KR20170047163A - 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분자마커를 벼 작물에 적용하면, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 벼 작물을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 벼 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 벼 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof}
본 발명은 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물, 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이, 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법에 관한 것이다.
작물 개량을 위해 분자유전학을 이용하는 목표 중의 하나는 필요한 유용유전자의 탐색, 특성 규명, 분리 및 이용을 통해 우수한 신품종을 육성하는 것이다. 지난 10여 년 동안 작물의 게놈(genome) 연구를 위한 다양한 기술이 개발되었는데, 이 중 DNA 표지인자를 이용한 기술은 전통적인 육종 방법으로 해결하기 힘든 여러 문제들에 대한 해법을 제시해 주고 있으며, 대표적인 것들로 양적형질 유전자좌(QTL: quantitative trait locus)의 분석과 야생종 등의 유전자원에서 유용유전자의 탐색 및 이용 등을 들 수 있다.
식물 게놈 분석 기술의 진보로 양적형질 유전자좌에 관여하는 유전적 변이의 연구가 가능해졌으며, 목표유전자의 이전 및 선발에 MAS(marker-assisted selection)가 효율적으로 이용될 수 있게 되었는데, 특히 양적형질 유전자좌 (QTLs: quantitative trait loci) 분석은 분자표지인자를 이용하고 측정이 가능한 형질에 관여하는 염색체의 특정 부분을 확인함으로써, 특정 환경에서 수량성, 과실 무게, 출수기 등 주요 형질에 관여하는 유전자의 수 및 염색체 위치, 개개 유전자의 영향력, 상위작용, 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 유전적인 배경과의 상호작용 등 주요 농업형질의 유전적 배경에 대한 전반적이고 직접적인 정보를 얻을 수 있다.
야생벼는 작물의 수량성뿐만 아니라 병해충저항성, 스트레스 저항성 및 이와 관련된 형질들의 개선을 위한 유용 유전자들의 중요한 공급원이다. 야생 유용유전자를 탐색하여 이들을 재배종에 도입하고 마커를 이용하여 선발하는(marker-assisted selection) 일련의 기술은 수량성, 각종 저항성 등을 개선하는데 있어서 효과적인 수단으로 알려져 있다. 현재, 전 세계적으로 유전자은행에 보관중인 많은 양의 유전자들이 수량 및 기타 유용한 형질들에 관여하는 새로운 유전자들을 탐색하는데 있어서 기초 연구 자료로 광범위하게 활용되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1255336호에는 미량 원소 함량이 증가된 벼 품종 및 이를 이용한 기능성 식품에 대해 개시하고 있으며, 일본공개특허 제2011-131023호에는 벼의 철 등의 금속 착체 흡수 또는 수송에 관여하는 트랜스포터 및 그 유전자에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 아직 언급된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼의 종자 무게를 조절한다고 알려진 GW2 유전자가 아연 함량조절에도 관여한다는 것을 확인하였다. 따라서, GW2 유전자 분석을 통해 GW2 유전자의 염기서열 중에 316번째 염기가 결손(Deletion)되어 야생형(wild type)에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 용이하게 선별할 수 있는 분자마커를 개발하여 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분자마커를 벼 작물에 적용하면, 야생형(wild type)에 비해 아연 함량이 증가된 벼 작물을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 벼 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 벼 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 HG101의 양적형질 유전자좌(QTL)를 분석한 결과(A)이며, 화성벼(Hwaseong)와 HG101의 종자 크기를 비교한 결과(B)이다. HG101은 화성벼의 유전적 배경에 야생벼(Oryza grandiglumis)의 염색체가 부분적으로 이전된 근동질계통(near-isogenic lines, NILs)을 나타낸 것이다.
도 2는 화성벼(Hwaseong)와 HG101에서 현미 및 왕겨의 아연 함량(A)과 종자크기(B)를 비교한 결과이다.
도 3은 11개의 벼 품종에서 현미의 아연 함량을 비교한 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 서열번호 1은 야생형(wild type)인 GW2 유전자의 염기서열을 나타내며, 상기 316번째 염기는 A(adenine)을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기(A) 및 316번째 염기(C)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 서열번호 2의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째인 A(adenine)가 결손(Deletion)된 GW2 유전자의 염기서열로서 서열번호 1의 염기서열 중 315번째 염기가 A(adenine)이고, 316번째 염기인 A(adenine)가 결손되었으며, 317번째 염기가 C(cytosine)인 염기서열을 나타내는 것이다. 따라서, 서열번호 2의 염기서열에서 315번째 염기는 A이고 316번째 염기는 C이다.
