KR20090110738A - 췌도세포의 배양시 그의 생존률 또는 기능을 증진시키는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 췌도세포의 배양시 생존률을 증가시키는 방법 또는 기능 및 활성을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 췌도세포의 배양시 중간엽 줄기세포를 공동배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 또는 췌도세포 배양시 중간엽 줄기세포의 배양액으로 췌도세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포의 배양시 생존률을 증가시키는 방법 또는 활성을 증진시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이를 위한 배양액 또는 췌도세포의 배양용 키트를 제공한다.

본 발명에 의하면 췌도세포의 배양기간 동안 췌도세포의 생존률과 활성이나 기능을 높일 수 있어 췌도세포의 이식을 보다 성공적으로 수행할 수 있도록 한다.

췌도 이식, 중간엽 줄기세포, 췌도 배양, 제대혈, 골수, 사이토킨

Description

췌도세포의 배양시 그의 생존률 또는 기능을 증진시키는 방법{Method for improving pancreatic islet cell survival or its activity}

본 발명은 세포배양기술 및 임상의학분야의 장기 이식 전 전처리 기술의 영역에 속하는 것으로서, 췌도세포의 배양시 그의 생존률 또는 그의 기능이나 활성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

현재 당뇨병으로 고통받고 있는 환자는 전 세계의 4.6%이며, 지속적으로 증가하여 2025년에는 6.0%를 초과할 것으로 예상되고 있다. 최근, 췌장이식 및 췌도세포이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있다. 그러나 현재 췌도세포 이식을 위한 세포의 분리 및 배양기술은 2~4명의 공여자로부터 얻은 췌도세포로 한 명의 당뇨병환자에게 이식할 수 있는 정도이며, 이식 후 인슐린 비의존성의 유지는 10% (5년)을 넘지 못하고 있는 실정이다. 그러므로 췌도세포 분리 및 배양 조건을 최적화하고, 이식된 췌도의 손상을 최소화하여 이식 조직의 생존률을 향상시키고자 하는 연구들뿐만 아니라(1-5), 다양한 췌도세포의 증식방법, 인간 이외의 동물조직을 이용한 이종이식 등의 방법 등에 대해서도 연구를 진행하고 있다. 또한, 췌도세포는 췌장조직으로부터 분리될 때, 췌도세포의 기능이 손상되고 세포사멸이 초래된다는 문제점이 있고, 일반적인 세포주와 달리 췌도세포는 배양기간에 따라 세포의 손실이 급증하는 것으로 알려져 있다.

한편, 현재 췌도세포의 기능 및 활성의 향상에 관련된 여러 가지 성장인자들이 알려져 있고(6), 이들의 췌도세포에 대한 영향에 대한 현상 및 그 기전에 대하여 다각적인 검증이 이루어지고 있는 추세이다. 대표적으로 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor: VEGF(7,8)), 인터루킨-6 (Interleukin-6: IL-6(9,10)), TGF-베타(11), 간성장인자 (Hepatocyte growth factor: HGF (12)) 등을 들 수 있고, 연구 결과 이러한 성장 인자들이 중간엽 줄기세포로부터 인접세포들에 대한 자극 효과(trophic effect)(13)에 의해서 방출되는 성장 인자들 중에 포함이 된다. 하지만 이러한 성장인자들의 조합에 의한 췌도세포의 생물학적 기능 및 활성의 향상에 대해서는 현재까지도 연구 성과가 미비한 상황이다.

국내외적으로 이식 전 췌도세포의 질의 향상 또는 장기적으로 유지할 수 있는 방법에 대해서 다양한 측면에서 연구가 진행이 되고 있다. 이와 관련된 많은 단일 인자들과 그 기전들에 대해서도 연구가 되고 있다. 하지만 췌도세포에 국한되어 보았을 때, 그 실질조직(parenchymal cell)과 간엽조직(mesenchymal cell), 그 중에서도 특히 간엽 줄기세포의 실질조직에 대한 자극 효과(trophic effect)에 대해서는 아직까지 활발히 연구가 되지 않고 있는 실정이다. Izumida Y et al . 그룹에서 섬유아세포를 이용하여서, 췌도세포와 공동배양을 하여, 그 활성과 기능이 증가된 연구 성과가 2006년에 발표되긴 하였지만(14), 중간엽 줄기세포에 비해서는 그 자극 효과(trophic effect)가 미약할 것으로 추측되며, 동물실험 수준에서 혈당을 실질적으로 조절할 수 있는 측면에서의 비교 검증이 안 되었고, 또한 그 기전 또한 연구가 되어 있지 않은 상태이므로, 본 발명에서는 처음으로 중간엽 줄기세포 중 원시 세포로 알려진, 골수 및 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하여 췌도세포와 공동배양 또는 중간엽 줄기세포를 배양한 배양액을 이용하여 췌도세포를 배양한 후, 그 질 및 활성화 과정을 다양한 측면에서 확인하고, 기전을 밝히는데 주안점을 둘 것이며, 시험관 수준뿐만 아니라 동물실험 수준에서도 실질적인 효과를 증명하는 최초의 연구가 될 것으로 사료된다.

현재 임상에서 췌도세포 이식을 통해서, 환자에게 타인의 췌도세포를 이식 하였을 경우, 이식된 췌도세포의 점진적인 사멸로 인하여, 5년 성공률이 높지 않은 실정이다 (15). 이는 췌도세포 이식 전 배양 단계에서의 췌도세포의 활성 및 기능의 저하에 상당부분 기인된다고 사료된다. 그러므로 환자에게 이식하기 전 췌도세포의 배양단계에서 생존률을 높이고 활성 또는 기능 저하를 방지할 수 있는 배양법을 확립하는 것이 본 발명의 해결하고자 하는 과제이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 인간 유래 골수 및 제대혈로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 마우스 및 인간으로부터 분리한 췌도세포와 공동 배양하여 췌도세포의 생존률을 증가시키고, 췌도세포의 활성 또는 기능을 유지하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 중간엽 줄기세포를 이용하여 제작한 배양액으로 췌도세포를 배양하여 췌도세포의 생존률을 증가시키고, 췌도세포의 활성 또는 기능을 유지하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 췌도세포를 배양시 췌도세포의 생물학적인 활성 및 기능의 손실이 적으며 췌도세포의 생존률을 높일 수 있어, 췌도세포의 이식을 보다 성공적으로 수행할 수 있도록 한다.

