KR20170026308A - 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 - Google Patents

아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체를 이용하는 경우, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 또는 바이러스의 세포 내 전달효율이 향상된다. 따라서 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체는 다양한 치료제의 세포 내 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물{Compositions for Intercelluar Delivery Comprising Peptide derived from Adenovirus Protein VI and Pharmaceutical Compositions for Treating Cancer Comprising the Same}
본 발명은 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
기존의 암 유전자 치료제는 대부분 국소투여(local administration)를 통해 체내에 주입하기 때문에 온몸에 퍼져있는 전이암에 대한 접근성이 떨어지는 한계가 있었다. 이로 인해 전이암과 같이 온몸에 미세하게 퍼져있는 질환의 경우에는 현재까지 유전자 치료 대상에서 거의 제외되어 왔지만, 유전자 치료제 시장을 확장하기 위해서는 전신 투여가 가능한 제품의 개발이 필요하다.
아데노바이러스의 경우, 유전자 전달 벡터로서 여러 가지 장점들이 부각되면서 암 유전자 치료에서 사용빈도가 꾸준히 증가하고 있으며, 환자를 대상으로 진행하는 임상시험에서 가장 높은 빈도로 이용되고 있다. 특히, 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포만을 살상할 수 있는 종양 살상 아데노바이러스는 일차 감염세포에서 치료효과를 나타낼 뿐만 아니라 증식된 바이러스가 주변의 종양세포들을 2차, 3차 연쇄적으로 감염하고 암세포들을 살상함으로써, 그 치료효과가 도미노 현상과 같이 계속 퍼져 나갈 수 있기 때문에 암 치료효과를 현저하게 증대시킬 수 있다. 한편, 종양 살상 아데노바이러스에 치료 유전자를 탑재하면, 치료 유전자의 발현이 암세포에서만 제한적으로 고효율로 발현됨으로서, 치료효과를 상승적으로 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, 주변의 정상세포에서는 종양 살상 아데노바이러스의 증식이 억제되므로 세포살상이 일어나지 않으므로 안전성이 높다는 장점이 있어 차세대 항암 치료제로서 주목을 받고 있다.
하지만, 바이러스 기반 유전자 치료제는 전신투여의 경우 혈액 내에 있는 면역 세포들에 의해 바이러스가 빠르게 제거되어 타겟 종양조직으로 전달되는 양이 매우 적으며, 간에 많은 양이 축적되어 간독성을 야기할 수 있다는 한계가 있다. 또한, 반복 투여의 경우 고농도의 중화항체를 형성하기 때문에 반복 투여에 의한 치료 효과가 상당히 감소되는 단점이 있다. 이러한 이유들로 인하여 현재 개발되고 있는 종양 살상 아데노바이러스는 모두 국소투여에 의한 암치료가 이루어지고 있다. 따라서 전신투여가 가능하며 효율적으로 아데노바이러스를 목표인 종양세포에 전달할 수 있는 새로운 혁신적인 방법의 개발이 필요한 상황이다.
새로운 방법 중의 하나로서 종양살상용 아데노바이러스 자체를 치료제로 사용하는 것이 아니라, 종양살상용 아데노바이러스의 DNA를 타겟 종양세포에 전달하여 암을 치료하는 방법이 시도되고 있다. 이를 위해서는 인체에 안전하면서도 보다 효율적으로 아데노바이러스 DNA를 종양세포에 전달할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 바이러스의 DNA 또는 바이러스를 보다 효율적으로 종양세포 내에 전달하여 종양 살상 효과를 나타낼 수 있는 조성물 또는 방법을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드 또는 상기 펩티드-폴리머의 복합체를 이용하여 바이러스 DNA 또는 바이러스를 종양세포 내로 전달하는 경우, 바이러스 DNA 또는 바이러스의 세포 내 도입효율이 향상되고, 우수한 항암치료 효과를 나타낸다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물 및 바이러스 DNA 또는 바이러스를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 다음과 같은 서열번호 1의 펩티드를 포함하는 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물을 제공하며, 상기 생리활성 조절 물질은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
서열번호 1: SWGSLWSGIKNFG
본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 양전하 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 양전하 아미노산은 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 소수성 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 소수성 아미노산은 알라닌(Ala) 또는 페닐알라닌(Phe)이며, 보다 구체적으로 알라닌-페닐알라닌이 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단에 연결되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드 또는 상기와 같이 서열번호 1의 변형된 펩티드의 이량체를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드, 상기와 같이 서열번호 1의 변형된 펩티드, 또는 이들의 이량체 및 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)를 포함하는 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)는 (i) 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions), (ii) 전하성 부위(chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위(bioreducible portion)를 포함하는 폴리머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions)는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (a) (i) 서열번호 1의 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드, 상기 펩티드 또는 이들의 이량체, 및 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer), 리포솜, 나오좀, 및 나노물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질, (ii) 바이러스 DNA 또는 바이러스를 포함하는 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 생체적합성 폴리머 등은 예를 들어 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
i. 폴리머
비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산 (Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.
ii. 리포좀 및 니오좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호 작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
한편, 리포좀이 인지질을 이용하여 만들어 지는 반면, 니오좀(niosome)은 비-이온성 계면활성제(nonionic surfactant) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있어, 인지질 등에 의한 지질 미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하다는 이점이 있다. 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.
iii. 나노물질
본 명세서 상의 용어 나노물질은 수 내지 수백 나노미터의 크기를 갖는 생체 적합성 고분자 물질을 의미하는 것으로서, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(poly-lactide, PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide, PGA), 폴리락티드코글리콜 리드(poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolactone, PCL), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(chitosan), 또는 혈청 알부민이 이에 해당할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체를 유효성분으로 이용하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 “바이러스의 DNA"는 바이러스 지놈 DNA 전체인 것, 바이러스 지놈 DNA의 일부가 결실된 것 또는 바이러스 지놈 DNA의 일부가 변형된 것을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따른면, 상기 바이러스 DNA가 아데노바이러스 DNA인 경우 (Ad pDNA-폴리머-dimeric peptide 복합체), 상기 Ad pDNA: 폴리머의 중량비는 1:1 ~ 1: 1000일 수 있고, 상기 Ad pDNA와 dimer peptide의 중량비는 1: 0.001 ~ 1:1000일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 바이러스는 어떠한 바이러스도 포함하며, 구체적으로 유전자 치료제로 이용되는 바이러스를 포함한다. 예를 들어 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
ⅰ. 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 cis-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 한편, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 구체적으로 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되며, 보다 구체적으로 결실된 E1 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 적합한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다.
아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다.
ⅱ. 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열이 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표된 바 있다. Kasahara et al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스(MMLV)의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
ⅲ. AAV 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템에 사용될 수 있다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941호 및 제 4,797,368호에 상세하게 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al., J. Virol ., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol ., 65:2936-2945( 1991))를 동시에 형질전환시켜 제조된다.
