KR20170010439A - 히단토인 유도체 함유 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 뼈 및/또는 연골 동화작용(anabolism)을 유도하기 위한 의약 조성물이다;
[화학식 1]
Figure pct00067

(화학식 중 R1, R2, R3, R4는 특허청구범위에 기재된 그것과 동일 정의이다).

Description

히단토인 유도체 함유 의약 조성물{Hydantoin derivative-containing pharmaceutical composition}
본 발명은 높은 대사 안정성을 갖고, 강력한 PTH 유사 작용을 발휘하는 히단토인 유도체를 유효 성분으로 하는 의약품에 관한 것으로, 뼈 및/또는 연골 동화작용을 유도시켜 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 결손, 변형성관절증, 관절연골 결손, 무형성골증, 연골무형성증, 연골저형성증, 골연화증, 골절 등에 대한 예방, 치료, 회복 및 치유 촉진을 위한 의약을 제공한다.
부갑상선 호르몬(PTH)은 뼈나 신장의 표적세포에 작용하여 칼슘(Ca) 및 인(Pi) 항상성(homeostasis)을 조절하는 호르몬으로서 알려져 있다(비특허문헌 1). PTH에 의한 혈청 Ca 농도 레벨의 유지는 주로 소화관, 뼈 및 신장으로의 직접적 또는 간접적인 작용에 의해 행해지고 있다. PTH는 신장 요세관에서의 Ca의 재흡수를 촉진하여 생체내 Ca의 체외로의 배설을 억제한다. 또한 신장에 있어서 비타민 D를 활성형 비타민 D로 변환하는 효소의 합성을 높임으로써 활성형 비타민 D에 의한 소화관으로부터의 Ca 흡수 촉진에 기여한다. 또한 PTH는 골아세포 등을 매개로 하여 간접적으로 파골세포의 분화를 항진함으로써 뼈로부터의 Ca 방출을 촉진한다. 이들 PTH의 작용은 주로 PTH1R로의 결합에 의한 cAMP 생산을 매개로 한 아데닐산 시클라아제 및/또는 포스포리파아제 C의 수용체에 의한 활성화를 매개로 하여 발휘되는 것으로 생각되고 있다.
PTH 제제[PTH(1-34)와 PTH(1-84)]는 인간에 있어서 강력한 뼈 동화작용을 가져 골밀도와 골강도의 현저한 상승을 유도한다. 현재 인간에서 이용 가능한 골다공증 치료제의 대부분은 뼈 흡수 억제제로, 적극적으로 골밀도를 상승시키는 뼈 동화작용을 갖는 약은 PTH 제제뿐이다. 이러한 사실로부터 PTH 제제는 골다공증 치료의 가장 유효한 치료의 하나로 간주되고 있지만(비특허문헌 2), 펩티드이기 때문에 침습투여가 필요하다. 이 때문에 PTH 유사 작용을 갖고, 또한 비침습적으로 투여할 수 있는 약제의 창출이 기대되고 있다.
변형성관절증은 무릎, 고관절, 척추, 손가락 등 전신 관절에 있어서의 연골의 변성·파괴, 활막염, 연골하골의 경화, 골극 형성 및 만성 동통에 의한 관절의 기능부전을 특징으로 하는 변성 질환으로, 65세 이상 인구의 40% 이상이 이 질환을 앓고 있는 것으로 되어 있어 의료 경제학적으로 커다란 부담이 되고 있다(비특허문헌 3, 비특허문헌 4). 변형성관절증의 원인은 관절연골로의 물리적 과가중, 활막 및 골수에 있어서의 염증, 연골 기질 성분의 유전적 소인, 연골하골의 골대사 항진 등을 들 수 있는데 관절연골의 변성·파괴를 억제하는 치료제는 시판되고 있지 않아 의료적 필요성은 여전히 높다.
지금까지 치료제의 표적으로서 연골 기질의 파괴에 관여하는 아그레카나제(ADAMTS-4, ADAMTS-5 등)나 매트릭스메탈로프로테아제(MMP-3, MMP-9, MMP-13 등, 비특허문헌 5)나 염증성 사이토카인(IL-1, IL-6 등, 비특허문헌 6)이 주목받아 왔으나 실용화에는 이르지 못하였다. 한편, 연골하골의 대사 회전 항진을 표적으로 하는 약제(리세드로네이트, 칼시토닌, 비특허문헌 7, 비특허문헌 8)의 임상시험도 행하여졌으나 관절연골의 변성·파괴를 억제하지 못하였다. 또한 이 메커니즘에 더하여 뼈 형성 촉진작용과 연골 형성 촉진작용을 함께 갖는 라넬산 스트론튬의 임상시험에 있어서 관절연골의 파괴를 억제하는 효과가 나타났으나(비특허문헌 9), 실용화에는 이르지 못하였다.
그러나 근래의 연구에 의해 변형성관절증의 병리 발생에 관절연골이 영구 연골로부터 석회화 연골로 형질전환되는 것이 보고되어 그의 억제가 치료제의 표적으로서 주목받게 되었다(비특허문헌 10). 이 작용 메커니즘을 토대로 관절연골의 최종 분화를 억제하는 복수의 메커니즘의 약제가 변형성관절증의 모델 동물에 있어서 관절연골의 변성·파괴를 억제하는 것이 보고되어 있어, 이 메커니즘을 토대로 하는 치료제의 실용화 가능성이 시사되고 있다(비특허문헌 11, 비특허문헌 12).
이러한 상황 하에 본 출원인은 하기 화학식 A로 표시되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염;
[화학식 A]
Figure pct00001
〔화학식 중 W, X, Y, m, n, R1, R2, R33, R34는 특허문헌 1을 참조〕이 PTH 유사 작용을 갖는 화합물, 바람직하게는 PTH1R 아고니스트로서 유용하여, 골다공증, 골절, 골연화증, 관절염, 혈소판감소증, 부갑상선 기능저하증, 고인혈증 또는 종양성 석회침착증 등의 예방 및/또는 치료, 또는 줄기세포 동원에 유용한 것을 발견하고, 앞서 특허출원을 하였다(특허문헌 1).
그런데 임상에 있어서 가치가 높은 비침습적으로 투여할 수 있는 약제의 창출에는 타깃에 대한 직접 작용과 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설 등의 체내동태를 고려할 필요가 있다. 이를 위해서는 인간 PTH1R을 매개로 하는 cAMP 생산능이 강하고, 또한 인체 간 마이크로솜에 대한 대사 안정성이 높은 PTH 유사 작용을 갖는 약제가 요망된다.
국제공개 제2010/126030호
Kronenberg, H.M., et al., In Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy, G.R., and Martin, T.J., (eds), pp.185-201, Springer-Verlag, Heidelberg(1993) Tashjian and Gagel, J. Bone Miner. Res. 21: 354-365(2006) Sem Arth Rheumatism 2013; 43: 303-13 CPMP/EWP/784/97 Rev. 1. 2010, European Medicines Agency Osteoarth Cart 2010; 18: 1109-1116 Osteoarth Cart 2013; 21: 16-21 Arthritis Rheum. 2006;54(11):3494-507 J Clin Pharmacol. 2011;51(4):460-71 Ann Rheum Dis. 2013 Feb;72(2):179-86 Arth Rheum 2006; 54(8): 2462-2470 Nat Med 2009; 15(12): 1421-1426 Sci Trans Med 2011;3: 101ra93
본 발명은 강한 대사 안정성을 갖고, 강력한 PTH 유사 작용을 발휘하는 히단토인 유도체를 비침습적으로 전신 폭로 또는 국소 폭로시킴으로써 뼈·연골 동화작용을 유도시켜 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 결손, 변형성관절증, 관절연골 결손, 무형성골증, 연골무형성증, 연골저형성증, 골연화증, 골절 등에 대한 예방, 치료, 회복 및 치유 촉진방법을 제공하는 것이다.
이러한 상황 하에 본 발명자들은 연구를 거듭한 결과, 새롭게 발견된 본 발명의 히단토인 유도체가 인간 PTH1R을 강제 발현시킨 세포에 있어서 강한 cAMP 생산능을 나타내고, 또한 인체 간 마이크로솜의 대사에 대해 높은 안정성을 가지고 있는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 본 발명의 화합물을 투여함으로써 뼈·연골 동화작용(anabolism)을 유도하여 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 결손, 변형성관절증, 관절연골 결손, 무형성골증, 연골무형성증, 연골저형성증, 골연화증, 골절 등에 대한 예방, 치료, 회복 및 치유를 촉진하기 위한 의약 조성물로서 유용한 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 다음에 관한 것이다.
〔1〕하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 뼈 및/또는 연골 동화작용을 유도하기 위한 의약 조성물;
Figure pct00002
〔화학식 중,
R1 및 R2는 R1과 R2가 모두 수소원자가 아니라는 조건하에 각각 독립적으로
1) 수소원자,
2) 할로겐원자,
3) 1~5개의 불소원자로 치환되어 있어도 되는 탄소수 1~2개의 알킬기, 또는
4) 1~5개의 불소원자로 치환되어 있어도 되는 탄소수 1~2개의 알콕시기
이거나; 또는
R1 및 R2는 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
Figure pct00003
(식 중 각 ＊는 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이고;
또한 R3 및 R4는 각각 독립적으로 1~3개의 불소원자로 치환되어 있어도 되는 메틸기이거나; 또는
R3 및 R4는 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 탄소수 3~6의 고리(여기서 고리를 형성하는 탄소원자 중 하나는 산소원자; 황원자; 또는 메틸기로 치환되어 있어도 되는 질소원자로 치환되어 있어도 된다.)를 형성한다.〕.
본 발명의 의약 조성물에 유효 성분으로서 포함되는 화합물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 R1과 R2의 조합이 트리플루오로메틸기와 수소원자이고, 또한 R3 및 R4는 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 시클로펜틸 고리를 형성하는 화합물을 제외시킬 수 있다.
〔2〕상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R1 및 R2가 아래의 조합에서 선택되고:
1) R1이 수소원자 또는 할로겐원자이며, 또한 R2가 수소원자, 트리플루오로메틸기 또는 트리플루오로메톡시기이다(단, R1과 R2가 모두 수소원자가 되는 경우를 제외한다);
2) R1이 트리플루오로메틸기 또는 트리플루오로메톡시기이고, 또한 R2가 수소원자 또는 할로겐원자이다;
3) R1 및 R2가 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
Figure pct00004
(식 중 각 ＊는 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이다;
또한 R3 및 R4가 메틸기이거나; 또는
R3 및 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
Figure pct00005
(식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)
를 형성하는, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔3〕상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R1, R2가 아래의 조합에서 선택되고:
1) R1이 트리플루오로메톡시기이며, 또한 R2가 불소원자이다;
2) R1이 브롬원자이고, 또한 R2가 수소원자이다;
3) R1이 트리플루오로메틸기이고, 또한 R2가 불소원자이다;
4) R1이 불소원자이고, 또한 R2가 트리플루오로메톡시기이다;
5) R1이 트리플루오로메틸기이고, 또한 R2가 수소원자이다;
6) R1이 수소원자이고, 또한 R2가 트리플루오로메톡시기이다;
7) R1, R2는 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
Figure pct00006
(식 중 각 ＊는 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이다;
또한 R3 및 R4가 메틸기이거나; 또는
R3 및 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
Figure pct00007
(식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성하는, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔4〕상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R3 및 R4가 메틸기인, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔5〕상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R3 및 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
Figure pct00008
(식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성하는, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔6〕아래의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는, 〔1〕에 기재된 의약 조성물:
1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
1-(4-(2-((2-(3-브로모페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온:
1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
1-(4-(2-((2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
1-(4-(2-((2-(2,2-디플루오로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온);
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온;
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-8-메틸-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온;
5-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2-옥사-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-6,8-디온; 및
4-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-4,6-디아자스피로[2.4]헵탄-5,7-디온.
〔7〕화합물이 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염인, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔8〕화합물이 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염인, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔9〕화합물이 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염인, 〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔10〕의약 조성물이 골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료 또는 골절의 회복 촉진용인,〔1〕에 기재된 의약 조성물.
〔11〕〔1〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 의약적으로 유효한 양을 골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료 또는 골절의 회복 촉진을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 뼈 및/또는 연골 동화작용의 유도방법.
〔12〕뼈 및/또는 연골 동화작용의 유도방법이 골다공증의 예방 또는 치료방법, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선방법, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진방법, 변형성관절증의 예방 또는 치료방법, 관절연골 결손의 회복 촉진방법, 무형성골증의 예방 또는 치료방법, 연골무형성증의 예방 또는 치료방법, 연골저형성증의 예방 또는 치료방법, 골연화증의 예방 또는 치료 또는 골절의 회복 촉진방법인,〔11〕에 기재된 방법.
〔13〕골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료, 또는 골절의 회복 촉진을 위한 의약 조성물을 제조하기 위한,〔1〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 사용.
〔14〕뼈 및/또는 연골 동화작용을 유도하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한, 〔1〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 사용.
〔15〕골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료, 또는 골절의 회복 촉진에 있어서 사용하기 위한, 〔1〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염.
또한 본 발명은 화학식 1 또는 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것에 의한, 뼈 및/또는 연골 동화작용에 의해 예방, 치료 및/또는 회복될 수 있는 병태의 처치방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해 강한 PTH 유사 작용을 갖고, 또한 높은 대사 안정성을 갖는 히단토인 유도체를 사용함으로써 뼈 및/또는 연골 동화가 유도되어 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 결손, 변형성관절증, 관절연골 결손, 무형성골증, 연골무형성증, 연골저형성증, 골연화증, 골절 등에 대한 예방, 치료, 회복 및/또는 치유 촉진이 가능해진다.