본 발명은 골수 또는 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포와 췌도세포를 공동 배양하므로써 췌도세포 배양시 췌도세포의 생존율을 높이며, 췌도세포의 활성 또는 기능을 유지시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도 인간 유래 중간엽 줄기세포와 췌도세포를 공동배양할 경우 췌도세포의 생존률이 대조군에 비하여 증가한다는 것을 발견하고(도 1), 이를 AO/PI 염색법으로 확인하였다(도 2). 또한 ADP/ATP 비율, 인슐린 분비능을 검증하는 시험법인 GSIS(glucose-stimulated insulin secretion) 결과를 통하여 상기와 같이 공동배양된 췌도세포의 기능, 활성이 대조군과 비교하여 증진된다는 것을 확인하였다(도 3A-D).

또한 본 발명의 발명자들은 중간엽 줄기세포를 배양한 배양액 상등액을 사용하여 췌도세포를 배양할 경우도 췌도세포의 활성이 대조군에 비하여 증가한다는 것을 발견하였다(도3 E-F).

상기와 같은 중간엽 줄기세포 또는 이의 배양액이 췌도세포에 영향을 주는 기전을 밝히기 위하여 본 발명의 발명자들은 배양단계에서의 사이토킨 및 단백질의 발현을 관찰한 결과, 공동배양시 췌도세포의 기능 및 활성에 많은 도움을 준다고 기존에 알려진 IL-6, HGF, VEGF, FGF, TGF-베타 등이 증가한 것을 확인할 수 있었고(도5a 및 5b의 A-E), 또한 주목할 만한 것은 전염증사이토킨(pro-inflammatory cytokine)인 인터페론 감마 (Interferon-gamma)와 티엔에프 알파 (TNF-alpha)가 감소했으므로(도5b의 E-F), 이러한 결과로 인하여, 시험관 배양시 췌도세포의 사멸을 막을 수 있는 기전적인 실마리를 제공한다고 할 수 있다. 또한 상기 공동배양시 췌도세포 내 베타 세포의 증식에 관련된 단백질로써 보고된 P27의 감소 및 PDX-1의 증가가 관찰되었다. 그리고 이 두 단백질의 상위 신호전달 단백질로 알려진 PI-3K의 발현이 증가함을 확인하여, P27과 PDX-1의 발현 변화가 상위 신호 단계로부터 유래함을 유추할 수 있고, 이런 신호의 시발이 인간 유래 중간엽 줄기세포로부터 올 수 있음을 시사한다. 이런 결과들을 종합해 볼 때 인간 유래 중간엽 줄기세포와의 공동 배양이 췌도세포 내 베타세포의 증식에 영향을 미침을 간접적으로 확인할 수 있다. 더불어 세포 사멸에 관련된 기전인 CASPASE 단백질의 발현을 억제하는 XIAP의 발현이 공동배양으로 증가되는 것을 관찰하여 췌도세포의 사멸의 억제효과 또한 유도되는 상태를 확인하였으며, 췌도세포의 스트레스와 관련하여, 공동배양에서 염증반응 (inflammatory reaction) 과 산화적 스트레스 (oxidative stress)에 의한 췌도세포내 HSP32와 HSP70단백질의 발현이 증가하여 췌도세포의 활성이 우수함을 알 수 있었다(도 6).

이와 같은 시험관적인 시험 결과를 공동 배양이 생체 내에서도 더욱 우수한 실험성적을 나타낼 수 있는 지를 STZ(streptozotocin)을 이용한 제 1형 당뇨병 마우스 모델에서 검증하기 위하여 중간엽 줄기세포 배양액으로 48시간 동안 배양한 마우스 췌도세포를 마우스의 신장 피막하에 이식하여, 2주 동안 혈당 변화를 관찰한 결과, 일반적인 배양액을 이용한 대조군에 비교하였을 때, 계속적으로 낮은 혈당을 유지하였으므로, 대조군에 비해 우수한 혈당 조절능을 가지고 있는 것을 마우스 생체 내에서 확인하였으며(도 7A), 중간엽 줄기세포를 배양한 액에서 배양한 췌 도세포를 이식한 그룹에서는 체중이 정상적으로 증가하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 7B). 또한 이식된 췌도세포의 기능을 확인하기 위해서 실시한 당부하능 검사(IPGTT; Intraperitoneal Glucose Tolerance Testing)에서도 대조군에 비해서 중간엽 줄기세포를 배양한 액에서 배양한 췌도세포를 이식한 그룹이 더욱 더 우수한 성적을 보여주는 것을 확인하였다(도 7C).

상기와 같은 실험결과를 바탕으로 본 발명은 췌도세포의 배양시 중간엽 줄기세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포 생존률을 높이는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 췌도세포의 배양시 중간엽 줄기세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포의 기능 또는 활성을 유지하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면으로는 본 발명은 중간엽 줄기세포를 배양하고 그의 상등액을 취하는 단계 및 상기 상등액에 췌도세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포 생존률을 높이는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 중간엽 줄기세포를 배양하고 그의 상등액을 취하는 단계 및 상기 상등액에 췌도세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포의 기능 또는 활성을 유지하는 방법을 제공한다.

본 발명에 사용되는 중간엽 줄기 세포가 골수 유래 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 사람, 마우스를 포함하는 포유동물로부터 유래한 것을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양액을 제공한다.

또한 본 발명은 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양용 키트를 제공한다.

췌도세포의 배양액으로는,M199, CMRL1066, Miami 배지, RPMI1640가 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 제대혈 및 골수액의 수집 ( Cell collection )

제대혈 (umbilical cord blood)은 위원회지침서 (institutional guidelines)에 따라 삼성서울병원에서 정상(full-term) 분만 또는 조산(preterm) 분만자로부터 수집하였다. 혈액은 시트르산-인산-덱스트로즈 항응혈제 (citrate-phosphate-dextrose anticoagulant, CPDA)가 포함되어 있는 250 ㎖ 표준 혈액수집백(standard blood collection bag, 녹십자, 한국)에 수집되었다.

