KR20170026254A

KR20170026254A - 인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20170026254A
Application number: KR1020160109311A
Authority: KR
Inventors: 김송철; 심인경
Original assignee: 울산대학교 산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2017-03-08
Also published as: KR101828696B1

Abstract

본 발명은 지방유래 줄기세포와 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지방유래 줄기세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 지방유래 줄기세포 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계; 및 상기 접종된 인슐린분비세포를 지방유래 줄기세포와 적층구조로 공동배양하는 단계를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법에 따른 인슐린분비세포 이식용 조성물은 생체 내 인슐린분비세포의 생착률을 증가시키고 안정적으로 인슐린 분비를 유지시킬 수 있으므로, 효과적인 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.

Description

인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for insulin secreting cell transplantation and method for preparing the same}

본 발명은 지방유래 줄기세포 시트와 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

한국인의 10명 가운데 3명이 고혈당 위협에 노출된 것으로 나타났으며 나이가 들수록 유병률이 증가함에 따라 국내 당뇨병 인구가 가파르게 증가함에 따라, 치료비용의 급등으로 인한 막대한 경제적 손실이 나타나고 있다. 우리나라의 경우 2003년 동안 당뇨병 환자가 사용한 진료비가 건강보험의 5분의 1을 차지하는 것으로 나타났으며 당뇨 환자의 1인당 평균 진료비는 일반인의 4.63배에 달하는 것으로 확인되었다.

현재 인슐린 의존성 당뇨의 주 치료법인 인슐린 주사는 매번 혈당을 측정해야 하며 저혈당 발생의 위험성 및 만성 합병증 위험을 근본적으로 막을 수 없다는 문제가 있고, 췌장 이식은 침습적이다.

췌장도세포 이식은 췌장이식과 달리 비교적 간단한 수술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하며 무엇보다도 체외에서의 배양 가능성 및 면역조절(immuno-modulation)등의 조작을 시행할 수 있고 췌장도세포의 장기간 냉동보관 및 장거리 이송이 가능하다는 장점이 있어 가장 이상적인 치료방법으로 부각되고 있으나, 현재까지는 이식 세포원의 부족, 면역반응과 같은 문제가 발생하고 있어 10% 정도의 낮은 치료 성과를 나타내고 있다.

특히, 췌장도세포 공급원의 학보가 가장 중요한 임상적 난제이며, 성공적인 췌장도세포 이식을 위해서는 해결해야할 가장 중요한 문제이다.

일반적인 췌장도세포의 이식은 간문맥을 통하여 주입되며, 이 경우 혈액을 통한 염증 반응, 급성 허혈손상, 혈전생성 유도 등의 위험성이 있다. 또한 이식된 세포의 섬유화, 고혈당 및 이상지질혈증으로 인한 독성(glucolipotoxicity), 혈관생성과 같은 문제로 이식된 췌장도세포의 50-75%가 생착되지 못함에 따라, 수년 안에 대부분 당뇨가 재발하는 경우가 많다.

이러한 세포치료제의 문제를 해결하기 위해 다양한 종류의 지지체를 이용하거나 캡슐화와 같은 조직공학 기술을 이용한 세포치료제에 관한 연구가 수행되고 있다.

세포치료제의 효과적인 이식을 위하여 다양한 종류의 지지체가 시도되고 있으나, 심장, 간, 췌장과 같이 대부분의 세포로 이루어진 구조를 갖는 장기의 경우 지지체로 인하여 세포간의 긴밀한 상호작용을 이루기 어렵고, 지지체의 분해가 완전하지 않을 경우 이차적인 부작용으로 인하여 기능성이 저하됨에 따라, 지지체와 같은 이물질을 사용하지 않고 세포로 이루어진 삼차원 형태의 생체모방형 장기의 개발이 필요하다.

한국공개특허 제2009-0110738호

본 발명은 기존의 간문맥을 통하여 이식되는 췌장도세포의 낮은 생착률을 해결하기 위한 방법으로 지방유래 줄기세포를 이용한 세포 시트에 인슐린분비세포를 적층시킨 후 공동배양하여 제작한 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제공하여 인슐린분비세포의 생체 내 이식율 및 안전성을 증가시키고 효과적인 인슐린분비를 통하여 당뇨병을 예방하거나 치료하고자 한다.

