KR20170016360A - 폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역원성을 증진시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다당류 항원의 면역원성을 증진시키는 조성물 및 그 방법을 제공한다. 유니버셜(universal) 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신이 제공된다. 상기 조성물의 제조 방법, 및 세균 감염증을 치료하거나 예방하는 방법도 제공된다. 상기 조성물 및 방법은 유아, 고령자 및 면역약화자(immunocompromised individual)의 면역 반응을 증진시키는데 유용하다.

Description

폴리사카라이드-단백질 접합체의 면역원성을 증진시키는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF ENHANCING IMMUNOGENICITY OF POLYSACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATES}
관련 출원의 상호 참조
본원은 2014년 5월 11일자로 출원된 중국 특허 출원 제201410198533.5호를 우선권 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
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기술분야
본 발명은 면역학 및 백신학 분야에 관한 것으로, 특히 다당류-단백질 접합체의 면역원성을 증진시키는 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.
담체 단백질에 대한 다당류의 공유 결합 접합에 의해, 다당류를 합텐으로부터 면역원으로 변환시켜(예를 들어, 소아), 다당류의 면역원성을 증진시킬 수 있다. 이러한 다당류-단백질 접합체를 기제로 하는 백신은 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae(Pn)), 수막염균(Neisseria meningitidis(Men)), 및 b형 인플루엔자균(Haemophilus influenzae type b(Hib))에 의한 세균 감염증을 예방하기 위해 소아들 사이에서 널리 사용되어 왔다.
파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체 CRM197, 및 Hib의 재조합 표면 단백질 D를 비롯한 각종 담체 단백질이 다당류-단백질 접합체를 제조하는데 사용되어 왔다. 그러나, 다양한 담체 단백질의 다양한 면역학적 특성으로 인해, 다양한 담체 단백질에 접합된 동일한 다당류는 면역 동물에서 다양한 면역원성을 나타낼 수 있다. 따라서, 다양한 기술을 이용하여 생산된 담체 단백질은 다양한 면역원성의 다당류-단백질 접합체 백신을 만들어 낼 수 있다.
면역원이 동물 체내에 들어가면, 항원제시세포(Antigen Presenting Cell; APC)에 의해 APC 내의 에피토프로 처리되는데, 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex; MHC)에 혼입되어 APC의 표면에 발현되고 T 림프구에 의해 인식되는 것으로 면역학에 잘 확립되어 있다. 세 가지 요인이 주어진 에피토프의 면역원성에 기여한다: (1) 적절한 에피토프의 생성; (2) 에피토프에 결합되는 MHC 분자의 발현; (3) MHC-에피토프 복합체를 인식하는 T 세포 수용체의 발현. 이러한 세 가지 요인 중 어느 하나가 결여되면, 면역원에 대한 면역 반응의 결손 또는 손실을 초래한다.
마우스에서의 실험에 의해, 적절한 MHC-에피토프 복합체의 결여가 면역원에 대한 면역 반응의 손실의 가장 일반적인 원인인 것으로 밝혀졌다. MHC 분자는 고도의 다형성을 나타낸다. 각각의 에피토프는 MHC 분자의 하나 또는 여러 개의 대립유전자와 복합체를 형성할 수 있으나, 에피토프는 MHC 분자의 모든 대립유전자와는 복합체를 거의 형성할 수 없다. 게다가, 면역원의 부적절한 처리 또는 T 세포 관용의 결여는 면역 반응의 손실을 초래할 수 있다.
실험에 의해, 파상풍 톡소이드의 3개의 에피토프 중 2개, 즉, QYIKANSKFIGITEL(P2로 명명됨) 및 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(P30으로 명명됨) 에피토프, 및 오브알부민의 ISQAVHAAHAEINEAGR(OVAp로 명명됨) 에피토프가 다수의 다양한 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있다(Panina-Bordignono P et al. (1989) "Universally immunogenic T cell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells." Eur. J. Immunol. 19: 2237-2242). 이러한 에피토프는 T 세포에 의해 인식될 수 있으며, 보편적인 면역원성을 나타낸다. 따라서, 이러한 에피토프는 유니버셜(universal) 에피토프로 명명된다.
유니버셜 에피토프는 다수의 인간 MHC 클래스 II 분자 동종형 및 대립유전자형에 결합할 수 있다. 이러한 유니버셜 에피토프의 보편적인 MHC 결합 특성은 집단의 대다수의 개체에서의 면역 반응을 유발할 수 있는 백신을 개발하는데 이용될 수 있다.
연구 조사에 의해, P2 에피토프가 파상풍 톡소이드의 아미노산 830-844(QYIKANSKFIGITE(서열 번호 1))로 구성되는 것으로 입증되었다. P30 에피토프는 파상풍 톡소이드의 아미노산 947-967(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(서열 번호 2))로 구성된다. OVAp 에피토프는 오브알부민의 아미노산 323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR(서열 번호 3))로 구성된다. APC에 의해 섭취되면, 이러한 에피토프 서열을 갖는 단백질은 분해되지만, 에피토프는 보존되고, MHC 분자에 결합되어, APC의 표면에 발현되며, T 세포에 의해 인식된다. 이러한 유니버셜 에피토프는 동일한 메커니즘을 통해 여러 종류의 HLA-DR과 상호 작용할 수 있다.
MHC 분자는 처리된 면역원의 수용체이며, 이의 주요 기능은 흉선에서 외인성 면역원에 대하여 면역관용 및 말초 면역 반응의 유도 시에 면역원으로부터 유래되는 에피토프를 발현하는 것이다. 한편으로는, MHC 분자가 다수의 특정한 에피토프를 발현하는 경우, 면역원의 T 세포 인식의 레벨 상승이 예측되지만, 대부분의 T 세포 공급원을 고갈시켜가며, 면역관용을 유도한다. 다른 한편으로는, MHC 분자가 다만 소수의 특정한 에피토프를 발현하는 경우, T 세포 공급원은 보존되지만, 극히 일부의 외인성 면역원 만이 효과적으로 말초 면역 반응을 일으키는 것으로 나타날 수 있다. 따라서, 외인성 면역원 유래의 유효한 에피토프로, MHC 분자가 발현되는 에피토프 수의 밸런스를 유지할 수 있어야 한다. 소수의 대표적인 에피토프를 갖는 면역원이 존재하는데, APC로 처리된 후에, 고도의 서열 완전성(sequence integrity)을 보존하며, 지나치게 많은 T 세포를 고갈시키지 않고서 일정량의 T 세포가 면역 기억을 확립하게 하여 면역관용을 유도할 수 있다. 이러한 에피토프를 갖는 면역원은 강한 면역원성을 가지며, 이러한 현상은 파상풍 톡소이드가 매우 강한 면역원성을 갖는 이유를 설명해준다.
현재 알려진 대부분의 T 세포 에피토프는 비특이적 MHC 클래스 II 하플로타입과의 면역원성 기능(immunogenic function)이 한계가 있다. 다양한 개체가 동일한 면역원 내의 다양한 에피토프 서열을 보존하고 발현하여, 이들의 T 세포를 작동시킨다. 다양한 MHC 클래스 II 하플로타입을 갖는 집단에서 T 세포를 유도하기 위한 대부분의 에피토프의 이러한 유전적 한계로, 합성 백신의 개발이 크게 억제된다. 다양한 MHC 클래스 II 하플로타입을 갖는 개체를 유도할 수 있는 에피토프의 발견으로(예컨대, 마우스 및/또는 인간에서), T 세포를 활성화하기 위한 보편적인 계획을 기대하게 된다. 유니버셜 에피토프, 예컨대 P2, P30, OVAp 등은 천연 단백질 면역원에 포함될 수 있다. 융합된 엔터티(fused entity)는 T 세포 항원 클러스터로 알려져 있으며, 대부분의 개체에서 MHC 클래스 II 분자에 의해 인식될 수 있다. 이러한 T 세포 항원 클러스터를 직접 사용하여, T 세포를 유도시키거나, 약한 면역원에 대하여 B 세포에 의한 항체 생산을 촉진시켜, 면역 반응을 증강시킬 수 있다.
병원성 세균은 통상 세균 세포 표면을 피포화(encapsulation)하는 고분자량 협막 다당류(CP)를 발현한다. 협막 다당류는 성인에 대한 우수한 면역원이며, 유효한 백신을 제조하는데 사용될 수 있다. 그러나, 소아, 특히 2세 미만의 유아에 대해서는, CP는 T 세포 비의존성 항원으로 간주된다. 실험에 의해, CP가 야생형 및 T 세포 결손 마우스에서의 CP 특이적 IgM 항체의 생산을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, CP는 IgM 항체의 IgG 항체로의 변환을 유도할 수 없다. 인간으로부터의 데이터에 의해서도, CP가 성인에서는 방어 항체의 생산을 유도할 수 있지만, CP가 아기 및 유아에서는 면역 반응을 유도할 수 없는 것으로 입증된다. 구체적으로는, CP 항원을 사용한 소아의 반복된 백신 접종 후에, 두 번째 백신 접종에 대해서도 반응이 증강되지 않고, 이러한 백신 접종에 의해 유도되는 T 세포 기억도 지속되지 않는다.
면역학적 실험에 의해, 다당류-단백질 접합체를 기제로 하는 백신이 다당류-단백질 접합체와 관련된 유도된 체액성 면역 반응으로 인해 순수한 다당류를 기제로 한 백신보다 유리한 것으로 밝혀졌다. T 세포 비의존성 CP 항원은 담체 단백질에 공유 결합되어, 다당류-단백질 접합체를 제공할 수 있다. 이러한 다당류-단백질 접합체를 사용한 포유동물의 예방접종에 의해, T 세포를 유도하여 B 세포에 의한 CP 특이적 IgG 항체의 생산을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 다당류-단백질 접합체는 CP 특이적 IgM의 IgG로의 변환, 기억 B 세포의 분화, 및 장기간의 T 세포 기억의 성립을 유도할 수 있다.
다당류 접합체를 기제로 하는 백신은 중증 감염증, 예컨대 b형 인플루엔자균, 폐렴연쇄구균 및 수막염균을 예방하는데 중요한 역할을 해왔다. 그러나, 다당류-단백질 접합체를 기제로 하는 현재의 백신은 특이적 다당류 및 면역원성 담체 단백질의 구조 변화때문에 이의 면역원성이 크게 변동된다. 특정한 고위험 집단, 예컨대 소아, 고령자 및 면역약화자(immunocompromised individual)에서, 면역원성이 약한 다당류의 단백질 접합체는 일반적으로 효과적이지 않으며, 이의 예방 효과는 다소 제한적이다. 따라서, 면역원성이 더욱 강한 다당류-단백질 접합체를 기제로 하는 백신의 개발이 여전히 당해 분야에서 매우 필요한 부문이다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 공보 및 특허 출원서는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 사용하여, 다당류 항원의 면역원성을 증진시키는 조성물 및 그 방법을 제공한다. 다당류-키메라 담체 단백질 접합체를 기제로 하는 면역원성 조성물 및 백신, 세균 감염증의 치료 방법, 및 다당류-키메라 담체 단백질 접합체의 제조 방법이 추가로 제공된다.
본원의 한 측면에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합되는 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피(copy)의 유니버셜 에피토프를 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 길이가 약 8 내지 약 20개의 아미노산으로 되어 있다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합된다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 디프테리아 독소의 CRM197의 사슬 A로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 글리신 폴리머, 글리신-세린 폴리머, 글리신-알라닌 폴리머, 또는 알라닌-세린 폴리머로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 가요성 링커이다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 길이가 1 내지 20개의 아미노산 잔기로 되어 있다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 39 내지 44로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 51 내지 56으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 평균 분자량이 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa(예컨대, 약 10 kDa 내지 약 100 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 또는 약 500 kDa 내지 약 1000 kDa 중 어느 하나)이다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다.
상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 협막 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 협막 다당류는 b형 인플루엔자균(Hib)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 협막 다당류는 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 수막염균으로부터 유래된다.
본원의 한 측면에서, 상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체는 서로 상이한 담체 단백질을 포함한다.
본 명세서에 기재된 면역원성 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체는 서로 상이한 세균종으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다.
본 명세서에 기재된 면역원성 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 동일종의 상이한 혈청형의 세균으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 13개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 24개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 4개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다.
상술한 면역원성 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 애주번트는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄이다.
본원의 한 측면에서, 상술한 면역원성 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신이 제공된다.
본원의 한 측면에서, 상술한 면역원성 조성물 중 어느 하나 또는 상술한 백신 중 어느 하나의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 다당류 항원이 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체인, 세균에 의한 질환에 대하여 개체를 예방접종하는 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 적어도 2회의 용량으로 개체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 폐렴연쇄구균으로 인한 폐렴, 이염(ear infection), 부비동염, 수막염, 또는 균혈증이다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 b형 인플루엔자균에 의한 수막염, 폐렴, 후두개염, 봉와직염, 관절염, 또는 이염이다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 수막염균에 의한 수막염 또는 수막염균혈증이다.
상술한 예방접종 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 개체는 다당류 항원에 대한 면역 반응이 양호하지 못하다.
상술한 예방접종 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 개체는 약 2세 미만의 소아, 고령자(예컨대, 약 65세 이상의 사람), 또는 면역약화자이다.
본원의 한 측면에서, 세균에 의한 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 상술한 면역원성 조성물 중 어느 하나 또는 상술한 백신 중 어느 하나의 용도 - 여기서, 다당류 항원은 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체임 - 가 제공된다.
본원의 한 측면에서, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나의 제조 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
상술한 제조 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 다당류 항원을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
상술한 제조 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 34 내지 38로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 46 내지 50으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 58 내지 63으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
상술한 제조 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli) 또는 효모이다.
상술한 제조 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 키메라 담체 단백질을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
상술한 제조 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 환원적 아미노화, 시안화(cyanylation) 접합, 또는 카르보다이이미드 반응에 의해 키메라 담체 단백질에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 1-시아노-4-다이메틸암모늄피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 아디프산 다이하이드라자이드(ADH) 링커를 통해 키메라 담체 단백질에 접합된다.
상술한 제조 방법 중 어느 하나에 따른 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 접합된 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 단리하여 다당류-단백질 접합체를 얻는 단계를 추가로 포함한다.
또한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나, 면역원성 조성물 중 어느 하나, 또는 상술한 백신 중 어느 하나의 약제학적 조성물, 키트 및 제조품이 제공된다.
본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면, 및 이점은 후속하는 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다. 본원에 기재된 다양한 실시 형태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부를 조합하여, 본 발명의 다른 실시 형태를 형성할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 용어는 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 것으로서 본 명세서에 사용된다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 측면 및 실시 형태는 측면 및 실시 형태로 "이루어지는" 및/또는 "실질적으로 이루어지는"를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서의 "약" 값 또는 파라미터에 관한 언급은 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 변화량을 포함한다(기술한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 표현은 "X"의 표현을 포함한다.
본 명세서에 사용되는, 값 또는 파라미터가 "아니다"에 관한 언급은 일반적으로, 그 값 또는 파라미터 "이외의" 것을 의미하며 이를 나타낸다. 예를 들어, 방법이 타입 X의 암을 치료하는데 사용되지 않는다는 것은 상기 방법이 X 이외의 타입의 암을 치료하는데 사용된다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수형 "부정관사(a)", "또는" 및 "정관사(the)"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.
본 발명은 키메라 담체 단백질, 및 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체를 제공한다. 키메라 담체 단백질은 면역원성 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함한다. 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신, 및 다당류-단백질 접합체의 제조 방법도 제공된다. 유니버셜 에피토프를 포함하지 않는 담체 단백질에 대한 동일한 다당류 항원의 대응하는 접합체와 비교하여, 본 명세서에 기재된 다당류-단백질 접합체는 면역원성이 적어도 약 3 내지 5배 증가된다. 다당류-단백질 접합체는 개체, 특히 유아, 고령자 및 기타 면역체계가 약화된 개체 간에 세균 감염증을 예방하기 위한 백신으로서 유용하다.
따라서, 한 측면에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합되는 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
다당류-단백질 접합체
한 측면에서의 본 발명은 하나 이상의 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 포함하는 면역원성이 증진된 다당류-단백질 접합체를 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 접합되는(공유 결합으로 접합되는) 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함). 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체 - 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하고, 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 접합됨(공유 결합으로 접합됨) - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체 - 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하고, 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래되고, 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 접합됨(공유 결합으로 접합됨) - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체 - 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하고, 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 접합됨(공유 결합으로 접합됨) - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체 - 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32, 39 내지 44, 및 51 내지 56으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 접합됨(공유 결합으로 접합됨) - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
본 명세서에 기재된 다당류-단백질 접합체는 다당류 항원을 포함한다. 용어 "다당류"는 글리코사이드 결합에 의해 함께 공유 결합되는 다수의(예를 들어, 약 9개 보다 많은) 단당류(예를 들어, 반복) 단위로 구성되는 폴리머 탄수화물 분자를 지칭한다. 화학 또는 생화학(예를 들어, 효소 소화) 반응에 의한 다당류의 글리코사이드 결합의 가수분해에 의해, 구성 단당류 또는 올리고당을 생성할 수 있다. 단당류는 Cx(H2O)y(여기서, x 및 y는 전형적으로 약 3 이상 약 10 이하인 정수이다)의 화학식을 갖는 분자를 포함한 단당 분자, 및 이의 변형된 분자, 예컨대 아미노당(예를 들어, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민)이다. 올리고당은 소수(예를 들어, 약 3개 내지 약 9개)의 단당류를 포함하는 폴리머이다. 본 명세서에 사용되는 "다당류", "PS"는 천연 유래의 전장(full length) 다당류 분자, 전장 다당류 분자의 가수분해 생성물(단당류, 올리고당 및 다당류 종류 포함)의 임의의 조합의 혼합물, 전장 다당류 분자 또는 이의 가수분해 생성물의 화학적으로 변형되거나 작용화된 유도체, 또는 이들의 조합을 지칭할 수 있다. 다당류는 선상 또는 분지상 단일 화학종 또는 관련 화학종(예컨대, 동일한 기본 단당류 단위를 갖지만, 상이한 수의 반복체를 갖는 분자)의 혼합물일 수 있다.
용어 "다당류 항원" 또는 "PS 항원"은 면역 반응, 예컨대 PS 특이적 항체 생산을 유도할 수 있는 다당류(동일한 다당류 분자로부터 유래되는 관련 다당류 종류의 혼합물 포함)를 지징한다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 단독은 T 세포 비의존성 면역 반응, 또는 면역 기억을 갖지 않는 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 단독은 PS 항원으로 예방접종된 개체(예컨대, 면역약화자, 유아 또는 고령자)에게서 강력하거나(높은 항 PS 항체 역가(antibody titer) 및/또는 PS 항원에 대한 높은 항체 친화성을 지님) 지속적인(long-lasting) 면역 반응을 유도하지 않는다. "강력한", "높은" 및 "지속적인"은 개체에게서 PS 항원을 갖는 병원체(예컨대, 세균)에 의한 감염증 및/또는 상기 감염증과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나, 개선시키거나, 둔화시키거나, 지연시키도록 어느 정도까지 예방하기에 충분한 레벨 또는 양을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 평균 분자량이 적어도 약 10 kDa, 약 50 kDa, 약 100 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa, 약 300 kDa, 약 400 kDa, 약 500 kDa, 약 600 kDa, 약 700 kDa, 약 800 kDa, 약 900 kDa, 약 1000 kDa 또는 그 이상 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 평균 분자량이 약 10 kDa 내지 약 50 kDa, 약 50 kDa 내지 약 100 kDa, 약 100 kDa 내지 약 150 kDa, 약 150 kDa 내지 약 200 kDa, 약 200 kDa 내지 약 250 kDa, 약 250 kDa 내지 약 300 kDa, 약 300 kDa 내지 약 400 kDa, 약 400 kDa 내지 약 500 kDa, 약 500 kDa 내지 약 600 kDa, 약 600 kDa 내지 약 700 kDa, 약 700 kDa 내지 약 800 kDa, 약 800 kDa 내지 약 900 kDa, 약 900 kDa 내지 약 1000 kDa, 약 10 kDa 내지 약 100 kDa, 약 10 kDa 내지 약 250 kDa, 약 10 kDa 내지 약 500 kDa, 약 100 kDa 내지 약 250 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 약 10 kDa 내지 약 750 kDa, 약 500 kDa 내지 약 750 kDa, 약 500 kDa 내지 약 1000 kDa, 약 250 kDa 내지 약 750 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 평균 분자량이 약 10 kDa 내지 약 10000 kDa(예컨대, 약 10 kDa 내지 약 100 kDa, 약 100 kDa 내지 약 500 kDa, 또는 약 500 kDa 내지 약 1000 kDa 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류이다. 본 명세서에 사용되는 "협막 다당류" 또는 "CP"는 세균 또는 미생물의 표면을 감싸는 세균종 또는 다른 미생물(예컨대, 진균 또는 조류(alga))에 의해 생성되는 다당류 분자를 지칭한다. 각각의 세균종 또는 미생물종은 아종을 포함할 수 있으며, 각각은 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 특이한 화학 구조의 CP 및/또는 조성물(예컨대, 단당류 및/또는 단당류 간의 결합)을 생산할 수 있다. 본 발명에서, "다당류" 또는 "PS"는 "협막 다당류" 또는 "CP"를 지칭하는데 사용될 수 있으나, 본 명세서에 기재된 다당류 또는 다당류 유도체(예컨대, 다당류-단백질 접합체)는 협막 다당류 또는 이의 CP 유도체에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래되는 반복 단당류 또는 올리고당 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 화학적으로 변형된 CP 또는 이의 단편(예컨대, 반복 단당류 또는 올리고당 단위)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 병원성 세균으로부터 유래되는 협막 다당류이다. 본 발명에 의해 고려되는 병원성 세균으로는 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn) 및 수막염균(Men) - 모든 이들의 아종, 혈청형, 종류, 군(group), 균주 및 변이 포함 - 을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 폐렴연쇄구균의 90개 이상의 혈청형 및 수막염균의 12개 이상의 혈청형이 동정되어 있으며, 각각의 혈청형은 특이한 협막 다당류와 관련되어 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류이다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib)으로부터 유래되는 협막 다당류이다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 협막 다당류이다. 일부 실시 형태에서, 다당류-단백질 접합체는 하나 이상의(예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상 중 어느 하나) 상이한 다당류 항원, 예컨대 동일한 세균종의 상이한 혈청형의 다당류 항원을 포함한다.
