서 고려되는 프로드럭의 예로는 생체 가수분해성(biohydrolyzable) 아미드, 생체 가수분해성 에스테르, 생체 가수분해성 카르바메이트, 생체 가수분해성 카르보네이트, 생체 가수분해성 우레이드, 및 생체 가수분해성 포스페이트 유사체와 같은 생체 가수분해성 모이어티를 포함하는 본 발명의 화합물의 유사체 또는 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 프로드럭의 다른 예로는 -NO, -NO2, -ONO 또는 -ONO2 모이어티를 포함하는 본원에 기술된 화합물의 유도체가 포함된다. 프로드럭은 통상적으로 익히 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 문헌[Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5th ed)]에 기술된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 유도체"는 필요로 하는 환자에게 투여시 달리 본원에 기술된 화합물 또는 이의 대사물질 또는 잔기를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 부가물 또는 유도체이다. 약제학적으로 허용되는 유도체의 예로는 에스테르 및 이러한 에스테르의 염이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기술된 화합물의 약제학적으로 허용되는 프로드럭으로는 에스테르, 아미노산 에스테르, 포스페이트 에스테르, 금속염 및 설포네이트 에스테르가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 화합물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제(adjuvant) 또는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명은 상기 기술된 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제 또는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제 또는 비히클을 포함하는 약제학적 조성물이다. 약제학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 의도된 투여 형태와 관련하여 적합하게 선택되고 종래의 약제학적 관행(pharmaceutical practice)과 일치하는 약제학적 희석제, 부형제 또는 담체가 포함된다.
"유효량"은 "치료학적 유효량" 및 "예방학적 유효량"을 포함한다. 용어 "치료학적 유효량"은 인플루엔자로 감염된 환자에서의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하고/하거나 개선시키는데 유효한 양을 말한다. 용어 "예방학적 유효량"은 인플루엔자 바이러스 감염 대발병의 기회 또는 크기를 예방하고/하거나 실질적으로 경감시키는데 유효한 양을 말한다. 유효량의 구체예는 개시된 화합물의 용도라는 제목의 섹션에 상기 기술되어 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 화합물의 생물학적 활성을 과도하게 억제하지 않는 비활성 성분을 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 생체적합성(biocompatible), 예를 들면, 비독성, 비-염증성, 비-면역원성이어야 하거나, 대상체에게 투여시 기타 바람직하지 않은 반응 또는 부작용이 전혀 없어야 한다. 표준 약제학적 제형 기술을 사용할 수 있다.
본원에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 또는 비히클로는 원하는 특정 투여형에 맞추어 임의의 및 모든 용매, 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장성 제제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 및 윤활제가 포함된다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)]은 약제학적으로 허용되는 조성물을 제형화하는데 사용되는 각종 담체 및 이의 제조를 위한 공지의 기술을 개시한다. 임의의 종래 담체 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성시키거나 또는 그렇지 않으면 약제학적으로 허용되는 조성물의 임의의 다른 구성성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 본원에 기술된 화합물과 양립할 수 없는 한을 제외하고는, 이의 용도는 본 발명의 범위 내인 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 어구 "부작용"은 치료요법(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제)의 원치 않는 역효과를 포함한다. 부작용은 언제나 원치 않지만, 원치 않는 효과가 반드시 유해한 것은 아니다. 치료요법(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제)으로부터의 역효과는 유해하거나 불편하거나 위험할 수도 있다. 부작용으로는 발열, 오한, 무기력, 위장 독성(위 및 장 궤양 및 미란(erosion)), 구역, 구토, 신경독성, 신독성, 신장 독성(신유두 괴사 및 만성 간질성 신염과 같은 이러한 병태 포함), 간 독성(상승된 혈청 간 효소 수준 포함), 골수 독성(백혈병, 골수억제, 혈소판 감소증 및 빈혈 포함), 건조한 입, 금속 맛(metallic taste), 임신의 연장, 쇠약, 경면, 통증(근육 통증, 골 통증 및 두통 포함), 모발 손실, 무력증, 어지럼증, 추체외로 증상(extra-pyramidal symptom), 정좌 불능증, 심혈관 교란 및 성 기능이상이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
약제학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 몇몇의 예로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예를 들면, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예를 들면, tween 80, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 또는 소르브산 칼륨), 포화된 식물성 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질(예를 들면, 프로타민 설페이트, 인산 수소 2나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화 나트륨, 또는 아연 염), 콜로이달 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 라놀린(wool fat), 당, 예를 들면, 락토스, 글루코스 및 슈크로스; 전분, 예를 들면, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화된 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예를 들면, 코코아 버터 및 좌제 왁스, 오일, 예를 들면, 땅콩유, 면실유; 홍화유; 참깨유; 올리브유; 옥수수유 및 대두유; 글리콜; 예를 들면, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리코; 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이드 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예를 들면, 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 발열원-불포함 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜, 및 포스페이트 완충액, 및 다른 비-독성 적합성 윤활제, 예를 들면, 황산 라우릴 나트륨 및 스테아르산 마그네슘이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니고, 또한 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 훈습제(perfuming agent), 보존제 및 항산화제도 조제사(formulator)의 판단에 따라 조성물 중에 존재할 수 있다.
투여 방법
상기 기술된 화합물 및 약제학적으로 허용되는 조성물은 치료되는 감염의 중증도에 따라 사람 및 다른 동물에게 경구, 직장, 비경구, 낭내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고 또는 드롭제에 의해), 경구 또는 비강 스프레이 등으로서 협측 투여할 수 있다.
경구 투여용 액체 투여형으로는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽제 및 엘릭시르(elixir)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 활성 화합물 이외에, 액체 투여형은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면실, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 및 참깨유), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 보조제, 예를 들면, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제 및 훈습제를 포함할 수 있다.
주사가능한 조제, 예를 들면, 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 공지의 분야에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 조제는 또한 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 1,3-부탄디올 중의 용액으로서 멸균 주사가능한 용액, 현탁액, 또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매들은 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화 나트륨 용액이다. 또한, 멸균 고정유는 종래 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드(bland) 고정유를 사용할 수 있다. 또한, 지방산, 예를 들면, 올레산은 주사가능한 조제에 사용된다.