ⅳ. 기타 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 리오바이러스, 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 셈리키 포리스터 바이러스로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
한편, 본 발명에서 이용되는 바이러스의 외래 유전자 서열은 암세포의 사멸을 유도하고 궁극적으로 종양을 퇴화시키는 암 치료 유전자로서, 종양 억제 유전자, 면역 조절 유전자[예: 사이토카인 유전자, 케모카인 유전자 및 조자극 인자(costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)], 항원성 유전자, 자살 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
자살 유전자는 세포가 외부 인자에 의해 살상되기 쉽도록 유도하는 물질을 발현하거나 세포에 독성 조건을 유발하는 핵산 서열이다. 이러한 자살 유전자로 잘 알려진 것은 티미딘 키나제(TK) 유전자이다(미국특허 제5,631,236호 및 제5,601,818호). TK 유전자 산물을 발현하는 세포는 간사이클로비르(gancyclovir)의 투여에 의해 선택적인 사멸에 민감하다. 종양 억제 유전자는 종양의 형성을 억제하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 가리킨다. 종양 억제 유전자는 포유동물에서 자연발생 유전자이며, 이 유전자의 결실 또는 불활성화는 종양 발생에 필수 전제인 것으로 믿어지고 있다. 종양 억제 유전자의 예로는 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2, 망막아세포종 유전자(Lee et al. Nature, 329:642(1987)), 선종양 폴립증 장 단백질(adenomatous polyposis coli protein; 미국특허 제 5,783,666 호), 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자(Cheng et al. Proc. Nat .Acad. Sci., 95:3042-3047(1998)), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16 및 p21을 포함한 종양 억제 유전자의 INK4 계열의 일원 및 이의 치료학적으로 유효한 단편(예, p56Rb, p94Rb 등)이 포함된다. 당업자는 상기 예시된 유전자 외에 기타 알려진 항종양 유전자 모두가 본 발명에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 용어, "항원성 유전자 (antigenic gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 및 PSA(prostate specific antigen), AFP(α-feto protein), p53(WO 94/02167)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제 I 형 항원에 결합시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어, "세포독성 유전자(cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자(WO 97/16459 및 WO 96/30385) 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 항종양 효과를 돕기위한 수단으로서, 본 발명의 아데노바이러스에 의해 운반될 수 있다. 예를 들면, 사이토카인(예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨(예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자(예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹(단핵구 화학 주성단백질 1(MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2(MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3(MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4(MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β(MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ(MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α(MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인(ELC), 대식구 염증성 단백질 4(MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5(MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론(p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인(TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테롤 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS와 같은 바이러스, 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.
본 명세서에서 용어, "친-세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF-, TRAIL, p53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어, "항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 1998, 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.
또한, 본 발명자들에 의해 아데노바이러스 유전자 치료에 적합한 것으로 규명된 릴랙신 유전자 또는 데코린 유전자도 유전자 전달체에 의해 세포내로 운반될 수 있는 유전자이다.
상술한 목적의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 또는 EMBL과 같은 DNA 서열 데이터뱅크로부터 입수할 수 있다.
상술한 본 발명의 펩티드-바이러스 DNA(또는 바이러스) 복합체 또는 펩티드-폴리머-바이러스 DNA(또는 바이러스) 복합체는 다양한 질환의 치료에 이용될 수 있지만, 특히 항암 치료에 유용할 수 있다.
본 명세서에서 "암"은 유방암, 비소세포성 폐암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 방광암, 후두암, 골육종, 갑상선암, 뇌암, 결장암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 부신암, 음경암, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 수뇨관암, 신장골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 비인두암, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 암 세포 형성의 예방; (ⅱ) 암 세포의 제거에 따른 암과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 암 세포의 제거에 따른 암과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강 내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 105-1 × 1015 pfu/㎖의 폴리머-바이러스 복합체를 포함하며, 통상적으로 1 × 1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면 서열번호 1의 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드를 포함하는 조성물을 이용하여 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 펩티드 또는 이의 변형된 펩티드 및 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)를 포함하는 조성물을 이용하여 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "생리활성 조절 물질"은 생물학적 활성을 갖는 생리기능 조절물질을 의미하며, 본 발명의 목적 상, 생리기능의 불균형 또는 이상에 의해 야기되는 모든 질환의 치료에 적용될 수 있는 물질로서, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 (Chemical compound, Chemotherapeutics) 또는 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 상술한 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체를 이용하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 조성물을 제공한다.
(b) 또한, 본 발명은 상기 조성물 및 바이러스 DNA 또는 바이러스를 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
(c) 또한, 본 발명은 생리활성 조절 물질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다.
(d) 본 발명의 펩티드 또는 펩티드-폴리머 복합체는 기존의 방법에 비해 높은 세포 내 전달효율을 나타내므로 다양한 치료제의 세포 내 전달을 위한 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상효능을 보여주는 개요도이다.
도 2는 아데노바이러스 플라스미드 DNA-폴리머를 이용한 전신 투여법을 아데노바이러스 자체를 이용한 투여법과 비교한 개요도이다.
도 3은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-폴리머-VI-9R)의 DNA 농축(condensation) 조건을 확인한 결과이다.
도 4는 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PPCBA-VI-9R)의 세포 내 유전자 전달효율 비교한 사진이다.
도 5는 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad DNA-폴리머-VI-9R)의 바이러스 증식능을 분석한 도표이다.
도 6은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-폴리머-VI-9R)의 세포흡수 효율을 분석한 도표이다.
도 7은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R)의 엔도좀 탈출을 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 변형된 펩티드들의 서열을 정리한 도표이다.
도 9는 pH 변화에 따른 펩티드의 표면전하 비교한 도표이다.
도 10은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PPCBA-R-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율 비교한 사진이다.
도 11은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율 비교 검증한 결과이다.
도 12는 다양한 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체의 세포흡수 효율을 비교분석한 도표이다.
도 13은 다양한 종류의 변형된 펩티드와 Ad pDNA 복합체의 DNA 농축효율을 비교한 도표이다.
도 14는 다양한 종류의 변형된 펩티드에 의한 막 용해활성(membrane lytic activity)을 비교한 사진이다.
도 15는 다양한 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체의 핵내 위치화 효율 비교한 도표이다.
도 16은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-(PAM-ABP)-펩티드)의 효과를 검증한 것으로서, 도 16의 a는 바이러스 증식능을 확인한 결과; 도 16의 b는 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 17은 Ad DNA-폴리머-펩티드 복합체(Ad pDNA-(PAM-ABP)-펩티드)의 바이러스 증식능을 Q-PCR로 viral Paticle의 수를 측정하여 확인한 결과이다.
도 18은 Ad DNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체(Ad pDNA-(PAM-ABP)-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 19는 Ad DNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체(Ad pDNA-(PPCBA-PEI-Arg)-펩티드)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 20은 PC-3 세포주에서, Ad pDNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체의 효과를 확인한 것으로서, 도 20의 a는 바이러스 증식능을 확인한 결과; 도 20의 b는 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 21은 HapT1 세포주에서, Ad pDNA-폴리머-이량체 펩티드 복합체의 효과를 확인한 것으로서, 도 21의 a는 바이러스 증식능을 확인한 결과; 도 21의 b는 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 22는 A549 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 23은 MCF-7 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 24는 H460 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 25는 U343 세포주에서, 아데노바이러스/펩티드 복합체(Ad/펩티드 복합체)의 세포 내 유전자 전달효율을 확인한 결과이다.
도 26은 화학물질/펩티드 복합체의 세포흡수 효율을 비교 분석한 결과이다.
도 27은 화학물질/펩티드 복합체 (MG123/펩티드 복합체)의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 28은 화학물질/펩티드 복합체 (DOX/펩티드 복합체)의 암세포 살상능을 확인한 결과이다.
