KR20170038626A - 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리 추출물 중의 적어도 어느 하나를 함유하는 조성물을 구비한 복합 천연 방부제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 부작용 및 독성이 적은 천연추출물에서 유도되는 천연 추출 항균제 조성물을 함유하는 천연방부제로서, 황금(Skullcap, Scutellaria barbata) 및 청호(Artemsia annua)의 혼합으로부터 추출한 항균 조성물을 유효성분으로 포함하는 구성을 마련하여, 인체 안전성 시험에서 독성이나 자극도 발생하지 않아 인체사용에 있어 안전한 물질인 황금로부터 추출을 포함한 항균 조성물을 방부 목적으로 화장품, 식품 및 의약품 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제 및 그 제조방법{Complex natural preservative comprising scutellaria extract and method manufacture the same}

본 발명은 천연 추출물을 함유하는 조성물을 구비한 복합 천연 방부제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 특히 상세하게는 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리 추출물 중의 적어도 어느 하나를 함유하는 조성물을 구비한 복합 천연 방부제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

사회 경제적 발전으로 인해 개인적 관리의 하나로 외모에 대한 중요성이 높아지고, 화장품 및 관련 산업규모가 증대되면서 화장료 및 개인관리 상품의 품질에 대한 소비자의 관심 또한 커지고 있다. 즉, 소득이 증가하고, 청결이 중시되며, 외모에 대한 관심이 고조됨에 따라서 스킨, 로션, 크림, 에센스, 샴푸, 비누, 치약, 및 세정제 등의 각종 화장료의 사용량이 증가되고 있다.

이러한 화장품류는 자주 개봉하며, 사용빈도가 높아서 오염이 쉽게 되는 특징을 가지며 방부제의 사용을 필요로 하는 제품류이다.

화장품에 사용되는 방부제는 주로 합성된 원료를 사용하는 방부제가 주류를 이루고 있다. 합성방부제는 비록 방부능력이 우수하다 할지라도 피부에 미치는 부작용을 완전히 제거하지 못하여 사용자의 건강에 어느 정도 영향을 미치는 점이 문제로 대두하고 있다. 특히 최근 천연물 또는 유기농 천연물을 원료로 사용하는 화장품류에 대한 기대가 높아지면서 이에 어울리는 방부제에 대한 요구도 증대되고 있다.

즉, 식품, 의약품, 화장품 등의 많은 제품의 품질을 오랫동안 유지하기 위해 미생물의 의한 부패를 방지하는 방부제가 필수적으로 포함되어 있다. 기존의 방부제로서 가장 안전하며 화장품, 의약품에 범용적으로 사용되는 파라벤류의 방부제는 피부 알레르기(Andrea Counti et al., Contact Dermatitis, 1997, 37; 35-36)와 환경 호르몬으로서의 가능성(Edwin et al., Toxicology and applied pharmacology, 1998, 153; 12-19) 및 내성균 유발이라는 문제점을 가지고 있다.

화장품의 경우, 인체에 직접 사용하고, 포장을 개봉한 후에 비교적 장기간 사용하게 되며, 제품의 특성상 변질이 쉽기 때문에 방부 처리를 하는 것이 필수적이다. 이에 따라, 종래에는 화학물질을 합성하여 이루어지는 합성 방부제를 일정 함량 화장품에 첨가함으로써, 화장품의 변질, 부패를 방지하였다. 이러한 합성 방부제는 화장품에 대해 방부 효과가 탁월하기는 하지만, 화학물질을 합성하여 이루어지는 화학제품이므로 화장품 사용자의 건강에 영향을 미치며, 당연히 건강과 웰빙을 중시하는 화장품 사용자의 요구나 사회 경향과는 배치된다는 문제점이 있다.

또한, 천연활성 물질들은 대부분 색취, 안정성 저하, 좁은 항균스펙트럼, 제형상의 문제점 등으로 인하여 상용화되지 못하고 있으며, 나한백 추출물인 히노키티올(hinokitiol)과 목련 추출물인 마그놀롤(magnolol), 자몽추출물인 DF-100 등 극히 일부만이 상용화되고 있는 실정이다. 이 중에서 가장 제품개발에 앞선 DF-100의 항균력은 DF-100에 포함된 유기산 및 합성보존료인 벤제토늄클로라이드(benzethonium chloride) 때문인 것으로 알려져 있으며, 그 외 다른 천연항균제 등은 경제성이 낮거나 좁은 항균스펙트럼 또는 물성에 의한 상용범위의 제한성 등의 문제가 있어 보다 진보되고 제품화개발이 가능한 천연항균제가 절실한 실정이다. 따라서 기존의 합성방부제의 부작용을 줄이고 동시에 폭넓은 항균스펙트럼, 제형상의 안정성 등을 보유한 천연방부제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 기술의 일 예가 하기 문헌 1 및 2 등에 개시되어 있다.

예를 들어, 하기 특허문헌 1에는 황금 추출물 10 내지 40 중량부, 목단피 추출물 10 내지 30 중량부 및 자몽종자 추출물 15 내지 40 중량부를 포함하는 천연 방부제 조성물에 대해 개시되어 있다.

