KR20170049565A - 핵산의 합성을 위한 변성 뉴클레오티드, 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 합성 핵산 시퀀스 또는 유전자의 제조를 위한 이들의 용도 - Google Patents

핵산의 합성을 위한 변성 뉴클레오티드, 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 합성 핵산 시퀀스 또는 유전자의 제조를 위한 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

"천연" 질소성 염기 또는 천연 질소성 염기 유사체, 리보오스 또는 디옥시리보오스 탄수화물, 및 적어도 하나의 포스페이트기를 포함하는, 긴 체인 핵산의 효소적 합성을 위하여 의도된 변성 뉴클레오티드로, 상기 변성 뉴클레오티드가, 천연 질소성 염기 또는 이의 유사체에 의하거나, 및/또는 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자의 위치 3'의 산소에 의하여 파생되는, 상기 뉴클레오티드의 중합을 차단하고 및/또는 핵산 합성 동안 단백질과 같은 다른 분자와 상기 뉴클레오티드의 상호작용을 가능하게 하는, 변성 기(modifier group)라고 불리는, 적어도 하나의 관능 말단기를 포함하는 적어도 하나의 R 기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드.

Description

핵산의 합성을 위한 변성 뉴클레오티드, 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 합성 핵산 시퀀스 또는 유전자의 제조를 위한 이들의 용도{MODIFIED NUCLEOTIDES FOR SYNTHESIS OF NUCLEIC ACIDS, A KIT CONTAINING SUCH NUCLEOTIDES AND THEIR USE FOR THE PRODUCTION OF SYNTHETIC NUCLEIC ACID SEQUENCES OR GENES}
본 발명은 생물학적 관심의 관능화된 공중합체(functionalized copolymer)의 합성의 분야에 속한다. 이는 특히 핵산, 특히 매우 긴 핵산의 합성에 요구되는 뉴클레오티드, 이러한 뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 합성 핵산 시퀀스 또는 유전자의 제조를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
현재까지, 시험관 내 핵산의 합성의 두 가지 주요 범주가 존재한다: 화학적 합성 및 효소적 합성.
가장 흔한 시험관 내 핵산 화학적 합성법은 문헌 Adams et al. (1983, J. Amer. Chem. Soc. 105:661) 및 Froehler et al. (1983, Tetrahedron Lett. 24:3171)에 기술된 포스포르아미다이트에 의한 중합법이다. 이 방법에 있어서, 첨가되어야 할 각 뉴클레오티드는 5'-OH기 상에서 보호되어 동일한 형태의 여러 뉴클레오티드의 미제어된 중합을 방지하도록 한다. 일반적으로, 5'-OH기의 보호는 트리틸기(trityl group)로 수행된다. 강력한 시약의 사용으로 인한 임의의 분해를 방지하기 위하여, 뉴클레오티드에 의하여 파생된 염기들이 또한 보호될 수 있다. 일반적으로, 사용된 보호는 이소부틸기를 포함한다 (문헌 Reddy et al. 1997, Nucleosides & Nucleotides 16:1589). 신규 뉴클레오티드의 각 포함 이후, 후속하는 중합 단계에서 이를 사용가능하게 만들 목적으로 체인의 마지막 뉴클레오티드의 5'-OH기가 탈보호 반응을 진행한다. 핵산 그 자체를 구성하는 뉴클레오티드에 의해 파생된 질소성 염기는 단지 완전한 중합이 마감된 이후에 탈보호된다.
이러한 화학적 반응법은 고가이고 포함되는 시약의 속성으로 인하여 사용하기 위험한 것으로 입증되었다. 게다가, 이들은 긴 핵산 단편 (약 백개 이상의 뉴클레오티드의 단편)의 합성을 위하여는 비효율적이다.
특히 매우 긴 단편을 높은 수율로 제조하기 위한 핵산 합성법 및 또한 DNA 플라스미드 등과 같이 이미 존재하는 유전 요소(genetic element)와 호환되는 방법을 개발할 목적으로, 심지어 주형 가닥(template strand)의 부재 중에서도 뉴클레오티드들 간의 커플링 반응을 실행하기 위하여 효소적 촉매를 사용하는 합성 기술이 개발되었다.
이러한 효소적 합성법 중의 일부에 있어서, 중합을 가능하게 하는 효소가 직접적으로 천연 뉴클레오티드에 첨가된다 (문헌 Deng et al. 1983, Meth. Enzymol. 100:96). 프라이머로 알려진 초기 핵산 단편으로부터 출발하여, 중합 효소 및 또한 하나의 그리고 동일한 형태의 뉴클레오티드들이 첨가된다. 계속해서 중합 반응이 개시되고, 상기 중합이 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 중단될 때까지 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond)을 생성하는 이러한 단계의 반복에 의하여 핵산이 순차적으로 성장한다.
천연 뉴클레오티드 (즉 미변성되고 미보호된 뉴클레오티드)의 사용은 미제어된 중합을 야기하여 매우 불균질한 핵산 분자의 혼합물의 결과를 가져온다. 이는 최초의 첨가 이후 하나의 그리고 동일한 형태의 여러 뉴클레오티드의 첨가를 방지하지 못하기 때문이다. 실제로, 이러한 합성법은 소정의 시퀀스를 갖는 핵산 단편의 합성을 위하여는 사용불가능한 것으로 입증되었다.
보호된 뉴클레오티드의 사용은, 특정한 정도까지, 이러한 미제어된 중합 현상을 해결하는 것을 가능하게 한다. 보호된 뉴클레오티드는 후속하는 포스포디에스테르 결합의 생성을 원하는 정도까지 전체적으로 또는 부분적으로 방지하는 것에 의하여 합성을 중단시키는 것을 가능하게 한다.
뉴클레오티드는 핵산 합성을 위하여 사용되는 "단량체(monomer)"이다. 이들의 화학적 특성 및 또한 이들의 반응하거나 반응하지 않는 능력은 소정의 반응이 정확하게 일어나는 것을 보증한다. 뉴클레오티드를 하나씩 소정의 순서로 중합하는 것을 가능하게 하여 소정의 시퀀스를 포함하는 핵산을 합성이 가능하게 되도록 하는 것이 중요하다. 이러한 중합은 하나씩 뉴클레오티드를 엄격하게 부착되어야 하는 순서로 첨가하는 것과 등가이다. 동일한 질소성 염기를 포함하고 동시에 도입된 여러 뉴클레오티드가 체인 중에 반응되지 않도록 주의를 기울여 올리고머성의 체인의 미제어된 성장 및 그 결과로서 오류가 있는 핵산 시퀀스의 생산을 야기하지 않도록 하는 것이 특히 필요하다.
천연 뉴클레오티드에 비하여 이들이 핵산 합성을 위하여 사용되는 경우에 이들에 특정한 이점을 부여하는 특정한 구조적 변경을 포함하는 변성 뉴클레오티드가 존재한다. 이들은 일반적으로 세포 중에 천연적으로 존재하는 뉴클레오티드의 화학적 또는 효소적 변성에 의하여 수득된다. 일부 변성 뉴클레오티드는 이들이 다른 반응 동안 보존되어야 할 화학적 관능(chemical function)의 변경을 억제하는 화학기(chemical group)를 포함하기 때문에 보호되어야 한다고 한다. 보호기는 뉴클레오티드 분자의 여러 자리에 위치될 수 있다.
보호된 뉴클레오티드의 하나의 특정한 부류는 중합-반응-종결 관능을 갖는다. 이러한 "체인-종결(chain-terminating)" 뉴클레오티드의 역할은 반응 매질 내로 도입된 뉴클레오티드의 과도한 그리고 원치않는 중합을 방지하는 것으로 이루어진다. 종결자 뉴클레오티드(terminator nucleotide)가 핵산 분자 내로 포함되는 경우, 이는 다른 뉴클레오티드의 후속의 중합을 지연시킨다. 따라서, 연장 단계 동안에 단일 뉴클레오티드가 각 핵산 분자에 첨가될 수 있다. 심지어 합성되어야 할 핵산 단편을 이루는 여러 뉴클레오티드가 순차적으로 도입되는 경우, 원치않는 반복 현상을 방지하기 위하여 "종결자" 뉴클레오티드를 사용할 것이 필요하다.
"종결자" 뉴클레오티드의 사용은 화학적이든 효소적이든 간에 핵산 합성법의 신뢰성 및 재현성을 보증한다. 이들은 주어진 방법의 합성 성능 수준에 큰 영향을 줄 수 있다.
핵산의 화학적 합성을 위하여 사용되는 보호된 뉴클레오티드는, 5'-OH 위치 내에, DMT (4,4'-디메톡시트리틸)기에의 공유적 결합에 의한 보호를, 그리고, 3'-OH 위치 내에, 뉴클레오티드의 다른 하나와의 중합 반응을 위한 촉매로서 작용하는 포스포르아미다이트기를 포함한다. DMT 및 포스포르아미다이트기를 포함하는 이러한 뉴클레오티드는 보호된 포스포르아미다이트 뉴클레오티드라고 불린다. 미제어된 중합에 대한 보호는 5'-OH를 보호하는 DMT기에 의해 제공된다. 화학적 핵산 합성 동안, 탈트리틸화(detritylation)라고 불리는 제1 탈보호 단계가 일어나 DMT기를 제거하고 삽입되어야 할 뉴클레오티드와 반응하는 데 사용될 수 있는 5'-OH기를 수득하도록 한다. 모든 경우들에서 다음 뉴클레오티드의 첨가를 허용하도록 가장 효율적인 탈보호 반응을 가능하게 하는 것이 특히 중요하다.
보호된 포스포르아미다이트 뉴클레오티드는 핵산의 화학적 합성 동안에 배타적으로 사용된다. 이들 "종결자" 관능은 실제로 5'-OH에 결합된 DMT기에 의해 제공된다. 화학적 합성이 3'로부터 5'의 방향 내에서 일어나기 때문에, 5'-OH를 보호하는 DMT기의 존재는 다음 탈보호 단계까지 임의의 과도한 중합을 방지하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 보호된 포스포르아미다이트 뉴클레오티드는 효소적 합성법을 위하여는 적절하지 않다.