도 29는 단백질 (Human serum albumin)/Peptide 복합체의 세포흡수 효율을 확인한 것으로서, 도 29의 a는 50nM의 단백질을 이용한 경우, 도 29의 b는 0.5M의 단백질을 이용한 경우이다.
도 30은 항체/펩티드 복합체 (Antibody(Rabbit polyclonal to TGF beta 1)/ 펩티드 복합체)의 세포 내 전달효율을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 통상의 기술자에 있어 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 펩티드 및 폴리머 복합체의 물리적 특성 분성
아데노바이러스 단백질 VI에서 유래한 13개의 아미노산으로 구성된 펩티드(서열번호 1)의 C-말단에 9개의 아르기닌 아미노산을 연결시킨 펩티드(VI-9R) 및 폴리머를 이용하여 아데노바이러스 DNA의 세포 내로의 전달효율을 향상시키고자 하였다. 이를 위해, 우선 아데노바이러스 DNA를 PBS 버퍼에 넣고, 여기에 중량 비율을 계산하여 펩타이드를 넣은 뒤, 상온에서 10분간 반응시켰으며, 이후 다양한 중량 비율로 폴리머를 다시 첨가하고 상온에서 15분간 반응시켜 Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체를 제조하였다. 폴리머로서 arginine-grafted bio-reducible poly(CBA-DAH) polymer (ABP)와 polyamidoamine (PAMAM) dendrimer가 결합된, PAM-ABP를 사용하였으며, 구조는 하기 나타낸 바와 같다 (Journal of Controlled Release, Vol 160 592-600 2012).
Figure pat00001
이후, DNA가 펩티드-폴리머 복합체가 Ad pDNA와 결합하여 복합체를 형성하는 조건을 찾고자 하였다. 아데노바이러스 플라스미드 DNA(Ad pDNA)와 VI-9R의 중량비율을 1:10으로 고정하여 반응시킨 다음, 폴리머와의 중량비율을 1:1, 1:5, 1:10, 1:15 및 1:20으로 조절하여 Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체의 결합정도를 확인하였다. Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체형성의 최적 조건을 결정하고 물리적 특성을 분석하기 위하여 gel retardation assay를 실시하였다.
분석결과, DNA:폴리머의 중량비가 1:1일 때부터 아데노바이러스 DNA가 폴리머-펩티드 복합체로 탑재되어 DNA 농축이 충분히 일어난 것을 확인할 수 있었다(도 4). 따라서 VI-9R을 폴리머와 함께 사용하는 경우, 적은양의 폴리머로도 아데노바이러스 DNA가 폴리머-펩티드 복합체 내로 충분히 탑재될 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2: Ad pDNA - 폴리머 -VI-9R 복합체의 세포 내 유전자 전달효율 확인
실시예 2에서는 폴리머로서, 생분해성과 pH 민감성을 갖는 폴리머로 PPCBA (mPEG-b-Pip-CBA)를 사용하였으며, 구조는 하기 나타낸 바와 같다 (Biomaterials, Vol41 53-68 2015).
Figure pat00002
Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여, 우선, GFP를 발현하는 복제 불능 아데노바이러스의 플라스미드 DNA(pdE1/GFP)를 이용하여 아데노바이러스 DNA를 PBS 버퍼에 넣고 중량 비율을 계산하여 동일한 튜브에 펩타이드를 넣고 상온에서 10분간 반응시켰다 이후, 상기 폴리머를 첨가시킨 뒤 상온에서 15분간 반응시켜 Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체를 제조하였다. pdE1/GFP-PPCBA 및 pdE1/GFP-PPCBA-VI-9R 복합체를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주된 293A 세포주를 처리하고 72시간 후에 형광 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
관찰결과, pdE1/GFP-PPCBA의 경우, GFP의 발현이 전혀 관찰되지 않았지만, pdE1/GFP-PPCBA-VI-9R 복합체를 세포에 처리한 경우, 현저하게 증가한 GFP의 발현을 관찰할 수 있었다(도 4). 상기 결과를 통하여 폴리머와 VI-9R을 결합한 형태의 pdE1/GFP-PPCBA-VI-9R 복합체는 바이러스 DNA와 폴리머만이 결합된 복합체(pdE1/GFP-PPPCBA)의 한계인 낮은 유전자 전달효율을 극복하고 세포 내로의 유전자 전달효율을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3: Ad pDNA-폴리머-VI-9R 복합체의 바이러스 증식능 확인
실시예 3에서는 폴리머로 PPCBA를, 아데노바이러스 DNA로 GFP를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 RdB/GFP의 viral DNA인 Ad pDNA (RdB/GFP)를 사용하였다. Ad pDNA(RdB/GFP)-PPCBA-VI-9R 복합체의 바이러스 증식능을 확인하기 위하여 A549 세포주를 12 well 플레이트에 분주하고, 24시간 후에 naked Ad pDNA, Ad pDNA-PEI 25K 복합체 및 Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 72시간 후에 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자(particle)수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다.
분석결과, naked Ad pDNA만을 처리한 경우 바이러스 생산량은 기초 수준(9.2 X 103 VP)을 나타낸 반면, Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체를 처리한 경우에는, naked Ad pDNA를 처리한 경우보다 596배 더 증가된 바이러스 생산량(5.5 X 106 VP)을 확인하였다(도 5). 이는 양성 대조군인 Ad pDNA-PEI 25K 복합체를 처리한 경우(1.2 X 106 VP)에 비해서도 4.6배 증가된 것이었다. 이러한 결과는 Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체의 경우 암세포 내에서 바이러스 증식이 매우 성공적으로 이루어지며, 이후 증식된 아데노바이러스가 연쇄적으로 종양세포에서 증식되는 특성으로 인해 바이러스의 생산량이 매우 크게 증가할 가능성을 보여주는 결과이다.
실시예 4: Ad pDNA - 폴리머 -VI-9R 복합체에 의한 Ad pDNA의 cellular Uptake 효율 확인
실시예 4에서는 폴리머로 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA(dE1/GFP)-PAM-ABP-VI-9R 복합체에 의해 증가된 Ad pDNA의 세포 흡수효율을 확인하기 위하여 293A 세포주를 12 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후에 FITC로 표지된 Ad 플라스미드 DNA(FITC-pDNA)를 이용한 Ad pDNA-PEI, Ad pDNA-PAM-ABP 및 Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체를 세포에 처리하였다. 2시간 후 FACS를 이용하여 세포내로 흡수된 FITC 표지-pDNA의 양을 비교하였다.
분석결과, FITC로 표지된 Ad pDNA를 PEI, PAM-ABP 및 PAM-ABP/VI-9R (pDNA:VI-9R 1:5 또는 1:10 중량비)와 반응시켜 형성된 복합체를 세포에 트랜스펙션하고 2시간 후에 FACS를 실시하였다. 분석결과, PAM-ABP를 사용한 경우, 양성 대조군으로 사용한 Ad pDNA-PEI에 비해서 현저하게 증가되었다. 특히, Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체의 경우, 폴리머만을 이용한 PAM-ABP보다 각각 1.2 내지 1.4배 향상된 세포흡수율을 나타내었다(도 6). 이러한 결과는 VI-9R이 pDNA 및 PAM-ABP와 결함하여 세포투과성을 높여주었기 때문에 Ad pDNA-PAM-ABP/VI-9R 복합체의 세포흡수효율이 향상된 것으로 보인다.
