KR20170032463A - 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 방사성 표지 항체 단편 - Google Patents

암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 방사성 표지 항체 단편 Download PDF

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Abstract

본 출원은 고형 종양 또는 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질, 예를 들어 HER2에 특이적으로 결합하는, 중쇄 항체의 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 그것으로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 출원은 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산; 이러한 폴리펩티드의 제조 방법; 이러한 폴리펩티드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 및 특히 이러한 폴리펩티드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 출원은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 이러한 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물을 제공한다.

Description

암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 방사성 표지 항체 단편{RADIO-LABELLED ANTIBODY FRAGMENTS FOR USE IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 방사성 표지(radio-labelled) 항체 단편 및 예방 및/또는 치료 목적을 위한 이의 용도의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 방사성 표지 항체 단편에 관한 것이다.
혈액 종양을 치료하는데 있어서 방사성 표지 항체의 압도적인 성공과 대조적으로, 고형 종양의 방사면역 치료에서는 대단하지 않은 성공만이 달성되어 왔다. 방사면역 치료의 성공적인 적용에 있어서의 제한들 중 하나는 완전(intact) 면역글로불린의 분자 크기가 커서 혈청 반감기가 길고 종양 침투 및 흡수가 불충분하다는 것이다. 항체 공학의 출현에 따라, 개선된 약동학적 특성 및 종양 침투를 나타내는 저분자량 항체 단편들이 생성되어 왔다. 그러나, 그들의 임상적 적용은 부분적으로 최적화된(suboptimal) 흡수 및 짧은 체류 시간에 의해 제한되어 왔다. 따라서, 항체 단독의 분자 크기의 최적화는 방사면역 치료의 임상적 성공을 위하여는 충분하지 않다.
실제로, 그들의 큰 분자 크기는 별문제로 하고, 방사성 표지 항체는 고형 종양의 세포 표면상에서 발현된 그들의 표적 항원에 도달하기 전에 다른 방해를 받는다. 이들 방해 요인들 중 몇몇으로는 큰 종양에서의 불충분한 혈액 흐름, 혈관 내피의 투과성, 종양 기질의 상승된 간질액 압력, 및 이종 항원 발현이 있다.
새로운 최적화 전략은 생물학적 변형제(modifier)를 이용하여 고형 종양에 의해 제기된 방해요인을 조정하는 것을 포함한다. 방사성 표지 항체와 함께, 여러 가지 작용제(agent)들이 고형 종양 흐름을 개선하고, 혈관 침투성을 향상시키고, 기질 세포 및 세포외 기질 성분의 조정을 통해 종양 간질액 압력을 저하시키고, 표적 항원의 발현을 상향 조절하고, 방사성 약품(radiopharmaceutical)의 침투 및 체류(retention)를 개선하기 위해 사용되고 있다.
그럼에도 불구하고, 투여된 항체 중 매우 소량(0.001-0.01%로 낮음)만이 종양에 모이고 더욱 많은 양의 방사성 표지 mAb를 투여하면 골수 독성이 유발되기 때문에, 고형 종양에 대한 방사 면역 치료의 임상적인 성공은 여전히 먼 꿈인 것으로 보인다. 임상적인 성공을 위하여, 고형 종양에 대한 방사 면역 치료는 종양에서 방사성 표지 항체의 종양 흡수 및 체류를 향상시키고 비표적 조직의 노출을 최소화하도록 최적화될 필요가 있다.
Pruszynski 등(2014)은 Nε-(3-*I-아이오도벤조일)-Lys5-Nα-말레이미도-Gly1 -GEEEK를 이용한 방사요오드화(radioiodination) 및 IODO-GEN를 이용한 VHH의 직접 요오드화와 비교하여, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸 3-125-131I-아이오도벤조에이트를 이용한 131I로서의 표지를 통해 HER2-표적화 VHH의 개선된 종양 표적화를 보여주었다. *I-SGMIB-VHH의 경우의 종양 흡수는 트라스투주맙 차단(Trastuzumab blocking)을 통해 유의하게 감소되어서, HER2 결합을 위한 VHH와 트라스투주맙 사이의 경쟁이 확인되었다. Pruszynski 등에서 개시된 VHH는 카르복시 말단 시스테인 함유 테일(tail)을 함유하므로, 단량체 형태 및 이량체 형태의 평형 혼합물이 얻어진다. Pruszynski 등은 방사성 표지 VHH들의 임의의 치료 효과를 보여주지 못했다.
본 발명자들은 암의 치료에서 사용하기 위한 것으로 고형 종양 또는 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 신규하고 개선된 단편들을 확인했다.
특히, 고형 종양 또는 암세포와 특이적으로 상호작용하는 것으로, 중쇄(heavy chain) 항체 유래의 특정 형태의 항체 단편, 즉 중쇄 가변 도메인(이하, VHH라 함)의 방사성 표지(radiolabelling)를 통해, 본 발명자들은 높은 종양 흡수 또는 암세포 흡수값, 건강한 조직에의 낮은 흡수값, 낮은 전체 생체분포(biodistribution) 및 혈액으로부터의 빠른 제거(clearance)에 특징이 있는 개선되고 효과적인 방사 면역치료 전략을 개발했다.
따라서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 항체는 당 업계에 알려진 통상적인 (면역글로불린 및 비면역글로불린)과 비교하여 몇몇의 이점을 나타내는데, 이러한 이점으로는 효능이 더 높고, 독성이 더 낮고 안정성이 더 높아서 (1) 의료 용도에서의 최대 내약 용량(maximally tolerated dosage (MTD))이 더 높아서, 높은 치료 용량의 반복되고 지속된 투여가 가능하여, 정상의 건강한 조직(방사면역 치료에서 특히 적절한)에 대한 용량제한 독성(DLT) 부작용 미만으로 여전히 잔류하면서 종양 또는 암세포 성장을 효적적으로 저해하고, (2) 정맥 내 투여 외에도 경구, 피하, 복막 내, 척수강 내(intrathecal) 경로 및 지연 방출 제제를 포함한 투여 경로의 선택이 더욱 넓다는 것이 있다. 또한, 그의 작은 크기 때문에, 본원에서 개시된 바와 같은 항체 단편은 다른 더욱 큰 폴리펩티드 및 단백질들이 접근할 수 없는 생리학적 구획, 조직 및 장기 내로 침투하는 능력이 있다.
놀랍게도, 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 항체 단편은 일가 포맷(monovalent format)으로 사용되고, 수명을 연장하기 위해 변형되지 않았다. 실제로, 전체 항체(whole antibodies)는 수명이 예외적으로 긴 반면에, 작은 항체 단편은 종종 순환계로부터 신속하게 제거된다. 따라서, VHH들의 생체 내 적용은, 예를 들어 혈장 반감기를 연장하기 위하여 항혈청 알부민 VHH에의 결합 또는 페길화(pegylation)를 통해 변형되어진 VHH들에 따라 결정되는 것이 일반적이다(Siontorou 2013 International Journal of Nanomedicine 8:4215-4227; Tijink 등. 2008 Mol Cancer Ther 7:2288-2297). 또한, VHH들을 다량체화(multimerization)하면, 생체 내 체류가 연장될 수 있고 친화성이 증가한다(Siontorou 2013). 본 발명자들은 일가의 수명이 연장되지 않은 VHH들의 치료 효능을 입증했다.
본 발명은 이러한 방사성 표지 항체 단편뿐만 아니라, 한 종 이상의 이러한 방사성 표지 항체 단편을 포함하거나 그로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드 및 예방 및/또는 치료 목적, 특히 방사면역 치료를 위한 이러한 방사성 표지 항체 단편 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
특정 실시 예에서, 상기 방사성 표지 항체 단편 뿐만 아니라, 한 종 이상의 이러한 방사성 표지 항체 단편을 포함하거나 그로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드는 암의 예방, 예를 들어 암질환 재발의 예방, 즉 완화 후 한 종 이상의 징후, 증상 또는 질환의 재발의 회피 또는 예방을 위해 사용될 수 있으나, 그로 제한되지 않는다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 암세포 상에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 유래의 방사성 표지 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양 상에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 유래의 방사성 표지 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 암세포상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 한 종의 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 한 종의 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합한다.
암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인된 바와 같이, HER2에의 결합을 위해 단클론 항체인 트라스투주맙(Herceptin®) 또는 단클론항체인 페르투주맙(Pertuzumab (Perjeta®))과 경쟁하지 않는다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 이를 필요로 하는 대상(subject)에게, 상기 대상에서 0.002 내지 0.1 mSv/MBq의 계산된 평균 유효 선량을 가지면서 투여된다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 필요로 하는 대상에게 1일에 1회 내지 1달에 1회의 투여간격 또는 1에 1회 내지 1년에 1회의 투여 간격으로 투여된다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 고형 종양 또는 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 5 nM 미만의 친화력으로 결합한다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 α-방출 방사성 동위원소 및 β-방출 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지되어 있다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무스-212, 비스무스-213, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-60, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테늄-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 테크니튬-99m, 라듐-223, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 토륨-227, 크세논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 이트륨-90으로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지되어 있다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 131-요오드로 표지되어 있다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트(iodobenzbate) ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH는 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역, 및/또는 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함한다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH는 서열번호 7 또는 8의 아미노산들 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH는 서열번호 7 또는 8의 아미노산들 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 동일하다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 암은 유방암이다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 암의 예방 및/또는 치료는 면역치료와 병행된다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은, 필요로 하는 대상에게 정맥 내, 척수강 내 또는 복막 내 투여된다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH는 일가 포맷(monovalent format)으로 존재한다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 시스테인 함유 태그(tag), 바람직하게는 GGC-태그가 없다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 카르복시-말단 폴리펩티드 태그(tag)가 없다. 바람직하게는, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 태그가 없다(untagged).
하나의 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질(종양 특이적 항원이라고도 기재함)에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 유래 방사성 표지 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질(종양 특이적 항원이라고도 기재함)에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 유래 방사성 표지 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을, 필요로 하는 대상에게 10㎍ 내지 1000㎍의 VHH 투여량으로 투여함으로써 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
특정의 다른 실시 예에서, 암의 예방 및 치료는 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을, 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 달성되는데, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 대상에서 0.002 내지 0.1 mSv/MBq의 계산된 평균 유효 선량을 갖는 것을 특징으로 한다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을, 필요로 하는 대상에게 1일에 1회 내지 1달에 1회의 투여 간격 또는 1달에 1회 내지 1년에 1회의 투여 간격으로 투여함으로써 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 종양 특이적 항원과 같은, 고형 종양 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 고형 종양 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 1 내지 5 nM, 바람직하게는 2 내지 3 nM과 같은 5 nM 미만의 친화도로서 특이적으로 결합한다.
특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 암세포 특이적 항원과 같은, 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 1 내지 5 nM, 바람직하게는 2 내지 3 nM과 같은 5 nM 미만의 친화도로서 특이적으로 결합한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합한다. 추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 게시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 1 내지 5 nM, 바람직하게는 2 내지 3 nM과 같은 5 nM 미만의 친화도로서 특이적으로 결합한다.
특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2 표적화 VHH 또는 이의 기능적 단편은 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER2에의 결합을 위하여 트라스투주맙 및 페르투주맙과 경쟁하지 않는다. 이는 암, 더욱 구체적으로는 HER2-양성 유방암과 같은 HER2-양성 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 본원에서 개시된 바와 같은 HER2 표적화 VHH 또는 이의 기능적 단편을 트라스투주맙(Herceptin®) 및/또는 페르투주맙(Perjeta®)과 병용하는 것을 가능하게 하는 이점이 있다.
특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 HER2 표적화 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2의 도메인 IV, 더욱 구체적으로는 HER2의 도메인 IV의 C 말단과 상이한(즉, 아닌), HER2 상의 결합 부위에 대하여 특이적으로 지시된다(directed). 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 HER2 표적화 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2의 도메인 II와 상이한(즉, 아닌), HER2 상의 결합 부위에 대하여 특이적으로 지시된다. 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 HER2 표적화 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2의 도메인 IV, 더욱 구체적으로는 HER2의 도메인 IV의 C 말단, 및 HER2의 도메인 II와 상이한(즉, 아닌), HER2 상의 결합 부위에 대하여 특이적으로 지시된다.
특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무스-212, 비스무스-213, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-60, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테늄-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 테크니튬-99m, 라듐-223, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 토륨-227, 크세논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 이트륨-90으로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소를 포함하나 그로 제한되지 않는, α-방출 방사성 동위원소 및 β-방출 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지된 것이다. 여전히 추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 요오드-131으로 표지된 것이다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 세포 특이적 항원 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공하는데, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 세포 특이적 항원 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공하는데, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[211At]아스타노벤조에이트([211At]SGMAB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 211-아스타틴으로 표지된 것이다.
특정 실시 예에서. 고형 종양과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편의 아미노산 서열은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역, 및/또는 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함한다.
추가의 특정 실시 예에서, 고형 종양 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH는 서열 번호 7 또는 8의 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
여전히 추가의 특정 실시 예에서, 종양 특이적 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH는 서열 번호 7 또는 8의 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 동일하다.
추가의 특정 실시 예에서, 암세포 특이적 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH는 서열 번호 7 또는 8의 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
여전히 추가의 특정 실시 예에서, 암세포 특이적 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH는 서열 번호 7 또는 8의 아미노산 서열 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 동일하다.
특정 실시 예에서. 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공하는데, 상기 암은 유방암이다.
특정의 다른 실시 예에서. 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공하는데, 상기 암의 예방 및/또는 치료는 면역치료와 병행된다.
특정의 다른 실시 예에서. 암의 예방 및/또는 치료는 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 이를 필요로 하는 대상에게 정맥 내 또는 복막 내 또는 척수강 내 투여함으로써 달성된다.
추가의 특정 실시 예에서, 고형 종양 항원 또는 암세포 특이적 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 일가 포맷으로 존재한다. 여전히 추가의 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 상기 VHH 또는 기능적 단편의 이량체화와 같은 다량체화를 유도하는 태그(tag), 더욱 구체적으로는 GGC 태그와 같은 시스테인 함유 태그가 없다.
특정 실시 예에서, 고형 종양 항원 또는 암세포 특이적 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 수명이 연장되지 않은 포맷으로 존재한다.
특정 실시 예에서, 고형 종양 항원 또는 암세포 특이적 항원과 특이적으로 상호작용하는 것으로 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 카르복시 말단 폴리펩티드 태그가 없다. 카르복시 말단 폴리펩티드 태그가 없는 VHH는 His-표지 VHH 및 Myc-His-표지 VHH와 같은 카르복시 말단 폴리펩티드 표지 VHH와 비교하여 신장에서 덜 체류한다는 점에서 이점이 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양 및/또는 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 방사성 표지 VHH 또는 이의 적어도 하나의 기능적 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양 및/또는 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 방사성 표지 VHH 또는 이의 적어도 하나의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 한 종 이상의 보조제를 추가로 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 개시는 암의 예방 및 치료 중 하나 또는 둘 모두를 위한 방법으로서, 암세포 또는 고형 종양에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 항원 유래의 방사성 표지된, 태그 없는(untagged) 일가 중쇄 가변 도메인(VHH)을, 필요로 하는 대상에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 할로겐 방사성 동위원소로 표지된 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 131-요오드로 표지된 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 α-방출 방사성 동위원소 및 β-방출 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지된다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무스-212, 비스무스-213, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-60, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테늄-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 테크니튬-99m, 라듐-223, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 토륨-227, 크세논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 이트륨-90으로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지된 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합한다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합하고 할로겐 방사성 동위원소로 표지된 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합하고 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER2에의 결합을 위하여 단클론 항체인 Herceptin® (트라스투주맙) 또는 단클론 항체인 페르투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 대상 내에서 0.002 내지 0.1 mSv/MBq의 계산된 평균 유효 선량을 가지면서 상기 대상에게 투여된다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 1일에 1회 내지 1달에 1회의 투여 간격 또는 1달에 1회 또는 1년에 1회의 투여 간격으로 대상에게 투여된다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 고형 종양 또는 암세포 상에 존재하는 HER2에 5 nM 미만의 친화도로서 결합한다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함한다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산들 중 적어도 하나와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산들 중 적어도 하나와 동일하다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산들 중 적어도 하나와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산들 중 적어도 하나와 동일하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 암은 유방암이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방법은 상기 대상에 대하여 면역치료를 수행하는 것을 추가로 포함한다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 대상에게 정맥 내, 척수강 내 또는 복막 내 투여된다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
본원에서 게시한 바와 같은 방법들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 카르복시 말단 폴리펩티드 태그가 없고, 바람직하게는 태그가 없다.
본 개시의 다른 측면은 암세포 또는 고형 종양 상에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 것으로, 중쇄 항체 유래의 방사성 표지된, 태그 없는 일가 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER2에의 결합을 위하여 단클론 항체인 (Herceptin®) 또는 단클론 항체인 페르투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 고형 종양 또는 암세포 상에 존재하는 HER2에 5 nM 미만의 친화도로서 결합한다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함한다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 동일하다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 동일하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
본원에서 게시한 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 카르복시 말단 폴리펩티드 태그가 없다.
본 개시의 여전히 다른 측면은 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH들 또는 이의 기능적 단편들 중 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 암세포 또는 고형 종양 상에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합한다. 상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다. 상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 HER2에 특이적으로 결합하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER2에의 결합을 위하여 단클론 항체인 (Herceptin®) 또는 단클론 항체인 페르투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 고형 종양 또는 암세포 상에 존재하는 HER2에 5 nM 미만의 친화도로서 결합한다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함한다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 동일하다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열들 중 적어도 하나와 동일하고, N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지된 것이다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
상기 약학적 조성물의 몇몇 실시 예에서, 상기 방사성 표지된, 태그 없는 일가 VHH 또는 이의 기능적 단편은 카르복시 말단 폴리펩티드 태그가 없다.
본 발명의 방사성 표지 항체 단편뿐만 아니라, 한 종 이상의 이러한 방사성 표지 항체 단편을 포함하거나 그로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드는 암의 예방, 예를 들어 암질환 재발의 예방, 즉 완화 후 한 종 이상의 징후, 증상 또는 질환의 재발의 회피 또는 예방을 위해 사용될 수 있으나, 그로 제한되지 않는다.
도 1: His-태그 [131I]SGMIB-표지 이가 항-HER2 VHH 2Rb17c의 주사 후, 관심 있는 여러 조직들을 자동화 감마 카운터에서 131I 활성에 대하여 카운트한다. 흡수값은 % 주입 활성/그램 조직(% IA /g)으로 표시되었다. 흡수값은 주사 후 3시간, 24시간 및 72시간에서 좌측에서 우측으로 도시한다. 얻어진 데이터를 이용하여, 건강한 조직에 대한 종양의 비를 계산했다. 여성 성인에 대한 방사선량 평가치는 1시간의 배뇨 방광 간격을 이용하여 OLINDA 1.0 소프트웨어를 이용하여 생체 분포 데이터로부터 계산되었다. 그 계산치는 장기내의 분해들의 수를 결정하기 위해 시간-활성 곡선에 기초했다. 여러 장기에 대하여 적절한 가중 계수를 이용하여 장기 선량 및 유효 선량을 계산했다.
도 2: His-태그 [131I]SGMIB-표지 일가 항-HER2 VHH 2Rb17c의 주사 후, 관심 있는 여러 조직들을 자동화 감마 카운터에서 131I 활성에 대하여 카운트한다. 흡수값은 % 주입 활성/그램 조직(% IA /g)으로 표시되었다. 흡수값은 주사 후 3시간, 24시간 및 72시간에서 좌측에서 우측으로 도시한다. 얻어진 데이터를 이용하여, 건강한 조직에 대한 종양의 비를 계산했다. 여성 성인에 대한 방사선량 평가치는 1시간의 배뇨 방광 간격을 이용하여 OLINDA 1.0 소프트웨어를 이용하여 생체 분포 데이터로부터 계산되었다. 그 계산치는 장기 내의 분해들의 수를 결정하기 위해 시간-활성 곡선에 기초했다. 여러 장기에 대하여 적절한 가중 계수를 이용하여 장기 선량 및 유효 선량을 계산했다.
도 3: His-태그 [131I]SGMIB-표지 일가 항-HER2 VHH 2Rs15d의 주사 후, 관심 있는 여러 조직들을 자동화 감마 카운터에서 131I 활성에 대하여 카운트한다. 흡수값은 % 주입 활성/그램 조직(% IA/g)으로 표시되었다. 흡수값은 주사 후 3시간, 24시간 및 72시간에서 좌측에서 우측으로 도시한다. 얻어진 데이터를 이용하여, 건강한 조직에 대한 종양의 비를 계산했다. 여성 성인에 대한 방사선량 평가치는 1시간의 배뇨 방광 간격을 이용하여 OLINDA 1.0 소프트웨어를 이용하여 생체분포 데이터로부터 계산되었다. 그 계산치는 장기 내의 분해들의 수를 결정하기 위해 시간-활성 곡선에 기초했다. 여러 장기에 대하여 적절한 가중 계수를 이용하여 장기 선량 및 유효 선량을 계산했다.
도 4: 전신 이미지화 및 99mTc-표지 VHH들의 생체분포. 정상(naive)(a, e), 5T33MM (b, f) 또는 5T2MM 마우스(c, g)에서 99mTc-cAbBCII10 (a 내지 c) 또는 99mTc-R3B23 (e 내지 g)의 주사(p.i.) 후 1시간에서 융합된 SPECT/micro-CT 스캔 이미지들의 시상도(Sagittal view). 각각의 그룹의 하나의 대표적인 이미지가 도시되어 있다. 국립보건원(National Institutes Health)의 색상 척도(color scale)가 사용되고, 모든 이미지들은 주입 활성에 대하여 보정된, 이미지 내의 최대 활성에 대하여 25%로 균등하게 축소된다. 주사 후(i.p.) 1.5시간에서 정상, 5T33MM 및 5T2MM 병든 마우스에서 99mTc-cAbBCII10 (d) 및 99mTc-R3B23 (h)의 흡수 값. 방사능은 붕괴에 대하여 보정된 그램 조직 또는 장기 당 주입 활성의 백분율(%IA/g)로 나타낸다.
도 5: 177루테늄-접합 R3B23 VHH를 이용한 5T2MM 마우스의 예방적 처리. (a) 177Lu-R3B23 (n=6), 177Lu-cAbBcII10 (n=6) 또는 염수 용액 (무처리; n=3)를 이용하여 5주간 처리한 5T2MM 마우스의 융합된 SPECT/micro-CT 스캔 이미지의 시상도. 이미지화의 목적을 위하여, 모든 마우스들은 99mTc-R3B23 VHH로 주사되었고, 주사 후 1시간에서 SPECT/micro-CT 스캔 이미지가 획득되었다. 국립보건원(National Institutes Health)의 색상 스케일이 사용되고, 모든 이미지들은 이미지 내의 최대 활성에 대하여 20%로 균등하게 축소된다. 각각의 그룹의 하나의 대표적인 이미지가 도시되어 있다. (b) 177Lu-R3B23를 이용한 5주의 처리 후 심장에서 99mTc-R3B23 트레이서 흡수의 상대적인 양. (c) 177Lu-R3B23을 이용한 7주의 처리 후 비장의 중량. *P<0.05; **P<0.005; ***P<0.0005; n.s., 유의적이지 않음.
도 6: VHH인 R2A6, R2A57, R3B23 및 R3B41은 5T2MM 개별특이형(idiotype) 상의 밀집하고 크게 중복되는 에피토프들에 결합한다. (A) 표면 플라스몬 공명 측정을 통해 확인한 바와 같이, 고정화된 5T2MM에의 결합을 위한 VHH들 사이의 대표적인 경쟁 연구. 각각의 그래프에서, 등몰 농도(각각 1 mM)에서 두 개의 VHH들 사이의 경쟁이 도시되어 있다. 두 개의 VHH들은, 첫 번째 단계에서의 하나의 VHH의 포화 결합이 두 번째 단계에서의 경쟁하는 VHH의 결합을 저해하는 때 동일 에피토프에 대하여 경쟁한다. (B) 5T2MMid 항원의 중복되는 에피토프들에 대한 4개의 연구된 VHH들의 결합에 대한 제안된 모델.
도 7: VHH인 R2A6, R2A57, R3B23 및 R3B41에 의한 5T2MMid의 특이적 인식. 고정화된 5T2MMid, 5T33MMid, 전체 마우스 IgG 또는 블랭크 웰(well)에서 His- 및 HA-태그를 갖는 정제된 VHH들의 ELISA. 결합된 VHH들은 HRP-결합 항-HA 이차 항체를 이용하여 검출했다. 결과는 평균 ± 3회의 독립적인 실험의 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 8: VHH인 R2A6, R2A57, R3B23 및 R3B41의 결합 친화성 측정. (A) 고정화된 5T2MM 개별특이형에 대한 정제된 VHH들의 표면 플라스몬 공명(SPR) 센소그램(sensogram). 각각의 센소그램은 500 내지 1.95nM에서 VHH의 2배 희석액의 1단계 결합 후, 2단계에서 항원으로부터의 해리를 나타낸다. (B) 고정화된 5T2MM 개별특이형에 대한 SPR에 의한 정제된 VHH들의 계산된 결합 속도 상수 ka1 및 ka2, 해리 속도 상수 kd1 및 kd2 및 평형 해리 상수 KD(2단계 결합 모델을 구비한 곡선에 기초함).
도 9: 5T2MM 세포에 대한 정제된 HA-태그 VHH들의 유세포 분석.
생체 외 5T2MM 세포를 대조 VHH cAbBclM O, 항-5T2MMid VHH 또는 항-5T2MMid 항체와 함께 배양했다. VHH 결합은 항-HA 항체 및 항-IgG1 APC 항체를 이용하여 검출했다. 항-5T2MMid 항체는 항-IgG APC에 의해 직접 검출되었다. 각각의 VHH에 대한 하나의 대표적인 프로필이 도시되어 있다(n=3). 항-5T2MMid MoAb를 이용한 막 염색 결과, 전체 집단의 66.8%가 5T2MMid에 대하여 양성인 것으로 확인되었다. 항-5T2MMid MoAb를 이용한 염색과 비교하였을 때, VHH인 R2A6, R2A57 및 R3B41은 5T2MMid 양성 집단의 85.2%, 28.7% 및 24.1%를 각각 검출할 수 있었다. VHH R3B23 은 5T2MMid 양성 집단의 98.7%를 검출한 반면, 대조군인 VHH cAbBclHO은 이러한 세포를 염색하지 않았다.
도 10: 99mTc-표지 R3B23 VHH를 이용한 질병 진행의 모니터링. 5T2MM 종양 세포 접종 후 0, 6, 9 및 12 주에서 스캔한 마우스의 융합된 SPECT/micro-CT 스캔의 시상도. 트레이서 혈액 수준을 비침습적으로 측정하기 위한 간접적인 방법으로서, 본 발명자들은 심장에서 ROI에서 %IA/cm3을 정량했다. NIH 색상 척도가 사용되고, 모든 이미지들은 주입 활성에 대하여 보정된, 이미지 내의 최대 활성을 기준으로 75%로 균등하게 축소된다. 5T2MM 세포 접종 후 6주째부터, 본 발명자들은 혈액내의 트레이서 흡수를 정량할 수 있었고(0.83±0.06%), 이러한 값은 9주째에 증가했고(0.99±0.04%) 12주째에 일정하게 유지되었다(0.99±0.02%). 혈액 풀(Blood-pool) 수준은 정상(naive) 마우스의 경우 매우 낮았다(0.0146±0.0004%). 하나의 대표적인 추적 연구 결과가 도시되어 있다(n=5).
도 11: 여러 가지 태그 없는 2Rs15d 접합체들의 (방사-)크로마토그래피 분석. (A) 미접합 VHH, (B) CHX-A"-DTPA-2Rs15d, (C) 1B4M-DTPA-2Rs15d, (D) 177Lu-DTPA-2Rs15d, (E) 111In-DTPA-2Rs15d; (A-C) Superdex 10/30 상의 SEC, (D) Superdex 75 5/150GL 상의 방사-SEC; (E) PLRP-S 상의 방사-HPLC. 주요 피크의 R-시간이 각각의 그래프에서 도시되어 있다.
도 12: 건강한 Wistar 쥐(n=3)에서 여러 In-표지 2Rs15d 포맷의 주사 후 시간에 따른 신장에서 방사능의 축적; (A-D) 감마 카메라 동적 신티그래피에 의해 얻은 이미지들의 선택이 도시되어 있다; (A) 2Rs15d-Myc-His-태그, (B) 2Rs15d-His-태그, (C) 태그 없는 2Rs15d, (D) 80 mg/kg 젤로푸신(Gelofusin)을 동시 주입한 태그 없는 2Rs15d. (E) 쥐(조건당 n=3)에서 신장 정체의 시간-활성 곡선. 신장에서의 최저 축적은 150 mg/kg 젤로푸신이 동시 주입된 In-표지 태그 없는 2Rs15d의 경우에 관찰되었다.
도 13: 복막 내 투여 후 1시간째에 HER2pos 종양 이종이식 마우스에서 177Lu-표지 2Rs15d 작제물의 생체 외 생체분포 분석. 동물들에게 21.5 MBq (4㎍) 방사성접합체(radioconjugate)를 주사했다. 칼럼, 평균 (n=3); 바, SD. 신장 축적은 C-말단 아미노산의 제거 및 젤로푸신의 동시 주입을 통해 유의하게 감소했다. 종양 표적화는 영향을 받지 않았다.
도 14: 표적화된 방사핵종 치료 동안의 종양 성장 모니터링. (A) 생체발광 이미지화(ph/s/cm2/sr) 또는 (B) 캘리퍼 측정(mm3)을 이용하여 시간(일)에 따라 종양 체적을 정량했다. 동물들(그룹당 n=8)은 태그 없는 177Lu-표지 2Rs15d (20.7 ± 0.4 MBq)의 매주 주사를 통해 처리했고, 대조군의 경우 PBS 또는 177Lu-표지 BCII10 (19.3 ± 0.8 MBq)으로 처리했다. 모든 처리는 150 mg/kg 젤로푸신을 동시주입하면서 수행했다. 종양 성장의 측면에서, 캘리퍼 및 생체발광 측정의 경우 두 대조군과 처리군의 사이에서 중요한 차이가 관찰되었다.