다당류은 항원은 키메라 담체 단백질의 임의의 아미노산 잔기에 공유 결합으로 접합되거나 공유 결합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 아미노기(예컨대, 라이신의 곁사슬) 또는 설프하이드릴기(예컨대, 시스테인 잔기의 곁사슬)에 공유 결합된다. 일부 실시 형태에서, 가요성 유기 링커는 다당류 항원과 키메라 담체 단백질 사이에 배치된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질의 하나 이상의 잔기(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상 중 어느 하나)는 다당류 항원 분자에 공유 결합된다. 다당류 항원(즉, 전체 다당류 항원 분자) 대 키메라 담체 단백질의 상대 비율(중량 당 중량)은 바람직한 면역원성 효능을 달성하는데 중요할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.2, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.2, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.75, 약 2 또는 그 이상 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.2 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 약 0.8, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 약 1.1 내지 약 1.2, 약 0.6 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.2, 약 1.2 내지 약 1.5, 약 1.5 내지 약 2, 약 1.0 내지 약 1.4, 약 0.8 내지 약 1.2, 약 0.6 내지 약 1.5, 약 0.2 내지 약 1.0, 또는 약 1.0 내지 약 2.0 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.0이다. 일부 실시 형태에서, 다당류-단백질 접합체 중의 다당류 항원의 중량 백분율은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 42%, 약 44%, 약 46%, 약 48%, 약 50%, 약 52%, 약 54%, 약 56%, 약 58%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 그 이상 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류-단백질 접합체 중의 다당류 항원의 중량 백분율은 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 44%, 약 44% 내지 약 46%, 약 46% 내지 약 48%, 약 48% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 52%, 약 52% 내지 약 54%, 약 54% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 80%, 약 44% 내지 약 49%, 약 49% 내지 약 54%, 또는 약 44% 내지 약 54% 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류-단백질 접합체 중의 키메라 담체 단백질의 중량 백분율은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 42%, 약 44%, 약 46%, 약 48%, 약 50%, 약 52%, 약 54%, 약 56%, 약 58%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 그 이상 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 다당류-단백질 접합체 중의 키메라 담체 단백질의 중량 백분율은 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 46%, 약 46% 내지 약 48%, 약 48% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 52%, 약 52% 내지 약 54%, 약 54% 내지 약 56%, 약 56% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 80%, 약 46% 내지 약 51%, 약 51% 내지 약 56%, 또는 약 46% 내지 약 56% 중 어느 하나이다.
본 명세서에 기재된 다당류-단백질 접합체는 다당류-단백질 접합체 분자의 단일종 또는 관련 다당류-단백질 접합체 분자종의 혼합물을 포함할 수 있으며, 여기서 관련 PS-단백질 접합체 종은 동일한 키메라 담체 단백질, 및 동일한 공급원(예컨대, 동일한 세균종, 동일한 협막 다당류 등)으로부터 유래된 PS 항원을 포함하나, PS 항원의 정확한 화학 구조(각각의 PS 항원 분자의 길이, 이의 반복 단위의 화학적 성질, 이의 반복 단위수 등 포함), 키메라 담체 단백질의 결합 위치(들), 및/또는 키메라 담체 단백질에 대한 PS 항원 분자의 수는 상이한 다당류-단백질 접합체 분자 간에 다를 수 있다. 따라서, 상술한 다당류-단백질 접합체의 특성은 PS-단백질 접합체 분자의 평균값을 나타낼 수 있다.
키메라 담체 단백질
본 명세서에 기재된 다당류-단백질 접합체는 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 포함한다.
또한 본원에 의해, 항원(예컨대, 다당류 항원)에 접합되어, 면역원성이 증진된 항원-단백질 접합체를 형성할 수 있는 키메라 담체 단백질이 제공된다.
한 측면에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는, 다당류 항원의 면역 반응을 증진시키기 위한 키메라 담체 단백질이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함). 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다.
일부 실시 형태에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는, 다당류 항원의 면역 반응을 증진시키기 위한 키메라 담체 단백질 - 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함함("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함) - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다.
일부 실시 형태에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는, 다당류 항원의 면역 반응을 증진시키기 위한 키메라 담체 단백질 - 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래됨 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다.
일부 실시 형태에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는, 다당류 항원의 면역 반응을 증진시키기 위한 키메라 담체 단백질 - 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함함 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다.
본 명세서에 사용되는 키메라 담체 단백질은 동일한 폴리펩티드 분자 또는 단백질로부터 자연적으로 유래되지 않는 적어도 2개의 구성 폴리펩티드 분자 또는 아미노산 서열을 융합함으로써 생성되는 융합 분자, 즉, 아미노산 폴리머를 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 키메라 담체 단백질은 단일 긴사슬 아미노산(예를 들어, 적어도 30개의 아미노산 길이)를 가질 수 있거나, 동일한 서열 또는 상이한 서열을 가질 수 있는 다수의 긴사슬 아미노산을 가질 수 있다. 키메라 담체 단백질의 사슬(들)은 단일 구조 엔터티(single structural entity)로 폴딩(folding)될 수 있다. 키메라 담체 단백질의 적어도 1개의 사슬(들)은 융합 분자를 포함하며, 적어도 2개의 구성 폴리펩티드 분자는 펩티드 결합, 곁사슬기를 포함하는 결합(예컨대, 다이설파이드 결합), 및/또는 유기 링커(예컨대, 거의 입체 장애가 없는 링커)에 의해 매개되는 결합을 통해 서로 공유 결합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 키메라 단백질 내의 2개의 인접한 구성 폴리펩티드 분자 또는 아미노산 서열 사이에 배치되어, 인접한 구성 폴리펩티드 분자 또는 아미노산 서열을 연결할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "링커"는 키메라 단백질 내의 2개의 구성 아미노산 서열 또는 폴리펩티드 분자를 펩티드 결합에 의해 결합하거나 연결하는 짧은 펩티드(예컨대, 1 내지 30개의 아미노산 포함)를 지칭할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 구성 폴리펩티드 분자의 폴딩, 입체구조, 및/또는 생물 활성에 영향을 미치지 않거나 유의한 영향을 미치지 않는다. 키메라 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있거나, 화학 합성에 의해 제조될 수 있거나, 천연 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성에 의해 제조될 수 있는 적어도 2개의 폴리펩티드 분자를 공유 결합으로 결합하여(예컨대, 화학 반응을 통해) 제조될 수 있다. 본 명세서에 언급된 키메라 단백질은 또한 자연적으로 변형되거나, 개입, 예컨대 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 폴리머(들)를 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 유사체를 포함하는 폴리펩티드, 및 당해 분야에 공지된 다른 변형체가 이 용어에 포함된다. 용어 "키메라 담체 단백질" 및 "키메라 단백질"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 "담체 단백질"은 T 세포(예컨대, 헬퍼 T 세포)에 의한 인식을 위한 항원 에피토프를 제공할 수 있으며, 비관련 항원(예컨대, 다당류 항원)의 면역원성을 증진시키도록 비관련 항원에 접합될 수 있는 천연 유래의 단백질 또는 이의 유도체(예컨대, 돌연변이체, 화학적으로 또는 자연적으로 변형된 단백질 등)를 지칭한다. 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 파상풍 톡소이드, 수막염균 외막 단백질 복합체(OMPC), 디프테리아 톡소이드, 인플루엔자균 단백질 D, 및 이들의 단편, 돌연변이체 및 다른 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 담체 단백질이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 교차 반응 물질(CRM, 예컨대 CRM197)은 세포 독성이 낮거나 없지만, 디프테리아 독소의 면역원성을 보존하는 디프테리아균 C7(β197) 배양액으로부터 단리된 디프테리아 독소의 변이체이다. 임의의 CRM 또는 이의 유전자 변형된 버전(예컨대, CRM197)은 본 발명의 키메라 단백질의 적절한 담체 단백질일 수 있다. CRM197의 사슬 A는 다당류-단백질 접합체 백신의 담체 단백질로서 이전에 사용되어 왔다(본원에 참조로 포함되는 중국 특허 출원 공개 제CN103495161A호 참조). 임의의 CRM197의 사슬 A 및 이의 유도체(예컨대, 서열 번호 4를 갖는 CRM197A를 비롯한 단편, 돌연변이체, 또는 변형된 변이체)는 본원의 키메라 담체 단백질의 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 이의 아미노산 잔기 21의 히스티딘을 글리신 및 이의 유도체(예컨대, 서열 번호 6을 갖는 CRM197A를 비롯한 단편, 돌연변이체, 또는 변형된 변이체)로 치환한 임의의 디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체도 본 발명의 키메라 담체 단백질에 사용될 수 있다. 게다가, 세포 독성을 유발하지 않고서 T 세포 반응을 유도할 수 있는 세균 또는 바이러스 단백질(표면 단백질, 캡시드 단백질 등 포함) 및 이의 유도체(예컨대, 단편, 돌연변이체, 또는 변형된 변이체)는 본 발명의 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8 또는 이의 유도체(예컨대, 서열 번호 5를 갖는 단편 CoreVP8을 비롯한 단편, 돌연변이체, 또는 변형된 변이체)는 본 발명의 키메라 담체 단백질의 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 디프테리아 독소의 CRM197의 사슬 A로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "유니버셜 에피토프"는 약 30개 이하의 아미노산 길이의 아미노산 폴리머를 지칭하며, 이는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 결합되어 나타내어지고, T 세포 수용체로 인식될 수 있는 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 기재된 유니버셜 에피토프는 키메라 단백질의 일부로서 포함되는 경우에 이하의 특성을 가질 수 있다: 유니버셜 에피토프를 포함하지 않는 키메라 단백질의 담체 단백질 부분과 비교하여, (1) 항원제시세포(APC)에의 노출 시 및 이것에 의해 흡수 시에, 유니버셜 에피토프의 적어도 에피토프 부분의 완전성이 보존되는데, 즉, APC는 키메라 단백질 내의 유니버셜 에피토프의 에피토프 부분을 절단하거나 분해하지 않으며; (2) 에피토프는 키메라 단백질의 담체 단백질에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 항체 역가를 측정하는 ELISA 분석법을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여, 면역 반응을 측정할 수 있다. 유니버셜 에피토프는 다수의 키메라 단백질 구축물(예컨대, 다양한 단백질 서열에 융합되는 경우), 하나 또는 다양한 APC 세포형, 및/또는 다양한 개체(MHC 분자의 다양한 다형 대립유전자를 갖는 개체)의 APC에서 상기 특성을 나타낼 수 있다. 유니버셜 에피토프의 아미노산 서열은 자연 발생적인 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래될 수 있거나, 인공적으로 설계될 수 있거나, 랜덤 펩티드 라이브러리(random peptide library)의 스크린을 통해 동정될 수 있다. 유니버셜 에피토프는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있거나, 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 유니버셜 에피토프는 선상 또는 분지상 펩티드, 변형 아미노산을 갖는 펩티드, 및/또는 비아미노산에 의해 중단된 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유니버셜 에피토프는 자연적으로 변형되거나, 개입, 예컨대 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 유사체를 포함하는 폴리펩티드, 및 당해 분야에 공지된 다른 변형체가 이 용어에 포함된다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 적어도 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개 또는 그 이상 중 어느 하나의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 동일한 아미노산 서열을 갖는 단일 종류의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5 또는 그 이상의 카피 중 어느 하나의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 적어도 약 1 종류, 약 2 종류 또는 약 3 종류의 유니버셜 에피토프 중 어느 하나를 포함하며, 각각의 종류의 유니버셜 에피토프는 특이적인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5 카피 중 어느 하나의 동일한 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 각 종류의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 유니버셜 에피토프는 길이가 약 8 내지 약 20개의 아미노산으로 되어 있다(예컨대, 약 8개 내지 약 10개, 약 10개 내지 약 12개, 약 12개 내지 약 14개, 약 14개 내지 약 16개, 약 16개 내지 약 18개, 약 18개 내지 약 20개, 약 8개 내지 약 12개, 약 12개 내지 약 15개, 약 10개 내지 약 15개, 또는 약 15개 내지 약 20개 중 어느 하나). 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 파상풍 톡소이드, 오브알부민 또는 다른 천연 유래의 면역원성 단백질로부터 유래된다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Panina-Bordignono P et al. (1989) "Universally immunogenic T cell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells." Eur. J. Immunol. 19: 2237-2242] 참조). 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 상이한 다형 대립유전자에 의해 인코딩되는 다수의(예컨대, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 그 이상 중 어느 하나) MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 P2(서열 번호 1), P30(서열 번호 2) 및 OVAp(서열 번호 3) 중에서 선택된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 임의의 위치에 융합될 수 있으며, 담체 단백질의 폴딩, 입체구조, 및/또는 면역원성에 영향을 미치지 않거나 유의한 영향을 미치지 않는다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 제1 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단에 공유 결합으로 융합되고, 제2 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 C 말단에 공유 결합으로 융합되며, 여기서 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 내부 위치 내, 예컨대 담체 단백질의 가요성 루프 내에 삽입된다. 일부 실시 형태에서, 제1 유니버셜 에피토프는 제2 유니버셜 에피토프에 융합되어 융합 유니버셜 에피토프가 얻어지고, 융합 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단 또는 내부 위치에 공유 결합으로 융합되며, 여기서 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있고, 제1 유니버셜 에피토프 또는 제2 유니버셜 에피토프는 이들 사이에 배치되는 링커의 유무에 관계없이 서로 융합되는 적어도 2개의 유니버셜 에피토프 서열을 갖는 융합 유니버셜 에피토프가 될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 유니버셜 에피토프의 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 제1 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 제2 유니버셜 에피토프에 융합되고, 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 제1 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 제2 유니버셜 에피토프에 융합되고, 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 2를 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 1을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 3을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 1을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 3을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 2를 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 2를 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 1을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 3을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 1을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 3을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 2를 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 2를 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 1을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 1을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 3을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 1을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 2를 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 3을 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하는 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 서열 번호 3을 포함하는 제1 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 서열 번호 2를 포함하는 제2 유니버셜 에피토프의 적어도 1 카피(예컨대, 약 1, 약 2 또는 약 3 카피 중 어느 하나)에 추가로 융합된다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 융합 유니버셜 에피토프는 1 또는 2 카피의 제2 유니버셜 에피토프에 공유 결합으로 융합되는 1 또는 2 카피의 제1 유니버셜 에피토프를 포함하고, 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 융합 유니버셜 에피토프는 1 또는 2 카피의 제2 유니버셜 에피토프에 공유 결합으로 융합되는 1 또는 2 카피의 제1 유니버셜 에피토프를 포함하고, 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 상기 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 상기 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 C 말단에 융합되는 제1 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 N 말단은 융합 유니버셜 에피토프에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 제1 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 융합 유니버셜 에피토프에 융합된다. 융합 유니버셜 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열의 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1와 서열 번호 2, 서열 번호 2와 서열 번호 3, 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 4를 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 5를 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1과 서열 번호 3을 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단에 융합되는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 담체 단백질의 C 말단은 유니버셜 에피토프에 융합되고, 융합 유니버셜 에피토프는 서열 번호 2와 서열 번호 3을 포함하고, 담체 단백질은 서열 번호 6을 포함하며, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1을 포함한다.
상술한 키메라 담체 단백질 중 어느 하나는 인접한 유니버셜 에피토프 사이, 및/또는 각각의 유니버셜 에피토프와 담체 단백질 사이에 추가의 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프(융합 유니버셜 에피토프 포함)는 이것과 제2 유니버셜 에피토프(융합 유니버셜 에피토프 포함) 또는 담체 단백질 사이에 배치되는 펩티드 링커에 의해 제2 유니버셜 에피토프 또는 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치되는 펩티드 링커없이 담체 단백질에 직접적으로 융합된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 이들 사이에 배치되는 펩티드 링커에 의한 제2 유니버셜 에피토프에 대한 제1 유니버셜 에피토프를 포함하는 융합 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 제1 유니버셜 에피토프 및 제2 유니버셜 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 적절한 링커는 적절한 길이, 예컨대 약 1개의 아미노산(예를 들어, Gly) 내지 약 20개의 아미노산, 약 2개 아미노산 내지 약 15개의 아미노산, 약 3개의 아미노산 내지 약 12개의 아미노산, 약 4개의 아미노산 내지 약 10개의 아미노산 포함, 약 5개의 아미노산 내지 약 9개의 아미노산, 약 6개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산, 또는 약 7개의 아미노산 내지 약 8개의 아미노산 중에서 용이하게 선택되고, 이로 이루어질 수 있으며, 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개 또는 약 7개 중 어느 하나의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 예시적인 가요성 링커로는 글리신 폴리머(G)n, 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n, (GSGSG)n(서열 번호 7), (GSGGS)n 및 (GGGS)n(여기서, n은 1 이상의 정수임) 포함), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 당해 기술 분야에 공지된 다른 가요성 링커를 들 수 있다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 상대적으로 구조화되지 않으므로, 성분들 간의 중성 테더(tether)로 기능을 할 수 있을 것이다. 예시적인 가요성 링커로는 GGSG, GSGSG(서열 번호 7), GGGGSGGGGSGGGGS, GGGGSG, GGSGG, GSGGG, GGGSG, GSSSG 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 길이가 약 1 내지 20개의 아미노산 잔기로 되어 있다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
상술한 담체 단백질 중 어느 하나는 하나 이상의 카피(예컨대, 1, 2, 3 또는 그 이상)의 상술한 유니버셜 에피토프 중 어느 하나 또는 그 조합과 결합되고, 임의로 상술한 링커 중 어느 하나와 결합되어, 본원의 키메라 담체 단백질을 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 담체 단백질, 및 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 담체 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 담체 단백질, 및 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 유니버셜 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 39 내지 44로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 51 내지 56으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
이전 섹션에 기재된 다당류-단백질 접합체는 이전 섹션에 기재된 어느 하나의 다당류 항원과 결합한, 본 섹션에서 상술한 어느 하나의 키메라 담체 단백질을 포함할 수 있다. 어느 하나의 다당류 항원과 어느 하나의 키메라 담체 단백질은 하기 섹션에 기재되는 제조 방법에서도 사용될 수 있다.
제조 방법
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 어느 하나의 키메라 담체 단백질 및 다당류-단백질 접합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 다당류-단백질 접합체의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 다당류 항원을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 키메라 담체 단백질을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
일부 실시 형태에서, 다당류 항원을 제조하는 단계 및 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 다당류-단백질 접합체의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질을 제조하는 단계 및 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 다당류-단백질 접합체의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
일부 실시 형태에서, 다당류 항원을 제조하는 단계, 키메라 담체 단백질을 제조하는 단계 및 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 다당류-단백질 접합체의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
일부 실시 형태에서,
i) 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하는 단계;
ii) 다당류 항원을 배양물로부터 회수하는 단계;
iii) 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계;
iv) 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수하는 단계; 및
v) 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 다당류-단백질 접합체의 제조 방법이 제공된다.
본원의 한 측면에서, 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 키메라 담체 단백질의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 34 내지 38로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 46 내지 50으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 58 내지 63으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 다당류를 단백질에 접합하거나 공유 결합하기 위해 당해 기술 분야에 공지된 다수의 방법 중 어느 하나의 사용을 고려하며, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Hermanson, Greg T. "Bioconjugate techniques." Academic press, 2013]을 참조한다. 예를 들어, 1) 반응물의 하나의 성분 상의 알데히드기 또는 케톤기가 다른 하나의 성분 상의 아미노기 또는 하이드라자이드기와 반응하고, 이어서 형성된 C=N 이중 결합이 환원제에 의해 C-N 단일 결합으로 환원되는 환원적 아미노화; 2) 다당류가 브롬화시안(CNBr) 또는 1-시아노-4-다이메틸암모늄피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)로 활성화되어, 시아네이트기를 하이드록실기에 도입하여, 단백질 성분의 첨가 시에 아미노기 또는 하이드라자이드기에 공유 결합을 형성하는 시안화 접합; 및 3) 카르보다이이미드(예컨대, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카르보다이이미드 또는 EDC)가 접합 반응의 하나의 성분 상의 카르복실기를 활성화시키고, 활성화된 카르복실기가 다른 하나의 성분 상의 아미노기 또는 하이드라자이드기와 반응하는 카르보다이이미드 반응을 포함하는 세 가지 방법이 다당류를 단백질에 접합하는데 통상 적용된다. 이들 반응은 또한 접합 반응 이전에 접합체의 성분들을 활성화시키는데 흔히 사용된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 환원적 아미노화, 시안화 접합, 또는 카르보다이이미드 반응에 의해 키메라 담체 단백질에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 1-시아노-4-다이메틸암모늄피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 아디프산 다이하이드라자이드(ADH) 링커를 통해 키메라 담체 단백질에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 합성된 다당류-단백질 접합체는 당해 기술 분야에 공지된 어느 하나의 방법, 예컨대 크로마토그래피, 전기영동, 한외여과, 투석 등에 의해 추가로 정제된다. 다당류-단백질 접합체는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 크로마토그래피, 질량 분석 등을 사용하여 특성화 및 정량화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류-단백질 접합체는 순도가 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 그 이상을 초과하는 것 중 어느 하나이다.
다당류 항원은 화학 합성, 및 천연 공급원으로부터의 단리, 예컨대 세균 배양물로부터의 단리를 포함하나 이에 한정되지 않는 당해 기술 분야에 공지된 어느 하나의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 세균 배양물의 용해된 세균의 가용성 분획으로부터 추출된다. 일부 실시 형태에서, 추출된 다당류 항원은 예를 들어, 각각 핵산 및 단백질을 제거함으로써 추가로 정제된다. 일부 실시 형태에서, 추출되고 임의로 정제된 다당류 항원은 추가로 처리되어(예컨대, 생화학적으로 또는 화학적으로 가수분해되거나, 분해되거나, 소화되어), 적절한 분자량 범위 및/또는 평균 분자량의 다당류 항원이 얻어진다. 추가의 정제법, 예컨대 크로마토그래피, 투석, 한외여과, 전기영동, 분별 침전(differential precipitation) 등을 사용하여, 다당류 항원을 제조할 수 있다. 제조된 다당류 항원은 다당류 항원을 정량화하고/하거나 다당류 항원의 화학적, 물리적 및/또는 구조 특성을 확인하기 위해, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 질량 분석, FTIR, 비색 분석, 전기영동 등을 사용하여 특성화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 추가로 활성화 및/또는 산화되어, 키메라 담체 단백질에 용이하게 접합될 수 있는 다당류 항원 유도체가 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 유도체는 예를 들어, 유기 링커를 통해 키메라 담체 단백질의 아미노산 잔기에 공유 결합될 수 있는 알데히드기를 갖는다.
키메라 담체 단백질은 화학 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 발현을 포함하나 이에 한정되지 않는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법, 및 당해 기술 분야에 공지된 화학적 또는 생화학적 방법에 의한 담체 단백질에 대한 유니버셜 에피토프의 접합에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 유니버셜 에피토프 및/또는 담체 단백질은 화학 합성 또는 재조합 DNA 기술 및 단백질 발현에 의해 제조될 수 있다. 통상 사용되는 재조합 DNA 기술, 세포형질전환, 단백질 발현 및 정제 기술, 및 단백질의 제조 또는 특성화에 관련된 다른 기술이 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다. 키메라 담체 단백질을 발현시키는데 적합한 숙주 세포로는 세균, 효모, 포유류 세포 및 곤충 세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 대장균 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 단백질 발현을 증진시키도록 유전자 조작된다. 단백질 발현을 위한 적절한 파라미터, 예컨대 온도, 배지, 지속시간, 유도시간 등은 단백질 발현계의 성질(키메라 담체 단백질의 숙주 세포, 크기, 수율, 용해성 및 다른 물리적 특성 등 포함)에 기초하여 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 선택되어 최적화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 단백질 글리코실화 경로를 갖지 않는다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 플라스미드이다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 키메라 담체 단백질을 인코딩하는 최적화된 핵산 서열(예를 들어, 숙주 세포의 네이티브(native) 코돈 빈도에 기초함, 및/또는 부가 조절 서열 사용)을 포함하며, 여기서 최적화된 핵산 서열은 전사되고/되거나, 고 효율로 번역될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 34 내지 38로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 46 내지 50으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 58 내지 63으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 발현된 키메라 담체 단백질은 배양물의 가용성 분획으로부터 단리된다. 일부 실시 형태에서, 발현된 키메라 담체 단백질은 세균 배양물의 봉입체(inclusion body)로부터 단리된다. 일부 실시 형태에서, 발현된 키메라 단백질은 리폴딩된다. 일부 실시 형태에서, 발현된 키메라 단백질은 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 크로마토그래피 및 투석 중 어느 하나를 사용하여 추가로 정제된다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 순도가 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 그 이상을 초과하는 것 중 어느 하나이다.