본 발명은 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트 및 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 인슐린분비세포 이식용 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 상기 세포시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b); 및 상기 접종된 인슐린분비세포를 지방유래 줄기세포 시트와 적층구조로 공동배양하는 단계(c)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 및 상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 인슐린분비세포 이식용 조성물은 같은 용량의 췌장도세포가 이식된 동물군보다 향상된 혈당조절 효과를 나타내었고, 혈중 글루코즈 농도가 정상 대조군과 유사하게 조절되는 것이 확인되었으며, 이식 2개월 후에도 이식부위에서 인슐린분비세포가 인슐린을 안정적으로 분비하는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 인슐린분비세포 이식용 조성물은 생체 내 인슐린분비세포의 생착률을 증가시키고 안정적인 인슐린 분비를 유지시킬 수 있으므로, 효과적인 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 지방유래 줄기세포 세포 시트 제작 및 상기 세포 시트 위에 췌장도세포를 적층형으로 공동배양하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 세포 시트 성능을 평가하여 최적의 세포 시트 제조방법을 확인하기 위한 실험군을 나타낸 도면이다.
도 3은 지방유래 줄기세포 시트와 췌장도세포의 공동배양 방법에 따른 세포 생리활성을 비교한 결과로, 도 3A는 췌장도세포 실험군, 세포부유액 상태로 공동배양된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 실험군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 적층 공동배양 실험군의 배양 6시간 후 및 배양 4일 후 세포독성을 확인한 결과이며, 도 3B는 지방유래 줄기세포 시트 실험군, 췌장도세포 실험군, 세포부유액 상태로 공동배양된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 실험군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 적층 공동배양 실험군의 배양 6시간 후 및 배양 4일 후 인슐린분비능을 확인한 결과이다.
도 4는 지방유래 줄기세포 시트 위에 췌장도세포를 적층시키고 공동배양하여 인슐린분비 세포 이식용 조성물을 제조하는 과정 및 당뇨가 유도된 마우스 피하에 상기 이식용 조성물을 이식하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 췌장도세포, 지방유래 줄기세포, 췌장도세포/지방유래 줄기세포 혼합물 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 주입된 각각의 췌장부전 마우스 동물모델의 혈당 및 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 정상대조군, 당뇨 마우스군 및 지방유래 줄기세포 시트로 췌장도세포가 이식된 당뇨 마우스군의 혈중 글루코즈 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 이식 1 및 2 개월 후 이식부위에 췌장도세포의 생착률을 확인한 조직학적 분석결과이다.
도 8은 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트를 마우스 동물 피하, 복막 및 간 표면에 이식하고, 이식 직후 및 이식 2개월 후 이식된 세포 시트를 확인한 결과이다.
도 9는 피하, 복막 및 간 표면에 1500IEQ 및 3000IEQ 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스군의 혈중 글루코즈 및 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 피하에 3000IEQ 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스, 간 표면에 1500IEQ 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스, 정상군 및 당뇨 마우스를 6시간 이상 금식시키고, 생리식염수에 녹인 포도당(2g/kg)을 복강으로 주입한 후 5, 15, 30, 60 및 120분에 각각의 마우스에서 혈중 글루코스를 확인한 내당능시험(IPGTT) 결과이다.
도 11 및 도 12는 간문맥을 통한 단일세포 주입 및 간 표면 세포이식 방법의 세포 전달 효율을 비교하기 위해 수행된 실험과정 및 결과이다.
도 13은 세포 시트 부착 효율성을 증가시키기 위해 개발된 콜라겐/L-도파 프레임과 상기 프레임을 이용하여 마우스 복막 표면에 세포 시트를 부착한 모습 및 세포 시트 부착 1일 후 세포 잔류 정도를 확인한 결과이다.

본 발명은 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트 및 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 조성물은 인슐린분비세포가 접종된 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트를 포함할 수 있다.

상기 세포 시트는 콜라겐과 L-도파를 더 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 5와 같이 본 발명의 인슐린분비세포 이식용 세포 시트가 이식된 췌장부전 마우스군의 혈당 조절효과를 확인한 결과, 같은 용량의 췌장도세포만 이식된 마우스군보다 향상된 혈당 조절 능력을 나타내었으며, 세포 시트가 제거될 때까지 혈당조절 능력이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6을 참고하면 세포 시트가 이식된 당뇨병 마우스군의 혈중 글루코즈 농도가 정상대조군의 혈중 글루코즈 농도와 유사한 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 인슐린분비세포 이식용 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물 100 중량부에 대하여 인슐린분비세포 이식용 조성물을 0.01 내지 90 중량부, 0.1 내지 90 중량부, 1 내지 90 중량부 또는 10 내지 90 중량부로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내,근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여될 수 있으며, 각 장기의 표면에 부착될 수 있다.