도 15: (A) 표적화 방사핵종 처리 동안의 무사건 생존율(Event-free survival). 사건(Event)은 다음과 같이 정의된다. 1. 사망; 2. > 20% 체중 감소; 3. 궤양화 종양 조직; 4. 종양 체적 > 250 mm3. 동물들(그룹당 n=8)은 태그 없는 177Lu-표지 2Rs15d (20.7 ± 0.4 MBq)의 매주 주사를 통해 처리했고, 대조군의 경우 PBS 또는 177Lu-표지 BCII10 (19.3 ± 0.8 MBq)으로 처리했다. 모든 처리는 150 mg/kg 젤로푸신을 동시 주입하면서 수행했다. (B) 신장 조직병리. 177Lu-선량의 동물군의 신장을 PBS-처리 동물군과 비교했다. 섹션을 H&E 염색하고 신장 독성의 증거를 조사했다. (B.1) PBS, (B.2) 태그 없는 177Lu-표지 BCII10 또는 (B.3) 태그 없는 177Lu-표지 2Rs15d를 투여받은 동물군들 사이에서 신장 조직의 차이가 관찰되지 않았다.
도 16: (A) 태그 없는 2Rs15d, (B) 태그 없는 CHX-A"-DTPA-2Rs15d 및 (C) 태그 없는 1B4M-DTPA-2Rs15d의 ESI-Q-ToF-MS 분석. 태그 없는 2Rs15d에 대한 CHX-A"-DTPA의 반응은 태그 없는 2Rs15d에 접합된 1, 2 및 3 DTPA의 혼합물을 나타냈다. 1B4M-DTPA를 이용하여, 2Rs15d에 대한 2 및 3 DTPA의 혼합물이 관찰되었다. 태그 없는 2Rs15d에 대한 1 B4M-DTPA 및 CHX-A"-DTPA 모두의 우세한 접합비(킬레이터: VHH)는 2:1 이다.
도 17: 트라스투주맙 접합체의 (방사-)크로마토그래피 분석. (A) 미접합 트라스투주맙, (B) 1B4M-DTPA-트라스투주맙, (C) 177Lu-DTPA-트라스투주맙; (A,B) Superdex 75 10/30 상의 SEC, (B) Superdex 75 5/150GL 상의 방사-SEC. 주요 피크의 R-시간이 각각의 그래프에 도시되어 있다.
도 18: 111In-표지 항-HER2 VHH의 주입 및 감마 카메라 신티그래피 후 시간에 따른 건강한 Wistar 쥐(조건당 n=3)의 신장에서 방사능의 축적. (A) VHH 2Rb17c, (B) VHH 1R136d.
도 19: 수컷 C57bl/6 마우스에서 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 혈액 클리어런스(clearance). 값은 % 주입 활성 / 전체 혈액 체적(% IA / TBV)으로 나타냈다.
도 20: 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 치료 효과. 동물들(그룹당 n=6/7)을 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d(131I-SGMIB-2Rs15d nb)를 매주 주사하여 처리하였고, 대조군의 경우 비히클 용액(vehicle solution) 또는 태크없는 일가 [131I]SGMIB-표지 비표적화 대조 VHH (131I-SGMIB-비표적화 nb)로 처리하였다. 20% 체중 감소 또는 1 cm3 초과의 종양 체적에 도달하는 때 동물들을 안락사시켰다. 여러 그룹의 동물들의 생존율이 도시되어 있다.
[정의]
[일반적 정의]
본 발명은 특정 실시 예에 관하여 설명되지만, 본 발명이 그에 제한되는 것이 아니라 특허청구범위에 의해서만 제한된다. 특허청구범위에서의 임의의 참조 부호는 그 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 하기의 용어 및 정의들은 오로지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본원에 구체적으로 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 용어는 본 발명의 분야의 당업자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 전문가(Practitioner)들은 당업계의 정의 및 용어에 대하여 다음문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)]을 특히 참조한다. 본원에서 제공된 정의들은 당업자에 의해 이해되는 것보다 좁은 범위를 갖는 것으로 해석되지 않아야 한다.
달리 나타내지 않는 경우, 구체적으로 상세히 기재되지 않는 모든 방법, 단계, 기법 및 조작법(manipulation)은 당업자에게 명백하게 되는 바와 같이, 원래 알려진 방식으로 수행될 수 있거나 수행되어 왔다. 예를 들어, 표준 핸드북(handbook), 위에서 나타낸 일반적인 배경 및 본원에서 인용한 추가의 참조문헌들을 다시 참조한다.
본원에서 사용되는 것으로, 단수형인 'a', 'an', 및 'the'는 그 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 경우 단수 및 복수의 지시 대상을 모두 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 '포함하는(comprising)', '포함한다(comprises)' 및 '구성되는'은 '포함하는(including)', '포함한다(includes)' 또는 '함유하는(containing)', '함유한다(contains)'와 같은 뜻을 나타내고, 모든 것을 포함하거나 제한이 없고, 추가의 언급되지 않는 멤버, 구성요소 또는 방법 단계들을 제외하는 것이 아니다.
종점들에 의한 수치 범위의 언급은 그 언급된 종점뿐만 아니라 그 각각의 범의내에 포함된 모든 수치 및 분수를 포함한다.
파라미터, 양, 시간적인 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 때 사용되는 용어 '약'은 그러한 편차가 본 발명에서 수행하기에 적절한 한에 있어서는 그 특정된 값의 +/- 10% 이하, 바람직하게는 +/- 5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/- 1% 이하, 여전히 더욱 바람직하게는 +/- 0.1% 이하의 편차를 포함하는 것을 의미한다. 수식어 '약'이 나타내는 값은 그 자체가 또한 구체적이고 바람직한 것으로서 개시되는 것임을 이해하여야 한다.
본원에서 사용되는 것으로, 아미노산 잔기는 그의 전체 명칭으로 표시되거나 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 표시된다.
본원에서 사용되는 용어 '폴리펩티드', '단백질', '펩티드', 및 '아미노산 서열'은 상호교환적으로 사용되고, 코드화되고 코드화되지 않은 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형 또는 유도된(derivatized) 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본(backbone)을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는, 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 '핵산 분자', '폴리뉴클레오티드', '폴리핵산', '핵산'은 상호교환적으로 사용되고, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드 또는 이의 유사체의 폴리머 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원적 구조를 가질 수 있고, 알려져 있거나 알려져 있지 않은 의의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예로는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 매신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 제조합 폴리뉴클레오티드, 측쇄 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 조절 영역, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머가 있다. 상기 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 '상동성(homology)'은 동일 또는 상이한 택손(taxon) 유래의 두 개의 거대 분자 사이, 특히 두 개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 적어도 2차 구조적 유사성의 의미하는데, 상기 유사성은 공유 계통(shared ancestry)에 기인한 것이다. 따라서, 용어 '상동성'은 상기 이차 및 선택적으로 삼차 구조적 유사성을 갖는 관련 거대분자들을 의미한다. 둘 이상의 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위하여, 제 1 뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 사이의 '서열 동일성의 %'는 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 제 2 뉴클레오티드 서열에서의 해당하는 위치의 뉴클레오티드들에 동일한 제 1 뉴클레오티드 서열에서의 뉴클레오티드들의 수를 제 1 뉴클레오티드 서열에서의 뉴클레오티드들의 총수로 나누고 100%를 곱하거나, NCBI Blast와 같은 서열 정렬을 위한 알려진 컴퓨터 알고리즘을 이용함으로써 계산될 수 있다. 두 개의 아미노산 서열들 사이의 서열 동일성의 정도를 확인하는데 있어서, 당업자는 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 치환으로서 일반적으로 기재될 수 있고 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 영향을 미치지 않거나 본질적으로 영향을 미치지 않는 이른바 '보존적' 아미노산 치환을 고려에 넣을 수 있다. 가능한 보존적 아미노산 치환은 당업자에게 명백하게 된다. 아미노산 서열 및 핵산 서열들은 그들의 전체 길이에 걸쳐서 100% 서열 동일성을 갖는 경우 '정확하게 동일하다'라고 말한다.
본원에서 사용되는 용어 '친화력'은 폴리펩티드, 특히 항체와 같은 면역글로불린, 또는 VHH와 같은 면역글로불린 단편이 항원에 결합하여 이의 결합에 의해 형성된 복합체의 존재를 향해 항원 및 폴리펩티드의 평형을 이동시키는 정도를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 항원 및 항체(단편)이 비교적 동일한 농도에서 결합되는 경우, 높은 친화력의 항체(단편)가 이용가능한 항원에 결합하여 얻어지는 복합체의 높은 농도를 향해 그 평형을 이동시키게 된다. 단백질 결합 도메인과 항원성 표적 사이의 친화력을 설명하기 위해 해리 상수가 일반적으로 사용된다. 일반적으로, 그 해리 상수는 10-5 M 미만이다. 바람직하게, 그 해리 상수는 10-6 M 미만, 더욱 바람직하게는 10-7 M 미만이다. 가장 바람직하게, 그 해리 상수는 10-9 M과 같은 10-8 M 미만이다.
본원에서 사용되는 용어 '특이적으로 결합한다' 및 '특이적 결합'은 서로 다른 항원들의 동종 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하려는 폴리펩티드, 특히 항체와 같은 면역글로불린, 또는 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 면역글로불린 단편의 능력을 일반적으로 의미한다. 특정 실시 예에서, 특이적 결합 상호작용은 시료 내의 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원 사이에서 구별되며, 몇몇 실시 예에서는, 약 10 내지 100배 이상(예를 들어, 약 1000배 10,000배 이상)이다.
따라서, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편은 그 아미노산 서열이 그 표적(또는 이의 적어도 일부분 또는 단편)에 대하여 친화력이 있고/있거나 특이성이 있고/있거나 그에 대하여 지시되는(directed) 경우 특정 표적에 '특이적으로 결합한다'라고 말한다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편은 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열이 관심 있는 제 2 표적 항원에 결합하는 친화력보다 적어도 5배, 예를 들어, 적어도 10배, 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 1000배의 친화력을 가지고서 관심 있는 제 1 표적 항원에 결합하는 경우 '관심 있는 제 2 표적 항원이 아닌 관심 있는 제 1 표적 항원에 대하여 특이적이다'라고 말한다. 따라서, 특정 실시 예에서, 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열은 관심 있는 제 2 표적 항원이 아니라 관심 있는 제 1 표적 항원에 본원에 정의한 바와 같이 특이적으로 결합할 수 있는 경우 관심 있는 제 2 표적 항원이 아니라 관심 있는 제 1 표적 항원에 '대하여 특이적이다"라고 말한다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편의 '특이성'은 친화력 및/또는 결합력(avidity)에 기초하여 확인될 수 있다. 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열의 '친화력'은 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 및 이것이 결합하는 관심 표적 단백질의 해리를 위한 평형 상수로 표시된다. KD 값이 낮을수록, 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열과 이것이 결합하는 관심 표적 단백질 사이의 결합 강도가 강하다. 그렇지 않으면, 그 친화력은 1/KD에 해당하는 친화력 상수(KA)의 측면에서 표시될 수 있다. 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열의 결합 친화력은 관심 있는 특정 표적 항원에 따라, 당업자에게 알려진 방식으로 확인될 수 있다. 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열의 '결합력(avidity)'은 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열과 괸심있는 관련 표적 단백질 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합력은 관심 표적 단백질 상의 결합 부위와 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열상의 결합 부위 사이의 친화력 및 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열상에 존재하는 관련 결합 부위들의 수와 관련이 있다. 일반적으로, 본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열은 1 마이크로몰(1 μΜ) 미만, 바람직하게는 1 나노몰(1 nM) 미만의 해리 상수(KD)[즉, 몰당 약 1,000,000 (106M-1, 1E6/M) 이상, 바람직하게는 몰당 약 1,000,000,000 (109M-1, 1E9/M) 이상의 해리상수(KA)]를 가지고서 관심 표적 단백질에 결합한다. 약 1 밀리몰 초과의 KD 값은 일반적으로 비결합 또는 비특이적 결합을 나타내는 것으로 여겨진다. 또한 KD는 kOn(몰-1 초-1 또는 M-1s-1로 표시됨)으로 나타낸 그의 해리의 속도 상수에 대한, kOff(초-1 또는 s-1으로 표시됨)로 나타낸 복합체의 해리 속도 상수의 비로 표시될 수 있는 것으로 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 특히, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열은 0.1 내지 0.0001s-1의 kOff 및/또는 1,000 내지 1,000,000 M-1s-1의 kOn을 가지고서 관심 표적 단백질에 결합하게 된다. 결합 친화력, kOff 및 kOn은 당업자에게 알려진 방법, 예를 들어, ELISA 방법, 등온 적정 열량 측정법(isothermal titration calorimetry), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 유세포분석(fluorescence-activated cell sorting analysis)등을 통해 확인될 수 있다.
본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH와 같은 항체 단편은 이것이 생성되는 숙주 세포 및/또는 배지로부터 추출 또는 정제된 경우 본원에서 사용된 바와 같이 '본질적으로 분리된 (형태)'인 것으로 여겨진다.
본원에 게시된 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편에 관하여, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열상에 존재하는 용어 '결합 영역', '결합 부위' 또는 '상호작용 부위'는 표적 분자에의 결합을 초래하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열상에 존재하는 아미노산 잔기들의 특정 부위, 부분, 도메인 또는 스트레치(stretch)의 의미를 갖는다. 이러한 결합 영역은 표적 분자와 접촉하고 있는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열 유래의 특정 아미노산 잔기들로 본질적으로 구성된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 '(와) 경쟁', '교차 차단(cross-blocking)', '교차 결합(cross-binding)' 및 '교차 억제(cross-inhibiting)'는 적당한 시험관 내, 세포 또는 생체 내 분석법을 이용하여 측정된 바와 같이, 관심 표적 단백질에의 본원에서 게시한 바와 같은 다른 아미노산 서열의 결합과 상호작용할 수 있는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH와 같은 항체 단편을 일반적으로 의미한다. 따라서, 더욱 구체적으로, 본원에서 게시한 바와 같은 '(와) 경쟁', '교차 차단', '교차 결합' 및 '교차 억제'는 본원에서 게시한 바와 같은 또 다른 아미노산 서열과 관심 표적 단백질과의 결합을 방해 또는 그 결합과 경쟁함으로써, 본원에서 게시한 바와 같은 '교차 차단' 아미노산 서열을 이용하지 않는 본원에서 게시한 바와 같은 그 다른 아미노산 서열과 관심 표적 단백질과의 결합과 비교하여, 적당한 시험관 내, 세포 또는 생체 내 분석법을 이용하여 측정한 바와 같이, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상만큼 그 결합을 감소시키는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편은 관심 있는 두 개의 서로 다른 표적 단백질들 모두에 대하여 (본원에 정의된 바와 같이) 특이적인 경우 그 두 개의 서로 다른 표적 단백질들에 대하여 '교차 반응성'을 나타낸다고 말한다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편의 둘 이상의 결합 부위들 모두가 관심 표적의 아미노산 잔기들의 동일 부위, 결정기(determinant), 부분, 도메인 또는 스트레치에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합하는 경우, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열은 '이가(bivalent)'(아미노 산 서열상의 두 개의 결합 부위의 경우) 또는 다가(multivalent)(아미노 산 서열상의 두 개 초과의 결합 부위의 경우), 예를 들어 삼가(trivalent)라고 말한다.
본원에서 사용되는 것으로, VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편을 언급할 때의 용어 '일가(monovalent)'는 단량체 형태의 항체 단편을 의미한다. 일가 항체 단편은 오직 하나의 결합 부위만을 함유한다. 이러한 정황에서, VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편의 결합 부위는 관심 표적의 아미노산 잔기들의 특정 부위, 결정기, 부분, 도메인 또는 스트레치에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합하는 항체 단편의 하나 이상의 '상보성 결정 영역' 또는 'CDR'를 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로, VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편을 언급할 때의 용어 '태그가 없는(untagged)'은 외래의 폴리펩티드를 함유하지 않는(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같은 방사성 동위원소로 표지된 VHH 서열 또는 이의 단편만을 함유함) 항체 단편을 의미한다. 모범적인 외래 폴리펩티드 서열로는 카브복시 말단 폴리펩티드 태그, 예를 들어, His-태그, 시스테인 함유 태그(예를 들어, GGC-태그), 및/또는 Myc-태그가 있다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편을 언급할때의 용어 '이중 특이적(bi-specific)'은 a) 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열의 결합 부위들 중 둘 이상이 그 표적의 아미노산 잔기들의 동일 (즉, 상이한) 부위, 결정기, 부분, 도메인 또는 스트레치가 아니라 관심 있는 동일 표적에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합하거나 (이때, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열은 '이중 특이적'(그 아미노산 서열상의 두 개의 결합 부위의 경우) 또는 다중특이적(그 아미노산 서열상의 두 개 초과의 결합 부위의 경우)이라고 말함) 또는 b) 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열의 둘 이상의 결합 부위가 관심 있는 여러 가지 표적 분자들에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 용어 '다중특이적(multispecific)'은 두 개 초과의 결합 부위가 본원에 게시된 바와 같은 아미노 산 서열상에 존재하는 경우에 사용된다.
따라서, 본원에서 사용되는 '이중특이' VHH 와 같은 '이중특이' 아미노산 서열 또는 항체 단편, 또는 '다중특이' VHH와 같은 '다중특이' 아미노산 서열 또는 항체 단편은 각각 두 개 또는 적어도 두 개의 결합 부위를 포함하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH와 같은 항체 단편의 의미를 갖는데, 상기 둘 이상의 결합 부위는 상이한 결합 특이성을 갖는다. 따라서, 본원에서 정의한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH와 같은 항체 단편은 각각 둘 또는 두 개 초과의 상이한 결합 부위 영역들이 동일한 단량체성 아미노산 서열에 존재하는 경우 '이중특이적' 또는 '다중특이적'인 것으로 여겨진다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편의 '반감기(half-life)'는 본원에서 정의한 바와 같은 아미노산 서열의 생체 내 혈청 농도가 50% 만큼 감소하는데 필요한 시간으로 정의된다. 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열의 생체 내 반감기는 약동학적 분석과 같은 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 측정될 수 있다. 당업자에게 명백하게 되는 바와 같이, 그 반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하 면적(AUC)과 같은 파라미터를 이용하여 표현될 수 있다. 증가된 생체 내 반감기는 일반적으로 파라미터인 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하 면적(AUC)중 하나 이상, 바람직하게는 3개 모두의 증가에 특징이 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편을 언급할 때의 용어 "연장된 수명(lifetime extended)"은 항체 단편이 그 항체 단편의 반감기를 연장하도록 변형되어진 것을 나타내기 위해 사용된다. 항체 및 항체 단편의 반감기를 연장하기 위한 전략은 당업계에 잘 알려져 있고, 그의 예로는 제한없이, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 소혈청 알부민(BSA) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)과 같은, 반감기를 연장하는 하나 이상의 기 또는 부분(moieties), 항체 Fc 단편, 또는 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질을 표적하는 항원-결합 항체 단편에의 결합(화학적으로 또는 다른 방법으로)이 있다.
본원에서 사용되는 용어 '억제하는', '감소시키는' 및/또는 '예방하는'은 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하고 관심 표적 항원과 이의 천연 결합 짝(partner) 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 예방하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편(의 사용)을 의미할 수 있다. 또한, 용어 '억제하는', '감소시키는' 및/또는 '예방하는'은 적당한 시험관 내, 세포 또는 생체 내 분석법을 이용하여 측정한 바와 같이, 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하고 그 관심 표적 항원의 생물학적 활성을 억제, 감소 및/또는 예방하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편(의 사용)을 의미할 수도 있다. 따라서, '억제하는', '감소시키는' 및/또는 '예방하는'은 관심 표적 항원에 특이적으로 결합하고 그 관심 표적 항원이 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기작, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성을 억제, 감소 및/또는 예방하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열(의 사용)을 의미할 수도 있다. 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산의 길항제(antagonist)로서의 이러한 작용은 관심 표적 항원에 따라, 당업계에 알려진 임의의 적당한 방법 및/또는 임의의 적당한 (시험관 내 및 보통은 세포 또는 생체 내) 분석법을 이용하여 측정될 수 있다.
따라서, 더욱 구체적으로, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편을 이용한 '억제하는', '감소시키는' 및/또는 '예방하는'은, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열을 사용하지 않는 동일 조건하에서의 관심 표적 항원의 활성과 비교하여, 적당한 시험관 내, 세포 또는 생체 내 분석법을 이용하여 측정한 바와 같이, 예를 들어, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상 만큼, 관심 표적 항원과 이의 결합짝 사이의 상호작용을 억제, 감소 및/또는 예방하는 것, 또는 관심 표적 항원의 활성을 억제, 감소 및/또는 예방하는 것, 또는 관심 표적 항원이 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기작, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성을, 억제, 감소 및/또는 예방하는 것을 의미할 수 있다. 또한, '억제하는', '감소시키는' 및/또는 '예방하는'은 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열이 존재하지 않는 동일 조건과 비교하여, 그의 천연 결합짝들 중 하나 이상에 대한 관심 표적 항원의 친화성, 결합력, 특이성 및/또는 선택성의 감소를 유발하고/하거나 관심 표적 항원이 존재하는 배지 또는 주변에서의 하나 이상의 조건(pH, 이온 강도, 공동 인자(co-factor)의 존재 등과 같은)에 대한 관심 표적 항원의 민감성의 감소를 유발하는 것을 의미할 수도 있다. 본 발명의 문맥에서, '억제하는', '감소시키는' 및/또는 '예방하는'은 관심 표적 항원의 알로스테릭(allosteric) 억제, 감소 및/또는 예방을 포함할 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 '향상시키는', '증가시키는' 및/또는 '활성화하는'은 관심 표적 단백질에 특이적으로 결합하고 그 관심 표적 단백질과 이의 천연 결합짝 사이의 상호작용을 향상, 증가 및/또는 활성화하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편(의 사용)을 의미할 수 있다. 또한, 용어 '향상시키는', '증가시키는' 및/또는 '활성화하는'은 적당한 시험관 내, 세포 또는 생체 내 분석법을 이용하여 측정한 바와 같이, 관심 표적 단백질에 특이적으로 결합하고 그 관심 표적 단백질의 생물학적 활성을 향상, 증가 및/또는 활성화하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편(의 사용)을 의미할 수도 있다. 따라서, '향상시키는', '증가시키는' 및/또는 '활성화하는'은 관심 표적 단백질에 특이적으로 결합하고 그 관심 표적 단백질이 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기작, 효과, 반응, 기능 경로 또는 활성을 향상, 증가 및/또는 활성화하는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산(의 사용)을 의미할 수도 있다. 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산의 작동제(agonist)로서의 이러한 작용은 관심 표적 항원에 따라, 당업계에 알려진 임의의 적당한 방법 및/또는 임의의 적당한 (시험관 내 및 보통은 세포 또는 생체 내) 분석법을 이용하여 측정될 수 있다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편의 억제 또는 길항 활성 또는 향상 또는 작동 활성은 가역적 또는 비가역적일 수 있지만, 약학적 및 약물학적 용도의 경우 비가역적으로 발생하는 것이 일반적이다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편은 이것이 생성되는 숙주 세포 및/또는 배지로부터 추출 또는 정제된 것인 경우, 본원에서 사용된 바와 같은 '본질적으로 분리된 (형태)'인 것으로 여겨진다.
본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열, 특히 VHH 또는 이의 기능적 단편과 같은 항체 단편에 관하여, 본원에서 개시된 바와 같은 아미노산 서열상에 존재하는 용어 '결합 영역', '결합 부위' 또는 '상호작용 부위'는 그 표적 분자상에 존재하는 특정 부위, 영역, 위치, 부분 또는 도메인의 의미를 갖는데, 상기 특정 부위, 영역, 위치, 부분 또는 도메인은 그 표적 분자에의 결합을 유발하는 것이다. 따라서, 이러한 결합 영역은 그 표적 분자에 결합시 그 아미노산 서열과 접촉하는 그 표적 분자의 특정 부위, 영역, 위치, 부분 또는 도메인으로 본질적으로 구성된다.
본원에서 사용되는 용어 '항체'는 다클론 항체, 단클론 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 및 Fab F(ab)2, Fv, 및 모항체의 항원 결합 기능을 보유하는 다른 단편들과 같은 그들의 단편을 의미한다. 이와 같이, 항체는 면역글로불린 또는 당단백질, 또는 변형된 면역글로불린 유사 프레임워크(framework) 내에 포함된 항원 결합 부분을 포함하는 작제물, 또는 비면역글로불린 유사 골격 또는 지지체(scaffold)를 포함하는 작제물에 포함된 항원 결합 단백질을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 '단클론 항체'는 동종 항체 집단(population)을 갖는 항체 조성물을 의미한다. 상기 용어는 상기 항체의 종 또는 유래에 대하여 제한되지 않고, 이것이 만들어지는 방법에 의해 제한되지도 않는다. 상기 용어는 전제 면역글로불린뿐만 아니라, 항체의 항원 결합 기능을 보유하는 단편 등을 포함한다. 임의의 포유동물 종의 단클론 항체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 그러나, 실제적으로, 상기 항체는 일반적으로, 단클론 항체를 생성하기 위해 필요한 하이브리드 세포주 또는 하이브리도마를 제조하는데 있어서 사용하기 위한 쥐 또는 쥐과 동물 세포주의 이용가능성 때문에 쥐 또는 쥐과동물 유래일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 '다클론 항체'는 이종 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 의미한다. 다클론 항체는 면역화 동물 유래 또는 선택된 인간 유래의 혼주(pooled) 혈청에서 종종 얻어진다.
본원에서 사용되는 것으로 '항체의 중쇄 가변 도메인 또는 이의 기능적 단편'은 (i) 낙타(camelid) 또는 상어의 중쇄 항체의 종쇄 가변 도메인을 포함하나 그로 제한되지 않는, 경쇄가 본래 없는 중쇄 항체의 중쇄 가변 도메인(이하 VHH로도 나타냄), 또는 (ii) 통상적인 4개 사슬 항체의 낙타화 (본원에서 더욱더 정의한 바와 같은) 가변 도메인(이하 낙타화 VH라고도 나타냄)을 포함하나 그로 제한되지 않는 통상적인 4개 사슬 항체의 중쇄 가병 영역(이하 VH라고도 나타냄) 또는 이의 임의의 기능적 단편, 예를 들어, 종양 항원 또는 암세포 상에 존재하는 항원에의 결합에 특히 적당하고 본원에서 게시한 바와 같은 VHH에 존재하고/하거나 그에 혼입될 수 있는 (또는 본원에서 게시한 바와 같은 VHH의 CDR 서열에 기초하고/하거나 그로부터 유도될 수 있는) 아미노산 잔기의 하나 이상의 스트레치(즉, 작은 펩티드) 등을 의미한다.
아래에서 더욱 더 기재하는 바와 같이, 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 및 구조는 당업계 및 이하에서 '프레임워크 영역 1' 또는 'FR1', '프레임워크 영역 2' 또는 'FR2', '프레임워크 영역 2' 또는 'FR3', 및 '프레임워크 영역 4' 또는 'FR4'로 각각 나타내어지는 4개의 프레임워크 영역 또는 'FR들'로 구성되는 것으로 판단될 수 있으나, 그에 제한되지 않고, 상기 프레임워크 영역들은 당업계에서 '상보성 결정 영역 1' 또는 'CDR1', '상보성 결정 영역 2' 또는 'CDR2' 및 '상보성 결정 영역 3' 또는 'CDR3'로 각각 나타내어지는 세개의 상보성 결정 영역들 또는 'CDR'들에 의해 중단된다(interrupted).
본원에서 사용되는 것으로, 항체의 문맥 내의 용어 '상보성 결정 영역' 또는 'CDR'는 H (중쇄) 또는 L (경쇄)의 가변 영역(각각 VH 및 VL로 약칭함)을 의미하고, 항원성 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 CDR 영역은 특정 항원 결정 구조에 대한 항체의 기본적 특이성의 원인이 된다. 또한, 이러한 영역은 '초가변 영역'이라고도 나타낸다. CDR들은 기변 영역들 내의 아마노산들의 비접촉 스트레치들을 나타내지만, 종에 상관없이, 가변 중쇄 및 경쇄 영역들 내의 이러한 중요한 아미노산 서열들의 위치는 그 가변 사슬들의 아미노산 서열들의 유사한 위치를 갖는 것으로 확인되었다. 모든 규범적인 항체들의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR 영역들을 갖는데, 그 CDR 영역들은 각각 경쇄(L) 및 중쇄(H)의 경우 다른 것(L1 , L2, L3, H1 , H2, H3로 명명됨)과 접촉하지 않는다.
또한, 아래에 더욱더 기재하는 바와 같이, 항체(VHH 또는 VH를 포함)의 중쇄 가변 도메인 내의 아미노산 잔기의 총수는 110 내지 130의 범위, 바람직하게는 112 내지 115의 범위, 가장 바람직하게는 113일 수 있다. 그러나, 항체의 중쇄 가변 도메인의 부분, 단편 또는 유사체는 이러한 부분, 단편 또는 유사체가 기능적 활성(의 적어도 일부)를 보유하고/하거나, 이러한 부분, 단편 또는 유사체가 유래되는 항체의 본래 중쇄 가변 도메인의 결합 특이성(의 적어도 일부)를 보유하는 한에 있어서는 그의 길이 및/또는 크기가 특별히 제한되지 않는 것을 유념하여야 한다. 기능적 활성(의 적어도 일부)를 보유하고/하거나, 이러한 부분, 단편 또는 유사체가 유래되는 항체의 본래 중쇄 가변 도메인의 결합 특이성(의 적어도 일부)를 보유하는 부분, 단편 또는 유사체들도 본원에서는 중쇄 가변 도메인의 '기능적 단편'으로 더욱더 기재된다.