일부 "종결자" 뉴클레오티드가 또한 "2차-생성(second-generation)" 시퀀싱법을 위하여 개발되었다. 그러나, 핵산 합성을 위하여 완전히 적절하지 않다는 것에 더하여, 시퀀싱을 위하여 사용된 종결자 뉴클레오티드는 특정한 수의 완전히 수용불가능한 제한점들을 갖는다.
주요한 제한은 연장 효소에 의하여 사용되어야 할 이들의 능력이다. 이는 시퀀싱을 위하여 종결자 뉴클레오티드에 결합된 형광 표지가 상당한 크기를 갖기 때문이다. 그러나, 연장 효소가 그들 활성 자리(active site) 내에 극히 작은 크기의 공간을 갖고 따라서, 이들을 중합하기 위하여, 컨쥬게이트된 방향족 환를 포함하는 기 등과 같은 형광을 부여하는 기를 감싸는 종결자 뉴클레오티드를 수용할 수 있는 경우가 거의 없다.
현대 DNA 시퀀싱 기술은 주형 가닥, 시퀀스된 가닥 및 연장을 수행하는 가닥 간의 상보성 상호작용에 기초하고 있다. 일반적으로, 시퀀싱을 위하여 사용되는 변성 뉴클레오티드는 그들의 상보성 뉴클레오티드와의 무손상의 페어링의 특성을 가져야 한다. 변성 뉴클레오티드는 이들의 사용을 위하여 필수적인 이들의 상호작용의 특성을 보존하여야 한다. 그러나, 시퀀싱을 위한 변성 뉴클레오티드를 구성하는 질소성 염기는 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실 및 시토신 등과 같은 천연의 질소성 염기와 유사하고, 따라서 동일한 화학적 구조를 갖지 않고: 일부 원자들이 다른 것으로 치환되고 일부 기들이 첨가되거나 삭제된다. 이러한 비천연의 질소성 염기는, 예를 들어, 살아 있는 유기체에 의해 인식되지 않는 것과 같은 많은 단점을 가질 수 있다.
일단 포함되면, 종결자 뉴클레오티드가 탈보호되어 다음 뉴클레오티드의 첨가를 허용하도록 한다. 탈보호 단계는 종결자 관능의 원인이 되는 기를 제거하는 것을 가능하게 하는 물리적 또는 화학적 수단을 포함한다. 변성 뉴클레오티드와 연관되는 다른 관능기는 유사한 탈보호 단계 동안 탈락된다. 따라서 다음 뉴클레오티드의 결정으로 이동하도록 하는 것을 가능하게 하도록 여러 시퀀싱 공정 동안 여러 탈보호 단계가 일반적으로 요구된다. 이들 여러 탈보호 단계들은 반응 매질 중에 존재하는 여러 화학종들의 분해 및 특히 핵산의 분해를 촉진하는 강력한 시약 또는 과도한 물리적 조건의 사용을 누적시키고 증가시킨다. 게다가, 다수의 탈보호 단계들은 방법의 신속성 및 그의 성능 수준을 상당하게 감소시킨다.
시퀀싱을 위한 변성 뉴클레오티드의 사용 동안에 직면하게 되는 또 다른 주요한 문제는 탈보호 단계 이후의 흔적(scar)의 출현이다. 관능기와 뉴클레오티드 간의 연결로 작용하는 여러 화학적 구조가 탈보호 단계 동안 파괴될 수 있다. 그러나, 이러한 파괴는 모든 화학적 결합 구조를 분리시키는 것을 가능하게 하지는 않는다. 따라서, 여러 탈보호 단계에도 불구하고, 이러한 구조들의 다소 많은 부분들이 뉴클레오티드에 부착된 채로 잔류한다. 이들 잔기들은 시퀀싱 과정에 대하여 그리고 일반적으로 핵산의 임의의 사용 또는 변성에 매우 해로운 영향을 준다.
어떤 핵산의 구조가 보류되던 간에, 현존하는 변성 뉴클레오티드는 효소적 합성법의 기대를 만족시키는 것이 가능하지 않다. 연장 효소에 의한 이들의 열악한 사용, 여러 관능기들의 포지셔닝(positioning), 변성 염기성 염기의 체계적인 사용, 상보성 뉴클레오티드와의 상호작용을 보존하여야 하는 의무, 여러 탈보호 단계 및 잔류 흔적의 존재들이 효소적 핵산 합성을 위한 이들 뉴클레오티드의 사용을 방해한다.
따라서, 현재까지는, 핵산의 효소적 합성, 특히 매우 긴 핵산 단편의 효소적 합성에 호환될 수 있는 보호된 뉴클레오티드를 제안하는 만족스러운 기술적인 해결책이 없었다.
본 발명의 제1 목적은 효소적 핵산 합성에 적합한 변성 뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이들에 핵산 합성 과정 동안 호환될 수 있는 이들의 사용을 가능하게 만드는 여러 관능기들로 변성된 천연 뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특히 본 출원인의 미공개된 특허출원인 FR 14-53455에 기술된 공정에 따라 매우 긴 핵산 즉 적어도 수백개 또는 수천개의 뉴클레오티드의 핵산을 합성하는 것을 가능하게 하는 변성 뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
이러한 효과를 위하여, 본 발명은 "천연" 질소성 염기 또는 천연 질소성 염기 유사체, 리보오스 또는 디옥시리보오스 탄수화물 및 적어도 하나의 포스페이트기를 포함하는 긴-체인 핵산과 같은 핵산의 효소적 합성을 위해 의도된 변성 뉴클레오티드로서, 상기 뉴클레오티드가 변성 기(modified group)로 불리는 적어도 하나의 R 또는 R' 기로서:
- 상기 천연 질소성 염기 또는 유사체에 의하거나,
- 및/또는 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자의 위치 3' 내 산소에 의하여 파생되어, 상기 뉴클레오티드의 중합을 차단 (변성 기는 이후 보호기가 됨)하고/하거나 핵산 합성 동안 뉴클레오티드가 아닌 단백질과 같은 다른 분자와 상기 뉴클레오티드의 상호작용을 가능하게 하는 변성 기(modifier group)로 불리는 적어도 하나의 R 또는 R'기를 포함하며, R은 적어도 하나의 관능 말단기(functional end group) (이는 또한 효과기(effector group)이라고 불릴 수 있음)를 포함하는 것을 특징으로 하는 변성 뉴클레오티드를 제공한다.
특히, 변성 기는 유리하게도, 컨쥬게이트된 방향족 환(aromatic ring)과 같은 큰 기(large group)가 아니어서, 특히 반응 사이트로의 효소의 접근을 허용한다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드는 포스페이트기(들)가 유리된, 즉 미변성된, 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트일 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드는 하기 식 (I), (III) 및 (IV) 중의 하나의 형태이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
상기에서:
(PP)PO는 모노포스페이트기, 디포스페이트기 또는 트리포스페이트기를 나타내고,
(OH)는 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자의 가능성을 기술하고,
T는 수소 또는 -NH2, -N3, -(C=O)H, n이 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 12인 -CnH2n+1, -트리메틸실릴, -포스페이트, -SO3, n이 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 12인 -(C=O)OCnH2n +1, n이 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 12인 -(C=O)SCnH2n +1, -니트로벤젠, -벤질, -할로벤질, -아미드, -카보네이트, -벤조일, -퍼옥실, -니트릴, -티올, -이미드, -카바메이트, -시아네이트, -알킨, -페닐, -할로페닐, -피콜릴으로부터 선택되는 개열가능한 라디칼(cleavable radical)이고,
M은, 존재하거나 미존재하는, 알킬, 알케닐, 알킨, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 아실, 알킬옥시, 알킬아미노, 알콕시아미노, 아미도, 알킬이미도, 알케닐이미도, 아릴이미도, 플루오로알킬, 알킬포스페이트, 알킬티오, 티오아실, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 알킬설피닐, 알킬암모늄, 알킬설포늄, 알킬실릴, 알킬카르보닐, 알킬카르바닐, 알킬카바모일 또는 알킬하이드록실아미노로부터 선택되는, Q에 및 Z에 공유적으로 결합되는 기이고,
Z는 -O-, -S-, =SH-, =S=, ≡S-, -SiH2-, =SiH-, =Si=, ≡Si-, -Se-, =SeH-, ≡Se-, =Se=, -SeH2-, -PH-, =P-, =PH=, ≡P=, ≡PH-, -PH3-, -AsH-, =As-, =AsH=, ≡As=, ≡AsH-, -ASH3-, 아민, 에스테르, 실릴, 알킬, 벤질, 니트로벤질, 아미드, 카보네이트, 벤조일, 퍼옥실, 니트릴, 티올, 이미드, 카바메이트, 시아네이트, 하이드록실아민, 설폭사이드, 설포네이트, 티오설피네이트, 티오에스테르, 아실할라이드, 하이포이오딜, 알킨, 할로페닐, 할로벤질, 피코일, 디올 또는 디설파이드로부터 선택되거나 M이 -니트로벤질-, -니트로톨릴-, -니트로자일릴-, -니트로나프틸- 또는 -니트로페닐-인 경우 -CH2 또는 -NH-로부터 선택되는 개열가능한 기이고,
Q는 비오틴, 단백질, 정의된 시퀀스의 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 항원, 호르몬, 신경전달물질(neurotransmitter), 디곡신과 같은 글리코시드, 특히 글루타치온 등과 같이 티올 관능을 포함하는 황-함유 라디칼 또는 카테콜과 같은 두자리 리간드(bidentate ligand)로부터 선택되는 것으로, R 또는 R'기의 말단 관능기 또는 효과기이고,
R 및 R'는, 독립적이거나 또는 동시적일 수 있고, R 및 R'가 동시적으로 제공되는 경우:
Z기는 동일하거나 서로 다를 수 있고,
M기는 동일하거나 서로 다를 수 있고,
Q기는 동일하거나 서로 다를 수 있으며,
"Base(염기)"는, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌 또는 우라실에서 선택되는 "천연" 질소성 염기 또는 "천연" 질소성 염기 유사체를 나타내고, 이때, R'가 존재하고 Q가 비오틴을 포함하는 경우 티민은 제외된다.
바람직하게는, T는, T가 수소가 아닌 경우, 및 또한 R 및 R'는, 핵산 합성 과정의 연장 단계의 체인 종결(chain termination)을 제공하는 기를 구성한다.
