JP2017527556A - 核酸合成用修飾ヌクレオチド及び前記ヌクレオチドを含むキット、並びに合成核酸配列又は遺伝子の製造のためのそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
特に、核酸、特に非常に長い核酸の合成のために必要なヌクレオチド及び当該ヌクレオチドを含むキット、並びに合成核酸配列又は遺伝子の製造のためのそれらの使用に関する。
核酸の生体外における化学的合成方法の最も一般的なものとして、ホスホラミダイトを利用した重合法がある(非特許文献1及び非特許文献2)。この方法では、加える各ヌクレオチドは、同種の複数のヌクレオチドの重合が制御不能になることを抑止するため、5’−OH基で保護されている。通常、この5’−OH基の保護にはトリチル基を用いる。強力な試薬を用いることによるいかなる分解も抑止するため、ヌクレオチドが担持する基部も保護できる。この保護基を用いる場合、通常、イソブチリル基を用いる(Reddy et al.1997,Nucleosides & Nucleotides 16:1589)。新しいヌクレオチドの各取込後、次の重合ステップにおいて使用可能とするために、鎖の最後のヌクレオチドの5’−OH基が脱保護反応を受ける。核酸を形成するヌクレオチドが担持する窒素塩基自体の脱保護は、完全な重合の終了後にのみ行う。
本発明に係るヌクレオチドは、モノリン酸塩、二リン酸塩又は三リン酸塩であって良く、これらリン酸塩基は遊離基、すなわち非修飾基であって良い。
(OH)はリボース又はデオキシリボース分子であって良く、
Tは水素又は−NH2、−N3、−(C=O)H、−CnH2n+1(n=1〜30、好ましくは1〜12)、−トリメチルシリル、−リン酸塩、−SO3、−(C=O)OCnH2n+1(n=1〜30、好ましくは1〜12)、−(C=O)SCnH2n+1(n=1〜30、好ましくは1〜12)、−ニトロベンゼン、−ベンジル、−ハロベンジル、−アミド、−炭酸塩、−ベンゾイル、−パーオキシル、−ニトリル、−チオール、イミド、−カルバミン酸塩、−シアン酸塩、−アルキン、−フェニル、−ハロフェニル、並びに−ピコリルよりなる群から選択される切断可能ラジカルを示し、
Mは任意に存在し、QとZとに共有結合し、アルキル、アルケニル、アルキン、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アシル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルコキシアミノ、アミド、アルキルイミド、アルケニルイミド、アリールイミド、フルオロアルキル、アルキルリン酸、アルキルチオ、チオアシル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルアンモニウム、アルキルスルホニウム、アルキルシリル、アルキルカルボニル、アルキルカルバニル、アルキルカルバモイル及びアルキルヒドロキシルアミノよりなる群から選択される基を示し、
Zは切断可能基であって−O−、−S−、=SH−、=S=、≡S−、−SiH2−、=SiH−、=Si=、≡Si−、−Se−、=SeH−、≡Se−、=Se=、−SeH2−、−PH−、=P−、=PH=、≡P=、≡PH−、−PH3−、−AsH−、=As−、=AsH=、≡As=、≡AsH−、−ASH3−、アミン、エステル、シリル、アルキル、ベンジル、ニトロベンジル、アミド、炭酸塩、ベンゾイル、パーオキシル、ニトリル、チオール、イミド、カルバミン酸塩、シアン酸塩、ヒドロキシルアミン、スルホキシド、スルホン酸塩、チオスルフィン酸塩、チオエステル、ハロゲン化アシル、ヒポヨージル、アルキン、ハロフェニル、ハロベンジル、ピコイル、ジオール及びジスルフィドよりなる群から選択される基である、Mが−ニトロベンジル−、−ニトロトリル−、−ニトロキシリル−、−ニトロナフチル−、若しくは−ニトロフェニル−基である場合はZは−CH2及び−NHよりなる群から選択される基を示し、
QはR基又はR’基の末端官能基又はエフェクター基であってビオチン、タンパク質、定義された配列のポリヌクレオチド、炭水化物、抗原、ホルモン、神経伝達物質、ジゴキシンなどのグリコシド、特に、グルタチオンなどの、チオール官能基を有する硫黄含有ラジカル、及びカテコールなどの二座配位子よりなる群から選択される基を示し、
R及びR’は個別に又は同時に存在することができ、RとR’とが同時に存在する場合は:各Z基は同一でも互いに異なっていても良く、
M基は同一でも互いに異なっていても良く、
Q基は同一でも互いに異なっていても良く、