도 1은 난소 적출 랫트로의 6주간 반복투여에 있어서의 요추 및 대퇴골의 골밀도를 나타내는 도면이다. 즉, 난소 적출 랫트에 비히클(vehicle), 화합물 7 또는 hPTH(1-34)를 6주간 1일 1회 반복투여한 경우의 요추 및 대퇴골의 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 정상 랫트로의 4주간 반복투여에 있어서의 요추 및 하퇴골의 골밀도를 나타내는 도면이다. 즉, 정상 랫트에 비히클, 화합물 7 또는 hPTH(1-34)를 4주간 1일 1회 반복투여한 경우에 있어서의 요추 및 하퇴골의 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 정상 랫트로의 4주간 반복투여에 있어서의 하악골의 골밀도를 나타내는 도면이다. 즉, 정상 랫트에 비히클, 화합물 7 또는 hPTH(1-34)를 4주간 1일 1회 반복투여한 경우의 하악골의 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 토끼 하퇴골 관절연골세포의 최종 분화에 대한 화합물 7의 억제작용을 나타내는 도면이다. 즉, 토끼 하퇴골 관절연골세포의 최종 분화에 대한 화합물 7 및 hPTH(1-34)의 억제작용을 알칼리포스파타아제 염색(A), 알리자린 레드 S 염색(B)에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 연골세포에 있어서의 프로테오글리칸 합성량을 나타내는 도면이다. 즉, 인간 연골세포에 있어서의 프로테오글리칸 합성에 대한 화합물 7 및 hPTH(1-34)의 촉진작용을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 토끼 반월판 부분 절제 모델의 하퇴골 관절연골의 병변부 면적 비율을 나타내는 도면이다. 즉, 토끼 반월판 부분 절제 모델의 관절 내에 비히클 또는 화합물 7을 지속 투여한 경우의 하퇴골 관절연골의 병변부 면적 비율을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 토끼 반월판 부분 절제 모델의 하퇴골 관절연골의 수술 후 2주간에서의 육안적 변화를 나타내는 도면이다. 즉, 토끼 반월판 부분 절제 모델의 관절 내에 비히클 또는 화합물 7을 지속 투여한 경우의 수술 후 2주간에서의 하퇴골 관절연골의 변화를 육안적으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 정상 랫트로의 4주간 반복 경구투여 후의 대표예의 대퇴골 원위단(distal end) 관절연골의 조직 화상을 나타내는 도면이다. 즉, 정상 랫트에 비히클 또는 화합물 7을 4주간 1일 1회 반복 경구투여한 후, 대표예의 대퇴골 원위단 관절연골을 광학 현미경으로 병리조직학적으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 TPTX 랫트 모델에 30 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여했을 때의 각 화합물의 투여 후 24시간까지의 혈청 Ca 농도 평균 변화량을 나타내는 도면이다.
도 10은 성숙령의 난소 적출 랫트에 비히클, 화합물 7 또는 hPTH(1-34)를 3개월간 1일 1회 반복투여한 경우의 요추 및 대퇴골의 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 토끼 반월판 부분 절제 모델의 관절 내에 비히클 또는 화합물 7을 투여하고 4주간 후의 무릎관절 연골의 변화를 조직학적으로 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 높은 대사 안정성을 갖고, 강력한 PTH 유사 작용을 발휘하는 히단토인 유도체 및 그의 이용에 관한 것이다. 본 발명자들은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 합성하여 그 화합물 또는 그의 염이 뼈 및/또는 연골 동화작용을 유도하는 것을 발견하였다.
본 명세서에 있어서의 「알킬」은 지방족 탄화수소로부터 임의의 수소원자를 1개 제외시켜서 유도되는 1가의 기로, 골격 중에 헤테로원자 또는 불포화 탄소-탄소 결합을 함유하지 않고, 수소 및 탄소원자를 함유하는 히드로카르빌 또는 탄화수소기 구조의 부분 집합을 갖는다. 알킬기는 직쇄상 및 분지쇄상의 구조를 포함한다. 알킬기로서는, 바람직하게는 탄소원자수 1 또는 2의 알킬기이다. 알킬로서는, 구체적으로는 메틸기, 에틸기를 들 수 있고, 바람직하게는 메틸기이다.
본 명세서에 있어서의 「알콕시」는 상기 정의의 「알킬」이 결합한 옥시기인 것을 의미하고, 바람직하게는 탄소원자수 1 또는 2의 알콕시기이다. 구체적으로는 예를 들면 메톡시기, 에톡시기를 들 수 있고, 바람직하게는 메톡시기이다.
본 명세서에 있어서 「A로 치환되어 있어도 되는 B」란, B 중 임의의 수소원자가 임의의 수의 A로 치환되어 있어도 되는 것을 나타낸다.
또한 본 발명에 있어서는 치환기의 수는 특별히 언급이 없는 한 한정되지 않지만, 예를 들면 치환기의 수는 1~5개, 1~4개, 1~3개, 1~2개 또는 1개 등인 경우를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「할로겐원자」는 불소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 요오드원자를 의미한다.
본 명세서에 있어서 화학식 중 「＊」는 결합 위치를 의미한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 강한 PTH 유사 작용을 갖고, 또한 높은 대사 안정성을 갖는다.
본 명세서에 있어서의 「PTH 유사 작용」이란, PTH 수용체에 작용하거나, 또는 PTH 수용체를 매개로 한 시그널 전달계에 작용하여 세포내 cAMP(cAMP: 환상 아데노신-인산)를 생산시키는 활성을 의미한다.
본 발명에 있어서 「강한 PTH 유사 작용」, 「PTH 유사 작용이 강함」 또는 「강력한 PTH 유사 작용을 가짐」 여부는, 예를 들면 J. Bone. Miner. Res. 14: 11-20, 1999에 기재된 방법에 따라 cAMP 시그널 전달 해석을 행하여 cAMP 시그널 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 참고 시험예 1에 기재된 방법에 따라 인간 PTH1R을 강제 발현시킨 세포에 있어서의 cAMP 생산량을 시판의 cAMP EIA 키트(예를 들면 Biotrack cAMP EIA system, GE health care)를 사용해서 인간 PTH(1-34)를 100 nM 투여했을 때의 cAMP 시그널 활성을 100%로 하여, 각 화합물이 20% cAMP 시그널 활성을 나타내는 농도(EC20) 또는 50% cAMP 시그널 활성을 나타내는 농도(EC50)를 측정한다. 본 발명에 있어서의 「강한 PTH 유사 작용」 또는 「PTH 유사 작용이 강함」은, 예를 들면 상기 방법에 의해 측정된 EC20의 값(μM)이 5.0 이하인 것이 바람직하고, 3.0 이하인 것이 보다 바람직하며, 2.0 이하인 것이 더욱 바람직하다. EC50의 경우, 예를 들면 상기 방법에 의해 측정된 값(μM)이 25.0 이하인 것이 바람직하고, 15.0 이하인 것이 보다 바람직하며, 10.0 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한 「높은 대사 안정성」 또는 「대사 안정성이 높음」 여부는 일반적인 측정방법을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들면 간세포, 소장세포, 간 마이크로솜, 소장 마이크로솜, 간 S9 등을 사용하여 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 간 마이크로솜 중 화합물의 안정성을 T Kronbach 등의 문헌(Oxidation of midazolam and triazolam by human liver cytochrome P450IIIA4. Mol. Pharmacol, 1989, 36(1), 89-96)의 기재에 따라 측정함으로써 확인할 수 있다. 보다 구체적으로는 참고 시험예 3에 기재된 방법에 따라 확인할 수 있다. 본 발명의 「높은 대사 안정성」 또는 「대사 안정성이 높음」은, 예를 들면 상기 참고 시험예에 기재된 인체 간 마이크로솜을 사용한 대사 안정성 시험에 있어서의 클리어런스(μL/min/㎎)의 값이 60 이하인 것이 바람직하고, 40 이하인 것이 보다 바람직하며, 35 이하인 것이 더욱 바람직하다. 특히 상기 화학식 1에 있어서 R1과 R2의 조합이 트리플루오로메틸기와 수소원자이고, 또한 R3와 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 시클로펜틸 고리를 형성하는 경우를 제외하고 높은 대사 안정성을 얻는 것이 가능하다.
또한 「뼈 및/또는 연골 동화작용을 유도」하는지 여부는 공지의 방법을 사용하여 확인하는 것이 가능하다.
뼈 동화작용의 유도에 대해서는, 예를 들면 피험 화합물을 일정 기간 계속하여 투여한 후에 골밀도 또는 골량을 일반적인 측정방법을 사용하여 측정하고 대조와 비교함으로써 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 다케다 등의 문헌(Bone 2013; 53(1):167-173)에 기재된 방법에 따라 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치(예를 들면 DCS-600EX(알로카 주식회사))를 사용하여 측정할 수 있다. 이때, 골밀도가 용매 대조와 비교하여 높은 경우에는 뼈 동화작용이 유도되어 있다고 생각할 수 있다. 본발명의 화합물은, 예를 들면 골다공증 치료제로서 사용되고 있는 hPTH(1-34)의 임상 상당 용량을 피험 대상에게 투여했을 때의 골밀도 증가량과 동등 또는 그 이상의 증가를 나타내는 것이 바람직하고, 구체적으로는 예를 들면 골밀도가 용매 대조에 대해 8~12% 증가하는 경우가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 12% 이상의 증가가 있는 경우이다.
연골 동화작용의 유도에 대해서는, 예를 들면 연골세포를 본 발명의 화합물 존재하에서 배양하여 연골세포의 기질(예를 들면 프로테오글리칸) 생산량을 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한 연골세포의 최종 분화 및 석회화가 억제되는지 여부를 측정함으로써도 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 연골 기질 생산량에 대해서는 Loeser 등의 문헌(Atrh Rheum 2003; 48(8): 2188-2196), Ab-Rahim 등의 문헌(Mol Cell Biochem 2013; 376: 11-20.)에 기재된 방법에 따라 측정할 수 있다. 또한 최종 분화의 억제에 관해서는 Okazaki 등의 문헌(Osteoarth Cart 2003;11(2):122-32.)의 방법에 따라 평가할 수 있다. 이때, 연골 기질 생산량이나 최종 분화 및 석회화가 대조와 비교하여 항진 및 억제되고 있는 경우에는 연골 동화작용이 유도되어 있다고 생각할 수 있다. 본 발명의 화합물로서는, 예를 들면 연골 기질 생산 및 연골세포의 최종 분화 억제에 있어서 PTH와 동등 또는 그것 이상의 효과를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물은 PTH에 비해 높은 대사 안정성을 가지고 있는 것으로부터 상기 병태에 대해 충분한 효과를 가지면서 복수의 투여 경로를 선택하는 것이 가능해진다. 또한 연골 기질 생산량에 관해서 PTH보다 높은 효과가 얻어지는 경우는 상기 병태에 대해 PTH보다도 우수한 효과를 얻는 것이 가능해진다.
또한 예를 들면 피험 화합물을 일정 기간 계속하여 투여한 대상의 연골뼈를 채취하고 이것을 병리조직학적으로 관찰하여 관절연골 및 성장판의 비후를 확인함으로써 연골 동화작용의 유도를 확인하는 것도 가능하다. 구체적으로는 조직학적으로 관절연골 및 성장판의 연골 두께를 계측할 수 있다. 이때, 연골의 비후가 대조와 비교하여 증가해 있는 경우에는 피험 화합물의 연골 동화작용이 유도되어 있다고 생각할 수 있다. 특히 연골 비후가 PTH에 비해 현저한 경우에는 상기 병태에 대해 충분한 효과를 생각할 수 있기 때문에 바람직하고, 더욱 바람직하게는 피험 화합물이 경구투여로 효과를 갖는 것이다.
또한 예를 들면 Kikuchi 등의 방법(Osteoarth Cart 1996;4(2):99-110)이나 Sampson 등의 방법(Sci Transl Med 2011; 3: 101ra93)에 따라 반월판을 부분 절제하여 무릎관절을 불안정화시켜서 변형성관절증을 유도한 동물(설치류 및 비설치류)에게 피험 화합물을 일정 기간 계속하여 투여한 후에 당해 무릎관절 부위의 관절연골의 변성 상태를 육안적 또는 병리조직학적으로 평가함으로써도 확인할 수 있다. 이때 PTH와 마찬가지로 당해 무릎관절의 관절연골의 변성이 억제되어 있으면 피험 화합물의 연골 동화작용 및 최종 분화 억제작용에 의한 효과가 있었다고 판단할 수 있다. 더욱 바람직하게는 이들의 효과가 피험 화합물의 경구투여로 얻어지고 있는 것이다.
또한 예를 들면 Wakitani 등의 방법(Bone Joint Surg Br. 1989;71(1):74-80.)에 따라 피험 화합물을 일정 기간 관절연골 및 연골하골을 결손시킨 대상에 투여하여 결손부에 있어서의 연골의 재생 상황을 해석함으로써도 평가가 가능하다. 이때, 대조에 대해 우수한 연골 재생 효과가 관찰되면 피험 화합물의 연골 동화작용이 유도되어 있다고 생각할 수 있다. 특히 연골 재생 효과가 PTH에 비해 현저한 경우에는 상기 병태에 대해 충분한 효과를 생각할 수 있기 때문에 바람직하고, 더욱 바람직하게는 피험 화합물이 경구투여로 효과를 발휘하는 것이다.
