KR20170037396A - 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물 - Google Patents
버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
버섯은 담자균류와 자낭균류의 고등균류를 통틀어 일컫는다. 주로 그늘진 땅이나 썩은 나무에서 자라며, 홀씨로 번식한다. 버섯에는 식용버섯과 독버섯이 있으며 식용버섯으로는 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯, 느타리버섯, 싸리버섯, 능이버섯, 팽이버섯 등이 있다.
버섯은 식이섬유가 풍부하여 장내의 유해물, 노폐물을 배설하고 혈액을 깨끗하게 하며 면역 기능을 높이고 감염이나 암 예방 등에 효능이 있다.
표고버섯(Shiitake mushroom; Lentinula edodes)은 느타리과에 속하는 버섯으로, 한국, 중국, 일본 등지에 분포한다. 표고버섯은 자연에 분포하기도 하고 인공적으로도 재배할 수도 있다.
표고버섯은 혈액순환개선, 혈당 조절 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 표고버섯에는 레이다데민이라는 물질이 있어서 혈액 속의 콜레스테롤 수치를 저하시키고 혈압을 떨어뜨린다. 따라서 표고버섯은 고혈압이나 동맥경화 예방, 빈혈 등에 효과적이다. 또한 표고버섯은 비타민 C 함량이 높고 비타민 D2의 전구체인 에르고스레롤도 함유되어 있다.
이외에 표고버섯은 바이러스 증식 억제, 면역력 증강, 암 전이 억제 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
이러한 다양한 효능을 갖는 표고버섯은 자연 그대로 섭취하거나 가공하여 식품, 음료수, 주류 등으로 이용할 수 있고, 표고버섯에 의한 효능을 향상시키기 위해 유효성분만을 추출하여 이용할 수도 있다. 이때, 유효성분을 추출하는 방법으로는 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등의 추출법이나 알코올 발효, 젖산 발효, 메탄 발효 등의 발효법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 기질인 표고버섯의 유효성분을 포함하는 추출물을 제조할 수 있다.
그러나, 열수 추출이나 가압 추출을 이용할 경우에는 높은 열과 압력에 의해 기질의 유효성분이 파괴될 뿐만 아니라 변성되어 원하는 효능을 발휘하기 어려울 수 있고, 용매 추출을 이용할 경우에는 유효성분의 손실은 막을 수 있으나, 추출물에 잔존하는 비극성 용매, 유기 용매 등으로 인하여 인체에 해로울 수 있다는 문제점이 있다.
특허공개공보 제2012-0087408호에는 미생물을 이용하여 발효시켜 얻어진 버섯 발효추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 미생물을 이용하여 발효할 경우에는 접종 미생물이 생장하기 적합한 온도, 습도, 산소 농도 등의 조건을 일정하게 유지하기 어려우며, 접종하지 않은 다른 미생물의 오염으로 인해 원하는 발효가 일어나지 않을 수 있다.
이러한 추출법 및 발효법의 단점을 개선하기 위한 방법으로, 당장법을 이용할 수 있다. 당장법은 고농도의 당을 첨가하여 삼투압 현상에 의해 기질 내 수분과 함께 유효성분을 용출하는 방법이다. 당장법에 의하여 열 또는 압력에 의한 유효성분의 손실을 줄이면서 유효성분을 용이하게 얻을 수 있지만, 당장법은 추출법과 발효법에 비해 추출물을 얻는데 장시간이 소요될 뿐만 아니라 기질에 존재하는 미생물의 상태, 종류에 따라 반복적으로 균일한 추출물을 얻기 어려울 수 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 당장법으로 추출된 추출물에 미생물을 접종하여 발효하는 방법도 알려져 있다. 그러나, 기질에서 유효성분을 포함하는 추출물을 빠르고 균일하게 얻을 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 버섯의 유효성분을 열에 의한 손실 없이 균일하게 추출할 수 있는 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 제조방법으로 제조된 삼투압 효소 발효물을 제공한다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 열에 의한 유효성분의 손실 없이 버섯의 유효성분을 추출함으로써, 버섯의 유효성분을 균일하게 함유하는 삼투압 효소 발효물을 제조할 수 있다. 이러한 삼투압 효소 발효물은 항염증, 항알러지, 피부 재생, 항산화 등 효과가 우수하여 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 모식도이다.
도 2~4는 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 NO 생성 억제능 그래프이다.
도 5~도 8은 각각 본 발명의 일 예에 따른 비장세포 증식능 그래프, T 림프구 활성 효과 그래프, B 림프구 활성 효과 그래프, NK 세포 활성 효과 그래프를 나타낸다.
도 9~도 12는 각각 동물 실험을 통한 본 발명의 일 예에 따른 비장세포 증식능 그래프, T 림프구 활성 효과 그래프, B 림프구 활성 효과 그래프, NK 세포 활성 효과 그래프를 나타낸다.