상기 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 1,000 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 1,000 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b); 및 상기 접종된 인슐린분비세포를 지방유래 줄기세포 시트와 적층구조로 공동배양하는 단계(c)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공한다.

상기 이식용 조성물 제조방법은 (c) 단계의 공동배양된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계(d)를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 고리형태로 제작된 콜라겐/L-도파 프레임에 세포 시트를 부착하고 마우스 동물모델 복막 좌측 표면에 이식하고, 우측 표면에는 세포 시트를 단독으로 이식한 후, 이식 1일 후 세포 잔류를 확인한 결과, 도 12와 같이 콜라겐/L-도파 프레임을 이용하여 세포 시트를 이식한 좌측 복막에서는 세포 잔류가 확인된 반면, 세포 시트를 단독으로 이식한 우측 복막에서는 잔류세포가 확인되지 않았다.

상기 결과로부터 콜라겐/L-도파 프레임을 이용할 경우 세포 시트 부착이 어려운 부위에서도 세포 시트 부착능을 향상시킬 수 있음이 확인됨에 따라, 콜라겐/L-도파 프레임은 다양한 부위에 세포 시트 부착을 가능하게 하여 인슐린 분비세포를 안정적으로 전달함으로써, 세포 부착능 저하에 따른 혈당조절 효과 감소 문제점을 해결할 수 있다.

상기 (a) 단계의 지방유래 줄기세포는 포유동물 유래일 수 있으며, 상기 (b) 단계의 인슐린분비세포는 포유동물 유래 췌장도세포일 수 있다.

상기 포유동물은 인간, 소, 말, 돼지, 염소, 개, 고양이, 닭, 마우스, 랫트 또는 래빗일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간 또는 랫트일 수 있다.

상기 (b) 단계는 지방유래 줄기세포가 70 내지 100 % 합류된 세포 시트에 인슐린분비세포를 10 IEQ 내지 4000 IEQ로 접종될 수 있으며, 상기 (c) 단계의 접종된 인슐린분비세포는 지방유래 줄기세포 위에서 6시간 내지 7일간 공동배양될 수 있다.

또한, 본 발명은 지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 및 상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 이식용 조성물 제조방법은 (b) 단계의 인슐린분비세포가 접종된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계 또는 (b) 단계의 인슐린분비세포가 접종된 세포 시트를 랩핑(wrapping)하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 지방유래 줄기세포는 온도에 따라 친수성이 변하는 표면에 배양될 수 있으며, 상기 방법으로 배양된 세포는 세포외 기질의 손상이 없고, 세포와 세포외 기질의 생체 내 상호 작용을 갖는 형태로 이식됨으로 세포 전달 효율이 높고 향상된 기능을 나타낼 수 있다.

췌장도세포 이식의 체내 적용의 가장 큰 문제점은 췌장도세포의 특성상 분리 및 이식과정 중 심각한 세포사멸 및 인슐린 분비 기능저하가 나타나고 이식 후 충분한 산소공급이 이루어지지 않을 경우 허혈성 손상이 나타날 수 있다. 또한 이식 방법에 따라서 일반적인 주입 방법의 경우, 이식부위에서 세포가 매우 낮은 생착률을 나타내어 실제 이식한 세포의 효능이 거의 나타나지 않는 문제가 있다.

그러나 췌장도세포를 지방유래 줄기세포를 함께 이식할 경우, 지방유래 줄기세포가 분비하는 다양한 성장인자 및 호르몬으로 인하여 췌장도세포의 아팝토시스를 억제될 수 있으며, 인슐린 분비 효과가 유지되거나 향상되는 것이 확인되었다. 또한, 지방유래 줄기세포가 분비하는 성장호르몬인 VEGF로 인하여 이식 초기부터 이식부위에 많은 신생혈관 생성이 유도되어 이식된 세포에 충분한 산소를 공급할 수 있다.