이들 효과는 PTH 유사 작용을 측정함으로써도 확인할 수 있다. PTH의 수용체인 PTH1R을 파라크라인으로 활성화하는 PTHrP는 연골세포의 증식 및 분화 조절에 관여하는 중요한 인자로, 연골세포의 최종 분화를 억제하여 연골조직을 유지하는 작용이 알려져 있다(Science 1996; 273; 663-666.). PTH1R의 활성화에 의한 연골 동화작용은 예를 들면 Xie 등의 방법(Human Mol Genet 2012; 21(18): 3941-3955)에 따라 피험 화합물을 정상 또는 유전적으로 성장장애가 있는 대상에 일정 기간 투여하여 연골뼈의 성장 속도 및 조직학적인 성장판의 비후를 해석함으로써도 평가하는 것이 가능하다. 이때, 대조에 비해 성장 속도나 성장판의 비후를 확인할 수 있으면 피험 화합물의 연골 동화작용이 있었다고 판단할 수 있다. 특히 피험 화합물의 효과가 PTH보다 우수한 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 피험 화합물이 경구투여로 효과를 갖는 것이다.
본 발명에 관련되는 화합물은 프리체여도, 약리학적으로 허용되는 염이어도 본 발명에 포함된다. 이러한 「염」으로서는, 예를 들면 무기 산염, 유기 산염, 무기 염기염, 유기 염기염, 산성 또는 염기성 아미노산염 등을 들 수 있다.
무기 산염의 바람직한 예로서는, 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등을 들 수 있고, 유기 산염의 바람직한 예로서는, 예를 들면 초산염, 숙신산염, 푸마르산염, 말레산염, 타르타르산염, 구연산염, 락트산염, 스테아르산염, 안식향산염, 메탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염 등을 들 수 있다.
무기 염기염의 바람직한 예로서는, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리토류 금속염, 알루미늄염, 암모늄염 등을 들 수 있고, 유기 염기염의 바람직한 예로서는, 예를 들면 디에틸아민염, 디에탄올아민염, 메글루민염, N,N-디벤질에틸렌디아민염 등을 들 수 있다.
산성 아미노산염의 바람직한 예로서는, 예를 들면 아스파라긴산염, 글루타민산염 등을 들 수 있고, 염기성 아미노산염의 바람직한 예로서는, 예를 들면 아르기닌염, 리신염, 오르니틴염 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 대기 중에 방치해 둠으로써 수분을 흡수하여 흡착수가 부착되거나 수화물이 되는 경우가 있어, 그러한 수화물도 본 발명의 염에 포함된다.
또한 본 발명의 화합물은 다른 어떤 종의 용매를 흡수하여 용매화물이 되는 경우가 있는데, 그러한 염도 화학식 1의 화합물의 염으로서 본 발명에 포함된다.
본 명세서 중에 있어서는 화합물의 구조식이 편의상 일정 이성체를 나타내는 경우가 있으나, 본 발명에는 화합물의 구조상 발생하는 모든 기하이성체, 비대칭 탄소에 기초하는 광학이성체, 입체이성체, 호변이성체 등의 이성체 및 이성체 혼합물을 포함하고, 편의상의 식의 기재에 한정되는 것은 아니며, 어느 한쪽의 이성체여도 혼합물이어도 된다. 따라서, 본 발명의 화합물에는 분자 내에 비대칭 탄소원자를 가져 광학활성체 및 라세미체가 존재하는 경우가 있을 수 있으나, 본 발명에 있어서는 한정되지 않고 모두 포함된다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물의 모든 동위체를 포함한다. 본 발명 화합물의 동위체는 1개 이상의 원자가 원자번호(양성자 수)가 같고, 질량 수(양성자와 중성자의 수의 합)가 상이한 원자로 치환된 것이다. 본 발명 화합물에 포함되는 동위체의 예로서는 수소원자, 탄소원자, 질소원자, 산소원자, 인원자, 황원자, 불소원자, 염소원자 등이 있고, 각각 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl 등이 포함된다. 특히 3H나 14C와 같은 방사능을 발하여 붕괴시키는 방사성 동위체는 의약품 또는 화합물의 체내 조직 분포 시험 등을 행할 때에 유용하다. 안정 동위체는 붕괴를 일으키지 않아 존재량이 거의 변하지 않고, 방사능도 없기 때문에 안전하게 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 동위체는 합성에서 사용하고 있는 시약을 대응하는 동위체를 포함하는 시약으로 치환함으로써 통상의 방법에 따라 변환할 수 있다.
본 발명에 관련되는 화합물에는 결정 다형이 존재하는 경우도 있으나 특별히 한정되지 않고, 어느 하나의 결정형이 단일이어도 결정형 혼합물이어도 된다.
본 발명에 관련되는 화합물은 그의 프로드러그를 포함한다. 프로드러그란, 화학적 또는 대사적으로 분해할 수 있는 기를 가져, 생체에 투여된 후, 원래의 화합물로 복원되어 본래의 약효를 나타내는 본 발명 화합물의 유도체로, 공유 결합에 의존하지 않는 복합체 및 염을 포함한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 적합하게는 다음과 같다.
화학식 중 R1 및 R2가 아래의 조합에서 선택되고:
1) R1이 수소원자 또는 할로겐원자이며, 또한 R2가 수소원자, 트리플루오로메틸기 또는 트리플루오로메톡시기이다(단, R1과 R2가 모두 수소원자가 되는 경우를 제외한다);
2) R1이 트리플루오로메틸기 또는 트리플루오로메톡시기이고, 또한 R2가 수소원자 또는 할로겐원자이다;
3) R1 및 R2가 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
Figure pct00009
(식 중 ＊는 각각 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이다;
또한 R3 및 R4는 메틸기이거나;
또는 R3 및 R4는 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
Figure pct00010
(식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 보다 적합하게는 다음과 같다.
화학식 중 R1, R2는 아래의 조합에서 선택되고:
1) R1이 트리플루오로메톡시기이며, 또한 R2가 불소원자이다;
2) R1이 브롬원자이고, 또한 R2가 수소원자이다;
3) R1이 트리플루오로메틸기이고, 또한 R2가 불소원자이다;
4) R1이 불소원자이고, 또한 R2가 트리플루오로메톡시기이다;
5) R1이 트리플루오로메틸기이고, 또한 R2가 수소원자이다;
6) R1이 수소원자이고, 또한 R2가 트리플루오로메톡시기이다;
7) R1, R2는 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
Figure pct00011
(식 중 ＊는 각각 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이다;
또한 R3 및 R4는 메틸기이거나;
또는 R3 및 R4는 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
Figure pct00012
(식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성한다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서 더욱 적합하게는, 아래의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염이다.
화합물 1: 1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 2: 1-(4-(2-((2-(3-브로모페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 3: 1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 4: 1-(4-(2-((2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 5: 1-(4-(2-((2-(2,2-디플루오로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 6: 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 7: 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온,
화합물 8: 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온,
화합물 9: 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-8-메틸-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온,
화합물 10: 5-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2-옥사-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-6,8-디온, 및
화합물 11: 4-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-4,6-디아자스피로[2.4]헵탄-5,7-디온.
이들 화합물 1~11 중에서는 화합물 6, 7, 8이 보다 적합하다.
이러한 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염은 뼈·연골 동화작용을 유도하여 당해 작용에 의해 골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 손상의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 또는 골연화증의 예방 또는 치료에 유용하다.
본 발명에 관련되는 화합물 또는 그의 염은 관용되고 있는 방법에 의해 정제, 산제, 세립제, 과립제, 피복 정제, 캡슐제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 안연고제, 점안제, 점비제, 점이제, 파프제, 로션제 등으로서 제제화할 수 있다. 제제화에는 통상 사용되는 담체, 예를 들면 부형제, 결합제, 활택제, 착색제, 교미교취제 및 필요에 따라 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면활성제, pH 조정제, 방부제, 항산화제 등을 사용할 수 있고, 일반적으로 의약품 제제의 원료로서 사용되는 성분을 배합하여 통상의 방법에 의해 제제화된다.
예를 들면 경구 제제를 제조하려면, 본 발명에 관련되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염과 부형제, 추가로 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미교취제 등을 첨가한 후, 통상의 방법에 의해 산제, 세립제, 과립제, 정제, 피복 정제, 캡슐제 등으로 한다.
이들 성분으로서는, 예를 들면 콩기름, 쇠기름, 합성 글리세리드 등의 동식물유; 유동 파라핀, 스쿠알란, 고형 파라핀 등의 탄화수소; 미리스트산 옥틸도데실, 미리스트산 이소프로필 등의 에스테르유; 세토스테아릴알코올, 베헤닐알코올 등의 고급 알코올; 실리콘 수지; 실리콘유; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 등의 계면활성제; 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리아크릴산, 카르복시비닐 폴리머, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로오스 등의 수용성 고분자; 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알코올; 글리세린, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등의 다가 알코올; 글루코오스, 자당 등의 당; 무수규산, 규산알루미늄마그네슘, 규산알루미늄 등의 무기 분체, 정제수 등을 들 수 있다.
부형제로서는, 예를 들면 젖당, 콘스타치, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 이산화규소 등을 들 수 있다.
결합제로서는, 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 트래거캔스, 젤라틴, 쉘락, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜·폴리옥시에틸렌·블록 폴리머, 메글루민 등을 들 수 있다.
붕괴제로서는, 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴, 카르복시메틸셀룰로오스·칼슘 등을 들 수 있다.
활택제로서는, 예를 들면 스테아르산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화 식물유 등을 들 수 있다.
착색제로서는 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이, 교미교취제로서는 코코아 분말, 박하뇌, 방향산, 박하유, 용뇌, 계피 분말 등이 사용된다.
이들 정제·과립제에는 당의, 그외 필요에 따라 적절히 코팅하는 것은 물론 지장 없다. 또한 시럽제나 주사용 제제 등의 액제를 제조할 때에는 본 발명에 관련되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염에 pH 조정제, 용해제, 등장화제 등과, 필요에 따라 용해 보조제, 안정화제 등을 첨가하여 통상의 방법에 의해 제제화한다.
외용제를 제조할 때의 방법은 한정되지 않고 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉 제제화에 있어서 사용하는 기제 원료로서는 의약품, 의약부외품, 화장품 등에 통상 사용되는 각종 원료를 사용하는 것이 가능하다. 사용하는 기제 원료로서 구체적으로는, 예를 들면 동식물유, 광물유, 에스테르유, 왁스류, 고급 알코올류, 지방산류, 실리콘유, 계면활성제, 인지질류, 알코올류, 다가 알코올류, 수용성 고분자류, 점토광물류, 정제수 등의 원료를 들 수 있고, 추가로 필요에 따라 pH 조정제, 항산화제, 킬레이트제, 방부·방곰팡이제, 착색료, 향료 등을 첨가할 수 있으나, 본 발명에 관련되는 외용제의 기제 원료는 이들에 한정되지 않는다.
또한 필요에 따라 분화 유도작용을 갖는 성분, 혈류 촉진제, 살균제, 소염제, 세포 부활제, 비타민류, 아미노산, 보습제, 각질 용해제 등의 성분을 배합하는 것도 가능하다. 또한 상기 기제 원료의 첨가량은 통상 외용제의 제조에 있어서 설정되는 농도가 되는 양이다.
본 발명에 관련되는 화합물 또는 그의 염 또는 그들의 수화물을 투여하는 경우, 그 형태는 특별히 한정되지 않고 통상 사용되는 방법으로 경구투여해도 되고 비경구투여해도 된다. 예를 들면 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 안연고제, 점안제, 점비제, 점이제, 파프제, 로션제 등의 제로서 제제화하여 투여할 수 있다.
본 발명에 관련되는 의약의 투여량과 투여방법은 증상의 정도, 연령, 성별, 체중, 투여 형태·염의 종류, 질환의 구체적인 종류 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
투여량은 환자의 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 연령, 성차, 약제에 대한 감수성차 등에 따라 현저히 상이하나, 통상 성인으로서 1일당 약 0.03-1,000 ㎎, 바람직하게는 0.1-500 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1-100 ㎎을 1일 1-수회에 나누어 투여한다.
투여경로는 환자의 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 연령, 성차, 약제에 대한 감수성차 등을 고려하여 적절하게 선택된다. 투여방법은 본 발명의 화합물이 비침습적으로 전신 폭로 또는 국소 폭로되어 뼈 및/또는 연골 동화작용의 유도 효과가 얻어지는 방법이라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 투여방법으로서, 예를 들면 경구투여, 정맥 내 투여, 경비투여, 경피투여, 경폐투여, 관절 내 투여를 들 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 본 발명 화합물의 제조에 있어서는 원료 화합물·각종 시약은 염이나 수화물 또는 용매화물을 형성하고 있어도 되고, 모두 출발 원료, 사용하는 용매 등에 따라 상이하며, 또한 반응을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다.
사용하는 용매에 대해서도 출발 원료, 시약 등에 따라 상이하고, 또한 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해하는 것이면 특별히 한정되지 않는 것은 물론이다.
각종 이성체(예를 들면 기하이성체, 비대칭 탄소에 기초하는 광학이성체, 회전이성체, 입체이성체, 호변이성체 등)는 통상의 분리 수단, 예를 들면 재결정, 디아스테레오머염법, 효소 분할법, 각종 크로마토그래피(예를 들면 박층 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 등)를 사용함으로써 정제하여 단리할 수 있다.