용어 "개열가능한 라디칼 또는 기(cleavable radical or group)"는 리보오스 분자의 위치 3' 또는 2' 내의 또는 디옥시리보오스 분자의 위치 3' 내의 산소에 또는 질소성 염기의 원자에 공유적으로 결합되고, 상기 결합이 화학적으로 또는 광화학적으로 파괴되도록 하는 원인이 되는 라디칼 또는 기를 의미하는 것으로 의도된다. 유리하게도, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 분자의 T기 및 Z기의 개열가능한 결합 전부의 파괴는 전적으로 그리고 동시적으로, 즉 동일한 "탈보호" 단계 동안에, 특히 하나의 그리고 동일한 조건의 적용에 의하여 또는 하나의 그리고 동일한 시약의 결합된 작용에 의하여 수행된다.
이러한 변성 기의 제거(deletion)는 바람직하게는 전체적이어서, 어떠한 변성 기도 없는 뉴클레오티드, 즉 (질소성 염기의 구조를 제외하고는) 천연 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드의 생성을 야기한다.
전술된 바와 같이, R 및 R' 기는 유리하게는 핵산 합성 공정의 연장 단계의 체인 종결을 제공하는 기들이다. 이들 R 및 R' 기는, R 및 R'의 자유 말단(free end)에 위치되는 관능 기 Q에 의해, 핵산이 아닌, 다른 분자, 예를 들어, 지지체 상에 존재하는 분자에의 부착하는 특성을 가질 수 있다.
이는, 핵산 합성 공정 동안, 예를 들어, 전술된 FR　14-53455에서 기술된 공정 중에서, 몇몇 단계가 사용되는 변성 뉴클레오티드가 고체 지지체와 상호작용할 수 있음을 가정하기 때문이다. 이러한 고체 지지체는, 그들 표면에, 본 뉴클레오티드의 변성 기와 호환될 수 있는 분자, 단백질 또는 화학적 관능들을 포함한다. 계속해서 변성 뉴클레오티드의 이러한 관능성(functionality)은 핵산 합성 공정이 정확하게 일어나도록 하기 위해 필수적이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 변성 뉴클레오티드는 이들이 고체 지지체와 결합되도록 하는 것을 허용하는 기를 포함하여, 예를 들어, 고체 지지체의 표면에 존재하는 분자와 특히 10-6　mol/ℓ 미만의, 매우 낮은 해리 상수를 갖는 조합 착체(combination complex)를 형성하는 것에 의하여 정제될 수 있도록 한다. 탈보호 단계에 후속하여, 이러한 조합 기능을 제공하는 기가 계속해서 파괴되어 뉴클레오티드와 고체 지지체 간의 상호작용을 제거하도록 할 수 있다. 이 경우에 있어서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드는 이중 이점(double advantage), 즉 정제를 허용하는 기의 존재 및 하나의 그리고 동일한 뉴클레오티드 상의 다른 변성 기와 동시적으로 이 동일한 기를 파괴하는 능력을 갖는다.
바람직하게는, 변성 기 R은 질소성 염기에 의해 파생되고 하기 구조 (V) 중의 하나를 형성한다:
Figure pct00004
상기 구조에서:
"sugar(당)"는 상기 질소성 염기와 뉴클레오티드 분자의 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자 간의 결합을 나타내고,
Z1 및 Z2는 동일하거나 서로 다른 개열가능한 Z기임.
Z기, M기 및 Q기는 전술된 의미를 가진다.
본 발명의 이러한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드는 대개는 왓슨-크릭 페어링 메카니즘(Watson-Crick pairing mechanism)에 포함되는 질소성 염기에 의해 파생되는, 즉 대개는 상보성 뉴클레오티드와의 페어링에 포함되는 아민 관능의 질소 원자에 의해 파생되는 기로 변성된다. 질소성 염기를 구성하는 원자에의 여러 변성 기의 부착은 항상 공유 형태의 결합을 통하여 개열가능한 형태의 Z기에 의해 실시된다.
아데닌 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 바람직한 일 구현예는 1차 아민기 6-NH2 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 Va).
티민 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 다른 바람직한 구현예는 2차 아민기 3-NH 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 Vt).
시토신 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 다른 바람직한 구현예는 1차 아민기 4-NH2 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 Vc).
우라실 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 다른 바람직한 구현예는 2차 아민기 3-NH 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 Vu).
구아닌 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 다른 바람직한 구현예는 개열가능한 기의 도움으로 하나가 2차 1-NH이고 다른 하나가 1차 2-NH2인 2개의 아민기들 중의 하나에의 또는 동시적으로 둘 다에의 변성 기의 결합으로 이루어진다 (구조 Vg). 2개의 아민기들이 동시적으로 사용되어 변성 기를 포함하는 특정한 경우, 바람직하게는 6개의 원자로 구성되는 고리가 여러 별개의 서브그룹 간에서 발생할 수 있다. 이러한 고리는 선택적으로 변성 기의 구조의 안정화를 초래한다.
변성 기가 질소성 염기에 의해 파생되는 이러한 구현예들에 있어서, 뉴클레오티드의 3'OH 및/또는 2'OH 사이트들은 유리(free)되어 핵산 합성 동안 연장 효소에 대한 기질로서의 이들의 사용을 촉진한다.
분자간 수소결합이 일어날 수 있다. 실제로, 질소성 염기에 의해 파생되는 변성 기 R은 하기 구조 (VI)들 중의 하나를 형성할 수 있다:
Figure pct00005
상기에서:
"Sugar(당)"는 상기 질소성 염기와 뉴클레오티드 분자의 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자 간의 결합을 나타내고,
X1 및 X2는, 동일하거나 서로 다를 수 있고, M에 의해 파생되는 질소, 산소 또는 황 원자를 나타내며, 이는 변성 뉴클레오티드의 상기 질소성 염기와 분자간 수소결합 (이후 이러한 수소결합은 상보성 뉴클레오티드 간의 통상적인 페어링 동안 관측되는 분자간 수소결합과 유사함)을 형성할 수 있다.
이러한 배치(configuration)는 변성 뉴클레오티드의 안정성을 강화시킨다. 이는 또한 변성 기의 조밀도(compactness)에 영향을 주고 대개는 주형 가닥의 존재에 의존하는 연장 효소에 의한 이들의 사용을 허용한다.
아데닌 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 바람직한 일 구현예는 1차 아민기 6-NH2 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 VIa). 존재하는 X1기는 퓨린환(purine ring)의 질소 원자 1과의 분자간 수소결합의 생성을 촉진한다. 따라서, 상보성 티민의 존재가 모방된다(mimicked).
티민 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 바람직한 일 구현예는 2차 아민기 3-NH 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 VIt). 존재하는 X1기는 피리미딘 환(ring)의 위치 4 내 산소 원자와의 분자간 수소결합의 생성을 촉진한다. 따라서, 상보성 아데닌의 존재가 모방된다.
시토신 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 바람직한 일 구현예는 1차 아민기 4-NH2 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 VIc). 존재하는 X1기 및 X2기는 피리미딘 환의 위치 3 내의 질소 원자 및 위치 2 내의 산소 원자와의 분자간 수소결합의 생성을 촉진한다. 따라서, 상보성 구아닌의 존재가 모방된다.
구아닌 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 바람직한 일 구현예는 개열가능한 Z1기 및 Z2기의 도움으로 2차 1-NH인 제1 및 1차 2-NH2인 제2의 2개의 아민기 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 VIg). 존재하는 X1기는 퓨린환의 위치 6 내의 산소 원자와의 분자간 수소결합의 생성을 촉진한다. 따라서, 상보성 시토신의 존재가 모방된다.
우라실 형태의 질소성 염기의 경우, 본 발명의 바람직한 일 구현예는 2차 아민기 3-NH 에의 변성 기의 결합으로 이루어진다(구조 VIu). 존재하는 X1기는 피리미딘 환의 위치 4 내의 산소와의 수소결합의 생성을 촉진한다. 따라서, 상보성 아데닌의 존재가 모방된다.
본 발명에 따른 변성 뉴클레오티드가 임의의 주형 가닥에 의해 파생된 가능한 상보성 뉴클레오티드와 페어링하여야 하는 임무가 필요한 것은 아니다. 핵산의 생성을 위한 본 발명의 대상인 변성 뉴클레오티드의 사용 동안, 상기 뉴클레오티드가 가능한 주형 가닥과의 상보성 상호작용에 의하여 포함되는 것으로 필수적으로 의도되는 것은 아니다.
본 발명의 대상인 변성 뉴클레오티드는 특정한 단계 동안 뉴클레오티드의 변성 기를 상실하는 것을 허용하는 특성을 갖는다. 뉴클레오티드의 모든 변성 기의 상실 이후, 본 발명의 뉴클레오티드는 따라서 변형되고 이후 주형 가닥에 의해 파생되는 상보성 뉴클레오티드와 페어링하는 능력을 회복한다.
특정한 일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 뉴클레오티드는 이후 심지어 상보성 가닥의 부재 하에서도 합성을 수행하는 가닥에 대하여 상보성인 주형 핵산 가닥의 존재에 일반적으로 의존적인 중합효소에 대한 기질로서 사용될 수 있다.
R기 또는 R'기의 관능 말단 라디칼 Q는 바람직하게는, 핵산 합성 동안, 상기 지지체의 표면에 부착된, 단백질과 같은 핵산 이외의 분자에 의해 상기 뉴클레오티드의 고체 지지체에의 부착을 허용할 수 있고, 보다 바람직하게는 하기 상호작용 페어(interaction pair): 항원/항체, 호르몬/수용체, 비오틴/(스트렙트)아비딘, 신경전달물질/수용체, 중합효소/프로모터, 디곡신/안티디곡신, 탄수화물/렉틴, 황-함유 라디칼/금 등과 같은 금속, 글루타치온/글루타치온 S-전달효소 또는 달리 두자리 리간드/금속산화물의 하나 또는 다른 하나에 따른 핵산 이외의 분자와 상호작용할 수 있다.
금속산화물은, 예를 들어, TiO2, ZrO2, CeO2, Fe3O4, Ga2O3, In2O3, Cr2O3, Al2O3, ZnO, CuO, Cu2O3, Mn3O4, Mn2O3, V2O3, MoO2일 수 있다.