키메라 담체 단백질을 제조하고, 다당류 항원을 제조하며, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 위해 본 명세서에 기재된 어떠한 단계 및 파라미터도, 모든 조합이 개별적으로 기재된 것처럼, 다당류-단백질 접합체를 제조하기 위해 서로 조합될 수 있는 것으로 되어 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 어느 하나의 제조 방법에 의해 제조되는 키메라 담체 단백질 및 다당류-단백질 접합체가 본 명세서에 제공된다.
면역원성 조성물
본 발명의 한 측면은 상술한 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 조성물(면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)을 제공한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 각각, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합되는 다당류 항원을 포함하는 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 - 상기 하나 이상의 다당류-단백질 접합체는 각각, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하며, 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합됨 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2이다.
일부 실시 형태에서, 각각, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 접합되는(예를 들어, 공유 결합으로 접합되는) 다당류 항원을 포함하는 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함). 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 - 상기 하나 이상의 다당류-단백질 접합체는 각각, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하며, 상기 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 접합됨(공유 결합으로 접합됨) - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 - 상기 하나 이상의 다당류-단백질 접합체는 각각, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하며, 상기 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32, 39 내지 44, 및 51 내지 56으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고("상기 아미노산 서열로 실질적으로 이루어진다" 또는 "상기 아미노산 서열로 이루어진다" 포함), 상기 다당류 항원은 상기 키메라 담체 단백질에 접합됨(공유 결합으로 접합됨) - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2(예컨대, 약 0.8 내지 약 0.9, 약 0.9 내지 약 1.0, 약 1.0 내지 약 1.1, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 중 어느 하나)이다.
일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 하나의 다당류-단백질 접합체로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의(예컨대, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개 또는 그 이상 중 어느 하나) 다당류-단백질 접합체를 포함한다. 다수의 다당류-단백질 접합체는 상이한 종류의 다당류-단백질 접합체, 예컨대 상이한 키메라 담체 단백질을 갖는 PS-단백질 접합체, 상이한 혈청형의 동일한 세균종으로부터 유래되는 PS를 갖는 PS-단백질 접합체, 상이한 세균종으로부터 유래되는 PS를 갖는 PS-단백질 접합체, 상이한 PS 대 키메라 담체 단백질 비를 갖는 PS-단백질 접합체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 다당류-단백질 접합체의 원하는 효능을 실질적으로 손상시키는 상이한 다당류-단백질 접합체 간의 상호작용은 존재하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체가 상이하다. 예를 들어, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체는 키메라 담체 단백질, 키메라 담체 단백질의 유니버셜 에피토프의 종류 또는 이들 종류의 조합, 키메라 담체 단백질의 유니버셜 에피토프의 카피수, 키메라 담체 단백질의 링커, 키메라 담체 단백질 내의 유니버셜 에피토프의 위치(즉, N 말단, C 말단 또는 둘 다), 또는 이들의 임의의 조합이 상이할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 적어도 2개의 상이한 세균종(상이한 혈청형 포함)으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함하는 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 적어도 2개의 상이한 세균종은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로 구성되는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 동일종의 상이한 혈청형의 세균으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의(예컨대, 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개 또는 약 24개 중 어느 하나) 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 다당류 항원(예컨대, 협막 다당류 항원)은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의(예컨대, 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개 또는 약 13개 중 어느 하나) 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 약 24개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 약 13개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의(예컨대, 약 1개, 약 2개, 약 3개 또는 약 4개 중 어느 하나) 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 다당류 항원(예컨대, 협막 다당류 항원)은 A, C, Y 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 수막염균으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 약 4개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다.
다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 중의 상이한 다당류-단백질 접합체 간의 상대 비율(예컨대, 중량 대 중량, 또는 몰 대 몰)은 각각의 다당류-단백질 접합체의 면역원성, 및 면역원성 조성물에 포함되는 각각의 다당류 항원에 대한 원하는 면역원성 효능에 영향을 미치는 다수의 요인에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 상대 비율, 키메라 담체 단백질의 성질(예컨대, 유니버셜 에피토프의 종류 및 개수), PS 항원의 성질(예컨대, 분자량, 길이, 반복 단위수, 반복 단위의 화학적 성질, 세균원 등), 및/또는 PS 항원의 제조 방법, 키메라 담체 단백질의 제조 방법, 및/또는 키메라 담체 단백질에 대한 PS 항원의 접합 방법은 모두 면역원성 조성물 중의 각각의 PS-단백질 접합체의 면역원성 효능에 영향을 미칠 수 있으며, 이들은 PS-단백질 접합체의 제조 배치(batch) 간에 따라 다를 수 있으므로, 면역원성 조성물을 얻기 위해 PS-단백질 접합체를 혼합하기 전에 PS-단백질 접합체의 각각의 배치에 대하여 실험적으로 결정되어야 할 수도 있다. 각각의 다당류 항원에 대한 원하는 면역원성 효능은 면역원성 조성물의 실제 용도, 예를 들어, 예방접종되는 개체 집단 간의 각각의 세균 혈청형 빈도, 각각의 세균 혈청형의 중증도, 예방접종되는 개체(예컨대, 개체가 PS 항원에 대한 정상 또는 약한 면역 반응, 유사한 PS-단백질 접합체에 대한 사전 또는 동시 노출 등을 갖는지의 여부에 관계없이), 및 세균 혈청형에 대한 바람직한 예방을 달성하는데 필요한 유효 PS 특이적 항체 역가에 좌우된다. 면역원성을 측정하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 어느 하나의 방법, 예컨대 면역원성 조성물로 예방접종된 동물에서 PS 특이적 항체 역가를 정량화하는 ELISA 분석법은 면역원성 조성물 중의 상이한 다당류-단백질 접합체 간의 상대 비율을 측정하는데 사용될 수 있다. 게다가, 분석 방법, 예컨대 크로마토그래피, 질량 분석 등은 면역원성 조성물 중의 각각의 다당류-단백질 접합체의 화학적 특성 및 구조 특성을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 대략 동일한 몰 비로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용되는 애주번트는 면역원성 조성물의 면역원성을 증진시키는 것과 같은 면역원성 조성물 또는 백신 중의 다른 물질의 효과를 개선시키는 물질이다. 애주번트는 고 항체 역가를 얻는 것, 더욱 지속적인 예방을 제공하는 것, 및/또는 주사 회수 및 주사 용량의 감소와 같은 면역 반응을 촉진시키는데 주어질 수 있다. 애주번트는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 애주번트는 면역원성 조성물의 제형을 안정화시킬 수 있다. 면역원성 조성물의 유효성을 증진시키는 적절한 애주번트로는 알루미늄염(명반), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; 광유, 예컨대 파라핀유; 세균 산물, 예컨대 세균 세포벽 성분, 사균, 세균 톡소이드의 해독 돌연변이체 등; 비세균성 유기물, 예컨대 스쿠알렌, 티메로살 등; 전달 시스템, 예컨대 사포닌 애주번트계(예를 들어, 퀼-에이(Quil-A)®), 리비(Ribi)™ 애주번트계(RAS) 등; 사이토카인, 예컨대 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-12 등), 인터페론(예를 들어, 감마 인터페론), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 보조자극분자 B7-1 및 B7-2 등; 조성물, 예컨대 프로인트 완전 애주번트(Freund's complete adjuvant), 프로인트 불완전 애주번트(Freund's incomplete adjuvant); 면역원성 조성물의 유효성을 증진시키도록 면역자극제로서 작용하는 다른 물질; 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄을 추가로 포함한다.
또한 본 발명에 의해, 상술한 면역원성 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신이 제공된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 피험자로 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 봉입 물질을 의미한다. "약제학적으로 허용가능한"은 생물계, 예컨대 세포, 세포 배양물, 조직 또는 유기체에 적합한 비독성 물질을 지칭하는데 사용된다. 용어 "담체"는 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분을 나타내며, 활성 성분을 적용을 용이하게 하도록 이것과 배합한다. 담체의 특성은 투여 경로에 따라 다르다. 생리학적 및 약제학적으로 허용가능한 담체는 당해 기술 분야에 잘 알려진 희석제, 충전제, 염류, 완충제, 안정제, 가용화제 및 다른 물질을 포함한다.
본 명세서에 기재된 면역원성 조성물 중 어느 하나 또는 이의 조합은 기재된 면역원성 조성물(들)을 본 명세서에 기재된 치료 방법, 투여 방법 및 투여 계획에 사용하기 위해 당해 기술 분야에 알려진 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 안정제 및/또는 다른 물질과 배합함으로써, 백신, 또는 다른 약제학적 조성물 또는 제제에 사용될 수 있다.
적절한 약제학적 담체로는 멸균수; 생리식염수, 덱스트로스; 물 또는 생리식염수 중의 덱스트로스; 피마자유 1몰 당 에틸렌 옥사이드 약 30 내지 약 35 몰이 배합된 피마자유와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물; 액체산; 저급 알칸올; 오일, 예컨대 옥수수유; 낙화생유, 참기름 등(유화제, 예컨대 지방산의 모노글리세라이드 또는 다이글리세라이드, 또는 포스파타이드, 예를 들어, 레시틴 등을 함유함); 글리콜; 폴리알킬렌 글리콜; 현탁화제, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스의 존재 하에서의 수성 매질; 알긴산나트륨; 폴리(비닐피롤리돈) 등 단독, 또는 적절한 분산제, 예컨대 레시틴; 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 등을 함유한 것 등을 포함한다. 담체는 또한 침투촉진제와 함께 애주번트, 예컨대 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제 등을 함유할 수 있다. 최종 형태는 무균 상태일 수 있으며, 또한 주사 기구, 예컨대 중공 침을 용이하게 통과할 수 있다. 적절한 점도는 용매 또는 부형제의 적절한 선택에 의해 달성되어 유지될 수 있다. 게다가, 분자 또는 미립자 코팅, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액 중의 입자 크기의 적절한 선택, 또는 계면활성제 특성을 지닌 물질의 사용이 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물(백신 포함)은 면역원성 조성물의 특성을 개선시키기 위해 다른 물질, 부형제 또는 안정제를 포함할 수 있다. 적절한 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 식염수, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸- 및 프로필하이드록시벤조에이트, 탤크, 스테아르산마그네슘 및 광유를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 제제는 추가로 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 보존제, 감미제 또는 향미제를 포함할 수 있다. 유화제의 예로는 토코페롤 에스테르, 예컨대 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트 등, 플루로닉(pluronic)®, 폴리옥시에틸렌 화합물, 스판(Span) 80 및 관련 화합물을 기제로 하는 유화제 및 당해 기술 분야에 공지되고 동물 또는 인간용 제형에서의 사용이 승인된 다른 유화제를 들 수 있다. 약제학적 조성물(백신 포함)은 당해 기술 분야에 잘 알려진 절차를 사용하여 환자에게 투여한 후에, 활성 성분의 신속 방출, 지속 방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 예를 들어, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 6.5, 또는 약 5.6 내지 약 6.0 중 어느 하나의 pH 범위를 비롯한 약 4.5 내지 약 9.0의 범위의 pH를 갖도록 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 pH가 약 5.6 이상으로 제형화된다. 약제학적 조성물(백신 포함)은 또한 적절한 장성 조절제(tonicity modifier), 예컨대 글리세롤의 첨가에 의해 혈액과 등장성이 되게 제조될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "개체", "피험자" 또는 "환자"는 포유류를 지칭하며, 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 인간에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 비경구 투여에 의해 인간에게 투여하기에 적합하다. 비경구 투여용으로 적합한 제제로는 제제를 대상으로 하는 수용자의 혈액에 적합하게 하는, 산화방지제, 완충제, 정균제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 들 수 있다. 제제는 단위 용량(unit-dose) 또는 다회 용량(multi-dose) 밀봉 용기, 예컨대 주사기 및 바이알로 제공될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 치료 방법, 투여 방법 및 투여 계획에 사용하기 위해 사용 직전에 주사용 멸균액 부형제(즉, 물)의 첨가 만을 필요로 하는 동결 건조된(lyophilized) 상태로 보관될 수 있다. 즉석(extemporaneous) 주사액 및 현탁 주사액은 멸균 분말, 과립, 및 상술한 종류로부터 제조될 수 있다. 주사 제제가 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 일회용 주사기, 예컨대 일회용 밀봉 주사기에 포함된다. 일부 실시 형태에서, 각각의 일회용 주사기는 개체에게 투여하기에 적합한 중량 또는 체적 단위의 다당류 접합체 또는 다수의 다당류 접합체의 치료적 또는 예방적 유효량을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 다회 사용 바이알에 포함된다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물(백신 포함)은 용기 내에 벌크로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 백신은 1가 백신이며, 여기서 백신은 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하고, 하나 이상의 다당류-단백질 접합체는 단일 세균 혈청형으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 1가 b형 인플루엔자균(Hib) 백신 - 상기 하나 이상의 다당류-단백질 접합체는 각각, 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(예컨대, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 유니버셜 에피토프)를 포함하며, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib)으로부터 유래됨 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 백신은 다가 백신이며, 상기 백신은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하고, 각각의 다당류-단백질 접합체는 동일종의 상이한 혈청형의 세균으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약 13개의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 13가 폐렴연쇄구균 백신 - 각각의 다당류-단백질 접합체는 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(예컨대, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 유니버셜 에피토프)를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함함 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 약 24개의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 24가 폐렴연쇄구균 백신 - 각각의 다당류-단백질 접합체는 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(예컨대, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 유니버셜 에피토프)를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함함 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 약 24개의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 4가 수막염균 백신 - 각각의 다당류-단백질 접합체는 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 포함하고, 상기 키메라 담체 단백질은 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(예컨대, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 유니버셜 에피토프)를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 A, C, Y 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함함 - 이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 백신은 다른 항원(PS 항원 또는 키메라 담체 단백질과 관련되거나 관련되지 않음)을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다른 항원은 애주번트, 희석제, 부형제, 담체 및 다른 약제학적으로 허용가능한 물질과 함께 제제화될 수 있다.
치료 방법
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 어느 하나의 조성물(다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 세균이 다당류 항원을 포함하는, 세균에 의한 질환(예컨대, 감염증)을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 개체는 약 2세 미만의 소아, 고령자 또는 면역약화자이다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 또는 백신 중 어느 하나의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 세균이 다당류 항원을 포함하는 다당류(예컨대, 협막 다당류)를 발현하는, 세균에 의한 질환에 대하여 개체를 예방접종하는 방법이 제공된다. 다른 측면에서, 세균에 의한 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 중 어느 하나의 용도 - 여기서, 다당류 항원은 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체임 - 가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 세균은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균 또는 수막염균(Men)이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 약 2세 미만의 소아, 고령자 또는 면역약화자이다.
본 명세서에 기재된 치료 방법은 일반적으로, b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn) 또는 수막염균(Men)에 의한 질환 또는 상태를 포함하나 이에 한정되지 않는, 다당류 항원을 포함하는 다당류(예컨대, 협막 다당류)를 발현하는 세균에 의한 임의의 질환 또는 상태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 폐렴연쇄구균에 의한 폐렴, 이염, 부비동염, 수막염, 균혈증, 이들의 임의의 조합, 및/또는 임의의 다른 질환 또는 상태이다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 b형 인플루엔자균에 의한 수막염, 폐렴, 후두개염, 봉와직염, 관절염, 이염, 이들의 임의의 조합, 및/또는 임의의 다른 질환 또는 상태이다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환은 수막염균에 의한 수막염, 수막염균혈증, 이들의 조합 및/또는 임의의 다른 질환 또는 상태이다.
본 명세서에 사용되는 "개체", "피험자" 또는 "환자"는 포유류를 지칭하며, 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 인간 개체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 약화된 면역체계를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 건강한 성인과 비교하여, 다당류 항원에 대한 약한 면역 반응(예컨대, 낮은 PS 특이적 항체 역가, 지속시간이 짧은 면역 반응 및/또는 낮은 면역 기억)을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 결손 또는 미숙 T 세포계를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 결손 또는 미숙 면역 기억계를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 유아(예컨대, 약 2세 미만의 소아, 예를 들어 약 3개월, 약 6개월, 약 12개월, 약 1.5세 또는 약 2세 미만의 소아)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 고령자, 예컨대 50세, 55세, 60세, 65세, 70세, 75세, 80세, 85세, 90세, 95세 또는 그 이상 중 어느 하나보다 많은 개체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 개체는 면역약화자이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 MHC 분자가 다양한 다형성을 갖는 개체 간의 광범위한 면역 보호를 제공한다.
본 명세서에 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방적 수단 또는 예방 대책을 비롯하여, 임상 결과를 포함한 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근 방법이다. 본 발명의 목적 상, 유익하거나 원하는 임상 결과로는 다음 중 하나 이상을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다: 질환에 의한 하나 이상의 증상의 감소, 질환 정도의 저하, 질환 안정화(예를 들어, 질환의 악화 저지 또는 지연), 질환의 만연 방지 또는 지연, 질환의 발생 또는 재발 방지 또는 지연, 질환의 진행 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선, 질환 관해(부분 관해인지 완전 관해인지에 관계없이)의 달성, 질환을 치료하는데 필요한 하나 이상의 기타 약물의 용량 감량, 생활의 질 상승, 및/또는 생존 기간의 연장. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물은 질환(예컨대, 세균에 의한 감염증)과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 치료 전의 동일한 개체의 대응하는 증상과 비교하거나, 치료 방법 또는 조성물을 취하지 않은 다른 개체의 대응하는 증상과 비교하여, 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 중 어느 하나로 경감시킨다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 이러한 치료 측면을 고려한다.
질환의 "진행 지연"을 행할 수 있는 치료는 질환 진행의 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정화, 및/또는 연기를 포함할 수 있다. 이러한 지연은 병력 및/또는 치료 중인 개체에 따라, 다양한 기간으로 될 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 충분하거나 현저한 지연은 사실상, 개체, 예를 들어 장애 또는 상태를 발병할 위험성이 있는 개체가 질환을 발병하지 않는다는 점에서, 예방을 포함할 수 있다.
당해 기술 분야에서 알 수 있는 바와 같이, "유효량"은 원하는 치료 결과(예를 들어, 질환의 중증도 또는 지속시간의 경감, 질환의 중증도의 안정화, 질환의 하나 이상의 증상의 제거, 또는 질환의 발병 방지)를 도출하기에 충분한 조성물 또는 병용 치료제의 양을 지칭한다. 그 양은 하나 이상의 용량, 즉, 단회 용량 또는 다회 용량으로 될 수 있다. 시험관내 분석(예를 들어, ELISA), 세포 베이스 분석(cell-based assay; 예를 들어, 옵소닌식균작용 분석(opsonophagocytotic killing assay)), 동물 모델, 및/또는 인체 실험과 같은 표준 방법은 유익한 효과의 크기를 측정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물(다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)은 유의한 부작용 없이 면역방어반응을 유도하는 양으로 투여된다. 그러한 양은 세균종, 및 세균의 혈청형에 따라 다를 수 있다. 특정 백신에 대한 성분의 최적량은 피험자에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 포함한 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신 접종 후에, 피험자는 충분히 간격을 두고 1회 내지 수회 부스터 예방접종을 받을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물(다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)은 1회 이상(예컨대, 1회, 2회, 3회 또는 그 이상)의 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 적어도 2회(예컨대, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상)의 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 개체의 다당류 특이적 항체 역가는 초기 용량과 비교하여, 후기 용량에 반응하여 증가된다. 일부 실시 형태에서, 2개의 인접한 투여 간의 간격은 약 1개월, 약 3개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년 또는 그 이상 중 어느 하나이다. 일부 실시 형태에서, 각각의 용량은 다당류 항원 0.1 내지 100 ㎍을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 각각의 용량은 다당류 항원 0.1 내지 10 ㎍을 포함한다.
본 발명의 조성물(다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)은 임의의 적절한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 주사액과 같은 조성물이 비경구적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 전신 또는 점막 경로를 통해 투여된다. 본 발명에 적용가능한 예시적인 투여 경로로는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구도(oral tract)/소화관, 기도(예를 들어, 비강내) 또는 비뇨생식기관으로의 점막 투여를 통한 주사를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
키트 및 제조품
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 키메라 담체 단백질, 다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신을 포함한 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트 또는 제조품을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류 항원의 면역원성을 증진시키는데 유용한 키트가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32, 39 내지 44, 및 51 내지 56 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 다당류 항원을 포함하는 세균에 대한 백신으로서 유용한 다당류-단백질 접합체의 제조를 위한, 다당류 항원, 및 임의로, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 위한 시약을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 어느 하나의 조성물(본 명세서에 기재된 다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)을 포함하며, 다당류 항원이 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체인, 세균에 의한 질환(예컨대, 감염증)을 치료하거나 예방하는데 유용한 키트가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 어느 하나의 조성물(본 명세서에 기재된 다당류-단백질 접합체, 면역원성 조성물, 약제학적 조성물 및 백신 포함)을 포함하며, 다당류 항원이 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체인, 세균에 대하여 개체를 예방접종하는데 유용한 키트가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 세균은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균 또는 수막염균(Men)이다. 일부 실시 형태에서, 조성물, 예컨대 백신은 주사기에 포함되어 있다.
제조품 또는 키트는 용기 및 상기 용기 상 또는 이것에 수반되는 라벨 또는 첨부 문서(package insert)를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 정맥주사용(IV) 용액 백 등을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제작될 수 있다. 용기는 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 조성물 단독 또는 다른 조성물과 조합한 상기 조성물을 담고 있을 수 있으며, 멸균 접근 입구(sterile access port)를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 마개를 갖는 정맥주사용 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 하나의 활성 물질은 본 발명의 키메라 담체 단백질 또는 다당류-단백질 접합체이다. 라벨 또는 첨부 문서는 조성물이 선택 질환을 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 본 발명의 이러한 실시 형태의 제조품은 조성물이 특정 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 것을 나타내는 첨부 문서를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로는 또는 게다가, 제조품 또는 키트는 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 인산 완충 생리식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업 상 또는 사용자의 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서는 당해 기술 분야의 숙련가가 본 발명을 실시가능하게 하기에 충분한 것으로 간주된다. 본 명세서에 제시되고 기재된 본 발명의 변경 이외에도 다양한 변경이 상술한 상세한 설명으로부터 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백하게 될 것이며, 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함될 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원서는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 실시 형태
실시 형태 1. 일부 실시 형태에서, 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합되는 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체가 제공된다.
실시 형태 2. 실시 형태 1의 일부 추가의 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함한다.
실시 형태 3. 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 일부 추가의 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함한다.
실시 형태 4. 실시 형태 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 길이가 약 8 내지 약 20개의 아미노산으로 되어 있다.
실시 형태 5. 실시 형태 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합된다.
실시 형태 6. 실시 형태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시 형태 7. 실시 형태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균의 단백질 D로부터 유래된다.
실시 형태 8. 실시 형태 7의 일부 추가의 실시 형태에서, 담체 단백질은 디프테리아 독소의 CRM197의 사슬 A로부터 유래된다.
실시 형태 9. 실시 형태 7의 일부 추가의 실시 형태에서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시 형태 10. 실시 형태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합된다.
실시 형태 11. 실시 형태 10의 일부 추가의 실시 형태에서, 펩티드 링커는 글리신 폴리머, 글리신-세린 폴리머, 글리신-알라닌 폴리머, 또는 알라닌-세린 폴리머로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 가요성 링커이다.