골수(bone marrow)는 뇌사자의 장골(iliac bone)로부터 헤파린이 5mL 포함되어 있는 50mL 실린지로 흡인(aspiration)하는 방법으로 수집되었다. 위원회지침서(institutional guidelines)에 따라 삼성서울병원에서 공여자의 사전 동의하에 적출하였다.

실시예 2: 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

중간엽 줄기세포를 분리하기 위해서, Bieback et al (16) 그룹에서 발표한 방법을 자체 개량하였다. 상기 실시예1에서 분리한 제대혈과 골수액을 각각 2mM EDTA(Sigma, St. Louis. MO, USA) 가 첨가된 인산완충용액(phosphate-buffered saline)과 1:1 희석하고, 밀도구배를 위하여 50mL 튜브에 20 mL 씩 미리 분주된 Ficoll-Paque Plus(Amersham, Freiburg, Germany) 상태에서 미리 희석된 골수액과 제대혈을 천천히 중첩시킨 후, 400g, 30분, 무제동으로 상온에서 원심분리하여, 하단에 적혈구층, 중간에 단핵세포층 및 상단에 혈청층의 순서로 분리하였다. 피펫을 이용하여 단핵세포층을 수거하여 50 mL 튜브로 옮기고, 2mM EDTA (Sigma, St. Louis. MO, USA) 가 첨가된 인산완충용액 (phosphate-buffered saline)으로 50 mL 까지 채운 후, 1800rpm, 10분 동안 상온에서 원심분리를 하고, 상층액을 제거 한 후, 추가로 50 ml의 인산완충용액으로 세척하여 1800rpm, 10분 동안 원심 분리를 한 후, 25 mL 의 DMEM-Low glucose 배양액에 재부유하고, 트리판블루(tryphan blue; Gibco, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 염색을 한 후, 혈구측정기(hemocytometer)로 세포의 생존률 및 세포 수 측정을 하였다. T-75cm² 배양접시상에서 면적당(cm²) 1.5 x 10⁶ 개의 단핵구 세포를 10% FBS 와 2 mmol/l L-글루타민이 첨가된 DMEM-저포도당 (Dulbeco's Modified Eagle Media-low glucose: Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 분주하였다. 일주일 동안 37℃ 항온 5% CO2 배양기에서 배양하고, 배양 접시 상에 붙지 않은 세포는 일주일 후, 인산완충용액(phosphate-buffered saline)을 이용하여 제거하고, 계속해서 10% FBS와 2 mmol/l L-글루타민이 첨가된 DMEM-저포도당 (Dulbeco's Modified Eagle Media: Gibco, Grand Island, NY, USA) 배양액을 이용하여서 계대 배양하였다.

실시예 3: 중간엽 줄기세포 배양 상층액의 제조

상기 실시예2에 의한 방법으로 배양중인 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 1x10⁶ 개의 세포수로 T-75cm² 배양접시상에서 10% FBS 와 2 mmol/l L-글루타민이 첨가된 DMEM-저포도당 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 분주하였다. 24시간 동안 37℃ 항온 5% CO2 배양기에서 배양하고, 현미경으로 관찰하여 세포배양접시 대비 세포수 밀도가 60~70%가 된 것을 확인하였다. 배양액을 인간 췌도세포 배양의 경우10% FBS 가 첨가된 CMRL1066, 마우스 췌도세포의 경우 10% FBS 가 첨가된 M199 로 교체하고, 48시간 동안 37℃ 항온 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배양 접시 상의 배양액을 파이펫으로 수거하여, 실린저 필터(0.22㎛ pore size ; BD, San Diego, CA)로 상층액을 필터링 한 후, 부유물이나 죽은 세포의 단편을 제거한 순수한 배양액만을 수거하여 4℃ 냉장고에서 보관하였다.

실시예 4: 췌도세포의 분리 및 배양.

4-1) 인간 췌도세포 분리 및 배양

본 발명에 쓰인 인간 췌도세포의 분리는 뇌사자 췌장을 이용하였다. 위원회지침서 (institutional guidelines)에 따라 삼성서울병원에서 공여자의 사전 동의 하에 췌장을 적출하였다. 수술적으로 무균상태에서 췌장 적출 후 바로 얼음이 채워진 University of Wisconsin용액에 넣어 췌도 분리실로 옮긴 후 자체 개량한 Ricordi 방법으로(17) 췌도를 분리하였다. 즉, 리버라제 (liberase)를 카테터를 통하여 췌관내로 서서히 주입 후, 충분히 부푼 췌장을 분리 챔버에 넣고 연동펌프 (peristaltic pump)를 이용해 미리 준비해 둔 37℃ HBSS를 챔버 내로 순환시키면서 부드럽게 챔버를 흔들어 주었다. 또한 리버라제 (Roche; Nutley, NJ, USA)가 췌장내에 순환액이 분당 1-2℃ 상승하도록 하여, 순환액은 분당 70-79mL의 속도로 흘려 보냈다. 이때부터 약 1-2분 간격으로 소화된 용액을 채취하여 0.2mM diphenylthiocarbazone으로 염색하여 현미경으로 관찰하여 완전히 분리된 췌도가 하나 이상 보이면 소화가 되었다고 판단하여 4℃ HBSS(Hank’s balanced salt solution; Sigma, St. Louis. MO, USA) 를 빠르게 주입하고 챔버로 유인된 관을 얼음에 담궈 챔버 온도를 급격히 내려 liberase 분해효소를 불활성 시켰다. 챔버에서 나온 소화 조직은 HBSS (10%FBS함유)가 들어있는 시험관에 하나씩 모아 원심분리하고 (1500 rpm, 5분, 4-6회), 세포분리기 Cobe2992를 이용하여 순수 분리하였다. 얻어진 췌도는 배양액으로 37℃에서 2일간 배양 후, 각 단계의 상층액을 채집하여 미생물 오염도 검사를 시행하였다.

