KR20170014459A - 아미노산 공급원으로 효모 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성방법 - Google Patents

아미노산 공급원으로 효모 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무세포 단백질 합성 방법에 있어서, 무세포 단백질 합성 반응액에 포함된 합성 기질로서 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 이용하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법은 잘려진 형태의 단백질 발현이 감소하고, 전장(full-length)의 단백질 발현이 증가하는 효과가 있는 무세포 단백질 합성 방법이다.

Description

아미노산 공급원으로 효모 추출물을 이용하는 무세포 단백질 합성방법{Method of cell-free protein synthesis using yeast extract as amino acid source}
본 발명은 아미노산 공급원으로 효모 추출물 또는 트립톤(tryptone)을 이용하는 무세포 단백질 합성방법에 관한 것이다.
일반적으로 세포 내에서 행해지고 있는 단백질의 합성반응은 먼저 유전 정보를 가진 DNA로부터 그 정보가 mRNA에 전사된 후, 리보솜이 mRNA의 정보를 번역하여 단백질을 합성하게 된다. 이와 같이 세포 내에 있어서의 단백질 합성을 시험관 등의 생체 외에서 행하는 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis)은 세포에서 단백질 생산에 관련되는 세포 내 단백질 합성기구와 이의 인자들만을 추출하여 세포 외부에서 세포의 생리적 조절 기작이 배제된 상태로 단백질의 합성 과정만을 인위적으로 반복시켜 단기간에 목적 단백질을 대량 생산하는 기술로서, 요구되는 단백질 생합성 기구 즉, 리보좀, 개시인자, 신장인자, 종결인자, 아미노아실티알엔에이(aminoacyl tRNA) 합성효소 등은 세포 추출액에 포함된 것을 이용하거나 별개로 추가하여 사용할 수 있다(Yoshihiro Shimizu et. al, 2001, Nature Biotechnology, 19(8):751-755; Tae-Wan Kim et. al, 2006, Journal of Biotechnology, 126(4):554-561).
종래의 무세포 단백질 합성 시스템은 중합체 합성반응 속도와 번역반응의 정확성에 있어서 세포 내에 단백질합성에 필적하는 고성능을 유지하며, 타겟 단백질을 복잡한 정제 과정을 실시하지 않고도 얻을 수 있는 유용한 방법으로 알려져 있으며, 더욱 유용하게 산업상에 적용하기 위하여 합성효율 및 경제성의 향상에 관한 몇 가지 발명이 개시되어 왔다.
이와 같은 무세포 단백질 합성방법에 관련된 알려진 기술의 일례로, 한국등록특허 제0733712호에서는 종래의 방법으로 제조된 세포 추출액보다 높은 단백질 생산 능력과 일정한 생산성을 나타내게 하면서 세포 추출액의 제조 공정을 단순화하여 제조 비용 및 시간을 절감하는 효과를 제공하는 무세포 단백질 합성용 세포 추출액 제조 및 이를 이용한 단백질 합성법에 관한 기술이 알려져 있고, 한국등록특허 제0546009호에서는 무세포 단백질 합성반응에서 사용되는 mRNA, 에너지 재생계 효소, 기질, 에너지원 중에서 선택된 요소에 대하여 추가·보존·교환·배출 중에서 선택되는 처치를 도입하는 연속 무세포 단백질 합성수단이 개시되어 있다.
하지만, 무세포 단백질 합성에 필요한 합성 기질로서, 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 사용하여 무세포 단백질을 합성하는 방법에 관해서는 아직까지 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 아미노산 공급원으로 효모 추출물 또는 트립톤을 이용하는 무세포 단백질 합성방법에 관한 것으로, 무세포 단백질 합성에서 필요한 합성 기질인 아미노산 혼합물 대신에, 효모 추출물 또는 트립톤을 이용하여 타겟 단백질이 효율적으로 합성되어 합성 기질로 아미노산을 직접 이용하는 경우와 비슷하거나 오히려 단백질 합성량이 증가할 뿐만 아니라, 잘려진 형태(truncated form)의 단백질 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 무세포 단백질 합성 방법에 있어서, 무세포 단백질 합성 반응액에 합성 기질로서 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 단백질 합성 에너지원, 타겟 유전자 정보원 및 완충용액을 함유하는 반응 배지, 세포 추출액 및 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 무세포 단백질 합성 키트를 제공한다.