주사가능한 제형은 사용하기 전에 예를 들면, 세균-보전(bacterial-retaining) 필터를 통한 여과에 의해 또는 멸균수 또는 기타 멸균 주사가능한 매질 중에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 포함시킴으로써 멸균될 수 있다.
본원에 기술된 화합물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 화합물의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 이것은 수용성이 좋지 않은 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 이어서, 화합물의 흡수 속도는 용해 속도에 의존하고, 이는 결국 결정 크기 및 결정 형태에 의존할 수 있다. 대안으로, 비경구 투여된 화합물 형태의 지연된 흡수는 화합물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다. 주사가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜라이드와 같은 생체분해성 폴리머에 화합물의 미세캡슐 매트릭스를 형성함으로써 이루어진다. 화합물 대 폴리머의 비율 및 사용된 특정 폴리머의 성질에 따라, 화합물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생체분해성 폴리머의 예로는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 데포 주사가능한 제형은 또한 신체 조직과 적합한 리포솜 또는 미세에멀젼에 화합물을 포획함으로써 제조된다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 구체적으로는 본원에 기술된 화합물을 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체, 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌제 왁스와 혼합하여 제조될 수 있는 좌제이고, 이는 주위 온도에서 고체이지만 체온에서 액체이므로 직장이나 질강에서 융해되어 활성 화합물을 방출한다.
경구 투여용 고체 투여형은 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여형에서, 활성 화합물은 적어도 하나의 비활성, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 예를 들면, 시트르산 나트륨 또는 인산 2칼슘 및/또는 a) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산; b) 결합제, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 슈크로스 및 아카시아; c) 글리세롤과 같은 습윤제; d) 한천-한천, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정 실리케이트 및 탄산나트륨과 같은 붕해제; e) 파라핀과 같은 용액 지연제; f) 흡수 촉진제, 예를 들면, 4급 암모늄 화합물; g) 습윤제, 예를 들면, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; h) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡착제; 및 i) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 황산 라우릴 나트륨 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정(dragee), 캡슐, 환제 및 과립의 고체 투여형은 약제학적 제형화 분야에 익히 공지되어 있는 장용 코팅 및 기타 코팅과 같은 코팅 및 외피(shell)로 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제(opacifying agent)를 함유할 수 있고, 또한 활성 성분(들)을 선택적으로 또는 지연된 방식으로 장관의 소정 부분에서만 또는 우선적으로 방출하는 조성물로 이루어질 수 있다. 사용될 수 있는 포매(embedding) 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스가 포함된다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 사용될 수 있다.
활성 화합물은 또한 상기 나타낸 바와 같은 하나 이상의 부형제와 함께 미세캡슐화된 형태일 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립의 고체 투여형은 코팅 및 외피, 예를 들면, 장용 코팅, 방출 제어 코팅 및 약제학적 제형화 분야에 익히 공지되어 있는 기타 코팅으로 제조될 수 있다. 이러한 고체 투여형에서, 활성 화합물은 슈크로스, 락토스 또는 전분과 같은 적어도 하나의 비활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여형은 또한 통상적인 실시에서와 같이 비활성 희석제 이외의 추가의 물질, 예를 들면, 타정(tableting) 윤활제 및 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정 셀룰로스와 같은 기타 타정 보조제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 함유할 수 있고, 활성 성분(들)을 선택적으로 또는 지연된 방식으로 장관의 소정 부분에서만 또는 우선적으로 방출하는 조성물로 이루어질 수 있다. 사용될 수 있는 포매(embedding) 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스가 포함된다.
본원에 기술된 화합물의 국소 또는 경피 투여용 투여형은 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다. 활성 구성성분은 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의의 필요한 보존제 또는 필요할 수 있는 완충제와 함께 멸균 조건 하에서 혼합된다. 안과 제형, 이어드롭(eardrop) 및 점안제도 또한 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 고려된다. 추가로, 본 발명은 경피 패치의 사용을 고려하고, 경피 패치는 신체에 대한 화합물의 제어된 전달을 제공한다는 추가적인 이점을 갖는다. 이러한 투여형은 화합물을 적절한 매질에 용해시키거나 분배함으로써 제조될 수 있다. 흡수 향상제는 또한 피부를 가로지르는 화합물의 플럭스(flux)를 증가시키는데 사용될 수 있다. 속도는 속도 제어막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 경구, 비경구, 흡입 분무, 국소, 직장, 비강, 협측, 질내 또는 이식된 저장소(reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액막내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 특히, 조성물은 경구, 복강내 또는 정맥내 투여된다.
본원에 기술된 조성물의 멸균 주사가능한 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당해 분야에 공지되어 있는 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 조제는 또한 비-독성 비경구-허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들면, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화 나트륨 용액이다. 또한, 멸균의 고정유는 종래 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유를 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산은 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연의 약제학적으로 허용되는 오일, 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 버전에서와 같이 주사가능한 조제에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 에멀젼 및 현탁액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 투여형의 제형화에 일반적으로 사용되는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. Tweens, Spans 및 약제학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 다른 투여형의 제조에 일반적으로 사용되는 기타 유화제 또는 생체이용률 증강제와 같은 기타 통상적으로 사용되는 계면활성제 또한 제형화의 목적으로 사용될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 임의의 경구적으로 허용되는 투여형으로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체로는 락토스 및 옥수수 전분이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트도 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제로는 락토스 및 건조 옥수수 전분이 포함된다. 경구용으로 수성 현탁액이 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁 제와 혼합한다. 필요에 따라, 소정 감미료, 향미제 또는 착색제도 첨가할 수 있다.
대안으로, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들은 실온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체이므로 직장에서 용해되어 약물을 방출할 것인 적합한 비-자극성 부형제와 함께 제제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 또한 특히 치료의 표적이 눈, 피부 또는 하부 장관의 질환을 포함하는 국소 도포에 의해 용이하게 접근가능한 부위 또는 기관을 포함하는 경우에 국소 투여될 수 있다. 적합한 국소 제형은 이들 부위 또는 장기 각각에 대해 용이하게 제조된다.