4-2) 마우스 췌도의 분리 및 배양

마우스 췌도세포의 분리는 콜라게나아제 (type P, Sigma) 용액을 직접 마우스의 총담관으로 주입하는 방법을 기본으로 하였다. 실험직전 콜라게나아제 를 HBSS 용액에 0.8mg/ml의 농도로 녹여 0.22㎛ 시린지 필터 통과시킨 후 4℃로 유지시켜 실험에 사용하였다. 마우스에 케타민 (ketamine) (45mg/kg)과 자일라진(xylazine) (2.5mg/kg)을 혼합하여 조제한 케타민 혼합액을 복강 투여하여 마취 하에 개복하였다. 원위부를 결찰하고 총담관의 근위부에 30 게이지 바늘 (Gauge needle)을 삽관하였다. 삽관된 바늘을 통하여 콜라게나아제 용액 2.5-3 ml를 주입하여 췌장을 팽창시키고, 팽창된 췌장을 적출하여 50 ml 튜브에 담아 37℃ 항온조에서 15-20분간 배양신킨 후 약 10초 정도 보텍스 (vortex)하여 소화된 조직을 잘게 부쉈다. 이 용액에 4℃ 냉각된 HBSS+10% FBS 용액 20 ml를 가하여 콜라게나아제 의 작용을 멈추고 원심분리 (2000rpm, 1분)을 통하여 세포를 모았다. 그리고 이 혼탁액을 4℃의 HBSS로 2회 세척한 후 1200 ㎛및 500 ㎛의 메쉬 필터 (mesh filter; Bellco, Vineland, NJ, USA)를 각각 1회씩 통과시키고, 통과한 조직을 냉각된 HBSS 용액으로 2회 세척한 다음 원심분리 (1500 rpm, 2분)후 상층액을 제거한다. 침전된 조직에 27% Ficoll용액 7 ml을 첨가하여 잘 섞고, 순서대로 23%, 20.5%, 11%의 Ficoll 용액 5 ml씩으로 불연속 구배를 만들어, 원심분리 (2000 rpm, 20분, 무제동)후, 11%와 20.5%의 계면 (interface)에서 피펫을 이용하여 췌장소도를 걷어내었다. 걷어낸 췌장소도를 냉각된 HBSS 용액으로 2회 세척한 후, 10 % 소태아혈청 (fetal bovine serum), 2mg/ml 포도당 및 항생제를 함유하는 배양액에 담아 37℃ 항온 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

실시예 5: 인간 유래 중간엽 줄기세포와 췌도세포의 공동 배양

상기 실시예2에서 분리한 골수 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 24-웰(well) 배양 접시에 웰당 3 x 10⁴개의 세포수로 미리 분주하여 24시간 동안 37℃ 항온 5% CO2 배양기에서 10% FBS 와 2 mmol/l L-글루타민이 첨가된 DMEM-저포도당 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배양액에서 배양하였다. 24시간 후, 현미경으로 관찰하여 세포배양접시 대비 세포수 밀도가 60~70%가 된 것을 확인하고, 상층액을 제거한 후, 인산 완충 용액(PBS)로 3회 세척한 후, 포어 크기 12 ㎛의 세포 배양 인서트 (Millicell; Millipore. Mississauga,. Ontario)를 배양접시의 웰에 각각 삽입하고, 췌도세포 배양을 위한 배양액[인간 췌도의 경우: CMRL1066 배지 (Gibco, Grand Island, NY, USA), 마우스 췌도의 경우 : M199 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)]을 각 웰당 700 ㎕씩 췌도세포와 함께 분주하였다. 37℃ 항온 5% CO2 배양기에서 약 48시간 동안 배양하여, 기본 배양액 상에서 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 사이토킨이 혼합되는 조건을 만들어 주고, 세포배양 인서트를 사용함으로써, 배양액은 공유하면서, 중간엽 줄기세포와 췌도세포가 혼합되지 않도록 하였다.

실시예 6: 중간엽 줄기세포의 배양 상층액을 이용한 췌도세포의 배양

상기 실시예3의 방법으로 중간엽 줄기세포를 배양하여 얻은 상층액을 이용하여, 실시예 4의 방법으로 분리된 췌도세포를 배양하며 췌도세포의 기능 및 생존률을 관찰하였다. 분리된 췌도세포의 배양을 위해 적당한 수의 100mm 규격의 페트리 디쉬를 준비하였다. 분리과정 직후의 췌도세포를 HBSS로 세척하고, 원심분리 (1500 rpm, 30초)하여 상층액을 제거하였다. 상기 중간엽 줄기세포를 배양하여 얻은 상층액으로 췌도세포를 재부유시키고, 약 700~1000 개의 췌도세포를 각각의 페트리디쉬에 분주되도록 나누어 담았다. 상기 각 분주된 췌도세포가 담긴 페트리디쉬에 상기 중간엽 줄기세포를 배양하여 얻은 상층액을 총 양이 약 12 ml 가량이 되도록 넣어준다. 12 mL의 배양액에 분주된 췌도세포는 37℃ 항온 5% CO₂ 배양기에서 약 48시간 가량 배양하였다.

실시예 7: 배양된 췌도세포의 생존률

상기 실시예6의 방법으로 인간 유래 중간엽 줄기세포 상층액을 이용하여 인간 췌도세포를 24, 72시간 동안 배양한 후, 사멸되지 않고 살아있는 췌도세포를 카운팅하는 방법으로 계수하였다. 도 1은 각각 통상 마우스와 인간 췌도의 연구용으로 사용하는 배지 M199+10%FBS, CMRL1066+10%FBS과 현재 췌도 이식 임상에게 사용 중인 사이토킨이 첨가되어 제품화된 Miami media에서 췌도세포를 배양하였을 때와 중간엽 줄기세포를 CMRL1066에서 배양하여 얻은 상층액(conditioned Media in CMRL1066)에서 배양하였을 때 생존 췌도세포의 수를 췌도세포수의 단위인 EIN 단위로 나타낸 것이다. 동일한 수의 췌도세포가 분주된 조건에서, 기존에 이용되는 배양액들에 비교해서 볼 때, 중간엽 줄기세포와 공동 배양을 한 실험군에서 남아있는 췌도세포의 수가 상대적으로 많은 것을 관찰하였다 (도 1).