항체(VHH 또는 VH를 포함)의 중쇄 가변 도메인의 가변 도메인의 아미노산 잔기들은 위에서 나타낸, Riechmann 및 Muyldermans의 논문에서 낙타(Camelid) 유래의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, Kabat 등에 의해 제공된 중쇄 가변 도메인에 대한 일반적인 넘버링('Sequence of proteins of immunological interest', US Public Health Services, NIH Bethesda, Md., Publication No. 91)에 따라 넘버링된다(예를 들어, 상기 참조문헌의 도 2 참조). 이러한 넘버링에 따라, 중쇄 가변 도메인의 FR1은 위치 1 내지 30의 아미노산 잔기들을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 CDR1은 위치 31 내지 35의 아미노산 잔기들을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 FR2는 위치 36 내지 49의 아미노 산들을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 CDR2는 위치 50 내지 65의 아미노산 잔기들을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 FR3는 위치 66 내지 94의 아미노산 잔기들을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 CDR3는 위치 95 내지 102의 아미노산 잔기들을 포함하고, 중쇄 가변 도메인의 FR4는 위치 103 내지 113의 아미노산 잔기들을 포함한다. 이 점에 있어서, VHH 도메인에 당업계에 잘 알려진 바와 같이, CDR들의 각각에서 아미노산 잔기들의 총수는 변화할 수 있고 카밧(Kabat) 넘버링에 의해 나타내어진 아미노산 잔기들의 총수에 해당하지 않을 수 있다는 것을 유념하여야 한다(즉, 카밧 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에 존재하지 않을 수 있거나, 그 실제 서열은 카밧 넘버링에 의해 가능하게 되는 수보다 더욱 많은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다). 이는 일반적으로, 카밧에 따른 넘버링이 실제 서열 내의 아미노산 잔기들의 실제 넘버링에 해당하거나 해당하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 그러나 일반적으로, 카밧의 넘버링에 따르고 CDR들 내의 아미노산 잔기들의 수와 상관없이, 카밧 넘버링에 따른 위치 1은 FR1의 출발점에 해당하거나 그 반대이고, 카밧 넘버링에 따른 위치 36은 FR2의 출발점에 해당하거나 그 반대이고, 카밧 넘버링에 따른 위치 66은 FR3의 출발점에 해당하거나 그 반대이고, 카밧 넘버링에 따른 위치 103은 FR4의 출발점에 해당하거나 그 반대라고 말할 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기들을 넘버링하기 위한 대안의 방법들은 Chothia 등 (Nature 342, 877-883 (1989))에 의해 기재된 방법, 이른바 'AbM 정의' 및 이른바 '접촉 정의(contact definition)'이다. 그러나 본 발명의 설명, 특허청구범위 및 도면에서는, 달리 나타내지 않는 경우, Riechmann 및 Muyldermans에 의해 VHH 도메인에 적용된 바와 같은 카밧에 따른 넘버링이 수행된다.
중쇄 항체 및 그의 가변 도메인의 일반적인 설명에 대하여는, 일반적인 배경 기술로서 언급되는 하기의 참조문헌들을 특히 참조한다: Vrije Universiteit Brussel의 WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103; Unilever의 WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193; Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)의 WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 및 WO 03/055527; Algonomics N.V. 및 Ablynx NV의 WO 03/050531; National Research Council of Canada의 WO 01/90190; Institute of Antibodies의 WO 03/025020 (=EP 1 433 793); Ablynx NV 의 WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, 및 Ablynx NV의 그 밖의 공개된 특허 출원; Hamers-Casterman 등, Nature 1993 Jun. 3; 363 (6428): 446-8; Davies 및 Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb. 21; 339(3): 285-90; Muyldermans 등, Protein Eng. 1994 September; 7(9): 1 129-3; Davies 및 Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi 등, 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies 및 Riechmann, Protein Eng. 1996 June; 9(6): 531-7; Desmyter 등, Nat Struct Biol. 1996 September; 3(9): 803-11; Sheriff 등, Nat Struct Biol. 1996 September; 3(9): 733-6; Spinelli 등, Nat Struct Biol. 1996 September; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi 등, FEBS Lett. 1997 Sep. 15; 414(3): 521-6; Vu 등, Mol. Immunol. 1997 November-December; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch 등, Journal of Carnel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen 등, J. Mol. Biol. 1998 Jan. 23; 275(3): 413-8; Lauwereys 등, EMBO J. 1998 Jul. 1 ; 17(13): 3512-20; Frenken 등, Res Immunol. 1998 July-August; 149(6):589-99; Transue 등, Proteins 1998 Sep. 1 ; 32(4): 515-22; Muyldermans 및 Lauwereys, J. Mol. Recognit. 1999 March-April; 12 (2): 131-40; van der Linden 등, Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr. 12; 1431 (1): 37-46; Decanniere et al., Structure Fold. Des. 1999 Apr. 15; 7(4): 361 -70; Ngyuen 등, Mol. Immunol. 1999 June; 36(8): 515-24; Woolven 등, Immunogenetics 1999 October; 50 (1-2): 98-101; Riechmann 및 Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec. 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli 등, Biochemistry 2000 Feb. 15; 39(6): 1217-22; Frenken 등, J. Biotechnol. 2000 Feb. 28; 78(1): 11-21; Nguyen 등, EMBO J. 2000 Mar. 1 ; 19(5): 921 -30; van der Linden et al., J. Immunol. Methods 2000 Jun. 23; 240 (1-2): 185-95; Decanniere 등, J. Mol. Biol. 2000 Jun. 30; 300 (1): 83-91; van der Linden 등, J. Biotechnol. 2000 Jul. 14; 80(3): 261 -70; Harmsen 등, Mol. Immunol. 2000 August; 37(10): 579-90; Perez 등, Biochemistry 2001 Jan. 9; 40(1): 74-83; Conrath 등, J. Biol. Chem. 2001 Mar. 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans 등, Trends Biochem Sci. 2001 April; 26(4):230-5; Muyldermans S., J. Biotechnol. 2001 June; 74 (4): 277-302; Desmyter 등, J. Biol. Chem. 2001 Jul. 13; 276 (28): 26285-90; Spinelli 등, J. Mol. Biol. 2001 Aug. 3; 311 (1): 123-9; Conrath 등, Antimicrob Agents Chemother. 2001 October; 45 (10): 2807-12; Decanniere 등, J. Mol. Biol. 2001 Oct. 26; 313(3): 473-8; Nguyen 등, Adv Immunol. 2001; 79: 261-96; Muruganandam 등, FASEB J. 2002 February; 16 (2): 240-2; Ewert 등, Biochemistry 2002 Mar. 19; 41 (11): 3628-36; Dumoulin 등, Protein Sci. 2002 March; 11 (3): 500-15; Cortez-Retamozo 등, Int. J. Cancer. 2002 Mar. 20; 98 (3): 456-62; Su 등, Mol. Biol. Evol. 2002 March; 19 (3): 205-15; van der Vaart J M., Methods Mol. Biol. 2002; 178: 359-66; Vranken 등, Biochemistry 2002 Jul. 9; 41 (27): 8570-9; Nguyen 등, Immunogenetics 2002 April; 54 (1): 39-47; Renisio 등, Proteins 2002 Jun. 1; 47 (4): 546-55; Desmyter 등, J. Biol. Chem. 2002 Jun. 28; 277 (26): 23645-50; Ledeboer 등, J. Dairy Sci. 2002 June; 85 (6): 1376-82; De Genst 등, J. Biol. Chem. 2002 Aug. 16; 277 (33): 29897-907; Ferrat 등, Biochem. J. 2002 Sep. 1 ; 366 (Pt 2): 415-22; Thomassen 등, Enzyme and Microbial Technol. 2002; 30: 273-8; Harmsen 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002 December; 60 (4): 449-54; Jobling 등, Nat. Biotechnol. 2003 January; 21 (1 ): 77-80; Conrath 등, Dev. Comp. Immunol. 2003 February; 27 (2): 87-103; Pleschberger 등, Bioconjug. Chem. 2003 March-April; 14 (2): 440-8; Lah 등, J. Biol. Chem. 2003 Apr. 18; 278 (16): 14101-11; Nguyen 등, Immunology. 2003 May; 109 (1): 93-101; Joosten 등, Microb. Cell Fact. 2003 Jan. 30; 2 (1): 1; Li 등, Proteins 2003 Jul. 1; 52 (1): 47-50; Loris 등, Biol. Chem. 2003 Jul. 25; 278 (30): 28252-7; van Koningsbruggen 등, J. Immunol. Methods. 2003 August; 279 (1-2): 149-61; Dumoulin 등, Nature. 2003 Aug. 14; 424 (6950): 783-8; Bond 등, J. Mol. Biol. 2003 Sep. 19; 332 (3): 643-55; Yau 등, J. Immunol. Methods. 2003 Oct. 1; 281 (1-2): 161-75; Dekker 등, J. Virol. 2003 November; 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi 등, Toxicon. 2003 December; 42 (7): 785-91; Verheesen 등, Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec. 5; 1624 (1-3): 21 -8; Zhang 등, J Mol Biol. 2004 Jan. 2; 335 (1): 49-56; Stijlemans 등, J Biol. Chem. 2004 Jan. 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo 등, Cancer Res. 2004 Apr. 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli 등, FEBS Lett. 2004 Apr. 23; 564 (1-2): 35-40; Pleschberger 등, Bioconjug. Chem. 2004 May-June; 15 (3): 664-71; Nicaise 등, Protein Sci. 2004 July; 13 (7): 1882-91; Omidfar 등, Tumour Biol. 2004 July-August; 25 (4): 179-87; Omidfar 등, Tumour Biol. 2004 September-December; 25(5-6): 296-305; Szynol 등, Antimicrob Agents Chemother. 2004 September; 48(9):3390-5; Saerens 등, J. Biol. Chem. 2004 Dec. 10; 279 (50): 51965-72; De Genst 등, J. Biol. Chem. 2004 Dec. 17; 279 (51): 53593-601; Dolk 등, Appl. Environ. Microbiol. 2005 January; 71 (1): 442-50; Joosten 등, Appl Microbiol Biotechnol. 2005 January; 66(4): 384-92; Dumoulin 등, J. Mol. Biol. 2005 Feb. 25; 346 (3): 773-88; Yau 등, J Immunol Methods. 2005 February; 297 (1-2): 213-24; De Genst 등, J. Biol. Chem. 2005 Apr. 8; 280 (14): 14114-21; Huang 등, Eur. J. Hum. Genet. 2005 Apr. 13; Dolk 등, Proteins. 2005 May 15; 59 (3): 555-64; Bond 등, J. Mol. Biol. 2005 May 6; 348(3):699-709; Zarebski 등, J. Mol. Biol. 2005 Apr. 21.
일반적으로, 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되는 용어 '중쇄 가변 도메인'은 특정의 생물학적 유래(source) 또는 특정의 제조 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 아래에 더욱 상세히 기재하는 바와 같이, 본원에서 개시되는 중쇄 항체 유래의 중쇄 가변 도메인(즉, VHH)은 (1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인의 분리; (2) 자연 발생 VHH 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현; (3) 임의의 동물 종, 특히 인간과 같은 포유동물 종 유래의 자연 발생 VH 도메인의 '낙타화'(아래에 기재된 바와 같은), 또는 이러한 낙타화 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현; (4) Ward 등(위에서 언급)에 의해 기재된 바와 같은 '도메인 항체' 또는 'Dab'의 '낙타화', 또는 (5) 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하기 위한 합성 또는 반합성 기법을 이용한 이러한 낙타화 VH 도메인을 암호화하는 핵산의 발현; (6) 핵산 합성을 위한 기법을 이용한 VHH를 암호화하는 핵산의 제조 후, 이와 같이 얻어진 핵산의 발현; 및/또는 (7) 전술한 것들의 임의의 조합을 통해 얻어질 수 있다. 전술한 것들을 수행하기 위한 적당한 방법 및 기법들은 본원의 개시에 기초하여 당업자에게 명백하게 되고, 그의 예로는 아래에 더욱 상세히 기재된 방법 및 기법들이 있다.
본원에서 사용되는 용어 '유효량'은 원하는 결과 또는 결과들을 달성하는데 필요한 양을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 '확인하는(determining)', '측정하는', '평가하는', '모니터하는' 및 '분석하는'은 상호교환적으로 사용되는 것으로서, 정량적 및 정성적 확인 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 '예방 및/또는 치료'는 특정 질환 및/또는 장애를 예방 및/또는 치료하고, 특정 질환 및/또는 장애의 개시(onset)를 예방하고, 특정 질환 및/또는 장애의 진행을 지연 또는 역전시키고, 특정 질환 및/또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 개시를 예방 또는 지연시키고, 특정 질환 및/또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 완화하고, 특정 질환 및/또는 장애의 심각성 및/또는 기간을 감소시키고, 일반적으로 치료중인 대상 또는 환자에게 이로운 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열의 임의의 예방 효과를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 '진단', '예측' 및/또는 '예지'는 특정 질환 및/또는 장애를 진단, 예측 및/또는 예지함으로써, 특정 질환 및/또는 장애의 개시 및/또는 존재를 예측하고/하거나, 특정 질환 및/또는 장애의 진행 및/또는 기간을 예측하고/하거나, 치료에 대한 특정 질환 및/또는 장애를 갖는 환자의 반응을 예측하는 것을 포함한다.
[발명과 관련된 정의]
본원에서 사용되는 용어 '고형 종양 특이적 항원', '종양 특이적 항원', '종양 항원', '(고형) 종양 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질', '종양 특이적 표적 (단백질), "종양 관련 항원"은 상호교환적으로 사용되는 것들로서, 임의의 다른 세포가 아니라 종양 세포 상에만 존재하는 임의의 단백질, 또는 몇몇의 종양 세포 및 몇몇의 정상의 건강한 세포 상에 존재하는 임의의 단백질을 포함한다. 종양 항원의 비제한적인 예로는 조직 분화 항원, 돌연변이 단백질 항원, 종양형성 바이러스 항원, 암-정소 항원 및 혈관 또는 기질 특이적 항원이 있다.
본원에서 사용되는 용어 '종양 세포'는 원발성 또는 전이성 종양 병소에 존재하는 세포를 의미한다. 이러한 문맥에서, 종양은 암세포로 구성되는 외에도, 복잡한 이방향성 상호작용(interplay)이 형질전환 세포와 비형질전환 세포 사이에 존재하는 장기 유사 구조로서 간주되어야 한다. 형질전환 세포의 악성 가능성(malignant potential)은, 섬유아세포, 지방세포, 혈액 및 림프 혈관으로 구성될 수 있고 넓은 범위의 면역 세포가 상당히 침투할 수도 있는 기질 유래의 적당한 지지 구조를 필요로 한다.
본원에서 사용되는 용어 '암세포 특이적 항원', '암 특이적 항원', '암 항원', '암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질', '암세포 특이적 표적 (단백질)", "암 (세포)-관련 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용되는 것들로서, 임의의 다른 세포가 아니라 암세포 상에만 존재하는 임의의 딘백질, 또는 몇몇 암세포뿐 만 아니라 몇몇의 정상의 건강한 세포 상에도 존재하는 임의의 단백질을 포함한다. 암세포 특이적 비제한적인 예로는 조직 분화 항원, 돌연변이 단백질 항원, 종양형성 바이러스 항원, 암-정소 항원 및 혈관 또는 기질 특이적 항원이 있다.
본원에서 '방사성 표지된' 아미노산 서열, '방사성 표지된' 항체 단편 또는 '방사성 표지된' VHH에서와 같이 사용되는 용어 '방사성 표지된'은 그 아미노산 서열, 항체 단편 또는 VHH의 방사성 동위원소 표지를 의미하는데, 상기 아미노산 서열, 항체 단편 또는 VHH는 그의 아미노산 서열 구조에 방사성핵종을 포함, 결합 또는 화학적으로 연결함으로써 표지된다.
본원에서 사용되는 용어 '방사성핵종(radionuclide 또는 radioactive nuclide)', '방사성 동위원소(radioisotope 또는 radioactive isotope)는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 것들로서, 핵 내부의 새로이 생성된 방사선 입자에 또는 내부 전환을 통해 부여되도록 이용될 수 있는 과량의 에너지에 특징이 있는 불안정한 핵을 갖는 원자를 의미한다. 이러한 과정 동안에, 상기 방사선 핵종은 방사성 붕괴를 받아서, 감마 선(들) 및/또는 알파 또는 베타 입자와 같은 아원자 입자들을 방출한다. 이러한 방출은 이온화 방사선을 구성한다. 방사선 핵종은 자연발생하거나 인위적으로 생성될 수 있다.
"고형 종양(들)" 또는 "종양(들)"은, 제한없이 신경교종, 췌장 종양, 폐암, 예를 들어, 소세포 폐암, 유방암, 표피모양 암종, 신경내분비 종양, 부인과 및 비뇨기과 암, 예를 들어, 경부, 자궁, 난소, 전립선, 신장-세포 암종, 고환 생식 세포 종양 또는 암, 췌장 암(췌장 선암), 교모세포종, 머리 및/또는 목의 암, 중추신경계(CNS) 암, 골 종양, 고형 소아과 종양, 혈액암, AIDS-관련 암, 연부조직 육종, 및 흑색종 및 카포시(Kaposi) 육종을 포함한 피부암 등과 같은 원발성 종양 및/또는 전이물(어디든지 위치함)을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 '암세포'는 조절되지 않은채로 비정상적으로 무한히 분열 및 재생하고 부수어져서 신체의 다른 부분으로 이동하고 또 다른 부위를 구성할 수 있는(전이라고 나타냄) 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 '병소(lesion)'는 상해 또는 질병에 기인하는 신체 조직 또는 장기의 임의의 비정상적인 변화를 의미한다. 암 용어에 있어서, 병소는 일반적으로 종양을 의미한다.
본원에서 'HER-2 양성 (암) 병소', 'HER-2 양성 (유방) 암', 또는 'HER-2 양성 종양'에서와 같이 사용되는 용어 'HER-2 양성'은 HER2 유전자 증폭 또는 HER2 단백질 과발현에 특징이 있어서 정성의 건강한 세포와 비교하여 비정상적으로 높은 수준의 HER2 유전자 및/또는 HER2 단백질을 갖는 암성 또는 악성 세포를 의미한다. HER-2 양성 유방암은 HER2 유전자 증폭 또는 HER2 단백질 과발현에 특징이 있는 암성 유방 세포에 특징이 있다. 모든 5개 유방암들 중 1개에 있어서, 그 암세포는 하나 이상의 유전자 돌연변이로 인해 주로 HER2 유전자 증폭을 유발하는 과량의 HER2를 포함한다. 그것이 발생하는 HER2 단백질의 상승된 수준은 많은 형태의 암에서 발생하므로, 유방암으로 제한되지 않는다.
본원에서 'HER-2 음성 (암) 병소', 'HER-2 음성 (유방) 암', 'HER-2 음성 종양', 'HER-2 음성 세포(들)'에서와 같이 사용되는 용어 'HER-2 음성'은 암성 또는 악성 세포 또는 조직을 의미하거나, 정상의 건강한 세포 또는 조직을 의미할 수 있는데, 그 모두는 HER2 유전자 증폭 또는 HER2 단백질 과발현이 없고 따라서 HER2 유전자 및/또는 HER2 단백질의 정상 수준에 특징이 있다.
본원에서 사용되는 용어 '인 시튜 혼성화(ISH)'는 특정 DNA 또는 RNA를 조직의 일부 또는 섹션(인 시튜)에 위치시키거나, 그 조직이 충분히 작은 경우(예를 들어, 식물 종자, 초파리 배아) 전체 조직(전체 마운트 ISH), 세포 및 순환 종양 세포(CTCs)에 위치시키기 위해 표지된 상보성 DNA 또는 RNA 가닥(즉, 프로브)를 이용하는 일종의 혼성화 분석법을 의미한다. 인 시튜 혼성화는 조직 섹션 내의 개개의 세포들 내의 특정 mRNA 종을 확인하여 생리학적 과정 및 질병 발병을 확인하기 위한 효과적인 기법이다. 특히, 인 시튜 혼성화는 염색체 또는 조직에서 특정 아미노산 서열의 위치를 조사하기 위해 사용되는 것으로서, 유전자의 구성, 조절 및 기능을 이해하기 위한 중요한 단계이다. 현재 사용되고 있는 중요한 기법으로는 하기의 것들이 있다: 올리고뉴클레오티드 및 RNA 프로브(모두 방사성 표지 및 헵텐 표지됨)를 이용한 mRNA에의 인 시튜 혼성화; 광 및 전자 현미경을 이용한 분석; 전체 마운트(whole mount) 인 시튜 혼성화; RNA 및 RNA + 단백질의 이중 검출; 및 염색체 서열을 검출하기 위한 형광성 인 시튜 혼성화. DNA ISH는 염색체의 구조를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 형광성 DNA ISH (FISH)는 예를 들어, 염색체 무결성을 평가하기 위한 의학적 진단에서 사용될 수 있다. RNA ISH (RNA 인 시튜 혼성화)는 조직 섹션, 세포, 전체 마운트 및 순환 종양 세포(CTC) 내의 RNA를 측정 및 위치 확인하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 '형광 인 시튜 혼성화(FISH)'는 염색체 상의 특정 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출 및 위치 확인하기 위해 사용되는 특수한 형태의 인 시튜 혼성화 분석법이다. FISH는 고도의 서열 상보성을 나타내는 염색체의 부분들에 결합하는 형광 프로브를 이용한다. 형광 프로브가 염색체에 결합되는 지를 확인하기 위해 형광 현미경 분석이 사용될 수 있다. FISH는 유전 상담, 의학 및 종 확인에서 사용하기 위한 DNA의 특정 특징을 확인하기 위해 종종 사용된다. 또한, FISH는 세포, 순환 종양 세포 및 조직 시료 내의 특정의 RNA 표적 (mRNA, IncRNA 및 miRNA)을 검출 및 위치 확인하기 위해 사용될 수도 있다. 따라서, 이는 세포 및 조직 내의 유전자 발현의 공간적-시간적 패턴을 정의하는데 도움을 줄 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 '면역조직화학(IHC)'은 생물학적 조직의 섹션 내의 항원에 특이적으로 결합하는 항원의 원리를 이용하여 조직 섹션의 세포 내의 항원(예를 들어, 단백질)을 검출하는 과정을 의미한다. 면역조직화학적 염색은 암성 종양에서 발견되는 것들과 같은 비정상 세포들의 진단에서 널리 이용된다. 또한, IHC는 생물학적 조직의 서로 다른 부분에서 바이오마커 및 서로 다르게 발현된 단백질들의 분포 및 위치를 이해하기 위한 기초 연구에서도 널리 이용된다.
'트라스투주맙'(상표명: Herclon®, Herceptin®)은 HER2/neu 수용체와 상호작용하는 단클론 항체이다. 이의 주요한 용도는 특정의 유방암을 치료하는 것이다.
'페르투주맙' 또는 '2C4'(상표명: Perjeta®)은 HER2, 더욱 구체적으로는 HER2의 도메인 II에 결합하여, 다른 HER 수용체에 의한 HER2의 이량체화를 억제하는 단클론 항체이다. 이의 주요한 용도는 HER2-양성 유방암을 치료하는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 '원발성 종양(들)'은 종양 진행이 시작되고 진행하여 암 덩어리를 형성한 해부학적 부위에서 성장하는 종양이다.
본원에서 사용되는 용어 '전이성 병소(들)'는 그의 최초 위치로부터 신체의 다른 부분으로 확산한 악성 또는 암성 종양을 의미한다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 관련된 의학 용어로는 후기암, 진행된 암, 또는 전이성 질환이 있다. 일반적으로, 전이성 병소는 불치성인 것으로 여겨지지만, 암성 세포의 확산을 제어하고 대상의 수명을 연장할 수 있도록 하기 위한 치료가 종종 이용될 수 있다.
전이는 신체 내의 그의 최초 부위로부터 암의 확산에 대한 용어이다. 따라서, 전이성 병소는 원발성 종양의 최초 출발점에서 멀리 떨어진 위치에서 확인되는 암성 종양이다. 전이성 종양은 원발성 종양 유래의 세포들이 부수어져서 림프계 또는 혈액계를 통해 신체의 먼 부분으로 이동하는 때 발생한다. 그렇지 않으면, 최초 종양 유래의 세포들은 이웃한 장기 또는 조직에서의 새로운 종양 내로 침투할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 '전이성 질환'은 후기암을 의미하고, 또 암세포가 최초 종양 근처의 림프절에서 확인되는 단계 III, 또는 암세포가 원발성 종양 부위로부터 신체의 먼 부분으로 이동한 단계 IV의 암으로 분류되는 암의 의학적 분류를 의미한다. 전이성 병소는 뇌, 폐, 간 또는 뼈에서 일반적으로 확인된다. 전이성 암을 갖는 대상은 임의의 증상을 경험하거나 경험하지 않을 수 있고, 그 증상은 전이한 세포가 다시 위치하는 부위와 관련이 있을 수 있다. 일단 전이성 병소가 신체 내에 존재하면, 그 개체의 암은 대부분의 암 형태의 경우 불치성인 것으로 간주된다. 이는 모든 존재하는 암세포를 이용 가능한 치료를 통해 근절하는 것이 아주 어렵다는 것을 의미한다. 이러한 경우에 있어서, 치료의 목적은 종양의 성장을 지연시켜서 삶의 최고 가능한 수준을 유지하고 가능하면 대상의 수명을 연장시키는 것이다. 몇몇의 경우, 전이성 병소를 갖는 사람은 증상 관리를 위해 적절히 치료받으면서 수년 동안 살 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로 대상 내의 방사선의 '(계산된 평균) 유효 선량'은 신체의 모든 특정 조직 및 장기에서 해당 선량들의 조직 가중(tissue-weighted) 합계를 의미하고, 신체 부분에 전달된 이온화 방사선의 암 유발 및 유전적 영향의 가능성인 확률론적인 건강 위험을 나타낸다. 이는 방사선의 형태 및 방사선 조사되는 각각의 장기 또는 조직의 특징을 고려에 넣는다. 이는 International Commission on Radiological Protection (ICRP)에 의해 안출된 방사선 방호의 국제 시스템에서 방사선 방호에서 선량 제한을 위한 주요한 양이다. 유효 선량에 대한 SI 단위는 1 J/kg인 시버트(Sv)이다. 그 유효 용량은 1991년에 선량의 ICRP 시스템에서 이전의 "유효 선량 해당량"을 대체했다. 방사성 의약품을 이용하는 과정의 경우, 그 유효 선량은 일반적으로 주입된 활성의 단위 당 표시된다. 즉, mSv/MBq로 표시된다. 따라서, 개개의 환자에 대한 유효 선량은 MBq로 표시한 방사성 의약품의 주입 활성 및 mSv/MBq로 나타낸 계산된 평균 유효 선량에 따라 결정된다.
방사성 의약품에 대한 유효 선량은 2004년에 FDA에 의해 승인된 OLINDA/EXM® 소프트웨어를 이용하여 계산된다. OLINDA/EXM® 퍼스널 컴퓨터 코드는 방사성의약품에 대한 선량 계산 및 키네틱 모델링(kinetic modeling)을 수행한다((OLINDA/EXM은 Organ Level INternal Dose Assessment/EXponential Modeling을 나타낸다). OLINDA®은 전신 투여된 방사성 의약품으로부터 신체의 여러 장기들에 대한 방사선량을 계산하고, 핵 의약품에 대한 이러한 계산을 확인하기 위해 사용자-공급 바이오키네틱 데이터에 대한 회귀 분석을 수행한다. 이러한 계산은 핵 의학에서 진단 및 치료 용도로 이러한 의약품의 사용의 위험/수혜 평가를 수행하기 위해 사용된다. 그 기술은 성인, 어린이, 임산부 등에 대한 다수의 신체 모델을 이용하는데, 이러한 모델은 내부 선량 커뮤니티에서 널리 허용되고 사용되는 것이다. 상기 계산은 방사성 약물이 환자 또는 연구 대상에게 투여되는 때 전달되는 허용된 방사선량을 연구하는 제약산업 개발자, 핵의학 전문가, 교육자, 단속원 및 연구원에게 유용한 것이다.
계산된 유효 선량은 선택된 표준 신체 모델 및 선택된 배뇨(voiding) 방광 모델에 따라 결정된다. 그 본원에서 제공된 값은 여성 성인 모델 및 1시간의 배뇨 방광 간격을 이용하여 계산되었다.
본 명세서에서 인용되는 모든 문헌들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 달리 정의하지 않는 경우, 기술 및 과학 용어들을 비롯하여, 본 발명을 게시하는데 있어서 사용된 모든 용어들은 본 발명의 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가의 안내로서, 용어의 정의가 본 발명의 교시내용을 더욱 잘 인정하기 위해 포함된다.
[설명의 본문]
본 발명자들은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양 및/또는 암세포에 대하여 특이적인 항원과 특이적으로 상호작용하는 고형 종양-결합 항체 단편 및 암세포-결합 항체 단편, 더욱 구체적으로는 VHH 또는 이의 기능적 단편을 확인했다. 추가적이고 더욱 중요한 것으로, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH를 방사성 표지함으로써, 방사면역치료를 위한 개선되고 효과적인 방법을 개발한 결과, 이를 필요로 하는 대상, 특히 이를 필요로 하는 인간 환자에서 높은 종양 또는 암세포에의 흡수값, 낮은 건강한 조직에의 흡수값, 낮은 전체 생체 분포, 및 혈액으로부터의 빠른 제거가 얻어졌다.
따라서, 본원에서 게시한 VHH 또는 이의 기능적 단편은 높은 치료 효능을 나타낼뿐 만 아니라, 정상의 건강한 조직에의 그의 낮은 흡수 및 그의 빠른 제거를 통해서, 낮은 독성 효과를 나타내고, 따라서 통상적인 면역치료 또는 알려진 방사면역치료제와 비교하여 치료 환자에서 아주 적은 부작용을 나타낸다.
본원에서 게시한 바와 같은 항체 단편의 효능 및 유효성은 의료 분야에서 더욱 높은 최대 허용 선량(MTD)에 대한 가능성을 나타내어, 높은 치료 용량의 반복되고 지속된 투여가 가능하게 되어, 종양 또는 암세포 성장을 효과적으로 저해하면서 정상의 건강한 조직에서 선량 제한 독성(DLT) 부작용 미만의 양으로 여전히 잔류한다.
따라서, 본 발명은 방사성 표지 항체 단편, 특히 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편이 암으로부터 동물 또는 인간을 효과적으로 보호 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 최초로 설명한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 방사성 표지된, 일가의 수명이 연장되지 않은 VHH 또는 이의 기능적 단편의 치료 효능을 나타낸다.