또 하기 특허문헌 2에는 용아초 추출물, 황련 추출물 및 용정차 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 항균용 천연 복합 방부제 조성물로서, 상기 용아초 추출물 : 상기 황련 추출물 : 상기 용정차 추출물의 중량비는 2:1:2인 천연 복합 방부제 조성물에 대해 개시되어 있다.

또 하기 특허문헌 3에는 유자씨를 유산균 배양배지에 혼합하여 발효시켜 유자씨 발효 추출물을 얻는 단계, 유자씨로부터 유자씨 추출물을 얻는 단계, 황금으로부터 황금 추출물을 얻는 단계, 팔각회향으로부터 팔각회향 추출물을 얻는 단계 및 상기 유자씨 발효 추출물 1 내지 60 중량%, 유자씨 추출물 1 내지 30 중량%, 황금 추출물 1 내지 80 중량% 및 팔각회향 추출물 1 내지 60 중량%를 혼합시키는 단계를 포함하는 천연 방부제의 제조 방법에 대해 개시되어 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-0762303호(2007.09.20 등록) 대한민국 등록특허공보 제10-1525976호(2015.05.29 등록) 대한민국 등록특허공보 제10-1532005호(2015.06.22 등록)

주로 화장품에 사용되는 안식향산과 화장품을 비롯한 외용제에 사용하는 파라벤, 이미다졸 우레아 및 클로로페네신 등은 제형의 안정성 및 방부 유효성은 우수하지만 독성, 피부자극 및 알레르기를 유발할 수 있다는 단점이 있었다.

또 상기와 같은 종래의 기술에서 천연물의 방부제를 제시하였지만, 그 추출과정이 번잡하고 방부력이 저하된다는 문제가 있었다.

본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 천연물 유래의 재료로 이루어져서 인체에 대한 부작용이 없기 때문에 인체에 직접 접촉하는 제품에 적합하며, 특히 유기농 화장품류에 사용이 적합한 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 그람양성 및 그람음성균, 효모, 곰팡이에 매우 우수한 항균력을 가진 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물추출물을 이용하여 최적의 혼합비로 배합하여 항균활성이 우수하고, 항균 스펙트럼에서도 폭넓은 범위를 가지는 인체에 안전한 복합 천연 방부제 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 천연방부제는 부작용 및 독성이 적은 천연추출물에서 유도되는 천연 추출 항균제 조성물을 함유하는 천연방부제로서, 황금(Skullcap, Scutellaria barbata) 및 청호(Artemsia annua)의 혼합으로부터 추출한 항균 조성물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 천연방부제에서, 님잎(Neem leaves, Azadirachta indica), 라벤더(Lavender, Lavandula angustifolia) 및 로즈마리(Rosemary, Rosmarinus officinalis) 중의 적어도 하나로부터 추출한 항균 조성물을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 천연방부제에서, 상기 항균 조성물은 화장품, 식품 또는 의약품 중의 어느 하나에 포함되는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 천연방부제에서, 상기 항균 조성물은 화장품, 식품 또는 의약품의 완제품 100 중량부에 대해 0.1 내지 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 천연방부제에서, 상기 추출은 정제수, 알콜, 70% 에탄올, 100% 에탄올, 에틸아세테이트 또는 디메틸클로로메탄으로 실행되는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 천연방부제에서, 상기 추출은 70% 에탄올로 실행된 후, EtOAc, n-BuOH, CH₂Cl₂에 의해 분획 추출되고, 상기 항균 조성물은 조성물 100 중량부에 대해 EtOAc로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 청호 황금 20~50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 천연방부제의 제조방법은 부작용 및 독성이 적은 천연추출물에서 유도되는 천연 추출 항균제 조성물을 함유하는 천연방부제의 제조방법으로서, (a) 허브로서 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리를 각각 마련하여 건조하는 단계, (b) 상기 단계 (a)에서 건조된 허브에서 정제수, 알콜, 70% 에탄올, 100% 에탄올, 에틸아세테이트 또는 디메틸클로로메탄을 이용하여 유효 성분을 추출하는 단계, (c) 상기 단계 (b)에서 추출된 유효 성분을 여과하여 농축하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (b)에서의 추출은 분획여두에서 극성을 달리하는 용매인 CH₂Cl₂, EtOAc, BuOH, 정제수로 순차적으로 분획하여 실행되는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 천연 방부제 조성물 및 이의 제조방법에 의하면, 다양한 균들에 대한 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 나타내며, 인체 안전성 시험에서 독성이나 자극도 발생하지 않아 인체사용에 있어 안전한 물질인 황금로부터 추출을 포함한 항균 조성물을 방부 목적으로 화장품, 식품 및 의약품 등에 유용하게 사용할 수 있다는 효과가 얻어진다.