실시예 8: AO / PI 염색법에 의한 췌도활성의 측정

마우스 췌도세포를 인간 유래 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우와 중간엽 줄기세포 없이 배양한 후(대조군), 췌도세포의 활성을 측정할 수 있는 염색법인 AO(Acridine Orange)/PI(Propidium iodide) 로 염색을 한 결과를 비교하였다. In Vitro Cell Dev Biol. 1988 Apr;24(4):266-73의 방법을 기초로, 공동 배양한 각 실험그룹의 마우스 췌도세포를 수거하여, 8℃, 1500rpm, 15초 동안 원심 분리하여, 췌도세포를 15mL 튜브상에 다운시킨다. 1 mL 의 HBSS 로 재부유하여, 1.5 mL 의 E-Tube(Eppendorf tube)에 옮겼다. 각각의 Acridine orange (0.67μmolL)와 PI(75 μmolL) 100 ㎕씩과 췌도세포 부유액 100 ㎕를 혼합하여, 슬라이드 글라스에 분주하여, 형광현미경상에서 관찰하였다. 도 2의 A에서 상단은 대조군이고, 하단은 중간엽 줄기세포와 공동배양한 경우이다. 중간엽 줄기세포와 공동배양을 한 경우, 마우스의 췌도상에서, 죽은 세포에게서 붉은색으로 염색 되는 PI가 현저히 줄어드는 경향으로 관찰되는 것을 확인하였다.

배양 후 각각 1, 3, 5일에 AO(Acridine Orange)/PI(Propidium iodide)로 염색을 하여, 췌도세포를 관찰한 결과, 골수(도 2의 D) 및 제대혈(도 2의 C) 유래의 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우가 대조군(도 2의 B)에 비하여 생존 췌도세포의 비율이 높은 것을 확인하였다.

실시예 9: 배양된 췌도세포의 활성 또는 기능의 비교

마우스 및 인간으로부터 분리한 췌도세포를 인간 골수 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 공동 배양하여, 췌도세포의 퀄리티를 측정할 수 있는 실험법인 ADP/ATP 어세이를 시행하였다. 어세이키트(Apoglow BioAssay Kit; Lonza, Rockland, ME, USA) 상에서 제공하는 실험 방법을 췌도 실험에 맞게 자체 변경하여 각각의 실험조건에 의해 배양된 췌도세포를 실험 표본수(N값) 에 맞게 핸드피킹(hand-picking)의 방식으로 수거하여, 1.5 mL 의 E-Tube(Eppendorf tube)에 옮겼다. 4000RPM, 2분동안 원심분리를 하고, 다시 인산 완충액으로 세척을 한 후, 동일 조건에서 다시 한번 원심 분리를 하고 상층액을 제거하였다. 해당 어세이 키트 상에서 제공하는 NRR 버퍼 100㎕를 넣어주고 15분간 4℃에서 정치하고, NMR 버퍼 20 ㎕를 넣어주고 루미노미터(luminometer)로 측정하고(A값), 그 후 10분 동안 상온에서 정치하고 다시 루미노미터로 측정하고(B값), 각 샘플에 다시 ADP-CR 버퍼를 넣어주고, 상온에서 5분 정치 후 재차 루미노미터로 측정(C값)하며, ADP/ATP ratio 값은 (C값-B값)/A값이 된다. 마우스 췌도 (도 3A) 및 인간 췌도 (도 3B) 모두에서 중간엽 줄기세포와 공동배양을 하였을 경우 ADP/ATP 결과가 감소하여, 췌도세포의 퀄리티가 상대적으로 우수함을 증명하였다. ATP/ADP 비율 값이 낮은 췌도세포일 수록 더욱 활성이나 기능이 좋다고 보고 되어져 있다(18).

또한 인슐린 분비능을 검증하는 시험법인 GSIS(glucose-stimulated insulin secretion)를 시행을 한 경우 마찬가지로 마우스 췌도 (도 3C) 및 인간 췌도에서(도 3D) 모두 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우가 대조군과 비교하여 인슐린 분비능이 증진되는 것을 확인하였고, 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포에서 배양한 경 우 더욱 더 우수한 결과를 얻을 수 있었다.

중간엽 줄기세포를 이용하여, 췌도세포 배양액을 제조할 경우, 몇일 동안 중간엽 줄기세포를 배양한 배양액이 췌도세포의 퀄리티 증진에 효과가 있는지를 ADP/ATP 어세이를 통해서 확인해 본 결과(도 3E), 이틀동안 중간엽 줄기세포를 배양한 배양액이 마우스 췌도세포의 퀄리티를 가장 크게 증진 시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한 이렇게 스크리닝 된 이틀 동안 중간엽 줄기세포 배양액을 이용하여 마우스 췌도세포와 1, 2, 3, 5일 동안 각각 배양을 한 후, ADP/ATP 어세이를 한 결과 일반적인 배양액을 이용한 경우에 비해서, 일관적으로 중간엽 줄기세포 배양액을 이용한 그룹에서 우수한 결과를 췌도세포의 퀄리티를 보여주고 있는 것을 확인하였다(도 3F).

실시예 10: 중간엽 줄기세포 배양액의 사이토킨

췌도세포를 배양하기 위한 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양액상에서 검출되는 사이토킨을 엘라이자(ELISA)법으로 스크리닝하였다 (도 4). 췌도세포의 기능 및 활성에 많은 도움을 준다고 기존에 알려진 TGF-beta, HGF, VGEF, IL-6, FGF등이 유의적인 농도로서 검출이 되었다. A) 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 배양액 B) 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 배양액

실시예 11: 췌도세포와 중간엽 줄기세포 공동 배양시 사이토킨의 변화

인간 유래 췌도세포와 중간엽 줄기세포를 공동 배양을 할 때, 배양액상에서의 사이토킨 변화 양상을 관찰하기 위하여, 공동 배양중인 배양액에서 상층액을 수거하여, ELISA법으로 사이토킨의 변화를 관찰하였다(도 5). 대조군은 췌도세포 단독으로 배양한 그룹이고, 실험군은 각각 췌도세포를 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 그룹이다. 결과에서 췌도세포에 긍정적인 영향을 준다고 알려진 IL-6, HGF, VEGF, TGF-BETA, FGF-2가 공동배양시 증가한 것을 확인할 수 있었고, 또한 주목할 만한 것은 전염증사이토킨(pro-inflammatory cytokine)인 인터페론 감마(Interferon-gamma)와 티엔에프 알파(TNF-alpha)가 감소했으므로, 이러한 결과로 인하여, 시험관 배양시 췌도세포의 사멸을 막을 수 있는 기전적인 실마리를 제공한다고 할 수 있다.