도 13~도 20은 각각 본 발명의 일 예에 따른 비장세포의 TNF-α 생성 효과 그래프, IL-6 생성 효과 그래프, IL-1β 생성 효과 그래프, IFN-γ 생성 효과 그래프, IL-2 생성 효과 그래프, IL-10 생성 조절 효과 그래프, IgA 생성 효과 그래프, IgG 생성 효과 그래프를 나타낸다.
도 21~도 23은 각각 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 Hexosaminidase 분비 저해능 그래프, UV 조사 후 회복능 그래프, 항상화능 그래프를 나타낸다.
도 2~4는 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 NO 생성 억제능 그래프이다.
도 5~도 8은 각각 본 발명의 일 예에 따른 비장세포 증식능 그래프, T 림프구 활성 효과 그래프, B 림프구 활성 효과 그래프, NK 세포 활성 효과 그래프를 나타낸다.
도 9~도 12는 각각 동물 실험을 통한 본 발명의 일 예에 따른 비장세포 증식능 그래프, T 림프구 활성 효과 그래프, B 림프구 활성 효과 그래프, NK 세포 활성 효과 그래프를 나타낸다.
도 13~도 20은 각각 본 발명의 일 예에 따른 비장세포의 TNF-α 생성 효과 그래프, IL-6 생성 효과 그래프, IL-1β 생성 효과 그래프, IFN-γ 생성 효과 그래프, IL-2 생성 효과 그래프, IL-10 생성 조절 효과 그래프, IgA 생성 효과 그래프, IgG 생성 효과 그래프를 나타낸다.
도 21~도 23은 각각 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 Hexosaminidase 분비 저해능 그래프, UV 조사 후 회복능 그래프, 항상화능 그래프를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
<삼투압 효소 발효물의 제조방법>
본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 도 1에 도시된 바와 같이, (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(버섯), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다.
기질로는 버섯을 사용하며, 이들의 종류, 원산지 및 형태는 특별히 한정되지 않는다. 기질로는 표고버섯, 꽃느타리버섯, 새송이버섯, 양송이버섯, 팽이버섯 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 기질로는 표고버섯을 사용한다. 표고버섯은 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 등을 포함하는 전초를 사용할 수 있다. 이때, 기질은 유효성분을 용이하게 추출하기 위해, 일정한 크기로 분쇄하거나 압착기를 이용한 착즙 형태일 수 있다.
당으로는 당업계에 공지된 통상적인 당류를 제한 없이 사용할 수 있으며, 백설탕, 황설탕 및 원당(비정제당)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 당으로는 황설탕 또는 원당을 사용하는 것이 바람직하고, 원당을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
접종하는 미생물로는 효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 모두 사용하며, 효모 발효와 유산균 발효가 동시에 진행될 수 있다. 상기 효모로는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)(KCTC 7904)를 사용할 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유산균으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)(KCTC 3112)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP)을 사용할 수 있다. 상기 미생물은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합될 수 있으며, 효모 : 유산균 = 1 : 1로 혼합되는 것이 바람직하다.
상기 기질, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 기질의 유효성분을 최대한으로 추출할 수 있다. 상기 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2이고, 바람직하게는 기질 : 당 = 1 : 1이다. 상기 미생물의 사용량은 상기 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 3 내지 5 중량% 이다.
이러한 기질, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 적절한 온도 및 호기 조건을 갖는 인큐베이터(incubator)에서 1차 발효함으로써, 기질의 수분과 함께 유효성분이 용출된 1차 발효물로 제조된다.
1차 발효 온도는 특별히 한정되지 않으나, 20 내지 50 ℃이고, 바람직하게는 25 내지 45 ℃ 이다.
이때, 상기 혼합물이 산소가 차단된 혐기 조건에서 발효할 경우에는 효모에 의한 당 분해시 알코올이 생성되어 미생물의 효소 활성을 저해할 수 있으므로, 산소가 공급되는 호기 조건에서 발효를 진행한다. 예를 들면 부직포로 발효용기의 입구를 산소만 겨우 통과할 정도로 막아 혐기 조건이 되지 않도록 한다.
상기 1차 발효하는 동안에는 일정한 간격으로 1차 발효물의 pH를 측정하여 오염 유무를 확인하고, 액상의 상층에 쌓이는 기포들을 제거한다. BCA assay, Bradford assay 등의 단백질 정량법을 이용하여 생성된 효소량을 추정한다.
상기 1차 발효물의 pH는 3 내지 6인 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 효모에 의한 혐기 발효가 일어나거나 접종한 미생물이 아닌 외부 미생물에 의해 오염된 것으로 볼 수 있다. 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 경우에는 효소가 충분히 생성된 것으로, 1차 발효를 종료한다. 이때, 1차 발효 기간은 특별히 한정되지 않으나, 4일 내지 10일 동안 발효할 수 있다.
(b) 숙성 단계
(b) 단계는 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다.