실시예 5: Ad pDNA - 폴리머 -VI-9R 복합체의 암세포 내 엔도좀 탈출( endosome escape) 효과
실시예 5에서는 폴리머로 PAM-ABP를, 아데노바이러스 DNA로 pdE1-GFP 사용하였다. 세포 내로 전달된 생물학적 제제의 엔도좀 격리현상(endosomal sequestration)은 유전자 전달효율 향상의 중요한 장애물로 작용한다. 한편, 아민, 술폰아마이드 또는 카르복실산 등을 지닌 고분자 물질은 엔도좀 막(endosome membrane)을 파괴하여 세포 내로 전달된 생물학적 제제를 엔도좀에서 탈출시키는 기능을 나타내며, 결과적으로 비바이러스성 유전자 전달효율 및 화학 약물의 핵 내로의 전달효율을 증가시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 실시예 5에서는 VI-9R에 의한 viral DNA의 엔도좀 탈출(endosome escape) 효과를 검증하기 위하여, 세포의 형광 염색을 실시하였다. HEK293(1 × 105 cells) 세포주를 커버슬라이드가 들어 있는 6 well에 분주하고 24시간 후에 핵과 엔도좀을 각각 DAPI와 lysotracker로 염색하였다. 이후 GFP를 발현하는 아데노바이러스의 DNA(pdE1-GFP)와 PAM-ABP 또는 PAM-ABP-VI-9R 복합체와의 결합물인 Ad pDNA-PAM-ABP, 또는 Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R을 각각 2 ㎍/㎖mL의 농도로 처리하고, 4시간 후에 4% 포름알데히드 용액으로 고정하여 공초점현미경으로 엔도좀 탈출효과를 관찰하였다.
관찰결과(도 7), Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 세포의 경우 lysotracker와 GFP가 중첩되어 있었는데, 이는 Ad pDNA-PAM-ABP를 단독으로 viral DNA와 결합하여 처리하였을 때 viral DNA의 엔도좀으로부터 탈출효율이 낮다는 것을 의미한다. 반면, Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체를 처리한 경우 GFP와 lysotracker의 형광이 겹쳐지지 않았을 뿐만 아니라 바이러스(GFP)가 핵 내로 이동한 것이 관찰되었는데, 이는 Ad pDNA-PAM-ABP-VI-9R 복합체가 viral DNA의 엔도좀 탈출효율을 향상시켰다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 Ad pDNA-PAM-ABP를 단독으로 사용한 경우 낮은 엔도좀 탈출효과 및 이에 따른 유전자 전달효율의 저하라는 한계가 폴리머-VI-9R 복합체의 사용에 의해 극복될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 6: Ad Protein VI 유래 펩티드의 변형 및 이들의 물리적 특성
상기 실시예에서 확인된 VI-9R의 유전자 전달효율을 보다 개선하기 위하여, 아데노바이러스 단백질 VI 유래 펩티드(서열번호 1)를 다양한 형태로 변형시켰다(도 8). 즉, 펩티드의 N-말단에 소수성 아미노산을 추가하거나 기존에 알려져 있는 세포투과 펩티드(CPP)인 TAT을 추가로 연결시켰다. 변형된 펩티드들의 물리적 특성을 분석하고자 각각의 펩티드를 10 ㎍/㎖ 씩 총 1 ㎖ 부피의 큐벳에 넣고 Zeta-sizer를 이용하여 pH 7.4 PBS 및 pH 6.4 PBS에 용해된 펩티드들의 표면전하 값을 측정하였다.
Zeta potential 분석 결과(도 9), VI-9R의 경우 pH 7.4의 환경에서 16.6 ± 0.41 mV 의 음전하를 띠고 있었으며, VI-9R 펩티드의 경우 R 서열의 추가로 4.87 ± 0.42 mV의 양전하를 띠고 있었다. 변형된 VI(mVI)의 경우 VI 펩티드와 비교했을 때 표면전하가 양전하로 바뀌었다. 또한, 양극성 아미노산인 글루탐산(E, Glutamic acid)을 추가한 mVI-TAT-A 또는 mVI-A-TAT의 경우 pH가 낮아짐에 따라 표면전하가 증가하였다.
실시예 7: Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율
실시예 7에서는 폴리머로 PPCBA 및 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA(dE1/GFP)-PPCBA-펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여 293A 세포주를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 변형된 6종류의 펩티드와 Ad pDNA-PPCBA-펩티드 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 대조군으로는 VI-9R, NLS, TAT 및 protamine을 사용하였으며 복합체를 처리하고 24시간 후, 형광 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
분석결과, Ad pDNA-PPCBA-VI-9R 복합체를 처리한 경우, Ad pDNA 또는 Ad pDNA-PPCTBA를 처리한 경우에 비하여 GFP의 발현이 현저하게 증가하였다. 또한, 변형된 6종류의 펩티드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 또는 mVI-G-A-TAT를 Ad pDNA-PPCTBA과 복합체를 형성하여 처리한 경우, VI-9R을 변형하지 않은 경우에 비해 GFP의 발현이 증가하였다(도 10).
또 다른 폴리머인 PAM-ABP를 이용한 Ad pDNA(dE1/GFP)-PAM-ABP-펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여 293A 세포주를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후에 변형된 6종류의 펩티드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI-G-A-TAT를 이용한 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 대조군으로 Ad pDNA-PAM-ABP/TAT와 Ad pDNA/PEI25K를 사용하였으며 복합체를 처리하고 4일 후, 형광 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다.
분석결과, Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 처리한 경우 Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 경우보다 유전자 전달효율 증가하였다(도 11). 특히, 양성대조군인 Ad pDNA-PAM-ABP/TAT를 처리한 경우에 비해서도 변형된 6종류의 펩티드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 PAM-ABP와 결합시킨 형태의 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 처리한 경우에 유전자 전달효율이 현저하게 증가하였다. 이와 같은 결과는 변형된 펩티드가 Ad pDNA-PPCBA-펩티드 복합체의 유전자 전달효율을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 8: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체에 의한 Ad pDNA의 세포흡수 효율증가
실시예 7에서는 폴리머로 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체의 세포 흡수효율을 확인하기 위하여 A549 폐암 세포주를 12 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후에 FITC가 표지된 Ad pDNA(dEl/GFP)와 PAM-ABP-VI-9R 또는 다양한 종류의 PAM-ABP-변형된 펩티드 복합체(mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT)를 처리하였다. 대조군으로 Ad pDNA-PAM-ABP-NLS 및 Ad pDNA-PAM-ABP-TAT을 사용하였으며 복합체를 처리하고 30분 후에 FACS를 이용하여 세포 내로 흡수되 FITC-pDNA의 양을 비교, 분석하였다.
VI-9R 및 6종류의 변형된 펩티드(mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT)로 형성된 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체의 세포 흡수율은 대조군인 Ad pDNA-PAM-ABP에 비해 각각 2.4, 2.6, 2.5, 2.0, 2.1, 1.6 및 2.1배 증가하였다(도 12). 특히, 또 다른 양성 대조군인 Ad pDNA-PAM-ABP/NLS 및 Ad pDNA-PAM-ABP/TAT에 비해서도 현저히 증가된 세포흡수율을 나타내었다.