두자리 리간드(bidentate ligand)는 카테콜, 하이드록사메이트(hydroxamate) 또는 하이드록시카르복실레이트(hydroxycarboxylate)일 수 있다.
T 라디칼은 "차단제(blocker)"로서 호칭되며 여기에서 이는 임의의 추가 뉴클레오티드 첨가에 대한 탄수화물의 3' 하이드록실기 또는 2' 하이드록실기를 보호한다.
바람직하게는, T 및 Z, 또는 Z1, Z2은, 핵산 합성 동안, 10-3 내지 10-11 meter(미터)의 파장을 갖는 전자기 방사선의 도움으로 상기 뉴클레오티드의 조사에 의하여, 특히 자외선에의 노출에 의하여 개열가능하다(cleavable).
본 발명의 유리한 구현예는 하기 뉴클레오티드들과 관련된다:
- X1 및 X2가 -NH이고, T가 -NH2이고, Z가 -CH2이고, M이 메틸니트로벤질-이고, Q가 -비오틴인 뉴클레오티드,
- X1 및 X2가 -NH이고, T가 -NH2이고, Z, Z1 및 Z2가 각각 -O-이고, M이 -니트로나프틸-이고 Q가 -비오틴인 뉴클레오티드,
- R'기 만을 포함하는 식 (I) (이때, Z가 -(C=O)-이고, M이 -C8H16-이고 Q가 -NH-비오티닐임)의 뉴클레오티드,
- Z, Z1 및 Z2가 각각 -(COO)-이고, M이 -tert-부틸니트로벤질-이고 Q가 -NH-비오티닐인 특정한 구조 (V)의 뉴클레오티드.
본 발명은 또한, 전술된 바와 같이, 특히 효소적 합성법에 따라, 유전자, 합성 핵산 시퀀스, DNA, RNA 또는 핵산 중합체의 제조를 위한 방법에서의 뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 특히 폴리뉴클레오티드 체인이 그의 5' 말단을 통하여 부착되는 경우에 및 상기 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 체인의 3' 말단을 통하여 실행되는 경우, 고체 지지체 상에 사전에 부동화된 폴리뉴클레오티드 체인 내로의 상기 뉴클레오티드의 포함을 위한 용도이다.
그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 뉴클레오티드는 필요한 경우 대이온(counterion)과 조합되는 유리 형태(free form)이다. 비록 이들이 고체 지지체에 부착되는 능력을 가지지만, 이러한 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 체인 내로의 이들의 포함 시 임의의 지지체로부터도 유리된다. 따라서 이의 화학적 구조는 임의의 고체 지지체에 연결되지 않는다. 그 자체가 부동화된 핵산의 단편에 뉴클레오티드가 첨가되기 때문에 변성 뉴클레오티드의 유리 속성은 공개되지 않은 특허출원 FR 14-53455에서 기술된 방법에서의 이의 용도를 위하여 특히 중요하다. 계속해서 이러한 단편이 방출되고 바로 포함된 뉴클레오티드의 효과기 덕분으로 후속하여 대향 말단을 통하여 제2 고체 지지체에 부착된다. 따라서 이는 폴리뉴클레오티드를 구축하는 데 사용되는 본 발명에 따른 뉴클레오티드가 아닌 고체 지지체에 부착된 소정의 시퀀스의 핵산 체인 또는 폴리뉴클레오티드를 완성한다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명에 따른 변성 뉴클레오티드를 포함하는 키트에 관한 것이며, 특히 상기 키트는 여러 변성 뉴클레오티드, 연장 효소 및 적어도 하나의 상기 뉴클레오티드가 부착될 수 있는 고체 지지체를 포함할 수 있다.
본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 이하의 구체적인 실시예를 참조하여 보다 상세하게 기술될 것이다.
도 1은 본 발명의 대상인 변성 뉴클레오티드의 여러 일반 구조를 보여준다;
도 2는 식 (V)의 변성 뉴클레오티드의 특정한 구조를 나타낸다;
도 3은 천연 질소성 염기 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌의 식을 나타낸다;
도 4는 식 (VI)의 분자가 수소결합 형태의 상호작용이 가능한 변성 기의 예들을 보여준다;
도 5는 화합물 NH2-dTTP-NitroB-Biot의 합성을 모식적으로 나타낸다;
도 6은 화합물 NH2-dGTP-NitroN-Biot의 합성을 모식적으로 나타낸다;
도 7은 화합물 FA-Biot-dNTP의 합성을 모식적으로 나타낸다;
도 8은 화합물 dATP-NitroB-Biot의 합성을 모식적으로 나타낸다;
도 9는 화합물 dCTP-NitroB-Biot의 합성을 모식적으로 나타낸다;
도 10은 중합된 화합물 NH2-dT-NitroB-Biot의 탈보호의 예를 보여준다;
도 11은 중합된 화합물 NH2-dG-NitroB-Biot의 탈보호의 예를 보여준다;
도 12는 중합된 화합물 FA-Biot-dNTP의 탈보호의 예를 보여준다;
도 13은 중합된 화합물 dA-NitroB-Biot의 광개열에 의한 탈보호의 예를 보여준다;
도 14는 중합된 화합물 dC-NitroB-Biot의 화학개열에 의한 탈보호의 예를 보여준다;
도 15는 Q가 카테콜인, 본 발명에 따른 변성 뉴클레오티드의 예를 나타낸다;
도 16은 화합물 FA-Cat-dNTP의 합성을 모식적으로 나타낸다.
실시예
변성 (보호된) 뉴클레오티드의 합성 - 구체적 실시예 1 내지 6
실시예 1 - 화합물 NH2-dTTP-NitroB-Biot의 합성 (도 5)
단계 A1: 주변 온도에서 밤새도록 Et3N (트리에틸아민) 2.2 ㎖ 및 DMAP (4-디메틸아미노피리딘) 175 ㎎ 및 계속해서 DMTCl (4,4'-디메톡시트리틸클로라이드) 5.25 g을 피리딘 중에 용해된 2'-디옥시티미딘 5 g에 첨가하였다. 계속해서 Et3N 2.4 ㎖ 및 MsCl (메탄설포닐클로라이드) 1.27 ㎖을 혼합물에 첨가하였다. 2 시간 동안 주변 온도에서 배양한 후, 혼합물을 여과하고 에틸아세테이트로 세척하였다. 여액을 농축시키고 에탄올 75 ㎖ 중에 용해시키고, 여기에 NaOH 1M을 첨가하였다. 1.5 시간 동안 환류시킨 후, 혼합물을 주변 온도까지 냉각시키고 HCl 1M을 첨가하였다. 에탄올을 회전 증발기 중에서 증발시키고 잔사를 CH2Cl2로 추출하였다. 실리카겔 컬럼 정제 후, 생성물 dTTP-A1을 수득하였다.
단계 A2: 0℃에서 N,N'-디이소프로필아조디카르복실레이트 1.75 ㎖를 테트라하이드로퓨란 50 ㎖ 중의 생성물 dTTP-A1 2.237 mmol, 트리페닐포스파인 2.1 g 및 N-하이드록시프탈이미드 1.3 g의 용액에 첨가하였다. 주변 온도에서 밤새도록 재가열 후, 반응 생성물을 물 0.3 ㎖로 처리하고 진공 하에서 용제를 증발시켰다. 크로마토그래피에 의하여 대부분의 불순물을 제거한 다음 생성물 dTT-A2를 수득하였다.
단계 A3: 주변 온도에서 DMF 내 LiH 10 당량을 화합물 dTT-A2 1 당량에 첨가하였다. 혼합물을 30 분 동안 반응시켰다. 3-아미노-4-(브로모메틸)-5-니트로페닐비오틴을 첨가하는 것에 의하여 반응을 지속시키고, 계속해서 혼합물을 수 시간 동안 교반시켰다. 생성물 dTT-A3을 수득하였다.
단계 A4: 화합물 dTTP-A3을 메탄올 중에 재현탁시키고 수성 농 염산으로 처리하였다. 용액을 밤새도록 -20℃까지 냉각시켜 생성물 dTTP-A4를 수득하였다.
단계 A5: 디옥산 1.3 ㎖ 중의 2-클로로-4H-1,2,3-벤조디옥산포스포린-4-온 130 ㎎의 용액이 피리딘 2 ㎖ 및 디옥산 1.7 ㎖ 중에 용해된 5'-OH 뉴클레오시드 유사체 dTTP-A4 425 ㎎에 첨가되었다. 혼합물을 주변 온도에서 20 분 동안 방치하였다. DMF 중의 트리부틸암모늄파이로포스페이트 1.4 mmol 및 트리부틸아민 3.2 mmol의 혼합물이 첨가되었다. 20 분 후, 피리딘 14 ㎖ 중의 요오드 180 ㎎ 및 물 0.28 ㎖의 용액이 첨가되었다. 30 분 후, 수성 5% Na2SO3 용액을 첨가하는 것에 의하여 반응을 중단시켰다. 진공 하에서 용제를 증발시켰다. 물 25 ㎖ 및 CH3CN 20 ㎖이 첨가되었다. 혼합물을 여과하고 역상 HPLC로 정제하여 트리포스페이트 화합물, 이 경우 문제의 dTTP-A5를 수득하였다.
단계 A6: -5℃에서 냉 메틸히드라진 0.385 ㎖이 무수 CH3Cl2 중의 화합물 dTTP-A5에 첨가되었다. 10 분 후, 1,2-디하이드로-4-하이드록시-2-메틸-1-옥소프탈리진의 침전물이 형성되었다. 혼합물을 1 시간 동안 주변 온도에서 교반시켰다. 침전물을 여과에 의해 제거하고 CH2Cl2로 세척하였다. 계속해서 여액을 회전 증발기 중에서 농축시키고 크로마토그래피로 정제하여 생성물 NH2-dTTP-NitroB-Biot를 수득하였다.
실시예 2 - 화합물 NH2-dGTP-NitroN-Biot의 합성 (도 6)
단계 B1: tert-부틸디메틸실릴클로라이드 2.4 mmol을 무수 DMF 중의 2'-디옥시구아닌 1.845 mmol 및 이미다졸 326 ㎎의 용액에 교반하면서 첨가하였다. 반응을 20 시간 동안 주변 온도에서 교반하면서 배양시켰다. 진공 하에서 용제를 제거하고 잔사를 크로마토그래피로 정제하여 생성물 dGTP-B1을 수득하였다.