실시 형태 12. 실시 형태 10 또는 실시 형태 11의 일부 추가의 실시 형태에서, 펩티드 링커는 길이가 약 1 내지 20개의 아미노산 잔기로 되어 있다.
실시 형태 13. 실시 형태 10 내지 12 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 펩티드 링커는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
실시 형태 14. 실시 형태 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시 형태 15. 실시 형태 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 39 내지 44로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시 형태 16. 실시 형태 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 51 내지 56으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
실시 형태 17. 실시 형태 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2이다.
실시 형태 18. 실시 형태 1 내지 17 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 평균 분자량이 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa이다.
실시 형태 19. 실시 형태 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래된다.
실시 형태 20. 실시 형태 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn), 또는 수막염균(Men)으로부터 유래된다.
실시 형태 21. 실시 형태 20의 일부 추가의 실시 형태에서, 협막 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래된다.
실시 형태 22. 실시 형태 20의 일부 추가의 실시 형태에서, 협막 다당류는 b형 인플루엔자균(Hib)으로부터 유래된다.
실시 형태 23. 실시 형태 20의 일부 추가의 실시 형태에서, 협막 다당류는 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 수막염균으로부터 유래된다.
실시 형태 24. 일부 실시 형태에서, 실시 형태 1 내지 23에 따른 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
실시 형태 25. 실시 형태 24의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체는 서로 상이한 담체 단백질을 포함한다.
실시 형태 26. 실시 형태 24 또는 실시 형태 25의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체는 서로 상이한 세균종으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다.
실시 형태 27. 실시 형태 24 또는 실시 형태 25의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 동일종의 상이한 혈청형의 세균으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함한다.
실시 형태 28. 실시 형태 27의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 약 13개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다.
실시 형태 29. 실시 형태 27의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 약 24개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다.
실시 형태 30. 실시 형태 27의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 약 4개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함한다.
실시 형태 31. 실시 형태 24 내지 30 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물은 애주번트를 추가로 포함한다.
실시 형태 32. 실시 형태 31의 일부 추가의 실시 형태에서, 애주번트는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄이다.
실시 형태 33. 일부 실시 형태에서, 실시 형태 24 내지 32에 따른 면역원성 조성물 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신이 제공된다.
실시 형태 34. 일부 실시 형태에서, 실시 형태 24 내지 32에 따른 면역원성 조성물 중 어느 하나 또는 청구항 33의 백신의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 다당류 항원이 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체인, 세균에 의한 질환에 대하여 개체를 예방접종하는 방법이 제공된다.
실시 형태 35. 실시 형태 34의 일부 추가의 실시 형태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 적어도 2회의 용량으로 개체에게 투여된다.
실시 형태 36. 실시 형태 34 또는 실시 형태 35의 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 질환은 폐렴연쇄구균으로 인한 폐렴, 이염, 부비동염, 수막염, 또는 균혈증이다.
실시 형태 37. 실시 형태 34 또는 실시 형태 35의 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 질환은 b형 인플루엔자균에 의한 수막염, 폐렴, 후두개염, 봉와직염, 관절염, 또는 이염이다.
실시 형태 38. 실시 형태 34 또는 실시 형태 35의 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 질환은 수막염균에 의한 수막염 또는 수막염균혈증이다.
실시 형태 39. 실시 형태 34 내지 38 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 개체는 다당류 항원에 대한 면역 반응이 양호하지 못하다.
실시 형태 40. 실시 형태 34 내지 39 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 개체는 약 2세 미만의 소아, 고령자 또는 면역약화자이다.
실시 형태 41. 일부 실시 형태에서, 세균에 의한 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 실시 형태 24 내지 32에 따른 면역원성 조성물 중 어느 하나 또는 실시 형태 33에 따른 백신의 용도 - 여기서, 다당류 항원은 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체임 - 가 제공된다.
실시 형태 42. 일부 실시 형태에서, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 실시 형태 1 내지 23의 다당류-단백질 접합체 중 어느 하나의 제조 방법이 제공된다.
실시 형태 43. 실시 형태 42의 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
실시 형태 44. 실시 형태 42 또는 실시 형태 43의 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 방법은 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 다당류 항원을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
실시 형태 45. 실시 형태 42 내지 44 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 키메라 담체 단백질은 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수함으로써 제조된다.
실시 형태 46. 실시 형태 45의 일부 추가의 실시 형태에서, 숙주 세포는 대장균 또는 효모이다.
실시 형태 47. 실시 형태 45 또는 실시 형태 46의 일부 추가의 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 34 내지 38로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
실시 형태 48. 실시 형태 45 또는 실시 형태 46의 일부 추가의 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 46 내지 50으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
실시 형태 49. 실시 형태 45 또는 실시 형태 46의 일부 추가의 실시 형태에서, 벡터는 서열 번호 58 내지 63으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함한다.
실시 형태 50. 실시 형태 42 내지 49 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 방법은 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 키메라 담체 단백질을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
실시 형태 51. 실시 형태 42 내지 50 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 환원적 아미노화, 시안화 접합, 또는 카르보다이이미드 반응에 의해 키메라 담체 단백질에 접합된다.
실시 형태 52. 실시 형태 51의 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 1-시아노-4-다이메틸암모늄피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화된다.
실시 형태 53. 실시 형태 51의 일부 추가의 실시 형태에서, 다당류 항원은 아디프산 다이하이드라자이드(ADH) 링커를 통해 키메라 담체 단백질에 접합된다.
실시 형태 54. 실시 형태 42 내지 53 중 어느 하나에 따른 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 방법은 접합된 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 단리하여 다당류-단백질 접합체를 얻는 단계를 추가로 포함한다.
실시예
실시예는 본 발명을 단지 예시하고자 하는 것이므로, 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 또한 상기에서 논의된 본 발명의 측면 및 실시 형태를 기술하고 상세히 설명한다. 실시예는 이하의 실험이 행해진 모든 실험이나 유일한 실험을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 기하기 위해 노력해왔으나, 일부 실험 오차 및 편차가 설명되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨온도이고, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.
이하의 실시예는 다당류-단백질 접합체에서 유니버셜 에피토프(들)를 담체 단백질에 부가하여, 다당류-단백질 접합체의 면역원성을 증진시키는 방법을 제공한다. 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질은 유전자 재조합 기술에 의해 유전자 조작된 세균을 사용하여 생산된다. 그 다음에 다당류가 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합된다. 동물 체내에 들어가면, 다당류-단백질 접합체는 항원제시세포(APC)에 의해 흡수 및 분해되어 유니버셜 에피토프 및 다당류의 반복 단위의 분획을 생산할 수 있으며, 이는 효과적인 T 세포 유도를 위해 MHC 클래스 II 분자에 결합되고 제시되어, 증진된 면역원성, 및 세균 협막 다당류에 대한 증가된 특이적 항체 역가 산출을 가져올 수 있다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 대응하는 다당류-단백질 접합체와 비교하여, 본 명세서에 기재된 담체 단백질에 유니버셜 에피토프를 갖는 예시적인 다당류-단백질 접합체는 약 3배 내지 5배로 증진된 면역원성을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 예시적인 다당류-단백질 접합체의 기술적 전략은 다음과 같다:
a) 유니버셜 에피토프(들)를 담체 단백질에 도입하여, 키메라 담체 단백질을 구성하고, 유전자 재조합 기술에 의해 유전자 조작된 세균을 사용하여 키메라 담체 단백질을 생산하는 것;
b) 유니버셜 에피토프를 갖는 a)의 키메라 담체 단백질을 다당류에 공유 결합으로 접합하여, 다당류-단백질 접합체를 얻는 것.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 키메라 담체 단백질은 X 개수의 유니버셜 에피토프를 포함하며, 여기서 X는 1 이상이다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 키메라 담체 단백질은 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 동시에 N 말단 및 C 말단 둘 다에 연결되는 유니버셜 에피토프를 포함한다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 키메라 담체 단백질은 GSGSG 아미노산 서열을 통해 담체 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 연결되는 유니버셜 에피토프를 포함한다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 키메라 담체 단백질은 QYIKANSKFIGITEL(P2로 명명됨), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(P30으로 명명됨), ISQAVHAAHAEINEAGR(OVAp으로 명명됨) 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 키메라 담체 단백질은 돌연변이 디프테리아 독소 CRM197 사슬 A(CRM197A로 명명됨), 로타바이러스 표면 단백질 코어 VP8(CoreVP8로 명명됨) 및 돌연변이 디프테리아 독소 H21G 사슬 A(H21G로 명명됨) 중에서 선택되는 담체 단백질을 포함한다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 유전자 재조합 기술에 의해 유전자 조작된 세균은 유전자 조작된 재조합 대장균이다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된 다당류는 b형 인플루엔자균(Hib), 폐렴연쇄구균(Pn) 또는 수막염균(Men)을 배양하여 제조된 협막 다당류이다.
일부 추가의 실시 형태에서, 이들 실시예에 기재된, 다당류를 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합하는 방법은 환원적 아미노화, ADH 방법(아디프산 다이하이드라자이드 사용) 또는 CDAP 방법(3-(에틸이미노메틸렌아미노)-N,N-다이메틸-프로판-1-아민 사용)이다.
실시예 1: CRM197A 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체의 제조 및 면역학적 평가
파트 1. 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열의 디자인
1. CRM197 면역원성 담체 단백질의 서열 디자인
디프테리아 독소는 디프테리아균(코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae))의 디프테리아 독소 유전자를 운반하는 β 파지에 의해 발현되는 세포질 폴리펩티드이다. 상기 폴리펩티드는 560개의 아미노산 및 62,000 달톤의 분자량을 갖는다. 야생형 디프테리아 독소의 아미노산 서열은 서열 번호 64로 하기에 나타낸다.
(서열 번호 64)
Figure pct00001
N 말단 25개의 잔기 리더 서열은 세균의 표면에 폴리펩티드 분비 시에 제거되어, 535개의 아미노산 및 58 kDa의 분자량을 갖는 분비된 외가닥 폴리펩티드가 유도되며, 이는 하기에 나타낸 서열 번호 65의 아미노산 서열을 갖는다.
(서열 번호 65)
Figure pct00002
분비된 디프테리아 독소는 사슬 A 및 사슬 B로 효소로 분해되며, 이는 다이설파이드 결합을 통해 연결되어 단일 단백질 분자를 형성한다. 2개의 폴리펩티드 사슬은 각각, 고유 기능을 갖는다. 사슬 A는 디프테리아 독소 단백질의 N 말단 단편으로, 193개의 아미노산 및 21 kDa의 분자량을 갖는다. 사슬 A는 디프테리아 독소의 독성의 원인이다. 진핵세포의 세포질에서, 사슬 A는 NAD+의 ADP-리보스 부분을 신장 인자-2(EF-2)로 공유 결합으로 전이하여, 숙주 세포의 단백질 합성을 감쇠시켜, 세포 증식 저해를 유도하여, 결국 세포사를 일으키게 된다. 사슬 B는 디프테리아 독소의 C 말단 단편으로, 342개의 아미노산 및 37 kDa의 분자량을 갖는다. 사슬 B는 감수성 세포 표면 상의 특이적 수용체를 인식하여, 디프테리아 독소를 감수성 세포에 부착시켜, 사슬 A의 세포로의 침입을 촉진시킬 수 있다.
디프테리아 독소의 사슬 A는 우수한 수용해도를 나타낸다. 이의 아미노산은 서열 번호 66으로 하기에 나타낸다.
(서열 번호 66)
Figure pct00003
연구에 따르면, 교차 반응 물질(CRM)로서 알려진, β 파지에서의 디프테리아 독소를 인코딩하는 독소 유전자의 돌연변이체가 상기 파지의 복제에 거의 영향을 미치지 않으나, 발현된 디프테리아 독소의 독성을 크게 감소시키거나 제거하는 것으로 밝혀졌다(Giannini et al. (1984) "The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtheria toxin: CRM45 and CRM197." Nucleic Acid Research 12: 4063-4069). 혈청 중의 CRM의 면역원성은 여전히 고도로 야생형 독소의 면역원성과 상관관계가 있다. 특히, 비독성 돌연변이체 CRM197은 아미노산 52의 Gly→Glu 점 돌연변이를 가지며, 이의 아미노산 서열은 서열 번호 4로 하기에 나타낸다.
(서열 번호 4)
Figure pct00004
폐렴연쇄구균에 대한 백신에 사용되는 시판 중인 다른 담체 단백질과 비교하여, CRM197 사슬 A(이하, CRM197A로 명명됨)는 하기 이점을 갖는다. CRM197A의 면역원성과 전장 야생형 디프테리아 독소의 면역원성은 고도로 상관관계가 있다. 저분자량 및 고 수용해도를 나타내므로, CRM197A는 생산하기가 용이하며, 고분자량 분자의 제조를 위해 화학 반응에 사용하기에 용이하다. 디프테리아 독소에 기초한 백신의 장기 임상 응용에 의해, 이러한 백신의 안전성과 유효성을 입증하였다.
여기에서, 재조합으로 발현된 CRM197A 단백질을 다당류-단백질 접합체의 생산 시에 담체 단백질로서 사용하였다. CRM197A를 폐렴연쇄구균(Pn)의 협막 다당류(CP)에 공유 결합하여, Pn PS-CRM197A 접합체를 제조하였다. CRM197A를 b형 인플루엔자균(Hib)의 협막 다당류(CP)에 공유 결합하여, Hib PS-CRM197A 접합체를 제조하였다. CRM197A를 수막염균(Men)의 협막 다당류(CP)에 공유 결합하여, Men CP-CRM197A 접합체를 제조하였다. 각각의 접합체를, 동일한 CP를 갖지만, CRM197A 및 하나 이상의 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 갖는 대응하는 접합체의 면역원성의 조사를 위한 대조군으로서 기능을 하도록 백신 조성물로 추가로 제조하였다.
2. 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
유니버셜 에피토프를 CRM197A 면역원성 담체 단백질에 융합하여, 다당류-단백질 접합체의 제조에 유용한 새로운 키메라 담체 단백질을 구축하였다. 유니버셜 에피토프 P2, P30 또는 OVAp를 각각 개별적으로, CRM197A 담체 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합하였다. 대안적으로, 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프의 각 조합을 각각, CRM197A 담체 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합하였다. 세 번째 전략에서, 2 카피의 동일한 유니버셜 에피토프를 서로 융합한 다음에, CRM197A 담체 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합하였다. 네 번째 전략은 유니버셜 에피토프를 CRM197A 담체 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 융합하고, CRM197A의 나머지 말단을 동일하거나 상이한 종류의 2 카피의 유니버셜 에피토프에 연결하여, 서로 융합하였다.
2-1. P2 및 CRM197A를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-1-1. P2-N 말단-CRM197A 키메라 담체 단백질(P2CRM197A)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P2CRM197A로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 8로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 8)
Figure pct00005
2-1-2. CRM197A-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(CRM197AP2)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, CRM197AP2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 9로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 9)
Figure pct00006
2-1-3. P2-N 말단-CRM197A-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(P2CRM197AP2)의 서열 디자인
각각, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 및 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해, 각각 CRM197A 담체 단백질의 N 말단 및 C 말단에 융합하여, P2CRM197AP2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 10으로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 10)
Figure pct00007
2-1-4. P2P2-N 말단-CRM197A 키메라 담체 단백질(P2P2CRM197A)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P2P2CRM197A로 명명되는 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 11로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 11)
Figure pct00008
2-1-5. CRM197A-C 말단-P2P2 키메라 담체 단백질(CRM197AP2P2)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P2P2CRM197A로 명명되는 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 12로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 12)
Figure pct00009
2-1-6. P2P2-N 말단-CRM197A-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(P2P2CRM197AP2)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2P2CRM197AP2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 13으로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 13)
Figure pct00010
2-1-7. P2-N 말단-CRM197A-C 말단-P2P2 키메라 담체 단백질(P2CRM197AP2P2)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, P2(서열 번호 1)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2CRM197AP2P2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 14로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 14)
Figure pct00011
2-2. P30 및 CRM197A를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-2-1. P30-N 말단-CRM197A 키메라 담체 단백질(P30CRM197A)의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P30CRM197A로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 15로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 15)
Figure pct00012
2-2-2. CRM197A-C 말단-P30 키메라 담체 단백질(CRM197AP30)의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, CRM197AP30으로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 16으로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 16)
Figure pct00013
2-2-3. P30-N 말단-CRM197A-C 말단-P30 키메라 담체 단백질(P30CRM197AP30)의 서열 디자인
각각, P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 및 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해, 각각 CRM197A 담체 단백질의 N 말단 및 C 말단에 융합하여, P30CRM197AP30으로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 17로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 17)
Figure pct00014
2-2-4. P30P30-N 말단-CRM197A 키메라 담체 단백질(P30P30CRM197A)의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P30P30CRM197A로 명명되는 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 18로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 18)
Figure pct00015
2-2-5. CRM197A -C 말단- P30P30 키메라 담체 단백질( CRM197AP30P30 )의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, CRM197AP30P30으로 명명되는 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 19로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 19)
Figure pct00016
2-2-6. P30P30 -N 말단- CRM197A -C 말단-P30 키메라 담체 단백질( P30P30CRM197AP30 )의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P30P30CRM197AP30로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 20으로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 20)
Figure pct00017
2-2-7. P30-N 말단- CRM197A -C 말단- P30P30 키메라 담체 단백질( P30CRM197AP30P30 )의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, P30(서열 번호 1)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P30CRM197AP30P30으로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 21로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 21)
Figure pct00018
2-3. OVAp 및 CRM197A를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-3-1. OVAp-N 말단-CRM197A 키메라 담체 단백질(OVApCRM197A)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, OVApCRM197A로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 22로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 22)
Figure pct00019
2-3-2. CRM197A-C 말단-OVAp 키메라 담체 단백질(CRM197AOVAp)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, CRM197AOVAp로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 23으로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 23)
Figure pct00020
2-3-3. OVAp-N 말단-CRM197A-C 말단-OVAp 키메라 담체 단백질(OVApCRM197AOVAp)의 서열 디자인
각각, OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 및 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해, 각각 CRM197A 담체 단백질의 N 말단 및 C 말단에 융합하여, OVApCRM197AOVAp로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 24로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 24)
Figure pct00021
2-3-4. OVApOVAp-N 말단-CRM197A 키메라 담체 단백질(OVApOVApCRM197A)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, OVApOVApCRM197A로 명명되는 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 25로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 25)
Figure pct00022
2-3-5. CRM197A-C 말단-OVApOVAp 키메라 담체 단백질(CRM197AOVApOVAp)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, CRM197AOVApOVAp로 명명되는 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 26으로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 26)
Figure pct00023
2-3-6. OVApOVAp-N 말단-CRM197A-C 말단-OVAp 키메라 담체 단백질(OVApOVApCRM197AOVAp)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, OVAp의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, OVApOVApCRM197AOVAp로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 27로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 27)
Figure pct00024
2-3-7. OVAp-N 말단-CRM197A-C 말단-OVApOVAp 키메라 담체 단백질(OVApCRM197AOVApOVAp)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, OVAp(서열 번호 3)의 2 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, OVApCRM197AOVApOVAp로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 28로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 28)
Figure pct00025
2-4. 적어도 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
3개의 상이한 유니버셜 에피토프, P2, P30 및 OVAp의 조합을 각각, CRM197A 담체 단백질에 융합하여, 새로운 키메라 담체 단백질을 서열 디자인하였다.
2-4-1. P2-N 말단-CRM197A-C 말단-P30 키메라 담체 단백질(P2CRM197AP30)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고, P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2CRM197AP30으로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 29로 하기에 나타낸다. P2 및 P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 29)
Figure pct00026
2-4-2. P30-N 말단-CRM197A-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(P30CRM197AP2)의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P30CRM197AP2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 30으로 하기에 나타낸다. P2 및 P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 30)
Figure pct00027
2-4-3. P2P30-N 말단-CRM197A-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(P30CRM197AP2)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열 및 P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2P30CRM197AP2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 31로 하기에 나타낸다. P2, P30 및 OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 31)
Figure pct00028
2-4-4. P2P30-N 말단-CRM197A-C 말단-OVAp 키메라 담체 단백질(P2P30CRM197AOVAp)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열 및 P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CRM197A 담체 단백질(서열 번호 4)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CRM197A 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2P30CRM197AOVAp로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 32로 하기에 나타낸다. P2, P30 및 OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 32)
Figure pct00029
II. CM197A 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(들)를 포함하는 키메라 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
1. CRM197A 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
완전 CRM197 단백질, PRF:224021의 아미노산 서열을 젠뱅크(GenBank)로부터 얻고, CRM197의 사슬 A 단편(이하, CRM197A로 명명됨)의 서열은 CRM197 서열의 아미노산 1 내지 193개인 것으로 측정되었다. CRM197A 서열에 기초하여, CRM197A 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 최적화하여, 대장균에서 사슬 A 단편의 고 효율 발현을 가능하게 하였다. 커스텀(custom) 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. CRM197A의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 CRM197A 서열에 발견되지 않았다. CRM197A 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 33으로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 33)
Figure pct00030
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 CRM197A 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑(mapping)을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터(master) 스톡 및 워킹(working) 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리(stock library)를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2. CRM197A 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
2-1. P2CRM197A의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P2CRM197A의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P2CRM197A 서열에 발견되지 않았다. P2CRM197A 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 34로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 34)
Figure pct00031
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P2CRM197A 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-2. P2CRM197AP2의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P2CRM197AP2의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P2CRM197AP2 서열에 발견되지 않았다. P2CRM197AP2 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 35로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 35)
Figure pct00032
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P2CRM197AP2 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-3. CRM197AP2, P2P2CRM197A, CRM197AP2P2, P2P2CRM197AP2 및 P2CRM197AP2P2의 발현 플라스미드의 구축
방법은 섹션 "2-1. P2CRM197A의 발현 플라스미드의 구축"에서 상술한 바와 동일하다.
2-4. P30CRM197A의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30CRM197A의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30CRM197A 서열에 발견되지 않았다. P30CRM197A 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 36으로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 36)
Figure pct00033
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30CRM197A 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-5. CRM197AP30, P30CRM197AP30, P30P30CRM197A, CRM197AP30P30, P30P30CRM197AP30 및 P30CRM197AP30P30의 발현 플라스미드의 구축
방법은 섹션 "2-4. P30CRM197A의 발현 플라스미드의 구축"에서 상술한 바와 동일하다.
2-6. OVApCRM197A의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. OVApCRM197A의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 OVApCRM197A 서열에 발견되지 않았다. OVApCRM197A 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 37로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 37)
Figure pct00034
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 OVApCRM197A 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-7. CRM197AOVAp, OVApCRM197AOVAp, OVApOVApCRM197A, CRM197AOVApOVAp, OVApOVApCRM197AOVAp 및 OVApCRM197AOVApOVAp의 발현 플라스미드의 구축
방법은 섹션 "2-6. OVApCRM197A의 발현 플라스미드의 구축"에서 상술한 바와 동일하다.
2-8. P30CRM197AP2의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30CRM197AP2의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30CRM197AP2 서열에 발견되지 않았다. P30CRM197AP2 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 38로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 38)
Figure pct00035
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30CRM197AP2 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-9. P2CRM197AP30, P2P30CRM197AP2 및 P2P30CRM197AOVAp의 발현 플라스미드의 구축
방법은 섹션 "2-8. P30CRM197AP2의 발현 플라스미드의 구축"에서 상술한 바와 동일하다.
III. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CRM197A 키메라 담체 단백질의 제조
실험에 의해, CRM197A 담체 단백질과, CRM197A 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 유사 특성을 입증하였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 모든 담체 단백질의 정제법은 유사하다. CRM197A 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 예시적인 제조 방법이 이하에 기재된다.
1. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 제조
키메라 담체 단백질을 발현하는 각각의 플라스미드를 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 컴피턴트 세포로 형질전환시켜, 단백질 발현을 조사하였다. 단백질 발현 레벨이 높고 항혈청 시험을 통과한 클론을 선택하여, 마스터 스톡 라이브러리 및 워킹 스톡 라이브러리를 구축하였다.
2. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 발효
유니버셜 에피토프를 포함하는 특이적 CRM197A 키메라 담체 단백질을 발현할 수 있는 1개의 튜브의 세균을 저온 냉동기의 유전자 조작된 대장균 워킹 스톡 라이브러리로부터 채취하여, 실온에서 해동시켰다. 워킹 스톡 중의 세균 현탁액을 무균 조작을 이용하여 50 mL 배지로 옮겨, OD600가 약 1.0에 이를 때까지 180 rpm의 진탕 속도로 37℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 그 다음에 세균 배양물을 사용하여 1L 배지에 접종시켜, OD600가 약 1.0에 이를 때까지 180 rpm의 진탕 속도로 37℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 그 후에 1L 세균 배양물을 사용하여 50 L 발효조의 20 L 배지에 접종한 다음에, 240 rpm 및 37℃에서 발효시켰다. OD600가 약 7 내지 8에 이르면, IPTG를 배양물에 첨가하여, 세균에서 단백질 발현을 유도하였다. 발효 과정 개시로부터 14시간 후에 발효를 중지시켰다. 발효된 세균 배양물을 원심분리하여, 세균을 채취하였다.
3. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CRM197A 키메라 담체 단백질의 정제
CRM197A를 유니버셜 에피토프를 갖는 다양한 키메라 담체 단백질을 구축하는데 코아 성분으로서 사용하기 때문에, 실험에 따르면, 유니버셜 에피토프의 첨가에도 불구하고, 단백질 정제에 관한 파라미터는 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. CRM197A 담체 단백질의 정제 절차를 변경시켜, 유니버셜 에피토프를 포함하는 CRM197A 키메라 담체 단백질의 정제 방법을 구축할 수도 있다.
50 g의 젖은 세균을 2 L 원심분리컵에 칭량하였다. 상기 컵에 300 mL 1X PBS pH 7.0 완충액을 첨가하여, 세균을 재현탁시켰다. 세균 현탁액을 자석 교반 플레이트 상에서 30분간 완전히 혼합한 다음에, 4℃, 4000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세균을 채취하였다. 이들 단계를 2회 반복하였다. 세균을 갖는 원심분리관에, 300 mL 1X PBS pH 7.0을 첨가하였다. 세균을 호모게나이저에서 용해시켜, 4℃, 10000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 펠릿을 채취하고, 상청액을 버렸다. 펠릿에 300 mL 1X PBS pH 7.0 완충액을 첨가하여, 혼합물을 자석 교반 플레이트 상에서 30분간 완전히 혼합하였다. 혼합물을 4℃, 4000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 봉입체를 채취하고, 상청액을 버렸다. 900 mL 변성 용액을 세정된 봉입체에 첨가하였다. 그 다음에 혼합물을 25℃, 10000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 상청액을 6 내지 8 KDA 투석 백에 옮겼다. 투석 백을 밀봉시켜, 10 L 리폴딩 완충액 1에 넣어, 자석 교반 플레이트 상에서 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 10L 리폴딩 완충액 2에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 투석 백을 10 L 투석 완충액 3에 옮기고, 교반하여, 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 10L 리폴딩 완충액 4에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 투석 백을 10 L 리폴딩 완충액 5에 옮기고, 교반하여, 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 2L 저장 완충액에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 저장 완충액을 2회 교체하여, 투석을 실온에서 하룻밤 동안 행하였다. 1 mL 투석 용액을 얻어, 실온 및 12000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하여, 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 시료를 미리 평형화시킨 DEAE 겔 컬럼 상에 로딩하고, 그래디언트 모드(gradient mode)를 사용하여 용리하여, 표적 단백질 피크를 수집하였다. 그 다음에 채취된 시료를 추가의 정제를 위해 페닐 소수성 컬럼 상에 로딩하고, 용출 피크를 수집하였다. 최종적으로, 채취된 시료를 SP 겔 컬럼 상에 로딩하고, 용출 피크를 수집하였다. 채취된 정제된 표적 단백질을 투석 백에 옮기고, 0.15 M NaCl 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석된 시료를 4℃ 저장고에 옮겼다.
IV. 세균 협막 다당류의 제조
접합체 백신을 제조하기 위해, 폐렴연쇄구균, b형 인플루엔자균, 및 A, C, Y 및 W135군의 수막염균의 13종 혈청형을 포함한 세 가지 세균종의 협막 다당류를 정제하였다. 정제된 협막 다당류의 품질은 다당류-단백질 접합체 백신의 합성에 사용되는 다당류에 대한 WHO 기준을 충족시킨다.
1. 폐렴연쇄구균의 협막 다당류의 제조
1-1. 스톡 라이브러리의 구축
1(품목 번호(item number): 9163), 3(품목 번호: 10813), 4(품목 번호: BAA-334), 5(품목 번호: BAA-341), 6A(품목 번호: BAA-659), 6B(품목 번호: 700675), 7F(품목 번호: 10351), 9V(품목 번호: 700671), 14(품목 번호: 6314), 18C(품목 번호: 10356), 19A(품목 번호: 700673), 19F(품목 번호: 700905) 및 23F(품목 번호: 700669)를 포함한, 폐렴연쇄구균의 13종 혈청형 균주를 ATCC로부터 구입하였다. ATCC(오리지널 스톡)로부터 구입한 각각의 세균 균주에, 0.5 mL 폐렴연쇄구균 액체 배지 AHC를 첨가하여, 세균 균주와 함께 완전히 혼합하였다. 0.25 mL의 세균 배양물을 사용하여, 5% 양 혈액을 함유하는 AHC 배지에 접종시켜, 36℃ ± 1℃, 120 rpm의 진탕기에서 약 12 내지 20시간 동안 배양하였다. OD600가 1.0에 이른 후에, 접종 루프(inoculation loop)를 사용하여 AHC 한천 평판 상에 5% 양 혈액을 함유하는 AHC 배양물을 접종시켜, 36℃ ± 1℃의 배양기에서 12 내지 20시간 동안 배양하였다. 접종 루프를 사용하여, 1개 내지 여러개의 세균 콜로니를 각 10 mL AHC 배양액에 접종시켜, 150 내지 200 rpm의 진탕 속도로 36℃ ± 1℃의 진탕기에서 12시간 동안 배양하였다. 세균 배양물의 OD600가 1.0에 이르면, 5 mL의 세균 AHC 배양물을 사용하여 새로운 200 mL AHC 배양물에 접종시켜, 150 내지 200 rpm의 진탕 속도로 36℃ ± 1℃의 진탕기에서 12시간 동안 배양하였다. OD600가 1.0에 이른 후에, 세균 배양물을 200개의 작은 시험관에 일정 분량을 취해 각각 1 mL 세균 배양물을 포함하게 하여, 원심분리하였다(4000 rpm, 10분). 상청액을 버리고, 0.5 mL 새로운 AHC 배양액 및 0.5 mL 멸균 탈지유를 펠릿에 첨가하고, 완전히 혼합하여, 에탄올-드라이아이스욕에서 급속 냉동시켰다. 그 다음에 시료를 동결 건조시키고, 넘버링하여, 마스터 스톡으로서 4℃ 냉동기에 보관하였다. 마스터 스톡을 채취하고, 마스터 스톡 구축 방법을 사용하여, 워킹 스톡을 구축하였다: 세균 배양물을 사용하여, 새로운 200 mL AHC 배양액에 접종시켜, 150 내지 200 rpm의 진탕 속도로 36℃ ± 1℃의 진탕기에서 12시간 동안 배양하였다. OD600가 1.0에 이른 후에, 세균 배양물을 200개의 작은 시험관에 일정 분량을 취해 각각 1 mL 세균 배양물을 포함하게 하여, 원심분리하였다(4000 rpm, 10분). 상청액을 버리고, 0.6 mL 새로운 AHC 배양액 및 0.4 mL 40% 글리세롤 용액을 시료에 첨가하여, 완전히 혼합하고, 드라이아이스 상에서 급속 냉동시켜, 워킹 스톡으로서 -70℃ 저온 냉동기에 보관하였다.
1-2. 폐렴연쇄구균의 발효
동결 건조된 워킹 스톡을 스톡 라이브러리로부터 채취하고, 1 mL AHC 영양 풍부 배양액을 첨가하여, 동결 건조 세균을 용해시켰다. 용해된 세균 용액을 사용하여, 시험관 중의 5 mL AHC 영양 풍부 배양액에 접종시키고, CO2 배양기에 정치시켜 하룻밤 동안 배양하였다. 세균 증식이 관찰되면, 세균 배양물을 사용하여, 플라스크 중의 100 mL AHC 영양 풍부 배지에 접종시켰다. 플라스크를 진탕기에 넣어, OD600가 1.0에 이를 때까지 36℃, 200 rpm에서 배양하였다. 100 mL 세균 배양물의 2회 분취량을 각각 사용하여, 각각 배양병 중의 1L AHC 영양 풍부 배지에 접종시켰다. 배양병을 진탕기에 넣어, OD600가 1.0에 이를 때까지 36℃, 200 rpm에서 배양하였다. 35 L의 세균 여과된 AHC 영양 풍부 배양액을 50 L 발효조에 옮겼다. OD가 1인 2L 세균 배양물을 발효조에 옮겼다. 세균 증식이 분열 정지기(plateau phase)에 이르면, 세균을 사멸시키고, 상청액을 채취하였다.
1-3. 협막 다당류의 정제
심층 여과기(depth filter)를 사용하여, 상청액을 여과하여, 잔존하는 세균 및 잔해를 더욱 제거하였다. 무균 상청액을 100 KDa 한외여과막을 사용하여 10회 농축시켰다(약 600 mL). 6 L 25 mM 아세트산나트륨을 한외여과 워시로 사용하였다. HB 보존 용액을 첨가하여, 1% (w/v)의 최종 농도를 얻고, 완전히 혼합하여, 냉장실에 하룻밤 동안 보관하였다. 용액을 4000 rpm으로 1시간 원심분리하여, 다당류/HB 침전물을 채취하고, 상청액을 버렸다. 25 mM 아세트산나트륨 및 1% HB 용액을 다당류/HB 침전제에 첨가하고, 교반하여 재현탁시킨 다음에, 재현탁액을 4000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여, 다당류/HB 침전제를 채취하고, 상청액을 버렸다. 원심분리 과정을 3회 반복하였다. 600 mL 0.25 M 염화나트륨 용액을 다당류 + HB 혼합물에 첨가하여, 완전히 혼합하고, 요오드화칼륨을 0.5%의 최종 농도로 첨가하였다. 용액을 하룻밤 동안 냉장실에 보관하였다. 용액을 심층 여과기를 사용하여 여과하여, HB/I 침전제를 제거하고, 0.25 M 염화나트륨/0.5% 요오드화칼륨 용액을 사용하여 심층 여과기 상의 침전제를 세정하였다. 여과액을 수집하고, 침전제를 버렸다. 조(crude) 다당류 용액을 활성탄을 갖는 심층 여과기에서 30분간 루프 여과하였다(4% 활성탄 여과기/0.5 mg/ml 조 다당류 용액). 인산나트륨 완충액 pH 6.8을 25 mM의 최종 농도로 다당류 용액에 첨가하였다. 상기 용액을 HA 컬럼(50 내지 100 ml)을 통해, 30분간 순환시켰다. 동일한 인산염 완충액을 사용하여, 컬럼을 4 내지 5배의 컬럼 체적으로 세정하였다. 30 KDa 막을 사용하여, 다당류 용액을 5회 한외여과 농축시켰다. 발열성 물질 제거 증류수(pyrogen-free water)를 사용하여, 다당류 용액을 한외여과 세정하였다. 0.22 μm 막을 사용하여, 다당류 용액을 여과한 다음에, 동결 건조시켰다.
2. b형 인플루엔자균의 협막 다당류의 제조
2-1. 스톡 라이브러리의 구축
기프트(gift)로서 얻은 b형 인플루엔자균 세균 균주를 오리지널 스톡으로서 사용하여, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 구축하였다. 스톡을 구축하는 방법은 폐렴연쇄구균의 스톡 라이브러리의 구축 섹션에 설명되어 있다.
2-2. b형 인플루엔자균의 발효
b형 인플루엔자균(Hib) 워킹 스톡을 사용하여, 평판배지에 접종시켜, 36.5 ℃ 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다. Hib 콜로니를 취해, 5 mL 새로운 필수 배지에 접종시켜, 36.5 ℃ 및 300 rpm의 진탕기에서 배양하였다. 접종된 배양물이 0.6 내지 1.0의 OD와 함께 중간 대수증식기에 이르면, 접종된 배양물을 45 mL 새로운 필수 배지를 함유하는 250 mL 배양 플라스크에 옮겨, 36.5 ℃ 및 300 rpm의 진탕기에서 배양하였다. 접종된 배양물이 0.6 내지 1.0의 OD와 함께 중간 대수증식기에 이르면, 접종된 배양물을 1 L 새로운 필수 배지를 함유하는 4 L 배양 플라스크에 옮겨, 36.5 ℃ 및 300 rpm의 진탕기에서 배양하였다. 접종된 배양물이 0.6 내지 1.0의 OD와 함께 중간 대수증식기에 이르면(약 16 내지 18시간), 접종된 배양물을 20 L 새로운 필수 배지를 함유하는 발효조에 옮겼다. Hib 세균이 중간 대수증식기에 이르면, 새로운 필수 배지 및 보충 배지를 첨가하여, 배지 중의 최종 글루코스 농도 23 g/L를 얻었다. 첨가된 새로운 보충 배양액은 총체적이 25 L이었다. 배양한 지 14.5 시간 후에 발효를 중지시켰다.
2-3. 협막 다당류의 정제
Hib 배양물을 원심분리하여, 펠릿형 Hib 세균을 채취하고, 2L 증류수에 재현탁시켜, 자석 교반기를 사용하여 완전히 혼합하였다. 200 mL 12% 데옥시콜산나트륨 용액을 세균 현탁액에 첨가하여, 30분간 완전히 혼합하고, 10℃ ± 3 ℃ 냉장실로 옮겨, 세균을 용해시키고 다당류를 방출하기 위해 8 내지 24시간 동안 교반하였다. 20 ℃ ± 5 ℃에서 50% 아세트산 용액을 사용하여, 세균 용해물의 pH를 6.4 내지 6.8로 조절하고, 교반을 중지하여, 용액을 12 내지 24시간 동안 정치시켰다. 용액을 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여, 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 0.05 M 인산염 완충액 pH 7.0을 사용하여, 다당류 상청액에 대하여 투석하였다. 동일 체적의 0.2% HB 용액을 첨가하고, 자석 교반기를 사용하여 30분간 혼합한 다음에, 4℃ 냉장실에 옮겨, 하룻밤 동안 정치시켰다. 용액을 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여, 펠릿을 채취하고, 상청액을 버렸다. 100 mL 0.5 M 염화나트륨 용액을 첨가하여, 펠릿을 용해시켰다. 680 mL 무수 에탄올을 첨가하여, 완전히 혼합한 다음에, 4℃ 냉장실에 옮겨, 하룻밤 동안 정치시켰다. 용액을 10,000 rpm으로 30분간 원심분리하여, 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 5.2 mL 무수 에탄올을 첨가하여, 완전히 혼합한 다음에, 4℃ 냉장실에 옮겨, 하룻밤 동안 정치시켰다. 용액을 10,000 rpm으로 30분간 원심분리하여, 펠릿을 채취하고, 상청액을 버렸다. 500 mL 증류수를 첨가하여, 펠릿을 용해시킨 다음에, 투석하여, 동결 건조시켰다.
3. 수막염균의 협막 다당류의 제조
3-1. 스톡 라이브러리의 구축
기프트로서 얻은 수막염균 세균 균주 A, C, Y 및 W135를 원균주(original strain)로서 사용하여, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 구축하였다. 스톡을 구축하는 방법은 폐렴연쇄구균의 스톡 라이브러리의 구축 섹션에 설명되어 있다.
3-2. 수막염균의 발효 및 협막 다당류의 정제
Hib의 발효 및 Hib 다당류의 정제에 관한 대응 섹션을 참조한다.
V. 다당류-단백질 접합체의 제조
다양한 세균성 다당류의 화학 구조는 다양한 작용기를 포함한다. 따라서, 다양한 다당류를 담체 단백질에 공유 결합하여, 접합체를 형성하는데 다양한 합성 방법이 요구된다. 다양한 합성 방법에 의해 형성된 접합체의 수율 및 면역원성은 각각 다를 수 있다. 본 발명의 실험 결과에 의하면, 세 가지의 다양한 합성 방법, 즉, 환원적 아미노화, CDAP 방법(3-(에틸이미노메틸렌아미노)-N,N-다이메틸-프로판-1-아민 사용) 및 ADH 방법(아디프산 다이하이드라자이드)은 특이적 다당류-단백질 접합체를 합성한다는 것을 나타내었다. 본 발명의 예시적인 다당류-단백질 접합체로는 13가 폐렴연쇄구균(Pn) 다당류 접합체, b형 인플루엔자균(Hib) 다당류 접합체 및 4가 수막염균(Men) 다당류 접합체를 들 수 있다.
1. 13가 폐렴연쇄구균(Pn) 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 26 종류의 다당류-단백질 접합체를 서열 디자인하여 제조하였다. 단백질의 구조가 유사하기 때문에, 환원적 아미노화, ADH 방법 및 CDAP 방법 중에서 선택되는 동일한 방법을 사용하여, 다당류-단백질 접합체를 합성한다. 이하의 실시예는 단지 예시 목적으로, P2CRM197A 키메라 담체 단백질을 사용한 합성 과정을 보여준다. 다른 키메라 담체 단백질을 사용한 합성 방법이 유사하므로, 본 명세서에서 상세히 설명하지 않는다.