서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는 식물은 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물이므로, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기 결손 여부를 검출할 수 있는 프라이머 세트이어야 한다. 따라서, 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손됨으로 인해 315번째 염기와 317번째 염기가 인접하게 되며, 상기 프라이머 세트는 인접된 315번째 염기와 317번째 염기, 즉 서열번호 2의 315번째 염기(A)와 316번째 염기(C)를 포함하는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트이어야 한다. 이러한 프라이머는 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기(A) 및 316번째 염기(C)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하여 증폭 산물이 생성되면 식물 시료는 아연 함량이 야생형에 비해 증가된 시료인 것이며, 증폭 산물이 생성되지 않으면 아연 함량이 증가되지 않은 야생형으로 판별할 수 있는 것이다. 즉, 야생형은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손되지 않고 남아 있어 프라이머 어닐링이 되지 않아 본 발명의 프라이머 세트로는 증폭 산물이 생성되지 않는 것이다.
본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 8개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 15개 내지 50개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 15개 내지 30개의 뉴클레오티드, 더 더 바람직하게는 15개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴(biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프로브를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에서 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 마이크로어레이는 본 발명의 분자마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 올리고뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트는 상기 프로브 또는 상기 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손된 서열에 특이적인 프라이머 세트이므로, 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하여 증폭 산물이 생성되면 벼 시료는 아연 함량이 야생형에 비해 증가된 시료인 것이며, 증폭 산물이 생성되지 않으면 아연 함량이 증가되지 않은 야생형으로 판별할 수 있는 것이다.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 증폭 산물이 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기(A) 및 316번째 염기(C)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 서열분석, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 서열분석 방법은 Sanger 방법, 마이크로 전기영동 서열분석, 파이로 서열분석, 나노 포어 단일 DNA 서열분석 등을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 양적형질 유전자좌 ( QTL , quantitative trait loci ) 분석
화성벼를 자방친, 야생벼(Oryza grandiglumis , CCDD 게놈, IRGC Acc. no. 101154)를 화분친으로 하여 생산된 F1에 화성벼를 반복친으로 여교잡하여 BC5F1 후대를 작성하였으며, 이들을 자식시킨 후 표현형적으로 고정된 한 계통을 선정하여 HG101이라 명명하였다. HG101은 화성벼의 유전적 배경에 야생벼(Oryza grandiglumis)의 염색체가 부분적으로 이전된 근동질계통(near-isogenic lines, NILs)으로 종자중 등 작물학적 특성에서 화성벼와 차이를 보였다. HG101로 이전된 특정 염색체 단편이 어느 형질에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 화성벼/HG101 간 교잡을 실시하여 150개의 F2:3 계통을 육성하였다. 150개 계통과 양친을 난괴법 2반복으로 포장에 공시하여 출수기 등 주요 특성을 조사하고, 야생벼(Oryza grandiglumis)의 특이적 밴드와 형질 간의 관련성을 알아보기 위해 유전자지도를 작성하고 QTL 분석을 실시하였다. 그 결과, 염색체 2번의 마커 RM290 지역에서 종자중(tgw2) 종자폭(gw2) 및 종자두께(gt2)에 관여하는 QTL이 탐지되었다(도 1A). 또한, 도 1B에 개시된 바와 같이 화성벼(Hwaseong)와 HG101의 종자 크기가 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. GW2 유전자의 염기서열 분석 및 아연 함량 조절 확인
상기 실시예 1에서 QTL로 탐지된 종자중에 관여하는 GW2 유전자의 특징은 중국 연구자들에 의해 보고되었다. GW2의 모본인 FAZ1 대립유전자의 게놈 및 cDNA의 서열비교를 통해, 8개 엑손(exon) 및 7개 인트론(intron)을 확인하였으며, FAZ1 GW2 대립유전자는 약 47kDa의 425개의 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예상하였다. GW2의 FAZ1 및 종자중이 큰 벼 품종인 WY3 대립유전자의 염기서열 비교를 통해, 엑손 1 및 8에서 아미노산 변이를 일으키지 않는 2개의 염기 치환(substitution)과 WY3 대립유전자의 엑손 4에서 조기중지코돈(premature stop codon)을 야기하는 1bp 결손(deletion)을 확인하였다. 상기 조기중지코돈은 310개 아미노산 잔기의 절단(truncation)을 유도하였으며, 잔여 단백질은 13kDa의 115개의 폴리펩티드로 구성되었다(Song et al. 2007. Nature Genetics 39(5) A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase).