단계 B2: 0℃에서 N,N'-디이소프로필아조디카르복실레이트 1.75 ㎖을 테트라하이드로퓨란 50 ㎖ 중의 생성물 dGTP-B1 2.237 mmol, 트리페닐포스파인 2.1 g 및 N-하이드록시프탈이미드 1.3 g의 용액에 첨가하였다. 주변 온도에서 밤새도록 재가열 후, 반응 생성물을 물 0.3 ㎖로 처리하고 용제를 진공 하에서 증발시켰다. 크로마토그래피에 의하여 대부분의 불순물을 제거한 다음 생성물 dGTP-B2를 수득하였다.
단계 B3: 화합물 dGTP-B2 3.785 mmol를 피리딘 10 ㎖ 및 진공 하에서의 증발을 사용하여 여러 차례 건조시켰다. 잔사를 CH2Cl2 12.5 ㎖ 중에 용해시켰다. 디이소프로필에틸아민 9 mmol 및 6-아미노-4,5-비스(이오도옥시)-3-니트로나프탈렌-1-일-5-비오틴 7.57 mmol을 첨가하였다. 반응이 종결되면, 혼합물을 CH2Cl2 100 ㎖ 중에 희석시키고, 유기상을 중탄산나트륨 50 ㎖ 및 물 50 ㎖로 세척하였다. 계속해서 이를 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용제를 진공 하에서 증발시키고 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 dGTP-B3를 수득하였다.
단계 B4: 화합물 dGTP-B3 3.75 mmol을 THF 20 ㎖ 중에 용해시키고 THF 중의 TBAF (테트라-n-부틸암모늄플루오라이드) 1M로 처리하였다. 대략 2 시간 동안 교반한 후 반응을 종결시켰다. 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고 크로마토그래피로 정제하여 dGTP-B4를 수득하였다.
단계 B5: 5'-OH 뉴클레오시드 유사체 425 ㎎을 실시예 1의 단계 A5와 유사하게 처리하였다. 최종 혼합물을 여과하고 역상 HPLC로 정제하여 트리포스페이트 화합물, 이 경우 문제의 dGTP-B5를 수득하였다.
단계 B6: -5℃에서 냉 메틸히드라진 0.385 ㎖을 무수 CH2Cl2 중의 화합물 dGTP-B5 3.725 mmol에 첨가하였다. 10 분 후, 1,2-디하이드로-4-하이드록시-2-메틸-1-옥소프탈리진 침전물이 형성되었다. 혼합물을 주변 온도에서 1 시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과에 의해 제거하고 CH2Cl2로 세척하였다. 계속해서 여액을 회전 증발기 중에서 농축시키고 크로마토그래피로 정제하여 생성물 NH2-dGTP-NitroN-Biot를 수득하였다.
실시예 3 - 화합물 FA-Biot-dNTP의 합성 (도 7)
단계 C1: DMF 중의 ω1-비오틴 노난산(ω1-biotin nonanoic acid) 100 ㎕를 DMF 중의 1M 카르보닐디이미다졸 100 ㎕와 혼합시켰다. 주변 온도에서 이미다졸리드의 형성이 30 초 내에 일어난다. 계속해서 물 중의 50 mM 디옥시리보-뉴클레오티드 5'-트리포스페이트 100 ㎕를 혼합물에 첨가하였다. 주변 온도에서 12 시간 내에 생성물이 형성되었다. 계속해서 이를 아세톤으로 침전시키고 물 중에 용해시켜 최종적으로 크로마토그래피에 의해 정제하도록 하여 생성물 FA-Biot-dNTP를 수득하였다.
실시예 4 - 화합물 dATP-NitroB-Biot의 합성 (도 8)
단계 D1: 주변 온도에서 밤새도록 Et3N 2.2 ㎖ 및 DMAP 175 ㎎ 계속해서 DMTCl 5.25　g을 피리딘 중에 용해된 2'-디옥시아데닌 5 g을 첨가하였다. 계속해서 Et3N 2.4 ㎖ 및 MsCl 1.27 ㎖를 혼합물에 첨가하였다. 주변 온도에서 2 시간 동안 배양 후, 혼합물을 여과하고 에틸아세테이트로 세척하였다. 여액을 농축시키고 에탄올 75 ㎖에 용해시키고 여기에 1M NaOH를 첨가하였다. 1.5 시간 동안 환류시킨 후, 혼합물을 주변 온도까지 냉각시키고 1M HCl을 첨가하였다. 회전 증발기 내에서 에탄올을 증발시키고 잔사를 CH2Cl2로 추출하였다. 실리카겔 컬럼 정제 이후, 생성물 dATP-D1을 수득하였다.
단계 D2: tert-부틸디메틸실릴클로라이드 2.4 mmol를 무수 DMF 중의 dATP-D1 1.845 mmol 및 이미다졸 326 ㎎의 용액에 교반하면서 첨가하였다. 주변 온도에서 20 시간 동안 반응을 교반시키면서 배양시켰다. 진공을 적용하는 것에 의하여 용제를 제거하고 잔사를 크로마토그래피로 정제하여 생성물 dATP-D2를 수득하였다.
단계 D3: 화합물 dATP-D2를 메탄올 중에 재현탁시키고 수성 농 염산으로 처리하였다. 밤새도록 용액을 -20℃까지 냉각시켜 생성물 dATP-D3을 수득하였다.
단계 D4: 5'-OH 뉴클레오시드 유사체 425 ㎎을 실시예 1의 단계 A5로 처리하였다. 최종 혼합물을 여과하고 역상 HPLC로 정제하여 트리포스페이트 화합물, 이 경우 문제의 dATP-D4를 수득하였다.
단계 D5: 0.1M NaHCO3, pH 8.0 200 ㎕ 중의 화합물 dATP-D4 3.1 μmol을 디메틸포름아미드 200 ㎕ 중의 2,2-tert-부틸-1-(2-니트로-4-비오틴)페닐)헥실 (2,5-디옥소-피롤리딘-1-일) 카보네이트 3.4 μmol과 혼합시켰다. 주변 온도에서 밤새도록 반응을 수행하여 dATP-D5를 수득하였다 (Olejnik et al., PNAS, 1995, Vol 92, 7590-7594).
단계 D6: 화합물 dATP-D5 3.75 mmol을 THF 20 ㎖ 중에 용해시키고 THF 중의 TBAF (테트라-n-부틸암모늄플루오라이드) 1M로 처리하였다. 대략 2 시간 동안 교반한 후 반응을 종결시켰다. 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고 크로마토그래피로 정제하여 dATP-NitroB-Biot를 수득하였다.
실시예 5 - 화합물 dCTP-NitroB-Biot의 합성 (도 9)
단계 E1: 주변온도에서 밤새도록 Et3N 2.2 ㎖ 및 DMAP 175 ㎎ 계속해서 DMTCl 5.25　g을 피리딘 중에 용해된 2'-디옥시시티딘 5 g에 첨가하였다. 계속해서 Et3N 2.4 ㎖ 및 MsCl 1.27 ㎖을 혼합물에 첨가하였다. 주변 온도에서 2 시간 동안 배양한 후, 혼합물을 여과하고 에틸아세테이트로 세척하였다. 여액을 농축시키고 에탄올 75 ㎖ 중에 용해시키고 여기에 1M NaOH를 첨가하였다. 1.5 시간 동안 환류시킨 후, 혼합물을 주변 온도까지 냉각시키고 1M HCl을 첨가하였다. 회전 증발기 내에서 에탄올을 증발시키고 잔사를 CH2Cl2로 추출하였다. 실리카겔 컬럼 정제 후, 생성물 dCTP-E1을 수득하였다.
단계 E2: 3차-부틸디메틸실릴클로라이드 2.4 mmol을 무수 DMF 중의 dCTP-E1 1.845 mmol 및 이미다졸 326 ㎎의 용액에 교반하면서 첨가하였다. 주변 온도에서 20 시간 동안 교반하면서 반응을 배양시켰다. 진공을 적용하는 것에 의하여 용제를 제거하고 잔사를 크로마토그래피로 정제하여 생성물 dCTP-E2를 수득하였다.
단계 E3: 화합물 dCTP-E2를 무수 에탄올 중에 용해시키고 0℃까지 냉각시켰다. 무수 에탄올 중의 2,2-3차-부틸-1-(2-니트로-4-비오틴)페닐)프로필페닐카보네이트의 등몰 용액을 적가하였다. 혼합물을 주변 온도에서 밤새도록 교반시켰다. 용액을 여과하고, 물로 세척하고 CH2Cl2로 추출하여 dCTP-E3을 수득하였다.
단계 E4: 화합물 dCTP-E3을 메탄올 중에 재현탁시키고 수성 농 염산으로 처리하였다. 용액을 -20℃까지 밤새도록 냉각시켜 생성물 dCTP-E4를 수득하였다.
단계 E5: 5'-OH 뉴클레오시드 425 ㎎을 실시예 1의 단계 A5와 유사하게 처리하였다. 최종 혼합물을 여과하고 역상 HPLC로 정제하여 트리포스페이트 화합물, 이 경우 문제의 dCTP-E5를 수득하였다.
단계 E6: 화합물 dCTP-E5를 THF 20 ㎖ 중에 용해시키고 THF 중의 TBAF (테트라-n-부틸암모늄플루오라이드) 1M로 처리하였다. 대략 2 시간 동안 교반한 후 반응을 종결시켰다. 혼합물을 CH2Cl2로 추출하고 크로마토그래피로 정제하여 dCTP-NitroB-Biot를 수득하였다.
실시예 6 - 화합물 FA-Cat-dNTP의 합성 (도 16)
단계 F1: DMF 중의 1M 변성 카테콜 에스테르 100 ㎕를 1M 디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC) 110 ㎕ 및 DMF 중의 100% 4-(디메틸아미노)피리딘 5 ㎕와 혼합시켰다. 혼합물을 0℃에서 5 분 동안 배양시켰다. 계속해서 DMF 중의 50 mM 디옥시리보뉴클레오티드 5'-트리포스페이트 500　㎕를 혼합물에 첨가하였다. 주변 온도에서 3 시간 이내에 생성물이 형성되었다. 계속해서 아세톤으로 침전시키고 물 중에 용해시켜 최종적으로 크로마토그래피에 의해 정제하도록 하여 생성물 FA-Cat-dNTP를 수득하였다.