하부 장관에 대한 국소 적용은 직장 좌제 제형(상기 참조) 또는 적합한 관장 제형에 효과적일 수 있다. 국소-경피 패치도 사용할 수 있습니다.
국소 적용의 경우, 약제학적 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 활성 구성성분을 함유하는 적합한 연고에 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여용 담체로는 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 대안으로, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체에 현탁되거나 용해된 활성 구성성분을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 적합한 담체로는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2 옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
안과용으로, 약제학적 조성물은 등장성, pH 조정된 멸균 염수 중의 미세화된 현탁액으로서, 또는 구체적으로는 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제를 갖거나 갖지 않는 등장성의 pH 조정된 멸균 염수의 용액으로서 제형화될 수 있다. 대안으로, 안과용으로, 약제학적 조성물은 바셀린과 같은 연고에 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적 제형의 분야에 익히 공지되어 있는 기술에 따라 제조되고, 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체 이용률을 향상시키는 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 다른 종래 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수 중의 용액으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 화합물은 단위 투여형(unit dosage form)으로 제형화될 수 있다. 용어 "단위 투여형"은 치료를 받는 대상체에 대한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말하고, 각각의 단위는 임의로 적합한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 소정 양의 활성 물질을 함유한다. 단위 투여형은 단일 1일 용량 또는 다중 1일 용량(예를 들면, 1일당 약 1 내지 4회 이상)일 수 있다. 다중 1일 용량이 사용되는 경우, 단위 투여형은 각각의 용량에 대해 동일하거나 상이할 수 있다.
예시
이제 본 개시를 일반적으로 설명하지만, 단지 본 발명의 소정 양상 및 실시형태를 설명하기 위한 목적으로 포함되는 하기의 실시예를 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이며, 이는 본원을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 동정
시험관내 선별 실험은 인플루엔자 A/위스콘신/67/2005 (H3N2) 균주에서 수행하였다. 화합물 1의 항바이러스 활성은 3일 세포병변 효과(CPE)-기반 검정에서 MDCK 세포를 사용하여 측정하였다. MDCK 세포를 함유하는 반복검증(replicate) 웰을 1.0의 MOI에서 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 바이러스 복제의 대용물(surrogate)로서 CPE의 발달을 모니터링함으로써, 화합물 1에 대한 민감성이 감소된 변이체를 시험관내에서 선별하였다. 선별 실험은 화합물 1의 8개의 농도 각각에서의 32개의 반복검증 웰을 사용하여 384-웰 플레이트에서 수행하였고, 1x 내지 128x EC50의 범위였다. 바이러스를 상청액으로부터 샘플링하였고 새로운 세포에 계대하였다(passaged). 억제제의 존재 하에 바이러스 성장을 나타내는 웰의 상청액을 사용하여 화합물 1 민감성을 특징으로 하는 작은 바이러스 스톡(stock)을 성장시켰다. 화합물 1에 대한 민감성이 감소된 바이러스의 경우, 바이러스 RNA를 추출, 역 전사 및 PCR-증폭한 후 PA, PB1 및 PB2 암호화 영역의 Sanger-기반 집단 서열분석을 수행하였다. 화합물 1에 대한 바이러스 민감성에 대한 1차 아미노산 변화의 효과의 확인 및 역 유전학 시스템을 사용하여 바이러스 복제 능력을 수행하였고, 확인된 변이체의 고유 빈도를 분석하였다.
화합물 1에 대한 감수성이 감소된 변이체를 인플루엔자 A PB2 단백질의 아미노산 위치 306, 323, 324, 363, 376, 431 및 510에서 단리하였다. 이들 변이체는 자연 발생 사람 인플루엔자 서열의 공공의 서열 데이터베이스에서 매우 낮은 빈도(즉, <0.01%)로 발견되었다. 추가로, 모든 화합물 1-선택된 PB2 변이체는 시험관내에서 야생형 바이러스와 비교하여 복제적 손상을 나타낸다. 3개의 내성 선택 실험으로부터 단리된 변이체는 PB2의 캡-결합 포켓에 위치하며, 화합물 1의 결합을 직접적으로 또는 간접적으로 변경시킬 가능성이 있다. 이들 결과는 인플루엔자 폴리머라제 복합체의 본래의 '캡-스냇칭(cap-snatching)' 활성의 억제제로서의 화합물 1의 메커니즘을 지지한다.
화합물 1에 대한 감수성이 감소된 변이체는 PB1 또는 PA 유전자가 아닌 인플루엔자 바이러스 PB2 유전자에서 특이적인 변화를 보였다. PB2 아미노산 위치 Q306, F323, S324, F363, K376, M431 및 N510의 변이체는 화합물 1에 대한 민감성의 10배 이상의 변화를 나타냈다. 이러한 PB2 변경을 포함하는 역 유전학-생성된 바이러스는 화합물 1에 대한 감소된 민감성을 확인시켜주었다.
화합물 1(S324, S337, F363, K376, F404 및 M431)에 대한 감수성이 감소된 선택된 변이체의 대부분은 PB2 캡-결합 영역 내에 위치한다. 나머지 Q306H 및 N510T는 구조적 정보가 없는 PB2 영역에 위치하고 있다.
이들 변이체 위치는 A/푸에르토 리코/8/34 및 A/캘리포니아/07/2009로 수행된 화합물 1 내성 선택 실험에서 확인된 것들과 현저한 중첩을 나타낸다.
실시예 2: 화합물, 성장 배지 및 배지 보충물
화합물 1을 Vertex Pharmaceuticals Incorporated에서 합성하였고, 100% 디메틸 설폭시드(DMSO)에 10mM의 농도로 용해시켰고, -20℃에서 보관하였다. Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)로부터 DMEM(카탈로그 번호 11960), 200mM의 L-글루타민(카탈로그 번호 25030-081), 페니실린-스트렙토마이신 액체(카탈로그 번호 15140-122) 및 HEPES 완충액(카탈로그 번호 15630)을 구입하였다. 태아 소 혈청(FBS; 카탈로그 번호 F4135 또는 10091-148)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA) 또는 Invitrogen으로부터 각각 구입하였다. DMS0(카탈로그 번호 D2650) 및 Ex-CELL 무혈청 배지(카탈로그 번호 M8303)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. CellTiterGlo®(카탈로그 번호 G7573)는 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 톨릴설포닐 페닐알라닐 클로로메틸 케톤(TPCK)-처리된 트립신(카탈로그 번호 22725)은 USB Corporation(Affymetrix, Fremont, CA, USA)에서 구입하였다.