「base」は、アデニン、チミン、シトシン、グアニン及びウラシルよりなる群から選択される「天然」窒素塩基並びに当該天然窒素塩基の類似体を示すが、チミンについてはR’が存在しかつQがビオチンから成る場合には、チミンを除外する。
チミン型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を2級アミン基3−NHと結合する(構造Vt)。
シトシン型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を1級アミン基4−NH2と結合する(構造Vc)。
ウラシル型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を2級アミン基3−NHと結合する(構造Vu)。
X1及びX2は互いに同一又は異なる窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子であってMに担持されており、前記修飾ヌクレオチドの窒素塩基と分子内水素結合(この時、この水素結合はそれぞれ相補的ヌクレオチド間における従来の塩基対の形成時に観察される分子間水素結合と同様のものである)を形成することができる。
−X1及びX2が−NH、Tが−NH2、Zが−CH2、Mがメチルニトロベンジル−、Qが−ビオチンであるヌクレオチド、
−X1及びX2が−NH、Tが−NH2、Z、Z1及びZ2がそれぞれ−O−、Mが−ニトロナフチル−、Qが−ビオチンであるヌクレオチド、
−Zが−(C=O)−、Mが−C8H16−、Qが−NH−ビオチニルであるR’基のみ含む化学式(I)のヌクレオチド、
−Z、Z1及びZ2がそれぞれ−(COO)−、Mが−tert−ブチルニトロベンジル−、Qが−NH−ビオチニルである所定の構造(V)を備えたヌクレオチド。
ステップB1:tert−ブチルジメチルシリルクロリド(2.4mmol)を、無水DMF中に1.845mmolの2’−デオキシグアニンと326mgのイミダゾールを含む撹拌溶液に加えた。反応液を室温で20時間撹拌し培養した。溶媒を減圧雰囲気下で除去し、その後残渣をクロマトグラフィで精製して生成物dGTP−B1を得た。
ステップC1:ω1−ビオチンノナン酸(1モル、100μl)のDMF溶液とカルボニルジイミダゾール(1モル、100μl)のDMF溶液とを混合した。室温で30秒放置してイミダゾリドを得た。次いで、混合物にジオキシリボヌクレオチド 5’−三リン酸(50mM、100μl)の水溶液を加えた。反応液を室温で12時間放置して生成物を得た。次いで、反応生成物をアセトンで沈殿後水に溶解させ、クロマトグラフィで精製して生成物FA−ビオ−dNTPを得た。
ステップD1:Et3N(2.2ml)及びDMAP(175mg)を2’−デオキシアデニン(5g)のピリジン溶液に加え、その後DMTCl(5.25g)を加えた。混合物を室温で一晩反応させた。次いで、混合物にEt3N(2.4ml)及びMsCl(1.27ml)を加えた。室温で2時間培養後、混合物を濾過した後、濾液を酢酸エチルによって洗浄した。濾液を濃縮しエタノール(75ml)に溶解し、NaOH(1モル)を加えた。1.5時間還流後、混合物を室温に冷却し、HCl(1モル)を加えた。エタノールはロータリーエバポレータを用いて留去し、残渣をCH2Cl2で抽出した。抽出物をシリカゲルカラムで精製して生成物dATP−D1を得た。
ステップE1:Et3N(2.2ml)及びDMAP(175mg)を2’−デオキシシチジン(5g)のピリジン溶液に加え、次いでDMTCl(5.25g)を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、Et3N(2.4ml)及び(1.27ml)MsClを混合物に加えた。室温で2時間培養後、混合物を酢酸エチルによって濾過後、洗浄した。濾液を濃縮しエタノール(75ml)に溶解させ、NaOH(1モル)を加えた。1.5時間還流後、混合物を室温に冷却し、HCl(1モル)を加えた。エタノールはロータリーエバポレータを用いて留去し、残渣をCH2Cl2で抽出した。次いで、シリカゲルカラムで精製して生成物dCTP−E1を得た。
ステップF1:修飾子カテコールエステル(100μl)のDMF溶液(1モル)をジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(1モル、110μl)及び4−(ジメチルアミノ)ピリジン(100%、5μl)のDMF溶液と混合した。混合物を0℃で5分間培養した。次いでデオキシリボヌクレオチド5’−三リン酸(50mM、500μl)のDMF溶液を混合物に加えた。室温で3時間放置し生成物を得た。次いで得られた生成物をアセトンで沈殿させ、水に溶解させ、クロマトグラフィで精製して生成物FA−Cat−dNTPを得た。