1-1. 폐렴연쇄구균 혈청형 1( Pn1 ) 협막 다당류- P2CRM197A 접합체의 제조
5 mg Pn1 소화된 다당류를 반응 플라스크에 칭량하고, 1 M NaCl 0.5 mL를 반응 플라스크에 첨가하였다. 다당류를 교반하여 완전히 용해시켰다. 다당류 용액의 초기 pH를 기록하고, 적정량의 CDAP 용액을 측정하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 교반하여, 실온에서 1.5분간 반응시켜, 혼합물의 pH를 30초 경과 시에 측정하였다. 1.5분 후에, 0.2 M NaOH 용액을 첨가하여, 용액의 pH를 9.5로 조절하고, 혼합물을 교반하여 실온에서 3분간 반응시켰다(0.2 M NaOH를 사용하여, 혼합물의 pH를 9.5로 유지시켰다). 3분 직후에, 반응 플라스크에 P2CRM197A 키메라 단백질 5 mg을 첨가하고, 혼합물을 교반하여, 실온에서(25℃) 1시간 동안 반응시켰다. 37.5 μL 2 M 라이신 용액을 반응 플라스크에 첨가하고, 0.1 N HCl 용액을 사용하여, 혼합물의 pH를 9.0으로 조절하였다. 혼합물을 교반하여, 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 플라스크를 4℃로 전환시켜, 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8000)으로 옮겨, 4℃에서 0.85% NaCl 용액에 대하여 3회(6 L/회) 투석시켰다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스(Sepharose) CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-2. 폐렴연쇄구균 혈청형 3(Pn3) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
20 mg Pn1 소화된 다당류를 반응 플라스크에 칭량하고, 0.15 M NaCl 2 mL를 반응 플라스크에 첨가하였다. 다당류를 교반하여 완전히 용해시켰다. 적정량의 CDAP 용액을 측정하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 교반하여, 실온에서 1.5분간 반응시켜, 혼합물의 pH를 30초 경과 시에 측정하였다. 1.5분 후에, 0.2 M NaOH 용액을 첨가하여, 용액의 pH를 9.5로 조절하고, 혼합물을 교반하여 실온에서 3분간 반응시켰다(0.2 M NaOH를 사용하여, 혼합물의 pH를 9.5로 유지시켰다). ADH를 반응 플라스크에 첨가하여, 0.8 M의 최종 농도로 이르게 하고, 완전히 혼합하여, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 유도된 다당류를 투석 백에 옮겨, 0.15 M NaCl 용액에 대하여 투석시키고, NaCl 용액을 3회 교체하였다. 시료를 G-50 컬럼 상에 로딩하고, 0.15 M NaCl을 사용하여 용리시켜, 공간 용적(void volume)을 제외한 피크를 수집하였다. 채취된 시료를 투석 백에 옮겨, 물에 대하여 투석시키고, 물을 3회 교체하였다. 유도된 Pn3 다당류 5 mg을 칭량하여, 0.15 M NaCl 용액 0.5 mL에 용해시켰다. P2CRM197A 키메라 단백질 5 mg을 첨가하여, 완전히 혼합하였다. 30 mM EDC를 첨가하여, 실온에서 4시간 반응시키고, 4℃로 전환시켜, 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8000)으로 옮겨, 4℃에서 0.85% NaCl 용액에 대하여 3회(6 L/회) 투석시켰다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-3. 폐렴연쇄구균 혈청형 4(Pn4) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
5 mg 활성 다당류를 반응 플라스크에 칭량하고, 0.5 M 인산나트륨 완충액 100 μL를 측정하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. P2CR197A 키메라 단백질 5 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 다당류가 완전히 용해될 때까지, 혼합물을 교반하였다. 0.5 mL 순수를 측정하여, 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여 완전히 혼합하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5.0 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응계를 40℃ 드라이 배스(dry bath)에 넣어, 12시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후에, 0.15 M 염화나트륨 용액 1.5 mL를 반응 플라스크에 첨가하였다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응계를 22℃로 두어, 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 12-14 kDa)으로 옮겨, 4℃에서 0.15 M NaCl 용액에 대하여 3회(6 L/회) 투석시켰다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-4. 폐렴연쇄구균 혈청형 5(Pn5) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
5 mg 활성 다당류를 반응 플라스크에 칭량하고, 0.5 M 인산나트륨 완충액 100 μL를 측정하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. P2CR197A 키메라 단백질 4.0 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 0.5 mL 순수를 측정하여, 반응 플라스크에 첨가하고, 자석 교반하여 혼합하여 반응물을 용해시키고, 반응 혼합물의 pH를 측정하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5.0 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응계를 실온에 두어, 48시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 칭량하고, 피펫을 사용하여 10 μL 순수에 용해시켜, 반응 플라스크에 로딩하였다. 반응계를 23℃로 두어, 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8 KDA)으로 옮겨, 4℃에서 0.15 M NaCl 용액에 대하여 3회 투석시키고, NaCl 용액을 5시간마다 교체하였다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-5. 폐렴연쇄구균 혈청형 6A( Pn6A ) 협막 다당류- P2CRM197A 접합체의 제조
6.0 mg 활성 다당류 Pn6A를 반응 플라스크에 칭량하였다. 1 mL 순수를 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 교반하고, 용액의 초기 pH를 측정하였다. 0.1 M NaOH를 사용하여, 용액의 pH를 7.0으로 조절하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 4.0 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 충분히 교반하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5.0 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 시료를 채취하여, 검사를 위해 보냈다. 수소화붕소나트륨 2.7 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 후에 시료를 채취하여, 검사를 위해 보냈다. 반응 혼합물을 투석 백으로 옮겨, 4℃에서 0.15 M NaCl 용액에 대하여 3회(6 L/회) 투석시켰다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-6. 폐렴연쇄구균 혈청형 6B(Pn6B) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
5.0 mg Pn6B 다당류를 반응 플라스크에 칭량하였다. 1 mL 순수를 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 교반하고, 용액의 초기 pH를 측정하였다. 0.1 M NaOH를 사용하여, 용액의 pH를 7.0으로 조절하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 2.5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 충분히 교반하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5.0 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 20시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백으로 옮겨, 4℃에서 0.15 M NaCl 용액에 대하여 5회(6 L/회) 투석시켰다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-7. 폐렴연쇄구균 혈청형 6F(Pn6B) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
10.0 mg Pn6F 다당류를 반응 플라스크에 칭량하였다. 1 mL 순수를 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 0.1 M NaOH를 다당류 용액에 적가하여, 용액의 pH를 7.0으로 조절하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 3.5 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 완전히 혼합하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5.0 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 20시간 동안 반응시켰다. 물 990 μL를 반응 플라스크에 첨가하여, 완전히 혼합하였다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8KDA)에 옮겨, 4℃에서 5 mM 석신산염/0.9% 염화나트륨 완충액에 대하여 5회(6 L/회) 투석시켰다. 투석 후에, 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-8. 폐렴연쇄구균 혈청형 9V(Pn9V) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
10.0 mg Pn9V 활성 다당류를 반응 플라스크에 칭량하였다. 125 μL 인산나트륨 완충액을 반응 플라스크에 첨가하였다. 125 μL 순수를 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 교반하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 15 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 완전히 용해시켰다. NaBH3(CN) 10 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응계를 22℃로 두어, 48시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 칭량하고, 반응 플라스크에 첨가하여, 22℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-9. 폐렴연쇄구균 혈청형 14(Pn14) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
5 mg Pn14 활성 다당류를 반응 플라스크에 칭량하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 1 ml 3.9 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 다당류를 완전히 용해시켰다. 시아노수소화붕소나트륨 5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 22℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 반응 플라스크를 린스하는데 사용되는 투석 용액 2 mL를 포함하여, 투석 백(MWCO 12-14 KDA)에 옮겼다. 반응 혼합물을 0.15 M 염화나트륨 용액에 대하여 3회(6 L/회) 투석시키고, 염화나트륨 용액을 5시간마다 교체하였다. 투석 후에, 투석된 시료를 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-10. 폐렴연쇄구균 혈청형 18C(Pn18C) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
5 mg Pn18C 소화된 다당류를 반응 플라스크에 칭량하고, 1 mL 1M 염화나트륨 용액을 첨가하여, 다당류를 용해시켰다. 용해된 용액의 초기 pH를 측정하였다. 적정량의 CDAP 용액를 첨가하여, 실온에서 1.5분간 교반하였다. 0.2 M NaOH 용액을 첨가하여, 혼합물의 pH를 9.0으로 조절하였다. 그 다음에 혼합물을 실온에서 3분간 반응시켰다. P2CRM197A 키메라 단백질 10 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 25℃에서 45분간 반응시켰다. 반응 완료 후에, 2M 라이신 용액 37.5 μL를 첨가하여, 25℃에서 30분간 반응시켰다. 그 다음에 혼합물을 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8 KDA)으로 옮겨, 0.85% 염화나트륨 용액에 대하여 염화나트륨 용액을 교체하면서 3회(6 L/회) 투석시키고, 염화나트륨 용액을 5시간마다 교체하였다. 투석 후에, 투석된 시료를 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-11. 폐렴연쇄구균 혈청형 19A(Pn19A) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
10 mg Pn19A 활성 다당류를 반응 플라스크에 칭량하였다. 0.5 mL 완충액을 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 자석 막대를 사용하여 교반하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 10 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 완전히 혼합하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 20시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8 KDA)으로 옮겨, 0.85% 염화나트륨 용액에 대하여 3회(6 L/회) 투석시키고, 염화나트륨 용액을 5시간마다 교체하였다. 투석 후에, 투석된 시료를 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-12. 폐렴연쇄구균 혈청형 19F(Pn19F) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
5.2 mg 산화 Pn19F 다당류를 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 순수 1 mL를 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 자석 막대를 사용하여 교반하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 3.0 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 완전히 혼합하였다. 시아노수소화붕소나트륨 4.9 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 자석 교반 플레이트 상에서 교반하여, 18℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 배양기에서 18℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 12-14 KDA)에 옮겨, 투석 용액에 대하여 5회(투석 용액 6 L/회) 투석시키고, 투석 용액을 5시간마다 교체하였다. 투석 후에, 투석된 시료를 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
1-13. 폐렴연쇄구균 혈청형 23F(Pn23F) 협막 다당류-P2CRM197A 접합체의 제조
4.9 mg 산화 Pn23F 다당류를 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 순수 1 mL를 반응 플라스크에 첨가하여, 다당류가 완전히 용해될 때까지 자석 막대를 사용하여 교반하였다. P2CRM197A 키메라 단백질 5.0 mg을 반응 플라스크에 첨가하였다. 시아노수소화붕소나트륨 5.1 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 자석 교반 플레이트 상에서 교반하여, 배양기에서 18℃에서 17시간 동안 반응시켰다. 수소화붕소나트륨 2.5 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 배양기에서 18℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 12-14 KDA)에 옮겨, 0.15 M 염화나트륨 용액에 대하여 5회(투석 용액 6 L/회) 투석시키고, 투석 용액을 5시간마다 교체하였다. 투석 후에, 투석된 시료를 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 상청액을 수집하였다. 상청액을 정제하고, 세파로오스 CL-4B 겔 컬럼을 사용하여 투석시켜, 접합체 피크를 수집하고, 시료를 채취하여 검사를 위해 보냈다.
2. b형 인플루엔자균(Hib) 다당류-P2CRM197A(Hib-P2CRM197A) 접합체의 제조
b형 인플루엔자균(Hib) 접합체 백신을 합성하는 실시예에서, P2CRM197A, P2CRM197AP2, P30CRM197A, OVApCRM197A, P30CRM197AP2 및 P2P30CRM197AOVAp 키메라 담체 단백질을 비롯한, 유니버셜 에피토프 및 CRM197 담체 단백질을 포함하는 6종의 키메라 담체 단백질을 사용하였다. 다양한 키메라 담체 단백질을 갖는 Hib 접합체를 합성하는 방법이 유사하므로, P2CRM197A 키메라 담체 단백질을 사용하는 방법은 접합체 합성 방법을 설명하기 위해 본 발명에서 일례로서 사용된다.
ADH 방법을 사용하여, Hib 접합체를 합성하였다. 이러한 방법의 합성 단계는 Hib 다당류 유도 단계 및 접합체 합성 단계로 나누어질 수 있다.
2-1. Hib 다당류 유도 단계
5 mg Hib 다당류를 순수 1 mL에 용해시키고, 브롬화시안을 첨가하여 활성화시켰다. 반응 혼합물에 ADH 용액 2 mL를 첨가하여, 0.4 M의 최종 농도에 이르게 하여 2 내지 8℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 0.2 M 염화나트륨에 대하여 투석시켰다. 시료를 G-50 컬럼 상에 로딩하고, 공간 용적을 제외한 피크를 수집하였다. 접합체 시료를 투석 백으로 옮겨, 순수에 대하여 투석시키고, 동결 건조시켜, 고체 다당류 유도체를 얻었다. 다당류 유도체는 -20℃ 이하로 보존되어야 한다.
2-2. Hib 다당류-P2CRM197A 접합체의 합성
Hib 다당류 유도체 10 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 0.15 M NaCl 0.5 mL를 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 다당류를 용해시켜, 실온에 두고, 이어서 4℃에서 하룻밤 동안 두어, 다당류의 완전 용해를 확실히하였다. 혼합물 중의 다당류의 농도는 20 mg/mL이었다. 다당류 용액을 0.45 μm 막을 통해 반응 플라스크로 세균을 여과시켰다. 0.1 M NaOH 또는 0.1 N HCl을 사용하여, 여과된 용액의 pH를 5.5로 조절하였다. P2CRM197A 5 mg을 함유하는 용액을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 완전히 혼합하였다. EDC 2.9 mg을 반응 플라스크에 첨가하여, 4시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8 KDA)으로 옮겨, 4℃에서 0.15 M NaCl 용액에 대하여, 상기 NaCl 용액을 3회 교체하면서 투석시켰다. 투석된 시료를 세파로오스 CL-4B 컬럼을 통해 정제하고, 공간 용적을 제외한 피크를 수집하였다. 분석 결과에 근거하여, 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 세균을 여과하여, 4℃로 보관하였다.
2-3. Hib 다당류-CRM197A 접합체의 합성
상기 섹션 "Hib 다당류-P2CRM197A 접합체의 합성"에 기재된 방법에 따라, 본 발명은 CRM197AP2, P2CRM197AP2, P30CRM197A, OVApCRM197A, P30CRM197AP2, P2P30CRM197AOVAp를 비롯한, 유니버셜 에피토프를 포함하는 6종의 추가의 키메라 담체 단백질, 및 CRM197A 담체 단백질을 사용하는 대조군 시료를 선택하여, 총 7종의 접합체, 즉, Hib-CRM197AP2, Hib-P2CRM197AP2, Hib-P30CRM197A, Hib-OVApCRM197A, Hib-P30CRM197AP2, Hib-P2P30CRM197AOVAp 및 Hib-CRM197A를 제조한다.
3. 4가 수막염균 (Men) 다당류- P2CRM197A 접합체의 제조
ADH 방법을 사용하여, 수막염균 다당류-P2CRM197A 접합체를 합성하였다. 상기 방법은 두 가지 단계, 즉, 다당류 유도 및 접합체 합성을 갖는다.
3-1. 수막염균 A 균주 다당류- P2CRM197A 접합체( MenA - P2CRM197A )의 합성
3-1-1. 수막염균 균주 A( MenA ) 다당류의 유도
MenA 다당류 20 mg을 순수 4 mL에 용해시키고, 브롬화시안을 첨가하여 활성화시켰다. 반응 혼합물에 ADH 용액 10 mL를 첨가하여, 0.4 M의 최종 농도에 이르게 하여 2 내지 8℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 0.2 M 염화나트륨에 대하여 투석시켰다. 시료를 G-50 컬럼 상에 로딩하고, 공간 용적을 제외한 피크를 수집하였다. 접합체 시료를 투석 백으로 옮겨, 순수에 대하여 투석시키고, 동결 건조시켜, 고체 다당류 유도체를 얻었다. 다당류 유도체는 -20℃ 이하로 보존되어야 한다.
3-1-2. MenA 다당류-P2CRM197A 접합체의 합성
MenA 다당류 유도체 5 mg을 칭량하여, 반응 플라스크에 첨가하였다. 0.15 M NaCl 0.5 mL를 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 다당류를 용해시켜, 실온에 두고, 이어서 4℃에서 하룻밤 동안 두어, 다당류의 완전 용해를 확실히하였다. 혼합물 중의 다당류의 농도는 20 mg/mL이었다. 다당류 용액을 0.45 μm 막을 통해 반응 플라스크로 세균을 여과시켰다. 0.1 M NaOH 또는 0.1 N HCl을 사용하여, 여과된 용액의 pH를 5.5로 조절하였다. P2CRM197A 5 mg을 함유하는 용액을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 완전히 혼합하였다. EDC 2.9 mg을 반응 플라스크에 첨가하고, 교반하여, 4시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO 6-8 KDA)으로 옮겨, 4℃에서 0.15 M NaCl 용액에 대하여, 상기 NaCl 용액을 3회 교체하면서 투석시켰다. 투석된 시료를 세파로오스 CL-4B 컬럼을 통해 정제하고, 공간 용적을 제외한 피크를 수집하였다. 분석 결과에 근거하여, 접합체를 함유하는 분획을 모으고, 세균을 여과하여, 4℃로 보관하였다.
3-1-3. 다른 수막염균 다당류- CRM197A 접합체의 합성
상기 섹션 "MenA 다당류-P2CRM197A 접합체의 합성"에 기재된 방법에 따라, 수막염균 C군 다당류-P2CRM197A(MenC-P2CRM197A로 명명됨), 수막염균 Y군 다당류-P2CRM197A(MenY-P2CRM197A로 명명됨) 및 수막염균 W135군 다당류-P2CRM197A(MenW135-P2CRM197A로 명명됨)를 비롯한 3종의 추가의 접합체를 합성하였다.
3-2. 다른 4가 수막염균 다당류-CRM197A 접합체의 합성
이전 섹션 "4가 수막염균(Men) 다당류-P2CRM197A 접합체의 합성"에 기재된 방법에 따라, 본 발명은 CRM197AP2, P2CRM197AP2, P30CRM197A, OVApCRM197A, P30CRM197AP2, P2P30CRM197AOVAp을 비롯한, 유니버셜 에피토프를 포함하는 6종의 키메라 담체 단백질, 및 CRM197A 담체 단백질을 사용하는 대조군 시료를 선택하여, 총 7종의 접합체, 즉, 4Men-CRM197AP2, 4Men-P2CRM197AP2, 4Men-P30CRM197A, 4Men-OVApCRM197A, 4Men-P30CRM197AP2, 4Men-P2P30CRM197AOVAp 및 4Men-CRM197A를 제조한다.
VI. 다당류-단백질 접합체의 면역원성의 평가
대응하는 다당류-단백질 접합체를 사용하여 제조한 백신을 마우스에게 주입하였다. 혈액 시료를 채취하여, ELISA 분석법을 사용하여, 혈청의 항 다당류 항체 역가를 측정하였다. 옵소닌식균작용 분석을 이용하여, 면역원성의 증진을 평가하였다.
1. 13가 폐렴연쇄구균 다당류-단백질 접합체의 면역원성의 평가
1) 13가 Pn 다당류-P2CRM197A 접합체의 면역원성의 평가
유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체가 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 CRM197A 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체보다 우수한 면역원성을 갖는지의 여부를 평가하기 위해, 13가 Pn-CRM197A 접합체를 13가 Pn-CRM197A 키메라 담체 단백질 접합체의 면역원성의 증진을 평가하기 위한 대조군으로서 기능을 하도록 합성하였다.
1-1. 13가 Pn 다당류-P2CRM197A 단백질 접합체 백신 및 13가 Pn 다당류-CRM197A 단백질 접합체 백신의 제조
랩스케일(LABSCALE)™ 접선류 여과(tangential flow filtration; TFF) 시스템(Millipore, USA)을 사용하여, Pn-1, -3, -4, -5, -6A, -7F, -9V, -14, -18C, -19A, -19F 및 -23F 협막 다당류를 포함하는 접합체의 용액을 각각, 약 40 ㎍/mL의 다당류 농도로 농축시켰다. Pn-6B 혈청형 협막 다당류를 포함하는 접합체의 용액의 농도를 80 ㎍/mL의 다당류 농도로 농축시켰다. 하기 표 1에 기재된 다당류의 최종 농도에 따라, 대응하는 각 단일 혈청형 접합체의 계산 체적을 조제병에 첨가하였다.
[표 1]
접합체 혼합물을 0.22 μm 여과기를 통해 세균을 여과하였다. 멸균 인산알루미늄 겔을 첨가하여, 125 mg/ml의 최종 알루미늄 이온 농도에 이르게 하였다. 완충액을 최종 체적에 첨가하여, 0.5 ml/병으로 패키징하였다.
1-2. 유니버셜 에피토프를 갖는 다른 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 폐렴연쇄구균(Pn) 다당류-단백질 접합체의 제조
이전 섹션 "13가 Pn 다당류-P2CRM197AP2 단백질 접합체의 제조"에 기재된 방법에 따라, 본 발명에 의해 면역원성 평가 분석에 사용되는 하기 13가 Pn 다당류-CRM197 키메라 담체 단백질 접합체에 대응하는 백신을 제조하였다.
P2 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn 다당류 접합체를 사용하여 제조한 백신: 13Pn-CRM197AP2, 13Pn-P2CRM197AP2, 13Pn-P2P2CRM197A, 13Pn-CRM197AP2P2, 13Pn-P2P2CRM197P2 및 13Pn-P2CRM197AP2P2.
P30 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn 다당류 접합체를 사용하여 제조한 백신: 13Pn-P30CRM197A, 13Pn-CRM197AP30, 13Pn-P30CRM197AP30, 13Pn-P30P30CRM197A, 13Pn-CRM197AP30P30, 13Pn-P30P30CRM197AP30 및 13-P30CRM197AP30P30.
OVAp 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn 다당류 접합체를 사용하여 제조한 백신: 13Pn-OVApCRM197A, 13Pn-CRM197AOVAp, 13Pn-OVApCRM197AOVAp, 13Pn-OVApOVApCRM197A, 13Pn-CRM197AOVApOVAp, 13Pn-OVApOVApCRM197AOVAp 및 13Pn-OVApCRM197AOVApOVAp.
적어도 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn 다당류 접합체를 사용하여 제조한 백신: 13Pn-P30CRM197AP2, 13Pn-P2CRM197AP30, 13Pn-P2P30CRM197AP2 및 13Pn-P2P30CRM197AOVAp.
1-3. 마우스의 예방접종 및 채혈
5 내지 6주령의 70 KM57 마우스를 입수하였다. 각 마우스에게 제조된 13가 Pn 다당류-P2CRM197A 단백질 접합체 백신을 주입하였다. 주입량은 0.1 mL/마우스/회이었다. 마우스를 2개의 군으로 나누었다: 군 1은 13가 Pn 다당류-P2CRM197A 백신을 주사하고; 군 2는 대조군으로서, 13가 Pn 다당류-CRM197A 백신을 주사하였다. 마우스의 예방접종 스케쥴은 하기 표 2에 나타낸 바와 같았다:
[표 2]
Figure pct00037
혈액 시료를 원심분리관에 채취하여, 실온에서 2시간 동안 정치시키고, 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 피펫을 사용하여, 조심스럽게 상청액으로부터 혈청을 걷어서, 추가의 검사를 위해 4℃ 냉동기에 보관하였다.
1-4. ELISA를 이용한 마우스 혈청의 항 다당류 항체 역가의 측정
각각 1종의 13 Pn 혈청형 특이적 다당류 1 mg/ml(1X PBS 용액 중)를 갖는 13개의 용액을 제조하여, 4℃ 냉동기에 보관하였다. 혈청형 특이적 Pn 다당류 용액을 코팅 완충액 중에서 2 내지 4 ㎍/mL로 희석하였다. 코팅 완충액 100 μL를 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하여, 웰을 코팅하고, 실온에서 하룻밤 동안 배양하였다. 웰을 세정 완충액으로 4회 세정하고, 블로킹 완충액 100 μL를 각 웰에 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 웰을 세정 완충액으로 4회 세정하여, 4℃에서 1 주간 보관될 수도 있다.
접합체 백신 또는 대조군 시료를 주입한 마우스로부터 채취한 혈청 시료를 1:10으로 희석하여, 워킹 혈청 시료를 얻어, 추가로 적절한 배수로 희석하여, ELISA 플레이트의 제1 열의 웰에 200 μL/웰의 총 체적으로 첨가하였다. 제1 열의 시료의 연속 배수 희석물을 그 다음의 열에 준비하여, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 웰을 세정 완충액으로 4회 세정하였다. 100 μL 알칼리 포스파타제 표지 염소 항마우스 항체(1:2000 희석)를 각 웰에 첨가하여, 실온에서 4시간 동안 배양하였다. 웰을 세정 완충액으로 4회 세정하였다. 100 μL 이나트륨 4-니트로페닐포스페이트 기질을 각 웰에 첨가하여, 405 nm의 파장에서의 OD를 기록하였다. 마우스 혈청의 혈청형 특이적 Pn 다당류 항체 역가는 하기 표 3에 나타낸 바와 같았다.
[표 3]
Figure pct00038
그 결과는 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 접합체, 즉, P2CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn 협막 다당류-P2CRM197A 접합체로 된 백신이 13가 Pn 협막 다당류-CRM197A 접합체보다 우수한 면역원성을 갖는 것을 보여주었다. 3회 주사 후의 마우스 혈청의 Pn 다당류에 대한 특이적 IgG 항체 역가는 1회 또는 2회 주사 후의 IgG 항체 역가보다 유의하게 높았다. 3회 주사 후의 각 혈청형 특이적 항체 역가는 1회 주사 후의 항체 역가보다 4배보다 높았으며, 이는 접합체 백신 역가를 증가시키기 위한 WHO 기준을 충족시킨다. 13가 Pn 협막 다당류-CRM197A 접합체와 비교하여, 13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체는 마우스 혈청에 3회 주사 후에 각 혈청형 특이적 CP에 대하여 높은 항체 역가를 나타내었다.
1-5. 옵소닌식균작용 분석(OPA)
옵소닌식균작용 분석은 Pn 다당류 접합체 백신의 살균 효력을 평가하는 방법이다. 마우스 혈청 시료를 UAB-MOPA에 의해 "폐렴연쇄구균 협막 다당류에 대한 항체에 관한 다중화 옵소닌식균작용 분석용 프로토콜"을 이용하여 검사하였다. OPA 농도는 하기 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00039
실험 결과는 13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체의 3회 주사 후에 채취한 마우스 혈청 시료의 OPA 농도가 13가 Pn PS-CRM197A 접합체의 3회 주사 후에 채취한 마우스 혈청 시료의 OPA 농도와 비교하여, 유의하게 증가되는 것을 나타내었다.
2) 다른 13가 Pn PS-CRM197A 접합체의 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체의 면역원성의 평가"에 기재된 방법과 유사하게, 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다른 백신에 반응한 항 다당류 IgG 항체 역가가 하기 표 5에 나타나있다. 표 5에는 다만, 3회 주사 후의 항 다당류 IgG 항체 역가가 기재되어 있다.
[표 5]
Figure pct00040
상기 결과로부터, 유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체의 면역원성이 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 CRM197A 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체와 비교하여, 유의하게 증가되는 것으로 입증되었다. 2 카피의 동일한 유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체는 다만 1 카피의 유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체보다 높은 면역원성을 나타내었다. 키메라 담체 단백질 중의 유니버셜 에피토프의 카피수가 3으로 증가된 경우에는, 2 카피의 유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체와 비교하여, 이의 제조된 13가 Pn PS 접합체의 면역원성에 유의차를 나타내지 않았다. 유니버셜 에피토프의 키메라 담체 단백질의 N 말단 또는 C 말단으로의 융합은 대응하는 13가 Pn PS-CRM197A 키메라 담체 단백질 접합체의 면역원성에 차이를 나타내지 않았다. 적어도 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질은 대응하는 13가 Pn PS-CRM197A 키메라 담체 단백질 접합체의 면역원성을 더욱 증진시켰다.
2. Hib PS-CRM197A 키메라 담체 단백질 접합체의 면역원성의 평가
2-1. Hib PS-CRM197A 키메라 단백질 접합체를 기제로 하는 백신의 제조
Hib 다당류(Hib PS)를 사용하여, CRM197A 담체 단백질, 또는 유니버셜 에피토프를 갖는 6개의 상이한 종류의 CRM197A 키메라 담체 단백질 중 어느 하나를 포함하는 접합체를 제조하였다. Hib PS-단백질 접합체를 사용하여, 대응하는 주사용 백신을 추가로 제조하였다. 방법은 하기에 설명하는 바와 같다:
랩스케일™ 접선류 여과(TFF) 시스템(Millipore, USA)을 사용하여, 각각의 CP-단백질 접합체 용액을 약 25 ㎍/mL의 다당류 농도로 농축시켰다. 농축된 용액을 각각, 0.22 μm 여과기를 통해 세균을 여과하였다. 멸균 인산알루미늄 애주번트를 각각의 용액에 첨가하여, 125 mg/ml의 최종 알루미늄 이온 농도에 이르게 하였다. 백신 용액을 교반하여 완전히 혼합하여, 2 내지 8℃ 냉동기에 보관하였다.