탈보호 ( deprotection )
핵산 체인에의 뉴클레오티드의 첨가 이후, 하기 실시예 7 내지 11은 상기 분자의 탈보호 즉, 변성 기(들)의 제거의 실시예를 기술한다.
실시예 7 - 중합 뉴클레오티드 NH2-dT-NitroB-Biot의 탈보호 (도 10)
하기 공정 동안 동시적으로 여러 변성 기의 개열이 수행되었다. 수성 용액 중의 화합물 NH2-dT-NitroB-Biot 20 mM을 pH 5.5, NaNO2 350 내지 700 mM 및 NaOAc 1M을 포함하는 용액으로 처리하였다. 주변 온도에서 365 ㎚의 파장을 갖는 UV 광에 노출시켜 1 내지 2 분 동안 배양한 후, pH 7.0 인산염 완충제 1M을 첨가하는 것에 의하여 반응을 중단시키고 조사를 중단시켰다. 탈보호 반응 생성물은 dT이다.
실시예 8 - 중합 뉴클레오티드 NH2-dG-NitroN-Biot의 탈보호 (도 11)
하기 공정 동안 동시적으로 여러 변성 기의 개열이 수행되었다: 수성 용액 중의 화합물 NH2-dG-NitroN-Biot 20 mM을 pH 5.5, NaNO2 350 내지 700 mM 및 NaOAc 1M을 포함하는 용액으로 처리하였다. 주변 온도에서 365 ㎚의 파장을 갖는 UV 광에 노출시켜 1 내지 2 분 동안 배양한 후, pH 7.0 인산염 완충제 1M을 첨가하는 것에 의하여 반응을 중단시키고 조사를 중단시켰다. 탈보호 반응 생성물은 dG이다.
실시예 9 - FA-Biot-dN 타입의 중합 뉴클레오티드의 탈보호 (도 12)
주변 온도에서 1 시간 동안 수성 암모니아 용액 1 내지 100 mM로의 에스테르 관능의 가수분해에 의해 3'-OH 말단에 의해 파생된 변성 기의 개열을 수행하였다. dN 타입의 생성물을 수득하였다.
실시예 10 - 광 개열에 의한 중합 뉴클레오티드 dA-NitroB-Biot의 탈보호 (도 13)
질소성 염기에 의해 파생된 변성 기의 개열이 광개열에 의해 수행되었다. 주변 온도에서 화합물 dA-NitroB-Biot를 300 내지 370 ㎚의 파장을 갖는 UV 광원에 노출시켰다. 30 내지 300 초 후 UV 광원을 중단시켜 생성물 dA를 수득하였다.
실시예 11 - 화학 개열에 의한 중합 뉴클레오티드 dC-NitroB-Biol의 탈보호 (도　14)
질소성 염기에 의해 파생된 변성 기의 개열이 화학 개열에 의하여 수행되었다. 화합물 dC-NitroB-Biot 0.01 mmol을 에탄올 0.1 ㎖ 중에 용해시켰다. 에탄올 중에 용해된 0.02 mmol 소듐테트라클로로팔라데이트 II의 용액을 첨가하였다. 수소 가스(dihydrogen gas)를 교반 중의 혼합물 내로 20 분 동안 발포시켰다. 수득된 생성물은 dC이다.
유사한 방법이 부동화된 팔라듐을 사용하는 Kobayashi et al. (Science, 2004, 304, 1305-1308)에 의해 기술되었으며, THF 중의 1 ㎖/분의 H2의 기류가 다른 형태로 사용될 수 있다.
실시예 12 - 핵산 합성을 위한 본 발명에 따른 뉴클레오티드의 용도
특허출원 FR 14-53455에서 기술된 방법에 따라 주형 가닥 없이 핵산의 효소적 합성을 실행하는 데 본 발명의 대상인 변성 뉴클레오티드가 유리하게 사용될 수 있다. 변성 뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 실행하기 위하여 선택된 효소는 상용적으로 획득가능한 말단 디옥시뉴클레오티드 전달효소(terminal deoxynucleotidyl transferase) 또는 TdT이다.
합성을 개시하는 데 사용된 프라이머가 하기와 같이 주어졌다:
Figure pct00006
사용된 변성 뉴클레오티드는 실시예 1에 따라 제조된 NH2-dTTP-NitroB-Biot이다. 이는 제공된 시퀀스 번호 1에 T를 첨가하는 것을 가능하게 한다. 하기 기술된 바와 같이, 각 연장 단계 동안 각 DNA 단편에 단지 하나의 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다는 것이 기대된다.
그 3' 말단에 의해 유리판에 부착된 하기 시퀀스:
Figure pct00007
를 갖는 "포획(capture)" 단편을 포함하는 유리판(glass plate)을 사용하여 시퀀스 번호 1의 프라이머를 포획하였다. 이 유리판은 50 ㎕의 용적을 갖는 평행육면체 반응실(parallelepipedal reaction chamber)의 기반을 구성한다. 20 mM 트리스-염산 (pH = 7.5), 500 mM LiCl 및 1 mM EDTA를 포함하며 여기에 2 pmol의 프라이머가 첨가된 완충용액을 사용하여 포획이 수행되었다. 주변 온도에서 30 분에 걸쳐 포획 단계가 수행되었다. 일단 프라이머가 포획되면, 20 mM 트리스-염산 (pH = 7.5), 200 mM LiCl 및 1 mM EDTA의 완충용액 50 ㎕을 3회 첨가하고 제거하는 것에 의하여 판을 세척하였다.
하기 시약: pH 7.2에서 TdT 50 U, 포타슘카코딜레이트(potassium cacodylate) 1 M, 트리스-염산 125 mM, 트리톤 엑스-100 0.05 용적/용적%, CoCl2 5 mM을 반응실에 첨가하여 합성을 개시한다. 다음으로 유리되고 용액 중에서 그의 대이온(counterion)을 수반하는 뉴클레오티드 NH2-dTTP-NitroB-Biot 100 μM을 첨가하였다. 2 μM 효소를 마지막으로 첨가하여 첨가 반응을 개시하였다. 총 반응 용적은 50 ㎕이다. 혼합물을 37℃에서 5 분 동안 배양시켰다.
일단 합성 반응이 종결되면, 20 mM 트리스-염산 (pH = 7.5), 200 mM LiCl 및 1 mM EDTA의 완충용액으로 판을 3회 세척하였다. 이는 과량으로 도입된 NH2-dTTP-NitroB-Biot 뉴클레오티드를 제거하고, 반응실에 미반응된 뉴클레오티드가 제거된 고체 지지체를 잔류시키는 것을 확실하게 하는 효과를 갖는다. 세척의 끝에서, 20 mM 트리스-염산 완충제 (pH = 7.5) 50 ㎕를 반응실에 첨가하고 온도를 90℃까지 증가시켰다. 이는 포함된 변성 뉴클레오티드 NH2-dTTP-NitroB-Biot를 갖는 단편의 탈착을 보증하는 효과를 갖는다. 이 단편을 수집하고 새로운 에펜도르프 시험관(Eppendorf tube)에로 옮겼다.
계속해서 포함된 보호 뉴클레오티드 NH2-dTTP-NitroB-Biot를 갖는 DNA 단편이 하기 방법에 따라 정제되었다. 제조업자의 규약에 따라 제조된 스트렙타비딘 (ThermoScientific)으로 코팅된 통상의 자석구슬(magnetic bead)을 앞선 반응 혼합물 50 ㎕에 첨가하였다. 주변 온도에서 1 시간 동안 배양한 후, 적절한 자석의 도움으로 자석구슬을 수집하였다. 계속해서 상청액을 제거하였다. 계속해서 구슬을 트윈-20 0.1%를 수반하는 트리스 완충제 pH 7.2의 세척 완충제로 3회 세척하였다.
포함된 변성 뉴클레오티드 NH2-dTTP-NitroB-Biot를 갖는 DNA 단편이 그에 부착된 자석구슬을 pH 5.5, NaNO2 350 내지 700 mM 및 NaOAc 1M을 포함하는 용액에 재현탁시켰다. UV (365 ㎚)에의 노출 하에서 주변 온도에서 혼합물을 1 내지 2 분 동안 배양시켰다. pH 7.0 인산염 완충제 1M을 첨가하는 것에 의하여 반응을 중단시키고 조사를 중단시켰다. 이러한 작업은 그의 지지체 (구슬)로부터의 DNA 단편의 "탈착(detachment)"을 가능하게 한다.
적절한 자석의 도움으로 자석구슬을 수집하였다. 상청액을 회수하고 전기영동 겔 및 MALDI-TOF MS 분광분석기로 분석하여 99% 이상의 사례로 시퀀스 번호 1의 3' 말단에의 T 염기의 정확한 포함을 입증하였다.
계속해서, 필요한 경우, 동일한 규약에 따라 신규한 연장 단계가 수행될 수 있다.
실시예 13 - 핵산 합성을 위한 본 발명에 따른 뉴클레오티드의 용도의 다른 실시예
특허출원 FR 14-53455에서 기술된 방법에 따라 주형 가닥 없이 핵산의 효소적 합성을 실행하는 데 본 발명의 대상인 변성 뉴클레오티드가 유리하게 사용될 수 있다. 변성 뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 실행하기 위하여 선택된 효소는 상용적으로 획득가능한 말단 디옥시뉴클레오티드 전달효소 또는 TdT이다.
합성을 개시하는 데 사용된 프라이머가 하기와 같이 주어졌다:
Figure pct00008
사용된 변성 뉴클레오티드는 실시예 2에 따라 제조된 NH2-dGTP-NitroB-Biot이다. 이는 제공된 시퀀스 번호 1에 G를 첨가하는 것을 가능하게 한다. 하기 기술된 바와 같이, 각 연장 단계 동안 각 DNA 단편에 단지 하나의 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다는 것이 기대된다.