본 발명은 무세포 단백질 합성 방법에 있어서, 무세포 단백질 합성 반응액에 합성 기질로서 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명의 무세포 단백질 합성 방법은 단백질의 잘려진 형태(truncated form)로 발현되는 것이 감소할 뿐만 아니라, 전장(full length)의 단백질 합성량이 증가하는 효과가 있는 것이며, 아미노산 혼합물을 사용하는 것보다 경제적인 이점이 있어 단백질 합성관련 산업에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 무세포 단백질 합성 반응액에 포함된 합성 기질로서, 아미노산 혼합물, 효모 추출물 및 트립톤을 사용하여 GFP 단백질의 무세포 단백질 합성량을 확인한 SDS-PAGE 사진으로, Lane 1은 합성 기질로서 1.5%의 효모 추출물을 사용한 경우이고, Lane 2는 합성 기질로서, 1.5%의 트립톤을 사용한 경우이며, Lane 3은 합성기질로서, 1.5mM의 아미노산 혼합물을 사용한 경우이고, Lane 4는 음성 대조구로, DNA를 포함하지 않는 무세포 단백질 합성 반응액으로 합성한 결과이다.
도 2는 무세포 단백질 합성 반응액에 포함된 합성 기질로서 아미노산 혼합물 및 효모 추출물을 사용하여 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성량을 확인한 결과로, 무세포 단백질 합성 후, Ni-NTA 레진을 반응액에 첨가하여 세척 및 용출(elution)한 SDS-PAGE 사진이다. Lane 1은 1.5mM의 아미노산 혼합물을 포함하는 경우이고, Lane 2는 1.5%의 효모 추출물을 포함하는 경우이며, Lane 3은 1.5mM의 아미노산 혼합물 및 1.5%의 효모 추출물 둘 다를 포함하는 경우이다.
도 3은 효모 추출물의 농도에 따른 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성에서 주요 아미노산(시스테인, 글루타민)의 추가에 따른 발현량의 차이를 확인한 도면이다.
도 5는 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성에서 pH 변화에 의한 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성에서 에너지원으로 크레아틴 인산 이외에 포도당을 추가한 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 에너지원으로 크레아틴 인산 및 포도당을 사용하는 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성에서, pH 변화에 따른 발현량의 차이를 확인한 결과이다.
도 8은 다양한 사이토카인에 대하여 유비퀴틴을 융합하고, 효모 추출물을 아미노산 공급원으로 이용하여 무세포 단백질 합성한 결과이다.
본 발명은 무세포 단백질 합성 방법에 있어서, 무세포 단백질 합성 반응액에 합성 기질로서 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 구체적으로
(1) 단백질 합성 에너지원, 타겟 유전자 정보원 및 완충용액을 함유하는 반응 배지를 제조하는 단계;
(2) 상기 반응 배지에 세포를 파쇄하여 단백질 합성에 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함한 세포 추출액을 첨가하는 단계;
(3) 상기 단계 (2) 전 또는 후에, 효모 추출물 또는 트립톤을 첨가하여 무세포 단백질 합성 반응액을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 단백질 합성 반응액을 25 내지 40℃에서 2 내지 6시간 동안 반응시켜 타겟 단백질을 합성하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 (2)의 세포 추출액은 대장균 및 고초균 중에서 선택된 원핵세포 또는 밀의 배아 및 망상 적혈구 중에서 선택된 진핵세포로부터 추출한 세포 추출액인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)으로부터 추출한 세포 추출액을 이용하는 것이지만 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 단백질 합성 에너지원은 크레아틴 인산(creatine phosphate), 포도당(glucose) 또는 이들 둘 다를 이용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 크레아틴 인산에 6mM의 포도당을 에너지원으로 사용하는 것이지만, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 타겟 유전자 정보원은 목적 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA인 것이 바람직하며, 형태는 플라스미드 또는 PCR 증폭한 선형 DNA인 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 단백질 합성 반응액의 초기 pH는 7.5 내지 10.0인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 초기 pH가 7.5 내지 9.0인 것이고, 더욱더 바람직하게는 초기 pH가 8.5인 조건에서 무세포 단백질 합성하는 것이다.