숙성을 위하여 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물로부터 고형분을 제거한다. 고형분이 제거된 1차 발효액을 숙성한다. 이러한 1차 발효액은 저온 보관하여 숙성함으로써, 미생물에 의한 발효를 정지하면서 1차 발효액에 함유된 성분들이 상호작용할 수 있도록 하여 최종 삼투압 효소 발효물로 제조된다. 상기 숙성하는 온도는 0 내지 10 ℃인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 다른 일 예에 따르면 상기 (a) 단계 이후, (b) 단계 이전에 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우 숙성은 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 진행된다.
한편, 본 발명의 다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(버섯), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다. (a) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 (a) 단계와 동일한 것으로, 기질의 유효성분 및 미생물의 효소를 함유하는 1차 발효물을 제조한다.
(b-1) 멸균 단계
(b-1) 단계는 1차 발효물에 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계이다. 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 1차 발효액을 멸균한다. 상기 멸균하는 조건은 특별히 한정되지 않으나, 온도가 100 내지 140 ℃이고, 시간이 5 내지 30 분일 수 있다. 이로 인해, 1차 발효물 20~50%를 기질로 미생물을 재접종하여 2차발효를 진행할 수 있다. 이때 함유되는 죽은 미생물은 재 발효시에 단백질원이 공급될 수 있다.
(b-2) 2차 발효물 제조 단계
(b-2) 단계는 멸균된 1차 발효물에 당 및 미생물(효모, 유산균)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다. 상기 (b-1) 단계에서 멸균된 1차 발효물은 2차 발효하기 위해 당 및 미생물을 첨가한다.
상기 당 및 미생물로는 상기 (a) 단계에서 사용된 당 및 미생물과 동일하다.
상기 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 1차 발효물에 함유된 유효성분과 미생물에서 생성되는 효소의 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2이고, 바람직하게는 1차 발효물 : 당 = 1 : 1 이다. 상기 미생물의 사용량은 상기 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 3 내지 5 중량% 이다.
이러한 멸균된 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 첨가된 미생물이 1차 발효물에 함유된 유효성분뿐만 아니라 죽은 미생물을 단백질원으로 이용하여 효소 반응에 의해 2차 발효물로 제조된다.
(c) 숙성 단계
(c) 단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다. (c) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 숙성 단계와 동일한 것으로, 최종 삼투압 효소 발효물을 제조한다.
이와 같이, 본 발명의 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 버섯의 유효성분을 손실 없이 빠르고 균일하게 추출할 수 있다.
<삼투압 효소 발효물>
본 발명의 제조방법으로 제조된 삼투압 효소 발효물은 버섯의 유효성분을 함유하는 것으로, 이를 이용할 경우, 버섯에 의한 효과를 나타낼 수 있다.
<삼투압 효소 발효물을 포함하는 화장료, 식품, 약학 조성물>
본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물은 생물에서 유래하여 인체에 안전한 물질로서, 버섯의 삼투압 효소 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료, 식품, 약학 조성물로 이용될 수 있다. 이때, 상기 조성물들은 면역 및 재생 기능을 증대시켜 항염증, 항알러지, 피부 재생, 항산화 등에 효과적일 수 있다.
구체적으로, 상기 삼투압 효소 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 오일, 파우더, 에어졸, 연고 등의 형태로 이용될 수 있으며, 화장료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 샴푸, 린스, 토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스 등 모발용 화장료 조성물로 사용되거나 바디샤워, 바디로션, 바디오일, 바디미스트, 파운데이션, 세안제, 미스트 등 안면 또는 전신용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물을 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 음료, 건강보조식품 등의 형태로 이용될 수 있으며, 식품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물을 포함하는 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제, 외용제, 좌제, 주사용제 등의 형태로 이용될 수 있으며, 약품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 표고버섯 삼투압 효소 발효물
기질로서 표고버섯을 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 후 가로, 세로, 높이 모두 2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 기질과 당을 1:1의 중량비로 혼합하였다. 효모, 유산균은 기질과 당의 혼합물 전체 중량을 기준으로 각각 5중량%의 양으로 상기 혼합물에 접종하였다. 하기 표 1에 사용된 원료 및 함량이 기재되어 있다.
| 혼합물 | 함량 | |
| 기질 | 표고버섯 | 50중량% |
| 당 | 천연당 (원당) | 50중량% |
| 효모 | 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MABY1 (KCTC 11386BP) | 기질과 당의 혼합물 기준 5중량% |
| 유산균 | 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MieVL1106(KCTC 12082BP) | 기질과 당의 혼합물 기준 5중량% |
상기 혼합물을 발효용기에 담고, 산소만 겨우 통과하도록 부직포로 발효용기의 입구를 차단한 다음 30 ℃ 인큐베이터에서 1차 발효하였다. 1차 발효를 시작한 시점을 0일째 샘플로 간주하고, 24시간 간격으로 1차 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 단백질 정량법(BCA assay)으로 효소량을 측정하였다. 1차 발효하는 동안 1차 발효물의 표면에 생성되는 기포를 제거하였다. 약 7일째, 1차 발효물의 효소량이 800 ug/ml인 것을 확인한 후 미세망(300 mesh)을 이용하여 1차 발효물의 고형분을 제거하였다.