ヌクレオチドの核酸鎖への添加後に実施した以下の実施例7〜11により、前記分子の脱保護の実施例、すなわち修飾基の除去を説明する。
複数の修飾基の切断を以下のプロセスにおいて、同時に実施した。化合物NH2−dT−ニトロB−ビオの20mM水溶液を350〜700mMのNaNO2及び1モルのNaOAcを含む溶液(pH:5.5)で処理した。波長365ナノメートルの紫外線を照射し、室温で1〜2分間培養後、1モルのリン酸塩バッファ(pH:7.0)を加えて反応を停止させ、照射を停止した。脱保護反応液はdTとした。
複数の修飾基の切断を以下のプロセスにおいて同時に実施した:NH2−dG−ニトロN−ビオの20mM水溶液を350〜700mMのNaNO2及び1モルのNaOAcを含む溶液(pH:5.5)で処理した。波長365ナノメートルの紫外線を照射し、室温で1〜2分間培養後、1モルのリン酸塩バッファ(pH:7.0)を加えて反応を停止させ、照射を停止した。脱保護反応液はdGとした。
3’−OH端に担持された修飾基の切断を、1〜100mMのアンモニア水溶液中におけるエステル官能基の加水分解(室温、1時間)により実施した。これによりdN型の生成物を得た。
窒素塩基に担持された修飾基の切断を光切断により実施した。化合物dA−ニトロB−ビオに対し、室温で波長300〜370ナノメートルのUV源からの紫外線照射を行った。UV源からの紫外線照射を30〜300秒後に停止させ、生成物dAを得た。。
窒素塩基に担持された修飾基の切断を化学的切断により実施した。化合物dC−ニトロB−ビオ(0.01mmol)をエタノール(0.1ml)中に溶解させた。テトラクロロパラジウム(II)酸ナトリウム(0.02mmol)のエタノール溶液を加えた。混合物を20分間撹拌後、混合物に二水素ガスが泡立った。これにより生成物dCを得た。
変形例として使用することができる。。
本発明の主題である修飾ヌクレオチドは、特許出願FR14−53455に記載の方法により鋳型鎖の非存在下における核酸の酵素的合成に有利に用いることができる。修飾ヌクレオチド添加ステップの実施にあたり選択される酵素としては、市販のTerminal Deoxynucleotidyl Transferase又はTdTがある。
Claims (15)
- 核酸の酵素的合成のための修飾ヌクレオチドであって、「天然」窒素塩基又は天然窒素塩基の類似体、リボース又はデオキシリボース炭水化物、及び少なくとも一つのリン酸基を有し、
修飾基と呼ばれる少なくとも一つのR基又はR’基を、前記天然窒素塩基もしくはその類似体、及び/又は、リボース分子もしくはデオキシリボース分子の3’位置の酸素により、担持されて含んでおり、それは核酸合成中に、前記ヌクレオチドの重合を抑止し及び/又は前記ヌクレオチドのタンパク質などの、他のヌクレオチドとは異なる、他の分子との相互作用を可能にし、ここでRは少なくとも一つの官能性末端基を含み、下記化学式(I)、(III)、(IV)のうちの1つの形態である修飾ヌクレオチド:
(ここで(PP)POは、モノ−、ジ−、又は三リン酸塩基を示し、
(OH)はリボース又はデオキシリボース分子であって良く、
Tは水素、又は、−NH2、−N3、−(C=O)H、−CnH2n+1(n=1〜30、好ましくは1〜12)、−トリメチルシリル、−リン酸塩、−SO3、−(C=O)OCnH2n+1(n=1〜30、好ましくは1〜12)、−(C=O)SCnH2n+1(n=1〜30、好ましくは1〜12)、−ニトロベンゼン、−ベンジル、−ハロベンジル、−アミド、−炭酸塩、−ベンゾイル、−パーオキシル、−ニトリル、−チオール、−イミド、−カルバミン酸塩、−シアン酸塩、−アルキン、−フェニル、−ハロフェニル、並びに−ピコリルよりなる群から選択される切断可能ラジカルを示し、
Mは任意に存在し、QとZとに共有結合し、アルキル、アルケニル、アルキン、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アシル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルコキシアミノ、アミド、アルキルイミド、アルケニルイミド、アリールイミド、フルオロアルキル、アルキルリン酸、アルキルチオ、チオアシル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルアンモニウム、アルキルスルホニウム、アルキルシリル、アルキルカルボニル、アルキルカルバニル、アルキルカルバモイル及びアルキルヒドロキシルアミノよりなる群から選択される基を示し、