실시예 3: 바이러스 스톡
개 신장 세포주(MDCK)에서의 생산적인 감염을 허용하기 위해, MDCK 세포에서 A/위스콘신/67/2005(Influenza Reagent Resource, FR-397, Manassas, VA, USA)를 10회 일련 계대 배양하였다. 이러한 적응된 바이러스를 플라크 정제하였고(A/위스콘신/67/2005-p1로서 명명함), 표준 방법에 의해 제조하였다(World Health Organization, 간략하게, MDCK 세포(CCL-34, ATCC)를 2mM의 L-글루타민, 1X 비-필수 아미노산, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신(완전 DEME; cDMEM)이 10% FBS와 함께 보충된 DMEM에 유지하였다. 세포를 1μg/mL TPCK-처리된 트립신을 갖는 cDMEM(바이러스 성장 배지; VGM)에서 대략 48시간 동안 저 감염 다중도(MOI)로 감염시켰고, 그 후 Beckman GS-6R 원심분리기를 이용하여 650xg로 10분 동안의 원심분리에 의해 상청액을 수거하였다. 바이러스 스톡을 동결시켰고 -80℃에 보관하였다. TCID50(세포 배양물의 50%에서 병리학적 변화를 생성할 것인 감염성 제제의 양) 감염성 역가는 4-일 세포병변 효과-기반 검정에서 MDCK 세포에 대한 바이러스 스톡의 일련의 희석액을 시험함으로써 측정하였고, 그 결과는 카르베르(Karber) 방법에 의해 계산하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 4: 인플루엔자 변이체의 시험관내 선별
Biomek FX 액체 취급기(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 MDCK 세포(4x105 세포/mL)를 흑색의 투명한 바닥의 384-웰 플레이트에 50㎕의 바이러스 성장 배지(VGM: 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, HEPES 및 1㎍/mL의 TPCK-처리된 트립신이 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(DMEM))의 웰당 2x104 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션하여 세포가 부착되어 단층을 형성하도록 하였다. Biomek FX를 사용하여, 40μL의 배지를 제거하였고, 전체 50μL에 대해 1의 MOI(20,000 TCID50/웰)로 희석된 약물(0.5% DMS0의 최종 DMSO 농도)과 바이러스 15μL를 함유한 VGM 25μL로 대체하였다. 약물을 1x 내지 128x EC50 범위의 화합물 1의 8개의 농도 각각에서 32개의 반복 웰에 첨가하였다. 내부 통제는 세포를 함유한 64개의 웰과 화합물 부재 하의 바이러스 감염된 세포를 갖는 64개의 웰로 구성되었다. 상기 플레이트를 포화 습도의 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 20㎕의 상청액을 수거하였고, 150㎕의 cDMEM에 희석시켰다. 20㎕의 CellTiter-Glo를 30㎕의 배지 및 세포를 함유하는 플레이트에 Biomek FX를 이용하여 부가하였고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포 내의 총 ATP를 통한 세포 생존능(viability)의 측정값인 발광도는 EnVision 플레이트 판독기(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하여 화합물의 존재시 성장된 바이러스의 효과를 모니터링하였다. 희석된 상청액 바이러스를 새로운 웰에 계대 배양하였다. 2개의 추가의 바이러스 계대를 수행하였다. 총 3개의 계대 후, 억제제의 존재 하에 바이러스 성장을 나타낸 웰을 소형 바이러스 스톡으로 확대시켰고, 이들 스톡을 3일 MDCK 세포 보호 검정에서 화합물 1 민감성에 대해 특성확인하였다. 화합물 1에 대한 감소된 민감성을 나타내는 스톡들에 대해, PB1, PB2, 및 PA 암호화 서열은 RNA 단리, 역전사 PCR, PCR 증폭 및 Sanger-기반 집단 서열분석에 의해 결정되었다. 역 유전학-기반 시스템에서 시험하기 위한 잠재적 화합물 1 내성 변이체를 확인하기 위해, 몇몇의 기준을 사용하였다. 이 바이러스는 10배 이상의 화합물 1 민감성에서 EC50 변화를 입증할 필요가 있었고(3 내지 5배의 검정-대-검정 편차 밖), 다중 실험 웰에서 관찰되었다. 추가로, 화합물 1에 대한 내성을 부여하는 것으로 이전에 확인된 PB2 위치에서의 임의의 변이체도 분석하였다. 마지막으로, 화합물 1과 관련되어 있지 않은 일반적인 다형성(polymorphism)을 제거하기 위해, 변이체는 대조군 웰에서 관찰되는 경우 제외되었다. 모 균주로부터의 아미노산 변화를 확인하였고, 12-플라스미드 역 유전학 시스템을 사용하여 A/Puerto Rico/8/34 인플루엔자 배경에 클로닝하였다. 역 유전학 인플루엔자 균주의 표현형은 3일 MDCK 세포 보호, 억제제 민감성 검정에 의해 다시 특성확인되었다. 확인된 변이체의 고유 빈도는 인플루엔자 서열의 공공의 데이터베이스를 검색하여 분석하였고, 입수가능한 PB2 X-선 결정 구조 내에서 확인된 아미노산 변화의 위치를 평가하였다.
개 신장 세포주(MDCK)에서 생산적인 감염을 허용하기 위해, A/위스콘신/67/2005를 MDCK 세포에서 10회 일련 계대 배양하였다. 이러한 적응된 바이러스를 플라크 정제하였고 플라크 #1은 A/위스콘신/67/2005-p1로서 명명하였다. 모 및 플라크 #1 A/위스콘신/67/2005 바이러스 간의 서열 비교는 PA, PB1 및 PB2 서열이 동일함을 보여준다. A/위스콘신/67/2005-p1을 사용한 3일 MDCK 세포-기반 CPE 검정에서 화합물 1에 대한 민감도는 0.0020μM인 것으로 결정되었다.