고형분이 제거된 1차 발효액을 소독한 새로운 용기에 담고, 4 ℃에서 숙성함으로써, 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 제조하였다.
[비교예 1] 표고버섯 열수 추출물
표고버섯을 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 후 가로, 세로, 높이 모두 2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 표고버섯과 물을 1 : 1 중량비로 혼합하여 121℃에서 15분 동안 가열하였다. 이후 미세망(300 mesh)으로 고형분을 제거하여 표고버섯 열수 추출물을 제조하였다.
[비교예 2] 표고버섯 열수 추출 발효물
상기 비교예 1에서 제조된 표고버섯 열추 추출물에 상기 실시예 1과 동일한 효모 5 중량%와 유산균 5 중량%를 접종한 후 30℃에서 72시간 발효하였다. 이후 미세망(300 mesh)으로 고형분을 제거하여 표고버섯 열수 추출 발효물을 제조하였다.
[실험예 1~5] In-Vitro 실험
[실험예 1] 항염증 효과
(1) NO 생성 억제 효과
마이크로플레이트(96 well)에 RAW 264.7 세포를 1 X 104 cell/well로 24시간 동안 배양하였다. 배양은, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 고농도 글루코오스 배지(high glucose DMEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다.
상기 세포 배양액에 실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물, 꽃느타리버섯의 삼투압 발효물, 새송이버섯의 삼투압 발효물, 양송이버섯의 삼투압 발효물, 팽이버섯의 삼투압 발효물 각각 0.25%를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 후 1μg/mL의 LPS를 처리하여 18시간 더 배양하였다.
세포 배양액 50 ul에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 5% 인산과 0.1% 나프틸에틸에틸렌 디아민(naphthylethylethylene diamine)이 포함된 그리스 시약(Griess reagent)(Sigma chemical Co., USA) 50 ul를 첨가하였다. 10분 간 반응시킨 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 시료에 처리한 경우의 흡광도 값을 LPS만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
(2) 농도에 따른 NO 생성 억제 효과
마이크로플레이트(96 well)에 RAW 264.7 세포를 1 X 104 cell/well로 24시간 동안 배양하였다. 배양은, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 고농도 글루코오스 배지(high glucose DMEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다.
상기 세포 배양액에 실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물, 꽃느타리버섯의 삼투압 발효물, 새송이버섯의 삼투압 발효물, 양송이버섯의 삼투압 발효물, 팽이버섯의 삼투압 발효물을 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%씩 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 후 1μg/mL의 LPS를 처리하여 18시간 더 배양하였다.
세포 배양액 50 ul에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 5% 인산과 0.1% 나프틸에틸에틸렌 디아민(naphthylethylethylene diamine)이 포함된 그리스 시약(Griess reagent)(Sigma chemical Co., USA) 50 ul를 첨가하였다. 10분 간 반응시킨 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 시료에 대하여 농도별로 처리한 경우의 흡광도 값을 LPS만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
(3) 다양한 표고버섯 사용에 따른 NO 생성 억제 효과
실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 농도별로 처리하는 대신 실시예 1의 삼투압 효소 발효물, 비교예 1의 표고버섯 열수 추출물, 비교예 2의 표고버섯 열수 추출 발효물을 각각 0.1% 처리하는 것을 제외하고는, 상기 (1)과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물(도 4에서 표고버섯 MOF로 표시됨)을 처리한 경우에는 LPS만을 처리한 경우, 비교예 1의 열수 추출물, 비교예 2의 열수 추출 발효물을 처리한 경우에 비하여 NO 생성 억제 효과가 우수한 것으로 나타났으며, 인도메타신을 처리한 경우와 거의 동등한 수준의 NO 생성 억제 효과가 나타났다.
[실험예 2] 비장 세포 증식능 확인
(1) 비장 세포 배양
10% FBS RPMI 1640 배지에 2.5~5.0 X 106 cell/mL 의 농도로 현탁된 비장세포를 96 well pate에 well 당 90 uL씩 분주하였다. 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 10 μL 씩 분주하였다.
미토젠으로 T 림프구 활성 자극 인자인 Con A(10 μg/mL) 또는 B 세포 활성 자극 인자인 LPS(10 μg/mL)를, 대조군으로 10% FBS-RPMI 1640 배지를 10 μL 씩 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 48-72시간 배양하였다.
(2) MTT 시험
배양이 끝나기 4시간 전에 각 well에 MTT 용액 10 μL를 가하고, 알루미늄 호일로 밀폐한 다음 4시간 동안 다시 배양하여 포르마잔(formazan) crystal 형성을 유도하였다. 배양이 끝난 후 플레이트를 4℃, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 10분간 방치하여 MTT-formazan 결정을 용해시켰다. ELISA reader로 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 비장세포의 증식능은 다음의 공식에 의해 계산한다.