또한, 본 발명의 지방유래 줄기세포를 세포시트 형태로 이식할 경우 도 7과 같이 췌장도세포의 체내 생착률이 향상되는 것이 확인되었는데, 이는 췌장도세포가 지방유래 줄기세포 시트 내부에 머물러 있게 됨으로써 이식되는 췌장도세포의 체내 생착률을 향상시키는 것으로 확인되었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 지방유래 줄기세포 시트를 이용한 인슐린분비세포 이식용 조성물 제작

도 1과 같은 과정으로 지방유래 줄기세포를 이용하여 세포시트를 제작하고 인슐린분비세포와 공동배양하여 인슐린분비세포 이식용 조성물을 제작하였다.

먼저, 환자의 지방으로부터 콜라겐분해효소를 이용하여 지방유래 줄기세포 를 분리하여 배양하였다. 이렇게 획득된 지방유래 줄기세포의 특성을 확인한 후, 충분한 양의 지방유래 줄기세포를 일반 세포배양 접시에 배양하였다.

그 후, 트립신-EDTA 방법을 이용하여 지방유래 줄기세포(3 계대부터 5 계대까지 사용)를 단일세포로 획득하고, 상기 단일세포를 온도감응성 배양접시(UpCell)에 2×10⁴ 내지 2×10⁵ /cm²의 밀도로 분주하고 2일에서 5일간 배양하여 지방유래 줄기세포가 완전히 합류(confluence)되도록하여 세포 시트를 제작하였다.

SD(Sprague Dawley) 래트의 췌장에서 콜라겐분해효소와 밀도차이를 이용하여 췌장도세포를 분리 정제하였다. 상기 방법으로 분리된 췌장도세포 3000 IEQ를 상기 온도감응성 배양접시에서 배양된 지방유래 줄기세포 시트에 접종하고 6시간에서 24시간 방치하여 췌장도세포와 지방유래 줄기세포의 부착을 유도하여 췌장도세포와 지방유래줄기세포 시트 공동배양 구조체를 제작하였다.

< 실시예 2> 세포 시트의 체외 생리활성 확인

상기 실시예 1에서 제작된 세포 시트의 체외 생리활성을 확인하였다.

실시예 1과 같은 방법으로 제작된 지방유래 줄기세포 시트에 췌장도세포 50개를 접종하여 공동배양하였다. 또한, 도 2와 같이 지방유래 줄기세포로만 이루어진 실험군, 동량의 췌장도세포로 이루어진 실험군, 동량의 췌장도세포와 지방유래 줄기세포를 세포부유액 상태로 공동배양한 실험군을 대조군으로 선정하였다.

상기 실험군들과 같이 췌장도세포를 단독 또는 지방유래 줄기세포와 함께 6시간 또는 4일간 배양한 후 Live/dead viability/cytotoxicity assay kit (Invitrogen)을 이용하여 각 실험군에서 췌장도세포의 세포사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험방법을 통하여 살아있는 세포는 calcein AM에 의하여 녹색 형광을 띄고, 죽은 세포는 ethidium homodiber-1에 의하여 적색 형광을 띄게 된다.

그 결과, 도 3A와 같이 췌장도세포가 지방유래 줄기세포 시트에서 공동배양된 실험군 및 지방유래 줄기세포와 세포부유액 상태로 공동배양된 실험군보다 췌장도세포를 단독으로 배양한 실험군에서 죽은 세포가 많이 관찰되었다.

상기 결과로부터 지방유래 줄기세포가 췌장도세포를 보호효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 췌장도세포의 인슐린 분비기능을 체외에서 평가하기 위하여 포도당 자극 인슐린 분비(Glucose stimulated insulin secretion: GSIS)에 관한 실험(A Practical Guide to Rodent Islet Isolation and Assessment. Biological Procedures Online, Volume 11, Number 1, 2009)을 수행하였다.

상기 방법으로 모든 실험군을 1일 또는 4일간 배양하고 췌장도세포가 분비하는 인슐린양을 확인하여 저농도의 포도당(3.3mM)에서 췌장도세포가 분비하는 인슐린과 고농도의 포도당(16.7mM)에서 췌장도세포가 분비하는 인슐린양의 비율을 stimulation index(SI)로 표현하였다.