또한, 본 발명은 단백질 합성 에너지원, 타겟 유전자 정보원 및 완충용액을 함유하는 반응 배지, 세포 추출액 및 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 무세포 단백질 합성 키트에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 실험방법]
1. 세포 추출액( S12 extract )의 제조
대장균 유래의 BL21(DE3)를 5㎖의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 37℃에서 밤새 40㎖의 2xYTPG 배지에 계대 배양을 하고, 4ℓ의 2xYTPG 배지가 들어있는 발효조에 접종을 하여 같은 온도에서 배양을 하였다. 흡광도(OD600)가 0.6이 되었을 때, 최종적으로 1mM의 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 발효조에 넣어주어 T7 RNA 중합효소를 발현시키고, 흡광도(OD600)가 4.5가 되었을 때, 세포 배양을 중단하고, 원심분리(4,500rpm, 15분, 4℃)를 통하여 배지로부터 대장균만(cell pellet)을 수집하였다. 상기 회수된 대장균은 1g당 20mM의 완충용액 A[10mM Tris-acetate buffer(pH 8.2), 14mM magnesium acetate, 60mM potassium glutamate, 1mM dithiothreitol(DTT), 0.05%(v/v) 2-mercaptoethanol(2-ME)]를 넣어 잘 씻어주는 과정을 3회 반복하였다.
상기 세척된 대장균 10g 당 12.7㎖의 완충용액 B(완충용액 A에서 2-ME를 제거한 완충용액)를 넣고 상기 대장균을 균일하게 잘 풀어준 후, 압착기(French Pressure Cell Press, Thermo Scientific)를 이용하여 일정한 압력(12,000 psi)으로 세포를 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄액은 원심분리(30,000rcf, 30분, 4℃)를 통해 상등액을 수득하였고, 이를 37℃에서 30분간 인큐베이션 한 다음 소량씩 분주하여 사용할 때까지 초저온 냉동고(-80℃)에 보관하였다.
2. 무세포 단백질 합성 및 확인
무세포 단백질 합성 반응은 1.75㎖의 소형 시험관에 넣고 30℃의 항온수조에서 반응하였다. 57mM의 완충용액(HEPES-KOH, pH 8.2), 1.4mM의 ATP, 1.0mM의 CTP, GTP 및 UTP, 1.8mM의 DTT, 90mM의 포타슘 글루타메이트(potassium glutamate), 80mM의 암모늄 아세테이트(ammonium acetate), 8mM의 마그네슘 아세테이트(magnesium acetate), 20mM의 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 34㎍/㎖의 L-5-포르밀-5,6,7,8-테트라히드로폴릭산(L-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid; folinic acid), 2%(w/v)의 PEG(8000), 80mM의 D-포도당 또는 67mM의 크레아틴 인산(creatine phosphate), 13.3㎍/㎖의 플라스미드 DNA 또는 선형 DNA, 및 27%(v/v)의 S12 추출액을 무세포 단백질 합성 반응액으로 사용하였으며 종래에 사용하던 3.2mM의 20종의 아미노산 혼합물 대신에 1.5~6.0%(v/v)의 효모 추출물 또는 트립톤을 각 실시예의 조건에 따라 첨가하여 무세포 단백질 합성을 실시하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 무세포 단백질 합성은 30℃에서 2시간 내지 6시간의 조건으로 실시하였으며, pH는 6.7에서 10.0까지의 조건으로 하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 무세포 단백질 합성 결과는 Coomassie blue-stained Tricine-SDS-PAGE를 통하여 크기 및 발현량을 확인하였다.
실시예 1. 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물( yeast extract ) 또는 트립톤( tryptone )을 이용한 GFP 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 1에서는 무세포 단백질 합성에서 필요한 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 이용하여 GFP 단백질 합성이 가능한지 여부를 확인하였다. 상기한 바와 같은 무세포 단백질 반응액을 준비하였으며(S12 세포 추출액 및 에너지원으로 크레아틴 인산을 이용), pH7.5 조건으로, 30℃에서 2시간 동안 무세포 단백질 합성하였다.
무세포 단백질 합성 결과는 도 1에 개시한 바와 같이, 합성 기질로서, 20종의 아미노산 혼합물을 사용한 경우와 비교하여 효모 추출물 또는 트립톤을 사용한 경우, GFP 단백질의 합성량이 증가하는 것으로 나타남으로써, 효모 추출물 또는 트립톤을 사용하여 무세포 단백질 합성을 할 수 있을 뿐만 아니라 발현량이 증진된 것을 확인하였다.