본원에서 게시한 항체 단편은 천연 발생 폴리펩티드에서 유래될 수 있거나, 또는 그렇지 않으면, 완전히 인공적으로 디자인될 수 있다. 이러한 천연 발생 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 낙타의 중쇄 항체 등과 같은 중쇄 항체(hcAb)가 있다.
특히, 본원에서 게시한 바와 같은 중쇄 항체 유래의 중쇄 가변 영역(즉, VHH)는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되고, 전사후에 변형되지 않는다. 더욱 구체적으로, 본원에서 게시한 VHH 또는 이의 기능적 단편은 선천 또는 적응 면역계 유래, 바람직하게는 선천 또는 적응 면역계의 단백질 유래이다. 여전히 더욱 구체적으로, 본원에서 게시한 VHH는 4개의 프래임워크 영역 및 3개의 상보성 결정 영역, 또는 이들의 임의의 적당한 단편(이는 상보성 결정 영역들 중 적어도 하나를 형성하는 아미노산 잔기들 중 적어도 몇몇을 일반적으로 포함함)을 포함한다. 특히, 본원에서 게시한 VHH는 바람직하게는 미생물 재조합 발현계에서 고수율로 제조하기가 용이하고, 다음에 분리 및/또는 정제하기가 편리하다.
특정 실시 예에 따르면, 본 발명은 HER2 등과 같은, 종양 항원 또는 암세포 항원에의 결합에 특히 적합한 아미노산 잔기들의 다수의 스트레치(즉, 작은 펩티드)를 제공한다.
이러한 아미노산 잔기들의 스트레치는 특히 VHH의 항원 결합 부위(의 일부)를 형성하도록 본원에서 게시한 VHH 내에 존재하거나 그에 혼입될 수 있다. 이들 아미노산 잔기들의 스트레치가 항체의 CDR 서열로서 생성되는 경우(또는 본원에 더욱더 기재하는 바와 같이 이러한 CDR 서열에 기초하고/하거나 그로부터 유래될 수 있음), 'CDR 서열들' (즉, 각각 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열)로도 일반적으로 나타내어진다. 그러나 그의 가장 넓은 의미에서 본 발명은, 상기 아미노산 잔기들의 스트레치가 본원에서 게시한 바와 같은 가변 도메인이 종양 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합될 수 있도록 하는 한에 있어서는, 이러한 아미노산들의 스트레치가 본원에서 게시한 중쇄 가변 도메인에서 가질 수 있는 특정의 구조적 역할 또는 기능으로 제한되지 않는다는 것을 유념하여야 한다. 따라서, 일반적으로, 그의 가장 넓은 의미에서 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 것으로, 본원에서 기재한 바와 같은 CDR 서열들의 조합을 포함하고 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 단백질에 대하여 특이적으로 지시되는 방사성 표지 VHH에 관한 것이다.
따라서, 특정의 비제한적인 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH는 본원에서 개시되는 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 아마노산 서열을 포함한다. 특히 본원에서 게시한 바와 같은 VHH는 본원에서 개시되는 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열의 적어도 하나의 조합을 포함하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에서 개시되고 이러한 CDR 서열 조합들 중 하나를 갖는 임의의 VHH 항체단편은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합(본원에 정의한 바와 같이)할 수 있고, 더욱 구체적으로는 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에, 용액 상태에서 상기 기변 도메인의 10-8 몰/리터의 해리 상수를 가지고서 특이적으로 결합하도록 구성되는 것이 바람직하다.
특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 HER2에 대한 VHH 항체단편은 5 nM 미만, 예를 들어 1 내지 5 nM, 바람직하게는 2 내지 3 nM의 해리 상수(Kd)로서 HER2에 특이적으로 결합할 수 있도록 구성된다.
VHH 종양 항원 또는 암세포 항원의 특이적 결합은 당업계에 알려진 임의의 적당한 방법, 예를 들어, 바이오패닝(biopanning), Scatchard 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석법, 예를 들어, 방사면역분석(RIA), 효소 면역분석(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석, 및 당업계에서 알려진 이들의 여러 가지 변형 방법으로 확인될 수 있다.
추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH는 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역; 및/또는 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 서열들의 적어도 하나의 조합을 포함한다.
따라서, 특정 실시 예에서, 본 발명은 하기의 (일반적) 구조를 갖는 중쇄 항체 유래의 중쇄 가변 도메인을 제공한다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기에서, FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 나타내고, CDR1 내지 CDR3는 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 나타내고, 본원에 더욱더 정의한 바와 같다.
서열번호 7 및 8(표 1 참조)은 종양 특이적 항원, 특히 HER2에 대하여 발생된 중쇄 가변 도메인의 아마노산 서열을 나타낸다.
VHH 서열
명칭 서열 번호 VHH 아미노산 서열
2Rs15d 7 QVQLQESGGGSVQAGGSLKLTCAASGYIFNSCGMGWYRQSPGRERELVSRISGDGDTWHKESVKGRFTISQDNVKKTLYLQMNSLKPEDTAVYFCAVCYNLETYWGQGTQVTVSS
2Rb17c 8 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSNDAMTWVRQAPGKGLEWVSSINWSGTHTNYADSVKGRFTISRDNAKRTLYLQMNSLKDEDTALYYCVTGYGVTKTPTGQGTQVTVSS
특히, 몇몇의 특정 실시 예에서, 본 발명은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 단백질에 대한 방사성 표지 VHH 도메인으로서, 서열번호 7 또는 8(표 1 참조)의 중쇄 가변 도메인들 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 방사성 표지 VHH 도메인, 또는 이의 기능적 단편, 및 이러한 중쇄 가변 도메인 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
본원에서 게시한 바와 몇몇의 특히 바람직한 중쇄 가변 도메인 서열은 HER2에 결합하거나 그에 대하여 지시될 수 있고, 서열번호 7 또는 8(표 1 참조)의 중쇄 가변 도메인들 중 적어도 하나와 적어도 90%의 아미노산 동일성을 갖는 것들로서, 아미노산 동일성의 정도를 확인하는 목적을 위하여, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다.
이러한 중쇄 가변 도메인에 있어서, CDR 서열(표 2 참조)은 일반적으로 본원에 더욱더 정의한 바와 같다.
CDR 서열(IMGT 넘버링을 이용하여 확인한 CDR 서열)의 특정 조합
명칭 CDR1 서열 서열번호 CDR2 서열 서열번호 CDR3 서열 서열번호
2Rs15d GYIFNSCG 1 ISGDGDT 2 AVCYNLETY 3
2Rb17c GFIFSNDA 4 INWSGTHT 5 VTGYGVTKTP 6
본 발명은 본원에서 게시한 VHH 단편 (또는 이를 발현하는 뉴클레오티드 서열의 유래)이 제한되지 않고, 본원에서 게시한 VHH 단편 또는 뉴클레오티드 서열이 생성되거나 얻어지는 방법이 제한되지 않는다는 것을 유념하여야 한다. 따라서, 본원에서 게시한 VHH 단편은 (임의의 적당한 종에서 유래의) 천연 발생 아미노산 서열 또는 반합성 아미노산 서열이다. 본 발명의 특정의 비제한적인 측면에서, 상기 아미노산 서열은 천연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적당한 종에서 유래) 또는 합성 또는 반합성 면역글로불린 서열, 예를 들어, 제한 없이, "인간화" 면역글로불린 서열(부분적으로 또는 완전히 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특히 부분적으로 또는 완전히 인간화된 VHH 서열), "낙타화" 면역글로불린 서열, 친화성 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 천연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발), CDR 그라프팅, 베니어링(veneering), 서로 다른 면역글로불린 서열 유래의 단편들의 결합, 오버래핑 프라이머를 이용한 PCR 어셈블리, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기법과 같은 기법을 통해 얻어진 면역글로불린 서열, 또는 전술한 것들 중 임의의 것들의 임의의 적당한 조합이다. 또한, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 본원에서 더욱더 기재되는 바와 같이 적당히 인간화되어, 본 발명의 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 아미노산 서열을 제공할 수 있다. 마찬가지로, 아미노산 서열이 합성 또는 반합성 서열(부분적으로 인간화된 서열)을 포함하는 경우, 상기 서열은 본원에서 기재한 바와 같이 선택적으로 더욱더 적당히 인간화되어, 본원에서 게시한 바와 같은 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 아미노산 서열을 제공할 수 있다.
특히, 인간화 아미노산 서열은 인간화 치환이고/이거나 그에 해당하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 존재하는(특히, 프레임워크 잔기들 중 적어도 하나) 아미노산 서열이다. 부가적으로 또는 택일적으로, 천연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련이 있는 인간 VH 서열과 비교함으로써 다른 어쩌면 유용한 인간화 치환이 확인될 수 있고, 그 후 이와 같이 확인된 어쩌면 유용한 인간화 치환 (또는 이들의 조합) 중 하나 이상이 상기 VHH 서열 내로 도입될 수 있고(본원에 더욱더 기재된 바와 같이 그 자체로 알려진 임의의 방법으로), 얻어지는 인간화 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 표적에 대한 친화력, 발현의 용이성 및 수준 및/또는 다른 원하는 특성에 대하여 검사될 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행 착오를 통해, 다른 적당한 인간화 치환(또는 이들의 적당한 조합)이 당업자에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 게시한 바와 같은 의료 용도, 특히 본원에서 게시한 바와 같은 암의 치료 및 예방 용도, 즉, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편이 지시되는 항원을 발현하는 종양 세포 또는 암세포를 죽이거나, 이러한 종양 세포 또는 암세포의 성장 및/또는 증식을 감소 또는 지연시키는 용도에 적당하도록 하기 위하여, 상기 VHH는 방사성핵종에 연결 또는 결합(예를 들어, 화학적 결합)된다.
암의 예방 및/또는 치료를 위한 세포독성 화합물을 제공하기 위하여 본원에서 게시한 바와 같은 VHH에 연결될 수 있는 적당한 방사성핵종의 예들은 당업자에게 명백하게 되고, 예를 들어 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무스-212, 비스무스-213, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-60, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테늄-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 테크니튬-99m, 라듐-223, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 토륨-227, 크세논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 이트륨-90을 포함하나 그로 제한되지 않는, α-방출 방사성 동위원소 및 β-방출 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 서 어떠한 제한 없이 선택될 수 있다.
여전히 추가의 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편은 요오드-131로 표지된다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
특정의 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료, 더욱 구체적으로는 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되는 131I 표지된 VHH 서열을 제공한다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료, 더욱 구체적으로는 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8을 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
여전히 추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, 종양 항원 및/또는 암세포 항원에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8을 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
특히 바람직한 실시 예에서, 본 발명은 단량체 형태의 VHH 도메인 또는 이의 기능적 단편, 및 단량체 형태의 VHH 도메인 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적 조성물, 즉, 상기 폴리펩티드 및 약학적 조성물의 생체 내 반감기를 가능하면 최소화하도록 하나의 VHH 도메인만을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적 조성물을 제공한다.
[중쇄 가변 도메인 서열의 변이체]
특정의 측면에서, 본원에서 게시한 바와 같은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 하나 이상의 링커를 통해 하나 이상의 추가의 기, 부분(moieties) 또는 잔기에 선택적으로 연결될 수 있다. 이러한 하나 이상의 추가의 기, 부분 또는 잔기는 다른 관심 표적에 결합하도록 이용될 수 있다. 이러한 추가의 기, 잔기, 부분 및/또는 결합 부위는 본원에서 게시한 바와 같은 중쇄 가변 도메인에 추가의 작용성을 제공하거나 제공하지 않을 수 있고, 본원에서 게시한 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 특성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들어, 추가의 기, 잔기, 부분 또는 결합 부위는 생물학적 활성이 있을 수 있는 화학적 기일 수 있다.
특정의 실시 예에서, 이러한 기, 부분 또는 잔가는 중쇄 가변 도메인의 N- 또는 C-말단, 특히 C-말단에 연결된다.
특정의 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 이러한 변형은 중쇄 기변 도메인 상에 또는 그 내로 하나 이상의 작용기, 잔기 또는 부분을 도입 또는 연결하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 기, 잔기 또는 부분은 중쇄 가변 도메인에 하나 이상의 원하는 특성 또는 작용성을 부여할 수 있다. 이러한 작용기의 예들은 당업자에게 명백하게 된다,
예를 들어, 종쇄 가변 도메인에 이러한 작용기를 도입 또는 연결하면, 중쇄 가변 도메인의 용해도 및/또는 안정성이 증가할 수 있거나, 중쇄 가변 도메인의 독성이 감소할 수 있거나, 중쇄 가변 도메인의 임의의 원하지 않는 부작용이 제거 또는 약화될 수 있고/있거나, 다른 유리한 특성들이 얻어진다.
특정 실시 예에서, 상기 하나 이상의 기, 잔기 또는 부분은 하나 이상의 적당한 링커 또는 스페이서를 통해 중쇄 가변 도메인에 연결된다.
바람직하게, 상기 하나 이상의 기, 잔기 또는 부분은 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편에 연장된 반감기를 부여하지 않는다. 따라서, 바람직한 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
또한, 바람직하게, 상기 하나 이상의 기, 잔기 또는 부분은 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편의 이량체화와 같은 다량체화를 유도하지 않는다. 예를 들어, GCC-태그와 같은 카르복시 말단 시스테인 함유 태그를 함유하는 VHH는 단량체 형태와 이량체 형태의 평형 혼합물을 결과한다(Pruszyski 등. 2013 Nucl Med Biol. 40:52-59). 따라서, 특정 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편은 이량체화와 같은 다량체화를 유도하는 태그, 더욱 구체적으로는 시스테인 함유 태그, 아주 더 구체적으로는 GGC-태그가 없다.
특정의 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 His-태그 및/또는 Myc-태그와 같은 C-말단 폴리펩티드 태그가 없고, 바람직하게는 태그가 없다. 유리하게, His-태그 및 Myc-His-태그와 같은 폴리펩티드-태그가 있는 VHH와 비교하여, 카르복시 말단 태그가 없는 VHH를 이용한 때 신장 체류가 유의하게 감소된 것으로 확인되었다.
본원에서 게시한 바와 같은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 도메인은 단량체 형태인 것이 바람직하지만(본원에 더욱더 기재된 바와 같이), 특정의 대안의 실시 예에서는, 본원에서 게시한 바와 같은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 도메인들 또는 이의 기능성 단편들 중 둘 이상은 서로 연결될 수 있거나 결합될 수 있다. 특정의 실시 예에서, 상기 둘 이상의 중쇄 가변 도메인 또는 이의 기능적 단편은 하나 이상의 적당한 링커 또는 스페이서를 통해 서로 연결된다. 본원에서 게시한 바와 같은 여러 중쇄 가변 도메인들의 연결에서 사용하기 위한 적당한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 명백하게 되고, 일반적으로는 펩티드 및/또는 단백질들을 연결하기 위해 당 업계에서 사용되는 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다.
몇몇의 특히 적당한 링커 또는 스페이서로는 예를 들어, 글리신 링커, 세린 링커, 혼합 글리신/세린 링커, 글리신- 및 세린-풍부 링커, 또는 대부분이 극성인 폴리펩티드 단편으로 구성된 링커와 같은 폴리펩티드 링커, 또는 글루타르알데히드 또는 선택적으로 PEG-스페이스(spaced) 말레이미드 또는 NHS 에스테르와 같은 호모- 또는 헤테로이작용성 화학적 가교 화합물이 있으나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 폴리펩티드 링커 또는 스페이서는 1 내지 50개 아미노산, 예를 들어 1 내지 30개 아미노산, 특히 1 내지 10개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 적당한 아미노산 서열일 수 있다. 그 링커(들)의 길이, 유연성의 정도 및/또는 다른 특성은 암세포 상의 종양 표적 또는 표적에 대한 친화력, 특이성 또는 결합력 등을 비롯한, 중쇄 가변 도메인의 특성에 어느 정도 영향을 미칠 수 있다는 것이 명백하다. 둘 이상의 링커가 사용되는 경우, 이들 링커는 동일 또는 상이할 수 있다는 것이 명백하다. 본 발명의 문맥 및 개시에서, 당업자는 부당한 실험적 부담이 전혀 없이, 중쇄 가변 도메인들을 결합하는 목적을 위한 최적의 링커를 결정할 수 있다.
[중쇄 가변 도메인의 단편]
또한, 본 발명은 본원에서 게시한 바와 같은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 방사성 표지 VHH 도메인의 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체 및/또는 유도체, 및/또는 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체 및/또는 유도체가 본원에서 고려된 용도에 적당한 경우 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체 및/또는 유도체들 중 하나 이상을 포함하거나 그로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체 및/또는 유도체는 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 종양 항원 또는 암 항원에의 결합에 특히 적당한 것으로, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH의 CDR 서열로도 본원에 기재하는 아미노산 잔기들의 다수의 스트레치(즉, 작은 펩티드)를 제공한다. 이러한 스트레치는 본원에서 게시한 바와 같은 VHH의 기능적 단편으로 간주될 수 있고, 특히 적당한 지지체(scaffold) 또는 VHH의 항원 결합 부위를 형성하도록 본원에서 게시한 바와 같은 VHH 등과 같은 임의의 적당한 지지체(단백질)에 존재하고/하거나 그에 혼입될 수 있다. 그러나, 그의 가장 넓은 범위에서 본 발명은, 상기 아미노산 잔기들의 스트레치가 본원에서 게시한 바와 같은 지지체 또는 VHH가 종양 항원 및/또는 암 항원에 특이적으로 결합될 수 있도록 하는 한에 있어서는, 이러한 아미노산들의 스트레치가 본원에서 게시한 중쇄 가변 도메인에서 가질 수 있는 특정의 구조적 역할 또는 기능으로 제한되지 않는다는 것을 유념하여야 한다.
[핵산 서열]
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 게시한 바와 같은 조성물 내의 VHH 도메인 아미노산 서열(또는 이의 적당한 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 이러한 핵산 서열은 벡터 또는 유전자 적제물 또는 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 본원에서 게시한 바와 같은 핵산 서열은 합성 또는 반합성 서열, 라이브러리(특히, 발현 라이브러리)로부터 분리한 뉴클레오티드 서열, 오버래핑 프라이머를 이용한 PCR에 의해 제조한 뉴클레오티드 서열, 또는 원래 알려진 DNA 합성 기법을 이용하여 제조한 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
[작제물, 벡터, 숙주 세포]
본원에서 게시한 바와 같은 작제물은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 이중 가닥 DNA인 것이 바람직하다. 본 발명의 유전자 작제물은 원하는 숙주 세포 또는 숙주 생물의 형질전환에 적당한 형태, 원하는 숙주 세포의 게놈 DNA 내로의 통합에 적당한 형태, 또는 원하는 숙주 생물에서의 독립적인 복제, 유지 및/또는 유전성에 적당한 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전자 작제물은 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 벡터 또는 트랜스포존의 형태일 수 있다. 특히, 그 벡터는 발현 벡터, 즉, 시험관 내 및/또는 생체 내(예를 들어, 적당한 숙주 세포, 숙주 생물 및/또는 발현계)에서의 발현을 위해 제공될 수 있는 벡터일 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 게시한 바와 같은 하나 이상의 아미노산 서열을 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 또는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 VHH 서열, 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 또는 숙주 세포의 적당한 예들은 당업자에게 명백하게 된다.
[VHH 도메인을 포함하는 폴리펩티드]
추가의 측면에서, 본 발명은 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 적어도 하나의 VHH 서열을 포함하거나 그로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드(본원에서는 "본원에서 게시한 바와 같은 폴리펩티드"라고도 나타냄)를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 본원에서 게시한 바와 같은 적어도 하나의 VHH 또는 이의 기능적 단편, 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 통해 선택적으로 결합된 한 이상의 추가의 기, 부분, 잔기를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시 예에서, 본 발명은 단량체 형태의 VHH 도메인을 포함, 즉 폴리펩티드 및 약학적 조성물의 생체 내 반감기를 가능하면 최소화하도록 하나의 VHH 도메인만을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적 조성물을 제공한다.
그러나, 대안의 실시 예에서, 본 발명은 이가(또는 일가) 또는 이중특이(또는 다중특이) 폴리펩티드를 결과하는 둘 이상의 동일 또는 상이한 VHH 도메인들을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적 조성물을 또한 제공한다.
본원에 게시된 바와 같은 폴리펩티드는 다른 관심 표적 또는 표적 단백질에 결합하기 위한 하나 이상의 추가의 기, 부분 또는 잔기를 적어도 포함한다. 이러한 추가의 기, 잔기, 부분 및/또는 결합 부위는 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열(및/또는 이것이 존재하는 폴리펩티드 또는 조성물)에 추가의 작용성을 제공하거나 제공하지 않을 수 있고, 본원에서 개시된 바와 같은 아미노산 서열의 특성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다는 것이 명백하다. 또한, 이러한 기, 잔기, 부분 또는 결합 부위는 예를 들어, 생물학적 및/또는 약학적 활성이 있을 수 있는 화학적 기일 수 있다.
바람직하게, 상기 추가의 기, 잔기 또는 부분은 폴리펩티드에 연장된 반감기를 부여하지 않는다. 따라서, 바람직한 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 폴리펩티드는 수명이 연장되지 않은 것이다.
또한, 바람직하게, 상기 하나 이상의 기, 잔기 또는 부분은 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편의 이량체화와 같은 다량체화를 유도하지 않는다. 따라서, 특정 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 폴리펩티드는 이량체화와 같은 다량체화를 유도하는 태그, 더욱 구체적으로는 시스테인 함유 태그, 아주 더 구체적으로는 GGC-태그가 없다.
특정의 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 폴리펩티드는 His-태그 및/또는 Myc-태그와 같은 C-말단 폴리펩티드 태그가 없고, 바람직하게는 태그가 없다.
특정 실시 예에서, 이러한 기, 부분 또는 잔기는 본원에서 게시한 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 연결된다.
[본원에서 게시한 바와 같은 VHH 서열, 폴리펩티드 및 조성물의 유래 및 형태]
본 발명은 본 발명의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편, 폴리펩티드 또는 조성물 (또는 이를 발현하기 위해 사용된 본 발명의 뉴클레오티드 서열)의 유래가 제한되지 않는다는 것을 유념하여야 한다. 또한, 본 발명은 본원에서 게시한 바와 같은 VHH 서열, 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열이 생성 또는 얻어지는 방법이 제한되지 않는다. 따라서, 본원에서 게시한 바와 같은 아미노산 서열은 합성 또는 반합성 아미노산 서열, 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 조성물은 본질적으로 분리된 형태(본원에 정의된 바와 같은)이거나, 또는 그렇지 않으면, 본원에 게시된 바와 같은 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 본질적으로 구성될 수 있고 하나 이상의 다른 기, 부분 또는 잔기(모두 하나 이상의 적당한 링커를 통해 연결됨)를 선택적으로 추가로 포함할 수 있는 본원에서 게시한 바와 같은 폴리펩티드 또는 조성물의 일부를 구성할 수 있다.
[표적 종 및 교차 반응성]
본원의 개시내용에 기초하면, 예방 및/또는 치료 용도를 위하여, 본원에 게시된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편, 폴리펩티드 및 조성물은 원칙적으로 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원의 모든 형태에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 알 수 있다. 그러나, 본원에 게시된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편, 폴리펩티드 및 조성물이 수의(veterinary) 목적으로 사용되는 경우, 이들은 치료하고자 하는 종 유래의 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원의 모든 형태에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합하거나, 이들은 치료하고자 하는 종 유래의 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원의 모든 형태와 적어도 교차반응한다. 따라서, 하나의 개체 종 유래의 항원의 모든 형태에 특이적으로 결합하는 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편, 폴리펩티드 및 조성물은 하나 이상의 다른 개체 종 유래의 항원의 모든 형태와 교차 반응성을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 물론, 인간 또는 동물에서 사용하기 위한 아미노산 서열의 개발의 문맥에서, 연구 및 실험 검사에서 사용하기 위한 것으로, 치료하고자 하는 것 이외의 또 다른 종 유래의 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원의 형태에 결합하는 VHH 서열이 개발될 수 있는 것으로 생각된다.
또한, 본 발명의 VHH 서열 및 폴리펩티드는 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원의 다수의 천연 발생 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합하는 것으로 예상된다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 VHH 서열 및 폴리펩티드는 이러한 VHH 서열 및 폴리펩티드가 결합하는 (천연/야생형) 항원의 결합 부위, 일부 또는 도메인을 (여전히) 함유하는 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원의 그러한 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 적어도 결합하는 것으로 예상된다.
[표적]
특정 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH 도메인은 고형 종양 및/또는 암세포에 존재하고/하거나 그에 특이적인 특정의 표적 단백질에 대한 친화성 선별을 통해서 얻어진다. 특정의 고형 종양 또는 암세포에 대한 친화성 선별을 통해서 적당한 폴리펩티드를 얻는 것은, 예를 들어, 종양 특이적 항원 및/또는 암세포 특이적 항원에 대한 결합을 위해 그의 표면(예를 들어, 박테리오파지)상에서 VHH 를 발현하는 세포들의 세트, 집합(collection) 또는 라이브러리를 선별함으로써 얻어지는데, 그 모두는 원래 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 하기의 비제한적인 단계들을 본질적으로 포함한다: a) 가능한 암 약물에 대한 표적인 것으로 알려져 있는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 단백질 표적 분자의 분리된 용액 또는 현탁액을 얻는 단계; b) 상기 단백질 표적 분자에 대한 VHH 라이브러리로부터 파지 또는 다른 세포를 바이오-패닝(bio-panning)하는 단계; c) 상기 종양 특이적 또는 암세포 특이적 단백질 표적 분자에 결합하는 파지 또는 다른 세포를 분리하는 단계; d) 개개의 결합 파지 또는 다른 세포 유래의 VHH 삽입물(insert)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; e) 재조합 단백질 발현을 이용하여 이러한 서열에 따른 다량의 VHH를 생성하는 단계; 및 f) 상기 종양 특이적 또는 암세포 특이적 단백질 표적 분자에 대한 상기 VHH 도메인의 친화력을 결정하는 단계; 및 선택적으로 g) 생물학적 분석법(bio-assay)에서 상기 VHH 도메인의 종양세포치사(tumoricidal) 또는 항암 활성을 검사하는 단계. 예를 들어, 다음 문헌[Sambrook et al. (2001 ), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 바와 같이 당 업계에서 일반적으로 실시되는 효소결합 면역분석법(ELISA) 또는 표면 플리즈몬 공명(SPR) 분석법을 비롯한 여러 가지 방법들이 VHH 도메인과 종양 특이적 또는 암세포 특이적 단백질 표적 분자 사이의 친화력을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드와 이의 표적 분자 사이의 친화력을 설명하기 위해 해리 상수가 일반적으로 사용된다. 일반적으로, 폴리펩티드와 이의 표적 분자 사이의 결합의 해리 상수는 10-5 M 미만, 더욱 바람직하게는 10-6 M 미만, 아주 더 바람직하게는 10-7 M 미만, 가장 바람직하게는 10-9 M 미만과 같은 10-8 M 미만, 더욱 바람직하게는 10-10 M 미만과 같은 0.5.10-9 M 미만이다.
특정의 실시 예에서, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH 단편은 약 1.10-9 M 내지 약 5.10-9 M, 약 2.10-9 M 내지 약 3.10-9 M과 같은 5.10-9 M 미만의 친화도로서 고형 종양 항원에 결합한다.
종양 특이적 항원 또는 암세포 특이적 항원은 종양 세포 또는 암세포의 표면 상에서 특이적으로 발생되거나 특이적으로 및/또는 풍부하게 발현되지만, 정상의 건강한 세포의 표면 상에서는 발현되지 않거나 비교적 낮은 농도 또는 밀도로만 발생 또는 발현되는 분자이다. 이러한 종양 특이적 또는 암세포 특이적 항원이 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH에 결합되는 경우, 그 항원이 발현되는 해당하는 종양 또는 암세포는 방사성 독성(radiotoxicity)의 기작을 통해 죽거나 그의 성장이 적어도 저지, 억제 또는 감소한다.
적당한 종양 특이적 또는 암세포 특이적 종양 표적 분자는 당업자의 경우 기존의 문헌 또는 특허 데이터베이스로부터 쉽게 이용가능하고, ras 및 p53의 비정상적 생성물, 조직 분화 항원, 돌연변이 단백질 항원, 종양형성 바이러스 항원, 암-정소 항원, 종양태아성 항원 및 혈관 또는 기질 특이적 항원을 비롯한, 돌연변이로 인해 비정상적인 구조를 갖는 종양 세포에서 생성된 임의의 단백질을 제한 없이 포함한다. 특정의 종양 항원의 예로는 CTAG1B, MAGEA1, 효소 티로시나제, 알파페토프로테인(AFP), 암종배아 항원(CEA), EBV 및 HPV, 비정상적으로 구성된 세포 표면 당지질 및 당단백질 및 HER2, EGFR 및 이들의 변이체가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시 예에서, 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로 본원에서 게시한 바와 같은 방사성 표지 VHH 도메인은 HER2에 대하여 특이적으로 지시된다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로 HER2에 대하여 특이적으로 지시되는 방사성 표지 VHH 서열을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료, 더욱 구체적으로는 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8을 갖는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
여전히 추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8 중 적어도 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
여전히 추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 유방암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2에 대하여 특이적으로 지시되고 서열번호 7 또는 8을 갖는 131I 표지된 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
특정의 비제한적인 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 HER2 상의 Herceptin® (트라스투주맙) 결합 부위와 상이한 HER2 상의 결합 부위에 대하여 특이적으로 지시되고/되거나, 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER-2에의 결합을 위해 Herceptin®과 경쟁하지 않는다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열은 HER2의 도메인 IV와 상이한(아닌) HER2 상의 결합 부위에 대하여 특이적으로 지시된다. 여전히 또 다른 특정 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 HER2의 도메인 IV의 C-말단과 상이한(아닌) HER2 상의 결합 부위에 대하여 특이적으로 지시된다.