화합물 1에 대한 감수성이 감소된 A/위스콘신/67/2005-p1(본원에서는 A/위스콘신/67/2005로서 지칭함) 변이체의 선별을 수행하였다. EC50 내지 128x-EC50(즉, 0.0020μM 내지 0.256μM) 범위의 화합물 1 농도에서 선별을 수행하였다. 웰당 같은 농도에서 3번의 계대 배양 후, 상청액으로부터 농축된 바이러스 집단을 수거하였다. 확인가능한 표현형 분석 및 폴리머라제 유전자의 서열분석을 위해 16개의 잠재적 화합물 1-내성 변이체 함유 웰(즉, 감염되지 않은 웰에 비해 50% 미만의 ATP 수준을 갖는 웰) 및 16개의 대조군 웰을 선택하였다(표 3 및 표 4).
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
16개의 화합물 1 계대된 바이러스 단리물 중, 9개가 확인된 10배 초과의 EC50 변화를 가졌다. 이들 9종의 바이러스는 모두 A/푸에르토 리코/8/34 및/또는 A/California/07/2009(표 3의 텍스트, 표 5)의 화합물 1에 내성을 부여하는 것으로 이전에 특성확인된 위치에 PB2 변이체를 함유하였다. 200배 초과의 화합물 1-내성 바이러스는 PB2 변이체 S324R, S324N, K376N 또는 N510K를 함유하였고, 한편, F323S, Q306L 및 M431I는 덜 내성인 바이러스(10-200배)에서 관찰되었다. F363L 변이체는 5배 내성을 부여하는 바이러스에서 관찰되었다. 이 연구에서 관찰된 새로운 변이체는 이전에 특성확인된 PB2 위치에서 Q306L, K376N, M431I 및 N510K이었다. 이 연구에서 PA 또는 PB1 변이체는 화합물 1 내성과 관련이 없었다. 화합물 1 계대 배양된 웰에서 PB1 변이체가 관찰되지 않았지만, 화합물 1(1xEC50)에 대한 민감성의 확인된 감소를 갖지 않은 웰에서 2개의 PA 변이체가 관찰되었다.
역 유전학 방법을 사용하여 개별 잠재적 화합물 1-내성 변이체의 특성확인이 진행중이다. 현재까지 이들 바이러스는 4.9 내지 514배 범위의 화합물 1 EC50 변화를 입증하였다(표 5). 모든 변이체는 M2-억제제 내성 및 NAI 민감성을 부여하는 서열을 함유하는 A/Puerto Rico/8/34 역 유전학 시스템을 사용하여 생성되었기 때문에 교차-내성 연구는 수행되지 않았다.
내성 선별 연구에서 확인된 바이러스의 복제 능력을 평가하기 위해, MDCK 세포는 매우 낮은 MOI(0.01)에서 변이체를 생성한 역 유전학 물질에 감염시켰고 바이러스 역가는 62시간의 기간 동안 모니터링되었다. 야생형 바이러스에 대한 피크 역가는 감염 후 48시간째에 측정되었으므로, 모든 돌연변이 바이러스를 이 시점에 비교하였다. 모든 경우에, PB2 돌연변이 바이러스는 야생형 바이러스와 동등한 역가로 성장할 수 없었다(표 5). F404Y만이 야생형의 절반 이상(56%)의 역가를 달성하였다. 10종 바이러스는 야생형의 10% 이하의 역가를 나타냈다: Q306H, F323S, S324I, S337L, S337P, F363L, K376R, M431I, M431T 및 N510K. K376Q를 검정하였고, 감염 후 48시간째에 바이러스 역가가 검출 한계보다 더 낮았다. 참고로, 이 검정은 1회 수행되었으며, 각 바이러스는 해당 검정에서 적어도 3회 제시되었다. 각각의 시점에서 각각의 바이러스에 대한 3개의 값들을 평균계산하였다.
실시예 5: 화합물 1에 대한 인플루엔자 변이체의 민감성의 특성확인
화합물 항바이러스 활성은 CellTiter-Glo를 사용하여 세포 ATP 수준으로 측정시 인플루엔자 바이러스 감염의 결과로서 MDCK 세포 사멸을 방지하는 이의 능력에 의해 평가하였다. 간략하게, Biomek FX 액체 취급기를 사용하여 MDCK 세포(4x105세포/mL)를 흑색의 투명한 바닥의 384-웰 플레이트에 50μL VGM의 웰당 2x104 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 포화된 습도의 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션하여 세포가 접착되어 단층을 형성하도록 하였다. Biomek FX를 사용하여, 40㎕의 배지를 제거하였고, 희석된 약물을 함유하는 VGM(최종 DMSO 농도 0.5% DMSO) 25μL 및 100 TCID50/웰의 농도의 바이러스 15㎕를 부가하였다. 내부 통제는 세포만을 함유한 웰과 화합물 부재 하의 바이러스 감염된 세포를 함유하는 웰로 구성되었다. 상기 플레이트를 포화 습도의 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 20μL의 CellTiter-Glo를 Biomek FX를 사용하여 각 웰에 첨가하고 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. EnVision 플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 발광도를 측정하였다. Levenburg Marquardt 알고리즘(Condoseo 소프트웨어, Genedata Basel, 스위스)의 4-파라미터 곡선 맞춤 방법을 사용하여 화합물 용량 대 반응 데이터를 핏팅(fitting)함으로써 EC50(CPE가 대조군의 절반인 화합물 농도) 값을 계산하였다.
실시예 6: 바이러스 복제 역량(competency)의 결정
감염된 MDCK 세포에서 62시간의 성장 곡선을 통해 역 유전학 변이체에 대해 바이러스 복제 역량을 검정하였다. MDCK 세포를 웰당 4x104세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였고, 화합물 부재 하의 MOI=0.01의 바이러스로 감염시켰다. 다양한 시점에서 플레이트를 수거하였고, 상청액을 바이러스 역가에 대해 검정하였다. 바이러스 역가를 시간에 따라 플롯팅(plotted)하였고, 야생형 바이러스에 대한 피크 역가가 감염 후 48시간째에 발생하는 것으로 결정되었다.