그 결과, 도 3B와 같이 췌장도세포를 단독 배양한 실험군은 배양 4일 후 SI 수치가 2.5에서 1.5로 급격히 감소하였으나, 지방유래 줄기세포와 공동배양한 실험군은 4일간 배양하여도 SI 수치가 1일과 변함없이 유지되는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 지방유래 줄기세포는 췌장도세포의 인슐린 분비기능을 유지하는 효과가 있음이 확인되었으며, 상기 결과들로부터 지방유래 줄기세포 또는 지방유래 줄기세포로 구성된 세포 시트는 공동배양된 췌장도세포의 생존 및 인슐린 분비 기능을 잘 유지하는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 세포 시트의 in vivo 활성 확인

1. 췌장부전 마우스 동물모델에 세 포시트 이식

상기 실시예 1에서 제작된 각 이식용 조성물을 도 4와 같이 췌장부전에 의해 당뇨가 유도된 마우스 동물 모델의 피하에 이식하였다.

먼저, 누드마우스에 스트렙토조토신(Streptozotocin) 180mg/kg을 투여하여 췌장부전 마우스를 제작하고 상기 췌장부전마우스의 혈당이 3일 이상 300 mg/dl로 일정하게 유지되어 당뇨가 유도된 것을 확인하였다.

실시예 1과 같이 제작된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 공동배양 구조체의 배양온도를 20℃ 이하로 낮추어 세포 시트를 온도감응성 배양접시로부터 부유시켰다. 이렇게 얻어진 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 공동배양 구조체를 cell shifter를 이용하여 상기 제작된 췌장부전 마우스 피하에 이식하여 세포 시트를 피하에 부착시킨 후 cell shifter를 제거하고 피부를 봉합하였다. 또한, 이식시 췌장세포가 탈락되지 않도록 지방유래 줄기세포 시트의 모양을 봉입 형태가 되도록 랩핑(wrapping)할 수 있다.

또한, 대조군으로 지방유래 줄기세포 시트를 상기 동일한 방법으로 췌장부전 마우스 피하에 이식하였으며, 췌장도세포 실험군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 공동배양 실험군은 피하에 주사기를 이용하여 주입하였다.

2. 혈당 조절 및 체중변화 확인

상기 실시예 3-1에서 췌장도세포, 지방유래 줄기세포 시트, 췌장도세포/지방유래 줄기세포 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 주입 또는 이식된 각 췌장부전 마우스 동물모델 실험군의 혈당 및 체중 변화를 확인하였다.

매일 일정한 시간마다 실험군 및 대조군 마우스의 체중을 측정하였으며, 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 5와 같이 같은 양의 췌장도세포가 이식되었을 때, 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 실험군에서 매우 효과적인 혈당조절능이 확인되었으며, 몸무게가 증가하였다. 반면, 이식물 제거 후 혈당조절능이 사라진 것을 확인할 수 있었다.

또한, 정상군, 당뇨가 유도된 마우스군 및 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 동물 실험군의 혈중 글루코스 농도를 확인하였다.

이식된 췌장도세포의 당반응성을 확인하기 위해, 내당능시험(IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test)을 수행하였다. 정상마우스, 당뇨마우스 및 췌장도세포/지방유래줄기세포 시트가 이식된 마우스를 6시간 이상 금식시키고, 생리식염수에 녹인 포도당(2g/kg)를 복강으로 주입하였다.

주입 후 5, 15, 30, 60 및 120분에 각각의 마우스에서 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 6과 같이 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 당뇨 마우스 동물모델의 혈중 글루코스 농도가 정상군과 유사한 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트의 혈당 조절능력이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 이식된 인슐린분비세포의 생착능 확인

조직학적 평가를 통하여 마우스에 지방유래 줄기세포 시트를 이용하여 이식된 췌장도세포의 생착 정도를 확인하였다.

췌장도세포/지방유래줄기세포 시트를 당뇨병 모델 마우스 피하에 이식한 후 이식된 췌장도세포의 생착 및 인슐린 분비능을 확인하기 위해, 면역조직학적 염색을 수행하였다. 이식 후 1 및 2개월 후 이식부위에서 이식물을 확인하고 조직을 확보하였다. 이렇게 확보된 피하조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 4시간 고정한 후 30% 수크로스(sucrose)로 3일간 치환하고 O.C.T compound를 이용하여 동결블럭을 제작하였다. 제작된 동결블럭을 6um 두께의 슬라이드로 제작하고 사람 인슐린(insulin) 일차 항체와 형광을 나타내는 이차 항체(적색 형광)를 차례로 붙이고 핵은 DAPI로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 7과 같이 세포 시트 이식 후 1 및 2개월 이후에도 이식부위의 췌장도세포에서 인슐린이 분비되고 있는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트가 이식된 동물 모델의 췌장도세포 생착률이 향상된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 다양한 장기 표면에서 세포 시트 이식효과 확인

1. 세포 시트의 부착능 확인

세포 시트를 다양한 조직에 이식하기 위해, 피하, 간 표면 및 복막에서 세포 시트의 부착능을 확인하였다.