따라서, 특정 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER-2에의 결합을 위해 단클론 항체인 Herceptin®(트라스투주맙)과 경쟁하지 않는다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER2에의 결합을 위해 단클론 항체인 페르투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는다. 추가의 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 HER2 상의 Perjeta® (페르투주맙) 결합 부위와 상이한 HER2 상의 결합 부위에 대하여 지시되고, 더욱 구체적으로, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열은 HER2의 도메인 II와 상이한(즉, 아닌) HER2 상의 결합 부위에 대하여 지시된다.
특정 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인한 바와 같이, HER2에의 결합을 위해 단클론 항체인 트라스투주맙(Herceptin®) 및 단클론 항체인 페르투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는다. 추가의 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 HER2 상의 트라스투주맙(Herceptin®) 및 페르투주맙(Perjeta®)과 상이한 HER2 상의 결합 부위에 대하여 지시된다. 특정의 실시 예에서, 본 발명의 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능성 단편은 HER2의 도메인 IV, 더욱 구체적으로는 HER2의 도메인 IV의 C-말단과 상이한(즉, 아닌) HER2 상의 결합 부위에 대하여 지시된다.
항원 표적화 (예를 들어, HER2-표적화) 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편이 동일 항원을 표적하기 위해 단클론 항체와 같은 결합제와 상호작용하는 지의 여부를 확인하기 위한 적당한 경쟁 분석법은 예를 들어 생체 내 경쟁 분석법일 수 있으나 그에 제한되지 않는다. 생체 내 경쟁 분석법에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 단독이 투여된 시험 동물 및 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편의 투여 전에 결합제로 전처리된 시험 동물에서 비교되는데, 실질적으로 동일한 생체분포 프로필은 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편이 표적 항원에의 결합을 위해 결합제와 경쟁하지 않는다는 것을 나타낸다.
[표적 항원의 형태]
본원의 개시에 기초하여, 의료용, 즉, 예방 및/또는 치료의 목적을 위하여, 본원에서 게시한 바와 같은 중쇄 가변 영역은 원칙적으로 종양 특이적 항원 또는 암세포 특이적 항원의 여러 상이한 형태들에 대하여 지시되거나 그에 특이적으로 결합한다는 것을 인식할 수 있다. 또한, 본원에서 게시한 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 그의 종양 항원 또는 암 항원의 다수의 천연 발생 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 부분 및 단편에 결합하는 것으로 예상된다, 더욱 구체적으로, 본원에 게시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인은 이들 VHH 또는 이의 기능적 단편이 결합하는 천연 종양 또는 암 항원의 결합 부위, 일부 또는 도메인을 (여전히) 포함하는 종양 또는 암 항원의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 부분 및 단편에 적어도 결합하는 것으로 예상된다.
특정 실시 예에서, 본 발명이 HER2에 대하여 특이적으로 지시되는 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제공하는 경우, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH가 단량체 형태의 ER2에만 결합할 수 있거나 다량체 형태의 HER2에만 결합할 수 있거나, HER2의 단량체 및 다량체 형태에 결합할 수 있다는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 다시, 이러한 경우에 있어서, 본원에 게시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편은 본원에 게시된 바와 같은 VHH가 다량체 형태에 결합하는 친화성 및 특이성과 동일 또는 그와 상이한(즉, 더 높거나 낮음) 친화성 및/또는 특이성으로 HER2의 단량체 형태에 결합할 수 있다.
또한, HER2가 다른 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 다른 ERBB 수용체)와 결합(이종이량체화라고도 나타냄)하여 단백질 복합체(예를 들어, 다중 서브유닛을 갖는)를 형성할 수 있는 경우, 본원에 게시된 바와 같은 VHH가 그의 비결합 상태에서 HER2에 결합할 수 있거나, 그의 결합 상태에서 HER2에 결합할 수 있거나, 둘 모두에 결합할 수 있는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 일반적으로, 본원에 게시된 바와 같은 VHH 서열은 당업자에게 명백한 바와 같이, 생물학적 및/또는 치료의 관점에서 가장 적절하게 되는 HER2의 그러한 형태(단량체, 다량체 및 결합된 형태를 포함)에 적어도 결합할 수 있다.
[본원에 게시된 바와 같은 VHH 서열의 생성 및 제조 방법]
또한, 본 발명은 VHH 도메인 서열 또는 이의 기능적 단편을 제조 또는 생성하는 방법, 이들을 암호화하는 핵산을 제조하는 방법, 숙주 세포, 이들 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 생성물 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법의 몇몇의 바람직한 비제한적인 예들은 본원의 추가의 설명으로부터 명백하게 된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 개시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인을 제조하기 위한 한가지 특히 바람직한 방법은 하기의 단계들을 일반적으로 포함한다:
(a) 본원에서 개시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 중쇄 가변 도메인 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 유전자 작제물을 발현하는 단계; 및
(b) 상기 중쇄 가변 도메인 서열을 선택적으로 분리 및/또는 정제하는 단계.
본원에서 고려된 특정의 실시 예들에 있어서, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 중쇄 가변 도메인 서열은 VHH 서열의 무작위 라이브러리를 생성하고 종양 특이적 또는 암세포 특이적 중쇄 가변 도메인 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 VHH 서열 서열에 대하여 이러한 라이브러리를 선별하는 것을 포함하는 방법을 통해 얻어질 수 있다.
따라서, 특정 실시 예에서, 본원에 게시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 서열을 제조하는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) VHH 도메인의 아미노산 서열의 세트, 집합 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 결합할 수 있고/있거나 그에 대해 특이성을 갖는 아미노산 서열에 대해 상기 아미노산 서열의 세트, 집합 또는 라이브러리를 선별하는 단계; 및
c) 상기 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 결합할 수 있고/있거나 그에 대해 특이성을 갖는 아미노산 서열을 분리하는 단계.
이러한 방법에서, 상기 VHH 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 아미노산들의 임의의 적당한 세트, 집합 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 면역글로불린 단편 서열들의 천연 세트, 집합 또는 라이브러리, 면역글로불린 단편 서열들의 합성 또는 반합성 세트, 집합 또는 라이브러리, 및/또는 친화성 성숙을 받은 면역글로불린 단편 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리와 같은, 면역글로불린 단편 서열들(본원에서 기재한 바와 같은)의 세트, 집합 또는 라이브러리일 수 있다.
이러한 방법의 특정 실시 예에서, 상기 VHH 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적으로 적당히 면역시키거나 그에 기초하거나 그로부터 유래한 적당한 항원 결정기, 예를 들어, 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 이의 다른 에피토프로 적당히 면역시킨 포유동물 유래의 면역글로불린 단편 서열의 면역 세트, 집합 또는 라이브러리일 수 있다. 하나의 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법들에서, 상기 VHH 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 선별을 촉진하도록 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적당한 미생물(효모와 같은)상에서 발현될 수 있다. 아미노산 서열(의 세트, 집합 또는 라이브러리)를 발현 및 선별하기 위한 적당한 방법, 기법 및 숙주 미생물은 예를 들어 하기의 추가의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백하게 된다. 또한, 다음문헌[Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]에서 Hoogenboom에 의한 검토를 참조한다.
다른 실시 예에서, 본원에 게시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 서열을 생성하기 위한 방법은 적어도 하기의 단계들을 포함한다:
a) VHH 도메인 아미노산 서열을 발현하는 세포들의 집합 또는 시료를 제공하는 단계;
b) 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 결합할 수 있고/있거나 그에 대하여 친화성을 가질 수 있는 아미노산 서열을 발현하는 세포에 대하여 상기 세포들의 집단 또는 시료를 선별하는 단계;
c) (i) 상기 아미노산 서열을 분리하거나; (ii) 상기 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 상기 세포로부터 분리한 다음, 상기 아미노산을 발현하는 단계.
상기 세포들의 집합 또는 시료는, 예를 들어, B-세포의 집합 또는 시료일 수 있다. 또한, 이러한 방법에서, 상기 세포들의 시료는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적으로 적당히 면역시키거나 그에 기초하거나 그로부터 유래한 적당한 항원 결정기, 예를 들어, 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 이의 다른 에피토프로 적당히 면역시킨 포유동물에서 유래될 수 있다. 하나의 특정 측면에서, 상기 항원 결정기는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
다른 실시 예에서, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 지시되는 중쇄 가변 도메인 서열을 생생하기 위한 방법은 하기의 단계들을 적어도 포함할 수 있다:
a) VHH 도메인 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 결합할 수 있고/있거나 그에 대하여 친화성을 가질 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열에 대하여 상기 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리를 선별하는 단계; 및
c) 상기 핵산 서열을 분리한 다음, 상기 아미노산 서열을 분리하는 단계.
이러한 방법에서, 상기 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 예를 들어, 면역글로불린 단편 서열들의 천연 세트, 집합 또는 라이브러리를 암호화하는 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리, 면역글로불린 단편 서열들의 합성 또는 반합성 세트, 집합 또는 라이브러리를 암호화하는 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리, 및/또는 친화성 성숙을 받은 면역글로불린 단편 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리를 암호화하는 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리일 수 있다.
특히, 이러한 방법에서, 상기 핵산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 항원(본원에서 정의된 바와 같은)에 대하여 지시되는 VHH 도메인들의 세트, 집합 또는 라이브러리를 암호화한다.
상기 방법들에서, 상기 뉴클레오티드 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리는 선별을 촉진하도록 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적당한 미생물(효모와 같은)상에서 발현될 수 있다. 아미노산 서열들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들(의 세트, 집합 또는 라이브러리)를 발현 및 선별하기 위한 적당한 방법, 기법 및 숙주 미생물은 예를 들어 하기의 추가의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백하게 된다. 또한, 다음 문헌[Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]에서 Hoogenboom에 의한 검토를 참조한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법들을 통해 얻어질 수 있거나, 또는 그렇지않으면, 상기의 방법들의 하나를 포함하는 방법 및 적어도 VHH 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 적당한 숙주 세포 또는 숙주 생물에서의 발현 또는 화학적 합성과 같은 원래 알려진 방법으로 상기 VHH 서열을 발현 또는 합성하는 단계를 포함하는 방법을 통해 얻어지는 VHH 서열에 관한 것이다.
[본원에서 개시된 바와 같은 VHH 도메인의 분리]
몇몇 경우에 있어서, 본원에서 고려된 바와 같은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열을 제조하는 방법은 아미노산 서열 라이브러리로부터, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 검출 가능한 결합 친화성을 갖거나 검출 가능한 시험관 내 효과를 갖는 적어도 하나의 VHH 도메인을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 방법들은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 검출 가능한 결합 친화성을 갖거나 그의 활성에 대하여 검출 가능한 시험관 내 효과를 갖는 적어도 하나의 VHH 도메인을 암호화하는 서열을 증폭하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기재한 방법의 분리 단계로부터 얻은, 특정의 아미노산 서열을 발현하는 파지 클론은 숙주 박테리아의 재감염 및 성장 배지에서의 배양을 통해 증폭될 수 있다.
특정 실시 예에서, 이러한 방법들은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 결합할 수 있는 하나 이상의 아미노산 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
아미노산 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리에 포함된 중쇄 가변 도메인 서열이 적당한 세포 또는 파지 또는 입자상에서 발현되는 경우, 상기 세포 또는 파지 또는 입자로부터, 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 분리하는 것이 가능하다. 이러한 방식으로, 상기 선택된 아미노산 서열 라이브러리 멤버(들)의 뉴클레오티드 서열이 일반적인 서열분석 방법을 통해 결정될 수 있다.
추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 도메인을 제조하는 방법은 실제 원하는 아미노산 서열이 얻어지도록 적당한 조건하에서 숙주 생물에서 상기 뉴클레오티드 서열(들)을 발현하는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 수행될 수 있다.
또한, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 검출 가능한 결합 친화성을 갖거나 그의 활성에 대하여 검출 가능한 시험관 내 효과를 갖는 상기 얻어진 VHH 도메인은, 선택적으로 그의 서열이 확인된 후 가용성 단백질 작제물로서 합성될 수 있다.
예를 들어, 상기 방법들을 통해 얻어지거나, 얻어질 수 있거나 선택된 VHH 도메인은 당 업계에 알려진 재조합 또는 화학적 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 또한, 상기 방법들을 통해 얻어지거나, 얻어질 수 있거나 선택된 아미노산 서열은 유전자 공학 기법을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 상기 방법들을 통해 얻어지거나, 얻어질 수 있거나 선택된 VHH 서열을 합성하는 방법은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 검출 가능한 결합 친화성을 갖거나 그의 활성에 대하여 검출 가능한 시험관 내 효과를 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환 또는 감염시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 검출 가능한 결합 친화성을 갖거나 그의 활성에 대하여 검출 가능한 시험관 내 효과를 갖는 VHH 서열은 재조합 DNA 방법을 통해 만들어질 수 있다. 상기 아미노산 서열을 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 이용하여 쉽게 합성될 수 있다. 일단 제조되면, 그 DNA는 발현 벡터 내로 도입된 다음, 대장균 또는 임의의 적당한 발현계와 같은 숙주 세포 내로 형질전환 또는 형질감염되어, 재조합 숙주 세포 및/또는 이들 재조합 숙주 세포가 존재하는 배지에서 아미노산 서열의 발현을 얻을 수 있다.
단백질 발현 및 정제의 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이, 적당한 발현계를 이용하여 발현 벡터로부터 제조한 VHH 도메인은 용이한 정제를 위하여 예를 들어 His-태그 또는 다른 서열 태그로 표지될 수 있다(일반적으로는 그 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에서).
숙주 세포 내로 핵산 또는 벡터의 형질전환 또는 형질감염은 인산칼슘-DNA 동시침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포좀 융합, 리포펙션(lipofection), 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 바이오리스틱스(biolistics)를 비롯한, 당업자에게 알려진 여러 가지 수단을 통해 달성될 수 있다.
원하는 중쇄 가변 도메인 서열의 발현을 위해 적당한 숙주 세포는 시험관 내 또는 생체 내에 위치하건 상관없이 임의의 원핵 또는 진핵 세포(예를 들어, 대장균과 같은 세균 세포, 효모 세모, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포, 및 곤충 세포)일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 형질전환 식물에 위치할 수 있다.
따라서, 본 발명은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 대하여 검출 가능한 결합 친화성을 갖거나 그의 활성에 대하여 검출 가능한 시험관 내 효과를 갖는 VHH 도메인 서열의 제조 방법으로서, 그러한 VHH 서열을 암호화하는 핵산 서열 또는 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키고 적당한 조건하에서 그의 아미노산 서열을 발현하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
여전히 또 다른 실시 예에서, 본 발명은 본원에 게시된 바와 같은 약학적 조성물을 제조(또는 생산) 방법을 추가로 제공한다.
특정의 실시 예에서, 본 발명은 본원에 게시된 바와 같은 약학적 조성물의 제조 방법으로서, 하기의 단계들을 적어도 포함하는 방법을 제공한다:
- 종양 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 VHH 또는 이의 기능적 단편을 얻는 단계; 및
- 약학적 조성물에서 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편을 제형화하는 단계.
이러한 방법들의 특정 실시 예에서, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 VHH 또는 이의 기능적 단편을 얻는 단계는
(a) 종양 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 VHH 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하고, 선택적으로
(b) 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편을 분리 및/또는 정제하는 것을 포함한다.
이러한 방법들의 다른 특정 실시 예에서, 종양 특이적 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 VHH 또는 이의 기능적 단편을 얻는 단계는
a) VHH 도메인 서열들 또는 VHH 서열들의 기능적 단편들의 세트, 집합 또는 라이브러리를 제공하고;
b) 종양 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 그에 대하여 친화성을 갖는 서열에 대하여 상기 VHH 도메인 서열들 또는 기능적 단편 서열들의 세트, 집합 또는 라이브러리를 선별하고; 선택적으로
c) 종양 특이적 또는 암세포 특이적 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 그에 대하여 친화성을 갖는 상기 VHH 도메인 서열들 또는 이의 기능적 단편 서열들을 분리하는 것을 포함한다.
[본원에 게시된 바와 같은 VHH 도메인의 방사성 표지]
예방 및/또는 치료 목적, 특히 암관련 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료의 목적, 즉, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH가 지시되는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 항원을 죽이거나 적어도 그의 성장 또는 증식을 감소 또는 지연시키는 목적에 적당하도록 하기 위하여, 본원에서 개시된 바와 같은 VHH는 방사성핵종에 연결 또는 결합(예를 들어, 화학적으로 결합)될 수 있다.
암의 예방 및/또는 치료를 위한 세포독성 화합물을 제공하기 위하여 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 또는 이의 기능적 단편에 연결될 수 있는 적당한 방사성핵종의 예들은 당업자에게 명백하게 되고, 예를 들어, 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무스-212, 비스무스-213, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-60, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테늄-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 테크니튬-99m, 라듐-223, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 토륨-227, 크세논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 이트륨-90을 포함하나 그에 제한되지 않는, α-방출 방사성동위원소 및 β-방출 방사성동위원소로 이루어진 군에서 제한없이 선택될 수 있다.
여전히 추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편은 요오드-131로 표지되어 있다.
단백질에 방사성핵종을 혼입하기 위해 이용될 수 있는 여러 가지 방사성 표지 전략이 있다. 방사화학자를 위한 기법의 선택은 사용되는 방사성핵종에 따라 주로 결정된다. 요오드의 방사성 동위원소는 친전자성 치환을 통해 분자 내로 직접 통합될 수 있거나 접합(conjugation)을 통해 간접적으로 통합될 수 있다. 다른 한편으로, 방사성 금속은 킬레이트제를 이용한 착화를 통해 표지된다. 많은 금속성 방사성핵종은 킬레이트제와 안정한 착물을 형성함으로써 단백질과의 접합을 가능하게 하는 능력이 있다. 요오드 핵종을 이용하여 분자를 방사성 표지하는 것은 제약학적 방사화학에서 큰 중요성이 있다. 30종의 상이한 확인된 요오드 동위원소가 있지만, 이들 중 4종만이 방사요오드 화학에서 일반적으로 사용되고 있다: 23lI, 24lI, 25lI 및 133I.
단백질의 직접 방사요오드화는 종양 표적화 또는 암세포 표적화 방사성의약품의 합성을 위한 핵심 방법이다. 일반적으로, 두 개의 단백질 방사요오드화 접근 방법이 있다. 가장 간단한 접근 방법은 티로신 및 히스티딘 잔기에서의 친전자성 치환을 이용한 직접 단백질 표지이다. 방사성요요드화물이 인 시튜에서 산화되어 친전자체인 *I+를 생성한다. 이는 클로라민 T, lodogen® 및 N-할로숙신이미드와 같은 산화제를 이용하여 수행된다. 발생된 친전자체는 아미노산인 티로신의 방향족 고리의 전자를 공격하여 σ-복합체를 형성한다. 이러한 치환은 σ-복합체를 안정화하는 전자 공여 히드록시기로 인해 티로신 잔기에서 수행된다. 단백질의 표지는 온화한 조건하에서 일어나므로, 티로신에의 요오드의 부착이 아주 적당하다.
이러한 방법은 단백질의 표지를 위해 최적인 온화한 조건하에서 수행된다. 그러나 이는 단백질이 접근가능한 티로신 또는 히스티딘 잔기를 포함하는 경우에만 가능하다.
접합(conjugation)을 통한 단백질의 간접 요오드화는 흔히 사용되는 택일적인 방법이다. 이러한 접근방법에서, 요오드는 두 개의 작용기를 함유하는 보결기의 적용을 통해 혼입되어 단백질의 방사요오드화 및 단백질에의 혼입이 모두 가능하게 된다. 방사요오드화를 위해 사용되는 여러 가지 보결기가 있으나, 가장 흔히 사용되는 것은 N-숙신이미딜 5-[*1]아이오도-3-피리딘카르복실 ([131I]SIPC) 및 N-숙신이미딜-3-[*l]-아이오도벤조에이트 ([*I]SIB)이다. 그 두 활성 에스테르는 단백질의 아미노기에 접합되고 높은 생체 내 안정성을 나타낸다. 방향족 기의 아실화를 위한 또 다른 보결기는 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트(iodobenzbate) ([I-131]SGMIB)이다.
본 발명의 특정의 실시 예에서, 본원에 게시된 바와 같은 방사성 표지 VHH는 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체로 표지된다.
방사치료를 의한 상세한 프로토콜은 전문가에게 쉽게 이용될 수 있다(Cancer Radiotherapy: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine), Huddart RA Ed., Human Press 2002). 당업자는 질병의 특성 및 환자의 체질에 따라 적절한 선량 및 적용 스케쥴을 결정하는 방법을 알고 있다. 특히, 당업자는 선량-제한 독성(DLT)을 평가하는 방법 및 이에 따른 최대 허용 선량(MTD)을 결정하는 방법을 알고 있다.
특정 실시 예에서. 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 및 기능적 단편은 약 800 mCi 미만, 예를 들어 약 150 mCi 미만, 예를 들어 약 30 mCi 미만, 예를 들어 약 15 mCi 미만의 방사선량으로 투여된다.
특정 실시 예에서, 상기 방사면역접합체(radioimmunoconjugate)는 방사성핵종에 따라 약 0.5 mCi/mg 내지 약 8000 mCi/mg, 예를 들어 약 mCi/mg 내지 약 1500 mCi/mg, 예를 들어 1 mCi/mg 내지 약 300 mCi/mg, 예를 들어 1 mCi/mg 내지 약 150 mCi/mg의 비활성(specific activity)을 갖고, 정맥 내, 복막 내 경로 또는 다른 경로, 예를 들어 척수강 내 경로를 통해 투여될 수 있다. 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라, 본원에 게시된 바와 같은 방사선핵종-VHH 접합체는 다른 치료약 또는 방사선 감작제와 함께 일회 또는 수회 투여될 수 있다. 적용되는 방사면역접합체의 양은 암종의 정확한 특성에 따라 결정된다. 투여당 방사선량은 효과적이도록 충분히 높아야 하지만, 선량 제한 독성(DLT) 미만이어야 한다.
[예방 및/또는 치료 목적을 위한 VHH 서열, 폴리펩티드 및 약학적 조성물]
여전히 추가의 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 하나 이상의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및/또는 본원에서 고려된 바와 같은 핵산 서열을 포함하고 적어도 한 종의 허용 가능한 담체를 선택적으로 포함하는 조성물(본원에서는 본원에서 고려된 바와 같은 약학적 조성물이라고도 나타냄)이 제공된다.
특정의 실시 예에 따라, 본원에 고려된 바와 같은 조성물은 적어도 한 종의 다른 화합물을 추가로 선택적으로 포함할 수 있다.
특정의 실시 예에서, 본원에 게시된 바와 같은 조성물은 약학적 조성물이다.
본원에 고려된 바와 같은 약학적 조성물은 관심 있는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 분자와 관련이 있는 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 출원은 온혈 동물 특히 포유동물, 더욱 구체적으로는 인간에서 예방 및/또는 치료 용도로 적당하게 되는 것으로, 본원에서 고려된 바와 같은 하나 이상의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 한 종 이상의 암 관련 질환, 장애 또는 상태의 예방 및/또는 치료에서 수의 목적으로 사용될 수 있는 본원에서 고려된 바와 같은 한 종 이상의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
투여량, 투여 경로, 적용 방법, 반복 및 치료기간은 질병의 특성(종양 또는 암 등의 형태, 등급 및 단계) 및 환자의 특성(체질, 연령, 성별 등)에 따라 결정되고, 치료의 담당 전문의에 의해 결정될 수 있다. 위에서 기재되어 있는 개시된 조합의 성분들에 대한 가능한 투여량에 관하여, 치료의 담당 전문의는 임의의 선량 제한 독성 또는 다른 부작용이 일어나는 지를 조심스럽게 모니터하고 이를 조정하는데 필요한 단계들을 수행한다는 것이 명백하다.
일반적으로, 제약 용도의 경우, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은, 본원에서 고려된 바와 같은 적어도 하나의 VHH 서열 또는 폴리펩티드 및 적어도 한 종의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제, 및 선택적으로, 한 종 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 복막 내, 정맥 내 또는 다른 투여, 예를 들어 척수강 내 투여에 적당할 수 있다. 따라서, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및/또는 이를 포함하는 조성물은 예를 들어, 종양 또는 암세포의 위치에 따라, 관심 조직 또는 장기에 전신, 국소 또는 국부 투여될 수 있고, 바람직하게는, 사용하고자 하는 특정 약학적 제형 또는 조성물에 따라 복막 내, 정맥 내 또는 척수강 내 투여될 수 있다. 임상의는 이러한 투여에서 사용하고자 하는 적당한 투여 경로 및 적당한 약학적 제형 또는 조성물을 선택할 수 있다.
주사 또는 주입을 위해 적당한 약학적 투여 형태는, 멸균 주사 또는 주입 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 적합하고 선택적으로 리포좀에 내입되는 유효 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 최종 투여 형태는 제조 및 보관 조건하에서 멸균되고, 유동하고 안정하여야 한다. 그 담체 또는 부형제(vehicle)는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 기름, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적당한 혼합물을 포함하는 용액 또는 액상 분산매일 수 있다.
예방 및/또는 치료에서 사용하기에 필요한 본원에서 개시된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및 폴리펩티드의 양은 선택되는 특정의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 폴리펩티드뿐만 아니라, 투여 경로, 치료중인 상태의 특성, 환자의 연령 및 상태에 따라 다양할 수 있고, 담당의 또는 임상의의 재량으로 최종적으로 결정될 수 있다. 또한, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및 폴리펩티드의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편 또는 장기에 따라 다양할 수 있다.
특히, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및 폴리펩티드는 특히 상태의 심각성 및 치료하고자 하는 환자에 따라 의사에 의해 결정될 수 있는 양으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 질병 징후에 대한 최적 투여량은 단일 하루 투여량으로서 연속적으로(예를 들어, 주입을 통해) 또는 하루 동안의 다중 분할 투여량으로서 1일에 체중 1kg 당 투여하고자 하는 양을 고려하여 결정될 수 있다. 일반적으로 임상의는 본원에서 언급한 인자들에 따라 작당한 1일 투여량을 결정할 수 있다. 또한, 특정의 경우, 임상의는, 예를 들어 위에서 언급한 인자 및 그의 전문적인 판단에 기초하여 이러한 양을 벗어나는 양을 선택할 수 있다는 것이 명백하다.
본원에서 고려된 바와 같은 VHH 및 VHH 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 폴리펩티드의 유용한 투여량은 그의 시험관 내 활성 및/또는 동물 모델에서 그의 생체 내 활성을 확인함으로써 결정될 수 있다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 10㎍ 내지 1000㎍의 VHH의 투여량으로 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편을 제공한다. 추가의 특정 실시 예에서, 본 발명은 10㎍ 내지 1000㎍의 방사성 표지 VHH, 예를 들어 특히 10 내지 100㎍의 방사성 표지 VHH, 바람직하게는 20 내지 70㎍의 방사성 표지 VHH, 예를 들어 40 내지 60㎍의 방사성 표지 VHH, 더욱 바람직하게는 약 50㎍ 등의 방사성 표지 VHH의 투여량으로 방사성 표지 VHH를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 암의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능성 단편을 제공한다.
따라서, 특정 실시 예에서, 암의 예방 및/또는 치료는 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH를 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 달성되는데, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 대상 내에서 0.001 내지 0.05 mSv/MBq의 계산된 평균 유효 선량, 예를 들어, 0.02 내지 0.05 mSv/MBq, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.04 mSv/MBq, 가장 바람직하게는 0.03 내지 0.05 mSv/MBq 등의 계산된 평균 유효 선량을 갖는 것을 특징으로 한다.
따라서, 투여 당 환자에게 적용되는 방사선량은 효과적이도록 충분히 높아야 하지만, 선량 제한 독성(DLT) 미만이어야 한다. 예를 들어 131-요오드를 갖는 방사성 표지 항체를 포함하는 조성물의 경우, 최대 허용 선량(MTD)은 치료적 설정치를 초과하지 않도록 결정되어야 한다.
본원에서 고려된 바와 같은 폴리펩티드 및/또는 이를 포함하는 조성물은 예방 또는 치료하고자 하는 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기에 적당한 치료 방법에 따라 투여되어야 한다. 일반적으로 임상의는 적당한 치료 방법을 결정할 수 있다. 일반적으로, 그 치료 방법은 한 종 이상의 VHH 서열 또는 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 한 종 이상의 조성물을 하나 이상의 약학적으로 유효한 양 또는 투여량으로 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 투여량은 단일 투여량으로 제공되거나 적절한 간격으로 분할 투여(sub-dosed)되는 것이 적절할 수 있다. 투여 방법은 장기 (즉, 적어도 2주, 예를 들어 몇 개월 또는 몇 년) 또는 매일 치료를 포함할 수 있다. 특히, 투여 방법은 1일에 1회 내지 1달에 1회, 예를 들어 1일에 1회 내지 2주에 수회의 사이에서 다양할 수 있고, 예를 들어 1주에 1회의 투여일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라, 본원에서 게시한 바와 같은 약학적 VHH 조성물은, 예를 들어, 수일, 수주 또는 수개월 동안 하루에 1회 또는 수회 간헐적으로 투여될 수 있고 여러 투여량으로 투여될 수 있다. 본원에서 게시한 바와 같은 VHH의 투여량은 특정 암 질환의 특성에 따라 결정된다. 다수의 투여가 바람직하다. 그러나 방사성 표지 물질은 4 내지 24주의 간격으로 투여되는 것이 일반적이고, 바람직하게는 12 내지 20주의 간격으로 투여된다. 그러나 당업자는 각각의 투여의 직후에 투여될 수 있거나 예를 들어 1일 내지 1주의 범위의 얼마간의 예정된 간격을 두고서 투여될 수 있는 둘 이상의 투여로 투여를 분할하여 선택하는 방법을 알고 있다.
특히, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 본원에서 언급된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되거나 사용될 수 있는 다른 약학적 활성 화합물 또는 성분과 병용될 수 있고, 그 결과, 상승효과가 얻어지거나 얻어지지 않을 수 있다. 이러한 화합물 또는 성분의 예뿐만 아니라, 이들을 투여하기 위한 방법 및 약학적 제형 또는 조성물은 당업자에게 명백하게 된다.