실시예 9: Ad pDNA-펩티드 복합체에 의한 DNA 농축효율 분석
Ad pDNA-펩티드 복합체의 DNA 농축효율 확인하기 위하여, 피코그린 염색(picogreen staining)을 통한 DNA 농축효율을 확인하였다. DNA에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있는 피코그린 시약(100 ㎕)을 다양한 형태의 Ad pDNA-펩티드 복합체(1 ㎍)와 반응시킨 다음, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 형광발현 정도를 확인하고 농축되는 효율을 확인하였다. DNA 농축이 잘 되었을 수록 형광발현 정도가 약하게 나타난다.
분석결과, Ad pDNA-VI의 경우, DNA 농축이 거의 되지 않았으며, 변형된 펩티드 중, mVI-TAT, mVI-TAT-A 및 mVI-A-TAT의 경우 DNA 농축이 유도되었지만, mVI, mVI-G-TAT-A 및 mVI-G-A-TAT의 경우 DNA 농축이 유도되지 않는 것을 확인하였다 (도 13).
실시예 10: 펩티드에 의해 향상된 막 용해 활성
엔도좀 탈출(endosomal escape)는 엔도좀 내에서 막(membrane)을 용해하여 DNA가 탈출하는 현상이므로, Ad-폴리머-펩티드 복합체에 의해 막을 용해시키는 정도를 확인하고자 PI 염색을 실시하였다. 사용한 펩티드들은 50nM로 동일하게 30분간 37℃ 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 100 ㎍의 PI를 10분간 37℃에서 반응시킨 다음 배지교체 후, 형광 현미경으로 결과를 확인하였다. 막의 용해 정도가 높을수록 형광발현 정도가 증가하게 된다.
분석결과, 양성 대조군으로 사용한 펩티드인 TAT을 처리한 경우, 막의 용해가 거의 일어나지 않은 반면, 펩티드(VI-9R, mVI-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT)을 처리한 경우, 막 용해효율이 현저하게 향상된 것을 확인하였다(도 14). 이를 통하여 변형된 펩티드는 향상된 엔도좀 탈출효과를 나타낼 것이라고 기대할 수 있었다.
실시예 11: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체에 의해 증가된 핵 내 위치화 (nuclear localization)
실시예 11에서는 폴리머로 PAM-ABP를 사용하였다. Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체에 의해 향상된 핵 내 위치화를 비교하기 위하여, A549 세포주를 24 well에 분주하였다. Ad DNA에 FITC를 표지한 후, 이를 이용하여 Ad pDNA-PAM-ABP 복합체 및 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드(mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI-G-A-TAT, VI, VI-9R, TAT 및 NLS) 복합체를 만든 후, 이를 세포 분주 24시간 후에 각각 처리하였다. Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 처리하고 4시간 후에 세포질과 핵을 Nuclear/Cytosolic Fractionation Kit(Cell Biolabs, San Diego, CA)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 Ex/Em = 495/519 nm에서 측정하였다. 각 그룹의 세포질과 핵의 평균값의 합을 100%로 환산하여 상대 비교하였다.
분석결과, Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 경우와 비교하여 Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체를 이용한 모든 경우, Ad pDNA의 핵 내 위치화가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한, 이는 양성대조군(Ad pDNA-PAM-ABP-NLS 또는 Ad pDNA-PAM-ABP-TAT 복합체)과 비교한 경우에도 핵 내 위치화 비율이 증가한 것이었다(도 15). 이러한 결과를 통해, Ad pDNA-PAM-ABP-펩티드 복합체의 경우 펩티드의 변형을 통해 Ad DNA의 핵 내 위치화를 증가시킬 수 있으며 결과적으로 아데노 바이러스의 복제를 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 12: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체의 바이러스 증식능 및 암세포 살상능 확인
본 실시예에서는, Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체의 아데노바이러스 증식능 및 암세포 살상능을 확인하기 위하여, 폴리머 PAM-ABP와 아데노바이러스 DNA로 Decorin(DCN)과 shcMet을 발현하는 종양선택적 살상 아데노바이러스인 H-Rd19-k35/DCN/shcMet의 viral DNA를 포함하는 Ad pDNA를 사용하여 복합체를 제작하였다. 인체 자궁암 세포주인 Hela 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후, naked Ad pDNA, Ad pDNA/PAM-ABP, 6종류의 peptide mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 각각 Ad pDNA/PAM-ABP와 결합시킨 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체 및 대조군인 VI-9R, TAT peptide와의 복합체를 각각 상기 세포에 처리하였다. 또한 세포 독성여부를 검증하기 위하여, PAM-ABP 혹은 peptide 만을 단독으로 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였으며. 암세포 살상능을 검증하기 위하여 상층액을 제거한 plate에 PBS 내의 2 mg/ml의 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma Aldrich) 200 μL를 각 웰에 첨가시켰고, 37℃에서 4시간동안 배양시켰다. 그 후, 상청액을 제거하였고, 침전물을 1.0 ml 디메틸설폭사이드에 용해시킨 뒤, 플레이트를 마이크로플레이트 리더 상에서 540 nm의 흡광도에서에서 판독하였으며. 처리하지 않은 세포군을 음성 대조군으로 분류하였다.
분석 결과, Hela 세포주에서 naked Ad pDNA만을 처리한 경우, 바이러스 생산량은 기초 수준으로 1.5 X 103 VP 나타내었고, 6 종류의 peptide로 형성된 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체의 바이러스 생산량은 대조군인 Ad pDNA/PAM-ABP에 비해 mVI-G-TAT-A를 사용한 복합체를 제외하고, 각각 8.0, 11.6, 34.1, 29.5 및 25.6배 가량 증가하였으며, 특히, 다른 대조군인 VI-9R 혹은 TAT에 비해서도 현저히 증가된 바이러스 생산능을 확인할 수 있었다 (도 16a). 또한, 암세포 살상능과 세포 독성을 확인하기 위해 상층액을 제거한 각 plate에 MTT 용액을 처리한 결과, VI-9R peptide에서 높은 세포독성이 보였으나, mVI, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI- G-A-TAT 에서는 상대적으로 높은 세포독성을 보이지 않았으며, 암세포 살상능을 확인한 결과, 6종류의 peptide로 형성된 Ad pDNA-(PAM-ABP)-peptide 복합체의 바이러스 생산량은 대조군인 Ad pDNA/PAM-ABP에 비해 각각 22.5, 18.7, 29.5, 7.1, 21.7, 26.5% 증가된 암세포 살상능을 확인하였다 (도 16b). 특히, 상기 결과에서 VI-9R을 이용한 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체에서 가장 높은 암세포 살상능을 보인 점은, VI-9R 자체의 독성에 의한 암세포 사멸 유도 효과인 것으로 유추해 볼 수 있다.