또, 본 발명에 따른 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제 및 그 제조방법에 의하면, 천연물로서 안전성이 우수한 황금 추출물을 유효성분으로 함유하고, 항균 효과가 우수한 청호로부터 추출한 항균 조성물을 사용하므로, 화장품, 의약품, 세제류 등에 방부 효과를 제공할 수 있다는 효과도 얻어진다.

도 1은 본 발명에 적용 천연방부제를 제조하기 위한 허브 추출을 설명하기 위한 공정도,
도 2는 분획 추출물의 제조 과정을 나타내는 도면,
도 3은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 항균효과 결과를 나타낸 사진,
도 4는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균효과 결과를 나타낸 사진,
도 5는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균효과 결과를 나타낸 사진,
도 6은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균효과 결과를 나타낸 사진,
도 7은 진균류인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균효과 결과를 나타낸 사진,
도 8은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 대한 항균효과 결과를 나타낸 사진,
도 9는 70% 에탄올 추출물의 분획추출에 의한 항균효과를 나타낸 사진,
도 10은 1~6일까지 배양하여 관찰한 상태를 나타내는 사진.

본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

본 발명에 적용되는 항균 조성물을 유효성분으로 포함하는 천연방부제에 사용된 약초(medicinal herb)로서 허브는 황금(Skullcap, Scutellaria barbata), 청호(Artemsia annua), 님잎(Neem leaves, Azadirachta indica), 라벤더(Lavender, Lavandula angustifolia), 로즈마리(Rosemary, Rosmarinus officinalis) 중의 적어도 하나를 포함한다. 이하, 설명에서 사용된 용어로서, 허브의 종류를 특정하지 않는 한 '허브'는 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리의 각각 또는 이들의 혼합물인 것을 의미한다.

본 발명에 적용되는 황금(Skullcap, Scutellaria baicalensis)은 다년생 초본식물인 속썩은풀 꿀풀과의 뿌리로서, 그대로 또는 주피를 제거한 것이다. 황금에는 바이칼린, 바이칼레인, 위고닌 등의 플라보노이드 성분이 35% 이상 함유되어 있다. 이 성분은 항염작용은 물론 항암, 항바이러스, 항산화 효과가 있으며(Kim, E.N. et al., 2008), 생약제로서 황금은 한방에서 청열, 해독 등의 다양한 약리적 효능을 나타낸다(Yang, J.H. et al., 2006).

본 발명에 적용되는 청호(Artemisiae Annuae Herba)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 개똥쑥(Artemisia annua Linne) 또는 개사철쑥(Artemisia apiacea Hance)의 지상부를 의미한다. 청호에 포함된 암세포만을 골라 죽일 수 있다는 아르테미신이라는 물질은 기존의 항암제보다 1200배나 강한 진정성분으로 알려졌다. 또한, 청호는 해열진통, 면역증강, 간 기능 보호, 항말라리아 작용 등의 효능이 있는 것으로 알려졌다.

님잎(Neem leaf, Azadirachta indica)은 멀구슬나무과에 속하는 님나무(Azadirachta indica)의 잎 부위를 의미한다. 님나무는 상록활엽교목으로 인도, 파키스탄, 스리랑카 등이 원산지이며, 오랫동안 민간의료용으로 다방면에 이용하여 왔다. 말라리아, 뇌염 등을 예방하고 특히 옴이나 천연두, 외부기생충의 치료에 사용하여 왔으며 당뇨병 치료에도 사용된다. 님잎 추출물은 아자디라크틴 성분을 함유하며 유아에게 적용 가능할 정도로 안전한 진정성분이다.

라벤더(Lavender, Lavandula angustifolia)는 지중해 연안이 원산지로서, 줄기는 둔한 네모꼴이고 뭉쳐나며 잎은 돌려나거나 마주나고, 꽃과 식물체에서 채취된 향유는 향수와 화장품의 원료로 사용하고 요리의 향료로 사용할 뿐만 아니라 두통이나 신경안정을 치료하는 사용되고, 살균 및 방충용으로 사용되었다.

로즈마리(Rosemary, Rosmarinus officinalis)는 허브의 일종으로, 비타민과 미네랄이 풍부하고 각종 약리성분이 함유되어 소화, 이뇨, 살균, 항균작용을 한다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 천연방부제에 포함되는 약초(허브)는 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리 중의 적어도 하나 이상이며, 이 약초에서 추출한 항균 조성물은 원재를 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

유기 용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로탄올, 부탄올 등의 알콜, 에틸렌, 아세톤, 에테르, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, DMF (N,N-디메틸포름아미드), DMSO(디메틸설폭사이드), 이들의 혼합물 등을 이용하여 실온에서 또는 가온하여 유기 용매로 추출할 수 있다. 바람직하게는, 추출 용매로서 물(정제수) 또는 에탄올이 사용된다. 보다 바람직하게는 에탄올 추출 후 물(정제수), 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 부탄올로 분획을 하여 얻을 수 있다. 추출물은 건조 또는 비건조된 원재를 분쇄하고, 분쇄물에 용매를 10 내지 100배의 중량비로 가하여 침지한 후, 이를 여과 또는 원심분리하여 상등액을 수득하여 제조될 수 있다.