본 발명에 있어서, "와 병용(in combination with)", "병용 요법(in combination therapy)" 또는 "병용 치료(in combination treatment)"는 본원에서 게시한 바와 같은 방사선표지 VHH 서열 또는 본원에서 게시한 바와 같은 방사선표지 VHH 서열을 포함하는 폴리펩티드는 한 종 이상의 다른 약학적 활성 화합물 또는 성분과 함께 환자에게, 그 환자가 이러한 조합의 이로운 효과로부터 이익을 얻을 수 있는 방법으로 투여된다. 특히, 두 치료제는 시간적인 근사성을 두고 환자에게 투여된다. 바람직한 실시 예에서, 두 치료제는 4주(28일) 이내에 환자에게 투여된다. 더욱 바람직하게, 두 치료제는 2주(14일), 더욱 바람직하게는 1주(7일) 이내에 투여된다. 바람직한 실시 예에서, 두 치료제는 2일 내지 3일 이내에 투여된다. 또 다른 바람직한 실시 예에서, 두 치료제는 같은 날에, 즉 24시간 이내에 투여된다. 또 다른 실시 예에서, 두 치료제는 4시간 이내, 또는 2시간 이내 또는 1시간 이내에 투여된다. 또 다른 실시 예에서, 두 치료제는 병행, 즉 동시에 투여되거나, 그 두 투여는 시간적으로 중복된다.
특정의 바람직한 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열을 포함하는 폴리펩티드는 한 종 이상의 치료 항체 또는 치료 항체 단편과 함께 투여된다. 따라서, 이러한 특정의 비제한적인 실시 예에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 폴리펩티드를 이용한 방사면역치료는 한 종 이상의 치료 항체 또는 치료 항체 단편을 이용한 일반적인(regular) 면역치료와 병용된다. 추가의 특정 실시 예에서, 본원에서 게시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 이러한 방사성 표지 VHH 서열을 포함하는 폴리펩티드는 트라스투주맙(Herceptin®) 및/또는 페르투주맙(Perjeta®)을 이용한 병용 치료 등과 같은, 한 종 이상의 치료 항체 또는 치료 항체 단편을 이용한 병용 요법 또는 병용 치료법에서 사용된다.
예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 상기 방사성 표지 VHH 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 한 종 이상의 치료 항체 또는 치료 항체 단편, 예를 들어, 트라스투주맙(Herceptin®) 및/또는 페르투주맙(Perjeta®) 등은 동시에 주입될 수 있거나, 그 주입들은 시간적으로 중복될 수 있다. 그 두 약물이 동시에 투여되는 경우, 이들은 단일의 약학적 제제로 일제히 제형화될 수 있거나, 투여 전에 즉시 두 개의 약학적 제형들을 하나의 단일 주입 용액으로 용해 또는 희석함으로써 서로 혼합될 수 있다. 또 다른 실시 예에서, 두 약물은 별개로, 즉 두 개의 독립적인 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 하나의 바람직한 실시 예에서, 두 치료제의 투여는 환자의 신체 내의 종양 세포가 유효량의 세포독성 약물 및 방사성 물질에 동시에 노출되도록 수행된다. 또 다른 바람직한 실시 예에서, 유효량의 본원에서 개시된 바와 같은 방사성 표지 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 상기 방사성 표지 VHH 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 한 종 이상의 치료 항체 또는 치료 항체 단편, 예를 들어, 트라스투주맙(Herceptin®) 및/또는 페르투주맙(Perjeta®) 등은 종양의 부위에 동시에 존재한다.
또한, 본 발명은 정의된 바와 같은 조합 외에도 투여되는 추가의 작용제(agent)들의 용도를 제공한다. 이는 예를 들어, 한 종 이상의 추가의 화학요법제(들)일 수 있다. 또한, 이는 투여된 다른 약물들 중 어느 하나의 원치않는 부작용을 예방, 억제 또는 완화하기 위해 사용되는 한 종 이상의 작용제(들)일 수도 있다. 예를 들어, 백혈구감소증 또는 호중구감소증의 영향을 완화하기 위해 백혈구의 시토킨 자극 증식이 사용될 수 있다.
추가의 측면에 따르면, 관심 있는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 분자에 특이적으로 결합하는 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 또는 폴리펩티드의 사용은 상기 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 분자가 관여하는 적어도 한 종의 암 관련 질환 및/또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조를 위해 제공된다. 따라서, 본 출원은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 분자가 관여하는 적어도 한 종의 암 관련 질환 및/또는 장애의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것으로, HER2 등과 같은 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적 분자에 특이적으로 결합하는 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편, 폴리펩티드 및 약학적 조성물을 제공한다. 특정의 실시 예에서, 적어도 한 종의 암 관련 질환 및/또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법이 또한 제공되는데, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상에게, 본원에 고려된 바와 같은 한 종 이상의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편, 폴리펩티드 및/또는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 폴리펩티드를 이용하여 치료하고자 하는 대상 또는 환자는 암관련 질환 및/또는 장애로 고생하거나 그의 위험이 있는 임의의 온혈동물, 특히 포유동물, 더욱 특히 인간일 수 있다.
본원에 기재된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및 이를 포함하는 조성물의 효능은 관여하는 특정 질환 또는 장애에 따라, 원래 알려진 임의의 적당한 시험관 내 분석법, 세포 기반 분석법, 생체 내 분석법 및/또는 동물 모델, 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 검사될 수 있다. 적당한 분석법은 당업자에게 명백하게 된다.
관여하는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 표적에 따라, 일반적으로 당업자는 종양 특이적 또는 암세포 특이적 분자에 결합하거나 한 종 이상의 암 관련 질환 및 장애에 대하여 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 본원에서 기재된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및 폴리펩티드를 검사하기 위한 적당한 시험관 내 분석법, 세포 분석법 또는 동물 모델을 선택할 수 있다.
따라서, 약물로서 사용, 특히 암 관련 질환 또는 장애의 치료, 특히 고형 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 적어도 한 종의 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하거나 그로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드가 제공된다.
특정 실시 예에서, 본원에서 고려된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편 및 폴리펩티드는 암 및 종양(neoplastic) 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용된다. 암 또는 종양 상태의 예로는 섬유육종, 근육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척석종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing's) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 위암, 식도암, 직장암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 뇌암, 편평세포암, 피지선암, 유두상 암, 유두상 선암, 낭포선암(cystadenocarcinoma), 수질암, 기관지암, 신장세포암, 간세포암, 담도암, 융모암, 정상피종(seminoma), 배아암(embryonal carcinoma), 윌름(Wilm's) 종양, 자궁경부암, 고환암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 소모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 또는 카포시(Kaposi) 육종이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원에서 고려된 바와 같은 VHH 서열은 여러 가지 증식성 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 증식성 장애의 예로는 조혈 신생물성(hematopoietic neoplastic) 장애 및 세포 증식성 및/또는 분화성 장애, 예를 들어, 상피세포증식, 경화성 선증, 소담관 유두종(small duct papillomas); 종양, 예를 들어, 섬유선종, 엽상 종양 및 육종과 같은 기질 종양, 및 대담관 유두종(large duct papilloma)과 같은 상피종양; 유관상피내암(파제트병 포함) 및 소엽상피내암을 포함하는 비침윤성 암, 및 침윤성 유관암, 침윤성 소엽암, 수질암, 콜로이드(점액성) 암, 관상 암, 및 침윤성 유두암을 비롯한 폐의 암, 기타 악성 신생물, 여성형 유방암(gynecomastia carcinoma), 부수종양성 증후군, 기관지폐포암을 비롯한 기관지암, 기관지 유암과 같은 신경내분비종양, 기타 종양, 및 전이성 종양; 흉막의 병태, 예를 들어, 염증성 흉막 삼출, 비염증성 흉막 삼출, 기흉, 흉막 종양, 예를 들어, 고립성 섬유 종양(흉막 섬유종), 악성 중피종, 비신생물성 용종, 선종, 가족성 증후군, 대장 발암, 대장암, 유암종, 결절성 과증식, 선종, 및 악성 종양, 예를 들어, 간의 원발성 종양 및 전이성 종양, 체강 상피의 종양, 장액성 종양, 점액성 종양, 자궁내막성 종양, 투명세포 선암종, 낭선섬유종, 브레너(Brenner) 종양, 표면 상피 종양; 생식 세포 종양, 예를 들어, 성숙(양성) 기형종, 단배엽성 기형종, 미성숙 악성 기형종, 미분화세포종, 내배엽성 동종양, 융모막암, 성기삭 간질성 종양, 예를 들어, 과립막-난세포막 세포종양, 난세포막 섬유종, 남성배세포 종양, 힐세포(hill cell) 종양, 및 생식샘 모세포종; 및 크루겐베르그(Krukenberg) 종양과 같은 전이성 종양이 있다.
이하, 상기의 개시를 하기의 비제한적인 실시 예 및 도면을 참조하여 더욱더 설명하기로 한다.
하기의 비제한적인 실시 예들은 본 발명에 따른 방법 및 수단을 설명한다. 실시 예에서 달리 언급하지 않는 경우, 모든 기법들은 당 업계에서의 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 하기의 실시 예들은 본 발명의 구체 예들을 예시하기 위하여 포함된다. 당업자는 본 개시의 견지에서, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고 개시되는 특정 실시 예들의 많은 변화가 이루어질 수 있고 동일 또는 유사한 결과가 얻어진다는 것을 인정하게 된다. 더욱 구체적으로, 화학적 및 생리학적 모두의 측면에서 관련이 있는 특정 작용제들이 본원에 게시되어 있는 작용제들 대신에 사용되면서 동일 또는 유사한 결과가 달성된다는 것이 명백하다. 당업자에게 명백하게 되는 모든 이러한 유사한 치환 및 변경들은 첨부한 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 범위 및 개념에 포함되는 것으로 생각된다.
따라서, 도면, 서열목록 및 실험 파트 및 실시 예들은 오로지 본 발명을 더욱더 설명하기 위하여 제공되는 것으로서, 본원에서 달리 명백히 나타내지 않는 경우 어떤 식으로든 본 발명의 범위 및 첨부한 특허청구범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시 예
실시 예 1: 항- HER2 V HH 들의 방사성 표지
1. 131-요오드 실험 구성
방사화학 과정
VHH들의 방사요오드화를 위한 확립된 과정을 하기와 같이 수행했다: 필요한 양의 [I*] 요오드화나트륨을, 모두 클로로포름에 용해된 3% (v/v) 아세트산, 30% (v/v) 3차-부틸히드로퍼옥사이드 및 N-숙신이미딜 4-[N1,N2-비스(3차-부틸옥시카르보닐)구아니디노메틸]-3-(트리메틸스타닐)벤조에이트의 혼합물에 전달했다. 교반하면서, 그 혼합물을 실온에서 50분간 유지했다. 다음에, 에틸 아세테이트/헥산 구배를 이용하여, 순상(normal phase) HPLC 상에서 [l*]SGMIB-BisBoc를 정제했다. 트리플루오로아세트산과 함께 실온에서 15분의 유지 후 보호기 제거를 달성했다. 끝으로, 보호기 제거된 [l*]SGMIB를 실온에서 20분간 보레이트 완충액(pH 8.5)에서 100㎍의 항-HER2 VHH와 반응시켰다. His-태그 [131I]SGMIB-이가(2Rb17c-2Rb17c), His-태그 [131I]SGMIB-일가(2Rb17c), 및 His-태그 [131I]SGMIB-일가(2Rs15d) VHH들을, PBS에서 평형화된 PD-10 칼럼 상에서 정제했다.
품질 제어
PBS(pH 7.4)를 주행시킨, 실리카 겔 스트립이 함침된 유리 마이크로섬유 시트(Varian사, Lake Forest, CA, USA)를 이용하여 순간 박층 크로마토그래피(iTLC)에 의해 품질 관리를 수행했다. 동시에, 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체 역상 칼럼(PLRP-S 300 Å, 5 μm, 250/4 mm, Agilent사, Diegem, Belgium)를 이용한 분석 방사-HPLC를 수행했다. 물에 용해된 0.1% TFA 및 아세토니트릴의 혼합물을 하기의 프로토콜에서 사용했다: 0-5 분 25% 아세토니트릴; 5-7 분 25-34% 아세토니트릴; 7-10 분 75-100% 아세토니트릴; 10-25 분 100% 아세토니트릴, 1 ml/분의 유속.
실시 예 2: 종양 HER2 * 이종이식 마우스에서 방사성 표지 항- HER2 V HH 들의 생체분포 및 선량 측정
암컷의 10-12 주령 Balb c nu/nu 무흉선(athymic) 마우스에게, 종양 이식 2일 전에, 그의 등에 60일 연속 방출 17-β-에스트라디올 펠릿(0.72 mg, Innovative Research of America사: Sarasota, FL, USA)를 이식했다. 50 % Martigel (BD Biosciences사, Bedford, MA, USA) 내의 HER2+/루시퍼라제+ 종양 세포(5x106)를 우측 옆구리에 피하 주사하고, 350 내지 500 mm3의 체적에 도달할 때까지 성장시켰다.
His-태그 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH인 이가 2Rb17c (도 1; 표 3), His-태그 [131I]SGMIB-표지 일가 2Rb17c (도 2; 표 4)) 및 His-태크 [131I]SGMIB-표지 일가 2Rs15d (도 3; 표 5)의 정맥 내 주입 후 과량의 이소플루란에 의해 이종이식 마우스를 죽이고, 주사 후 3, 24 및 72시간째에 해부한 후, 관심 조직을 제거하고, 칭량하고, 자동식 감마 카운터에서 131I 활성을 카운트했다. 흡수 값은 % 주입 활성 / 그램 조직 (% IA / g)으로 표시했다.
His-태그 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH들의 주사 후, 관심 조직을 제거하고, 칭량하고, 자동식 감마 카운터에서 131I 활성을 카운트했다.
얻어진 데이터(% IA/g)로 표시됨)를 이용하여, 해당하는 건강한 조직에 대한 종양의 비를 계산했다(표 6)
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
　 131I-SGMIB-Biv(2Rb17c)2 131I-SGMIB-Monov(2Rb17c) 131I-SGMIB-Monov(2Rs15d)
　 3시간 24시간 72시간 3시간 24시간 72시간 3시간 24시간 72시간
종양/폐 15.34 172.42 38.49 17.33 10.76 1.89 79.02 222.59 96.63
종양/심장 38.71 261.95 176.09 133.64 216.65 36.52 194.74 314.47 318.22
종양/간 14.21 128.21 49.13 25.31 36.68 5.69 31.67 122.30 48.94
종양/우축 신장 2.21 26.97 8.87 2.64 8.71 2.83 1.70 11.90 7.56
종양/좌측 신장 2.00 38.48 12.02 2.33 8.62 1.78 1.87 12.11 8.37
종양/위 31.97 85.86 76.58 124.91 152.63 6.24 186.49 50.68 115.10
종양/췌장 97.05 795.12 477.74 307.58 930.94 119.37 609.19 811.41 932.66
종양/비장 34.35 232.62 42.66 43.65 55.55 18.93 77.11 259.52 87.30
종양/가상선 23.10 119.23 26.17 24.28 46.79 4.49 60.09 118.56 25.54
종양/근육 42.75 257.33 316.20 65.72 196.97 51.74 92.44 323.57 1177.17
종양/뼈 17.49 114.93 63.91 38.20 26.93 9.63 88.56 84.46 48.86
종양/소장 27.53 51.85 24.64 63.58 130.90 3.64 189.13 172.86 119.68
종양/대장 31.42 52.52 158.27 82.78 159.28 14.19 141.84 126.33 70.96
종양/혈액 78.29 313.63 151.63 178.48 162.05 28.57 239.96 361.37 224.33
종양/림프절 23.61 134.42 115.68 69.38 178.03 17.19 115.57 44.10 121.09
매우 높은 비율이 관찰되어서, 건강한 조직에서의 매우 낮은 흡수 및 이에 따른 낮은 독성이 확인되었다. 131요오드-SGMIB-표지 His-태그 VHH들을 이용하여 관찰된 바와 같은 이러한 정도의 비율은 다른 방사면역생물학적 의약품(radioimmunobiologicals)의 경우에 여태까지 결코 발표되지 않았다. 99mTc, 68Ga 또는 심지어는 131I와 같은 동위원소를 이용하여 VHH를 방사성 표지하는 다른 포맷들은 신장에서 매우 높은 % lA/g 조직을 일반적으로 나타냈기 때문에, SGMIB를 이용하여 131I로 표지하는 때 His-태그 2Rs15d 또는 2Rb17c VHH들의 경우의 신장에서 매우 낮은 흡수 값을 검출한 것은 특히 놀라운 것이었다. 이러한 신장 흡수 값들은 다음문헌[(Pruszynski 등, J. Nucl. Med.; 2014; Apr;55(4):650-6.; DOI: 10.2967/jnumed.113.127100)]에서 5F7GGC로 명명한 또 다른 Her2-표적화 VHH에 대하여 최근에 보고된 것보다 아주 낮았다. 따라서, 신장에 대한 방사능 흡수 선량을 계산하기 위한 위에서 언급한 원고(manuscript)에 기재된 바와 동일한 방법을 이용하고, 주사 후 3시간 및 24시간 후에 얻은 % lA/g 조직 값에 기초하여, 131I-SGMIB 표지 His-태그 일가 2Rs15d 또는 2Rb17c VHH들에 대하여 1055 cGy/mCi 또는 586 cGy/mCi의 값이 각각 얻어졌는데, 이는 위에서 언급한 원고로부터 생체분포 데이터에 기초하여 5F7GGC에 대하여 얻은 값보다 낮았다.
여러 신체 조직에서 흡수 선량을 계산하기 위한 또 다른 방법으로서, 여성 성인에 대한 평균 유효 선량 추정치(estimate)를, 1시간의 배뇨 방광 간격을 이용하여 OLINDA 1.0 소프트웨어를 이용하여 마우스의 생체분포 데이터로부터 계산했다(인간 예측치에 마우스 데이터의 외삽). 이러한 계산 결과, His-태그 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH인 일가 2Rs15d, His-태그 [131I]SGMIB-표지 일가 2Rb17c 및 His-태그 [131I]SGMIB-표지 이가 2Rb17c에 대한 평균 유효 선량 추정치는 각각 0.031 ± 0.00040 mSv/MBq, 0.032 ± 0.00081 mSv/MBq 및 0.032 ± 0.00026 mSv/MBq (값은 평균 ± SD를 나타냄)였다.
실시 예 3: 이미지화 및 항- 개별특이형 V HH 를 이용한 다발성 골수종의 방사면역치료
다발성 골수종(MM)은 골수(BM)에서 악성 혈장 세포의 단클론성 증폭 및 단클론성 단백질(M-단백질)의 생성에 특징이 있다. 자가 줄기 세포 이식 및 덱사메타손, 보르테조밉(bortezomib), 탈리도미드(thalidomide) 및 레날리도미드(lenalidomide)를 이용한 고투여량 화학요법을 실시하면, 생존율이 개선되지만, MM 환자들은 완전한 완화(CR)를 달성하더라도 여전히 재발한다. 따라서, 잔류 악성 세포를 표적하고 미세잔류질환(MRD)를 제거하여 환자의 상태를 개선하기 위하여는 새로운 치료 전략이 필요하다.
여기서, 본 발명자들은 MM에서 VHH들의 가능한 사용을 입증하기 위하여 쥐과동물 5T2MM 모델에 존재하는 M-단백질을 이용한다. 그 5TMM 모델은 인간 MM과 임상적이고 생물학적으로 유사한 동계(syngeneic) 면역적격 모델이다. 최상으로 특성화된 것은 5T33MM 및 5T2MM 모델이다. 전자는 단시간(4주) 내에 발생하는 공격성 종양을 나타내는 반면, 후자는 3달의 기간에 걸쳐서 발생하는 더욱 온건한 종양을 나타낸다. 둘 모두 세포막 표면상에서 상이한 개별특이형(각각, 5T33MMid 및 5T2MMid)을 나타낸다.
정제된 5T2MM M-단백질을 이용한 단봉낙타의 면역 및 간단한 선별 방법을 통해, 본 발명자들은 개별특이형 상의 가까운 에피토프를 인식하는 매우 특이적인 항-5T2MM-개별특이형 VHH들(α5T2MMid-Nb들)을 선택, 생성 및 정제할 수 있었다(도 6). 이러한 VHH들의 시험관 내 특성규명 후, R3B23이 최상의 결합제로서 확인되었고(도 7, 8 및 9), 따라서, 생체 내 검사를 위해 선택되었다. R3B23를 예전에 확립된 프로토콜을 이용하여 방사성핵종인 99m테크니튬(99mTc) 및 177루테늄(177Lu)으로 표지했다. 99mTc (반감기: 6 시간)은 핵의학 이미지화 기법을 위한 SPECT에서 사용되는 반면, 177Lu (반감기: 6.7 일)은 저에너지 β-마이너스 입자의 방출 때문에 치료 용도로 주로 사용된다.
우선, 본 발명자들은 생체 내에서 R3B23의 특이성을 연구했다. 주사 후(p.i.) 1시간째에, 예전에 설명된 바와 같이 핀홀 SPECT 및 마이크로-CT를 이용하여 마취 마우스를 이미지화했다. 이미지화 후 30분째에, 그 마우스를 죽이고, 여러 조직을 제거하고, 칭량하고, 방사능을 측정했다. 비표적화 대조군인 VHH 99mTc-cAbBCII10를 갖는 정상(naive) 마우스로부터 얻은 융합 SPECT/micro-CT 이미지들은 방광 및 신장에서만 트레이서 흡수(tracer uptake)를 나타냈다(도 4의 a). 생체분포 실험 결과(도 4의 d), 신장 여과를 통해 신체로부터 제거되는 미결합 트레이서의 경우에 예측된 바와 같이 두 신장에서의 높은 트레이서 흡수(>200%IA/g) 및 다른 장기에서의 낮은 수준의 흡수(근육 조직에서 0.20±0.04%IA/g 내지 폐에서 1.02±0.26%IA/g의 범위)가 확인되었다. 중요하게, 유사한 결과가 99mTc-R3B23가 주사된 정상 마우스에서 관찰되어(도 4의 e 및 h), R3B23은 생체 내 표적에서 순환 면역글로불린 등에 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 99mTc-cAbBCII10 (도 4의 b 및 도 d) 또는 99mTc-R3B23 (도 4의 f 및 h)가 주사된 말기 질병을 갖는 5T33MM 마우스 및 99mTc-cAbBcII1O (도 4의 c 및 d)의 SPECT/micro-CT 스캔 이미지 및 생체분포 연구는 신장 및 방광에서의 높은 트레이서 흡수 및 모든 다른 조직에서의 낮은 흡수와 함께 유사한 패턴들을 나타내어, MM 질환은 VHH 흡수에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 99mTc-R3B23 (도 4의 g)이 주입된 5T2MM 마우스의 SPECT/micro-CT 스캔 이미지는 전신적인 트레이서 흡수를 나타내었는데, 이는 생체분포 연구(도 4의 h)를 통해 확인되었다. 혈액에서 100배까지 상승된 트레이서 수준(44.56±2.54%IA/g)은 이러한 말기 질환 모델에서 높은 수준의 순환 M-단백질에의 항-개별특이형 VHH의 결합때문일 수 있다. 그 상승된 트레이서 혈액-풀(blood-pool) 활성은 신장에서 관찰된 감소된 흡수(약 8%IA/g)를 설명하고, 다른 장기에서의 상승된 흡수(근육에서의 0.91 ±0.04%IA/g 내지 폐에서의 11.63±2.35%IA/g의 범위)의 원인이 된다. 순환 M-단백질의 생체 내 증가가 99mTc-R3B23의 SPECT/micro-CT 스캔을 이용하여 시간에 따라 모니터될 수 있다는 것은 주목할만하다(도 10). 결론적으로, 생체분포 연구 결과는 R3B23이 건강한 마우스의 임의의 표적 또는 상이한 유전자형의 M-단백질에 결합하지 않으므로, 정말로 항-개별특이형이라는 것을 입증한다.
끝으로, 본 발명자들은 177루테늄이 접합된 VHH R3B23 (177Lu-R3B23)이 세포 성장에 미치는 영향을 평가했다. 정상 마우스 내로 5T2MM 세포의 접종 후 1주일째에, 본 발명자들은 정맥 내 투여된 177Lu-R3B23 또는 음성 대조군인 177Lu-cAbBCII10을 이용한 매주 처리를 출발했다. 5주의 처리 후, 동물들을 99mTc-R3B23의 SPECT/micro-CT 스캔을 이용하여 이미지화했다(도 5). micro-CT 이미지에 근거하여, 관심 타원체 영역을 심장 근처에 그렸다. 혈액-풀(blood-pool) 활성의 측정치로서 심장에서의 트레이서 흡수는 주입 활성(injected activity)/입방 센티미터로 나눈 조직에서의 카운트(%IA/cm3)로 표시한다. 177Lu-R3B23를 처리한 마우스의 심장에서 검출된 %IA/cm3 (5.55±1.42)은 무처리 마우스에서 측정된 값(10.03±0.27; P<0.005) 및 대조 VHH 177Lu-cAbBcII10으로 처리한 마우스에서 측정된 값(9.19±0.84; P<0.05)보다 유의하게 낮았다. 177Lu-R3B23을 처리한 마우스에서의 99mTc-R3B23 흡수의 더욱 낮은 혈액 값은 치료용 177Lu-표지 VHH와의 생체 내 경쟁에 기인하는 것이 아닌데, 이는 후자의 것이 이미 전신적으로 제거되었기(cleared) 때문이다. 실제로, 10㎍ 177Lu-VHH의 주입 후 10㎍ 99mTc-R3B23 주입 및 이후에 SPECT/micro-CT 스캐닝을 수행했다. 또한, 이러한 시점에서, 177Lu의 긴 물리적 반감기에도 불구하고, 임의 그룹에서의 SPECT 177Lu-채널에서는 신호가 검출될 수 없었다(도 5).
7주의 처리 후, 마우스들을 죽이고, 모세관 전기영동을 통해 혈청 M-단백질을 측정하고 BM의 May-Grunwald Giemsa-염색 표본(cytosmear) 상의 형질세포증가증(plasmacytosis)을 확인함으로써 종양 부하(tumor burden)를 평가했다. 무처리 마우스의 경우, 경계선(borderline) 량의 악성 혈장 세포(<10%) 및 순환 M-단백질(0.06 내지 0.16 g/dl)이 검출될 수 있었으나, 다른 두 그룹에서는 측정가능한 값이 얻어질 수 없었다(데이터 미도시). 그러나 이는 VHH들의 SPECT/micro-CT 스캐닝은 모세관 전기영동과 비교하여 M-단백질의 조기 검출을 위해 더욱 민감하다는 것을 나타낸다. 마우스의 경우, 비장비대는 MM-질환의 증상들 중 하나이다. 특히, 본 발명자들은 177Lu-cAbBCII10을 처리한 마우스 (0.19±0.01 g; P<0.005) 및 무처리 마우스 (0.21 ±0.01 g; P<0.0005)와 비교하여 177Lu-R3B23을 처리한 마우스(0.06±0.02 g)에서 유의하게 낮은 비장 중량을 관찰했다. 무처리 그룹과 177Lu-cAbBCII10 그룹 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 177Lu-R3B23를 처리한 마우스에서 관찰된 효과가 5T2MM 세포의 선택적인 표적화 때문이라는 것을 나타낸다.
요약하면, 본 발명자들은 개념의 증명으로서, MM에서 매우 특이적인 종양 마커에 대한 VHH들을 생성하고 이들을 ELISA 및 유세포 분석에 의한 5T2MMid의 시험관애 검출을 위해 사용하는 것이 가능하다는 것을 입증했다. 또한, 방사성핵종이 접종된 VHH들은 생체 내에서 질병 진행을 모니터하고 MRD-유사 구성(setup)에서 MM 세포를 표적함으로써, MM에서 신규한 진단 및 치료 기법의 개발에서 VHH들의 사용에 대한 추가의 증거를 제공할 수 있었다.
실시 예 4: 177Lu-표지 항-HER2 VHH를 이용한 표적화 방사성핵종 치료
본 연구에서는, 본 발명자들은 치료 방사성핵종인 177Lu(T1/2 = 6.72 일, <Εβ> = 133 keV)를 이용하여, HER2pos 이종이식 종양의 VHH-기반 표적화 방사성핵종 치료에 집중한다.