2-2. 백신의 예방접종 및 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-CRM197A 접합체의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 동물을 예방접종하고, 혈액 시료를 채취하여, ELISA 분석법을 이용하여 Hib 다당류에 대한 혈청 항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.
[표 6]
Figure pct00041
상기 항 Hib PS 항체 역가는 상이한 종류의 Hib PS-CRM197A 키메라 단백질 접합체와 유사한 결과를 나타내었다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 Hib PS-CRM197A 단백질 접합체와 비교하여, 유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 다른 6종의 접합체, 즉, Hib-P2CRM197A, Hib-P2CRM197AP2, Hib-P30CRM197A, Hib-OVApCRM197A, Hib-P30CRM197AP2 및 Hib-P2P30CRM197AOVAp는 IgG 역가가 유의하게 증가되었다. 1회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가와 비교하여, 3회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가도 p<0.05로, 유의차를 나타내었다.
3. 4가 Men PS-CRM197A 키메라 단백질 접합체의 면역원성의 평가
3-1. 4가 Men PS-CRM197A 키메라 단백질 접합체 백신(4Men-P2CRM197A)의 제조
랩스케일™ 접선류 여과(TFF) 시스템(Millipore, USA)을 사용하여, MenA-P2CRM197A, MenC-P2CRM197A, MenY-P2CRM197A 및 MenW135-P2CRM197A 접합체의 용액을 각각, 약 1000 ㎍/mL의 다당류 농도로 농축시킨 다음에, 0.85% NaCl 용액으로 희석시키고 혼합하여, 각 군의 다당류 농도가 100 ㎍/mL인 4Men-P2CRM197A 접합체 백신을 제조하였다. 백신 용액을 0.22 μm 막을 통해 여과시켜, 세균을 제거하였다. 멸균 인산알루미늄 애주번트를 백신 용액에 첨가하여, 125 mg/ml의 최종 알루미늄 이온 농도에 이르게 하였다. 백신 용액을 2 내지 8℃ 냉동기에 보관하였다.
3-2. 백신의 예방접종 및 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-CRM197A 접합체의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, 혈청 시료를 채취하였다. 10 ㎍/마우스/회의 다당류 주입량으로, 각 마우스에 백신 용액 0.1 mL를 주사하였다. ELISA 분석법을 이용하여, 각 Men 다당류 군에 대한 혈청 항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
[표 7]
Figure pct00042
상기 항 Men PS 항체 역가는 13가 Pn PS 접합체 및 Hib PS 접합체와 유사한 결과를 나타내었다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 4가 Men PS-CRM197A 단백질 접합체와 비교하여, 유니버셜 에피토프를 갖는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 포함하는 접합체가 유의하게 높은 특이적 항 PS IgG 역가를 나타내었다. 1회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가와 비교하여, 3회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가도 p<0.05로, 유의차를 나타내었다.
실시예 2: 로타바이러스 표면 단백질 VP8(CoreVP8) 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체의 제조 및 면역원성의 평가
I. CoreVP8과 , 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 단백질의 서열 디자인
1. CoreVP8의 서열 디자인
로타바이러스는 바이러스의 면역원성에 기초하여, 다양한 타입, 서브타입 및 혈청형으로 분류될 수 있다. 현재까지, 7종의 혈청형(A 내지 G 혈청형)이 발견되었다. 대부분의 인간 병원성 로타바이러스는 A, B 및 C 혈청형에 속한다. 다양한 로타바이러스의 표면 캡시드 단백질 VP7 및 VP4의 항원 클러스터는 다양하며, 각각 독립적으로 대응하는 중화 항체를 유도할 수 있다. 로타바이러스의 혈청형은 VP4 및 VP7 항원의 특이적 면역원성에 의해 결정될 수 있다. 로타바이러스 A는 추가로 VP7 및 VP4의 성질에 기초하여 G 혈청형 및 P 혈청형으로 분류될 수 있다. VP4는 트립신에 의해 2개의 상이한 바이러스 단백질, 즉, VP8 및 VP5로 절단될 수 있는 단백질이다. 연구 조사에 의해, VP5는 안정한 아미노산 서열을 갖지만, VP8의 아미노산 서열은 높은 돌연변이율을 수반한다는 것을 보여주었다. VP8의 서열은 바이러스가 P 혈청형에 속하는지의 여부를 결정한다. 따라서, VP8 표면 단백질은 광범위한 방어를 나타내는 항원을 얻기 위해 동물을 예방접종하는 항원으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 VP8을 다당류-단백질 접합체의 면역원성 담체 단백질로서 사용한다. 접합체의 VP8 면역원성 담체 단백질로부터 유래되는 항원은 예방접종을 받은 인간 개체군에서 항체 생산을 유도하여, 로타바이러스에 의한 감염증에 대하여 면역력을 부여할 수 있다.
로타바이러스 Wa 균주의 P 혈청형은 P1A 혈청형에 속하며, 인간의 모든 유행성 병원성 로타바이러스 균주 중 90%를 구성한다. 본 발명은 로타바이러스 Wa 균주의 VP4 중의 서브유닛 VP8을 인코딩하는 유전자에 기초하고 있다. VP8 유전자를 변형, 클로닝, 발현 및 정제하여, 접합체 백신의 담체 단백질을 제조하였다.
인간 로타바이러스 Wa 균주의 VP8 단백질은 247개의 아미노산 및 32,000 달톤의 분자량을 갖는다. 아미노산 서열은 서열 번호 67로 하기에 나타낸다.
(서열 번호 67)
Figure pct00043
VP8 바이러스 단백질은 로타바이러스의 캡시드 단백질이며, 구조 단백질이다. 전장 VP8 단백질은 수용해도가 양호하지 못하다. 전장 VP를 접합체를 합성하는데 담체 단백질로서 사용하는 경우, 정제 과정은 어려울 것이며, 접합체의 수율은 낮을 것이다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 전장 VP8 단백질을 인코딩하는 유전자는 절단된 VP8 단백질의 수용해도를 향상시키기 위해, 선택적으로 절단되어 다양한 길이의 VP8 단편을 클로닝할 수 있다. 절단에도 불구하고, VP8 단백질의 주요한 에피토프는 보존되어야 한다. VP8 단백질의 절단 부위는 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 둘 다일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 형태는 VP8 단백질의 N 말단 및 C 말단의 절단, 즉, N 말단으로부터의 위치 64 앞 및 C 말단 부근의 위치 223 뒤에서의 절단을 갖는다. 절단된 VP8 단백질은 160개의 아미노산을 갖는다. 실험에 의해, 이러한 서열이 로타바이러스의 숙주 세포로의 부착을 매개하는 수용체 영역을 포함하는 것으로 나타났다. 숙주 세포의 표면 상의 시알산은 VP8 부착을 위한 리간드로서 간주된다. 절단된 VP8 폴리펩티드는 분자량이 28 kDa인 코어 VP8로 명명된다. CoreVP8의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 하기에 나타낸다.
(서열 번호 5)
Figure pct00044
실험에 의해, CoreVP8 폴리펩티드가 고 수용해도를 나타내고, 정제하기가 용이하다는 것으로 입증되었다. 또한, 접합체의 담체 단백질로서의 CoreVP8에 의해, 합성된 접합체를 고 수율로 얻을 수 있다.
2. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
유니버셜 에피토프를 CoreVP8 면역원성 담체 단백질에 융합하여, 다당류-단백질 접합체의 제조에 유용한 새로운 키메라 담체 단백질을 구축하였다. 유니버셜 에피토프는 CoreVP8 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다. 대안적으로는, 2개의 상이한 유니버셜 에피토프는 각각, 각각의 CoreVP8 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다. 세 번째 전략에서, 2 카피의 동일한 유니버셜 에피토프는 서로 융합된 다음에, CoreVP8 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다.
CoreVP8 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인이 CRM197A 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인과 유사하기 때문에, 본 발명은 유니버셜 에피토프를 포함하는 몇몇 대표적인 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 기술한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 실시예에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
2-1. P2 및 CoreVP8을 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-1-1. P2-N 말단-CoreVP8 키메라 담체 단백질(P2CoreVP8)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P2CoreVP8로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 39로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 39)
Figure pct00045
2-1-2. P2-N 말단-CoreVP8-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(P2CoreVP8P2)의 서열 디자인
각각, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 N 말단 및 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해, 각각 CoreVP8 담체 단백질의 N 말단 및 C 말단에 융합하여, P2CoreVP8P2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 40으로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 40)
Figure pct00046
2-2. P30 및 CoreVP8을 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-2-1. P30-N 말단- CoreVP8 키메라 담체 단백질( P30CoreVP8 )의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P30CoreVP8로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 41로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 41)
Figure pct00047
2-3. OVAp 및 CoreVP8을 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-3-1. OVAp-N 말단- CoreVP8 키메라 담체 단백질(OVAp CoreVP8)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, OVApCoreVP8로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 42로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 42)
Figure pct00048
2-4. 적어도 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-4-1. P30-N 말단-CoreVP8-C 말단-P2 키메라 담체 단백질(P30CoreVP8P2)의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 N 말단에 융합하고, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P30CoreVP8P2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 43으로 하기에 나타낸다. P2 및 P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 43)
Figure pct00049
2-4-2. P2P30-N 말단-CoreVP8-C 말단-OVAp 키메라 담체 단백질(P2P30CoreVP8OVAp)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열 및 P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 CoreVP8 담체 단백질(서열 번호 5)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 CoreVP8 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2P30CoreVP8OVAp로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 44로 하기에 나타낸다. P2, P30 및 OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 44)
Figure pct00050
II. CoreVP8 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(들)를 포함하는 키메라 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
1. CoreVP8 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
인간 로타바이러스 Wa 균주, 젠뱅크:AGI04377의 아미노산 서열을 젠뱅크로부터 입수하고, VP8 단백질 단편의 서열을 결정하였다. VP8 서열에 기초하여, 각각, 아미노산 서열의 N 말단 및 C 말단 세그먼트를 제거하여, CoreVP8 아미노산 서열을 획득하였다. CoreVP8 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 최적화하여, 대장균에서의 CoreVP8 단백질의 고 효율 발현을 가능하게 하였다.
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. CoreVP8의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 CoreVP8 서열에 발견되지 않았다. CoreVP8 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 45로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 45)
Figure pct00051
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 CRM197A 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2. CoreVP8 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
유니버셜 에피토프를 갖는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 포함하는 PS-단백질 접합체의 면역원성을 평가하기 위해, 6개의 상이한 종류의 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 예로서 디자인하였다.
2-1. P2CoreVP8의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P2CoreVP8의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P2CoreVP8 서열에 발견되지 않았다. P2CoreVP8 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 46으로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 46)
Figure pct00052
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P2CoreVP8 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-2. P2CoreVP8P2의 발현 플라스미드의 구축
방법은 이전 섹션 "2-1. P2CoreVP8의 발현 플라스미드의 구축"에 기재된 방법과 유사하다.
2-3. P30CoreVP8의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30CoreVP8의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30CoreVP8에 발견되지 않았다. P30CoreVP8 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 47로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 47)
Figure pct00053
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30CoreVP8 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-4. OVApCoreVP8의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. OVApCoreVP8의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 OVApCoreVP8 서열에 발견되지 않았다. OVApCoreVP8 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 48로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 48)
Figure pct00054
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 OVApCoreVP8 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-5. P30CoreVP8P2의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30CoreVP8P2의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30CoreVP8P2 서열에 발견되지 않았다. P30CoreVP8P2 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 49로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 49)
Figure pct00055
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30CoreVP8P2 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-6. P2P30CoreVP8OVAp의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P2P30CoreVP8OVAp의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P2P30CoreVP8OVAp 서열에 발견되지 않았다. P2P30CoreVP8OVAp 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 50으로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 50)
Figure pct00056
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P2P30CoreVP8OVAp 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
III. CoreVP8 담체 단백질과, 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질의 제조
실험에 의해, CoreVP8 담체 단백질과, CoreVP8 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 유사 특성을 입증하였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 모든 담체 단백질의 정제법은 유사하다. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질의 예시적인 제조 방법이 이하에 기재된다.
1. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 제조
키메라 담체 단백질을 발현하는 각각의 플라스미드를 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 컴피턴트 세포로 형질전환시켜, 단백질 발현을 조사하였다. 단백질 발현 레벨이 높고 항혈청 시험을 통과한 클론을 선택하여, 마스터 스톡 라이브러리 및 워킹 스톡 라이브러리를 구축하였다.
2. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 발효
유니버셜 에피토프를 포함하는 특이적 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 발현할 수 있는 1개의 튜브의 세균을 저온 냉동기의 유전자 조작된 대장균 워킹 스톡 라이브러리로부터 채취하여, 실온에서 해동시켰다. 워킹 스톡 중의 세균 현탁액을 무균 조작을 이용하여 50 mL 배지로 옮겨, OD600가 약 1.0에 이를 때까지 180 rpm의 진탕 속도로 37℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 그 다음에 세균 배양물을 사용하여 1L 배지에 접종시켜, OD600가 약 1.0에 이를 때까지 180 rpm의 진탕 속도로 37℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 1L 세균 배양물을 사용하여 50 L 발효조의 20 L 배지에 접종한 다음에, 240 rpm 및 37℃에서 발효시켰다. OD600가 약 7 내지 8에 이르면, IPTG를 배양물에 첨가하여, 세균에서 단백질 발현을 유도하였다. 발효 과정 개시로부터 14시간 후에 발효를 중지시켰다. 발효된 세균 배양물을 원심분리하여, 세균을 채취하였다.
3. 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질의 정제
CoreVP8을 유니버셜 에피토프를 갖는 다양한 키메라 담체 단백질을 구축하는데 코아 성분으로서 사용하기 때문에, 실험에 따르면, 유니버셜 에피토프의 첨가에도 불구하고, 단백질 정제에 관한 파라미터는 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. CoreVP8 담체 단백질의 정제 절차를 변경시켜, 유니버셜 에피토프를 포함하는 CoreVP8 키메라 담체 단백질의 정제 방법을 구축할 수도 있다.
50 g의 젖은 세균을 2 L 원심분리컵에 칭량하였다. 상기 컵에 300 mL 1X PBS pH 7.0 완충액을 첨가하여, 세균을 재현탁시켰다. 세균 현탁액을 자석 교반 플레이트 상에서 30분간 완전히 혼합한 다음에, 4℃, 4000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세균을 채취하였다. 이들 단계를 2회 반복하였다. 세균을 갖는 원심분리관에, 300 mL 1X PBS pH 7.0을 첨가하였다. 세균을 호모게나이저에서 용해시켜, 4℃, 10000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 펠릿을 채취하고, 상청액을 버렸다. 펠릿에 300 mL 1X PBS pH 7.0 완충액을 첨가하여, 혼합물을 자석 교반 플레이트 상에서 30분간 완전히 혼합하였다. 혼합물을 4℃, 4000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 봉입체를 채취하고, 상청액을 버렸다. 900 mL 변성 용액을 세정된 봉입체에 첨가하였다. 그 다음에 혼합물을 25℃, 10000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 상청액을 6 내지 8 KDA 투석 백에 옮겼다. 투석 백을 밀봉시켜, 10 L 리폴딩 완충액 1에 넣어, 자석 교반 플레이트 상에서 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 10L 리폴딩 완충액 2에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 투석 백을 10 L 투석 완충액 3에 옮기고, 교반하여, 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 10L 리폴딩 완충액 4에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 투석 백을 10 L 리폴딩 완충액 5에 옮기고, 교반하여, 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 2L 저장 완충액에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 저장 완충액을 2회 교체하여, 투석을 실온에서 하룻밤 동안 행하였다. 1 mL 투석 용액을 얻어, 실온 및 12000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하여, 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 시료를 미리 평형화시킨 DEAE 겔 컬럼 상에 로딩하고, 그래디언트 모드를 사용하여 용리하여, 표적 단백질 피크를 수집하였다. 그 다음에 채취된 시료를 추가의 정제를 위해 Q 세파로오스 컬럼 상에 로딩하고, 용출 피크를 수집하였다. 최종적으로, 채취된 시료를 SP 겔 컬럼 상에 로딩하고, 용출 피크를 수집하였다. 채취된 정제된 표적 단백질을 투석 백에 옮기고, 0.15 M NaCl 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석된 시료를 4℃ 저장고에 옮겼다.
IV. 다당류-CoreVP8 접합체의 제조
세 가지의 다양한 합성 방법, 즉, 환원적 아미노화, CDAP 방법(3-(에틸이미노메틸렌아미노)-N,N-다이메틸-프로판-1-아민 사용) 및 ADH 방법(아디프산 다이하이드라자이드 사용)을 사용하여, 특이적 다당류-CoreVP8 접합체를 합성하였다. 다양한 합성 방법에 의해 형성된 접합체의 수율 및 면역원성은 각각 다를 수 있다. 다양한 세균성 다당류(PS) 접합체의 면역원성에 대한 유니버셜 에피토프를 갖는 다양한 키메라 담체 단백질의 효과를 조사하기 위해, 본 발명은 13가 폐렴연쇄구균(Pn) PS-CoreVP8 접합체, b형 인플루엔자균(Hib) PS-CoreVP8 접합체 및 4가 수막염균(Men) PS-CoreVP8 접합체를 기술한다.
1. 13가 Pn PS-CoreVP8 단백질(유니버셜 에피토프를 갖거나 갖지 않음) 접합체의 제조
P2CoreVp8, P2CoreVP8P2, P30CoreVP8, OVApCoreVP8, P30CoreVP8P2 및 P2P30CoreVP8OVAp를 비롯한, 유니버셜 에피토프를 갖는 6종의 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 사용하여, 각각 13가 Pn PS 접합체 백신: 13Pn-P2CoreVp8, 13Pn-P2CoreVP8P2, 13Pn-P30CoreVP8, 13Pn-OVApCoreVP8, 13Pn-P30CoreVP8P2 및 13Pn-P2P30CoreVP8OVAp를 합성하였다. 이들 접합체의 제조 방법은 상술한 13가 Pn PS-CRM197A 접합체 백신의 제조 방법과 유사하다.
2. Hib PS-CoreVP8 단백질(유니버셜 에피토프를 갖거나 갖지 않음) 접합체의 제조
P2CoreVp8, P2CoreVP8P2, P30CoreVP8, OVApCoreVP8, P30CoreVP8P2 및 P2P30CoreVP8OVAp를 비롯한, 유니버셜 에피토프를 갖는 6종의 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 사용하여, 각각 Hib PS 접합체 백신: Hib-P2CoreVp8, Hib-P2CoreVP8P2, Hib-P30CoreVP8, Hib-OVApCoreVP8, Hib-P30CoreVP8P2 및 13Pn-P2P30CoreVP8OVAp를 합성하였다. 이들 접합체의 제조 방법은 상술한 Hib PS-CRM197A 접합체 백신의 제조 방법과 유사하다.
3. 4가 Men PS-CoreVP8 단백질(유니버셜 에피토프를 갖거나 갖지 않음) 접합체의 제조
P2CoreVp8, P2CoreVP8P2, P30CoreVP8, OVApCoreVP8, P30CoreVP8P2 및 P2P30CoreVP8OVAp를 비롯한, 유니버셜 에피토프를 갖는 6종의 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 사용하여, 각각 4가 Men PS 접합체 백신: 4Men-P2CoreVp8, 4Men-P2CoreVP8P2, 4Men-P30CoreVP8, 4Men-OVApCoreVP8, 4Men-P30CoreVP8P2 및 4Men-P2P30CoreVP8OVAp를 합성하였다. 이들 접합체의 제조 방법은 상술한 4가 Men PS-CRM197A 접합체 백신의 제조 방법과 유사하다.
V. 다당류-CoreVP8 접합체 백신의 면역원성의 평가
1. 13가 Pn PS-CoreVP8 접합체 백신의 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체 백신의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항 PS IgG 항체 역가를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타낸다. 표 9에는 다만, 3회 주사 후의 항 PS IgG 항체 역가가 기재되어 있다.
[표 9]
Figure pct00057
표 9의 데이터로부터, 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS-CoreVP8 접합체의 면역원성이 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 CoreVP8 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS-CoreVP8 접합체와 비교하여, 유의하게 증가되는 것을 알 수 있었다. 2 카피의 동일한 유니버셜 에피토프를 갖는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체는 다만 1 카피의 유니버셜 에피토프를 갖는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS 접합체보다 높은 면역원성을 나타내었다. 적어도 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질은 대응하는 13가 Pn PS-CoreVP8 접합체의 면역원성을 더욱 증진시켰다.
2. Hib PS-CoreVP8 접합체 백신의 면역원성의 평가
이전 섹션 "Hib PS-P2CRM197A 접합체 백신의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, ELISA 분석법을 이용하여 항 PS IgG 항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00058
상기 항 Hib PS 항체 역가는 상이한 종류의 Hib PS-CoreVP8 키메라 단백질 접합체의 유사한 결과를 나타내었다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 Hib PS-CoreVP8 단백질 접합체와 비교하여, 유니버셜 에피토프를 갖는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 포함하는 다른 6종의 접합체, 즉, Hib-P2CoreVP8, Hib-P2CoreVP8P2, Hib-P30CoreVP8, Hib-OVApCoreVP8, Hib-P30CoreVP8P2 및 Hib-P2P30CoreVP8OVAp는 IgG 역가가 유의하게 증가되었다. 1회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가와 비교하여, 3회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가도 p<0.05로, 유의차를 나타내었다.
3. 4가 Men PS-CoreVP8 접합체 백신의 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체 백신의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, 혈청 시료를 채취하였다. 10 ㎍/마우스/회의 다당류 주입량으로, 각 마우스에 백신 용액 0.1 mL를 주사하였다. ELISA 분석법을 이용하여, 각 다당류 군에 대한 혈청 항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 11에 나타낸 바와 같다.
[표 11]
Figure pct00059
상기 항 Men PS 항체 역가는 13가 Pn PS 접합체 및 Hib PS 접합체와 유사한 결과를 나타내었다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 4가 Men PS-CoreVP8 단백질 접합체와 비교하여, 유니버셜 에피토프를 갖는 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 포함하는 접합체가 유의하게 높은 특이적 항 PS IgG 역가를 나타내었다. 1회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가와 비교하여, 3회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가도 p<0.05로, 유의차를 나타내었다.
실시예 3: 디프테리아 H21G 단백질 사슬 A(이하, H21G로 명명됨) 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체 의 제조 및 면역원성의 평가
I. H21G와, 유니버셜 에피토프를 포힘하는 H21G 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
1. H21G의 서열 디자인
H21G 담체 단백질은 디프테리아 독소 사슬 A의 히스티딘(H) 21이 글리신(G)으로 치환된 디프테리아 독소 사슬 A 기반 재조합 단백질이다. 디프테리아 독소 돌연변이체 CRM197과 유사하게, 변형된 디프테리아 독소 돌연변이체 사슬 A는 디프테리아 독소의 특이적 면역원성을 보존한다. 항 H21G 혈청은 디프테리아 독소 또는 톡소이드와 교차반응한다. H21G가 디프테리아 독소와 유사하기 때문에, 안전성 관점에서는, H21G는 접합체 백신을 합성하기 위한 적절한 담체 단백질로서 기능을 할 수 있다. 디프테리아 독소 돌연변이체 H21G의 아미노산 서열은 서열 번호 6으로 하기에 나타낸다.