Proliferation index = 시료(sample)의 흡광도 / 대조군(control)의 흡광도
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물, 비교예 2의 열수 추출 발효물에 비하여 비장 세포 증식능이 우수한 것으로 나타났으며, 비처리한 경우에 비하여는 2배 이상 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 3] T 림프구 활성화 효과
(1) T 세포 배양
10% FBS RPMI 1640 배지에 1.0 X 105 cell/mL 의 농도로 현탁된 비장세포를 96 well pate에 well 당 100 uL씩 분주하였다. 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 20 μL 씩 분주하였다.
미토젠으로 T 림프구 활성 자극 인자인 Con A(10 μg/mL)를, 대조군으로 10% FBS-RPMI 1640 배지를 20 μL 씩 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 72~96 시간 배양하였다.
(2) MTT 시험
배양이 끝나기 4시간 전에 각 well에 MTT 용액 10 μL를 가하고, 알루미늄 호일로 밀폐한 다음 4시간 동안 다시 배양하여 포르마잔(formazan) crystal 형성을 유도하였다. 배양이 끝난 후 플레이트를 4℃, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 10분간 방치하여 MTT-formazan 결정을 용해시켰다. ELISA reader로 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, T세포의 증식능은 다음의 공식에 의해 계산한다.
Proliferation index = 시료(sample)의 흡광도 / 대조군(control)의 흡광도
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물, 비교예 2의 열수 추출 발효물에 비하여 T 세포 증식능이 우수한 것으로 나타났으며, 비처리한 경우에 비하여는 2배 이상 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 4] B 림프구 활성화 효과
(1) B 세포 배양
10% FBS RPMI 1640 배지에 1.0 X 105 cell/mL 의 농도로 현탁된 비장세포를 96 well pate에 well 당 100 uL씩 분주하였다. 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 20 μL 씩 분주하였다.
미토젠으로 B 림프구 활성 자극 인자인 LPS(10 μg/mL)를, 대조군으로 10% FBS-RPMI 1640 배지를 20 μL 씩 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 72~96 시간 배양하였다.
(2) MTT 시험
배양이 끝나기 4시간 전에 각 well에 MTT 용액 10 μL를 가하고, 알루미늄 호일로 밀폐한 다음 4시간 동안 다시 배양하여 포르마잔(formazan) crystal 형성을 유도하였다. 배양이 끝난 후 플레이트를 4℃, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 10분간 방치하여 MTT-formazan 결정을 용해시켰다. ELISA reader로 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, B세포의 증식능은 다음의 공식에 의해 계산한다.
Proliferation index = 시료(sample)의 흡광도 / 대조군(control)의 흡광도
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물, 비교예 2의 열수 추출 발효물에 비하여 B 림프구 증식능이 우수한 것으로 나타났으며, 비처리한 경우에 비하여는 2배 이상 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 5] NK 세포 활성 효과
(1) 시료 준비
RPMI-1640 배지를 사용하여 Target 세포인 YAC-1 세포를 현탁하여 96-well plate에 well 당 세포를 1X104 씩 분주하였다. Effector 세포로 비장세포를 준비하여 effector 세포와 target 세포의 비가 200:1~25:1이 되도록 분주하였다.
Control로서 Back-ground control로는 well 당 RPMI-1640 배지만 분주하고, Low control 로는 YAC-1 세포만 분주하고 배양하여 NK 세포의 세포독성이 없는 상태에서의 YAC-1 세포의 기본적인 LDH 분비량을 측정하고, High control 로는 YAC-1 세포에 2% Triton X-100 용액을 넣고 배양하여 세포가 파괴되어 분비되는 최대 LDH 분비량을 측정하였다.
이를 37℃, 5% CO2 배양기에서 4~6시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 250g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 시료로 사용하였다.
(2) Cytotoxicity 측정
LDH 가 유리된 상층액 100 μL을 취하여 flat-bottom 96-웰 마이크로플레이트에 넣었다. Cytotoxicity LDH detection kit의 반응액(반응 혼합물)을 첨가하였다. 빛이 차단된 장소에서, 실온 (15-25℃)에서 30분간 반응시켰다. ELISA reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NK 세포 활성은 다음 공식을 이용하여 계산하여 백분율 (%)로 나타낸다.
Cytotoxicity (%) = (Test sample - Low control / High control - Low control ) X 100
그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물, 비교예 2의 열수 추출 발효물에 비하여 NK 세포 활성 효과가 우수한 것으로 나타났으며, 비처리한 경우에 비하여는 4배 이상 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 6 ~ 20] In vivo 동물 실험
생후 6주령된 BALB/c계 수컷 흰쥐(대한바이오링크) 20마리에게 고형 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 7일 동안 적응 기간을 두었다.
흰 쥐를 무작위로 다섯 그룹으로 분류하여 1군에 네마리씩 배정하였다.