고온 추출하는 경우, 원재를 물/유기 용매에 가하여 대략 70℃ 이상, 바람직하게는 대략 80℃ 이상, 보다 바람직하게는 90℃ 이상의 온도에서 1시간 이상, 바람직하게는 2시간 이상, 보다 바람직하게는 4시간 이상 가열하고 가열된 추출물을 여과하여 제조할 수 있다. 높은 온도에서 가열하는 경우 시간은 줄어들지만 유효성분이 파괴되어 손실될 수 있고, 상기 온도보다 낮은 온도에서 가열하게 되면 혼합물의 유효성분이 완전하게 추출되지 않으므로 온도 조절과 시간을 적절하게 조절하는 것이 중요하다.

열 추출 또는 냉침 추출한 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 냉동 여과법 등을 이용하여 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용할 수 있다.

황금으로부터 추출된 항균 조성물(또는 천연방부제라 함)은 화장품, 식품, 의약품 등 완제품 100 중량부에 대해 0.1 내지 30 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 천연방부제는 세균, 효모 특히 진균에 대해 광범위한 우수한 항균 활성을 나타내며, 인체 피부에 안전하다. 상기한 바와 같이 광범위한 방부 스펙트럼을 갖는 본 발명에 따른 천연방부제는 화장품, 식품, 의약품에 사용되어 기존의 화학 합성천연방부제가 인체에 나타내는 부작용을 전혀 나타내지 않으면서 우수한 방부력을 갖는다.

본 발명의 화장품 조성물에서, 화장품류는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 항균 조성물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 황금으로부터 추출한 항균 조성물을 포함하는 생활용품을 제공한다. 생활용품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 적용 예로서 물티슈, 기저귀, 생리대 및 천연펄프, 고분자(수지), 면, 부직포 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 황금으로부터 추출한 항균 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 균 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디 류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌 류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명에 따른 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제의 제조 과정에 대한 실시 예를 도 1에 따라 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명에 적용 천연방부제를 제조하기 위한 허브 추출을 설명하기 위한 공정도이고, 도 2는 분획 추출물의 제조 과정을 나타내는 도면이다.

먼저, 도 1에 도시된 바와 같이, 허브로서 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리를 각각 마련하고, 건조하였다(S10).

상기 단계 S10에서 건조된 황금과 청호 또는 황금과 청호에 님잎, 라벤더, 로즈마리 중 적어도 어느 하나를 세절하여 혼합한 시료 500g을 정제수, 70% 에탄올, 100% 에탄올 또는 에틸아세테이트로 각각 추출한다(S20).

상기 단계 S20에서의 추출은 예를 들어 플라스크(flask)에 시료의 10배의 정제수(w/v)를 첨가한 후, 80℃에서 2시간 동안 3회 환류 추출할 수 있다.

이후, 0.45㎛ 필터로 여과 후 감압농축기를 사용하여 농축하였다(S30). 상기 단계 S30는 예를 들어 Whatman NO.2 여과지로 2회 여과한 후 회전 진공 증발기(rotatory vacuum evaporator)로 감압 농축하였다.

도 2에 도시된 바와 같이, 열수, 70% EtOH, 100% EtOH, EtOAc의 추출을 통해 얻어진 농축물은 멸균한 DMSO(dimethylsulfoxide)용액을 사용하여 시료를 녹인 후, 각각을 5, 10, 30 50mg/ml로 희석하여 실험에 사용하였다.

효모, 곰팡이 등의 진균류에서 활성을 보이지 않아 물질 분획을 위해 70% EtOH 추출물을 얻은 후, 도 2와 같이 용매로 분획하였다.

즉, 도 2에 도시된 바와 같이, 각각의 추출물을 분획여두에서 극성을 달리하는 용매(CH₂Cl₂, EtOAc, BuOH, water)로 순차적으로 분획한 후, 이 분획물을 40℃ 수조 상에서 회전 진공 증발기로 농축하여 용매를 완전히 제거하였다. 즉, 본 발명에서는 에탄올(70% EtOH) 추출물에 대해 유리 컬럼(open column)을 이용하여 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 부탄올을 순차적으로 분획하였다. 이렇게 획득한 항균활성 물질을 농축 및 분무 건조하였다.

각각의 용매별로 얻어진 농축물은 멸균한 DMSO용액을 용매로 하여 농도를 일정하게 조절하여 각 균주별 항균 활성을 측정하였다.

추출물의 최종 용해 농도는 표 1과 같다.

본 발명에 따른 복합 천연 방부제에 대한 균주별 항균 활성 측정은 농축 후 동결건조하여 실험에 이용하였다.

본 발명의 검증을 위한 시약으로서 배지는 NA(Nutrient agar), TSA(Tryptic soy agar), LB(Lactose broth) 및 PDA(Potato dextros agar)을 사용하였으며, 이러한 배지는 Difco-BBL사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. 예를 들어 대장균(E. coli)과 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 배양에 사용된 배지는 LB였고, 슈도모나스 에루기노사(P. aeruginosa)와 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 그리고 칸디다 알비칸스(L.monocytogenes)와 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)는 각각 NA, PDA 배지를 사용하였다.