본 발명에 관련되는 화합물이 프리체로서 얻어지는 경우, 당해 화합물이 형성하고 있어도 되는 염 또는 그들의 수화물의 상태로 통상의 방법에 따라 변환할 수 있다. 또한 본 발명에 관련되는 화합물이 당해 화합물의 염 또는 수화물로서 얻어지는 경우, 당해 화합물의 프리체로 통상의 방법에 따라 변환할 수 있다.
본 발명에 관련되는 화합물의 단리·정제는 추출, 농축, 증류 제거, 결정화, 여과, 재결정, 각종 크로마토그래피 등의 통상의 화학 조작을 적용하여 행할 수 있다.
본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
일반적 합성법
본 발명의 화합물은 다양한 방법에 의해 합성할 수 있는데, 그 일부를 아래의 스킴으로 설명한다. 스킴은 예시로, 본 발명은 명시된 화학반응 및 조건만으로 제한되지 않는다. 아래의 스킴에서는 알기 쉽게 하기 위해 일부 치환기가 제외되어 있지만, 이들은 스킴 개시의 제한을 의도하는 것은 아니다. 본 발명의 대표적 화합물은 적절한 중간체, 공지의 화합물 및 시약을 사용하여 합성할 수 있다. 하기 일반적 합성법 중 식에 있어서의 R1, R2, R3, R4는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물(하기 일반적 합성법 중에서는 식 1로 표시되는 화합물)의 R1, R2, R3, R4와 동일 정의이다.
본 발명의 화합물(식 1)은 아래에 나타내는 제조법(방법 A, 방법 B)에 의해 합성할 수 있다.
스킴 1(방법 A)
Figure pct00013
스킴 1은 카르복실산 유도체(1)와 아미노-아미드 유도체(2)를 축합시켜 아미드-아미드 유도체(3)를 얻은 후, 분자 내 고리화로 스피로이미다졸론 고리를 구축하여 히단토인 유도체(식 1)를 얻는 방법이다.
스텝 1은 카르복실산 유도체(1)를 아미노-아미드 유도체(2)와 반응시키는 방법이다. 커플링 시약로서는, 예를 들면 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HATU) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 n-수화물(DMT-MM)을 들 수 있다. 염기로서는 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민을 들 수 있다. 필요한 경우 촉매로서 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)을 사용할 수 있다. 적절한 용매로서는 디클로로메탄 또는 N,N-디메틸포름아미드 등을 들 수 있다. DMT-MM을 사용하는 경우의 적절한 반응 용매로서 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴을 들 수 있다. 반응 온도는 예를 들면 0℃~실온에서 행하고, 반응 시간은 0.5~24시간이다. 얻어진 아미드-아미드 유도체(3)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 2는 수산화나트륨 수용액 또는 칼륨 t-부톡시드 등의 적절한 염기의 존재하 에탄올, tert-부탄올 또는 디메틸설폭시드 등의 적절한 용매 중에서 아미드-아미드 유도체(3)를 고리화하는 방법이다. 반응 온도는 예를 들면 실온~환류 조건에서 행하고, 반응 시간은 1~24시간이다. 얻어진 히단토인 유도체(식 1)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스킴 1에 나타내어지는 아미노-아미드 유도체(2)는 피페리디논 유도체(4)로부터 합성할 수 있다. 스킴 2에 아미노-아미드 유도체(2)의 합성법을 나타낸다.
스킴 2
Figure pct00014
스텝 3은 피페리디논 유도체(4)를 아미노-니트릴 유도체(5)로 유도하는 스트레커(Strecker) 합성이다. 즉, 피페리디논 유도체(4)를 물의 존재하/비존재하 메탄올, 에탄올 또는 테트라히드로푸란 등의 적절한 용매 중에서 시안화나트륨 또는 시안화칼륨 및 염화암모늄 또는 초산암모늄과 반응시키는 방법이다. 반응 온도는 예를 들면 실온~80℃에서 행하고, 반응 시간은 2~72시간이다. 얻어진 아미노-니트릴 유도체(5)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 4는 과산화수소 존재하에서의 염기성 가수분해 조건에 의해 니트릴기를 아미드기로 변환하는 방법이다. 본 반응은 예를 들면 Chemistry-A European Journal(2002), 8(2), 439-450을 참고로 행할 수 있다.
스텝 5는 H2 분위기하 각각 팔라듐 탄소 또는 수산화팔라듐 탄소 등의 촉매의 존재하 메탄올, 에탄올, 트리플루오로에탄올, 디메틸포름아미드 또는 디메틸아세트아미드 등의 불활성 용매 중에서 화합물(6)의 올레핀을 수소 첨가하는 방법이다. 반응 온도는 실온~80℃에서 행하고, 가압하에서 반응을 행해도 되는 경우도 있다. 얻어진 아미노-아미드 유도체(2)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스킴 2에 나타내어지는 피페리디논 유도체(4)는 공지의 케탈-비닐설포닐 유도체(7)와 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)로부터 합성할 수 있다. 스킴 3에 피페리디논 유도체(4)의 합성법을 나타낸다.
스킴 3
Figure pct00015
스텝 6은 N2 분위기하 각각 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐 등의 팔라듐 촉매의 존재하 트리-tert-부틸포스핀테트라플루오로붕산 등의 포스핀리간드, 메틸디시클로헥실아민 등의 적절한 염기를 첨가하고, N-메틸-2-피페리돈(NMP) 등의 적절한 용매 중에서 케탈-비닐설포닐 유도체(7)와 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)를 커플링시킴으로써 케탈-아릴비닐설포닐 유도체(9)를 합성하는 방법이다. 반응 온도는 90℃~환류 온도에서 행한다. 얻어진 케탈-아릴비닐설포닐 유도체(9)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 7은 케탈-아릴비닐설포닐 유도체(9)를 함수 테트라히드로푸란 등의 적절한 용매 중에서 염산 등의 산의 존재하 케탈을 케톤으로 변환하는 방법이다. 반응 온도는 예를 들면 용매의 비점, 반응 시간은 1~24시간이다. 얻어진 피페리디논 유도체(4)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스킴 3에 나타내어지는 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)는 4-브로모-3,5-디메틸아닐린(10)과 브로모초산 유도체(11) 또는 2-브로모-5-요오도-1,3-디메틸벤젠(13)과 아미노산 유도체(14)로부터 합성할 수 있다. 스킴 4에 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)의 합성법을 나타낸다.
스킴 4
Figure pct00016
스텝 8은 디이소프로필에틸아민 등의 적절한 염기 존재하 N-메틸-2-피페리돈(NMP) 등의 적절한 용매 중에서 4-브로모-3,5-디메틸아닐린(10)을 브로모초산 유도체(11)로 알킬화하는 방법이다. 반응 온도는 예를 들면 실온~100℃이고, 반응 시간은 1~24시간이다. 얻어진 아릴브로마이드-아미노산 유도체(12)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 9는 요오드화구리(I) 등의 금속 촉매 존재하 2-브로모-5-요오도-1,3-디메틸벤젠(13)과 아미노산 유도체(14)를 반응시켜 아릴브로마이드-아미노산 유도체(12)를 합성하는 방법이다. 반응은 디아자비시클로운데센(DBU) 등의 적절한 염기 존재하 N,N-디메틸아세트아미드(DMA) 등의 적절한 용매 중 80-120℃ 정도의 반응 온도에서 행할 수 있다. 얻어진 아릴브로마이드-아미노산 유도체(12)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 10은 아릴브로마이드-아미노산 유도체(12)와 시안산나트륨을 산성 조건하에서 반응시켜 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)를 합성하는 방법이다. 용매는 예를 들면 초산-디클로로메탄 등의 혼합 용매로 행하고, 반응 온도는 실온~60℃, 반응 시간은 1~24시간이다. 얻어진 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스킴 3에 나타내어지는 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)는 4-브로모-3,5-디메틸아닐린(10)과 케톤 유도체(15)로부터 합성하는 것도 가능하다. 스킴 5에 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)의 합성법을 나타낸다.
스킴 5
Figure pct00017
스텝 11은 케톤 유도체(15)를 아릴아미노-니트릴 유도체(16)로 유도하는 스트레커 합성이다. 즉, 케톤 유도체(15)를 초산 등의 적절한 용매 중 4-브로모-3,5-디메틸아닐린(10)과 시안화트리메틸실릴을 반응시키는 방법이다. 실온 등의 반응 온도에서 행하는 것이 가능하고, 반응 시간은 1~3시간 정도이다. 얻어진 아릴아미노-니트릴 유도체(16)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 12는 아릴아미노-니트릴 유도체(16)를 디클로로메탄 등의 적절한 용매 중 2,2,2-트리클로로아세틸이소시아네이트와 반응시킨 후 메탄올, 물, 트리에틸아민 등의 시약을 첨가하여 가열 조건하에서 반응시켜 이미노히단토인 유도체(17)를 합성하는 방법이다. 얻어진 이미노히단토인 유도체(17)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 13은 이미노히단토인 유도체(17)를 산성 조건하에서 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)로 변환하는 방법이다. 예를 들면 초산-물의 용매 중 65℃ 정도의 가열 조건하 1~6시간 정도의 반응 시간으로 합성할 수 있다. 얻어진 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스킴 6은 비닐설폰아미드 유도체(18)와 히단토인-아릴브로마이드 유도체(8)를 금속 촉매 존재하에서 헤크(Heck) 반응시킨 후, 얻어진 화합물(19)의 올레핀을 접촉 수소화하여 히단토인 유도체(식 1)를 얻는 방법이다.
스킴 6(방법 B)
Figure pct00018
스텝 14의 반응은 스텝 6, 스텝 15의 반응은 스텝 5의 방법에 따라 히단토인 유도체(식 1)를 합성할 수 있다. 얻어지는 히단토인 유도체(식 1)는 일반적 기술에 의해 단리하고, 필요한 경우 결정화 또는 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.
스텝 14에서 사용하는 비닐설폰아미드 유도체(18)는 WO2010/126030(A1)의 스킴 2, 스킴 3 및 스킴 12를 참고로 합성할 수 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 아래의 실시예에 의해 추가로 예시되나 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 난소 적출 랫트로의 6주간 반복투여에 있어서의 골밀도에 대한 효과
일본 찰스·리버 주식회사로부터 입수한 암컷 Crl:CD(SD) 랫트를 20~26℃, 습도 35~75%의 표준 실험실 조건하에서 1주간 이상 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 랫트에게는 수돗물 및 1.1% 칼슘, 1.0% 인산 및 250 IU/100 g의 비타민 D3를 포함하는 표준 설치동물 사료(CE-2)(클레어 재팬 주식회사)를 자유롭게 섭취시켰다.
12주령의 랫트에게 양측의 난소 적출술(OVX) 및 겉보기수술(Sham)을 실시하였다. 수술 후 4주째에 체중을 측정하여 1군 6마리로 각 군의 평균 체중이 균등해지도록 랫트를 배분하여 군을 나누었다. 군을 나눈 다음날부터 각 랫트에게 6주간 1일 1회 반복투여를 행하였다. Sham-대조군의 랫트에게는 경구투여의 용매(Vehicle) 및 피하 투여의 용매(PC buffer)가 각각 경구 및 피하 투여되었다. OVX-대조군의 랫트에게는 비히클 및 PC 버퍼가 각각 경구 및 피하 투여되었다. OVX-화합물 7의 랫트에게는 비히클에 용해시킨 전술한 화합물 7이 30 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여되고, 또한 PC 버퍼가 피하 투여되었다. OVX-hPTH(1-34)군의 랫트에게는 비히클이 경구투여되고, PC 버퍼에 용해시킨 hPTH(1-34)가 0.9 nmol/㎏의 용량으로 피하 투여되었다.
또한 골다공증 치료제로서 임상응용되고 있는 Forteo(등록상표) 20 ㎍을 인간에게 투여했을 때와 같은 정도의 AUC(혈중농도-시간곡선하면적)를 랫트에게 투여했을 때에 나타내는 투여 용량으로서 0.9 nmol/㎏을 설정하였다. 어느 쪽 군에도 경구투여는 5 mL/㎏, 피하 투여는 1 mL/㎏의 용량으로 각각 투여하였다. 비히클은 10% 디메틸설폭시드(와코 순약 공업 주식회사), 10% 콜리포르 EL(시그마알드리치 재팬 합동 회사), 10% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(니혼 쇼쿠힝 가코 주식회사)을 글리신(와코 순약 공업 주식회사) 및 수산화나트륨(와코 순약 공업 주식회사)에 의해 pH 10으로 조정한 조성의 것을 사용하였다. PC 버퍼는 25 mmol/L 인산·구연산 완충액, 100 mmol/L NaCl, 0.05% Tween80을 pH 5.0으로 조정한 조성의 것을 사용하였다. 최종 투여 다음날에 마취하에서 복대동맥으로부터 혈액을 채취하여 랫트를 안락사 처치한 후, 부검을 행하여 요추 및 대퇴골을 채취하였다. 요추 및 대퇴골은 70% 에탄올 중에 보존하였다. 요추 및 대퇴골의 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치(DCS-600EX, 알로카 주식회사)를 사용하여 측정하였다. 요추 골밀도는 제2 부터 제4 요추를 측정하고, 대퇴골 골밀도는 대퇴골을 세로로 10등분하여 무릎 측 3개 분량의 원위단을 측정하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.
데이터는 평균값＋표준오차(SE)로서 나타내었다. SAS 전 임상 패키지 ver.5.00(SAS Institute Japan)을 사용하여 아래의 통계학적 해석을 실시하였다. 유의수준은 양측 5%로 하였다. 요추 및 대퇴골 골밀도에 대해서 2군의 t검정에 의해 Sham-대조군과 OVX-대조군의 비교(#P＜0.05), OVX-대조군과 OVX-화합물 7의 비교(*P＜0.05), 및 OVX-대조군과 OVX-hPTH(1-34)군의 비교(∫P＜0.05)를 행하였다.