먼저 면역억제를 하지 않은 정상그룹(normal group)에게는 매일 1회씩 3일간 생리식염수를 복강 투여한 후, 증류수 300ul를 14일간 경구 투여하였다.
면역억제 모델 그룹들에게는 CY(Cyclophosphamide) 100mg/kg B.W. 을 매일 1회씩 3일간 복강 주사하여 면역력을 억제하였다. 면역억제 모델 그룹을 다시 증류수 처리군, β-glucan(1mg/kg B.W.) 처리군, 비교예 1의 열수 추출물 처리군, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물 처리군으로 분류하여 15mL/kg B.W. (body weight)(단 베타 글루칸은 1mg/kg B.W.)의 양으로 14일 동안 흰 쥐에게 경구 투여하였다. 마지막 투여가 끝나고 24시간이 경과한 후, 흰쥐의 혈액을 채집한 다음 흰쥐를 희생한 후 비장을 적출하여 비장세포의 증식능, NK세포 활성을 측정하였다.
[실험예 6] 비장 지수(Spleen Index) 및 흉선 지수(Thymus Index) 확인
(1) 실험종료일에 실험동물의 체중을 측정하고 희생시켰다. 비장을 적출하여 전자저울을 이용하여 무게를 측정하였다. 비장지수는 다음과 같이 계산한다.
비장 지수 (%) = (비장 중량/체중) X 100
(2) 실험종료일에 실험동물의 체중을 측정하고 희생시켰다. 흉선을 적출하여 전자저울을 이용하여 무게를 측정하였다. 흉선지수는 다음과 같이 계산한다.
흉선 지수 (%) = (흉선 중량 / 체중) X 100
(3) 측정한 비장 지수 및 흉선 지수를 하기 표 2에 나타내었다.
| 비장지수 | 흉선지수 | |
| 정상군 | 0.329 | 0.170 |
| 대조군 | 0.310 | 0.131 |
| 베타글루칸 | 0.310 | 0.169 |
| 비교예 1의 열수 추출물 | 0.300 | 0.177 |
| 실시예 1의 삼투압 발효물 | 0.476 | 0.204 |
[실험예 7] 비장 세포 증식능 확인
(1) 비장 세포 배양
10% FBS RPMI 1640 배지에 2.5~5.0 X 106 cell/mL 의 농도로 현탁된 비장세포를 96 well pate에 well 당 100 uL씩 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 48-72시간 배양하였다.
(2) MTT 시험
배양이 끝나기 4시간 전에 각 well에 MTT 용액 10 μL를 가하고, 알루미늄 호일로 밀폐한 다음 4시간 동안 다시 배양하여 포르마잔(formazan) crystal 형성을 유도하였다. 배양이 끝난 후 플레이트를 4℃, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 10분간 방치하여 MTT-formazan 결정을 용해시켰다. ELISA reader로 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, 비장세포의 증식능은 다음의 공식에 의해 계산한다.
Proliferation index = 시료(sample)의 흡광도 / 대조군(control)의 흡광도
그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등에 비하여 비장 세포 증식능이 우수한 것으로 나타났다.
[실험예 10] T 림프구 활성화 효과
(1) T 세포 배양
10% FBS RPMI 1640 배지에 1.0 X 105 cell/mL 의 농도로 현탁된 비장세포를 96 well pate에 well 당 100 uL씩 분주하였다. 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 20 μL 씩 분주하였다.
미토젠으로 T 림프구 활성 자극 인자인 Con A(10 μg/mL)를, 대조군으로 10% FBS-RPMI 1640 배지를 20 μL 씩 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 72~96 시간 배양하였다.
(2) MTT 시험
배양이 끝나기 4시간 전에 각 well에 MTT 용액 10 μL를 가하고, 알루미늄 호일로 밀폐한 다음 4시간 동안 다시 배양하여 포르마잔(formazan) crystal 형성을 유도하였다. 배양이 끝난 후 플레이트를 4℃, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 10분간 방치하여 MTT-formazan 결정을 용해시켰다. ELISA reader로 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, T세포의 증식능은 다음의 공식에 의해 계산한다.
Proliferation index = 시료(sample)의 흡광도 / 대조군(control)의 흡광도
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등에 비하여 T 세포 증식능이 우수한 것으로 나타났다.
[실험예 11] B 림프구 활성화 효과
(1) B 세포 배양
10% FBS RPMI 1640 배지에 1.0 X 105 cell/mL 의 농도로 현탁된 비장세포를 96 well pate에 well 당 100 uL씩 분주하였다. 적당한 농도로 희석한 시료를 well 당 20 μL 씩 분주하였다.
미토젠으로 B 림프구 활성 자극 인자인 LPS(10 μg/mL)를, 대조군으로 10% FBS-RPMI 1640 배지를 20 μL 씩 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 72~96 시간 배양하였다.