실시예 2. 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물( yeast extract )을 이용한 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 2에서는 interleukin-8 superfamily에 속하는 cytokine인 RANTES 단백질의 무세포 단백질 합성을 실시하였다.
RANTES 단백질의 가용성 (solubility)을 향상시키기 위해, N-말단에 유비퀴딘(ubiquitin)을 융합시켜 발현(ubRANTES)하였고, GFP 단백질의 발현과 마찬가지로 정제된 아미노산 혼합물(각각의 1.5mM 아미노산 20종의 혼합물) 대신에 효모 추출물을 사용하여 무세포 단백질 합성을 실시하였다.
무세포 단백질 합성 결과는 도 2에 개시한 바와 같이, 번역 주형으로 아미노산 혼합물을 사용한 경우와 비교하여 효모 추출물을 사용한 경우에도 ubRANTES 단백질의 합성량이 거의 유사하게 나타났으며, 아미노산 혼합물을 사용한 경우에는 truncated form이 관찰되었으나, 효모 추출물을 사용한 경우에는 full-length의 길이인 15kDa의 발현량이 증가하고, 잘려진 형태(truncated form)의 것은 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 3. 효모 추출물의 농도에 따른 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 3에서는 효모 추출물의 농도에 따른 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성을 실시하였다.
ubRANTES 단백질은 가용성(solubility)을 향상시키기 위해, N-말단에 유비퀴딘(ubiquitin)을 융합시킨 RANTES 단백질이고, 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물을 첨가한 무세포 단백질 합성 반응액을 이용하였다. 이때 효모 추출물의 농도를 1.5, 3 및 6%(v/v)으로 30℃에서 2시간 동안 반응하였고, 3%(v/v)의 효모 추출물을 첨가한 반응액은 별도로, 3시간 동안 반응하여 효모 추출물의 농도와 반응시간에 따른 양상을 분석하였다.
본 실시예 3에서는 상기한 방법으로 제조한 S12 추출액 및 에너지원으로 크레아틴 인산을 포함하는 단백질 합성반응액(pH 8.5)을 이용하였다.
결과는 도 3에 개시한 바와 같이, 효모 추출물의 농도가 증가할수록 잘려진 형태(truncated form)가 줄고, full-length를 갖는 단백질이 많이 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 3%(v/v)의 효모 추출물을 첨가한 경우, full-length의 발현량이 최대이며, 반응시간을 2시간에서 3시간으로 1시간 증가시킨 경우에도, 거의 동일한 양상을 보였다. 6%(v/v)의 효모 추출물을 사용한 경우, 잘려진 형태의 발현이 거의 없었으나, 15kDa 위치에서 나타나는 full-length를 갖는 단백질의 발현도 줄어든 것을 확인하였다.
실시예 4. 20종의 아미노산 혼합물 또는 효모 추출물의 첨가에 따른 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 4에서는 아미노산 혼합물 또는 효모 추출물을 사용한 경우에 추가로 주요 아미노산을 추가하여 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성을 실시하였다. 아미노산 혼합물 또는 효모 추출물에 추가로 주요 아미노산인 시스테인 또는 글루타민을 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일한 조건으로 무세포 단백질 합성을 실시하였다.
결과는 도 4에 개시한 바와 같이, 20종의 아미노산 혼합물을 사용한 경우(도 4의 lane 1), 20종의 아미노산 혼합물에 2mM의 시스테인과 2mM의 글루타민을 추가한 경우(도 4의 lane 2), 3%(v/v)의 효모 추출물에 2mM의 시스테인을 추가한 경우(도 4의 lane 3), 3%(v/v)의 효모 추출물에 2mM의 글루타민을 추가한 경우(도 4의 lane 4), 3%(v/v)의 효모 추출물에 2mM의 시스테인과 2mM의 글루타민을 추가한 경우(도 4의 lane 5) 및 3%(v/v)의 효모 추출물을 첨가한 경우 모두 ubRANTES 단백질이 발현하였으나, 20종의 아미노산 혼합물을 사용한 경우보다 3%(v/v)의 효모 추출물을 사용한 경우 발현량이 높았고, 각각의 경우에 주요 아미노산인 시스테인과 글루타민을 추가하여도 발현량에는 아무런 변화가 없었다. 이와 같은 결과로부터, 효모 추출물 첨가에 의한 발현량의 증가 및 잘려진 형태(truncated form)의 감소 효과는 단순하게 아미노산의 농도에 의한 효과가 아니라는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. pH 변화에 따른 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 5에서는 반응초기의 pH를 6.7에서 9.0까지 다르게 하는 조건으로, 3%(v/v)의 효모 추출물을 이용하는 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성을 37℃에서 2시간동안 반응시켰다.