도 1에 나타내는 바와 같이 대퇴골 골밀도에 있어서 OVX-대조군은 Sham-대조군에 대해 유의한 골밀도 감소를 나타내고, 양성 대조인 OVX-hPTH(1-34)군은 OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내었다. OVX-대조군에 대한 OVX-hPTH(1-34)군의 증가율은 8%였다. 이때 OVX-화합물 7군은 OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내고, 증가율은 12%였다. 또한 요추 골밀도에 있어서 OVX-대조군은 Sham-대조군에 대해 유의한 골밀도 감소를 나타내고, OVX-화합물 7군은 OVX-대조군에 대해 유의하지는 않으나 증가 경향을 나타내었다. OVX-hPTH(1-34)군은 OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내고, 증가율은 12%였다.
상기와 같이 화합물 7의 반복 경구투여에서는 골다공증의 병태 모델인 OVX 랫트의 골밀도가 증가한 것으로부터, 화합물 7은 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 손상 등, 뼈 동화작용의 유도, 골량의 증가 또는 골재건이 필요한 병태에 대한 예방, 치료, 개선, 회복 촉진에 유효할 것으로 생각된다. 또한 화학식 1로 표시되는 화합물도 강한 PTH 유사 작용과 높은 대사 안정성이 참고 실시예 1 내지 5에 있어서 확인되고 있어, PTH 유사 작용에 의한 뼈 동화작용을 통한 골밀도 증가작용이 얻어질 것으로 생각된다. 그렇기 때문에 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해서도 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 손상 등, 뼈 동화작용의 유도, 골량의 증가 또는 골재건이 필요한 병태에 대한 예방, 치료, 개선, 회복 촉진에 유효할 것으로 생각된다.
실시예 2: 정상 랫트로의 4주간 반복투여에 있어서의 골밀도에 대한 효과
주식회사 일본 의과학 동물자재 연구소로부터 입수한 암컷 RccHan:WIST 랫트를 20~26℃, 습도 30~70℃의 표준 실험실 조건하에서 1주간 이상 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 랫트에게는 수돗물 및 표준 설치동물 사료(CR-LPF)(오리엔탈 효모 공업 주식회사)를 자유롭게 섭취시켰다.
8주령 랫트에게 정맥 카테터를 유치하였다. 카테터는 서혜부의 대퇴정맥으로부터 삽입하고, 선단은 후대정맥까지 늘려서 유치하였다. 수술 후 1주째에 체중을 측정하여 1군 10마리로 각 군의 평균 체중이 균등해지도록 랫트를 배분하여 군을 나누었다. 군을 나눈 2일 후부터 모든 랫트에게 4주간 1일 1회 반복 정맥 내 투여를 하였다. 투여는 유치한 카테터에 인퓨전 펌프(MEDFUSION SYRINGEINFUSION PUMP Model 2001)를 접속하여 행하였다.
비히클-대조군에는 용매(Vehicle)를 정맥 내 투여하였다. 화합물 7-20 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏군에는 비히클에 용해시킨 화합물 7을 각각 20 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏의 용량으로 정맥 내 투여하였다. 어느 쪽 군도 투여 용량은 5 mL/㎏, 투여 속도는 5 mL/㎏/분으로 투여하였다. 용매는 5% 디메틸설폭시드(와코 순약 공업 주식회사), 25% 프로필렌글리콜(간토 가가쿠 주식회사)/20% 에탄올(쥰세이 화학 주식회사)/15% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(니혼 쇼쿠힝 가코 주식회사)/300 mM 글리신(와코 순약 공업 주식회사)/192 mM 수산화나트륨(와코 순약 공업 주식회사)/생리식염수(주식회사 오오츠카 제약 공장)의 조성의 것을 사용하였다. 최종 투여 다음날에 마취하에서 복대동맥으로부터 혈액을 채취하여 랫트를 안락사 처치한 후, 부검을 행하여 요추, 하퇴골 및 하악골을 채취하였다. 요추, 하퇴골 및 하악골은 70% 에탄올 중에 보존하였다. 요추(제2부터 제4 요추), 하퇴골 및 하악골의 골밀도를 이중 X선 골염량 측정장치(DCS-600EX, 알로카 주식회사)를 사용하여 측정하였다. 결과는 도 2, 도 3에 나타낸다.
데이터는 평균값＋표준오차(SE)로서 나타내었다. SAS 전 임상 패키지 ver.5.00(SAS Institute Japan)을 사용하여 아래의 통계학적 해석을 실시하였다. 유의수준은 양측 5%로 하였다. 요추, 하퇴골 및 하악골 골밀도에 대해서 비히클-대조군을 대조군으로서 화합물 7의 3용량군에 대한 파라메트릭 던네트(Parametric Dunnett)형 다중 비교(*P＜0.05)를 행하였다.
도 2에 나타내는 바와 같이 요추 및 하퇴골 골밀도에 있어서 화합물 7 투여군은 비히클-대조군에 대해 용량 의존적으로 유의한 골밀도 증가 효과를 나타내었다. 또한 화합물 7-20 ㎎/㎏군, 30 ㎎/㎏군, 50 ㎎/㎏군 3군의 비히클-대조군에 대한 요추 골밀도의 증가율은 각각 16%, 21%, 25%이고, 하퇴골 골밀도의 증가율은 7%, 16%, 19%였다. 또한 도 3에 나타내는 바와 같이 하악골 골밀도에 있어서 화합물 7-30 ㎎/㎏군은 비히클-대조군에 대해 유의한 골밀도 증가 효과를 나타내었다. 비히클-대조군에 대한 증가율은 7%였다.
상기와 같이 화합물 7의 반복 경구투여에서는 골다공증의 병태 모델인 OVX 랫트의 대퇴골 골밀도가 증가하고, 화합물 7의 반복 정맥 내 투여에서는 정상 랫트의 요추, 하퇴골 및 하악골 골밀도가 증가한 것으로부터, 화합물 7의 전신 폭로는 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 손상 등, 뼈 동화작용의 유도, 골량의 증가 또는 골재건이 필요한 병태에 대한 예방, 치료, 개선, 회복 촉진에 유효할 것으로 생각된다. 또한 화학식 1로 표시되는 화합물도 강한 PTH 유사 작용과 높은 대사 안정성이 참고 시험예 1 내지 5에 있어서 확인되고 있어, PTH 유사 작용에 의한 뼈 동화작용을 통한 골밀도 증가작용이 얻어질 것으로 생각된다. 그렇기 때문에 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해서도 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 손상 등, 뼈 동화작용의 유도, 골량의 증가 또는 골재건이 필요한 병태에 대한 예방, 치료, 개선, 회복 촉진에 유효할 것으로 생각된다.
실시예 3: 토끼 관절연골세포의 최종 분화에 대한 화합물 7의 억제 효과
NZW계 토끼(4주령, 오리엔탈 효모 공업 주식회사)를 안락사 처치 후, 하퇴골의 관절연골을 채취하여 50 mL 시험관(일본 벡톤·디킨슨 주식회사)으로 옮겼다. 거기에 1% 트립신(와코 순약 공업 주식회사) 함유 PBS(나칼라이 테스크 주식회사)를 첨가하여 37℃, 1시간 연조직을 소화하였다. 그 후 1,200 rpm, 5분간의 원심 분리 후 상청을 제거하고 PBS(-)를 첨가하여 연골조직을 현탁하고 1,200 rpm, 5분간 원심 분리 후 상청을 제거하여 PBS(-)로 현탁하는 세정을 3회 반복하였다. 1.200 rpm, 5분간 원심 분리 후 세포 펠릿에 0.2% Type II collagenase(CLS-2, Worthington Biochemical Corp.) 함유 DMEM(라이프 테크놀로지스·재팬 주식회사)으로 37℃에서 3시간 소화하고, 소태아 혈청(라이프 테크놀로지스·재팬 주식회사)을 10% v/v 첨가하여 반응을 정지시켜, 10 mL 피펫(일본 벡톤·디킨슨 주식회사)으로 강하게 피펫팅하여 연골세포를 단리하였다. 그 후 1,200 rpm, 5분간 원심 분리하고 상청을 제거하여 10% FCS 함유 DMEM으로 현탁하는 세정을 3회 반복하고, 연골세포를 I형 콜라겐 코팅한 96웰 배양 플레이트(AGG TECHNO CLASS CO., LTD.,)에 1×104개/well 파종하였다. 주 3회 배지 교환하고 세포가 컨플루언트에 도달한 후에는 100 ㎍/mL 인산 아스코브르산 마그네슘염 n-수화물(와코 순약 공업 주식회사), 10 mmol/L β글리셀로인산 5수화물(와코 순약 공업 주식회사), 10% FCS를 포함하는 DMEM으로 배양하였다. 이때, 아래의 조건에서 배양하고 알칼리포스파타아제 염색(14일간 배양) 및 알리자린 레드 염색(21일간 배양)을 행하여 연골세포의 최종 분화를 평가하였다.
1)　대조
2)　BMP-2　　　　100 ng/mL
3)　화합물 7　　 10-7 ㏖/L
4)　화합물 7　　 10-6 ㏖/L
5)　화합물 7　　 3×10-6 ㏖/L
6)　화합물 7　　 10-5 ㏖/L
7)　PTH(1-34) 　10-10 ㏖/L
8)　PTH(1-34)　 10-9 ㏖/L
9)　PTH(1-34) 　10-8 ㏖/Ｌ
10) PTH(1-34)　 10-7 ㏖/Ｌ
알칼리포스파타아제 염색은 배지를 폐기 후 연골세포를 200 mmol/L Tris-HCl pH 8.2 완충액으로 1회 세정하고, 알칼리포스파타아제 염색 키트(Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I, Vector Laboratories, Inc.)의 프로토콜에 따라 염색하여 도립현미경(주식회사 니콘)으로 사진촬영하였다(대물 4배).
그 결과 BMP-2는 알칼리포스파타아제 활성의 증가를 나타내었다. 화합물 7, PTH(1-34) 모두 농도 의존적으로 알칼리포스파타아제 활성을 억제하였다(도 4A).
알리자린 레드 염색은 배지를 폐기 후 연골세포를 PBS로 2회 세정하여 100% 에탄올(와코 순약 공업 주식회사)로 15분간 고정하고, 에탄올 폐기 후 1%의 알리자린 레드 S(와코 순약 공업 주식회사)로 15분간 염색 후 증류수로 세정하여 도립현미경으로 사진촬영하였다. 그 결과 BMP-2는 알리자린 레드 염색성을 현저하게 증가시켜 석회화를 촉진시켰다. 화합물 7, PTH(1-34) 모두 농도 의존적으로 알리자린 레드 염색성을 억제하여 석회화를 억제하였다(도 4B).
실시예 4: 인간 관절연골세포의 프로테오글리칸 합성에 대한 화합물 7의 효과
동결보존되어 있는 인간 관절연골세포(Lot 2867, Cell Applications Inc.,)를 구입 후, 37℃ 수욕 중에서 해동하여 T75 배양 플라스크(CORNING, Corning Japan K.K.)에 10% 성장 보조제(Growth Supplement) 함유 기본 배지(Basal Medium)(Growth Medium, Cell Applications Inc.) 15 mL를 넣어 배양하였다. 다음날, 증식 배지(Growth Medium) 15 mL를 교환하여 3일간 배양하였다. 증식 배지를 제거하고 HBS(Cell Application Inc.)로 연골세포층을 세정하여 제거하였다. 1 mL의 트립신/EDTA 용액(Cell Applications Inc.)을 첨가하여 실온에서 약 5분간 정치하고 연골세포를 플라스크로부터 박리시켰다. 10 mL의 중화용액(Neutralizing solution)(Cell Applications Inc.)을 첨가하고 Burker-Turk 혈구계산판을 사용하여 세포수를 계측 후, 15 mL 시험관에 옮겨서 원심 분리(1,200 rpm, 5분간, 주식회사 토미 정공)하여 연골세포의 펠릿을 제작하였다. 상청을 버리고 1.2% 알긴산 나트륨(25 mmol/L HEPES/150 mmol/L 염화나트륨 용액, pH 7.0)에 2×106개/mL가 되도록 조제하고, 22G 주사바늘을 부착한 1 mL 주사기(몰테 주식회사)로 흡입하여 102 mmol/L CaCl2 수용액 2 mL를 넣은 24웰 플레이트(Corning Jappan K.K.)의 웰에 5방울씩 적하하여 5분간 정치하고 비드를 형성시켰다. 그 후 150 mmol/L 염화나트륨 용액으로 3회 세정하여 증식 배지로 1일간 배양하고 1% 성장 보조제 함유 기본 배지(Cell Applications Inc.)로 교환하였다. 이때, 배지에 아래의 인자를 첨가하고 주 3회 배지교환을 행하여 13일간 배양하였다.