그 3' 말단에 의해 유리판에 부착된 하기 시퀀스:
Figure pct00009
를 갖는 포획 단편을 나타내는 유리판을 사용하여 시퀀스 번호 1의 프라이머를 포획하였다. 이 유리판은 50 ㎕의 용적을 갖는 평행육면체 반응실의 기반을 구성한다. 20 mM 트리스-염산 (pH = 7.5), 500 mM LiCl 및 1 mM EDTA를 포함하며 여기에 2 pmol의 프라이머가 첨가된 완충용액을 사용하여 포획이 수행되었다. 주변 온도에서 30 분에 걸쳐 포획 단계가 수행되었다. 일단 프라이머가 포획되면, 20 mM 트리스-염산 (pH = 7.5), 200 mM LiCl 및 1 mM EDTA의 완충용액 50 ㎕을 3회 첨가하고 제거하는 것에 의하여 판을 세척하였다.
하기 시약: pH 7.2에서 TdT 50 U, 포타슘카코딜레이트 1 M, 트리스-염산 125 mM, 트리톤 엑스-100 0.05 용적/용적%, CoCl2 5 mM을 반응실에 첨가하여 합성을 개시한다. 다음으로 유리되고 용액 중에서 그의 대이온을 수반하는 뉴클레오티드 NH2-dGTP-NitroB-Biot 100 μM을 첨가하였다. 2 μM 효소를 마지막으로 첨가하여 첨가 반응을 개시하였다. 총 반응 용적은 50 ㎕이다. 혼합물을 37℃에서 5 분 동안 배양시켰다.
일단 합성 반응이 종결되면, 20 mM 트리스-염산 (pH = 7.5), 200 mM LiCl 및 1 mM EDTA의 완충용액으로 판을 3회 세척하였다. 이는 과량으로 도입된 NH2-dGTP-NitroB-Biot 뉴클레오티드를 제거하고, 반응실에 미반응된 뉴클레오티드가 제거된 고체 지지체를 잔류시키는 것을 확실하게 하는 효과를 갖는다. 세척의 끝에서, 20 mM 트리스-염산 완충제 (pH = 7.5) 50 ㎕를 반응실에 첨가하고 온도를 90℃까지 증가시켰다. 이는 포함된 변성 뉴클레오티드 NH2-dGTP-NitroB-Biot를 갖는 단편의 탈착을 보증하는 효과를 갖는다. 이 단편을 수집하고 새로운 에펜도르프 시험관에로 옮겼다.
계속해서 포함된 보호 뉴클레오티드 NH2-dGTP-NitroB-Biot를 갖는 DNA 단편이 하기 방법에 따라 정제되었다. 제조업자의 규약에 따라 제조된 스트렙타비딘 (ThermoScientific)으로 코팅된 통상의 자석구슬을 앞서의 반응 혼합물 50 ㎕에 첨가하였다. 주변 온도에서 1 시간 동안 배양한 후, 적절한 자석의 도움으로 자석구슬을 수집하였다. 계속해서 상청액을 제거하였다. 계속해서 구슬을 트윈-20 0.1%를 수반하는 트리스 완충제 pH 7.2의 세척 완충제로 3회 세척하였다.
포함된 변성 뉴클레오티드 NH2-dGTP-NitroB-Biot를 갖는 DNA 단편이 그에 부착된 자석구슬을 pH 5.5, NaNO2 350 내지 700 mM 및 NaOAc 1M을 포함하는 용액에 재현탁시켰다. UV (365 ㎚)에의 노출로 주변 온도에서 혼합물을 1 내지 2 분 동안 배양시켰다. pH 7.0 인산염 완충제 1M을 첨가하는 것에 의하여 반응을 중단시키고 조사를 중단시켰다. 이러한 작업은 그의 지지체 (구슬)로부터의 DNA 단편의 "탈착"을 허용한다.
적절한 자석의 도움으로 자석구슬을 수집하였다. 상청액을 회수하고 전기영동 겔 및 MALDI-TOF MS 분광분석기로 분석하여 99% 이상의 사례로 시퀀스 번호 1의 3' 말단에의 T 염기의 정확한 포함을 입증하였다.
계속해서, 필요한 경우, 동일한 규약에 따라 신규한 연장 단계가 수행될 수 있다.
산업적 이용(Industrial application)
본 발명의 대상인 변성 뉴클레오티드는 특히 매우 높은 품질로 매우 긴 핵산의 합성을 허용하는 것에 의하여 핵산 합성 방법의 성능 수준을 개선한다. 이러한 뉴클레오티드는 다소 큰 규모로 합성 핵산 시퀀스 또는 유전자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이러한 변성 뉴클레오티드는 특히 생명공학 분야 보다 일반적으로는 광범위한 생물학 분야에서 연구, 개발 또는 산업화 목적으로 DNA 또는 RNA 등과 같은 핵산의 합성을 위하여 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> DNA SCRIPT <120> Modified nucleotides <130> IP20173108FR <140> PCT/FR2015/052310 <141> 2015-09-01 <150> FR1458194 <151> 2014-09-02 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> nucleic acid <400> 1 agccaagcgg tcgcgatgat 20 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> nucleic acid <400> 2 gtccgcttgg ct 12

Claims (15)

  1. "천연" 질소성 염기 또는 천연 질소성 염기 유사체, 리보오스 또는 디옥시리보오스 탄수화물(ribose or deoxyribose carbohydrate), 및 적어도 하나의 포스페이트기를 포함하는, 핵산의 효소적 합성을 위하여 의도된, 변성 뉴클레오티드로,
    상기 변성 뉴클레오티드가:
    - 천연 질소성 염기 또는 이의 유사체에 의하거나, 및/또는
    - 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자의 위치 3'의 산소에 의하여, 파생되는(borne) 변성 기(modifier group)라고 불리는 적어도 하나의 R 또는 R'기를 포함하여 상기 뉴클레오티드의 중합을 차단 및/또는 핵산 합성 동안 뉴클레오티드가 아닌 단백질과 같은 다른 분자와 상기 뉴클레오티드의 상호작용을 가능하게 하고,
    이때, R은 적어도 하나의 관능 말단기 (functional end group)를 포함하며,
    상기 뉴클레오티드는 하기 식 (I), (III) 및 (IV) 중의 하나의 형태인 것을 특징으로 하는, 변성 뉴클레오티드:
    Figure pct00010

    Figure pct00011

    상기에서:
    (PP)PO는 모노포스페이트기, 디포스페이트기 또는 트리포스페이트기를 나타내고,
    (OH)는 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자의 가능성을 기술하며,
    T는 수소 또는 -NH2, -N3, -(C=O)H, n이 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 12인 -CnH2n +1, -트리메틸실릴, -포스페이트, -SO3, n이 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 12인 -(C=O)OCnH2n +1, n이 1 내지 30, 바람직하게는 1 내지 12인 -(C=O)SCnH2n +1, -니트로벤젠, -벤질, -할로벤질, -아미드(amide), -카보네이트, -벤조일, -퍼옥실, -니트릴, -티올, -이미드, -카바메이트, -시아네이트, -알킨, -페닐, -할로페닐, -피콜릴으로부터 선택되는 개열가능한(cleavable) 라디칼이고,
    M은, 알킬, 알케닐, 알킨, 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 아실, 알킬옥시, 알킬아미노, 알콕시아미노, 아미도, 알킬이미도, 알케닐이미도, 아릴이미도, 플루오로알킬, 알킬포스페이트, 알킬티오, 티오아실, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 알킬설피닐, 알킬암모늄, 알킬설포늄, 알킬실릴, 알킬카르보닐, 알킬카르바닐, 알킬카바모일 또는 알킬하이드록실아미노로부터 선택되는, Q에 및 Z에 공유적으로 결합되는 기로 존재하거나 존재하지 않을 수 있고,
    Z는 -O-, -S-, =SH-, =S=, ≡S-, -SiH2-, =SiH-, =Si=, ≡Si-, -Se-, =SeH-, ≡Se-, =Se=, -SeH2-, -PH-, =P-, =PH=, ≡P=, ≡PH-, -PH3-, -AsH-, =As-, =AsH=, ≡As=, ≡AsH-, -ASH3-, 아민, 에스테르, 실릴, 알킬, 벤질, 니트로벤질, 아미드, 카보네이트, 벤조일, 퍼옥실, 니트릴, 티올, 이미드, 카바메이트, 시아네이트, 하이드록실아민, 설폭사이드, 설포네이트, 티오설피네이트, 티오에스테르, 아실할라이드, 하이포이오딜, 알킨, 할로페닐, 할로벤질, 피코일, 디올 또는 디설파이드로부터 선택되거나, M이 -니트로벤질-, -니트로톨릴-, -니트로자일릴-, -니트로나프틸- 또는 -니트로페닐-인 경우 -CH2 또는 -NH-로부터 선택되는, 개열가능한 기(clevable group)이고,
    Q는 비오틴, 단백질, 정의된 시퀀스의 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 항원, 호르몬, 신경전달물질, 디곡신과 같은 글리코시드, 특히 글루타치온과 같이 티올 관능을 포함하는 황-함유 라디칼 또는 카테콜과 같은 두자리 리간드(bidentate ligand)로부터 선택되는, R 또는 R'기의 말단 관능기(end functional group) 또는 효과기(effector group)이고,
    R 및 R'는 독립적이거나 또는 동시적일 수 있고, R 및 R'가 동시적으로 제공되는 경우:
    Z기는 동일하거나 서로 다를 수 있고,
    M기는 동일하거나 서로 다를 수 있고,
    Q기는 동일하거나 서로 다를 수 있으며,
    "Base (염기)"는, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌 또는 우라실에서 선택되는 "천연" 질소성 염기 또는 천연 질소성 염기 유사체를 나타내고, 이때 R'가 존재하고 Q가 비오틴을 포함하는 경우에는 티민은 제외됨.
  2. 제1항에 있어서,
    변성 기 R이 질소성 염기에 의해 파생되고 하기 구조 (V) 중의 하나를 형성함을 특징으로 하는 뉴클레오티드:
    Figure pct00012

    Figure pct00013

    상기 구조에서:
    "Sugar(당)"은 상기 질소성 염기와 뉴클레오티드 분자의 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자 간의 결합을 나타내고,
    Z1 및 Z2는 동일하거나 서로 다른 개열가능한(cleavable) Z 기임.