즉, 본 발명에 따른 복합 천연 방부제의 항균 활성 시험을 위해 한천 평판(Agar plate)을 준비한다.

배지의 오염 여부를 확인하기 위해 평판의 물기를 제거하고 실험 전 37℃에서 2~3시간 정도 인큐베이터(incubator)에 둔다. 균주의 적당한 농도를 알아보기 위해 10^-1, 10^-2, 10^-3 정도로 나누어 희석한 후, 본 실험 전에 배양하여 평판에 적당한 농도로 자라는지 확인한다.

다음에, 상층 배지(0.7% agar)를 제조하여 희석된 균주를 재빨리 첨가하여 충분히 섞어준다. 그리고 균주가 포함된 상층 배지를 하층 배지 위에 골고루 퍼지게 부어준다. 예비 배양을 위해 2~3시간 동안 전배양을 하여 상층 배지를 굳힌다.

다양한 농도로 희석된 허브 시료를 전 배양된 평판에 스폿으로 떨어뜨린다(Spot lawn method). 스폿으로 활성을 보이는 시료를 선별하여 한천 확산법(Paper disc diffusion method)을 실시하여 재확인하였다.

상기 한천 확산법은 희석된 균주를 한천 평판에 200㎕씩 도말한다. 은박지를 깔고 그 위에 멸균한 8mm의 디스크를 핀셋을 이용하여 올려놓는다. 그 후, 디스크에 준비한 5종의 허브인 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리의 시료를 농도별로 20~40㎕씩 로딩하여 건조시킨다.

멸균된 핀셋으로 로딩된 디스크를 집어서 균주 도말된 평판 위에 올려놓는다.

본 발명에 따른 시험에 사용한 균주는 세균으로 분류되는 균주 4종 및 효모로 분류되는 균주 1종 및 진균으로 분류되는 균주 1종을 사용하였으며 균주는 다음과 같다. 대장균(Escherichia coli CCARM0237), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa KACC14021), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus KCTC3881) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis KACC14394), 진균류인 칸디다 알비칸스 (Candida albicans KCTC7270), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger KACC40280)를 사용하였다(CCARM 서울여대 항생제 내성균주 은행, KACC 농촌진흥청 농업미생물은행, KCTC 한국생명공학연구원 생물자원센터). 각 세균은 1×10⁸CFU/mL을 얻어 접종하였다. 추출물은 여러 가지 농도별로 DMSO에 용해시켜 멸균한 페이퍼 디스크(직경 8mm)에 10㎕씩 점적하였다. DMSO가 완전히 건조된 다음 평판 배지에 치상하여 28~37℃로 유지하여 1, 2, 3일 후 페이퍼 디스크 주변의 투명도(clear zone)를 측정하여 항균활성을 조사하였다.

상기 시험 균주 5종을 배양하고, 배양한 균주를 10^{-2~- 3}로 희석하여 준비한다. 이어서 96 웰 플레이트에 옮기고 37℃에서 24시간 동안 3시간 간격(0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24hr)으로 배양하며 흡광도(600nm)를 측정하고, 일정 시간 간격에서 다표지 시료 측정장치(Multilabel Counter : 1420, Perkin Elmer)로 측정하여 생육 저해 곡선과 MIC(Minimum Inhibitory Concentration; 최저저해농도)값을 파악하였다.

상기 균주의 배양조건은 28~37℃의 배양기에 투명대(clear zone)가 나타날 때까지 배양한다(18~24hr). 곰팡이의 경우, 3~7일까지 배양한다.

하기 표 2는 사용 균주 및 배양 배지의 관계를 나타낸다.

본 발명에 따른 허브 열수 추출물의 항균효과는 다음과 같이 실험하였다.

황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리의 각각 50g을 10배(500㎖)의 3차 증류수에 침지시켰다. 이후 100℃에서 2시간 동안 가열한 후에 서서히 식혀 추출을 하였다. 이 추출물은 다시 체에 거른 후 이를 감압 필터하고, 추출액은 40℃에서 80rpm으로 회전 감압기를 사용하여 농축하였다.

이 추출물을 5,000ppm, 10,000ppm, 100,000ppm의 농도별 DMSO에 용해시킨 후 사용하였다. 대조구로 추출물을 녹인 DMSO로 사용하였다.

[실험 예 1]

실험 예1은 디스크확산법으로 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리 추출물의 항균 활성을 측정하였다.

본 발명에서는 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리를 비교적 안전한 물, 에탄올, 에틸아세테이트 용매를 활용하여 각각 항균 조성물을 추출하였으며, 대장균(E. coli)과 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 배양에 사용된 배지는 LB였고, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)와 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) 그리고 칸디다 알비칸스(L.monocytogenes)와 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 총 6종의 미생물을 대상으로 각 추출물(항균 조성물)의 농도를 5~100mg/ml으로 적정하여 디스크 확산법으로 실험하였다.