Zは切断可能基であって、−O−、−S−、=SH−、=S=、≡S−、−SiH2−、=SiH−、=Si=、≡Si−、−Se−、=SeH−、≡Se−、=Se=、−SeH2−、−PH−、=P−、=PH=、≡P=、≡PH−、−PH3−、−AsH−、=As−、=AsH=、≡As=、≡AsH−、−ASH3−、アミン、エステル、シリル、アルキル、ベンジル、ニトロベンジル、アミド、炭酸塩、ベンゾイル、パーオキシル、ニトリル、チオール、イミド、カルバミン酸塩、シアン酸塩、ヒドロキシルアミン、スルホキシド、スルホン酸塩、チオスルフィン酸塩、チオエステル、ハロゲン化アシル、ヒポヨージル、アルキン、ハロフェニル、ハロベンジル、ピコイル、ジオール及びジスルフィドよりなる群から選択される基であるか、Mが−ニトロベンジル−、−ニトロトリル−、−ニトロキシリル−、−ニトロナフチル−、若しくは−ニトロフェニル−基である場合はZは−CH2及び−NHよりなる群から選択される基を示し、
QはR基又はR’基の末端官能基又はエフェクター基であってビオチン、タンパク質、定義された配列のポリヌクレオチド、炭水化物、抗原、ホルモン、神経伝達物質、ジゴキシンなどのグリコシド、特に、グルタチオンなどの、チオール官能基を有する硫黄含有ラジカル、及びカテコールなどの二座配位子よりなる群から選択される基を示し、
R及びR’は個別に又は同時に存在することができ、RとR’とが同時に存在する場合は:
各Z基は同一でも互いに異なっていても良く、
M基は同一でも互いに異なっていても良く、
Q基は同一でも互いに異なっていても良く、
「base」は、アデニン、チミン、シトシン、グアニン及びウラシルよりなる群から選択される「天然」窒素塩基並びに当該天然窒素塩基の類似体を示すが、チミンについてはR’が存在しかつQがビオチンから成る場合には、チミンを除外する)
ことを特徴とするヌクレオチド。 - 合成に係る鎖に対し相補的な鋳型核酸鎖の存在に通常依存するポリメラーゼの基質として、相補的鎖が存在しない場合においてさえ用いることができることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載のヌクレオチド。
- R基又はR’基の末端官能基Qが、以下の相互作用対の一方又は他方により、核酸以外の分子と相互に作用することができることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載のヌクレオチド。:抗原/抗体、ホルモン/受容体、ビオチン/(ストレプト)アビジン、神経伝達物質/受容体、ポリメラーゼ/プロモータ、ジゴキシン/アンチジゴキシン、炭水化物/レクチン、硫黄含有基/金などの金属、グルタチオン/グルタチオンS−トランスフェラーゼ、及び二座配位子/金属酸化物。
- X1及びX2が−NH、Tが−NH2、Zが−CH2、Mがメチルニトロベンジル−、Qが−ビオチンであることを特徴とする請求項3に記載のヌクレオチド。
- X1及びX2が−NH、Tが−NH2、Z、Z1及びZ2がそれぞれ−O−、Mが−ニトロナフチル−、Qが−ビオチンであることを特徴とする請求項3に記載のヌクレオチド。
- 化学式(I)のヌクレオチドであって、修飾基としてR’基のみ含んでおり:Zが−(C=O)−、Mが−C8H16−、Qが−NH−ビオチニルであることを特徴とする請求項1に記載のヌクレオチド。
- Z、Z1及びZ2がそれぞれ−(COO)−、Mが−tert−ブチルニトロベンジル−、Qが−NH−ビオチニルである所定の構造(V)であることを特徴とする請求項2に記載のヌクレオチド。
- T並びにZもしくはZ1及びZ2は、核酸合成において前記ヌクレオチドに対する波長10−3〜10−11メートルの電磁放射線、特に紫外線への曝露により切断可能であることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1つに記載のヌクレオチド。
- 請求項1〜10のいずれか1つに記載のヌクレオチドの、特に酵素合成法を用いた遺伝子、合成核酸配列、DNA、RNA、又は核酸ポリマーの製造方法における使用。
- 請求項1〜11のいずれか1つに記載のヌクレオチドの、前記ヌクレオチドを固体担持体上に予め固定したポリヌクレオチド鎖に組み込むための使用。
- 前記ポリヌクレオチド鎖がその5’末端において結合しかつその3’末端に前記ヌクレオチドを組み込むことによる請求項12に記載のヌクレオチドの使用。
- 請求項1〜13のいずれか1つに記載の修飾ヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸合成のためのキット。
- 複数の修飾ヌクレオチド、伸長酵素及び前記ヌクレオチドの少なくとも一つを結合させることができる固体担持体を含む、請求項12との組合せる請求項14に記載のキット。
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