실시예 7: 바이러스 스톡 또는 감염된 MDCK 세포로부터의 인플루엔자 A 폴리 머라제 복합체의 증폭 및 서열분석
인플루엔자 A 바이러스의 서열 분석은 PB2, PB1 및 PA 암호화 영역에 대해 약 2.5킬로베이스 RNA 단편의 역-전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 증폭을 이용하였다. 바이러스성 RNA는 변성 조건 하에 300㎕의 용해 완충액 중의 2 x 106개의 감염된 MDCK 세포 또는 100㎕의 바이러스 스톡으로부터 추출하였다. RNeasy Plus Mini 방법(카탈로그 번호 74134, Qiagen, Valencia, CA, USA) 또는 QIAamp Virus RNA Mini 방법(카탈로그 번호 52904, Qiagen)을 사용하여 표준 상업용 실리카겔 막에 의해 바이러스 RNA를 단리하였다. 2.5μM의 Universal 12 프라이머(AGCRAAAGCAGG)(서열번호 2), 400U의 SuperscriptTM III 역전사효소(카탈로그 번호 18080-044, Invitrogen, Carlsbad, CA), 40U의 RNase OUT(카탈로그 번호 10777-019, Invitrogen), PC2 반응 완충액(50mM Tris-HCl pH 9.1, 16mM 황산 암모늄, 3.5mM 염화 마그네슘 및 150㎍/mL 소 혈청 알부민)(카탈로그 번호 1001, AB Peptides, St. Louis, MO, USA), 500μM의 dNTP(카탈로그 번호 639125, Clontech, Mountain View, CA, USA) 및 5mM의 디티올트레이톨(카탈로그 번호 18080-044, Invitrogen)을 함유하는 50μL의 반응물 중의 바이러스성 RNA로부터 상보성 DNA(cDNA) 단편을 합성하였고, 변성 단계(65℃ 5분 동안), 이어서, RT 반응에서 확장 온도를 상승시켰다(25℃ 10분, 42℃ 10분, 50℃ 20분, 55℃ 10분 및 70℃ 15분). 합성된 cDNA 풀로부터 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 서브유닛-암호화 단편을 증폭시키기 위해, 완료된 RT 반응물 5μL를 PC2 반응 완충액, 200μM dNTP(카탈로그 번호 639125, Clontech), 1.5M 베타인(카탈로그 번호, B0300, Sigma Aldrich), 3.2U Klentaq DNA 폴리머라제(카탈로그 번호 1001, AB Peptides), 1.6U Pfu DNA 폴리머라제(카탈로그 번호 600160, Stratagene, La Jolla, CA, USA) 및 400μM 각각 프라이머와 배합하여 최종 반응 체적을 50μL로 하였다(PA 절편의 경우: 전방: 5'-CGTCTCNGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAAT(서열번호 3) 및 역방: 5'-CGTCTCNTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGA(서열번호 4), PB1 절편의 경우: 전방: 5'-CGTCTCNGGGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAA(서열번호 5) 및 역방: 5'-CGTCTCNTATTAGTAGGAACAAGGCATTTTTTCATG(서열번호 6), PB2 절편의 경우: 전방: 5'-CGTCTCNGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAA(서열번호 7) 및 역방: 5'-CGTCTCNTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC(서열번호 8)). 반응은 94℃에서 2분 동안, 이어서, 94℃에서 15초 동안의 40사이클, 68℃-0.4℃/사이클('터치다운(touchdown)' PCR) 20초 동안, 그리고 68℃에서 3.5분 동안, 이어서, 68℃에서 7분 동안 인큐베이션하였다. PCR 생성물을 QIAquick 96 PCR 정제 키트(카탈로그 번호 28181, Qiagen)를 사용하여 정제하였고, 분취량을 품질에 대해 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 정제된 PCR 생성물의 순도 및 양은 분광 광도계(NanoDrop, 8000 v.1.1, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 평가하였다. 정제된 DNA는 사내에서 서열분석하거나 PB2, PB1 및 PA 분절의 서열분석을 위해 Beckman-Coulter (Agencourt® Biosciences, Danvers, MA, USA)로 보냈다.
Mutation Surveyor 소프트웨어(SoftGenetics, State College, PA)를 사용하여 서열 추적을 정렬하고 해석하였다. 아미노산 치환은 서열을 내성 선별에 사용된 대응 바이러스(즉, A/Wisconsin/67/2005)와 비교함으로써 검출되었다.
실시예 8: 역 유전학을 위한 플라스미드의 작제
바이러스 게놈 분절을 암호화하는 플라스미드 작제물을 하기와 같이 생성하였다. 인플루엔자 A/푸에르토 리코/8/34 바이러스 RNA 단리 및 cDNA 합성을 수행하였다. cDNA는 말단 BsmB1 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고를 사용하여 증폭시켰고, 증폭된 생성물을 TOPO® XL PCR Cloning Kit(카탈로그 번호 K4700 10, Invitrogen)를 사용하여 pCR-XL-TOPO 셔틀 벡터에 클로닝하였다. cDNA-함유 TOPO 벡터를 BsmB1으로 분해하였고 RNA 폴리머라제 I-구동된 발현 벡터 pHH21에 삽입물을 라이게이션하였다. cDNA 단편의 적절한 통합과 원치 않는 돌연변이의 부재를 확인하기 위해 플라스미드를 서열분석하였다.