여기서, 대조군은 기존의 상용 방부제 또는 화학 방부제이다.

그 결과, 청호, 님잎, 라벤더의 물, 에탄올, 에틸아세테이트 추출물은 표 2 내지 표 8에서 보는 바와 같이 대장균(E. coli), 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에서 항균활성을 나타내었다.

표 3은 열수 추출물에서의 항균활성을 나타낸다.

청호, 님잎, 라벤더의 열수 추출물에서는 표 3에서 보는 바와 같이 가장 높은 농도의 100,000ppm에서 대장균(E. coli) 균주에 대해서만 항균활성을 보였다.

다음에, 허브 70% 에탄올에 의한 추출 및 항균 활성을 실험하였다.

먼저, 허브 각각 100g을 10배(1.0L) 부피의 70% 에탄올에 침지시키고, 이후 160rpm으로 회전 교반시키며 24시간 동안 추출을 하였다.

이 추출물은 다시 체에 거른 후 상등액을 감압필터하고, 추출액은 40℃에서 80rpm으로 회전 감압기를 사용하여 농축하였다. 농축물은 5, 10, 100mg/ml(5000, 10000, 100000ppm)의 농도로 DMSO에 용해시킨 후 사용하였다.

대조군은 추출물이 없는 DMSO이고, 각각의 추출물의 MIC 값을 측정하였다.

표 4는 70% 에탄올 추출물에서의 항균활성을 나타낸다.

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 70% 에탄올을 사용하여 추출한 시료 5종 중 황금은 100,000ppm 농도에서 모든 균주에 대해 높은 항균 활성을 보였다. 라벤더와 로즈마리는 100,000ppm 농도에서 A. niger를 제외한 균주에서 높은 항균 활성을 보였다. 청호는 100,000ppm 농도에서 A. niger, P. aeruginosa를 제외한 균주에서 항균 활성을 보였다. 님잎은 100,000ppm 농도에서 E. coli, A. niger를 제외한 균주에서 항균 활성을 보였다.

표 5는 70% 에탄올 추출물의 MIC 값을 나타낸다.

MIC 측정한 결과, A. niger에서는 대조군을 포함하여 균주가 자라지 않았다. 황금이 다른 허브에 비해 낮은 저해농도를 나타냈다.

다음에, 실험의 신뢰성을 높이기 위해 70% 에탄올 추출물에 대한 항균 활성을 다시 실시하였고, 100% 에탄올 및 에틸아세테이트를 사용한 추출물의 항균 활성을 실험하였다.

70%/100% 에탄올 및 에틸아세테이트에 의한 추출 및 항균 활성 실험은 다음과 같다.

먼저, 허브 각각 100g을 10배(1.0L) 부피의 70%/100% 에탄올 및 에틸아세테이트에 각각 침지시켰다. 이후 각각을 160rpm으로 회전 교반시키며 24시간 동안 추출을 하고, 각각의 추출물은 다시 체에 거른 후 상등액을 감압필터 하고, 각각의 추출액은 40℃에서 80rpm으로 회전 감압기를 사용하여 농축하였으며, 각각의 농축물은 1, 5, 10, 50mg/ml의 농도로 DMSO에 용해시킨 후 사용하였다.

대조군은 추출물이 없는 DMSO, 0.4% 에칠렌파라벤(Ethylparaben), 유로나프레, 페녹시에탄올(Phenoxyethanol)을 적용하였다.

70% 에탄올, 100% 에탄올 및 에틸아세테이트 추출물의 항균효과 결과는 표 6 내지 11 및 도 3 내지 도 8과 같다.

표 6 및 도 3은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 항균효과 결과를 나타내고, 표 7 및 도 4는 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균효과 결과를 나타내고, 표 8 및 도 5는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균효과 결과를 나타내고, 표 9 및 도 6은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균효과 결과를 나타내고, 표 10 및 도 7은 진균류인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균효과 결과를 나타내고, 표 11 및 도 8은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 대한 항균효과 결과를 나타낸다.

황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리의 에탄올, 에틸아세테이트 추출물에서는 표 3 내지 표 8에서 보는 바와 같이 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에 대해서는 모두 항균활성을 보이며, 황금, 로즈마리 추출물에서는 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)에 대해 5mg/ml 이상의 농도에서 항균활성을 보였다. 즉, 바실러스 서브틸리스(B. subtils)를 제외한 균주에 대한 항균 활성은 약하거나 거의 나타나지 않아 분획 추출을 실시하였다.

[실험 예 2]

실험 예2는 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리에 대해 70% 에탄올 추출물의 분획추출(EtOAc, n-BuOH, CH₂Cl₂)의 항균효과를 측정하였다.

먼저, 도 2에 도시된 바와 같은 분획 추출을 위해 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리 5종의 허브를 70% 에탄올 추출하였다.