중국 연구자들에 의해 분석된 종자중에 관여하는 GW2 유전자에 대하여 본 발명에서는 상기 GW2 유전자의 추가적인 기능을 확인하기 위해, 미량원소 함량을 측정하였다. 아연 함량을 조사하기 위해 포장에서 수확한 정조에서 현미와 왕겨를 분리하였다. 시료당 200립을 채취하여 현미와 왕겨로 분리하여 각각 무게를 측정한 후 160℃에서 65%의 질산(nitric acid)으로 분해하였다. 아연 함량은 ICP-MS(inductively coupled plasma mass spectrometry; Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 두 계통 간에 아연(Zn) 함량의 차이가 있음을 확인하였다(도 2). 현미(grain)에서는 HG101(gw2 ql)이 종자 1kg에 34mg으로 화성벼(HS)의 28mg보다 약 22% 정도 높았고, 왕겨(husk)는 화성벼가 약 34% 높았는데 이러한 결과는 왕겨에서 현미로의 아연 전이효율성이 HG101에서 더 높다는 것을 시사한다. 또한, 종자중에 관여하는 GW2 유전자가 동시에 아연함량을 조절하는지 알아보기 위해, 150개 계통 중에서 출수기가 화성벼와 유사한 56개 계통을 선정하여 GW2와 밀접히 연관된 RM290 유전자형 간에 아연함량의 차이를 확인하였다. 그 결과, 표 1에 개시된 바와 같이 마커 유전자형에 따른 아연함량의 차이가 고도로 유의한 것을 확인할 수 있었다(P<0.02).
RM12813의 유전자형별 계통의 아연함량 비교
염색체 마커 특징 P 특징 평균
HH＠ GG＠
2 RM12813 Zn 함량 0.02 25.8(21)＆ 28.8(27)
@: 화성벼와 HG101 동형접합체의 상대적인 표현형 평균값, &: 각각의 유전자형 클래스에서 라인 수.
또한, HG101의 염기서열을 분석한 결과, 중국연구자들이 사용한 종자중이 큰 벼 품종인 WY3가 보인 염기서열과 동일한 변이를 보인 것으로 보아, 동일한 기작에 의해 종자중 및 아연함량이 조절되는 것으로 판단된다. 전 세계적으로 다양한 대립벼 유전자원이 존재하는데 중국연구자들이 대립벼인 JZ1560도 GW2 유전자에서 WY3와 동일한 염기변이를 보임을 보고하였다(Ying et al. 2012. Journal of Genetics and Genomics 39: 325-333). 그리고 2종의 대립벼(JZ1581 및 SLG1)와 국내 육성종 5종(화선찰, 드래찬, 화성벼, 보람찬, 일품)의 아연함량을 조사한 결과, HG101 및 WY3와 동일한 염기변이를 보이는 대립벼인 JZ1581 및 SLG1가 국내 육성종에 비해 통계적으로 유의하게 높은 아연함량을 보였다(도 3). 이는 GW2 유전자가 종자중에 관여하는 동시에 아연함량의 조절에도 관여함을 보여주는 결과이다.