1)　대조
2)　TGF-β1　　　　 10 ng/m
3)　PTH(1-34) 　 10-8 mol/L
4)　화합물 7　　　　　10-6 mol/L
5)　화합물 7　　　　　10-5 mol/L
배양 12일에 35S 표지 황산(주식회사 퍼킨엘머 재팬)을 370 kBq/well이 되도록 첨가하고 24시간 후에 배지를 시험관으로 회수하여 4℃에서 보존하였다. 알긴산 겔에 55 mmol/L 구연산 나트륨 용액(나칼라이 테스크 주식회사, 1 mL/well)을 첨가하고 37℃에서 10분간 인큐베이트하여 졸화시켜 마이크로튜브(에펜도르프 주식회사)로 회수하고 원심 분리(1,200 rpm, 5분간)하여 연골세포의 펠릿을 제작하였다. 마이크로튜브에 1 ㎎/mL 액티나아제 E(카켄 제약 주식회사) 함유 0.2 mol/L Tris-HCl(Sigma-Aldrich Co. LLC.)/5 mmol/L CaCl2(나칼라이 테스크 주식회사) pH 7.8, 0.5 mL로 현탁하여 12웰 플레이트(Corning Japan K.K.)로 옮겨 실링하고 50℃로 설정한 부란기(에스펙 주식회사) 중에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 이 소화액의 0.4 mL를 시험관으로 옮겨 0.1 ㎎/mL 콘드로이틴황산(와코 순약 공업 주식회사) 수용액을 250 μL, 2 mmol/L MgSO4(와코 순약 공업), 0.2 mol/L Tris-HCl(Sigma-aldrich)/5 mmol/L CaCl2(나칼라이 테스크 주식회사) pH 7.8), 1% 세틸피리디늄클로라이드(Cetylpyridinium chloride)(CPC, 와코 순약 공업 주식회사)/20 mmol/L NaCl(나칼라이 테스크 주식회사) 각각 2.5 mL를 첨가하여 37℃에서 3시간 인큐베이트하였다. 이 용액을 진공 펌프 흡인하에 유리필터(GC-50, ADVANTEC)로 여과하고, 1% CPC/20 mmol/L NaCl로 세정하여 프리 35S 표지 황산을 제거하였다. 유리필터를 액체 신틸레이션 카운터용 바이알에 옮기고 5 mL의 신틸레이터(Hionic-Fluor, 주식회사 퍼킨엘머 재팬)를 넣어서 액체 신틸레이션 카운터(TRI-CARB, 주식회사 퍼킨엘머 재팬)로 방사활성을 측정하였다.
소화액의 나머지 0.1 mL는 DNA 정량에 사용하였다. DNA 정량 키트(코스모·바이오 주식회사)의 완충액 1 mL에 발색액 100 μL와 소화액 450 μL를 혼화하고, 여기 356 ㎚，측정 458 ㎚로 형광강도를 측정하였다(Infinite M200, Tecan Group Ltd.).
DNA 농도의 표준곡선은 키트 부속의 표준액(100 ㎍/mL)을 2배 계단 희석하여 조제하였다. 이 표준곡선의 측정결과로부터 직선회귀식을 만들어(Excel, Microsoft) 샘플 DNA 농도를 산출하였다.
개개의 웰의 방사활성은 DNA 함량으로 표준화하였다(cpm/㎍ DNA).
그 결과, 양성 대조의 TGF-β1은 용매 대조의 10배의 방사활성을 나타내고, 프로테오글리칸의 합성량이 증가하여 있는 것이 나타났다. PTH(1-34)는 용매 대조의 6배의 방사활성을 나타내었다. 화합물 7은 10-6 mol/L에서는 용매 대조의 3배, 10-5 mol/L에서는 용매 대조의 10배의 방사활성을 나타내었다(도 5). 이 결과로부터, 화합물 7은 인간 관절연골세포에 있어서 연골 기질의 합성을 촉진시키는 작용이 있는 것이 명확해졌다.
실시예 5: 토끼 반월판 부분 절제 모델에 있어서의 화합물 7의 효과
12주령의 NZW계 수컷 토끼(오리엔탈 효모 공업 주식회사)를 5일간의 사육 순화 후, 이소플루란 마취하에 왼쪽 무릎관절의 외측 피부를 절개하고, 외측 인대 및 종자골 인대를 절제하여 외측 반월판을 노출시켰다. 외측 반월판의 중앙부를 3-4 ㎜의 폭으로 절제하여 변형성관절증 모델을 만들어냈다(Kikuchi T et al, Osteoarth Cart 1999; 4(2): 99-110.). 이때, 좌측 대퇴부 피하에 매설된 오스모틱 펌프 3개(2ML1, Durect, Road Cupertino, CA, US)에 접속된 폴리에틸렌 튜브 3개(PE60，일본 벡톤·디킨슨 주식회사)의 선단을 관절 내에 유치하고 관절 내에 약액을 지속 투여하였다. 오스모틱 펌프에는 1) 용매 대조(50% 디메틸설폭시드/50% 생식，v/v), 2) 화합물 7 3.0 ㎍/mL，3) 화합물 7 30 ㎍/mL 중 어느 하나를 충전하였다. 수술 후 7일에 재차 이소플루란 마취하여 최초에 이식한 것과 같은 약제를 충전한 오스모틱 펌프를 교환하였다. 반월판 부분 절제술 후 14일에서 토끼를 안락사시켜 대퇴골 및 하퇴골을 채취하고 20% 중성 완충 포르말린에 침지하여 고정하였다. 그 후, 관절연골 표면의 조조화(粗造化, crude construction)는 인디언 잉크로 염색하였다(도 7). 디지털 현미경(VHX-2000，주식회사 키엔스)을 사용하여 하퇴골의 표면구조를 촬영하고, 인디언 잉크 양성의 병변부 면적과 외측 관절융기(lateral condyle) 전체의 면적을 계측하여 병변부의 외측 관절융기 전체에 차지하는 비율을 산출하였다(도 6). 그 결과, 화합물 7은 용량 의존적으로 병변부 면적을 작게 하는 것이 판명되었다. 이때의 하퇴골 관절연골면의 사진을 도 4에 나타낸다.
실시예 6: 정상 랫트로의 4주간 반복 경구투여에 있어서의 성장판 연골에 대한 효과
주식회사 일본 의과학 동물자재 연구소로부터 입수한 암컷 RccHan:WIST 랫트를 20~26℃, 습도 30~70%의 표준 실험실 조건하에서 1주간 이상 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 랫트에게는 수돗물 및 1.1% 칼슘, 1.0% 인산 및 250 IU/100 g의 비타민 D3를 포함하는 표준 설치동물 사료(CE-2, 클레어 재팬 주식회사)를 자유롭게 섭취시켰다.
6주령의 랫트의 체중을 측정하여 1군 10마리로 각 군의 평균 체중이 균등해지도록 랫트를 배분하여 군을 나누었다. 군을 나눈 다음날부터 모든 랫트에게 4주간 1일 1회 반복투여하였다. 비히클-대조군에는 용매(Vehicle)를 경구투여하였다. 화합물 7-6 ㎎/㎏, 화합물 7-60 ㎎/㎏, 화합물 7-600 ㎎/㎏ 군에는 비히클에 현탁시킨 화합물 7을 각각 6 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏, 600 ㎎/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 어느 군도 투여용량은 2 mL/㎏로 투여하였다. 비히클은 프로필렌글리콜(특급, 간토 가가쿠 주식회사)을 사용하였다. 최종 투여 다음날에 마취하에서 복대동맥으로부터 혈액을 채취하여 랫트를 안락사 처치한 후 부검을 행하여 대퇴골을 채취하였다. 대퇴골은 10% 중성 완충 포르말린액으로 고정하고, 탈회 후에 파라핀 포매 박절 조직표본(헤마톡실린·에오딘 염색)을 제작하였다. 제작한 표본의 대퇴골 원위단을 광학현미경으로 병리조직학적으로 관찰하였다. 결과는 표 1에 나타내고, 대표예의 조직학적 화상을 도 8에 나타낸다.
Figure pct00019
표 1에 나타내는 바와 같이 화합물 7군은 비히클-대조군에 대해 용량 의존적으로 대퇴골의 성장판 연골을 비후시켰다. 도 8의 조직 화상으로부터 축척을 토대로 대표예의 성장판 연골의 폭(화살표)을 구하면, 비히클-대조의 개체는 약 390 ㎛이고, 화합물 7-600 ㎎/㎏의 개체는 약 2,940 ㎛였다.
상기와 같이 화합물 7의 반복 경구투여는 랫트의 대퇴골 성장판 연골을 비후시켰다. 이들의 작용은 화합물 7의 연골 동화작용의 유도, 연골의 최종 분화의 억제, 또는 연골의 증식항진에 의한 것으로, 화합물 7의 경구투여는 변형성관절증의 치료에 유효할 것으로 생각된다. 또한 화학식 1로 표시되는 화합물도 강한 PTH 유사 작용과 높은 대사 안정성이 참고 실시예 1 내지 5에 있어서 확인되고 있어, PTH 유사 작용에 의한 연골 동화작용을 통한 변형성관절증의 치료에 유효할 것으로 기대된다.
실시예 7: 성숙령 난소 적출 랫트로의 3개월간 반복투여에 있어서의 골밀도에 대한 효과
일본 찰스·리버 주식회사로부터 입수한 암컷 Crl:CD(SD) 랫트를 20~26℃, 습도 35~75%의 표준 실험실 조건하에서 1주간 이상 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 랫트에게는 수돗물 및 1.1% 칼슘, 1.0% 인산 및 250 IU/100 g의 비타민 D3를 포함하는 표준 설치동물 사료(CE-2)(클레어 재팬 주식회사)를 자유롭게 섭취시켰다.
8개월령의 랫트에게 양측의 난소 적출술(OVX) 및 겉보기수술(Sham)을 실시하였다. 수술 후 3개월째에 체중 및 요추 골밀도를 측정하여, Sham군 10마리, OVX 랫트는 1군 12마리로 5군으로 배분하였다. 각 군의 평균 체중과 요추 BMD가 균등해지도록 랫트를 군을 나누었다. 군을 나눈 후에 각 랫트에게 이하의 요령으로 3개월간 1일 1회 반복투여를 행하였다. Sham-대조군 및 OVX-대조군 랫트에게는, 경구투여(PO)의 용매(PO 비히클), 정맥내 투여(IV)의 용매(IV 비히클) 및 피하 투여(SC)의 용매(PC 버퍼)가 각각 PO, IV 및 SC 투여되었다. OVX-화합물 7-PO군의 랫트에게는, PO 비히클에 용해시킨 전술한 화합물 7이 30 mg/kg의 용량으로 PO 투여되고, 또한 IV 비히클 및 PC 버퍼가 각각 IV 및 SC 투여되었다. OVX-화합물 7-IV(저용량)군의 랫트에게는, IV 비히클에 용해시킨 전술한 화합물 7이 3 mg/kg의 용량으로 IV 투여되고, 또한 PO 비히클 및 PC 버퍼가 각각 PO 및 SC 투여되었다. OVX-화합물 7-IV(고용량)군의 랫트에게는, IV 비히클에 용해시킨 전술한 화합물 7이 10 mg/kg의 용량으로 IV 투여되고, 또한 PO 비히클 및 PC 버퍼가 각각 PO 및 SC 투여되었다. OVX-hPTH(1-34)군의 랫트에게는, PO 비히클 및 IV 비히클이 각각 PO 및 IV 투여되고, PC 버퍼에 용해시킨 hPTH(1-34)가 0.9 nmol/kg의 용량으로 SC 투여되었다.
또한, 골다공증 치료약으로서 임상응용되고 있는 Forteo(등록상표) 20 μg을 인간에게 투여했을 때와 같은 정도의 AUC(혈중농도-시간곡선하면적)를 랫트에게 투여했을 때에 나타내는 투여 용량으로서 0.9 nmol/kg을 설정하였다. 어느 쪽 군에도 PO 투여는 5 mL/kg, IV 투여는 2 mL/kg, 피하 투여는 1 mL/kg의 용량으로 각각 투여하였다. PO 비히클 또는 IV 비히클은, 10% 디메틸설폭시드(와코 순약 공업 주식회사), 10% 콜리포르 EL(시그마알드리치 재팬 합동 회사), 10% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(니혼 쇼쿠힝 가코 주식회사)을 글리신(와코 순약 공업 주식회사) 및 수산화나트륨(와코 순약 공업 주식회사)에 의해 pH 10으로 조정한 조성의 것을 사용하였다. PC 버퍼는 25 mmol/L 인산·구연산 완충액, 100 mmol/L NaCl, 0.05% Tween80을 pH 5.0으로 조정한 조성의 것을 사용하였다. 최종 투여 다음날에 마취하에서 복대동맥으로부터 혈액을 채취하여 랫트를 안락사 처치한 후, 부검을 행하여 요추 및 대퇴골을 채취하였다.
투여 기간 중, 또는 부검 시에 일반 상태에 이상이 인정된 랫트는 해석으로부터 제외하였다. 최종적인 각 군의 마릿수는, Sham-대조군 9마리, OVX-대조군 12마리, OVX-화합물 7-PO군 11마리, OVX-화합물 7-IV(저용량)군 11마리, OVX-화합물 7-IV(고용량)군 10마리, OVX-hPTH(1-34)군 12마리가 되었다.
요추 및 대퇴골은 70% 에탄올 중에 보존하였다. 요추 및 대퇴골의 골밀도를, 이중 X선 골염량 측정장치(DCS-600EX, 알로카 주식회사)를 이용하여 측정하였다. 요추 골밀도는 제2부터 제4 요추를 측정하고, 대퇴골 골밀도는, 대퇴골을 세로로 10등분하여 대퇴골두측 3개 분량의 근위단을 측정하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.