이 70% 에탄올 추출물에서 분획여두를 사용하여 물:CH₂Cl₂의 비율이 1:1을 첨가하여 CH₂Cl₂에 의한 추출물 층(layer)과 물 층(layer)으로 분획하여 CH₂Cl₂에 의한 분획 추출물을 얻었다. 얻어진 물 층의 동량의 EtOAc을 첨가하여 EtOAc에 의한 추출물 층과 물 층으로 분획하여 EtOAc에 의한 분획 추출물을 얻었다.

그리고 얻어진 물 층의 동량의 BuOH를 첨가하여 BuOH에 의한 추출물 층과 물 층으로 분획하여 BuOH에 의한 분획 추출물을 얻었다.

각각의 얻어진 EtOAc, n-BuOH, CH₂Cl₂ 추출물을 DMSO에 녹였다.

녹인 시료를 먼저 spot lawn method를 실시하고, Spot lawn method에서 항균 활성을 보인 시료를 선별하였다. 선별된 시료를 실험 예 1과 같이 디스크확산법을 실시하였다.

상술한 바와 같은 70% 에탄올 추출물의 분획추출(EtOAc, n-BuOH, CH₂Cl₂)의 항균효과는 표 12 및 도 9와 같았다.

표 12 및 도 9는 70% 에탄올 추출물의 분획추출에 의한 항균효과를 나타낸다.

표 12에서 보는 바와 같이, 황금 에틸아세테이트 분획 추출물에서 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 아스퍼질러스 나이거(A. niger) 균주를 제외한 병원성 미생물에서 모두 항균 활성을 나타내는 것을 볼 수 있다. 본 발명에 따르면, 청호 및 황금의 분획 추출물 중 청호 CH₂Cl₂, 황금 EtOAc, 황금 CH₂Cl₂ 이들 3종의 분획 추출물이 항균 활성이 높은 것을 확인하였다. 즉, 황금 및 청호의 혼합으로부터 추출은 70% 에탄올로 실행된 후, EtOAc, n-BuOH, CH₂Cl₂에 의해 분획 추출된 것을 사용하고, 항균 조성물은 조성물 100 중량부에 대해 EtOAc로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 청호 황금 20~50 중량부를 포함하는 것이 항균 활성에 대해 높게 나타났다.

[실험 예 3]

실험 예2에 대해 정확한 실험을 위해 복합천연방부제의 최적 혼합비 제조를 위한 항균 활성 측정을 디스크확산법으로 시행하였다. 즉, 실험 예2에서 실시한 조성물 100 중량부에 대해 EtOAc로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 청호 황금 20~50 중량부를 포함하는 추출물 중 최적 혼합비를 제조하기 위해 다양한 혼합비율로 항균 활성을 측정하였다.

실험 예 2에서 얻어진 시료 3종인 청호 CH₂Cl₂, 황금 EtOAc, 황금 CH₂Cl₂을 중량비로 하여 각각 20~50 중량부, 20~50 중량부, 20~50 중량부 내의 다양한 비율로 혼합하여 실시하였다.

표 13은 청호 CH₂Cl₂, 황금 EtOAc, 황금 CH₂Cl₂의 선별된 분획 추출물 혼합물에 의한 항균 효과의 결과를 나타낸다.

이들 3종의 시료를 표 13과 같이, 다양한 비율로 혼합하여 실험한 결과, no. 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9에서 높은 항균 활성을 나타냈다. C. albicans는 모든 혼합물에서 높은 항균 활성을 보였고, B. subtilis, S. aureus, P. auroginosa의 경우, 시료의 스폿이 흘러 데이터를 확인하기 위해 위의 시료 중 선별하여 디스크확산법을 통한 실험을 재실행하였다.

[실험 예 4]

실험 예 3에서 실행한 결과를 바탕으로 복합천연방부제의 최적 혼합비 제조를 위한 항균 활성 측정을 디스크확산법으로 시행하였다. 즉, 실험 예 3에서의 데이터를 통해 no. 2, 3, 4, 5, 8, 9의 항균 활성이 나타나는 것으로 선별하고, 선별된 6종의 혼합물을 디스크확산법으로 다시 확인하고 그 결과를 표 14에 나타내었다.

표 14에서, A는 청호 CH₂Cl₂(단일), B는 황금 EtOAc(단일), C는 황금 CH₂Cl₂(단일), C+는 control(DMSO)를 나타낸다.

표 14에서 알 수 있는 바와 같이, B. subtilis, C. albicans, S. aureus 균주에 대한 항균 활성은 높은 것으로 나타났다. 또 B. subtilis, C. albicans, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa 균주에 대한 A(청호 CH₂Cl₂)는 황금 단일, 혼합물보다 활성이 낮은 것으로 나타났다. B. subtilis, C. albicans, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa 균주에 대한 황금 단일(EtOAc, CH₂Cl₂)의 항균 활성은 혼합물과 비슷한 양상을 보였다. A. niger를 제외한 균주들에 대한 항균 활성을 확인할 수 있었지만, A. niger에 대한 항균 활성은 다시 실험하였다.