실시예 12: 췌도세포와 중간엽 줄기세포 공동배양시 단백질 발현

인간 유래 중간엽 줄기세포와의 공동 배양을 통해서 췌도세포의 기능 및 활성이 증가되는 기전을 확인하기 위해서 웨스턴 블로팅(western-blotting)법을 이용해서 췌도세포 내 단백질 발현을 비교 하였다(도 6). 그 결과, 베타 세포의 증식에 관련된 단백질로써 이미 보고된 바와 같이, P27의 경우 (19,20) 감소할수록, PDX-1의 경우 (21,22) 증가할수록 베타세포의 증식과 연관성이 있다고 알려진 바와 같이 본 실험에서도P27과 PDX-1의 감소와 증가가 관찰되었다. 또한, 이 두 단백질의 상위 신호전달 단백질로 알려진 PI-3K의 발현이 증가함을 (23, 24, 25) 확인하여, P27과 PDX-1의 발현 변화가 상위 신호 단계로부터 유래함을 유추할 수 있고, 이런 신호의 시발이 인간 유래 중간엽 줄기세포로부터 올 수 있음을 시사한다. 이런 결과들을 종합해 볼 때 인간 유래 중간엽 줄기세포와의 공동 배양이 췌도세포 내 베타세포의 증식에 영향을 미침을 간접적으로 확인할 수 있다.

더불어 세포 사멸에 관련된 기전인 CASPASE 단백질의 발현을 억제하는 XIAP (26, 27)의 발현이 증가하는 것으로 보아, 췌도세포의 사멸의 억제효과 또한 유도되는 상태를 확인하였으며, 췌도세포의 스트레스와 관련하여, inflammatory reaction and oxidative stress에 의한 췌도 HSP32와 HSP70의 경우 (28-31) 단백질의 발현이 증가할수록 췌도세포의 활성이 우수하다고 인정되고 있는 결과와 부합되게 증가하는 양상을 보여주었다.

실시예 13: 중간엽 줄기세포를 배양한 액을 이용하여 배양한 췌도세포의 당뇨병 동물모델에서의 효과 검증

시험관적인 시험에서 줄기세포 배양액으로 배양한 췌도세포의 퀄리티가 증진되는 경향을 확인하였고, 이를 생체 내에서도 더욱 우수한 실험성적을 나타낼 수 있는 지를 Streptozotocin(Sigma, St. Louis. MO, USA) 으로 유발된 마우스의 당뇨 모델에서 검증하였다. 동물실험에서의 그 효과를 검증하기 위하여 통하여 실험군과 대조군을 비교하였다. 동물 실험은 각 당뇨 모델로 준비된 마우스의 신장 피막 하에 대조군 췌도세포와 중간엽 줄기세포를 이용하여 제작된 췌도세포 배양액에 의해 배양되어 생물학적 활성이 증가 되었을 것이라 예상되는 췌도세포를 각각 신장 피막하에 이식하여, 당대사 능력 및 체중의 증감을 비교 후, 정착된 췌도세포의 활성 을 비교하였다.

당뇨효과 검증: 시험관적인 시험에서 줄기세포 배양액으로 배양한 췌도세포의 퀄리티가 증진되는 경향을 확인하였고, 이를 생체 내에서도 더욱 우수한 실험성적을 나타낼 수 있는 지를 Streptozotocin(Sigma, St. Louis. MO, USA)으로 유발된 마우스의 당뇨 모델에서 검증하였다. 동물실험에서의 그 효과를 검증하기 위하여 통하여 실험군과 대조군을 비교하였다. 동물 실험은 각 당뇨 모델로 준비된 마우스의 신장 피막 하에 대조군 췌도 세포와 중간엽 줄기세포를 이용하여 제작된 췌도 세포 배양액에 의해 배양되어 생물학적 활성이 증가 되었을 것이라 예상되는 췌도 세포를 각각 신장 피막하에 이식하여, 당대사 능력 및 체중의 증감을 비교 후, 정착된 췌도 세포의 활성을 비교하였다.

① 당뇨 모델 유도

췌도세포 이식의 효과를 검증하기 위한 제 1형 당뇨(Type 1 DM) 마우스 모델의 준비는 Streptozocine (STZ)의 투여로 이루어졌다. 투여를 위한 STZ 용액은 매 투여 당일 Citric buffer에 용해하여 신선한 상태로 준비한다. 마우스는 투여 전일 절식시키고, STZ 투여 직전 혈당을 측정하여 투여 후의 효과 검증을 위한 근거로 확보하였다. STZ는 180 mg/kg의 용량으로 복강투여를 실시한다. 투여 후 먹이는 정상 공급하며, 매일 혈당을 측정하여 당뇨 모델 유도를 확인하였다 (혈당 300mg/dL이상).

② 췌도세포 이식

마우스에서 신장 피막 하 췌도세포의 이식은 ketamine (45mg/kg) 과 xylazine (2.5mg/kg)을 혼합하여 조제한 ketamine 혼합액을 복강 내로 주사하여 유지 마취시킨 후 진행하였다. 유지 마취된 마우스의 등 쪽을 절개하여 신장을 멸균된 면봉을 이용하여 밖으로 꺼내어 가는 유리봉을 이용하여 신장피막을 분리한 후 마이크로인젝터(micro-injector; 자체제작) 췌도세포를 이식하고 다시 신장을 제자리로 넣은 후 절개된 피부를 봉합한다. 그 후 멸균된 방포를 깐 열판 위에서 충분히 회복시켰다.

③ 당대사능력 측정

이식 후 실험군과 대조군 마우스에서 평소 혈당의 측정과 IPGTT(Intraperitoneal Glucose Tolerance Testing) 를 이용하여 당대사 능력의 차이를 확인하였다.