내성 선택 실험으로부터 동정된 모 균주로부터의 아미노산 변화를 Quick Change™ XL 부위-지시된 돌연변이유발 키트(카탈로그 번호 200518, Agilent Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 상응하는 pHH21-A/Puerto Rico/8/34 플라스미드에 클로닝하였다. 간략하게, 10ng의 야생형 플라스미드 및 150ng의 각각의 전방 및 역방 돌연변이-함유 프라이머를 10x 반응 완충액 5μL, dNTP 혼합물 1μL, QuikSolution 3μL 및 PfuUltra HF DNA 폴리머라제 2.5U와 배합하여 PCR 등급수 50μL로 하였고, PCR에 의해 돌연변이를 도입하였다. 열 순환은 95℃에서 1 분 동안의 초기 변성, 95℃에서 50초 동안, 60℃에서 50초, 68℃에서 5분 동안의 18 사이클 및 68℃에서의 7분 동안의 최종 연장으로 수행하였다. 나머지 야생형 플라스미드를 DpnI 제한 효소로 분해하였고, 돌연변이-함유 플라스미드를 이. 콜라이로 형질전환시키고, 밤새 콜로니 스크리닝하였고, QIAGEN Plasmid Plus 미디 키트(카탈로그 번호 12943, Qiagen)를 사용하여 플라스미드를 단리하였다. 플라스미드 내로의 점 돌연변이의 적절한 결합은 서열분석에 의해 확인되었다.
실시예 9: 재조합 바이러스의 생성
돌연변이를 조사하기 위해, pHH21 돌연변이-함유 플라스미드 1.25μg, 각각 7종의 나머지 PHH21 야생형 플라스미드, 및 4개의 RNP 복합체 발현 플라스미드를 함유하는 플라스미드 혼합물로의 293T 세포(HEK 293T/17, CRL-11268, ATCC)의 일시적 형질감염에 의해 재조합 바이러스를 생성시켰다. 일시적인 형질감염은 TransIT-LT1 형질감염 시약(카탈로그 번호 MIR 2300, MirusBio, Madison, WI, USA)으로 수행하였다. 간략하게, 플라스미드 혼합물 및 형질감염 시약의 1:2 혼합물(w/v)을 1.5mL의 OPTI-MEM I 배지(카탈로그 번호 11058, Invitrogen)에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 15mL OPTI-MEM I 배지에서 50% 컨플루언시(confluency)로 293T 세포(293T 세포를 10% FBS이 보충된 15mL의 cDMEM에 유지하였고, 형질감염 혼합물을 첨가하기 전에 OPTI-MEM I 배지로 2회 세척하였다)를 함유하는 T-75 플라스크에 형질감염 혼합물을 첨가하였다. 세포를 포화 습도에서 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 상청액을 수거하였고, 세포 잔해물을 제거하기 위해 650xg에서 10분 동안 원심분리하였고, 낮은 MOI로 감염된 MDCK 세포에서 바이러스를 추가로 확장시킨 후 바이러스 스톡을 수거하여 적정하였다.
다른 실시형태들
본 발명은 이의 상세한 설명과 관련하여 기술되었지만, 상술한 설명은 예시하기 위한 것으로 의도되고, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아님이 이해되어야만 한다. 다른 양상들, 이점들 및 변경들은 하기 청구범위의 범위 내이다.
SEQUENCE LISTING <110> VERTEX PHARMACEUTICALS INCORPORATED <120> INFLUENZA A VIRUS VARIANTS <130> 223306/14-104PRV1/355615 <150> US 62/058,961 <151> 2014-10-02 <160> 8 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 759 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asn Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Thr 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Met Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Ile Thr Asn Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Ile Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Arg Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Ile Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu 180 185 190 Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr 210 215 220 Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp 225 230 235 240 Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Val Asp 245 250 255 Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Ala Val 260 265 270 Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln 275 280 285 Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Arg Gln Asn Pro Thr Glu 290 295 300 Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser 325 330 335 Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu 340 345 350 Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Val Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Ile Glu Met Ser Met Arg Gly Val Arg Ile 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Ile Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Ile 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asn Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu 565 570 575 Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Lys Ala Ile Arg Gly Gln Tyr 580 585 590 Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly 595 600 605 Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala 610 615 620 Pro Pro Lys Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Phe Thr Val Asn Val 625 630 635 640 Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe 645 650 655 Asn Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala 660 665 670 Gly Thr Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser 675 680 685 Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg Tyr 690 695 700 Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Asn Leu Ala Lys Gly Glu 705 710 715 720 Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys 725 730 735 Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys 740 745 750 Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn 755 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <400> 2 agcraaagca gg 12 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <400> 3 cgtctcnggg agcgaaagca ggtactgatc caaaat 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <400> 4 cgtctcntat tagtagaaac aaggtacttt tttgga 36 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <400> 5 cgtctcnggg agcgaaagca ggcaaaccat ttgaa 35 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <400> 6 cgtctcntat tagtaggaac aaggcatttt ttcatg 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <400> 7 cgtctcnggg agcgaaagca ggtcaattat attcaa 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub-Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <400> 8 cgtctcntat tagtagaaac aaggtcgttt ttaaac 36

Claims (62)

  1. 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 유전자 내에 돌연변이를 포함하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 유사체, 또는 이의 생물학적 활성 단편으로서, 상기 돌연변이는 야생형 인플루엔자 A 바이러스의 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기들에 상응하는 적어도 1개의 아미노산 치환을 초래하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드, 이의 생물학적 활성 유사체, 또는 이의 생물학적 활성 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 306에 상응하는 뉴클레오타이드가 Q를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 306에 상응하는 뉴클레오타이드가 H를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 306에 상응하는 뉴클레오타이드가 L을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 323에 상응하는 뉴클레오타이드가 F를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 323에 상응하는 뉴클레오타이드가 S를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 323에 상응하는 뉴클레오타이드가 Y를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 324에 상응하는 뉴클레오타이드가 S를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 324에 상응하는 뉴클레오타이드가 G를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 324에 상응하는 뉴클레오타이드가 I를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 324에 상응하는 뉴클레오타이드가 N을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 324에 상응하는 뉴클레오타이드가 R을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 337에 상응하는 뉴클레오타이드가 S를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 337에 상응하는 뉴클레오타이드가 L을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 337에 상응하는 뉴클레오타이드가 P를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 363에 상응하는 뉴클레오타이드가 F를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 363에 상응하는 뉴클레오타이드가 L을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 376에 상응하는 뉴클레오타이드가 K를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 376에 상응하는 뉴클레오타이드가 N을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 376에 상응하는 뉴클레오타이드가 Q를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 376에 상응하는 뉴클레오타이드가 R을 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 404에 상응하는 뉴클레오타이드가 F를 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 404에 상응하는 뉴클레오타이드가 Y를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 431에 상응하는 뉴클레오타이드가 M을 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 431에 상응하는 뉴클레오타이드가 I를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 431에 상응하는 뉴클레오타이드가 T를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 510에 상응하는 뉴클레오타이드가 N을 암호화하지 않는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 510에 상응하는 뉴클레오타이드가 T를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  29. 제1항에 있어서, 상기 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 510에 상응하는 뉴클레오타이드가 K를 암호화하는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  30. 제1항에 있어서, 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 2개의 아미노산들에 상응하는 뉴클레오타이드들이 돌연변이되어, 상기 뉴클레오타이드들은, 상응하는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산과 상이한 아미노산을 암호화하게 되는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  31. 제1항에 있어서, 아미노산 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 3개의 아미노산들에 상응하는 뉴클레오타이드들이 돌연변이되어, 상기 뉴클레오타이드들은, 상응하는 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산과 상이한 아미노산을 암호화하게 되는, 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드.