따라서, 본 발명에서 육성된 HG101 등 후대계통들은 종간잡종에서 유래한 계통으로 앞으로 아연함량이 증진된 계통을 육성하는데 중요한 교배모본으로 이용될 수 있을 것이다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof <130> PN16381 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1278 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggggaaca ggataggggg gaggaggaag gcgggggtgg aggagaggta cacgaggccg 60 caggggctgt acgagcacag ggacatcgac cagaagaagc tccggaagct gatcctcgag 120 gccaagctcg cgccgtgcta catgggcgcc gacgacgccg ccgccgccgc cgacctcgag 180 gagtgcccca tctgcttcct gtactaccca agtcttaacc gatcaaagtg ttgctcaaaa 240 gggatatgca ccgagtgctt tctccaaatg aaaccaactc acactgctca gcctacacaa 300 tgtccattct gcaaaactcc cagttatgct gtggagtatc gtggtgtaaa gacaaaggag 360 gaaaggagca tagaacaatt tgaagagcag aaagtcatag aagcacaaat gaggatgcgc 420 cagcaagcac ttcaagatga agaagataag atgaaaagaa aacagaacag gtgctcttct 480 agcagaacaa tcacaccgac caaagaagtg gagtatagag atatttgcag cacatccttt 540 tcagtgccgt cataccgatg tgctgagcaa gaaactgaat gctgttcatc ggaaccttca 600 tgctctgccc agactagcat gcgccctttc cattctaggc ataaccgtga tgataacatt 660 gacatgaata tagaggatat gatggttatg gaagcgattt ggcgttccat tcaggagcag 720 ggaagtatag ggaatcctgt ctgtggcaac tttatgcctg taactgagcc atctccgcgt 780 gaacgccagc cattcgttcc agctgcttct ctagaaatac ctcatggtgg tggattttcc 840 tgtgcggttg cggcaatggc tgagcaccag ccacccagta tggacttctc ttacatggct 900 ggcagcagcg cattcccagt tttcgacatg ttccggcgac catgcaacat tgctggtgga 960 agcatgtgta atctggagag ctcaccggag agctggagcg ggatagcacc aagctgcagc 1020 agggaagtgg taagagaaga aggagagtgc tcggctgacc actggtcgga gggtgcagag 1080 gccggaacaa gctacgcggg ctcagacatc gtggcagatg ccgggaccat gccgcagctg 1140 cctttcgccg agaacttcgc catggcgcca agccacttcc gcccggagag catcgaagaa 1200 cagatgatgt tttccatggc tctttcttta gcagatggtc atggaagaac acactcgcaa 1260 gggttggcat ggttgtag 1278 <210> 2 <211> 1277 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atggggaaca ggataggggg gaggaggaag gcgggggtgg aggagaggta cacgaggccg 60 caggggctgt acgagcacag ggacatcgac cagaagaagc tccggaagct gatcctcgag 120 gccaagctcg cgccgtgcta catgggcgcc gacgacgccg ccgccgccgc cgacctcgag 180 gagtgcccca tctgcttcct gtactaccca agtcttaacc gatcaaagtg ttgctcaaaa 240 gggatatgca ccgagtgctt tctccaaatg aaaccaactc acactgctca gcctacacaa 300 tgtccattct gcaaactccc agttatgctg tggagtatcg tggtgtaaag acaaaggagg 360 aaaggagcat agaacaattt gaagagcaga aagtcataga agcacaaatg aggatgcgcc 420 agcaagcact tcaagatgaa gaagataaga tgaaaagaaa acagaacagg tgctcttcta 480 gcagaacaat cacaccgacc aaagaagtgg agtatagaga tatttgcagc acatcctttt 540 cagtgccgtc ataccgatgt gctgagcaag aaactgaatg ctgttcatcg gaaccttcat 600 gctctgccca gactagcatg cgccctttcc attctaggca taaccgtgat gataacattg 660 acatgaatat agaggatatg atggttatgg aagcgatttg gcgttccatt caggagcagg 720 gaagtatagg gaatcctgtc tgtggcaact ttatgcctgt aactgagcca tctccgcgtg 780 aacgccagcc attcgttcca gctgcttctc tagaaatacc tcatggtggt ggattttcct 840 gtgcggttgc ggcaatggct gagcaccagc cacccagtat ggacttctct tacatggctg 900 gcagcagcgc attcccagtt ttcgacatgt tccggcgacc atgcaacatt gctggtggaa 960 gcatgtgtaa tctggagagc tcaccggaga gctggagcgg gatagcacca agctgcagca 1020 gggaagtggt aagagaagaa ggagagtgct cggctgacca ctggtcggag ggtgcagagg 1080 ccggaacaag ctacgcgggc tcagacatcg tggcagatgc cgggaccatg ccgcagctgc 1140 ctttcgccga gaacttcgcc atggcgccaa gccacttccg cccggagagc atcgaagaac 1200 agatgatgtt ttccatggct ctttctttag cagatggtca tggaagaaca cactcgcaag 1260 ggttggcatg gttgtag 1277

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물.
  2. 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트.
  3. 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프로브.
  4. 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 마이크로어레이.
  5. 제2항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트.
  7. 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 서열분석, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법.
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