④ 체중 측정

이식 후 실험군과 대조군 마우스에서 체중 증감을 관찰함으로서, 이식된 췌도세포의 활성을 간접적으로 확인하였다.

중간엽 줄기세포 배양액으로 48시간 동안 배양한 마우스 췌도세포를 마우스의 신장 피막하에 이식하여, 2주 동안 혈당 변화를 관찰한 결과, 일반적인 배양액을 이용한 대조군에 비교하였을 때, 계속적으로 낮은 혈당을 유지하였으므로, 대조군에 비해 우수한 혈당 조절능을 가지고 있는 것을 마우스 생체 내에서 확인하였다(도 7A). 또한 체중변화를 관찰한 결과, 중간엽 줄기세포를 배양한 액에서 배양 한 췌도세포를 이식한 그룹에서는 체중이 정상적으로 증가하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 7B). 또한 이식된 췌도세포의 기능을 확인하기 위해서 실시한 당부하능 검사(IPGTT; Intraperitoneal Glucose Tolerance Testing) 에서도 대조군에 비해서 중간엽 줄기세포를 배양한 액에서 배양한 췌도세포를 이식한 그룹이 더욱 더 우수한 성적을 보여주는 것을 확인하였다(도 7C).

참고 문헌:

1. Henning BJ, Kandaswamy R, Harmon JV, Ansite JD, Clemmings SM, Sakai T, Paraskevas S, Eckman PM, Sageshima J, Nakano M, Sawada T, Matsumoto I, Zhanng HJ, Sutherland DE, Bluestone JA: Transplantation of cultured islet from two-layer preserved pancreases in type 1 diabetes with anti-CD3 anti-body. AM. J. Transplant. 4:390-401, 2004.

2. Baidal DA, Froud T, Ferreira JV, Khan A, Alejandro R, Ricor　 di C : The bag method for islet cell infusion. Cell Transplant. 1:809-813, 2003

3. Hering BJ, Kandaswamy R, Ansite JD, Eckman PM, Nakano M, Sawada T, Matsumoto I, Ihm SH, Zhang HJ, Parkey J, Hunter DW, Sutherland DE. : Single-donor, marginal-dose islet transplantation in patients with type 1 diabetes. JAMA. 293:830-835, 2005.

4. Barshes NR, Lee T, Goodpasture S, Brunicardi FC, Alejandro R, Ricordi C, Soltes G, Barth M, Hamilton D, Goss JA. : Achievement of insulin independence via pancreatic islet transplantation using a remote isolation center. A first-year review. Transplant. Proc. 36:1127-1129, 2004.

5. Goss JA, Goodpastor SE, Brunicardi FC, Barth MH, Soltes GD, Garber AJ, Hamilton DJ, Alejandro R, Ricordi C.: Development of a human pancreatic islet-transplant program through a collaborative relationship with a remote islet-isolation center. Transplantation. 77:462-466, 2004.

6. Vasavada RC, Gonzalez-Pertusa JA, Fujinaka Y, Fiaschi-Taesch N, Cozar-Castellano I, Garcia-Ocana A.: Growth factors and beta cell replication. Int J Biochem Cell Biol. 38(5-6):931-50, 2006.

7. Brissova M, Shostak A, Shiota M, Wiebe PO, Poffenberger G, Kantz J, Chen Z, Carr C, Jerome WG, Chen J, Baldwin HS, Nicholson W, Bader DM, Jetton T, Gannon M, Powers AC. : Pancreatic islet production of vascular endothelial growth factor-a is essential for islet vascularization, revascularization, and function. Diabetes. 55(11):2974-85, 2006.

8. Lai Y, Schneider D, Kidszun A, Hauck-Schmalenberger I, Breier G, Brandhorst D, Brandhorst H, Iken M, Brendel MD, Bretzel RG, Linn T. : Vascular endothelial growth factor increases functional beta-cell mass by improvement of angiogenesis of isolated human and murine pancreatic islets. Transplantation. 15;79(11):1530-6, 2005.

9. Shimizu H, Ohtani K, Kato Y, Mori M. : Interleukin-6 increases insulin secretion and preproinsulin mRNA expression via Ca2+-dependent mechanism. J. Endocrinol.　Jul;166(1):121-6, 2000.

10. Choi SE, Choi KM, Yoon IH, Shin JY, Kim JS, Park WY, Han DJ, Kim SC, Ahn C, Kim JY, Hwang ES, Cha CY, Szot GL, Yoon KH, Park CG. : IL-6 protects pancreatic islet beta cells from pro-inflammatory cytokines-induced cell death and functional impairment in vitro and in vivo. Transpl. Immunol. Jun-Jul;13(1):43-53, 2004.

11. Hanley S, Rosenberg L. (2007) Transforming growth factor beta is a critical regulator of adult human islet plasticity. Mol Endocrinol. 21(6):1467-77.

12. Izumida Y, Aoki T, Yasuda D, Koizumi T, Suganuma C, Saito K, Murai N, Shimizu Y, Hayashi K, Odaira M, Kusano T, Kushima M, Kusano M. (2005) Hepatocyte growth factor is constitutively produced by donor-derived bone marrow cells and promotes regeneration of pancreatic beta-cells. Biochem Biophys Res Commun. 8;333(1):273-282.

13. Caplan AI, Dennis JE.: Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. Cell Biochem. 1;98(5):1076-84, 2006

14. Miki A, Narushima M, Okitsu T, Takeno Y, Soto-Gutierrez A, Rivas-Carrillo JD, Navarro-Alvarez N, Chen Y, Tanaka K, Noguchi H, Matsumoto S, Kohara M, Lakey JR, Kobayashi E, Tanaka N, Kobayashi N. : Maintenance of mouse, rat, and pig pancreatic islet functions by coculture with human islet-derived fibroblasts. Cell Transplantation 15(4):325-34, 2006.

15. Ryan EA, Paty BW, Senior PA, Bigam D, Alfadhli E, Kneteman NM, Lakey JR, Shapiro AM. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 2005 Jul;54(7):2060-9.

16. Bieback K, Kern S, Kluter H, Eichler H. (2004) Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells. 22(4):625-34.

17. Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, et al. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes 1988; 37: 413.