(서열 번호 6)
Figure pct00060
2. 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21G 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
유니버셜 에피토프를 H21G 면역원성 담체 단백질에 융합하여, 다당류-단백질 접합체의 제조에 유용한 새로운 키메라 담체 단백질을 구축하였다. 유니버셜 에피토프는 H21G 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다. 대안적으로는, 2개의 상이한 유니버셜 에피토프는 각각, 각각의 H21G 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다. 세 번째 전략에서, 2 카피의 동일한 유니버셜 에피토프는 서로 융합된 다음에, H21G 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다.
유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 다당류-단백질 접합체의 유사한 메커니즘 때문에, 본 발명은 유니버셜 에피토프를 포함하는 6종의 대표적인 CoreVP8 키메라 담체 단백질을 기술한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 실시예에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
2-1. P30 및 H21G를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-1-1. P30-N 말단-H21G 키메라 담체 단백질(P30H21G)의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P30H21G로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 51로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 51)
Figure pct00061
2-1-2. P30-N 말단-H21G-C 말단-P30 키메라 담체 단백질(P2CoreVP8P2)의 서열 디자인
각각, P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 N 말단 및 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해, 각각 H21G 담체 단백질의 N 말단 및 C 말단에 융합하여, P30H21GP30으로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 52로 하기에 나타낸다. P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 52)
Figure pct00062
2-2. P3 및 H21G를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-2-1. P2-N 말단-H21G 키메라 담체 단백질(P2H21G)의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, P2H21G로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 53으로 하기에 나타낸다. P2 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 53)
Figure pct00063
2-3. OVAp 및 H21G를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-3-1. OVAp-N 말단-H21G 키메라 담체 단백질(OVApH21G)의 서열 디자인
OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 N 말단에 융합하여, OVApCoreVP8로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 54로 하기에 나타낸다. OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 54)
Figure pct00064
2-4. 적어도 2개의 상이한 종류의 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 서열 디자인
2-4-1. P30-N 말단- H21G -C 말단-P2 키메라 담체 단백질( P30H21GP2 )의 서열 디자인
P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 N 말단에 융합하고, P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P30H21GP2로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 55로 하기에 나타낸다. P2 및 P30 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 55)
Figure pct00065
2-4-2. P2OVAp -N 말단- H21G -C 말단-P30 키메라 담체 단백질( P2OVApH21GP30 )의 서열 디자인
P2(서열 번호 1)의 1 카피의 아미노산 서열 및 OVAp(서열 번호 3)의 1 카피의 아미노산 서열을 이들 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 서로 융합한 다음에, 융합된 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 N 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 N 말단에 융합하고; 게다가, P30(서열 번호 2)의 1 카피의 아미노산 서열을 이것과 H21G 담체 단백질(서열 번호 6)의 C 말단 사이에 배치된 GSGSG 링커(서열 번호 7)를 통해 H21G 담체 단백질의 C 말단에 융합하여, P2OVApH21GP30으로 명명된 새로운 키메라 담체 단백질을 얻었다. 새로운 키메라 담체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 56으로 하기에 나타낸다. P2, P30 및 OVAp 에피토프의 서열은 밑줄이 그어져 있다.
(서열 번호 56)
Figure pct00066
II. H21G 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프(들)를 포함하는 키메라 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
1. H21G 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
전장 디프테리아 독소의 아미노산 서열, 참조 서열: NP_928615를 젠뱅크로부터 입수하고, 디프테리아 독소 사슬 A 단편의 서열을 결정하였다. 서열의 히스티딘 21을 글리신으로 치환하였다. 변형된 서열에 기초하여, H21G 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 최적화하여, 대장균에서의 H21G 단백질의 고 효율 발현을 가능하게 하였다. 커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. H21G의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 H21G 서열에 발견되지 않았다. H21G 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 57로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 57)
Figure pct00067
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 H21G 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2. H21G 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 발현 플라스미드의 구축
2-1. P30H21G의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30H21G의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30H21G 서열에 발견되지 않았다. P30H21G 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 58로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 58)
Figure pct00068
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30H21G 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-2. P30H21GP30의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30H21GP30의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30H21GP30 서열에 발견되지 않았다. P30H21GP30 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 59로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 59)
Figure pct00069
Figure pct00070
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30H21GP30 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-3. P2H21G의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P2H21G의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P2H21G 서열에 발견되지 않았다. P2H21G 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 60으로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 60)
Figure pct00071
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P2H21G 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-4. OVApH21G의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. OVApH21G의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 OVApH21G 서열에 발견되지 않았다. OVApH21G 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 61로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 61)
Figure pct00072
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 OVApH21G 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-5. P30H21GP2의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P30H21GP2의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P30H21GP2 서열에 발견되지 않았다. P30H21GP2 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 62로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 62)
Figure pct00073
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P30H21GP2 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
2-6. P2OVApH21GP30의 발현 플라스미드의 구축
커스텀 발현 플라스미드를 사용하였다. 제한효소 Nde I를 CATATG 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하고, 제한효소 Bam HI를 GGATCC 서열을 갖는 부위를 인식하는데 사용하였다. P2OVApH21GP30의 핵산 서열을 분석하였더니, Nde I 인식부위나 Bam HI 인식부위가 P2OVApH21GP30 서열에 발견되지 않았다. P2OVApH21GP30 단백질을 인코딩하는 합성 핵산 서열은 서열 번호 63으로 하기에 나타낸 바와 같다.
(서열 번호 63)
Figure pct00074
효소 NdeI 및 BamHI를 각각, 빈 플라스미드, 및 P2OVApH21GP30 담체 단백질을 인코딩하는 합성 유전자의 PCR 산물에 첨가하여, 이중 제한효소 소화를 수행하였다. 정제 후에, T4 리가아제를 라이게이션 혼합물에 첨가하여, 단편을 라이게이션하였다. 라이게이션 반응의 완료 후에, 발현 플라스미드를 정제하여, PCR 검정법 및 제한효소 소화 맵핑을 사용하여 확인하였다. BL21(DE3) 컴피턴트 세포를 사용하여, 발현 플라스미드를 세포로 형질전환시켜, 콜로니를 스크리닝하였다. 유전자 조작된 발현 세균의 양성 클론을 얻은 후에, 마스터 스톡 및 워킹 스톡을 포함하여 스톡 라이브러리를 구축하였다. 스톡 라이브러리를 -20℃의 냉동기에 보관하였다.
III. CoreVP8 담체 단백질과, 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21G 키메라 담체 단백질의 제조
실험에 의해, H21G 담체 단백질과, H21P 담체 단백질 및 유니버셜 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질의 유사 특성을 입증하였다. 따라서, 본 명세서에 기재된 모든 담체 단백질의 정제법은 유사하다. 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21P 키메라 담체 단백질의 예시적인 제조 방법이 이하에 기재된다.
1. 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21G 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 제조
키메라 담체 단백질을 발현하는 각각의 플라스미드를 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 컴피턴트 세포로 형질전환시켜, 단백질 발현을 조사하였다. 단백질 발현 레벨이 높고 항혈청 시험을 통과한 클론을 선택하여, 마스터 스톡 라이브러리 및 워킹 스톡 라이브러리를 구축하였다.
2. 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21G 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 발효
섹션 "유니버셜 에피토프를 포함하는 CRM197A 키메라 담체 단백질을 발현하는 유전자 조작된 세균의 발효"에 기재된 방법을 참조한다.
3. 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21G 키메라 담체 단백질의 정제
H21G를 유니버셜 에피토프를 갖는 다양한 키메라 담체 단백질을 구축하는데 코아 성분으로서 사용하기 때문에, 실험에 따르면, 유니버셜 에피토프의 첨가에도 불구하고, 단백질 정제에 관한 파라미터는 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. H21G 담체 단백질의 정제 절차를 변경시켜, 유니버셜 에피토프를 포함하는 H21G 키메라 담체 단백질의 정제 방법을 구축할 수도 있다.
50 g의 젖은 세균을 2 L 원심분리컵에 칭량하였다. 상기 컵에 300 mL 1X PBS pH 7.0 완충액을 첨가하여, 세균을 재현탁시켰다. 세균 현탁액을 자석 교반 플레이트 상에서 30분간 완전히 혼합한 다음에, 4℃, 4000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세균을 채취하였다. 이들 단계를 2회 반복하였다. 세균을 갖는 원심분리관에, 300 mL 1X PBS pH 7.0을 첨가하였다. 세균을 호모게나이저에서 용해시켜, 4℃, 10000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 펠릿을 채취하고, 상청액을 버렸다. 펠릿에 300 mL 1X PBS pH 7.0 완충액을 첨가하여, 혼합물을 자석 교반 플레이트 상에서 30분간 완전히 혼합하였다. 혼합물을 4℃, 4000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 봉입체를 채취하고, 상청액을 버렸다. 900 mL 변성 용액을 세정된 봉입체에 첨가하였다. 그 다음에 혼합물을 25℃, 10000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 버렸다. 상청액을 6 내지 8 KDA 투석 백에 옮겼다. 투석 백을 밀봉시켜, 10 L 리폴딩 완충액 1에 넣어, 자석 교반 플레이트 상에서 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 10L 리폴딩 완충액 2에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 투석 백을 10 L 투석 완충액 3에 옮기고, 교반하여, 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 10L 리폴딩 완충액 4에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 투석 백을 10 L 리폴딩 완충액 5에 옮기고, 교반하여, 실온에서 하룻밤 동안 평형화시켰다. 그 다음날, 투석 백을 2L 저장 완충액에 옮기고, 교반하여, 실온에서 약 8 내지 10 시간 동안 평형화시켰다. 저장 완충액을 2회 교체하여, 투석을 실온에서 하룻밤 동안 행하였다. 1 mL 투석 용액을 얻어, 실온 및 12000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 수집하여, 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 시료를 미리 평형화시킨 DEAE 겔 컬럼 상에 로딩하고, 그래디언트 모드를 사용하여 용리하여, 표적 단백질 피크를 수집하였다. 그 다음에 채취된 시료를 추가의 정제를 위해 페닐 세파로오스 컬럼 상에 로딩하고, 용출 피크를 수집하였다. 최종적으로, 채취된 시료를 Q 세파로오스 겔 컬럼 상에 로딩하고, 용출 피크를 수집하였다. 채취된 정제된 표적 단백질을 투석 백에 옮기고, 0.15 M NaCl 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석된 시료를 4℃ 저장고에 옮겼다.
IV. 다당류-H21G 접합체의 제조
세 가지의 다양한 합성 방법, 즉, 환원적 아미노화, CDAP 방법(3-(에틸이미노메틸렌아미노)-N,N-다이메틸-프로판-1-아민 사용) 및 ADH 방법(아디프산 다이하이드라자이드 사용)을 사용하여, 특이적 다당류-H21G 접합체를 합성하였다. 다양한 합성 방법에 의해 형성된 접합체의 수율 및 면역원성은 각각 다를 수 있다. 다양한 세균성 다당류(PS) 접합체의 면역원성에 대한 유니버셜 에피토프를 갖는 다양한 키메라 담체 단백질의 효과를 조사하기 위해, 본 발명은 13가 폐렴연쇄구균(Pn) PS-H21G 접합체, b형 인플루엔자균(Hib) PS-H21G 접합체 및 4가 수막염균(Men) PS-H21G 접합체를 기술한다.
1. 13가 Pn PS-H21G 단백질(유니버셜 에피토프를 갖거나 갖지 않음) 접합체의 제조
P30H21G, P30H21GP30, P2H21G, OVApH21G, P30H21GP2 및 P2OVApH21GP30을 비롯한, 유니버셜 에피토프를 갖는 6종의 H21G 키메라 담체 단백질을 사용하여, 각각 13가 Pn PS 접합체 백신: 13Pn-P30H21G, 13Pn-P30H21GP30, 13Pn-P2H21G, 13Pn-OVApH21G, 13Pn-P30H21GP2 및 13Pn-P2OVApH21GP30을 합성하였다. 이들 접합체의 제조 방법은 상술한 13가 Pn PS-CRM197A 접합체 백신의 제조 방법과 유사하다.
2. Hib PS-H21G 단백질(유니버셜 에피토프를 갖거나 갖지 않음) 접합체의 제조
P30H21G, P30H21GP30, P2H21G, OVApH21G, P30H21GP2 및 P2OVApH21GP30을 비롯한, 유니버셜 에피토프를 갖는 6종의 H21B 키메라 담체 단백질을 사용하여, 각각 Hib PS 접합체 백신: Hib-P30H21G, Hib-P30H21GP30, Hib-P2H21G, Hib-OVApH21G, Hib-P30H21GP2 및 Hib-P2OVApH21GP30을 합성하였다. 이들 접합체의 제조 방법은 상술한 Hib PS-CRM197A 접합체 백신의 제조 방법과 유사하다.
3. 4가 Men PS-H21G 단백질(유니버셜 에피토프를 갖거나 갖지 않음) 접합체의 제조
P30H21G, P30H21GP30, P2H21G, OVApH21G, P30H21GP2 및 P2OVApH21GP30을 비롯한, 유니버셜 에피토프를 갖는 6종의 H21G 키메라 담체 단백질을 사용하여, 각각 4가 Men PS 접합체 백신: 4Men-P30H21G, 4Men-P30H21GP30, 4Men-P2H21G, 4Men-OVApH21G, 4Men-P30H21GP2 및 4Men-P2OVApH21GP30을 합성하였다. 이들 접합체의 제조 방법은 상술한 4가 Men PS-CRM197A 접합체 백신의 제조 방법과 유사하다.
V. 다당류-H21G 접합체 백신의 면역원성의 평가
1. 13가 Pn PS-H21G 접합체 백신의 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체 백신의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, 항 PS IgG 항체 역가를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타낸다. 표 12에는 다만, 3회 주사 후의 항 PS IgG 항체 역가가 기재되어 있다. 제조된 13가 Pn PS-H21G 접합체 백신을 사용하여 마우스를 예방접종하고, 혈청 시료를 마우스로부터 채취하였다. 각 마우스에 백신 용액 0.1 mL를 주사하였으며, 다당류 용량은 10 ㎍/마우스/회이다.
[표 12]
Figure pct00075
표 12의 데이터로부터, 유니버셜 에피토프를 갖는 키메라 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS-H21G 접합체의 면역원성이 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 CoreVP8 담체 단백질을 포함하는 13가 Pn PS-H21G 접합체와 비교하여, 유의하게 증가되는 것을 알 수 있었다.
2. Hib PS-H21G 접합체 백신의 면역원성의 평가
이전 섹션 "Hib PS-P2CRM197A 접합체 백신의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여, ELISA 분석법을 이용하여 항 PS IgG 항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure pct00076
상기 항 Hib PS 항체 역가는 상이한 종류의 Hib PS-H21G 키메라 단백질 접합체의 유사한 결과를 나타내었다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 Hib PS-H21G 단백질 접합체와 비교하여, 유니버셜 에피토프를 갖는 H21G 키메라 담체 단백질을 포함하는 다른 6종의 접합체, 즉, Hib-P30H21G, Hib-P30H21GP30, Hib-P2H21G, Hib-OVApH21G, Hib-P30H21GP2 및 Hib-P2OVApH21GP30은 IgG 역가가 유의하게 증가되었다. 1회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가와 비교하여, 3회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가도 p<0.05로, 유의차를 나타내었다.
3. 4가 Men PS-H21G 접합체 백신의 면역원성의 평가
이전 섹션 "13가 Pn PS-P2CRM197A 접합체 백신의 면역원성의 평가"에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, 혈청 시료를 채취하였다. 10 ㎍/마우스/회의 다당류 주입량으로, 각 마우스에 백신 용액 0.1 mL를 주사하였다. ELISA 분석법을 이용하여, 각 다당류 군에 대한 혈청 항체 역가를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 14에 나타낸 바와 같다.
[표 14]
Figure pct00077
상기 항 Men PS 항체 역가는 13가 Pn PS 접합체 및 Hib PS 접합체와 유사한 결과를 나타내었다. 유니버셜 에피토프를 갖지 않는 4가 Men PS-H21G 단백질 접합체와 비교하여, 유니버셜 에피토프를 갖는 H21G 키메라 담체 단백질을 포함하는 접합체가 유의하게 높은 특이적 항 PS IgG 역가를 나타내었다. 1회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가와 비교하여, 3회 주사 후의 혈청 시료의 IgG 역가도 p<0.05로, 유의차를 나타내었다.
SEQUENCE LISTING <110> KANVAX BIOPHARMACEUTICALS LTD. <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF ENHANCING IMMUNOGENICITY OF POLYSACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATES <130> 750342000140 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> CN2014101985335 <151> 2014-05-11 <160> 67 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid P2 epitope <400> 1 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid P30 epitope <400> 2 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetanus toxoid OVAp epitope <400> 3 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 4 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Diphtheria toxin CRM197A <400> 4 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe 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Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535 <210> 66 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Diphtheria toxin, chain A <400> 66 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg <210> 67 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP8 full length <400> 67 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Ser Asn Ser Tyr Val Thr 1 5 10 15 Asn Ile Ser Asp Glu Val Asn Glu Ile Gly Thr Lys Lys Thr Thr Asn 20 25 30 Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val 35 40 45 Asp Trp Gly His Gly Glu Leu Pro Asp Ser Thr Leu Val Gln Pro Thr 50 55 60 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Val Asp Tyr 65 70 75 80 Trp Met Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly Lys Val Ala Glu Gly Thr 85 90 95 Asn Thr Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val Leu Val Glu Pro Asn Val 100 105 110 Gln Asn Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp Gly Arg Asn Val Gln Leu 115 120 125 Asn Val Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp Lys Phe Ile Leu Phe Ile 130 135 140 Lys Leu Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser Thr Leu Ser Thr 145 150 155 160 Pro His Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg Asp Asn Arg Val Tyr Trp 165 170 175 Tyr Gln Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile 180 185 190 Asn Asn Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp Ala Glu Phe Tyr Leu Ile 195 200 205 Pro Gln Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln Tyr Ile Asn Asn Gly Leu 210 215 220 Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Ile Val Pro Val Asn Ile Thr Ser 225 230 235 240 Arg Gln Ile Lys Asp Ile Arg 245

Claims (54)

  1. 담체 단백질 및 유니버셜(universal) 에피토프를 포함하는 키메라 담체 단백질과, 상기 키메라 담체 단백질에 공유 결합으로 접합되는 다당류 항원을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 키메라 담체 단백질은 약 1 내지 약 3 카피의 유니버셜 에피토프를 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 키메라 담체 단백질은 상이한 아미노산 서열로 된 적어도 2개의 유니버셜 에피토프를 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유니버셜 에피토프는 길이가 약 8 내지 약 20개의 아미노산으로 되어 있는 다당류-단백질 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유니버셜 에피토프는 담체 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단 및 C 말단 둘 다에 공유 결합으로 융합되는 다당류-단백질 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유니버셜 에피토프는 서열 번호 1 내지 3으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 디프테리아 독소의 교차 반응 물질(CRM), 로타바이러스 캡시드 단백질 VP8, 수막염균 외막 복합체, 또는 인플루엔자균(Haemophilus influenzae)의 단백질 D로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 담체 단백질은 디프테리아 독소의 CRM197의 사슬 A로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  9. 제7항에 있어서, 담체 단백질은 서열 번호 4 내지 6으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유니버셜 에피토프는 이것과 담체 단백질 사이에 배치된 펩티드 링커에 의해 담체 단백질에 공유 결합으로 융합되는 다당류-단백질 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 펩티드 링커는 글리신 폴리머, 글리신-세린 폴리머, 글리신-알라닌 폴리머, 또는 알라닌-세린 폴리머로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 가요성 링커인 다당류-단백질 접합체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 펩티드 링커는 길이가 1 내지 20개의 아미노산 잔기로 되어 있는 다당류-단백질 접합체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 8 내지 32로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 39 내지 44로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 담체 단백질은 서열 번호 51 내지 56으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 다당류-단백질 접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 항원 대 키메라 담체 단백질의 중량 대 중량 비는 약 0.8 내지 약 1.2인 다당류-단백질 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 항원은 평균 분자량이 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa인 다당류-단백질 접합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 항원은 협막 다당류로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 항원은 b형 인플루엔자균(Haemophilus influenzae type b(Hib)), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae(Pn)), 또는 수막염균(Neisseria meningitidis(Men))으로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 협막 다당류는 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  22. 제20항에 있어서, 협막 다당류는 b형 인플루엔자균(Hib)으로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  23. 제20항에 있어서, 협막 다당류는 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 다당류-단백질 접합체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체가 서로 상이한 담체 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 적어도 2개의 다당류-단백질 접합체가 서로 상이한 세균종으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 다수의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체가 동일종의 상이한 혈청형의 세균으로부터 유래되는 다당류 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 약 13개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체가 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 및 23F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 약 24개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체가 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 폐렴연쇄구균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 약 4개의 다당류-단백질 접합체를 포함하며, 각각의 다당류-단백질 접합체가 A, C, Y, 및 W-135로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 상이한 혈청형의 수막염균으로부터 유래되는 협막 다당류를 포함하는 면역원성 조성물.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 애주번트는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄인 면역원성 조성물.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 다당류 항원이 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체인, 세균에 의한 질환에 대하여 개체를 예방접종하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역원성 조성물 또는 백신을 적어도 2회의 용량으로 개체에게 투여하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 질환은 폐렴연쇄구균으로 인한 폐렴, 이염(ear infection), 부비동염, 수막염, 또는 균혈증인 방법.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 질환은 b형 인플루엔자균에 의한 수막염, 폐렴, 후두개염, 봉와직염, 관절염, 또는 이염인 방법.
  38. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 질환은 수막염균에 의한 수막염 또는 수막염균혈증인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 다당류 항원에 대한 면역 반응이 양호하지 못한 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 약 2세 미만의 소아, 고령자 또는 면역약화자(immunocompromised individual)인 방법.
  41. 세균에 의한 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 백신의 용도 - 여기서, 다당류 항원은 세균 표면에 발현된 다당류 또는 이의 유도체임 -.
  42. 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 다당류-단백질 접합체의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 다당류 항원을 포함하는 세균을 배양하고, 다당류 항원을 배양물로부터 회수하여, 다당류 항원을 제조하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 다당류 항원을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 담체 단백질을 발현시키는 조건 하에 키메라 담체 단백질을 인코팅하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 키메라 담체 단백질을 배양물로부터 회수하여, 키메라 담체 단백질을 제조하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli) 또는 효모인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 벡터는 서열 번호 34 내지 38로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 방법.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 벡터는 서열 번호 46 내지 50으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 방법.
  49. 제45항 또는 제46항에 있어서, 벡터는 서열 번호 58 내지 63으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 항원을 키메라 담체 단백질에 접합하기 전에 키메라 담체 단백질을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류 항원은 환원적 아미노화, 시안화(cyanylation) 접합, 또는 카르보다이이미드 반응에 의해 키메라 담체 단백질에 접합되는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 다당류 항원은 1-시아노-4-다이메틸암모늄피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)에 의해 활성화되는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 다당류 항원은 아디프산 다이하이드라자이드(ADH) 링커를 통해 키메라 담체 단백질에 접합되는 방법.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 접합된 키메라 담체 단백질 및 다당류 항원을 단리하여 다당류-단백질 접합체를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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