(2) MTT 시험
배양이 끝나기 4시간 전에 각 well에 MTT 용액 10 μL를 가하고, 알루미늄 호일로 밀폐한 다음 4시간 동안 다시 배양하여 포르마잔(formazan) crystal 형성을 유도하였다. 배양이 끝난 후 플레이트를 4℃, 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 각 well에 DMSO 150 μL를 가하여 10분간 방치하여 MTT-formazan 결정을 용해시켰다. ELISA reader로 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 여기서, B세포의 증식능은 다음의 공식에 의해 계산한다.
Proliferation index = 시료(sample)의 흡광도 / 대조군(control)의 흡광도
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우에 비하여 B 림프구 증식능이 우수한 것으로 나타났다.
[실험예 12] NK 세포 활성 효과
(1) 시료 준비
RPMI-1640 배지를 사용하여 Target 세포인 YAC-1 세포를 현탁하여 96-well plate에 well 당 세포를 1X104 씩 분주하였다. Effector 세포로 비장세포를 준비하여 effector 세포와 target 세포의 비가 200:1~25:1이 되도록 분주하였다.
Control로서 Back-ground control로는 well 당 RPMI-1640 배지만 분주하고, Low control 로는 YAC-1 세포만 분주하고 배양하여 NK 세포의 세포독성이 없는 상태에서의 YAC-1 세포의 기본적인 LDH 분비량을 측정하고, High control 로는 YAC-1 세포에 2% Triton X-100 용액을 넣고 배양하여 세포가 파괴되어 분비되는 최대 LDH 분비량을 측정하였다.
이를 37℃, 5% CO2 배양기에서 4~6시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 250g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 시료로 사용하였다.
(2) Cytotoxicity 측정
LDH 가 유리된 상층액 100 μL을 취하여 flat-bottom 96-웰 마이크로플레이트에 넣었다. Cytotoxicity LDH detection kit의 반응액(반응 혼합물)을 첨가하였다. 빛이 차단된 장소에서, 실온 (15-25℃)에서 30분간 반응시켰다. ELISA reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NK 세포 활성은 다음 공식을 이용하여 계산하여 백분율 (%)로 나타낸다.
Cytotoxicity (%) = (Test sample - Low control / High control - Low control ) X 100
그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우에 비하여 NK 세포 활성 효과가 우수한 것으로 나타났다.
[실험예 13] TNF-α 생성 효과
(1) 시료 준비
비장 세포를 배양 배지로 현탁하여 배양 플레이트(24 well/96-well)에 분주하였다. 미토젠으로 T 림프구 활성 자극 인자인 Con A(10μg/mL)와 B 세포 활성 자극 인자인 LPS(10 μg/mL)를 사용하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에 넣고 24-48시간 배양하고 상층액을 취하여 분석 시료로 사용하였다.
(2) 분석
효소결합면역흡착검사(enzymelinked immumosorbent assay, ELISA)를 이용한 키트 시약을 사용하여 분석하였다.
96 웰 플레이트에 TNF-α 항체를 넣어 코팅하고, 증류수(blank), TNF-α 표준액, 시료를 각각 100 μL 씩 넣어 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
비오틴과 결합된 TNF-α 항체를 100 μL 씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 아비딘과 결합된 horseradish peroxidase (HRP)를 100 μL 씩 넣고 실온 또는 37℃ 에서 30분간 반응시켰다. TMB 기질 용액을 100 μL 씩 넣고 실온에서 4-14분간 반응시켰다.
Stop solution (황산)을 100 μL 씩 넣어 반응을 종결시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
표준액의 흡광도와 비교하여 시료의 TNF-α 함량을 계산하였다.
그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 비장세포의 TNF- α 생성이 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 14] IL-6 생성 효과
TNF-α 항체 대신 IL-6 항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IL-6 표준액을 사용하였다는 점, TMB 기질 용액을 4~14분이 아닌 11~21분 동안 반응시켰다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 비장세포의 IL-6 생성이 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 15] IL-1β 생성 효과
TNF-α 항체 대신 IL-1β항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IL-1β 표준액을 사용하였다는 점, TMB 기질 용액을 4~14분이 아닌 11~21분 동안 반응시켰다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 비장세포의 IL-1β 생성이 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 16] IFN-γ 생성 효과
시료로서 비장세포 대신 혈청을 사용하였다는 점, TNF-α 항체 대신 IFN-γ 항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IFN-γ 표준액을 사용하였다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 혈청의 IFN-γ 생성이 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 17] IL-2 생성 효과
시료로서 비장세포 대신 혈청을 사용하였다는 점, TNF-α 항체 대신 IL-2 항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IL-2 표준액을 사용하였다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 혈청의 IL-2 생성이 증가한 것으로 나타났다. 도 17로부터 실시예 1의 삼투압 효소 발효물이 IL-2 생성을 촉진하여 림프구의 분화와 증식을 촉진하는 등 세포 매개성 면역 증강에 효과를 나타내는것으로 볼 수 있다.