1. 물질 및 방법
a) 세포주 및 배양 조건
인간 난소암 세포주인 SKOV3 (HER2pos)를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 얻었다. 그 SKOV3 세포에 루시퍼라제-암호화 렌티바이러스 입자들을 형질감염함으로서 SKOV3-LUC (HER2pos/Luciferasepos)를 얻었다. SKOV3 세포를 McCoy's 5A 배지를 이용하여 배양하고, SKOV3-LUC는 DMEM 배지에서 배양했다. 두 배지는 10% 우태혈청, L-글루타민(2 mM), 100 U/mL의 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신을 함유했다. 세포를 37℃에서 5% C02의 습기있는 분위기에서 성장시켰다. 시험관 내 및 생체 내 목적을 위해 사용하기 전에, 트립신-EDTA를 이용하여 세포들을 떼어내었다. 모든 배지 및 첨가물들은 Life Technologies사 (Paisley, UK)로부터 얻었다.
b) V HH 제조 및 정제
항-HER2 VHH인 2Rs15d, 2Rb17c 및 1R136b를 하기와 같이 3종류의 C-말단 아미노산 태그를 이용하여 제조했다: 태그 없는 (VHH), His-태그 (VHH-HHHHHH (서열번호 9)), 및 Myc-His-태그 (VHH-AAAEQKLISEEDLNGAA-HHHHHH (서열번호 10)). VHH들을 박테리아에서 발현시키고 정제했다. 간략히 말해서, 상기 서열들은 His-태그 (pHEN6) 또는 Myc-His-태그 (pHEN18)를 포함하거나 태그가 없는 (pHEN21) 발현 벡터 내로 다시 클로닝했다. 그 재조합 벡터들을, VHH 발현 및 주변 세포질 단백질의 추출을 위해 대장균의 WK6 세포 내로 형질전환했다. His- 및 Myc-His-태그(tagged) VHH들을 His-Select 니켈 친화성 겔(GE Healthcare사) 상에서 친화성 크로마토그래피를 통해 추가로 정제했다. 박테리아 효소를 인식하는 태그 없는 대조군인 VHH BeII10 및 태그 없는 2Rb17c 및 1R136b는 단백질 A Sepharose 비드(GE Healthcare사)상에서 정제했다. 모든 VHH들의 최종 정제는 PBS에서 75 16/60 칼럼(GE Healthcare사)를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 통해 수행했다. 단백질 순도 및 온전성(integrity)은 PBS에서 0.5 mL/분의 유속으로 Superdex 75 10/30 (GE Healthcare사)를 이용하여 평가했다. 또한, ESI-Q-ToF-MS (Waters, Micromass)는 포지티브 모드에서 수행했다.
c) V HH 서열 분석
VHH의 극성에 미치는 C-말단 편향(terminal deviation)의 영향을 Zimmerman 극성 스코어 플로트를 이용하여 평가했다. 간략히 말해서, VHH 서열 내의 아미노산들에, 측쇄들의 쌍극자 모멘트에 기초하여 극성 지수 값을 부여했다. 다음에, 이러한 값들을 Graphpad Prism을 이용하여 플로트했다(plotted).
d) V HH 들에의 1B4M - DTPA 및 CHX -A"- DTPA의 접합
10배 몰 과량의 이작용성 킬레이터인 1B4M-DTPA (177Lu의 경우) 또는 CHX-A"-DTPA (111In의 경우)를, 600 μl의 0.05 M 탄산나트륨 완충액(pH 8.5)에서 VHH의 유리 ε-아미노기들에 실온에서 3시간 동안 접합했다. 그 혼합물의 pH를 pH 7.0로 저하시켜서 그 접합(conjugation) 반응을 중지했다. VHH-킬레이터를 0.1 M 초산암모늄 완충액(7.0)에서 Superdex 75 10/30 (GE Healthcare사) 상에서 정제했다. 평균 접합도는 포지티브 모드로 ESI-Q-ToF-MS(Waters, Micromass)를 이용하여 평가했다.
e) 111 In - 및 177 Lu - DTPA - V HH 들의 제조
예전에 설명한 바와 같이(20) VHH들을 177Lu 로 표지했다. 3000 GBq/mg의 비특이성을 갖는 무담체 177Lu를 ITG사(Garching, Germany)로부터 염화물 용액 형태로 얻었다. 111In을 이용한 방사성 표지를 유사하게 수행했다. 1850 GBq/mg의 비특이성을 갖는 111InCl3는 Mallinckrodt사(Petten, The Netherlands)로부터 얻었다.
필요한 양의 177Lu/111In를, 무금속 0.1 M 초산암모늄(pH 5.0)을 함유하는 테스트 바이알에 200 μL의 최종 체적에 도달할 때까지 첨가했다. 다음에, 25 내지 100㎍의 VHH-DTPA (1 mg/ml)를 첨가하고, 실온에서 30분간 유지했다. 그 방사성 표지 VHH 용액을 일회용 Nap-5 겔여과 칼럼(GE Healthcare사) 상에서 정제하고 0.22 μm 필터에 통과시켰다. 방사화학적 순도를, 이동상으로서 0.2 M 시트르산을 이용한 iTLC 및 분석 방사-HPLC 또는 방사-SEC를 이용하여 평가했다. 방사-HPLC는 폴리스티렌 디비닐벤젠 공중합체 역상 칼럼(PLRP-S 300 Å, 5 μm, 250/4 mm, Agilent사, Diegem, Belgium)를 이용하여 수행했다. 여기서, H20에 용해된 0.1% TFA 및 ACN의 혼합물이 하기의 구배에서 용리액으로 사용되었다: 0-5분 25% ACN; 5-7분 25-34% ACN; 7-10분 75-100% ACN; 10-25분 100% ACN; 유속: 1 ml/분. 방사-SEC는 0.3 ml/분의 유속에서 PBS를 이동상으로 이용하여 Superdex 75 5/150GL 상에서 수행되었다.
동적 평면 신티그래피 연구를 위해 사용된 태그 없는 111In-DTPA-2Rs15d는 7:1의 VHH: 111In 비로 구성되었다. 태그 없는 177Lu-DTPA-2Rs15d를 이용한 생체 외 생체분포 연구의 경우, 9:1 (VHH: 177Lu)의 비가 달성된 반면, 표적화 방사성핵종 치료의 경우, 3:1의 VHH: 177Lu 비를 갖는 태그 없는 177Lu-DTPA-2Rs15d의 시료들이 사용되었다.
f) 177 Lu - DTPA -트라스투주맙의 제조
트라스투주맙에의 1B4M-DTPA의 접합을 수행하여 5:1의 DTPA: 트라스투주맙 비를 얻었다. 간략히 말해서, 100배 몰 과량의 이작용성 킬레이터인 1B4M-DTPA를, 3500 μl의 0.05 M 탄산나트룸 완충액(pH 8.5)에서 트라스투주맙(Herceptin®, Hoffman-La Roche사, Missis-sauga, ON, USA)내의 유리 ε-아미노산들에 실온에서 밤새 접합시켰다. 그 pH를 7.0으로 감소시켜서 그 반응을 중지했다. DTPA-트라스투주맙을 0.1 M 초산암모늄 완충액(pH 7.0)에서 Superdex 75 10/30 (GE Healthcare사) 상에서 정제했다. 접합의 정도는 포지티브 모드로 ESI-Q-ToF-MS (Waters, Micromass)를 이용하여 평가했다. 필요한 양의 177Lu를, 200 μL의 최종 체적에 도달할 때까지 무금속 0.1 M 초산암모늄 완충액(pH 5.0)에 첨가했다. 다음에, 100-250㎍ DTPA-트라스투주맙(2.4 mg/ml)를 첨가하고 실온에서 30분간 유지했다. 177Lu-DTPA-트라스투주맙을 일회용 Nap-5 겔여과 칼럼(GE Healthcare사) 상에서 정제하고 0.22 μm 필터에 통과시켰다. 방사화학적 순도는 위에서 기재한 바와 같이 iTLC and 방사-SEC를 이용하여 평가했다.
g) 동물 연구
건강한 수컷 Wistar 쥐(255 ± 53 g 체중)를 동적 평면 신티그래피 연구에서 사용했다. 암컷 무흉선 누드 마우스(20 ± 5 g 체중)를, 2.5% 이소플루란마취(Abbott사, Ottignies-Louvain-la-Neuve, Belgium)하에서, PBS에 용해된 8 x 106 SKOV3 세포를 우측 뒷다리에 피하 주사하여 접종했다. 생체 내 분포 목적을 위하여, 종양은 205 ± 68 mm3의 크기에 도달했다. 암컷 무흉선 마우스의 우측 뒷다리에 3 x 106 SKOV3-LUC 세포를 접종하여 SKOV3-LUC 이종이식체를 얻었다. 표적화 방사치료 목적을 위하여, 종양은 26 ± 5 mm3에 도달했다. 상기 동물 프로토콜은 Vrije Universiteit Brussel의 윤리 위원회의 승인을 받았다.
h) 건강한 Wistar 쥐에서 111 In - DTPA - V HH 들의 신장 체류
Wistar 쥐(n=3)를, 111In-DTPA-VHH (35.8 ± 5.4 MBq)의 정맥 내 주사 전에, 250 μL 펜토바비톨의 복막 내 주사를 통해 마취시켰다. 각각의 그룹에서, 111In-DTPA-태그 없는 VHH들이 80 mg/kg 젤로푸신(40 g/l, Braun Medical사, Diegem, Belgium)와 함께 추가로 동시 주사되었다. 방사성 표지 VHH들의 빠른 생체 내 반응(kinetics)을 기록하기 위하여, 주사 후 즉시 (30초의 100 프레임) 동적 평면 이미지화를 수행했다. AMIDE Medical Image Data Examiner 소프트웨어를 이용하여, 신장의 시간-활성 곡선을 생성했다. 다음에, 전체 신체 및 신장 근처에 ROI를 그려서, 전체 주입된 활성(% IA)을 기준으로 신장에 보유된 방사능을 계산했다.
i) 177 Lu - DTPA - V HH 들의 생체 내 종양 표적화
SKOV3 종양을 갖는 마우스(n=3)에게, 177Lu-DTPA-2Rs15d VHH 포맷들의 각각 (21 .5 ± 1 .7 MBq)을 정맥 내 주사했다. 각각의 그룹의 경우, 177Lu-DTPA-태그 없는 2Rs15d가 150 mg/kg 젤로푸신과 동시 주사되었다. 주사 후 1시간째에, 마우스를 안락사시키고 해부하여, 조직을 칭량하고, 방사능을 자동식 감마 카운터(Cobra Inspector 5003, Canberra Packard사, USA)를 이용하여 카운트했다. 여러 조직들에 존재하는 방사능의 양을 % IA/g 조직으로 표시했다.
j) 177 Lu - DTPA -트라스투주맙에 대한 단일 선량 177 Lu - DTPA -태그 없는 2Rs15d 및 젤로푸신의 비교 선량측정 계산
SK0V3 종양을 갖는 마우스에게, 14.7 ± 1.3 MBq 177Lu-DTPA-태그 없는 2Rs15d 및 150 mg/kg 젤로푸신 또는 10.1 ± 0.2 MBq 177Lu-DTPA-트라스투주맙을 정맥 내 주사했다. 주사 후 1, 3, 6, 24, 48, 72 및 120시간째에, 마우스를 안락사시키고 해부하여, 위에서 기재한 바와 같이 방사능을 카운트하고 % IA/g으로 표시된 조직 생체분포값을 얻었다. 주사 후 168 시간의 시점이 177Lu-DTPA-트라스투주맙의 선량측정 계산을 위해 포함되었다. 이러한 값들을 시간 적분하여(time integrated) 조직 g 당 체류 시간(residence time)을 얻었다. 간략히 말해서, 0시간과 120시간(177Lu-DTPA-트라스투주맙의 경우 168시간) 사이의 적분은 사다리꼴 방법을 이용하여 수행했다. 마지막 2개의 점들을 이용하여, 120시간으로부터 무한대까지의 체류 시간을 추정했다. 각각의 데이터 세트마다, 흡수 선량을 계산했다. 177Lu의 S 값은 RADAR 팬텀(www.doseinfo-radar.com/RADARphan.html)으로부터 얻었다. 1 g 구형체에 대한 S 값(0.0233 mGy/MBq s)이 선량 계산을 위해 사용되었다.
k) 177 Lu - DTPA -태그 없는 2Rs15d 및 젤로푸신을 이용한 실험적 표적화 방사성핵종 치료
SKOV3-LUC 종양이 20 내지 30 mm3의 체적에 도달한 때 (7일), 동물들을 3개의 그룹(n=8)으로 무작위로 분류했다. 각 그룹의 마우스는 20.7 ± 0.4 MBq 177Lu-DTPA-태그 없는 2Rs15d, 19.3 ± 0.8 MBq 177Lu-DTPA-태그 없는 BcII1O 또는 PBS를 포함하는 체적을 7회 정맥 내 주사(7주간에 걸쳐서 일주에 1회) 받았다. 모든 시료들은 150 mg/kg 젤로푸신에 희석되었다. 본 연구는 종양 세포 접종 후 125일째에 종료되었다. 동물 체중을 매주 모니터하면서, 종양 성장을 캘리퍼 측정을 통해 모니터했다. 또한, 2주에 1회씩, 150 mg/kg 루시페린의 복막 내 주사 후 생체발광 이미지화를 이용하여 종양 부하를 시각화했다. 결과는 무사건 생존율 곡선으로 요약하였는데, 사건은 다음과 같이 정의된다. (1) 사망, (2) > 20% 체중 감소, (3) 궤양형성 종양 조직, 또는 (4) 250 mm3을 초과하는 종양 체적. 연구의 종료 시, 동물들을 안락사 및 해부하고, 신장 조직을 보존했다.
l) 신장 조직병리
177Lu-선량 그룹 및 대조군의 신장 시료를 포르말린에 4시간동안 고정하고, 탈수하고, 파라핀에 포매했다. 그 파라핀 절편(3 μm)들을 처리하여 표준 프로토콜에 따라 H&E, PAS 및 Masson's 트리크롬으로 염색했다. 염색된 절편들은 광 현미경 분석하여, 신장 조직의 세포괴사, 세포자연사, 염증 및 혈관 변화를 평가했다.
m) 통계학
생체분포의 통계학적으로 유의한 차이는 양측검정(two-tailed t-test)을 통해 분석하면서, 처리된 그룹들 사이의 무사건 생존율은 로그순위법(log-rank test)을 이용하여 분석했다(P < 0.05).
2. 결과
a) V HH 에의 1B4M - DTPA 및 CHX -A"- DTPA의 접합
CHX-A"-DTPA는 111In 표지에 사용했고, 1B4M-DTPA는 177Lu 표지에 사용했다. SEC 프로필 및 ESI-Q-ToF-MS 분석은 여러 VHH 작제물에의 이작용성 DTPA-킬레이터의 성공적인 접합을 나타냈다. 태그 없는 2Rs15d, 태그 없는 1B4M-DTPA-2Rs15d 및 태그 없는 CHX-A"-DTPA-2Rs15d의 SEC 프로필이 도 11A 내지 도 11C에서 도시되어 있다. DTPA는 리신 잔기의 ε-아미노산에 접함됨으로써 티오우레아 결합을 형성했다. 따라서, 2Rs15d는 다수의 리신을 함유하므로, 그 접합 반응 결과, ESI-Q-ToF-MS 분석에 의해 확인된 바와 같이, 1, 2 및 3개의 DTPA 킬레이터들을 갖는 분자들의 혼합물이 얻어졌다. 태그 없는 2Rs15d (분자량: 12624 Da), 태그 없는 CHX-A"-DTPA-2Rs15d (주요 피크는 2 DTPA의 접합에 해당함; 분자량: 13923) 및 태그 없는 1B4M-DTPA-2Rs15d (주요 피크는 2 DTPA의 접합에 해당함, 분자량: 13842)의 MS 프로필이 도 16에서 도시되어 있다. 따라서, 표지되지 않은 2Rs15d에 대한 1B4M-DTPA 및 CHX-A'-DTPA 모두의 두드러진 접합비(킬레이터: VHH)는 2:1 이다. 표준화된 프로토콜을 적용함으로써, 2: 1 (킬레이터: VHH) 접합의 일관성있는 정도가 VHH인 2Rb17c 및 1R136d의 경우에 또한 얻어졌다.
b) 111 In - 및 177 Lu - DTPA - V HH 들의 제조
111In 표지를 위하여 VHH들을 CHX-A"-DTPA와 접합했다. 방사성 표지후, iTLC는 SEC 정제 전 및 후에 각각 95.1 ± 1 .7 % 및 > 99 %의 방사화학적 순도를 나타냈다. 1B4M-DTPA과 접합된 2Rs15d VHH 작제물을, iTLC에 의해 확인된 높은 수율, 즉, SEC 정제 전에 97.2 ± 2.5% 및 SEC 정제 후에 > 99%의 수율로 177Lu로 표지했다. 방사-HPLC 또는 방사-SEC를 이용하여 방사화학적 순도를 확인했다. 태그 없는 111In-DTPA-2Rs15d의 방사-HPLC 프로필 및 태그 없는 177Lu-DTPA 2Rs15d의 방사-SEC 프로필이 도 11D 내지 도 11E에서 도시되어 있다.
c) 177 Lu - DTPA -트라스투주맙의 제조
SEC 프로필 및 ESI-Q-ToF-MS 분석은 트라스투주맙에의 1B4M-DTPA의 성공적인 접합을 나타냈다. 177Lu-DTPA-트라스투주맙의 방사화학적 순도는 99.5 ± 0.2% (iTLC)였고 방사-SEC를 이용하여 확인했다. 미접합 트라스투주맙 및 DTPA-트라스투주맙의 SEC 프로필은 177Lu-DTPA-트라스투주맙의 방사-SEC 프로필과 함께 도 17에서 도시되어 있다.
d) 건강한 Wistar 쥐에서 111 In - DTPA - V HH 들의 신장 체류
VHH의 C-말단 극성이 신장 체류의 정도에 강하게 영향을 미친다는 것을 확인하기 위하여, Wistar 쥐에게 여러 111In-DTPA-VHH 작제물들을 주사했다. 대표적이고 균등하게 비례축소된 평면 이미지들이 도 12A 내지 도 12D에서 도시되어 있다. 끝으로, 전신 및 신장 ROI를 그리고 신간에 따라 플로트하여, 신장의 축적 방사능의 상대적인 양들을 얻었다(도 12E). 신장에서 축적 방사능의 최대 축적은 Myc-His-태그 2Rs15d의 경우에 확인되었고, 그 다음이 His-태그 및 태그 없는 2Rs15d 였는데, 이들은 주사 후 50분째에 52.44 ± 4.70, 36.45 ± 4.28 및 18.24 ± 1.71% IA의 값을 각각 나타냈다. 모든 세 개의 곡선은 유사한 포물선 모양을 나타냈다. 신장에서의 최저 축적은 80 mg/kg 젤로푸신과 동시주입된 표지 없는 2Rs15d이 경우에 관찰되었는데, 그 값은 주사 후 50분째에 겨우 6.52 ± 0.18% IA 였다. 여기서, 그 곡선은 방사능의 초기 경사를 나타낸 다음 급속하게 신장 내에서 일정하게 낮은 양의 방사능을 나타냈다. 이러한 결과는 두 개의 추가적인 HER2-표적화 VHH들인 2Rb17c 및 1R136d의 경우에 확인되었다(도 18).
e) 177 Lu - DTPA - 2Rs15d V HH 들의 생체 내 종양 표적화
SKOV3 종양 이종이식 마우스(n=3)에게 여러 177Lu-DTPA-2Rs15d VHH들을 주사했다. 종양 표적화는 C-말단 태그의 변화 또는 젤로푸신(gelofusin)과의 동시주입에 영향을 받지 않았는데, Myc-His-태그, His-태그, 태그 없는 VHH 및 태그 없는 VHH( 150 mg/kg 젤로푸신을 갖는)은 각각 5.9 ± 0.7 %; 6.4 ± 0.8 %; 6.9 ± 0.4 % 및 6.5 ± 0.2 % IA/g의 흡수값을 나타냈다. 더욱 중요하게, 신장 흡수의 실질적인 차이가 다시 관찰되었는데, Myc-His-태그, His-태그, 태그 없는 VHH 및 태그 없는 VHH( 150 mg/kg 젤로푸신을 갖는)는 각각 195.8 ± 23.7%; 127.7 ± 2.9%; 25.8 ± 1.3% 및 10.4 ± 1.7% IA/g의 감소하는 값을 나타냈다(도 13). 주요한 장기 및 조직에서의 흡수값들은 유의하게 변화하지 않았다.
f) 177 Lu - DTPA - 트라스주맙에 대한 단일 선량 177 Lu - DTPA -태그 없는 2Rs15d 및 젤로푸신의 비교 선량측정 비교
표지없는 177Lu-DTPA-2Rs15d VHH의 경우, 가장 높은 종양 흡수값이 초기의 시점에서 관찰되었는데, 그 값은 주사 후 1시간째의 6.50 ± 0.24% IA/g에서 주사 후 48시간째의 2.15 ± 0.11% IA/g, 주사 후 120시간째의 1.15 ± 0.16 % IA/g로 감소했다. 신장 흡수값은 주사 후 1시간째에 10.36 ± 1.73 % IA/g로서 최대였고, 그 다음 주사 후 48시간째의 2.08 ± 0.29% lA/g 및 주사 후 120시간째의 0.40 ± 0.29% IA/g로 감소했다. 뼈 활성은 낮아서, 177Lu의 실질적인 방출은 없었다. 다른 장지 및 조직에서의 방사능 농도는 낮았는데, 그 값은 초기 시점에서 0.5% IA/g이었고, 시간에 따라 감소했다. 이와 대조로, 177Lu-DTPA-트라스투주맙의 종양 흡수는 초기 시점에서는 낮았고, 그 값은 1.07 ± 0.31% IA/g으로부터 주사 후 96시간째의 28.09 ± 0.58% IA/g 및 주사 후 168시간째의 17.13 ± 2.00% IA로 증가했다. 혈액값은 주사 후 1시간째에 23.32 ± 4.36% IA/g로서 높았고, 주사 후 168시간째에 10.69 ± 1.77% IA/g으로서 여전히 높았다. 모든 시점에서, 추가의 장기들(특히, 간, 폐 및 비장)에서의 방사능 농도는 태그 없는 77Lu-DTPA-2Rs15d에 대한 것보다 아주 더 높게 유지되었다.
태그 없는 177Lu-표지 2Rs15d의 경우, 가장 높은 방사능 흡수 선량이 0.9 Gy/MBq의 균등 값으로 종양 및 신장에 전달된 반면, 다른 건강한 조직에서의 방사능 부하 매우 낮았다. 다른 한편으로, 177Lu-DTPA-트라스투주맙은 5.55 Gy/MBq의 계산된 선량을 종양에 전달했다. 그러나 혈액, 간, 장 및 폐에 전달된 방사능은 매우 높았고, 각각 4.18, 1.72, 1.60 및 1.55 Gy/MBq인 것으로 추정되었다.
g) 177 Lu - DTPA - 표지없는 2Rs15d 및 젤로푸신을 이용한 실험적 표적화 방사성핵종 치료
작은 SKOV3-LUC 종양을 갖는 마우스에게, 태그 없는 177Lu-DTPA-2Rs15d, 태그 없는 177Lu-DTPA-BcII10 (비표적화 대조 VHH) 또는 비히클인 PBS를 150 mg/kg 젤로푸신과 함께 정맥 내 동시 주사했다. PBS-처리 (n=8) 및 177Lu-DTPA-BcII10-처리 동물(n=8)의 경우, 모든 동물들의 종양 체적은, 캘리퍼스를 이용하여 측정한 바와 같이, 접종 후 33일 내지 75일 사이에 250 mm3의 값을 이미 초과했다(도 14B). 대조군의 모든 동물들은, 도 14B에서 도시된 바와 같이, 큰 종양(> 1 cm3)의 발생으로 인해 85일째에 안락사시켰다. 두 대조군들 사이의 무사건 생존율의 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이와 대조로, 125일째까지, 태그 없는 항-HER2 177Lu-DTPA-2Rs15d를 처리한 마우스(n=8)의 종양 크기의 실질적인 증가는 관찰되지 않았다. 특히, 8마리 마우스 중 5마리는, 생체 발광을 통해 확인한 바와 같이 종양 부하가 완전히 없었다(도 14A). 다른 3 마리 마우스는 작은 LUCpos의 촉지할 수 없는 종양을 발생했다. 이러한 그룹의 한 마리 동물은 95일째에 20% 초과의 체중 감소로 인해 인락사시켜야 했다. 종합하면, 무사건 생존율은 PBS (P < 0.0001) 또는 177Lu-DTPA-BcII10 (P < 0.0001)를 각각 투여받은 대조군들에 비해 처리군의 경우에 유의하게 길었다(도 15A). 신장 조직의 조직병리학적 분석은 실험군들 사이에 차이를 나타내지 않았다. 신사구체, 관(tubuli) 및 맥관구조가 형태학적으로 정상이었고, 세포 괴사가 관찰되지 않았다. 간질은 확장되지 않거나 섬유형이 아니었고, 염증 세포가 없었다. 단백질 캐스트(cast)가 관찰될 수 없었다(도 15B).
3. 검토
본 연구에서, 본 발명자들은 한편으로는 VHH 서열의 전체 극성 및 다른 한편으로는 신장 체류의 정도에 대한 C-말단 아미노산 태그의 영향을 조사했다. 아미노산 태그는 정제 및 방사성 표지 목적(His-태그) 또는 시험관 내 검출(Myc-태그)을 위하여 항체 단편과 같은 단백질에 일반적으로 연결된다. 그러나, 가능하게 대전된 아미노산의 도입은 단백질의 전체 극성에 영향을 미쳐서 그 단백질의 생체 내 거동에도 영향을 미치게 된다. 이러한 가정은 건강한 Wistar 쥐에서 여러 111In-DTPA- VHH 포맷들의 생체 내 거동을 평가함으로써 최종적으로 확인되었다. Myc-His-표지2Rs15d의 경우에, 신장에 보유된 가장 높은 활성이 관찰되었다. Myc-His-태그를 His-태그로 변화시킨 결과, 표지의 체류가 주사 후 50분째에 31% 만큼 감소했다. C-말단 아미노산 태그를 완전히 제거하면, 신장 체류가 Myc-His-태그 2Rs15d와 비교하여 최대 65% 만큼 저하되었다. 끝으로, 표지없는 111In-DTPA-2Rs15d를 젤로푸신과 함께 동시주입한 경우, 신장 체류가 65% 만큼 추가로 감소되었다. 이러한 관찰결과는 두 개의 다른 HER2-표적화 VHH들의 경우에도 확인되었다.
HER2pos 이종이식 마우스에서, 177Lu로 방사표지된 여러 2Rs15d 포맷을 주사한 후 유사한 경향이 관찰되었다. 도 13은 신장 체류에 대한 동적 스캔을 통한 관찰 결과를 나타낸다. Myc-His-표지 포맷의 경우에 신장에서 최대 흡수값이 관찰된 반면, 태그 없는 2Rs15d 및 150 mg/kg 젤로푸신의 경우에는 최저 흡수가 달성되었다. 종양 표적화는 C-말단 아미노산 태그를 조절하거나 젤로푸신을 동시주입하는 것에 의해 영향을 받지 않았다.
단일 선량의 177Lu-DTPA-트라스투주맙에 대한 단일 선량의 태그 없는 177Lu-DTPA-2Rs15d 및 150 mg/kg 젤로푸신의 비교 생체 외 생체분포를 120 시간 및 168 시간까지 각각 평가했다. 태그 없는 177Lu-DTPA-2Rs15d VHH를 주사하면, 모든 비표적 장기 및 조직으로부터 활성이 신속히 제거되었다. 주사 후 48시간째에, 종양 내의 방사능은 신장에 존재하는 양을 초과하여, 종양 및 신장에 대한 비교가능한 방사능 흡수 선량이 얻어졌다. 혈액, 간 및 비장과 같은 비표적 조직에 전달된 선량은 아주 낮았다. 또한, 뼈에 전달된 낮은 선량은 유리 177Lu가 없다는 것을 암시한다. 이와 대조로, 177Lu-DTPA-트라스투주맙은 표지없는 177Lu-DTPA-2Rs15d와 비교하여 6배 더 높은 선량을 종양에 공급했고, 또한 동시에 폐, 간, 비장, 뼈 및 혈액에의 방사능 부하는 155, 34, 80, 26 및 4180배 더 높았다.
끝으로, 최소 잔류 또는 미세전이성 질환을 모방하기 위한 예비 모델로서, 20 내지 30 mm3의 작은 종양 체적을 갖는 HER2pos 이종이식 마우스에서 VHH-기반표적화 방사성핵종 치료를 수행했다. 비특이적 177Lu-표지 BcII10 VHH 또는 비히클 PBS를 투여받은 두 실험군은 종양 성장 억제의 유의한 차이를 나타내지 않았다. 두 대조군의 모든 동물들의 종양 체적은 접종 후 33일 내지 75일의 사이에 250 mm3의 값을 이미 초과했다. 처리군의 동물들은 125일째까지 250 mm3을 초과하는 종양을 가졌다. 또한, 8마리의 처리된 마우스 중 5마리는 종양의 형성이 전혀 없었다. 나머지 3마리는 작지만 촉지 불가능한 종양을 발생했는데, 그 종양은 생체발광 이미지화를 통해 검출될 수 있었다.
종합하면, 여기서 제시한 결과들은 치료 방사성핵종인 루테늄-177을 이용한 VHH-기반 표적화 방사성핵종 치료가 종양을 갖는 마우스에서 성공적으로 적용된다는 것을 나타낸다. 고도로 특이적인 VHH들은 여러 가지 암관련 항원들에 대하여 용이하게 생성되므로, VHH-기반 표적화 방사성핵종 치료는 여러 종류의 암질환에 도입될 수 있다.
4. 결론
본 발명자들은 150 mg/kg 젤로푸신을 동시주입하면서 태그 없는 VHH들을 이용하는 경우 신장 체류가 감소된다는 것을 입증했다. 따라서, 항-HER2 VHH들은 표적화 방사성핵종 치료를 위한 효능 있는 소분자 전달체를 구상한다. 항-HER2 VHH들은 177Lu로 방사성 표지되는 경우, 건강한 조직에 명백한 방사능을 비특이적으로 전달하지 않고 이종이식 마우스에서 HER2 발현 종양의 성장을 효율적으로 억제한다. 또한, 신장 조직의 조직병리학적 분석 결과, 명백한 독성이 확인되지 않았다.
실시 예 5: C57bl /6 미우스에서 일가의, 수명이 연장되지 않고, 태그가 없는 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 혈액 클리어런스
물질 및 방법
6마리의 정상 수컷 C57bl/6 마우스를 이용하여 혈액 클리어런스(blood clearance)를 평가했다. 각각의 동물은 2500kBq 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d (약 4㎍)을 정맥 내 주사 받았다. 주사 후 2, 5, 10, 15, 20, 40, 60, 120 및 180 분째에 혈액 시료를 마이크로모세관을 이용하여 채취했다. 결과는 전체 혈액 체적당 주입 활성의 %(% IA/TBV)로 나타냈다. 전체 혈액 체적은 전체 체중의 7%로 평가되었다. GraphPad Prism를 이용한 이상 비선형 회귀 피트(fit)를 통해 혈액 반감기를 결정했다.
결과
태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d는 이상 혈액 곡선에 따라 제거되었다(도 19). 초기 신속 세척상(washout phase)에 대한 게산된 반감기는 약 1.93 분이었다. 60 분후, 2%미만의 IA/TBV (전체 혈액 체적당 주입 활성의 %)가 혈액에서 측정되었다.
실시 예 6: HER2 * 종양 이종이식 마우스에서 일가의, 수명이 연장되지 않고 태그가 없는 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체 분포 및 선량 측정, 및 여성 성인에 있어서의 선량 평가
물질 및 방법
종양 이식 하루 전에, 암컷 6주령의 CRLNu-FoxNInu 무흉선 마우스의 등 부위에 60-일 연속 방출 17-β-에스트라디올 펠릿(0.72 mg, Innovative Research of America사: Sarasota, FL, USA)를 이식했다. 50% Matrigel (BD Biosciences사, Bedford, MA, USA)내의 HER2+ BT474/M1 인간 유방암 세포(10x106)를 우측 옆구리 내로 피하 주사하고, 250 내지 350 mm3의 체적에 도달할 때까지 성장시켰다.