실시예 3-1과 같이 준비된 췌장부전에 의해 당뇨가 유도된 마우스 동물 모델의 피하, 복막 및 간 표면에 도 8과 같이 세포 시트를 이식하였다.

먼저, 누드마우스에 스트렙토조토신(Streptozotocin) 180mg/kg을 투여하여 췌장부전 마우스를 제작하고 상기 췌장부전 마우스의 혈당이 3일 이상 300 mg/dl로 일정하게 유지되어 당뇨가 유도된 것을 확인하였다.

실시예 1과 같이 제작된 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 공동배양 구조체의 배양온도를 20℃ 이하로 낮추어 세포 시트를 온도감응성 배양접시로부터 부유시키고, 부유된 세포 시트를 cell shifter를 이용하여 상기 췌장부전 마우스의 피하, 복막 및 간 표면에 각각 부착시킨 후 cell shifter를 제거하고 피부를 봉합하였다. 세포 시트는 피하 및 간 표면에서 손쉽게 부착된 반면, 복막 부위에서는 세포 시트 부착에 오랜 시간이 소요되었다.

세포 시트 이식 2개월 후 췌장부전 마우스 동물모델의 피하, 복막 및 간 표면에서 세포 시트의 부착 여부를 확인한 결과, 도 8과 같이 세포 시트 이식 2개월 후에도 피하, 복막 및 간 표면에 세포 시트가 안정적으로 부착되어 있었다.

상기 결과들로부터 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트는 다양한 조직에서 안정적으로 적용될 수 있음이 확인되었다.

2. 세포 시트의 혈당 조절능력 확인

상기 방법으로 췌장부전 마우스 동물모델의 피하, 복막 및 간 표면에 1500IEQ 또는 3000IEQ 세포 시트를 부착시킨 후 각 췌장부전 동물모델의 혈당 및 체중 변화를 확인하였다.

매일 일정한 시간마다 각각의 췌장부전 마우스의 체중을 측정하였으며, 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 9와 같이 간 표면에 1500IEQ가 투여된 실험군에서는 혈당이 장기간 조절되는 것으로 나타났으며, 간 절제시에도 세포 시트 이식으로 인하여 혈당 조절이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

피하에 이식된 마우스 실험군에서는 1500IEQ이 투여된 경우 혈당 조절이 완벽하게 나타나지는 않았으나, 3000IEQ로 이식된 실험군에서는 장기간 혈당조절이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

한편, 피하 및 간 표면에 이식된 췌장도세포의 당반응성을 확인하기 위해, 피하 또는 간 표면에 세포 시트가 이식된 마우스에서 내당능시험(IPGTT: Intraperitoneal glucose tolerance test)을 수행하였다.

정상마우스, 당뇨마우스, 피하 또는 간 표면에 췌장도세포/지방유래줄기세포 시트가 이식된 마우스를 6시간 이상 금식시키고, 생리식염수에 녹인 포도당(2g/kg)을 복강으로 주입하였다.

주입 후 5, 15, 30, 60 및 120분 마다 각각의 마우스에서 혈당을 측정하였다.

그 결과, 도 10과 같이 간 표면에 세포 시트가 이식된 당뇨 마우스 동물모델의 혈중 글루코스 농도가 정상군과 가장 유사한 수준으로 회복되는 것이 확인된 반면, 당뇨병 마우스는 포도당 주입 2시간 후에도 정상 혈당으로 회복되지 못하였다.

또한, 피하에 세포 시트가 이식된 당뇨 마우스 동물모델의 혈중 글루코스 농도는 포도당 주입 2시간 후에 정상군과 유사한 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트는 다양한 조직에 이식되어도 우수한 혈당 조절능력을 나타내는 것이 확인되었다.

< 실시예 6> 간문맥을 통한 단일세포 주입 및 간 표면 세포이식 방법의 세포 전달 효율 비교

췌장도세포/지방유래 줄기세포 시트 이식에 따른 인슐린 분비세포 전달 효율성을 확인하기 위해, 도 11과 같이 간 표면에 세포 시트를 이식한 마우스 동물모델실험군과 세포분화를 통하여 준비된 인슐린 분비세포를 단일세포로 간문맥에 직접 주입한 비교군에서 세포 절단 효율성을 확인하였다.