상기 결과로부터, Ad pDNA-(PAM-ABP)-peptide 복합체의 경우, 암세포 내에서 바이러스 증식이 매우 성공적으로 이루어지며, 종양세포에서 증식된 아데노바이러스는 연쇄적으로 암세포 특이적 살상능으로 이어져서 바이러스 증식능과 암세포 살상능이 크게 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 13: Ad pDNA - 폴리머 -펩티드 복합체의 바이러스 증식능 및 암세포 살상능 검증
본 실시예에서는, Ad pDNA-폴리머-펩티드 복합체의 아데노바이러스 증식능을 검증하고자 폴리머 PAM-ABP와 아데노바이러스 DNA로 Green Fluorescent Protein (GFP)을 발현하는 종양선택적 아데노바이러스인 RdB/GFP의 viral DNA를 포함하는 Ad pDNA를 사용하여 복합체를 제작하였다. 인체 폐암 세포주인 A549 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후에 naked Ad pDNA, Ad pDNA/PAM-ABP, 6종류의 peptide mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 각각 Ad pDNA-(PAM-ABP)와 결합시킨 Ad pDNA/PAM-ABP/peptide 복합체 및 대조군인 VI-9R, TAT peptide와의 복합체를 각각 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다.
분석 결과, A549 세포주에서 naked Ad pDNA만을 처리한 경우, 바이러스 생산량은 기초 수준으로 1.2 X 103 VP 나타내었고, 6 종류의 peptide로 형성된 Ad pDNA-(PAM-ABP)-peptide 복합체의 바이러스 생산량은 대조군인 Ad pDNA/PAM-ABP에 비해 mVI, mVI-G-TAT-A를 사용한 복합체를 제외하고 각각 1.95, 2.01, 1.03 및 10.7 배 가량 증가하였으며, 특히, 다른 대조군인 VI-9R 혹은 TAT에 비해서도 현저히 증가된 바이러스 생산능을 확인할 수 있었다 (도 17).
실시예 14: Ad pDNA - 폴리머 - 이량체 펩티드 복합체에 의해 증가된 세포내 유전자 전달효율 확인
본 실시예에서는, Ad pDNA(dE1/GFP)-(PAM-ABP)-dimeric peptide 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하기 위하여, 293A 세포주를 24 well plate에 60-70%로 분주하고 변형된 monomer peptide, dimeric peptide와 Ad pDNA-(PAM-ABP)-dimeric peptide 복합체를 각각 세포에 처리하고, 처리 48시간 후, 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 관찰하였다.
한편, Dimeric peptide는 air oxidation 기법을 이용하여 제작하였다. 구체적으로, 2 mg의 monomer peptide를 0.1 M deaerated ammonium bicarbonate 2 mL에 녹인 후, 혼합물을 24시간 동안 상온에서 뚜겅이 열린 조건으로 교반시켜 dimeric peptide를 제작하였다. 이후, dialysis castte을 이용하여 monomer peptide를 분리하고 남은 반응물은 freeze-dry를 통해서 power를 얻어서 사용하였다. 대조군으로는 TAT, 변형 전 펩타이드(mVI-G-A-TAT)를 사용하여 만든 복합체, PEI25k, PAM-ABP polymer와 Ad pDNA만을 결합시킨 복합체를 이용하였다.
또한, 다른 폴리머인 PPCBA-PEI-Arg를 이용한 Ad pDNA(RdB/GFP)-(PPCBA-PEI-Arg)-peptide 복합체의 세포 내 유전자 전달효율을 확인하였으며, 이를 위하여, 293A 세포주를 24 well plate에 60-70%로 분주하고 24 시간 후에 변형된 dimeric peptide를 이용해 Ad pDNA-(PPCBA-PEI-Arg)-dimeric peptide를 1:20, 1:30 (Ad pDNA : PPCBA-PEI-Arg weight ratio)로 결합시킨 뒤 각각 세포에 처리하고, 처리 4일 후, 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 관찰하였다. 대조군으로 Ad pDNA/PEI25K, Ad pDNA/Lipofectamine를 이용하였다.
분석결과, Ad pDNA-Polymer-dimeric peptide 복합체를 처리한 경우, Ad pDNA-PEI 25k, Ad pDNA-PAM-ABP를 처리한 경우에 비해, GFP의 발현이 현저하게 증가하였다. 또한, mVI-G-A-TAT peptide를 변형한 경우, 변형하지 않은 경우와 GFP 발현은 유사하였으나, 변형된 monomer peptide를 dimeric peptide로 만들어 Ad pDNA-Polymer-peptide 복합체를 처리한 경우, 대조군에 비해 GFP의 발현이 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 18)
또한, 처리된 Ad pDNA-(PPCBA-PEI-Arg)-dimeric peptide 복합체가 1:30:1의 Ad pDNA : Polymer : peptide 중량비로 이루어진 경우, 대조군인 Ad pDNA-PEI25K, Ad pDNA-Lipofectamine를 처리한 경우에 비해, GFP의 발현이 현저하게 증가하였고, 일반적으로 Ad pDNA : Polymer의 중량비가 30:1인 경우, 상기의 중량비가 20:1인 경우에 비해 그 효과가 우수하였으며, 결합하는 dimeric peptide의 양이 늘어날수록 농도 의존적으로 GFP의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 19). 즉, 상기의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드를 dimeric 형태로 변형시킴으로써, 세포내 전달효율을 보다 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 15: Ad pDNA - 폴리머 - 이량체 펩티드 복합체의 바이러스 증식능 및 암세포 살상능 확인
본 실시예에서는, Ad pDNA-폴리머-dimeric peptide 복합체의 아데노바이러스 증식능을 확인하기 위하여, 폴리머 PPCBA-PEI-Arg(PPR)와 아데노바이러스 DNA로 IL-12와 GMCSF를 발현하는 종양선택적 살상 아데노바이러스인 RdB/IL-12/GMCSF의 viral DNA를 포함하는 Ad pDNA를 사용하여 복합체를 제작하였다. 인체 전립선암 세포주인 PC-3 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후, naked Ad pDNA, PPCBA-PEI-Arg(PPR), dimeric peptide, Ad pDNA-Lipofectamine, Ad pDNA-PPR, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide (1:30:0.01, 1:30:0.05 [Ad pDNA:Polymer: peptide 중량비])로 복합체를 준비하고 각각 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다. 또한 햄스터종 췌장암 세포주인 HapT1 세포주를 12 well plate에 분주하고, 24시간 후에 naked Ad pDNA, PPCBA-PEI-Arg(PPR), dimeric peptide, Ad pDNA-Lipofectamine, Ad pDNA-PPR, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide (1:30:0.01, 1:30:0.05 [Ad pDNA:Polymer: peptide 중량비])로 복합체를 준비하고 각각 세포에 처리하였다. 처리 4일 후, 상기 배양액을 수집하여 아데노바이러스의 입자 (Particle) 수를 Q-PCR을 이용하여 확인하였다.
아울러, 암세포 살상능을 검증하기 위하여 상층액을 제거한 plate에 PBS 내의 2 mg/ml의 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT; Sigma Aldrich) 200 μL를 각 웰에 첨가시켰고, 37℃에서 4시간동안 배양시켰다. 그 후, 상청액을 제거하였고, 침전물을 1.0 ml 디메틸설폭사이드에 용해시킨 뒤, 플레이트를 마이크로플레이트 리더 상에서 540 nm의 흡광도에서에서 판독하였으며. 처리하지 않은 세포군을 음성 대조군으로 분류하였다.