태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체분포 포로필을 결정했다. 동물(n=3)에게 1185kBq의 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d (2.0㎍)을 주사했다. 주사 후 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96, 120 및 144 시간째에, 할로탄의 과량투여를 통해 안락사시키고, 해부하고, 그의 장기들을 수집했다. 관심 조직들을 칭량하고, 주입 표준(injection standards)에 따른 131I 방사능을 γ-카운터에서 카운트했다(표 7 - 표 8). 얻어진 데이터(% IA/g으로 표시됨)를 이용하여, 건강한 조직에 대한 해당하는 종양의 비를 계산했다(표 9 - 표 10).
또한, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체분포값을 선량측정 계산에 사용했다(표 11). 그 값을 시간 적분(time integrated)하여 조직 g 당 체류 시간을 얻었다. 간략히 말해서, 사다리꼴 방법을 이용하여 0 시간과 144 시간 사이의 적분을 수행했다. 다음에, 흡수된 선량을 계산했다. 흡수 선량 계산에 있어서, 인터넷상에 발표된 RADAR 팬텀(단위 밀도 구형체(Unit Density Spheres))로부터 131I에 대한 S 값을 얻었다. 1 g 구형체에 대한 S 값(0,0000304 Gy.Kg/MBq.s)을 이용하여 모든 장기 선량을 일반적으로 구했다. 이러한 간단한 선량측정 계산법은 131I 붕괴시의 저에너지 β-입자가 국소적으로 흡수되고 광자 및 다른 침투 방사선은 낮은 정도까지만 기여하여, 마우스의 여러 장기들 사이의 크로스-토크(cross-talk)가 무시될 수 있다는 사실 때문에 흥미로운 것이다.
성인 여성에 있어서 장기에 흡수된 선량의 평가는, 1시간의 배뇨 방광 간격 및 OLINDA software 소프트웨어를 이용하여, 마우스 내의 여러 시점에서의 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체분포 데이터를 성인 여성 팬텀(phantom)에 외삽하여 수행했다(표 12). 그 계산은 장기 내의 붕괴(disintegration)들의 수를 결정하기 위한 시간-활성 곡선에 기초하여 이루어졌다. 여러 장기에 대하여 적절한 가중 인자를 이용하여 장기 선량 및 유효 선량을 계산했다.
결과
건강한 조직에 대한 아주 높은 종양의 비가 달성되어(표 9 - 표 10), 건강한 조직에서의 매우 낮은 흡수 및 이에 따른 낮은 독성이 확인되었다. 상기 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d를 이용하여 관찰한 이러한 정도의 조직에 대한 종양의 비는 다른 방사면역생물학적 의약품(radioimmunobiologicals)의 경우에는 여태까지 발표되지 않았었다. 특히, 이러한 비율은 5F7GGC로 명명한 HER2-표적화 시스테인-태그 VHH(Pruszynski 등, 2014; J. Nucl. Med. 55(4):650-656)와 비교하여 유의하게 높았다. 폐, 심장, 간, 신장, 위, 비장, 근육 및 혈액에 대한 종양의 비들은 모두, 1시간 및 24시간의 시점에서 5F7GGC VHH와 비교하여 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 경우에 유의하게 높았다. 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 경우에 신장에서 매우 낮은 흡수값을 검출한 것은 특히 놀라운 것이었다. 이러한 신장 흡수값은 5F7GGC VHH에 대하여 보고된 값보다 아주 더 낮았다.
태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 주사 후, 관심 있는 21종의 조직들이 자동화 감마 카운터에서 131I 활성에 대하여 카운트된다. 흡수값은, %IA가 사용되는 갑상선, 부신 및 담낭를 제외하고, % 주입 활성/g 조직(% IA / g)으로 표시된다. 값들은 평균 (n=3) ± SD를 나타낸다.
1시간 3시간 6 시간 24시간 48 시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
뇌 0.08 0.08 0.49 0.44 0.01 0.003 0.002 0.001 0.004 0.001
폐 0.94 0.17 0.30 0.11 0.19 0.04 0.05 0.02 0.02 0.01
심장 0.43 0.07 0.15 0.02 0.08 0.004 0.02 0.001 0.01 0.003
간 1.05 0.18 0.39 0.12 0.24 0.09 0.04 0.01 0.05 0.003
신장 55.63 8.47 12.5 2.73 7.15 1.95 0.94 0.52 0.52 0.13
위 0.94 0.39 0.71 0.76 0.12 0.06 0.01 0.04 0.01 0.004
췌장 0.18 0.04 0.05 0.01 0.02 0.005 0.01 0.002 0.003 0.001
비장 0.39 0.07 0.21 0.02 0.09 0.04 0.02 0.004 0.01 0.002
피부 0.86 0.26 0.43 0.11 0.31 0.11 0.02 0.005 0.01 0.007
근육 0.62 0.15 0.24 0.15 0.08 0.01 0.01 0.01 0.004 0.002
뼈 1 0.08 0.53 0.30 0.28 0.2 0.04 0.01 0.02 0.01
소장 0.37 0.09 0.58 0.58 0.16 0.01 0.01 0.003 0.004 0.001
대장 0.3 0.12 0.36 0.34 0.1 0.02 0.01 0.01 0.004 0.002
림프절 0.44 0.15 0.19 0.03 0.1 0.02 0.02 0.01 0.01 0.003
혈액 0.83 0.02 0.19 0.06 0.07 0.01 0.02 0.002 0.01 0.003
자궁 1.1 0.21 0.02 0.005 0.34 0.38 0.02 0.003 0.01 0.002
갑상선* 0.01 0.002 0.001 0.001 0.001 0.0002 0.0001 0.00005 0.001 0.00011
부신* 0.02 0.02 0.002 0.001 0.001 0.0001 0.0001 0.0001 0.001 0.0001
담낭 0.01 0.004 0.003 0.002 0.001 0.001 0.0002 0.00002 0.001 0.00011
종양 20.22 1.64 17.17 1.87 7.17 1.18 5.1 1.9 1.16 0.16
방광 6.65 5.57 2.43 1.38 1.18 1.4 0.03 0.01 0.02 0.005
72시간 96 시간 120 시간 144 시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
뇌 0.0014 0.0005 0.0003 0.0004 0.0008 0.0007 0.01 0.02
폐 0.0089 0.0024 0.02 0.01 0.01 0.003 0.03 0.02
심장 0.0058 0.0009 0.01 0.002 0.004 0.0003 0.003 0.002
간 0.0112 0.0023 0.02 0.01 0.01 0.003 0.02 0.01
신장 0.2413 0.1426 0.13 0.06 0.09 0.02 0.1 0.02
위 0.0083 0.0016 0.01 0.01 0.004 0.0005 0.004 0.002
췌장 0.0014 0.0012 0.002 0.001 0.001 0.001 0.002 0.002
비장 0.005 0.0008 0.01 0.002 0.01 0.001 0.01 0.005
피부 0.0181 0.0073 0.01 0.002 0.01 0.003 0.01 0.004
근육 0.002 0.0009 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.003
뼈 0.0159 0.0105 0.02 0.01 0.01 0.01 0.05 0.04
소장 0.0078 0.0073 0.003 0.001 0.002 0.001 0.01 0.01
대장 0.0071 0.0039 0.02 0.03 0.002 0.001 0.01 0.01
림프절 0.0086 0.0046 0.004 0.003 0.004 0.002 0.02 0.01
혈액 0.0098 0.0017 0.01 0.001 0.01 0.0003 0.01 0.001
자궁 0.0063 0.002 0.01 0.002 0.004 0.001 0.003 0.002
갑상선* 0.00001 0.00002 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.00004
부신* 0.00011 0.00005 0.0001 0.0001 0.00003 0.00004 0.0001 0.0002
담낭 0.0001 0.0001 0.00001 0.00001 0.00007 0.00006 0.0002 0.0003
종양 0.3952 0.0531 0.14 0.01 0.11 0.03 0.01 0.01
방광 0.0185 0.0074 0.01 0.01 0.01 0.002 0.01 0.01
건강한 조직에 대한 종양의 계산된 비. 값들은 평균 (n=3) ± SD를 나타낸다.
1시간 3시간 6시간 24시간 48시간
종양/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
종양/뇌 435.35 278.36 57.59 36.68 830.65 351.38 3573.01 1848.90 2967.91 741.27
종양/폐 21.95 3.96 63.55 18.44 38.24 13.02 95.01 12.86 99.72 58.70
종양/심장 47.37 4.31 122.36 10.13 93.48 10.06 332.65 129.69 121.73 15.44
종양/간 19.76 3.95 49.12 16.93 31.71 10.07 139.18 44.97 23.76 2.96
종양/신장 0.34 0.06 1.47 0.39 1.06 0.38 6.48 4.45 2.28 0.44
종양/위 24.73 11.98 47.70 32.92 68.30 26.79 434.72 203.18 203.02 135.91
종양/췌장 112.78 20.65 398.68 103.12 380.57 31.62 1192.96 577.80 467.06 189.90
종양/비장 53.66 14.59 85.43 7.36 103.47 80/11 336.61 172.00 107.51 23.59
종양/피부 25.42 9.73 42.48 8.31 23.89 4.70 232.89 43.89 98.33 46.17
종양/근육 34.56 12.32 112.45 95.38 91.22 2.19 499.42 249.18 383.10 233.29
종양/뼈 20.30 2.80 41.83 23.00 31.98 13.43 121.67 46.99 78.78 41.41
종양/소장 56.73 11.52 57.89 45.42 46.28 11.40 1107.06 986.14 281.88 104.41
종양/대장 74.99 28.66 76.35 45.49 72.43 11.17 819.79 591.78 353.73 165.39
종양/림프절 49.66 17.83 97.34 22.84 75.39 20.89 376.44 289.04 146.48 55.22
종양/혈액 24.35 1.39 96.84 20.56 107.23 29.37 258.66 93.60 86.21 22.81
종양/자궁 18.77 3.29 773.99 150.39 43.43 29.74 260.55 53.85 107.01 21.00
72시간 96시간 120시간 144시간
종양/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
종양/뇌 305.22 69.97 1777.55 1503.79 800.14 1246.53 127.20 218.68
종양/폐 46.84 13.85 14.05 8.15 23.92 19.31 1.38 1.94
종양/심장 70.57 20.95 29.61 10.39 27.94 5.13 6.29 6.49
종양/간 36.22 9.22 7.53 3.27 13.19 6.27 1.14 0.68
종양/신장 1.46 0.14 1.17 0.40 1.13 0.12 0.15 0.06
종양/위 48.35 5.77 20.07 9.04 27.86 7.02 3.95 2.21
종양/췌장 401.81 238.60 99.27 41.36 122.83 49.57 208.69 347.90
종양/비장 82.13 25.18 22.91 9.53 18.67 3.30 5.25 6.42
종양/피부 26.37 17.02 16.51 4.28 12.58 4.83 1.30 0.59
종양/근육 209.72 55.17 397.50 619.22 37.80 7.76 11.12 15.97
종양/뼈 34.05 23.93 8.63 2.38 9.68 6.90 1.25 1.91
종양/소장 85.01 55.60 56.79 27.42 54.00 18.94 6.88 9.13
종양/대장 70.39 41.52 19.75 14.92 92.04 60.83 4.41 4.81
종양/림프절 54.48 23.58 216.58 326.69 28.43 7.59 0.97 0.32
종양/혈액 41.65 12.01 17.69 0.40 16.53 4.75 2.78 0.87
종양/자궁 65.95 18.96 25.56 4.91 30.62 11.81 5.22 2.58
신장에 대한 방사능 흡수 선량을 계산하기 위해 Pruszynski에서 기재된 바와 동일한 방법을 이용하고 % IA/g 조직 값에 근거하여(표 7 - 표 8), 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 경우에 835.96 cGy/mCi의 값이 얻어졌는데(표 11), 이는 Pruszynski 등의 선량 측정 데이터에 기초하여 5F7GGC VHH의 경우에 얻어진 값의 절반 미만이었다. 또한, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 경우, 간, 비장, 폐, 위 및 혈액에 대하여는 아주 더 낮은 값들이 얻어졌다.
태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 경우에 얻어진 값(835.96 cGy/mCi)은 his-태그 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 경우에 신장에 대하여 얻어진 흡수 선량(1055 cGy/mCi, 실시 예 2 참조)보다 놀랍게도 낮았다.
암컷 HER2+ 종양 이종이식 마우스에서 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d에 대한 선량 계산치
장기/조직 선량 ( cGy /mCi)
뇌 9.38
폐 26.66
심장 11.50
간 31.13
신장 835.96
위 24.94
췌장 3.75
비장 13.22
피부 28.38
근육 11.37
뼈 32.24
소장 20.79
대장 15.79
립프절 13.11
혈액 14.72
담낭 0.18
종양 1188.34
방광 119.53
마우스에서 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체분포 데이터로부터 OLINDA 1.0 소프트웨어를 이용하여 성인 여성에 대한 방사선량 추정치를 계산했다. 그 계산은 20개의 장기에서 붕괴들의 수를 결정하기 위한 시간-활성 곡선에 기초하였다. 여러 장기에 대한 적절한 가중 인자를 이용하여, 장기 선량, 유효 선량 및 유효 선량 해당량을 계산했다. 하기 표 12는 계산된 장기 흡수 선량을 요약하고 있다. 유효 선량은 0.0273 mSv/MBq로 평가되었다.
OLINDA 계산에 기초하여 평가한, 성인 여성의 경우의 여러 장기에 대한 방사선량 평가치
표적 장기 전체 ( mSv / MBq )
부신 2.17E-04
뇌 7.27E-07
유방 5.84E-05
담낭벽 7.33E-04
하부 대장벽 7.99E-03
소장 3.17E-03
위벽 3.52E-04
상부 대장벽 2.45E-03
심장벽 7.12E-05
신장 4.43E-04
간 2.62E-04
폐 6.49E-05
근육 1.83E-03
난소 7.45E-03
췌장 2.66E-04
적색 골수 1.27E-03
골원성 세포 8.93E-04
피부 6.16E-04
비장 2.63E-04
흉선 3.93E-05
갑상선 8.87E-06
방광벽l 4.91E-01
자궁 1.58E-02
전신 1.86E-03
　 　
유효 선량 해당량 3.33E -02
유효 선량 2.73E -02
실시 예 7: HER2 + 종양 이종이식 마우스에서 트라스투주맙 및/또는 페르투주맙과 경쟁적인, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체분포
트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이 둘의 조합을 이용한 전처리 후, HER2+ 종양 이종이식 마우스에서, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 생체분포 프로필을 평가했다. 트라스투주맙(상표명: Herclon®, Herceptin®) 및 페르투주맙(상표명: Perjeta®)은 HER2/neu 수용체를 방해하는 단클론 항체이다. 이들의 주요 용도는 특정 유방암을 치료하는 것이다.
물질 및 방법
종양 이식 하루 전에, 암컷 6주령의 CRL:Nu-FoxNInu 무흉선 마우스의 등 부위에 60-일 연속 방출 17-β-에스트라디올 펠릿(0.72 mg, Innovative Research of America사: Sarasota, FL, USA)를 이식했다. 50% Matrigel (BD Biosciences사, Bedford, MA, USA)내의 HER2+ BT474/M1 인간 유방암 세포(5x106)를 우측 옆구리 내로 피하 주사하고, 150 내지 250 mm3의 체적에 도달할 때까지 성장시켰다. 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 투여 72시간 전에, 동물들(n=3)을 100 몰 과량의 항-HER2 mAbs로 전처리했다. 다음에, 그 동물들은 1185kBq의 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d (5.0㎍)을 투여받았다. 주사 후 1시간째에, 할로탄 과량 투여를 통해 그 동물들을 안락사시키고, 해부하고, 그의 장기들을 수집했다. 관심 조직들을 칭량하고, 주사 표준에 따라 γ-카운터에서 131I 방사능을 카운트했다. 결과는 조직 1 g 당 % 주입 활성(% IA/g)으로 표시했다.
결과
그 결과는 하기 표 13에서 나타낸다. 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d 만을 투여받은 동물 그룹과 Herceptin® 및/또는 Perjeta®로 전처리한 동물 그룹 사이에 종양 흡수의 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d는, 제시한 생체 내 경쟁 분석법을 통해 확인된 바와 같이, HER2에의 결합을 위해 단클론 항체인 Herceptin® 및 Perjeta®와 경쟁하지 않는다.
트라스투주맙, 페르투주맙 또는 이들 두 항-HER2 mAb들의 조합과의 경쟁이 있거나 없이, 암컷 HER2+ 종양 이종이식 마우스에서 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d에 대한 생체분포 데이터. 값은, %IA가 사용되는 갑상선을 제외하고, % 주입 활성 / 조직의 g (% IA / g)으로 표시한다. 값들은 평균 (n=3) ± SD를 나타낸다.
장기/조직 2Rs15d 2Rs15d +
트라스투주맙 		2Rs15d + 페르투주맙 2Rs15d + 트라스투주맙 및 페르투주맙
뇌 0.03 0.01 0.03 0.01 0.04 0.02 0.05 0.03
폐 0.94 0.33 0.59 0.22 0.75 0.21 0.97 0.46
심장 0.34 0.03 0.35 0.04 0.39 0.03 0.47 0.06
간 1.58 0.26 1.82 0.78 0.95 0.49 1.38 0.29
신장 78.08 26.88 60.31 17.08 66.21 15.71 75.74 11.28
위 0.54 0.15 0.58 0.19 0.51 0.19 0.87 0.28
췌장 0.13 0.03 0.14 0.01 0.21 0.14 0.18 0.01
비장 0.43 0.1 0.49 0.15 0.44 0.05 0.7 0.1
근육 0.53 0.16 0.87 0.7 0.34 0.06 0.87 0.53
뼈 0.95 0.19 0.78 0.06 1.14 0.46 1.1 0.1
소장 0.27 0.1 0.25 0.06 0.24 0.08 0.45 0.1
대장 0.32 0.14 0.16 0.03 0.25 0.12 0.41 0.09
림프절 0.56 0.12 0.46 0.08 0.55 0.13 0.91 0.21
혈액 0.77 0.11 0.57 0.06 0.66 0.14 0.82 0.09
자궁 0.69 0.22 0.58 0.28 0.62 0.27 0.9 0.32
갑상선* 0.01 0.002 0.002 0.001 0.002 0.001 0.002 0.001
종양 11.00 3.94 9.31 2.35 8.91 2.06 8.59 2.85
실시 예 8: HER2 * 종양 이종이식 마우스에서 태그 없는 일가 [ 131 I] SGMIB -표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 치료 효능
태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d의 치료 효능은 HER2* 종양 이종이식 마우스에서 종양 성장을 억제하기 위한 그의 능력을 측정함으로써 평가했다. 그의 치료 효능의 특이성은 하기의 2개의 대조구를 포함시킴으로써 평가되었다: (1) 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 비표적화 대조 VHH의 투여; 및 (2) 비히클 용액인 PBS의 투여.
물질 및 방법
19 CRL:Nu-FoxNInu 누드 마우스의 우측 뒷다리에, 50/50 매트리겔/세포배양 배지에 함유된 5x106 HER2+ BT474/M1 종양 세포를 접종했다. 캘리퍼스 측정을 통해 확인된 바와 같이 50±30 mm3까지 종양을 성장시켰다. 다음에, 동물들을 다음과 같이 3개의 처리 그룹으로 무작위로 나누었다: 처리 그룹 1 (n=6): 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d (250±50 μCi/처리), 처리 그룹 2 (n=6): 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 비표적화 대조 VHH (250±50 μCi/처리), 및 처리 그룹 3 (n=7): 비히클 용액. 동물들을 5회(5주 동안 1주에 1회) 처리했다. 종양 체적 및 동물 체중은 매주 측정했다. 종양이 1 cm3에 도달하거나 > 20%의 체중 감소가 관찰된 때, 동물들을 안락사시켰다. 150일 후, 그 결과들은 생존율 곡선에서 합친 다음, 통계학적 분석을 수행했다(Log-rank (Mantel-Cox) test).
결과
작은 HER2+ BT474/M1 종양(50±30 mm3)을 갖는 마우스에게, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 비표적화 대조 VHH, 또는 비히클 용액인 PBS를 정맥 내 주사했다. PBS-처리한 모든 동물(n=7) 및 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 비표적화 대조 VHH로 처리한 그룹의 경우 1 마리를 제외한 모든 동물(n=6)은 큰 종양(> 1 cm3)의 발생으로 인해 150일째에 안락사시켰다(도 20). 두 대조 그룹들 사이에 무사건 생존율의 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
이와 대조로, 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 항-HER2 VHH 2Rs15d으로 처리한 그룹의 경우 상기 두 개의 대조 그룹과 비교하여 종양 성장이 유의하게 지연되었다(도 20). 또한, 150일째까지, 그 처리된 동물 그룹의 절반은 종양 부하가 전혀 없었다. 종합하면, PBS (P < 0.05) 또는 태그 없는 일가 [131I]SGMIB-표지 비표적화 대조 VHH(P < 0.05)를 각각 투여받은 대조 그룹과 비교하여 상기 처리 그룹의 경우에 생존이 유의하게 길었다. 이러한 확인 결과는, 치료 효과를 위하여는 수명 연장 및 다가(multivalency)가 요구된다는 것이 일반적으로 인정되는 반면, 방사성 표지되고, 태그가 없고 수명이 연장되지 않은 일가의 VHH가 치료 효과를 갖기 때문에, 특히 놀라운 것이다.
실시 예 9:
* 마우스에서 131I-SGMIB 표지 2Rs15d 또는 다른 VHH들에 대한 선량-증가 독성 곡선을 확립하여 이러한 프로브들에 대한 독성 제한 선량을 평가한다.
* 인간 자원자 유방암 환자에서 저 선량의 GMP 등급 131I-SGMIB-2Rs15d의 생체분포 분석을 수행하여 신장과 같은 다른 신체 조직에서는 낮은 배경 신호를 가지는, Her2-양성 종양 병소의 효과적인 표적화를 확립한다.
* 루시퍼라제-암호화 렌티바이러스 입자로 형질감염시킨 피하 Her2+ SKOV3 세포를 갖는 무흉선 누드 마우스에서 7회의 매주 주사의 방법에 따른 고 선량의 131I-SGMIB-2Rs15d의 투여의 치료 효능을 평가함으로써, 캘리퍼스 측정 및/또는 생체발광 이미지화를 통해 대조군 마우스와 비교한 종양 성장 지연을 측정한다.
SEQUENCE LISTING <110> VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL <120> RADIO -LABELLED ANTIBODY FRAGMENTS FOR USE IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF CANCER <130> VUB-064-PCT <150> 14178943.8 <151> 2014-07-29 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 sequence of VHH 2Rs15d <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Asn Ser Cys Gly 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 sequence of VHH 2Rs15d <400> 2 Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 sequence of VHH 2Rs15d <400> 3 Ala Val Cys Tyr Asn Leu Glu Thr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 sequence of VHH 2Rb17c <400> 4 Gly Phe Ile Phe Ser Asn Asp Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 sequence of VHH 2Rb17c <400> 5 Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 sequence of VHH 2Rb17c <400> 6 Val Thr Gly Tyr Gly Val Thr Lys Thr Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH sequence 2Rs15d <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Asn Ser Cys 20 25 30 Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Gly Arg Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr Trp His Lys Glu Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Val Lys Lys Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Val Cys Tyr Asn Leu Glu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH sequence 2Rb17c <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Asp 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Trp Ser Gly Thr His Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Gly Tyr Gly Val Thr Lys Thr Pro Thr Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag <400> 9 His His His His His His 1 5 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc-His-tag <400> 10 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 1 5 10 15 Ala His His His His His His 20

Claims (23)

  1. 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 암세포 상에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 유래의 방사성 표지 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편.
  2. 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양상에 존재하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 유래의 방사성 표지 중쇄 가변 도메인(VHH) 또는 이의 기능적 단편.
  3. 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 암세포 상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 한 종의 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물.
  4. 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 것으로, 고형 종양상에 존재하고/하거나 그에 특이적인 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 적어도 한 종의 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 약학적 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 또는 4 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편이 HER2에 특이적으로 결합하는 것인, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  6. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 5 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 적당한 경쟁 분석법을 이용하여 확인된 바와 같이, HER2에의 결합을 위해 단클론 항체인 트라스투주맙(Herceptin®) 또는 단클론항체인 페르투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는 것인, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  7. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 이를 필요로 하는 대상에게 상기 대상 내에서 0.002 내지 0.1 mSv/MBq의 계산된 평균 유효 선량을 가지면서 투여되는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  8. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은, 필요로 하는 대상에게 1일에 1회 내지 1달에 1회의 투여 간격 또는 1달에 1회 내지 1년에 1회의 투여 간격으로 투여되는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  9. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 고형 종양 또는 암세포에 존재하고/하거나 그에 특이적인 상기 표적 단백질에 5 nM 미만의 친화력으로 결합하는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  10. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 α-방출 방사성 동위원소 및 β-방출 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지되어 있는. 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  11. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무스-212, 비스무스-213, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-60, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테늄-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 테크니튬-99m, 라듐-223, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 토륨-227, 크세논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 이트륨-90으로 이루어진 군에서 선택된 방사성 동위원소로 표지되어 있는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  12. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편이 131-요오드로 표지되어 있는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 12 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 N-숙신이미딜-4-구아니디노메틸-3-[I-131]아이오도벤조에이트 ([I-131]SGMIB) 또는 이의 적당한 유도체 또는 변이체를 이용하여 131-요오드로 표지히어 있는. 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  14. 제 5 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 5 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH는 서열번호 1을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 2를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 갖는 CDR3 영역, 및/또는 서열번호 4를 갖는 CDR1 영역, 서열번호 5를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 6을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 군에서 선택된 CDR 조합들 중 하나를 포함하는. 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  15. 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 5 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH는 서열번호 7 또는 8의 아미노산들 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  16. 제 5 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 5 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH는 서열번호 7 또는 8의 아미노산들 중 적어도 하나 또는 이의 기능적 단편과 동일한, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  17. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 암이 유방암인, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  18. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 암의 예방 및/또는 치료가 면역치료와 병행되는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  19. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편이 필요로 하는 대상에게 정맥 내, 척수강 내 또는 복막 내 투여되는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  20. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH가 일가 포맷으로 존재하는, 척수강 내 또는 복막 내 투여되는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  21. 제 20 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 20 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편은 시스테인 함유 태그, 바람직하게는 GGC-태그, 가 없는, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  22. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 수명이 연장되지 않은 것인, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
  23. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 제 3 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 카르복시-말단 폴리펩티드 태그가 없고, 바람직하게는 상기 VHH 또는 이의 기능적 단편은 태그가 없는 것인, 방사성 표지 VHH 또는 이의 기능적 단편 또는 약학적 조성물.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013113391A2 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Brainlab Ag Method for determining an infusion parameter
US20180036442A1 (en) 2014-07-29 2018-02-08 Vrije Universiteit Brussel Radio-labelled antibody fragments for use in the prognosis, diagnosis of cancer as well as for the prediction of cancer therapy response
JP6917357B2 (ja) 2015-07-17 2021-08-11 フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ 癌治療に使用する放射標識抗体断片
US20200188541A1 (en) * 2017-03-30 2020-06-18 Duke University Radiolabeled biomolecules and their use
JP7432329B2 (ja) * 2018-09-13 2024-02-16 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 医用画像診断システム
EP4178982A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Precirix N.V. Antibody fragment against folr1
WO2023213801A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Precirix N.V. Pre-targeting
CN117670883B (zh) * 2024-01-31 2024-05-07 中国医学科学院北京协和医院 一种鉴别高低级别膀胱癌的方法、设备和系统

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
ATE370235T1 (de) * 1994-09-16 2007-09-15 Cancer Res Fund Of Contra Cost Rekombinantpeptide hergeleitet vom mc3 antikörper gegen ba46, verfahren zu deren verwendung und verfahren zur humanisierung von antikörperpeptiden
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
CA2258518C (en) 1996-06-27 2011-11-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
AU3596599A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
AU3041100A (en) 1999-01-05 2000-07-24 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
ATE276359T1 (de) 1999-01-19 2004-10-15 Unilever Nv Verfahren zur herstellung von antikörperfragmenten
CA2370351A1 (en) 1999-04-22 2000-11-02 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
PT1233987E (pt) 1999-11-29 2009-12-28 Bac Ip B V Imobilização de moléculas de ligação ao antigénio de um domínio
AU1859201A (en) 1999-11-29 2001-06-12 Unilever Plc Immobilisation of proteins
ES2324280T3 (es) 2000-03-14 2009-08-04 Unilever N.V. Dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos frente a lipasas dieteticas humanas y sus usos.
AU2001268855A1 (en) 2000-05-26 2001-12-03 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
EP1360207B1 (en) 2000-12-13 2011-06-22 Bac Ip B.V. Protein arrays of camelid heavy-chain immunoglobulin variable domains
JP4213586B2 (ja) 2001-09-13 2009-01-21 株式会社抗体研究所 ラクダ抗体ライブラリーの作製方法
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
WO2003050531A2 (en) 2001-12-11 2003-06-19 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
JP4323317B2 (ja) 2001-12-21 2009-09-02 フラームス・インテルウニフェルシタイル・インステイチュート・フォール・ビオテヒノロヒー・ヴェーゼットウェー（ヴェーイーベー・ヴェーゼットウェー） 可変領域配列のクローニング方法
EP1461085A2 (en) 2002-01-03 2004-09-29 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Immunoconjugates useful for treatment of tumours
WO2004041862A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
EP2267032A3 (en) 2002-11-08 2011-11-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
EP1587838B1 (en) 2003-01-10 2015-04-15 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and their use in modulating platelet-mediated aggregation
US20090304590A1 (en) * 2007-05-29 2009-12-10 Wyeth Therapeutic compositions and methods
EP2143735A1 (en) * 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
US20110200525A1 (en) * 2008-10-09 2011-08-18 Patz Jr Edward F Vhh antibody fragments for use in the detection and treatment of cancer
WO2011051327A2 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Small antibody-like single chain proteins

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