상기 실험군 및 비교군 마우스에 각각 세포 시트 및 인슐인 분비세포를 주입하고 주입 후 2일 및 7일에 in vivo 라이브 이미지 및 ex vivo 장기 이미지로 이식된 세포의 생존 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 11과 같이 간 표면에 세포 시트를 통하여 이식된 세포의 경우, 이식된 부위인 간 표면에서 장기간 생존하는 것으로 나타났다.

상기 결과를 확인하기 위해, 실제로 각 장기의 genomic DNA를 추출하여 이식된 세포의 잔량을 검사한 결과, 간 표면에 세포 시트가 이식된 실험군의 간 조직에서 세포가 2주일 이상 잔류하고 있음이 확인되었다.

상기 결과로부터 인슐린 분비세포를 단일세포로 직접 주입하는 방법보다 세포 시트를 이용하여 이식할 경우 이식된 세포의 전달 효율 및 생존 효율이 매우 우수한 것이 확인되었다.

< 실시예 7> 세포 시트 부착능 향상을 위한 디바이스

앞선 실험에서 확인된 복막 또는 장막과 같은 부위에 세포 시트의 부착력을 향상시키기 위해 부착능이 뛰어난 콜라겐/L-도파 멤브레인을 프레임으로 이용하였다.

먼저, 이온화 콜라겐 수용액과 L-도파 용액을 혼합하여 동결 건조하여 다공성 막을 제작하였다. 막의 두께에 따라 0.1 내지 3% 농도의 콜라겐 수용액에 L-도파를 0.01 내지 1%로 혼합하여 사용하였으며, 제작된 다공성 막을 적절한 형태로 잘라 고리형태의 콜라겐/L-도파 프레임을 제작하였다.

상기 고리형태로 제작된 콜라겐/L-도파 프레임에 세포 시트를 부착하고 마우스 동물모델 복막 좌측 표면에 이식하였으며, 우측 표면에는 세포 시트를 단독으로 이식하고, 이식 1일 후 세포 잔류를 확인하였다.

그 결과, 도 12와 같이 콜라겐/L-도파 프레임을 이용하여 세포 시트를 이식한 좌측 복막에서는 세포 잔류가 확인된 반면, 세포 시트를 단독으로 이식한 우측 복막에서는 잔류세포가 확인되지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트 및 인슐린분비세포를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 인슐린분비세포가 접종된 지방유래 줄기세포로 이루어진 세포 시트를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포 시트는 콜라겐과 L-도파를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 분비세포 이식용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 것을 특징으로 하는 인슐린 분비세포 이식용 조성물.
제1항에 따른 인슐린분비세포 이식용 조성물을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학조성물.
지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a);
상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b); 및
상기 접종된 인슐린분비세포와 지방유래 줄기세포 시트를 적층구조로 공동배양하는 단계(c)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 이식용 조성물 제조방법은 (c)단계의 공동배양된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계(d)를 추가로 더 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (a)단계의 지방유래 줄기세포는 포유동물 유래인 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (b)단계의 인슐린분비세포는 포유동물 유래 췌장도세포인 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (b)단계는 지방유래 줄기세포가 70 내지 100% 합류(confluence)된 세포 시트에 인슐린분비세포를 10 IEQ 내지 4000 IEQ로 접종하는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (c)단계의 접종된 인슐린분비세포는 지방유래 줄기세포 시트 위에 적층되어 6시간 내지 7일간 공동배양되는 것을 특징으로 하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
지방유래 줄기세포를 배양하여 세포 시트를 준비하는 단계(a); 및
상기 세포 시트 위에 인슐린분비세포를 접종하는 단계(b)를 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 이식용 조성물 제조방법은 (b)단계의 인슐린분비세포가 접종된 세포 시트의 외주를 콜라겐과 L-도파로 이루어진 프레임으로 둘러싸는 단계(c)를 추가로 더 포함하는 인슐린분비세포 이식용 조성물 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 이식용 조성물 제조방법은 (b)단계의 인슐린분비세포가 접종된 세포 시트를 랩핑(wrapping)하는 단계(c)를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이식용 조성물 제조방법.