데이터는 평균값+표준오차(SE)로서 나타내었다. JMP 9.02(SAS Institute Inc)를 사용하여 아래의 통계학적 해석을 실시하였다. 유의수준은 양측 5%로 하였다. 요추 및 대퇴골 골밀도에 대해서 2군의 t검정에 의해 Sham-대조군과 OVX-대조군의 비교(＃P＜0.05)를 행하였다. 또한, OVX-대조군을 대조군으로 하여, 화합물 7을 투여한 3군 및 hPTH(1-34)를 투여한 1군의 합계 4에 대한 파라메트릭 Dunnett형 다중 비교(*P＜0.05)를 행하였다.
도 10에 나타내는 바와 같이 대퇴골 골밀도에 있어서 OVX-대조군은 Sham-대조군에 대해 유의한 골밀도 감소를 나타내고, 양성 대조인 OVX-hPTH(1-34)군은 OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내었다. OVX-대조군에 대한 OVX-hPTH(1-34)군의 증가율은 14.3%였다. 이때 OVX-화합물 7-PO군 및 OVX-화합물 7-IV(고용량)군은, OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내고, 증가율은 각각 8.8% 및 18.7%였다.
또한, 요추 골밀도에 있어서 OVX-대조군은 Sham-대조군에 대해 유의한 골밀도 감소를 나타내고, 양성 대조인 OVX-hPTH(1-34)군은 OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내었다. OVX-대조군에 대한 OVX-hPTH(1-34)군의 증가율은 22.1%였다. 이때 OVX-화합물 7-IV(고용량)군은, OVX-대조군에 대해 유의한 증가를 나타내고, 증가율은 각각 13.3%였다.
상기와 같이 화합물 7의 반복 PO 또는 IV 투여에서는 골다공증의 병태 모델인 OVX 랫트의 골밀도가 증가한 것으로부터, 화합물 7은, 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 손상 등, 뼈 동화작용의 유도, 골량의 증가 또는 골재건이 필요한 병태에 대한 예방, 치료, 개선, 회복 촉진에 유효할 것으로 생각된다. 또한 화학식 1로 표시되는 화합물도 강한 PTH 유사 작용이 참고 실시예 2 및 5에 있어서 확인되고 있어, PTH 유사 작용에 의한 뼈 동화작용을 통한 골밀도 증가작용이 얻어질 것으로 생각된다. 그렇기 때문에 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해서도 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 손상 등, 뼈 동화작용의 유도, 골량의 증가 또는 골재건이 필요한 병태에 대한 예방, 치료, 개선, 회복 촉진에 유효할 것으로 생각된다.
실시예 8: 토끼 반월판 부분 절제 모델에 있어서의 화합물 7의 효과
13주령의 Kbl:JW계 수컷 토끼(오리엔탈 효모 공업 주식회사)를 입하하여 사육 순화하고, 10 또는 11일 후 이소플루란 마취하에 왼쪽 무릎관절의 외측 피부를 절개하고, 외측 측부인대 및 종자골 인대를 절제하여 외측 반월판을 노출시켰다. 외측 반월판의 중앙부를 3-4 mm의 폭으로 절제하여 변형성 관절증 모델을 만들어내었다(Kikuchi T et al, Osteoarth Cart 1999). 반월판 부분 절제 수술 후 3일 후에 비히클 또는 화합물 7을 저용량(0.4 mg), 중용량(2 mg), 고용량(10 mg)을 무릎관절 내에 투여하였다. 비히클은 생리 식염수를 이용하여 각 개체 400 μL씩 투여하였다. 투여 후 28일 후에 토끼를 안락사시키고, 대퇴골 및 경골을 채취하여 0.5% CPC 함유 20% 중성 완충 포르말린에 침지하여 고정하였다. 그 후, 10% EDTA액(pH 7.4)으로 탈회 후, 대퇴골 및 경골에 있어서의 양측 관절융기의 일정 부위(슬와근 기시부로부터 5 mm 원위의 대퇴골 관절융기부 횡단면 및 경골 관절융기부 중앙부 횡단면)에 대해 파라핀 절편을 제작하여, 사프라닌 O 염색(사프라닌 O, 퍼스트 그린 및 철 헤마톡실린 중염색)을 행하였다.
병리조직학적 검사는 광학 현미경(BHS, 올림퍼스 광학 공업 주식회사)을 이용하여 행하였다. 대퇴골 외측 관절융기 및 경골 외측 관절융기의 일정 부위의 표본을 이용하여, 연골 변성을 정량적으로 평가하기 위해, Colombo 등의 평가법(Colombo C et. al, Arthritis Rheum. 1983; 26: 875-86)을 일부 개변한 Kikuchi 등의 평가 기준(Kikuchi T et. al, Osteoarthritis and Cartilage. 1995; 4: 99-110)에 따라, 표층의 소실, 연골 미란, 조조화(粗造化)/균열, 프로테오글리칸 염색성(사프라닌 O 염색성) 저하, 연골 세포 배열 부정, 연골 세포 소실, 연골하골 노출, (연골 세포의) 방상집족 형성의 8항목에 대해 +1~+4의 4단계로 평가하였다. 8항목의 평가점의 총합을 종합 조직학적 평점(종합 평점으로 약칭)으로 하였다(도 11). 데이터는 평균값+표준오차(SE)로서 나타내었다. 병리조직학적 검사에 있어서의 평가 항목의 항목별 평점과 종합 평점에 대해서는, 통계 소프트 SPSS 14.0J(니혼 아이.비.엠(주))를 이용하여 Mann-Whitney의 U 검정을 행하였다. 유의수준은 위험률 5 및 1%로 했다.
그 결과, 병리조직학적 검사에서는, 경골 외측과 연골 병변에 있어서, 용매 대조군과 비교하여, 저용량군에서 연골 병변의 종합적 지표인 종합 평점이 유의한 낮은 값(연골 변성 억제)을 나타내었다. 중용량, 고용량군에서도 종합 평점도 낮은 값 경향을 나타내었다.
이러하기 때문에 화합물 7은, 경골 외측과 연골 병변에 있어서 연골 변성 억제 작용을 가지는 것이라고 생각되었다.
참고 실시예
본 발명의 내용을 아래의 참고 실시예 및 참고 시험예에서 더욱 상세히 설명하나, 본 발명은 그 내용에 한정되는 것은 아니다. 모든 출발 물질 및 시약은 상업적 공급업자로부터 입수 또는 공지의 방법을 사용하여 합성하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 내부 표준으로서 Me4Si를 사용하여 또는 사용하지 않고, Mercury300(varian 제조), ECP-400(JEOL 제조) 또는 400-MR(varian 제조)을 사용해서 측정하였다(s=싱글릿, d=더블릿, t=트리플릿, brs=브로드 싱글릿, m=멀티플릿). 질량 분석은 질량 분석장치, ZQ2000(Waters 제조), SQD(Waters 제조), 2020(Shimazu 제조)을 사용해서 측정하였다.
참고 실시예 1
1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(화합물 1)
(반응 1-1)
Figure pct00020
4-브로모-3,5-디메틸아닐린(3.47 g, 17.4 mmol)과 디이소프로필에틸아민(5.3 ㎖, 30.4 mmol)의 DMI(13 ㎖) 용액에 2-브로모이소부티르산(3.86 g, 23.1 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 1시간 가열 교반하였다. 추가로 2-브로모이소부티르산(496 ㎎, 2.97 mmol)과 디이소프로필에틸아민(0.8 ㎖, 4.59 mmol)을 첨가한 후 혼합물을 100℃에서 1시간 가열 교반하였다.
반응 혼합물에 MeOH(52 ㎖)와 5N 수산화나트륨 수용액(52 ㎖, 260 mmol)을 실온에서 첨가한 후 이 혼합물을 75℃에서 1.5시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 물을 첨가하고, 1 N 황산수소칼륨 수용액으로 pH 5로 하여 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 물로 세정 후 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 농축하여 2-((4-브로모-3,5-디메틸페닐)아미노)-2-메틸프로판산을 조생성물(crude product)로서 얻었다(5.79 g).
MS(ESI) m/z = 286, 288(M+H)+
(반응 1-2)
Figure pct00021
2-((4-브로모-3,5-디메틸페닐)아미노)-2-메틸프로판산(5.79 g, 반응 1-1에서 얻어진 화합물)의 디클로로메탄(62 ㎖)과 초산(62 ㎖) 혼합물에 시안산나트륨(5.03 g, 59.8 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 혼합물을 포화탄산수소나트륨 수용액(400 ㎖)에 첨가한 후, 추가로 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 7-8로 하여 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압하 농축하였다. 얻어진 고체를 초산에틸-헥산, 디클로로메탄-헥산으로 순차 세정하여 1-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 얻었다(3.80 g, 66%).
MS(ESI) m/z = 311, 313(M+H)+
(반응 1-3)
Figure pct00022
8-(비닐설포닐)-1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데칸(431 ㎎, 1.85 mmol), 1-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(575 ㎎, 1.85 mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(508 ㎎, 0.55 mmol), 트리-tert-부틸포스핀테트라플루오로붕산(165 ㎎, 0.55 mmol)과 메틸디시클로헥실아민(2.1 ㎖, 9.25 mmol)의 N-메틸-2-피롤리돈(18.5 ㎖) 혼합물을 질소 기류하 110℃에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 물로 퀀칭하고, 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 아미노실리카겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄-메탄올)로 정제하여 (E)-1-(4-(2-(1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데칸-8-일설포닐)비닐)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 얻었다(584 ㎎, 68%).
MS(ESI) m/z = 464(M+H)+
(반응 1-4)
Figure pct00023
(E)-1-(4-(2-(1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데칸-8-일설포닐)비닐)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(1.2 g, 2.58 mmol)의 테트라히드로푸란(26 ㎖) 용액에 2N 염산 수용액(26 ㎖, 52 mmol)을 10분간 적하하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 2N 수산화나트륨 수용액으로 pH 7로 하고, 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화식염수로 세정 후 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄-초산에틸)로 정제하여 (E)-1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소피페리딘-1-일)설포닐)비닐)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 얻었다(998 ㎎, 92%).
MS(ESI) m/z = 420(M+H)+
(반응 1-5)
Figure pct00024
(E)-1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소피페리딘-1-일)설포닐)비닐)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(994 ㎎, 2.37 mmol)의 메탄올(24 ㎖) 용액에 시안화칼륨(188 ㎎, 2.84 mmol)과 초산암모늄(237 ㎎, 3.08 mmol)을 실온에서 순차 첨가하였다. 혼합물을 60~70℃에서 3시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 감압하 농축하고, 초산에틸로 희석하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄-초산에틸)로 정제하여 (E)-4-아미노-1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸스티릴)설포닐)피페리딘-4-카르보니트릴을 얻었다(681 ㎎, 68%).
Figure pct00025
(반응 1-6)
Figure pct00026
(E)-4-아미노-1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸스티릴)설포닐)피페리딘-4-카르보니트릴(675 ㎎, 1.50 mmol)의 메탄올(7.5 ㎖)과 디메틸설폭시드(0.195 ㎖) 용액에 실온에서 2N 수산화나트륨 수용액(1.6 ㎖, 1.6 mmol)과 30% 과산화수소수(0.2 ㎖, 1.95 mmol)를 순차 천천히 적하하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물에 초산에틸, 헥산, 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하였다. 석출된 고체를 여과하여 모으고, 세정, 건조시켜 (E)-4-아미노-1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸스티릴)설포닐)피페리딘-4-카르복사미드를 얻었다(498 ㎎, 72%).
MS(ESI) m/z = 464(M+H)+
(반응 1-7)
Figure pct00027
(E)-4-아미노-1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸스티릴)설포닐)피페리딘-4-카르복사미드(1.3 g, 2.8 mmol)와 수산화팔라듐/탄소(Pd 20%)(약 50% 물로 적신 것)(1.3 g)의 메탄올(21 ㎖)-디메틸포름아미드(7 ㎖) 혼합물을 수소 분위기하 실온에서 4시간 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 세정한 후 여액을 감압하 농축하여 4-아미노-1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸페네틸)설포닐)피페리딘-4-카르복사미드를 얻었다(998 ㎎, 77%).
MS(ESI) m/z = 466(M+H)+
(반응 1-8)
Figure pct00028
4-아미노-1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸페네틸)설포닐)피페리딘-4-카르복사미드(120 ㎎, 0.258 mmol), 4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)안식향산(69 ㎎, 0.309 mmol)과 디이소프로필에틸아민(0.09 ㎖, 0.516 mmol)의 디메틸포름아미드(2.5 ㎖) 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HATU)(118 ㎎, 0.309 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 퀀칭한 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화식염수로 세정 후 무수 황산나트륨으로 세정하고 감압하 농축하여 1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸페네틸)설포닐)-4-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드)피페리딘-4-카르복사미드를 얻었다(150 ㎎, 67%).
MS(ESI) m/z = 672(M+H)+
(반응 1-9)
Figure pct00029
1-((4-(5,5-디메틸-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2,6-디메틸페네틸)설포닐)-4-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)벤즈아미드)피페리딘-4-카르복사미드(150 ㎎, 0.223 mmol)의 tert-부탄올(2.5 ㎖)과 에탄올(2.5 ㎖)의 혼합액에 칼륨 tert-부톡시드(75 ㎎, 0.670 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 질소 기류하 50℃에서 1.5시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 물로 희석, 포화 염화암모늄 수용액으로 퀀칭하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄-메탄올)로 정제하여 1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 얻었다(118 ㎎, 81%).
Figure pct00030
적절한 카르복실산 출발 원료, 시약, 용매를 사용하여 참고 실시예 1의 반응 1-8, 반응 1-9와 동일한 조작에 의해 아래에 나타내는 실시예 화합물을 합성하였다.