결과는 도 5에 개시한 바와 같이, pH가 7.5 내지 9.0에서는 무세포 단백질 합성이 잘 이루어졌으나, 낮은 pH인 6.7 또는 7.0에서는 합성이 잘 이루지지 않았음을 확인하였다. pH 8.5에서 무세포 단백질 합성을 실시한 경우, 다른 pH에 비해 발현률이 가장 높았으며, 잘려진 형태의 발현도 거의 나타나지 않았다.
실시예 6. 에너지원으로 크레아틴 인산 이외에 포도당을 추가한 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 6에서는 pH 7.5 및 8.5에서 기본적으로 크레아틴 인산을 에너지원으로 사용하고, 추가로 6mM 및 12mM의 포도당을 첨가하여 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성을 30℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
결과는 도 6에 개시한 바와 같이, pH8.5에서 6mM의 포도당을 추가한 경우가 발현량이 가장 높았으며, 이외의 조건에서도 발현은 잘 이루어지고 있음을 확인하였다.
실시예 7. 에너지원으로 크레아틴 인산 이외에 포도당을 추가한 ubRANTES 단백질의 무세포 단백질 합성
상기 실시예 6에서 실시한 pH 조건보다 높은 8.0 내지 10.0의 조건으로 무세포 단백질 합성을 실시하였으며, S12 추출액을 이용하였고, 기본 에너지원으로 크레아틴 인산을 이용하였으며, 각각의 pH에 대하여 6mM 및 12mM의 포도당을 추가하였고, 아미노산 혼합물 대신에 3%(v/v)의 효모 추출물을 사용하였다. 또한, 반응조건은 30℃ 아닌 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
결과는 도 7에 개시한 바와 같이, pH9.0에서 6mM의 포도당을 추가한 경우가 발현량이 가장 높았으며, 이외의 조건에서도 발현은 잘 이루어지고 있음을 확인하였다.
실시예 8. 사이토카인( IGF -1, IL -8 및 IL -6) 단백질의 무세포 단백질 합성
본 실시예 8에서는 다양한 사이토카인에 유비퀴틴을 융합하여 3%(v/v) 효모 추출물을 이용한 무세포 단백질 합성을 실시하였다. 무세포 단백질 합성 반응은 30℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 무세포 단백질 합성 반응액은 S12 추출액을 이용하였고, 에너지원으로, 크레아틴 인산 및 6mM 포도당을 이용하였으며, pH는 8.5에서 실시하였다.
결과는 도 8에 개시한 바와 같이, 가용성 사이토카인의 발현이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 무세포 단백질 합성 방법에 있어서, 무세포 단백질 합성 반응액에 합성 기질로서 아미노산 혼합물 대신에 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 단백질 합성 에너지원, 타겟 유전자 정보원 및 완충용액을 함유하는 반응 배지를 제조하는 단계;
    (2) 상기 반응 배지에 세포를 파쇄하여 단백질 합성에 필요한 세포 소기관 및 인자를 포함한 세포 추출액을 첨가하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2) 전 또는 후에, 효모 추출물 또는 트립톤을 첨가하여 무세포 단백질 합성 반응액을 제조하는 단계; 및
    (4) 상기 단백질 합성 반응액을 25 내지 40℃에서 2 내지 6시간 동안 반응시켜 타겟 단백질을 합성하는 단계;를 포함하는 무세포 단백질 합성 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 (2)의 세포 추출액은 대장균 및 고초균 중에서 선택된 원핵세포 또는 밀의 배아 및 망상 적혈구 중에서 선택된 진핵세포로부터 추출한 세포 추출액인 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단백질 합성 에너지원은 크레아틴 인산(creatine phosphate) 또는 포도당(glucose)인 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 타겟 유전자 정보원은 목적 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA인 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 단백질 합성 반응액의 초기 pH는 7.5 내지 9.0인 것을 특징으로 하는 무세포 단백질 합성 방법.
  7. 단백질 합성 에너지원, 타겟 유전자 정보원 및 완충용액을 함유하는 반응 배지, 세포 추출액 및 효모 추출물 또는 트립톤을 포함하는 무세포 단백질 합성 키트.
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