18. Goto M, Holgersson J, Kumagai-Braesch M, Korsgren O. The ADP/ATP ratio: A novel predictive assay for quality assessment of isolated pancreatic islets. Am J Transplant. 2006 Oct;6(10):2483-7.

19. Rachdi L, Balcazar N, Elghazi L, Barker DJ, Krits I, Kiyokawa H, Bernal-Mizrachi E. (2006) Differential effects of p27 in regulation of beta-cell mass during development, neonatal period, and adult life. Diabetes. 55(12):3520-8.

20. Georgia S, Bhushan A. (2006) p27 regulates the transition of beta-cells from quiescence to proliferation.Diabetes. 55(11):2950-6.

21. Feanny MA, Fagan SP, Ballian N, Liu SH, Li Z, Wang X, Fisher W, Brunicardi FC, Belaguli NS. (2008) PDX-1 expression is associated with islet proliferation in vitro and in vivo. J Surg Res. 144(1):8-16.

22. Melloul D. (2004) Transcription factors in islet development and physiology: role of PDX-1 in beta-cell function. Ann N Y Acad Sci. 1014:28-37.

23. Liang J, Slingerland JM. (2003) Multiple roles of the PI3K/PKB (Akt) pathway in cell cycle progression. Cell Cycle. 2(4):339-45.

24. Brandts CH, Bilanges B, Hare G, McCormick F, Stokoe D. (2005) Phosphorylation-independent stabilization of p27^kip1 by the phosphoinositide 3-kinase pathway in glioblastoma cells. J Biol Chem. 21;280(3):2012-9.

25. Buteau J, Roduit R, Susini S, Prentki M. (1999) Glucagon-like peptide-1 promotes DNA synthesis, activates phosphatidylinositol 3-kinase and increases transcription factor pancreatic and duodenal homeobox gene 1 (PDX-1) DNA binding activity in beta (INS-1)-cells. Diabetologia. 42(7):856-64.

26. Emamaullee JA, Rajotte RV, Liston P, Korneluk RG, Lakey JR, Shapiro AM, Elliott JF. (2005) XIAP overexpression in human islets prevents early posttransplant apoptosis and reduces the islet mass needed to treat diabetes. Diabetes. 54(9):2541-8.

27. Related Articles, LinksPlesner A, Liston P, Tan R, Korneluk RG, Verchere CB. (2005) The X-linked inhibitor of apoptosis protein enhances survival of murine islet allografts. Diabetes. 54(9):2533-40.

28. Johannesen J, Pociot F, Karlsen AE, Mandrup-Poulsen T, Nerup J. (2001) Strain-dependent difference in inducible nitric oxide synthesis (iNOS) expression in rat pancreatic islets correlates with interferon regulating factor 1 (IRF-1) and heat shock protein 70 (HSP70) expression. Eur Cytokine Netw. 12(3):501-9.

29. Margulis BA, Sandler S, Eizirik DL, Welsh N, Welsh M. (1991) Liposomal delivery of purified heat shock protein hsp70 into rat pancreatic islets as protection against interleukin 1 beta-induced impaired beta-cell function. Diabetes. 40(11):1418-22.

30. Related Articles, LinksLi YX, Li G, Dong WP, Lu DR, Tan JM. (2006) Protection of human islets from induction of apoptosis and improved islet function with HO-1 gene transduction. Chin Med J (Engl). 119(19):1639-45.

31. Lee SS, Gao W, Mazzola S, Thomas MN, Csizmadia E, Otterbein LE, Bach FH, Wang H. (2007) Heme oxygenase-1, carbon monoxide, and bilirubin induce tolerance in recipients toward islet allografts by modulating T regulatory cells. FASEB J. 21(13):3450-7.

도 1은 인간 유래 중간엽 줄기세포와 췌도세포를 공동 배양한 경우와 기존에 이용되는 배양액들에 췌도세포를 배양한 후 사멸되지 않고 살아 있는 췌도세포의 수를 비교하여 나타낸 것이다.

도 2는 마우스 췌도세포를 인간유래 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우와 중간엽 줄기세포 없이 배양한 경우에 있어서 AO/PI 염색 결과를 비교한 것이다.

도 3은 인간 또는 마우스 췌도세포를 인간유래 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우와 중간엽 줄기세포 없이 배양한 경우 (대조군: control)에 있어서 ADP/ATP 어세이 결과 및 인슐린 인덱스를 비교하고, 또한 중간엽 줄기세포를 이용해 제작한 췌도세포 배양액의 확립 및 그를 이용한 췌도배양에 있어 일자별 ADP/ATP 어세이 결과를 확인하였다. BM-MSC: 골수유래 중간엽줄기세포, CB-MSC:제대혈 유래 중간엽 줄기세포

도 4는 췌도세포를 배양하기 위한 인간유래 중간엽 줄기세포 배양액상에서 검출되는 사이토킨을 엘라이자(ELISA)법으로 스크리닝한 결과이다. A) 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 배양액 B) 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 배양액

도 5는 인간 유래 췌도세포와 중간엽 줄기세포를 공동 배양을 할 때, 배양액상에서의 사이토킨 변화 양상을 ELISA법으로 관찰한 것이다.

도 6은 췌도세포를 인간 유래 중간엽 줄기세포와 공동배양할 때와 중간엽 줄기세포 없이 배양할 때, 췌도세포 내의 단백질 발현을 비교한 것이다.

도 7은 중간엽 줄기세포를 배양한 액을 이용하여 배양한 췌도세포의 당뇨병 동물모델에서의 효과를 검증한 결과이다.

Claims (7)

1. 췌도세포의 배양시 중간엽 줄기세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포 생존률을 높이는 방법.
2. 췌도세포의 배양시 중간엽 줄기세포와 공동배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포의 기능 또는 활성을 유지하는 방법.
3. 중간엽 줄기세포를 배양하고 그의 상등액을 취하는 단계 및 상기 상등액에 췌도세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포 생존률을 높이는 방법.
4. 중간엽 줄기세포를 배양하고 그의 상등액을 취하는 단계 및 상기 상등액에 췌도세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양시 췌도세포의 기능 또는 활성을 유지하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포가 골수 유래 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
6. 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양액.
7. 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 췌도세포 배양용 키트.

Images