  3. 제2항에 있어서,
    질소성 염기에 의해 파생되는 변성 기 R이 하기 구조 (VI) 중의 하나를 형성함을 특징으로 하는 뉴클레오티드:
    Figure pct00014

    Figure pct00015

    상기에서:
    "Sugar(당)"는 상기 질소성 염기와 뉴클레오티드 분자의 리보오스 또는 디옥시리보오스 분자 간의 결합을 나타내고,
    X1 및 X2는, 동일하거나 서로 다를 수 있고, M에 의해 파생되는 질소, 산소 또는 황 원자로서, 변성 뉴클레오티드의 상기 질소성 염기와 함께 분자간 수소결합 (상보성 뉴클레오티드 간의 통상적인 페어링 동안 관측되는 것과 유사한 분자간 수소결합)을 형성할 수 있는 질소, 산소 또는 황 원자를 나타냄.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    심지어 상보성 가닥(complementary strand)의 부재하에서도 합성을 수행하는 가닥(strand)에 대하여 상보성인 주형 핵산 가닥의 존재에 일반적으로 의존적인 중합효소에 대한 기질로서 사용될 수 있는, 뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    R기 또는 R'기의 관능 말단 라디칼 Q가, 하기의 상호작용 페어의 하나 또는 다른 하나에 따른 핵산 이외의 분자와 상호작용할 수 있는 것임을 특징으로 하는 뉴클레오티드:
    항원/항체, 호르몬/수용체, 비오틴/(스트렙트)아비딘, 신경전달물질/수용체, 중합효소/프로모터, 디곡신/안티디곡신, 탄수화물/렉틴, 황-함유 라디칼/금과 같은 금속, 글루타치온/글루타치온 S-전달효소, 두자리 리간드(bidentate ligand)/금속 산화물.
  6. 제3항에 있어서,
    X1 및 X2가 -NH이고, T가 -NH2이고, Z가 -CH2이고, M이 메틸니트로벤질-이고, Q가 -비오틴인 뉴클레오티드.
  7. 제3항에 있어서,
    X1 및 X2가 -NH이고, T가 -NH2이고, Z, Z1 및 Z2가 각각 -O-이고, M이 -니트로나프틸-이고 Q가 -비오틴인 뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서,
    단지 R'기 만을 포함하는 식 (I) (여기서, Z는 -(C=O)-, M은 -C8H16-, Q는 -NH-비오티닐임)의 뉴클레오티드.
  9. 제2항에 있어서,
    특정의 구조 (V) (여기서, Z, Z1 및 Z2는 각각 -(COO)-이고, M은 -tert-부틸니트로벤질-, Q는 -NH-비오티닐임)를 특징으로 하는 뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 및 Z 또는 Z1, Z2가, 핵산 합성 동안, 10-3 내지 10-11 meter의 파장을 갖는 전자기 방사선의 조사에 의해, 특히 자외선에 의해, 개열가능한(clevable) 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드.
  11. 유전자, 합성 핵산 시퀀스, DNA, RNA 또는 핵산 중합체의 제조를 위한 방법에서의, 특히 효소적 합성법에 따른, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 뉴클레오티드의 용도.
  12. 사전에 고체 지지체 상에 부동화된 폴리뉴클레오티드 체인(chain) 내로의 상기 뉴클레오티드의 포함을 위한, 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 뉴클레오티드의 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드 체인이 이의 5' 말단을 통하여 부착되고, 상기 뉴클레오티드의 부가가 폴리뉴클레오티드 체인의 3' 말단을 통하여 실행되는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드의 용도.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 변성 뉴클레오티드 하나 이상을 포함하는, 핵산 합성을 위한 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    사전에 고체 지지체 상에 부동화된 폴리뉴클레오티드 체인(chain) 내로의 상기 뉴클레오티드의 포함을 위한, 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 뉴클레오티드의 용도와 조합된, 복수의 변성 뉴클레오티드들, 연장 효소 및 상기 뉴클레오티드 중 하나 이상이 부착될 수 있는 고체 지지체를 포함하는, 키트.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3020071B1 (fr) 2014-04-17 2017-12-22 Dna Script Procede de synthese d'acides nucleiques, notamment d'acides nucleiques de grande longueur, utilisation du procede et kit pour la mise en œuvre du procede
FR3025201B1 (fr) 2014-09-02 2018-10-12 Dna Script Nucleotides modifies pour la synthese d'acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d'acides nucleiques synthetiques
FR3052462A1 (fr) 2016-06-14 2017-12-15 Dna Script Variants d'une adn polymerase de la famille polx
GB2559117B (en) 2017-01-19 2019-11-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Double stranded polynucleotide synthesis method, kit and system
US11390856B2 (en) 2017-08-07 2022-07-19 Dna Script Variants of family a DNA polymerase and uses thereof
LT6615B (lt) * 2017-09-12 2019-04-25 Vilniaus Universitetas N4-modifikuoti citidino nukleotidai ir jų panaudojimas
US10435676B2 (en) 2018-01-08 2019-10-08 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
WO2020036654A2 (en) 2018-04-27 2020-02-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Highly knotted molecular topologies from single-stranded nucleic acids
GB2574197B (en) 2018-05-23 2022-01-05 Oxford Nanopore Tech Ltd Double stranded polynucleotide synthesis method and system.
GB201811810D0 (en) 2018-07-19 2018-09-05 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201811813D0 (en) 2018-07-19 2018-09-05 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201811811D0 (en) 2018-07-19 2018-09-05 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CA3122494A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
WO2020165137A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Dna Script Efficient product cleavage in template-free enzymatic synthesis of polynucleotides.
EP3744854A1 (en) 2019-05-28 2020-12-02 DNA Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
CA3140498A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
WO2021048142A1 (en) * 2019-09-09 2021-03-18 Dna Script Template-free enzymatic polynucleotide synthesis using photocleavable linkages
GB201913039D0 (en) 2019-09-10 2019-10-23 Oxford Nanopore Tech Ltd Polynicleotide synthesis method kit and system
CN114729389B (zh) * 2019-09-23 2024-03-08 Dna斯克瑞普特公司 增加多核苷酸的无模板酶促合成中的长序列产率
WO2021104514A1 (en) * 2019-11-29 2021-06-03 Bgi Shenzhen Co., Ltd. Enzymatic synthesis of oligonucleotides
US20220145345A1 (en) 2020-11-11 2022-05-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Spatial control of polynucleotide synthesis by strand capping
WO2023083997A2 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Dna Script Novel terminal deoxynucleotidyl
WO2023083999A2 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Dna Script Novel terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt) variants

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1453455A (fr) 1965-08-10 1966-06-03 Pechiney Saint Gobain Procédé de fluoration de polymères organiques
US4772691A (en) 1985-06-05 1988-09-20 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Chemically cleavable nucleotides
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5516664A (en) 1992-12-23 1996-05-14 Hyman; Edward D. Enzymatic synthesis of repeat regions of oligonucleotides
US5436143A (en) 1992-12-23 1995-07-25 Hyman; Edward D. Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides
FR2703052B1 (fr) 1993-03-26 1995-06-02 Pasteur Institut Nouvelle méthode de séquençage d'acides nucléiques.
US5656745A (en) 1993-09-17 1997-08-12 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
AU1436995A (en) 1993-12-30 1995-07-17 Chemgenes Corporation Synthesis of propargyl modified nucleosides and phosphoramidites and their incorporation into defined sequence oligonucleotides
US6232465B1 (en) 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6214987B1 (en) 1994-09-02 2001-04-10 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5763594A (en) 1994-09-02 1998-06-09 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5990300A (en) * 1994-09-02 1999-11-23 Andrew C. Hiatt Enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5808045A (en) 1994-09-02 1998-09-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5872244A (en) 1994-09-02 1999-02-16 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5917031A (en) 1996-04-19 1999-06-29 Taiko Pharmaceutical Co., Ltd. Method of synthesizing polydeoxyribonucleotides
US7270951B1 (en) 1999-03-10 2007-09-18 Asm Scientific, Inc. Method for direct nucleic acid sequencing
GB9907813D0 (en) 1999-04-06 1999-06-02 Medical Biosystems Ltd Synthesis
GB0013276D0 (en) 2000-06-01 2000-07-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Nucleotide analogues
WO2002029003A2 (en) 2000-10-06 2002-04-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
JP2004526448A (ja) 2001-03-30 2004-09-02 アプレラ コーポレイション 非鋳型ヌクレオチド付加を用いた核酸分析
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7504215B2 (en) * 2002-07-12 2009-03-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling methods
EP3795577A1 (en) 2002-08-23 2021-03-24 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides
WO2004048397A2 (en) * 2002-11-22 2004-06-10 Roche Diagnostics Gmbh Detectable labeled nucleoside analogs and methods of use thereof
US7932025B2 (en) 2002-12-10 2011-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods for high fidelity production of long nucleic acid molecules with error control
WO2004072304A1 (en) 2003-02-05 2004-08-26 Amersham Biosciences Corp Nucleic acid amplification
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US8212020B2 (en) 2005-03-11 2012-07-03 Steven Albert Benner Reagents for reversibly terminating primer extension
US7544794B1 (en) 2005-03-11 2009-06-09 Steven Albert Benner Method for sequencing DNA and RNA by synthesis
US7550264B2 (en) 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7858772B2 (en) 2006-12-22 2010-12-28 Roche Molecular Systems, Inc. Compounds and methods for synthesis and purification of oligonucleotides
DK2171088T3 (en) 2007-06-19 2016-01-25 Stratos Genomics Inc Nucleic acid sequencing in a high yield by expansion
US8034923B1 (en) 2009-03-27 2011-10-11 Steven Albert Benner Reagents for reversibly terminating primer extension
US8674086B2 (en) 2010-06-25 2014-03-18 Intel Corporation Nucleotides and oligonucleotides for nucleic acid sequencing
GB201017304D0 (en) * 2010-10-13 2010-11-24 Univ Bath Reagent
CA2866625C (en) 2012-03-13 2020-12-08 Swift Biosciences, Inc. Methods and compositions for size-controlled homopolymer tailing of substrate polynucleotides by a nucleic acid polymerase
US9279149B2 (en) 2013-04-02 2016-03-08 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
US8808989B1 (en) 2013-04-02 2014-08-19 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
FR3025201B1 (fr) 2014-09-02 2018-10-12 Dna Script Nucleotides modifies pour la synthese d'acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d'acides nucleiques synthetiques

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