  32. 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한, 아미노산 서열을 포함하는 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제.
  33. 제32항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 생물학적 활성 유사체를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제.
  34. 제32항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 생물학적 활성 단편을 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제.
  35. 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한, 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 인식하는, 항-인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 항체.
  36. 엄격한 조건 하에 제1항의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머.
  37. 제1항의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 링크된 제1항의 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는, 발현 시스템.
  39. 제38항의 벡터를 이용하여 형질감염되거나, 형질전환되거나, 또는 형질도입된 숙주 세포.
  40. 제37항에 있어서, mRNA 디스플레이 시스템인, 발현 시스템.
  41. 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 인플루엔자 A 바이러스 변이체로서, 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 적어도 1개의 아미노산이 돌연변이되어 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 아미노산과 상이한 아미노산을 암호화하게 되는, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 인플루엔자 A 바이러스 변이체.
  42. a) 인플루엔자 A 바이러스 감염된 환자로부터 생물학적 샘플을 수집하는 단계; 및
    b) 상기 샘플이, 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 각각의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 암호화하는 핵산을 포함하는지를 평가하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염의 폴리머라제 억제제에 대한 약물 내성 또는 민감성을 평가하는 방법.
  43. a) 제42항의 방법에 따른 환자의 폴리머라제 억제제에 대한 약물 내성 또는 민감성을 평가하는 단계; 및
    b) a)에서 평가된 약물 내성 또는 민감성에 기초하여 상기 환자에 대해 치료 용법을 최적화하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염용 치료를 안내하는 방법.
  44. a) 제41항의 인플루엔자 A 바이러스 변이체로 감염된 샘플을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 샘플 중의 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 활성의 억제시 상기 후보 화합물의 능력을 검정하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 확인하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 활성이 복제인, 방법.
  46. a) 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 레플리콘(replicon) RNA를 제공하는 단계; 및
    b) 후보 화합물이 a)의 상기 레플리콘 RNA의 복제를 억제하는지를 측정하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 후보 화합물을 확인하는 방법.
  47. a) 제32항의 단리된 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 및 폴리머라제 기질을 제공하는 단계(여기서, 상기 폴리머라제 및 상기 기질은 세포-기반 시스템 내에 또는 세포-불포함 시스템 내에 존재한다);
    b) 상기 기질의 존재 하에 상기 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제를 상기 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제 활성이 감소되는지를 측정하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 확인하는 방법.
  48. a) 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 지표(indicator)를 암호화하는 지표 유전자를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계;
    b) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 상기 후보 화합물의 존재 하에 그리고 상기 후보 화합물의 부재 하에 지표를 측정하는 단계
    를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 치료하기 위한 후보 화합물을 평가하는 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따라 확인된 화합물의 약제학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 방법.
  50. 기기-판독가능한 데이터로 암호화된 데이터 보관 재료를 포함하는 기기-판독가능한 데이터 보관 매체로서, 상기 기기-판독가능한 데이터는 인플루엔자 A 바이러스 변이체 또는 생물학적 샘플과 관련된 적어도 2개의 특성들에 관한 지수 값들을 포함하고; 여기서, 상기 특성들은:
    a) 폴리머라제 억제제에 대해 감소된 민감성을 위한 내성을 나타내는 능력;
    b) 306, 323, 324, 337, 363, 376, 404, 431 및 510로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에서의 아미노산이 야생형 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 상응하는 위치에서의 아미노산과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제;
    c) 환자의 이환율 또는 회복 가능성; 및
    d) 상기 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 변경된 복제 능력(증가되거나 감소됨)
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 기기-판독가능한 데이터 보관 매체.
  51. a) 환자로부터 혈장 샘플을 수득하는 단계; 및
    b) 상기 혈장 샘플 유래의 적어도 2개의 인플루엔자 A 바이러스 비리온(virion)으로부터 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 단계
    를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스-감염된 환자에서의 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 프로파일을 수득하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 적어도 20개의 인플루엔자 A 바이러스 비리온이 확인되는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 적어도 50개의 인플루엔자 A 바이러스 비리온이 확인되는, 방법.
  54. 제51항에 있어서, 적어도 100개의 인플루엔자 A 바이러스 비리온이 확인되는, 방법.
  55. 제51항에 있어서, 적어도 200개의 인플루엔자 A 바이러스 비리온이 확인되는, 방법.
  56. 제51항에 있어서, 적어도 500개의 인플루엔자 A 바이러스 비리온이 확인되는, 방법.
  57. 제51항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 폴리머라제의 뉴클레오타이드 서열이 제1항의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 포함하는, 방법.
  58. 제51항에 있어서, 상기 환자가 폴리머라제 억제제로 치료된, 방법.
  59. 제51항에 있어서, 적어도 2개의 혈장 샘플이 적어도 2개의 상이한 시점에서 상기 환자로부터 수득되는, 방법.
  60. 생물학적 샘플 중의 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출함을 포함하는, 생물학적 샘플 중의 인플루엔자 A 바이러스 변이체의 존재를 검출하는 방법.
  61. 제35항의 항체를 포함하는 진단학적 키트.
  62. 제36항의 뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단학적 키트.
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