즉, 1~6일까지 배양하여 관찰하였을 때, 도 10에 도시된 바와 같이, 혼합물 1~4번의 A. niger에 대한 항균 활성이 뛰어난 것을 확인하였다. 도 10은 1~6일까지 배양하여 관찰한 상태를 나타내는 사진이다.

위의 결과를 통해 no. 2, 3, 4의 혼합물을 선별하였다. 황금의 항균 활성이 청호보다 유의적인 차이를 보여 황금 분획 추출물의 함량이 높은 혼합물을 선별하였다. 또 신뢰성을 높이기 위해, 3종의 분획 추출물의 농도별 항균 활성 효과 및 이들 혼합물의 항균 활성 효과를 위의 결과를 바탕으로 표 15 내지 표 17과 같이 나타내고 MIC값에 대한 결과를 나타내었다.

표 15는 분획물의 농도별 항균 활성 효과를 나타내고, 표 16은 혼합물의 항균 활성 효과를 나타내며, 표 17은 혼합물의 MIC값(%)를 나타낸다.

상술한 실험 결과, No. 3, 4의 혼합물이 높은 항균 활성을 보인다. 즉, 황금 및 청호로부터 추출한 항균 조성물은 항균 활성이 있음을 확인하였다.

[실험 예 5]

다음에 본 발명에 따른 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제의 인체피부 일차자극을 시험하였다.

본 발명에 따른 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제의 인체피부 일차자극 시험한 결과, 표 18에 나타난 바와 같이 일반기준(control) 대비 반응도가 낮음을 알 수 있었다. 따라서 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제를 피부에 사용하여도 안전함을 확인하였다. 표 19는 패치 테스트 기준을 나타낸다.

표 18에서, Response = {∑(Grade × No. of Responders)} / {4(Maximum grade) × n(Total subjects)} ×100×1/2

즉, 본 발명에 따른 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제를 페트로라툼에 최종농도 5%로 하여 용해한 후 이를 첩포에 흡수시키고, 첩포는 피험자 30명에 적용한 후 48시간에 제거하였다. 이후 24시간 동안 피부의 반응을 관찰하여 평가하였다. 본 발명에 따른 복합 천연 방부제는 피험자 모두에게서 아무런 피부반응을 관찰할 수 없는 인체피부 감작성 측면에서 저감작성 물질임을 확인하였다.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.

본 발명에 따른 황금 추출물을 포함하는 복합 천연 방부제 및 그 제조방법을 사용하는 것에 의해 방부 목적으로 화장품, 식품 및 의약품 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (7)

1. 부작용 및 독성이 적은 천연추출물에서 유도되는 천연 추출 항균제 조성물을 함유하는 천연방부제로서,
   황금(Skullcap, Scutellaria barbata) 및 청호(Artemsia annua)의 혼합으로부터 추출한 항균 조성물을 유효성분으로 포함하는 천연방부제.
2. 제1항에서,
   님잎(Neem leaves, Azadirachta indica), 라벤더(Lavender, Lavandula angustifolia) 및 로즈마리(Rosemary, Rosmarinus officinalis) 중의 적어도 하나로부터 추출한 항균 조성물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천연방부제.
3. 제1항에서,
   상기 항균 조성물은 화장품, 식품 또는 의약품 중의 어느 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 천연방부제.
4. 제1항에서,
   상기 항균 조성물은 화장품, 식품 또는 의약품의 완제품 100 중량부에 대해 0.1 내지 30 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 천연방부제.
5. 제1항에서,
   상기 추출은 정제수, 알콜, 70% 에탄올, 100% 에탄올, 에틸아세테이트 또는 디메틸클로로메탄으로 실행되는 것을 특징으로 하는 천연방부제.
6. 제1항에서,
   상기 추출은 70% 에탄올로 실행된 후, EtOAc, n-BuOH, CH₂Cl₂에 의해 분획 추출되고,
   상기 항균 조성물은 조성물 100 중량부에 대해 EtOAc로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 황금 20~50 중량부, CH₂Cl₂로 추출된 청호 황금 20~50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 천연방부제.
7. 부작용 및 독성이 적은 천연추출물에서 유도되는 천연 추출 항균제 조성물을 함유하는 천연방부제의 제조방법으로서,
   (a) 허브로서 황금, 청호, 님잎, 라벤더, 로즈마리를 각각 마련하여 건조하는 단계,
   (b) 상기 단계 (a)에서 건조된 허브에서 정제수, 알콜, 70% 에탄올, 100% 에탄올, 에틸아세테이트 또는 디메틸클로로메탄을 이용하여 유효 성분을 추출하는 단계,
   (c) 상기 단계 (b)에서 추출된 유효 성분을 여과하여 농축하는 단계를 포함하고,
   상기 단계 (b)에서의 추출은 분획여두에서 극성을 달리하는 용매인 CH₂Cl₂, EtOAc, BuOH, 정제수로 순차적으로 분획하여 실행되는 것을 특징으로 하는 천연방부제의 제조방법.
   

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