분석 결과, PC-3 세포주에서 naked Ad pDNA만을 처리한 경우, 바이러스 생산량은 기초 수준으로 4.6 X 103 VP 나타내었다. Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우, 가장 높은 바이러스 생산량 (9.3X 107 VP)을 보였으며, 대조군인 Ad pDNA-PPR를 처리한 경우 (2.4 X 106 VP) 보다 7.3배 더 증가되었고, 양성 대조군인 Ad pDNA-Lipofectamine 복합체를 처리한 경우 (2.5X 107 VP)에 비해서도 3.7배 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 20a). 또한, HapT1 세포주에서는 naked Ad pDNA만을 처리한 경우 바이러스 생산량은 기초 수준으로 4.6 X 103 VP 나타내었다. 상기 결과와 마찬가지로, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우, 가장 높은 바이러스 생산량(6.5X 107 VP)을 보였으며, 대조군인 Ad pDNA/PPR를 처리한 경우(6.5 X 105 VP) 보다 99.4배 더 증가된 바이러스 생산량을 보였고, 양성 대조군인 Ad pDNA/Lipofectamine 복합체를 처리한 경우 (2.4 X 107 VP)에 비해서도 2.6배 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 21a)
또한, 암세포의 살상능을 검증하기 위해서 MTT assay를 진행한 결과, PC-3 세포주에서는 Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우 57.6%의 가장 뛰어난 암세포 살상능을 나타내었으며, 이는 대조군인 Ad pDNA-Lipofectamine 복합체 처리 그룹 혹은 Ad pDNA-PPR 그룹에 비해 암세포 사멸 효과가 각각 17.1%, 16.2%씩 증가된 결과였다 (도 20b). 또한 HapT-1 세포주에서도, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체를 처리한 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우, 57.3%의 가장 뛰어난 암세포 살상능을 나타내었으며, 이는 대조군인 Ad pDNA-Lipofectamine 복합체 처리 그룹 혹은 Ad pDNA-PPR 그룹에 비해 암세포 사멸 효과가 각각 4%, 10.5%씩 증가된 결과였다 (그림 도 21b).
상기 결과로부터, Ad pDN-/PPR-dimeric peptide를 처리 그룹 중 peptide와 Ad pDNA의 weight ratio가 1:0.01인 경우 가장 높은 아데노바이러스 증식능과 가장 큰 암세포 살상능을 나타냄을 알 수 있었으며, 이러한 결과는, Ad pDNA-PPR-dimeric peptide 복합체는 암세포 내에서 바이러스 증식이 매우 성공적으로 이루어지며, 종양세포에서 증식된 아데노바이러스는 연쇄적으로 암세포 특이적 살상능으로 이어져서 바이러스 증식능과 암세포 살상능이 크게 증가되는 것임을 시사하는 것이다.
실시예 16: 아데노바이러스/펩티드 복합체의 세포 내 유전자 전달효율 확인
본 실시예에서는, Adenovirus(dE1/GFP)-peptide 복합체의 세포 내 전달효율을 확인하기 위하여, 다양한 세포주 (A549, MCF, H460, U434)를 24 well 플레이트에 60-70%로 분주하고 24시간 후, 8종류의 펩티드 VI, VI-9R, mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT 및 mVI-G-A-TAT를 아데노바이러스(dE1/GFP)와 펩티드 1:1× 105, 1:1× 106, 1:1× 107 molar ratio로 결합시킨 다음, 세포에 각각 20 MOI로 처리하였으며, 처리 48시간 후, 형광 현미경을 통해 GFP의 발현을 관찰하였다. A549 세포주를 이용한 실험의 대조군으로 NLS, TAT 및 펩티드와 결합하지 않은 아데노바이러스 (Adenovirus only)를 이용하였으며, 이 밖의 세포주에 대한 대조군으로는 VI, VI-9R, NLS, TAT, 또는 peptide와 결합하지 않은 Adenovirus only 그룹을 이용하였다.
Adenovirus(dE1/GFP)/Peptide 복합체를 세포에 transduction 시키고 유전자 전달효율을 비교한 결과, Adenovirus only 그룹과 비교하였을 때에 Ad/peptide complex의 유전자 전달효율이 대부분 높게 나타났다 (도 22 내지 도 25). 특히, modified 6종류의 펩타이드 mVI, mVI-TAT, mVI-TAT-A, mVI-G-TAT-A, mVI-A-TAT, mVI-G-A-TAT를 Ad와 결합시켰을 때, Ad/peptide complex의 유전자 전달효율은 Ad/VI, Ad/VI-9R 그룹과 비교했을 때에 비해 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명의 펩티드는 아데노바이러스 DNA와 같은 핵산의 세포 내 전달효율을 증가시킬 뿐만 아니라 바이러스 자체의 세포 내 전달효율도 향상시킬 수 있으며, 이러한 경향은 peptide modification을 통해 보다 증진될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 17: 화학물질 /펩티드 복합체에 의해 증가된 cellular Uptake 효율 확인
본 실시예에서는, Chemotherapeutics/Peptide 복합체에 의한 증가된 cellular uptake을 확인하기 위하여, U343 또는 H460 세포주를 12 well plate에 70-80%로 분주하였다. 구체적으로, 물리적 결합 (DOX+mVI-G-A-Tat)의 경우, Chemotherapuetics인 Doxorubicin과 mVI-G-A-TAT peptide를 PBS 버퍼가 들어있는 튜브에 동시에 넣고 상온에 20분 보관하여 물리적 조건으로 반응시킨 후 복합체를 5μM 세포에 처리하였다. 또한 화학적 결합 (mVI-G-A-Tat conjugated DOX)의 경우에는 DMSO 버퍼 800 μL에 DOX (820 μg)와 가교제인 BMPH(N-β-maleimidopropionic acid hydrazide)를 1.1 당량으로 넣어서 섞어주었다. 해당 반응은 상온에서 24시간 동안 빛을 차단한 조건으로 실시하였으며, 이후, DOX:mVI-G-A-Tat peptide의 비율이 1:1 당량이 되도록 펩타이드 (4 mg) 를 넣어주고 상온에서 3 시간 반응시켰다. 마지막으로 3.5 kDa dialysis cassette를 이용하여 반응하지 않은 화학물을 제거한 뒤 동결건조 시켜 powder 형태로 만든 후 PBS에 녹여서 5μM의 복합체를 세포에 처리하였다. 처리 5분, 10분, 30분, 120분 후, 세포 내로 uptake된 Doxorubicin을 FACS를 수행하여 정량하였으며, 대조군으로 Chemotherapeutics를 단독으로 처리한 그룹을 시용하였다.
Chemotherapeutics/Peptide 복합체를 세포에 처리하고 cellular uptake를 확인한 결과, Chemotherapeutics를 단독으로 처리한 대조군과 비교하였을 때, Chemotherapeutics/peptide 복합체의 cellular uptake이 증가되었으며, 특히 Chemotherapeutics와 peptide를 물리적으로 결합시켰을 때, 초기 시간에 drug이 cell 내로 uptake되는 효율이 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 26).
이를 통하여, modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 chemotherapeutics를 함께 세포 내로 전달함으로써, 세포 내로 uptake되는 chemotherapeutics의 양을 증가시켜, 치료 효과를 보다 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 18: 화학물질/펩티드 복합체에 의해 증가된 암세포 살상 효과 확인
본 실시예에서는, Chemotherapeutics/Peptide 복합체에 의한 증가된 암세포 살상 효과를 확인하기 위하여, H460, A549 또는 U343 세포주를 96 well plate에 60-70%로 분주하고 24시간 후, Chemotherapuetics인 MG132 또는 Doxorubicin과 mVI-G-A-TAT peptide를 물리적 (mVI-G-A-Tat+MG132, DOX+mVI-G-A-Tat) 또는 화학적 (mVI-G-A-Tat conjugated MG123/DOX)으로 결합시켜 0.1-5μM 만큼 처리하였다. 처리 48시간 후, MTT assay를 수행하여 cell viability를 확인하였으며, 대조군으로는 mVI-G-A-TAT peptide, 그리고 MG132 또는 Doxorubicin을 단독으로 처리한 그룹을 이용하였다.