[실험예 18] IL-10 생성 조절 효과
시료로서 비장세포 대신 혈청을 사용하였다는 점, TNF-α 항체 대신 IL-10 항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IL-10 표준액을 사용하였다는 점, TMB 기질 용액을 4~14분이 아닌 1~8분 동안 반응시켰다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 혈청의 IL-10 생성이 정상화된 것으로 나타났다.
도 18로부터 실시예 1의 삼투압 효소 발효물은 IL-10 생장 조절을 통하여 면역억제 상태를 개선하는 것으로 볼 수 있다.
[실험예 19] IgA 생성 효과
시료로서 비장세포 대신 혈청을 사용하였다는 점, TNF-α 항체 대신 IgA 항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IgA 표준액을 사용하였다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 혈청의 IgA 생성이 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 20] IgG 생성 효과
시료로서 비장세포 대신 혈청을 사용하였다는 점, TNF-α 항체 대신 IgG 항체를 사용하였다는 점, TNF-α 표준액 대신 IgG 표준액을 사용하였다는 점을 제외하고는 실험예 13과 동일하게 실험을 수행하였다.
그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우 비교예 1의 열수 추출물 등을 처리한 경우 등에 비하여 혈청의 IgG 생성이 증가한 것으로 나타났다.
[실험예 21] 헥소사미니다아제(Hexosaminidase) 분비 저해 효과
ATCC로부터 RBL-2H3(rat basophilic leukemia cell line)을 분양받아 배양하였다. 배양은, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) 또는 gentamicin이 함유된 글루코오스 배지(glucose MEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% 트립신-EDTA 용액을 처리하여 세포를 부유시킨 다음 계대 배양하였다.
상기 세포 배양액에 실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물, 꽃느타리버섯의 삼투압 발효물, 새송이버섯의 삼투압 발효물, 양송이버섯의 삼투압 발효물, 팽이버섯의 삼투압 발효물 각각 0.25%를 처리하여 Hexosaminidase 분비 저해능을 측정하였다. 구체적으로 각각의 실시예의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우의 흡광도 값을 anti-DNP IgE와 DNP-BSA만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 헥소사미니다아제 분비 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
[실험예 22] UV 조사후 회복효과
정상적인 인간의 피부진피세포(normal human dermal fibroblast; NHDF)인 Human Dermal Fibroblasts를 분양받은 다음(Lonza, USA), 24 웰 플레이트(well plate)의 웰에 5 X 104 cell/well의 NHDF를 부착시킨 후 24시간 동안 배양하였다. 배양은, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 저농도 글루코오스 배지(low glucose DMEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다.
실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물, 꽃느타리버섯의 삼투압 발효물, 새송이버섯의 삼투압 발효물, 양송이버섯의 삼투압 발효물, 팽이버섯의 삼투압 발효물을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 4시간 배양한 후 PBS로 2번 wash 한 다음 100mJ/cm2 UV-B를 조사하여 손상을 주었다. 실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물, 꽃느타리버섯의 삼투압 발효물, 새송이버섯의 삼투압 발효물, 양송이버섯의 삼투압 발효물, 팽이버섯의 삼투압 발효물을 0.25% 농도로 처리하여 48시간 배양한 후 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma) 1mg/mL의 농도가 되도록 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. Dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma) 또는 0.04N HCl/Isopropanol 100 μl를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 micro-plate reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율을 백분율로 나타내었다. 그 결과를 도 22에 나타내었다.
[실험예 23] 항산화 효과
알러지 초기반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 측정하였다. 항원-항체 결합단계에서 β-hexosaminidase의 분비에 미치는 영향을 측정하기 위하여 RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 105 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하였다. 그 후 anti-DNP IgE (0.5 μg/ml)로 감작하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 12~16시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2) 로 2 번 세척한 다음 각 well 당 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2와 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하고 발효추출물을 농도별로 1 시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양 한 후 DNP-BSA (20 μg/ml)로 처리하여 1 시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10 분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다. 상층액 20 μl를 96 well plate에 옮기고 substrate buffer (4-p-Nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide 1 mM, sodium citrate 0.05 M, pH 4.5) 20 μl를 넣고 37℃에서 30 분 배양시킨 다음 각 well당 stop solution(0.1M Na2CO3/NaHCO3) 200 μl를 첨가하여 반응을 종결시켰다. Microplate reader (TECAN/infinite M200, Switzerland)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 23에 나타내었다.
Claims (19)
- (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
(b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계
를 포함하는 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
(b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계;
(c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계
를 포함하는 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
(b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계;
(b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계
를 포함하는 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 버섯이 표고버섯인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 당은 백설탕, 황설탕, 원당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP)인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP)인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효모 및 유산균은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 효모 및 유산균의 사용량은 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 발효 및 2차 발효는 호기 조건에서 진행되는 것인 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 버섯을 이용한 삼투압 효소 발효물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항염용 화장료 조성물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 UV 재생용 화장료 조성물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항알러지 화장료 조성물.
- 제12항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 화장료 조성물.
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