Chemotherapeutics/Peptide 복합체를 세포에 처리하고 암세포 살상 효과를 확인한 결과, Chemotherapeutics를 단독으로 처리한 대조군과 비교하였을 때에 Chemotherapeutics/peptide 복합체의 암세포 살상효과가 증가됨을 확인할 수 있었으며, 특히. Chemotherapeutics와 peptide를 물리적으로 결합시켰을 때, 화학적으로 결합시킨 형태에 비하여 그 효과가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 27 및 도 28).
이를 통하여, modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 chemotherapeutics를 함께 세포 내로 전달함으로써, chemotherapeutics에 의한 암세포 살상능이 증가되었음을 알 수 있었다.
실시예 19: 단백질/펩티드 복합체에 의해 증가된 암세포 내 전달효율 확인
본 실시예에서는, Protein(Human serum albumin)/Peptide 복합체의 세포 내 전달효율을 확인하기 위하여, 폐암 세포주인 A549를 96 well plate에 70-80%로 분주하고 24시간 후, FITC labeled Human serum albumin (HSA)과 mVI-G-A-TAT peptide를 물리적으로 결합시켜 0.5 또는 5 μM씩 처리하였다 (실시예 17의 물리적 결합 과정 참고). 처리 0.16 시간, 0.5 시간, 2 시간, 6 시간 후, 세포 내로 uptake된 FITC labeled HSA를 microplate reader를 이용하여 확인하였으며, 대조군으로 protein을 단독으로 처리한 그룹을 이용하였다.
protein(HSA)/Peptide 복합체를 세포에 처리하고 세포 내로 uptake되는 것을 확인한 결과, protein을 단독으로 처리한 대조군과 비교하였을 때에 protein/peptide 복합체의 cellular uptake이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 특히, Protein을 0.5, 5μM씩 처리한 실험군 모두에서 본 발명의 peptide와 함께 처리한 경우, protein을 단독으로 처리한 그룹에 비해, 통계적으로 유의한 세포내 protein 전달효율 증가를 보였다 (도 29). 이를 통하여 modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 protein을 함께 세포 내로 전달함으로써, protein의 세포 내 전달효율이 보다 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 20: 항체/펩티드 복합체에 의해 증가된 세포 내 항체 전달효율 확인
본 실시예에서는, Antibody(Rabbit polyclonal to TGF beta 1)/Peptide complex의 세포 내 전달효율을 확인하고자 하였다. transforming growth factor beta (TGF-β)는 cytoplasm에 존재하는 protein으로, 암세포에서 과발현 되어있다고 알려져 있으며, 외부에서 투여되는 항체에 의한 항원-항체 반응을 위해서는, 세포막에 대한 높은 투과성을 필요로 한다. 본 실시예에서는 modification한 Ad Protein VI 유래 peptide가 Antibody를 세포 내로 전달할 수 있는지를 확인해 보기 위하여, Antibody (Rabbit polyclonal to TGF beta 1)/Peptide 복합체를 permeabilization과정 없이 세포에 처리한 후, 세포 내 전달 여부를 확인하였다. 구체적으로, 폐암 세포주인 A549를 chamber slide에 70-80%로 분주하고 24시간 후, Antibody와 mVI-G-A-TAT peptide를 1:1의 중량비로 물리적으로 결합시킨 후 (실시예 17의 물리적 결합 과정 참고), 4μg 만큼 처리하였다. 처리 후, 2시간 동안 세포 내로 uptake된 Antibody를 Alexa Fluor 488 conjugated antibody (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L))를 이용하여 형광현미경으로 확인하였으며, 대조군으로 antibody만 처리한 그룹을 이용하였다.
분석 결과, antibody만을 처리한 대조군에서는 대부분의 antibody가 세포내로 전달되지 못한 반면, Antibody/peptide complex를 처리한 그룹에서는 다량의 antibody가 세포내 전달됨을 확인할 수 있었다 (도 30). 이를 통하여 modification한 Ad Protein VI 유래 peptide와 antibody를 함께 세포 내로 전달함으로써, antibody의 세포 내 전달효율이 보다 증가됨을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 통상의 기술자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-university Cooperation Foundation Hanyang University <120> Compositions for Intercelluar Delivery Comprising Peptide derived from Adenovirus Protein VI and Pharmaceutical Compositions for Treating Cancer Comprising the Same <130> P16U10C1513 <150> KR 10-2015-0122756 <151> 2015-08-31 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> VI <400> 1 Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VI-9R <400> 2 Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI <400> 3 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI-TAT <400> 4 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI-TAT-A <400> 5 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu 20 25 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI-G-TAT-A <400> 6 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Phe 1 5 10 15 Leu Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu 20 25 30 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI-A-TAT <400> 7 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Glu Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 25 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI-G-A-TAT <400> 8 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Phe 1 5 10 15 Leu Gly Ala Leu Ala Glu Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 9 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS <400> 10 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 10 <210> 11 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mVI-G-A-TAT dimer <400> 11 Ala Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Phe 1 5 10 15 Leu Gly Ala Leu Ala Glu Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala 20 25 30 Phe Ser Trp Gly Ser Leu Trp Ser Gly Ile Lys Asn Phe Gly Phe Leu 35 40 45 Gly Ala Leu Ala Glu Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 50 55 60

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 펩티드를 포함하는, 생리활성 조절 물질의 세포 내 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 양전하 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 양전하 아미노산은 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 소수성 아미노산이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 알라닌(Ala) 또는 페닐알라닌(Phe)인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩티드의 N-말단에 알라닌(Ala) 및 페닐알라닌(Phe)이 추가로 연결된 펩티드를 포함하는, 세포 내 전달용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 이량체 (dimer) 형태인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 조절 물질은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 화학물질 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)는 (i) 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions), (ii) 전하성 부위(chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위(bioreducible portion)를 포함하는 폴리머인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions)는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 세포 내 전달용 조성물.
  12. (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물, 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer) 및 아데노바이러스 DNA를 포함하는 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 항암용 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머(biocompatible polymer)는 (i) 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions), (ii) 전하성 부위(chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위(bioreducible portion)를 포함하는 폴리머인 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역반응 회피성 부위(escapable portion from immune reactions)는 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드[예컨대, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체(예컨대, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)], 폴리페닐렌 옥사이드, PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리(메톡시에틸 메타크릴에이트), 폴리(메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.

  15. 제12항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 DNA는 아데노바이러스 지놈 DNA 전체인 것, 아데노바이러스 지놈 DNA의 일부가 결실된 것 또는 아데노바이러스 지놈 DNA의 일부가 변형된 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 암은 유방암, 비소세포성 폐암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 방광암, 후두암, 골육종, 갑상선암, 뇌암, 결장암, 질암, 음문암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 부신암, 음경암, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 수뇨관암, 신장 골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 비인두암, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암인 것을 특징으로 하는, 항암용 약제학적 조성물.
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