(화합물 2-5)
Figure pct00031
참고 실시예 2
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(화합물 6)
(반응 2-1)
Figure pct00032
WO 2010/126030(A1)의 스킴 2, 스킴 3 및 스킴 12에 기재된 방법에 따라 합성한 2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-8-(비닐설포닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-4-온(150 ㎎, 0.387 mmol), 1-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(169 ㎎, 0.542 mmol), 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(45 ㎎, 0.077 mmol), 트리-tert-부틸포스핀테트라플루오로붕산(22 ㎎, 0.077 mmol)과 메틸디시클로헥실아민(0.123 ㎖, 0.581 mmol)의 N-메틸-2-피롤리돈(0.97 ㎖) 혼합물을 질소 기류하 100℃에서 1시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 물로 퀀칭하고, 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(초산에틸-헥산)로 정제하여 (E)-1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)비닐)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 얻었다(197 ㎎, 82%).
MS(ESI) m/z = 618(M+H)+.
(반응 2-2)
Figure pct00033
(E)-1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)비닐)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(195 ㎎, 0.316 mmol)과 수산화팔라듐/탄소(Pd 20%)(약 50% 물로 적신 것)(195 ㎎, 0.139 mmol)의 2,2,2-트리플루오로에탄올(6 ㎖) 혼합물을 수소 분위기하 실온에서 14시간 교반하였다. 혼합물을 여과한 후 여액을 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(초산에틸-헥산)로 정제하여 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 얻었다(121 ㎎, 62%).
Figure pct00034
참고 실시예 3
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(화합물 7)
(반응 3)
Figure pct00035
적절한 출발 원료, 용매를 사용하여 참고 실시예 2와 동일한 조작에 의해 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온(화합물 7)을 합성하였다.
Figure pct00036
참고 실시예 4
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온(화합물 8)
(반응 4-1)
Figure pct00037
시클로펜타논(42 ㎎, 0.500 mmol)과 4-브로모-3,5-디메틸아닐린(100 ㎎, 0.500 mmol)의 초산(0.5 ㎖) 혼합물에 시안화트리메틸실릴(0.063 ㎖, 0.500 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 질소 기류하 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응 혼합물을 28% 암모니아수(1 ㎖)에 넣어 퀀칭한 후 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하 농축하여 1-((4-브로모-3,5-디메틸페닐)아미노)시클로펜탄카르보니트릴을 조생성물로서 얻었다(152 ㎎).
Figure pct00038
(반응 4-2)
Figure pct00039
1-((4-브로모-3,5-디메틸페닐)아미노)시클로펜탄카르보니트릴(145 ㎎, 0.495 mmol)의 디클로로메탄(5 ㎖) 용액에 2,2,2-트리클로로아세틸이소시아네이트(0.070 ㎖, 0.593 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 질소 기류하 실온에서 1시간 교반하였다.
반응 혼합액에 트리에틸아민(0.103 ㎖, 0.742 mmol), 물(0.045 ㎖) 및 메탄올(0.10 ㎖)을 순차 첨가한 후 혼합물을 질소 기류하 1.5시간 가열 환류하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 물로 희석시키고, 1 N 염산 수용액으로 pH 5로 한 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하 농축하여 1-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-4-이미노-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2-온을 조생성물로서 얻었다.
MS(ESI) m/z = 336, 338(M+H)+.
(반응 4-3)
Figure pct00040
1-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-4-이미노-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2-온(전 반응에서 얻은 조생성물)의 초산(1.0 ㎖)과 물(0.25 ㎖)의 혼합물을 질소 기류하 65℃에서 1.5시간 가열 교반하였다. 추가로 초산(1.0 ㎖)과 물(0.25 ㎖)을 첨가한 후 혼합물을 질소 기류하 65℃에서 17시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각 후 물로 희석시키고, 포화탄산수소나트륨 수용액으로 pH 8로 하여, 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(초산에틸-헥산)로 정제하여 1-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온을 얻었다(121 ㎎).
MS(ESI) m/z = 337, 339(M+H)+.
(반응 4-4)
Figure pct00041
적절한 출발 원료, 용매를 사용하여 참고 실시예 2와 동일한 조작에 의해 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온(화합물 8)을 얻었다.
Figure pct00042
참고 실시예 5
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-8-메틸-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온(화합물 9)
(반응 5-1)
Figure pct00043
출발 원료로서 4-옥소피페리딘-1-카르복실산 tert-부틸을 사용하고, 또한 적절한 용매를 사용하여 참고 실시예 4와 동일한 조작에 의해 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2,4-디옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-8-카르복실산 tert-부틸을 얻었다.
MS(ESI) m/z = 777(M+H)+.
(반응 5-2)
Figure pct00044
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2,4-디옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-8-카르복실산 tert-부틸(11.7 ㎎, 0.015 mmol)의 디클로로메탄(0.13 ㎖) 혼합액에 트리플루오로초산(0.05 ㎖, 0.673 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 질소 기류하 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하 농축하여 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온 2 트리플루오로 초산염을 얻었다(13.6 ㎎).
MS(ESI) m/z = 677(M+H)+.
(반응 5-3)
Figure pct00045
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온 2 트리플루오로 초산염(21.1 ㎎, 0.022 mmol)의 포름산(0.033 ㎖) 혼합물에 37% 포름알데히드 수용액(0.055 ㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 기류하 80℃에서 3시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 농축 후 잔사를 초산에틸로 희석하였다. 유기층을 묽은 수산화나트륨 수용액으로 세정 후 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄-메탄올)로 정제하여 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-8-메틸-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온을 얻었다(4.5 ㎎, 30%).
Figure pct00046
참고 실시예 6
5-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2-옥사-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-6,8-디온(화합물 10)
(반응 6)
Figure pct00047
출발 원료로서 옥세탄-3-온을 사용하고, 또한 적절한 용매를 사용하여 참고 실시예 4와 동일한 조작에 의해 5-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2-옥사-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-6,8-디온을 얻었다.
Figure pct00048
참고 실시예 7
4-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-4,6-디아자스피로[2.4]헵탄-5,7-디온(화합물 11)
(반응 7-1)
Figure pct00049
2-브로모-5-요오도-1,3-디메틸벤젠(300 ㎎, 0.965 mmol), 1-아미노시클로프로판카르복실산(195 ㎎, 1.93 mmol), 요오드화구리(I)(37 ㎎, 0.194 mmol)와 디아자비시클로운데센(0.50 ㎖, 3.35 mmol)의 디메틸아세트아미드(2.6 ㎖) 혼합물을 질소 기류하 120℃에서 3시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Wakosil C18, 아세토니트릴-물(0.1% 포름산))로 정제하여 1-((4-브로모-3,5-디메틸페닐)아미노)시클로프로판카르복실산을 얻었다(219 ㎎, 80%).
MS(ESI) m/z = 284, 286(M+H)+.
(반응 7-2)
Figure pct00050
1-((4-브로모-3,5-디메틸페닐)아미노)시클로프로판카르복실산(198 ㎎, 0.697 mmol)의 초산(3 ㎖)과 디클로로메탄(1.5 ㎖) 혼합물에 시안산칼륨(424 ㎎, 5.23 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 교반한 후 60℃에서 2시간 가열 교반하였다. 반응 혼합물을 포화탄산수소나트륨 수용액으로 pH 8로 한 후 초산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화식염수로 순차 세정 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하 농축하였다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(초산에틸-헥산)로 정제하여 4-(4-브로모-3,5-디메틸페닐)-4,6-디아자스피로[2.4]헵탄-5,7-디온을 얻었다(49 ㎎, 23%).
MS(ESI) m/z = 309, 311(M+H)+.
(반응 7-3)
Figure pct00051
적절한 출발 원료, 용매를 사용하여 참고 실시예 2와 동일한 조작에 의해 4-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-4,6-디아자스피로[2.4]헵탄-5,7-디온(화합물 11)을 얻었다.
Figure pct00052
참고 실시예 8
1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온(화합물 12)
(반응 8)
Figure pct00053
적절한 출발 원료, 용매를 사용하여 참고 실시예 2와 동일한 조작에 의해 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온을 얻었다.
Figure pct00054
참고 시험예
본 발명의 화합물에 대해서 인간 PTH1R을 매개로 하는 cAMP 생산능, 랫트 수용체를 매개로 하는 cAMP 생산능, 인체 간 마이크로솜을 사용한 대사 안정성, 랫트 간세포를 사용한 대사 안정성, TPTX 랫트 모델에서의 혈청 Ca 농도 상승작용에 대한 각 시험 결과를 참고 시험예 1~5에 나타낸다. 또한 비교 화합물로서 표 3에 나타내는 WO 2010/126030A1에 기재된 화합물을 사용하였다.
Figure pct00055
참고 시험예 1: 인간 PTH1R에 있어서의 화합물의 인비트로(in vitro) cAMP 시그널 활성의 측정
(펩티드)
인간 PTH(1-34) 및 칼시토닌은 펩티드 연구소(일본, 오사카)로부터 구입해서 10 mM 초산에 용해시켜 1 mM로 하여 -80℃ 냉동고에서 보존하였다.
(세포 배양)
세포는 10% 소태아 혈청(Hyclone), 100 단위/㎖ 페니실린 G 및 100 ㎍/㎖ 황산스트렙토마이신(Invitrogen Corp)을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지(DMEM) 중에서 5% CO2 함유 가습 분위기하 37℃에서 배양하였다.
PTH1R을 발현하고 있지 않은 LLC-PK1 세포, 및 LLC-PK1의 1세포당 9.5×105개의 인간 PTH1R을 과잉 발현하는 HKRK-B7을 cAMP 시그널 전달 분석에 사용하였다(Takasu et al., J. Bone. Miner. Res. 14:11-20, 1999).
(cAMP 자극)
HKRK-B7 또는 LLC-PK1 세포를 1×105 세포/웰로 96웰 플레이트에 파종하여 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 다음으로 인간 PTH(1-34) 또는 화합물을 포함하는 50 ㎕의 cAMP 어세이 완충액(DMEM, 2 mM IBMX, 0.2 ㎎/㎖ 소혈청 알부민, 35 mM Hepes-NaOH, pH 7.4)을 첨가하여 37℃의 인큐베이터 중에 두고 20분간 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후, 세포를 100 ㎕의 cAMP 어세이 완충액으로 1회 세정하였다. 세포를 동결시키기 위해 플레이트를 드라이아이스 분말 상에 두고, 그 후 드라이아이스로부터 취출하였다. 40 ㎕의 50 mM HCl을 사용하여 세포를 융해시키고, 드라이아이스 상에서 재차 동결시켰다. 시판의 cAMP EIA 키트(Biotrack cAMP EIA system, GE health care)를 사용하여 세포내 cAMP의 생산량을 측정하였다.
(인비트로 cAMP 유도능 측정에서의 20% 유효 농도(EC20) 및 50% 유효 농도(EC50)의 산출.)
가변 구배에 의한 S자형 용량 반응식을 사용하여 해석하고, 100 nM에서의 인간 PTH(1-34)의 cAMP 시그널 활성을 100%로 하여, 각 화합물이 20% 또는 50%의 cAMP 시그널 활성을 나타내는 농도를 EC20 또는 EC50으로서 산출하였다.
HKRK-B7 세포에 있어서의 결과를 표 4에 나타낸다.
또한 LLC-PK1 세포에 있어서의 cAMP 응답의 정도는 HKRK-B7 세포에서의 정도에 비해 낮은 것이었다.
Figure pct00056
참고 시험예 2: 랫트 PTH1R에 있어서의 화합물의 인비트로 cAMP 시그널 활성의 측정
HKRK-B7 세포 대신에 추가이 세이야쿠에서 수립한 랫트 PTH1R을 과잉 발현하는 LLC-PK46_RATO_PTH1R 세포를 사용하여 참고 시험예 1과 동일하게 측정을 행하였다.
LLC-PK46_RATO_PTH1R 세포를 사용한 결과를 표 5에 나타낸다.
랫트 PTH1 수용체에 있어서의 인비트로 cAMP 시그널 활성의 EC20값은 인간 PTH1R에 있어서의 인비트로 cAMP 시그널 활성의 EC20값과 양호한 상관 관계에 있었다. EC50값에 대해서도 랫트와 인간 사이에서 양호한 상관 관계에 있었다.
Figure pct00057
참고 시험예 3: 인체 간 마이크로솜을 사용한 대사 안정성 시험
0.1 M 인산 완충액(pH 7.4) 중 인체 간 마이크로솜과 화합물 또는 비교예를 NADPH 공존하 37℃에서 소정 시간 인큐베이션하였다. 각 반응 시간에 있어서의 친화합물 농도를 LC/MS/MS를 사용하여 측정하고, 반응 시간에 대한 잔존률의 기울기로부터 고유 클리어런스(μL/min/㎎ protein)를 산출하였다.
＜어세이 조건＞
화합물 농도: 1 μM
마이크로솜: 0.5 ㎎/mL
NADPH: 1 mM
반응 시간: 0, 5, 15 및 30분
결과를 표 6에 나타낸다. 화합물 1~11은 비교예 1~6에 비해 인체 간 마이크로솜에 대해 높은 대사 안정성을 나타내었다.
Figure pct00058
참고 시험예 4: 랫트 간세포를 사용한 대사 안정성 시험
랫트(SD, ♀)의 간장으로부터 콜라게나아제 환류법에 의해 간세포를 조제하였다. 참고 실시예 화합물 또는 비교예를 첨가하여 37℃에서 소정 시간 인큐베이션한 후 반응 정지액을 첨가하였다. 각 반응 시간에 있어서의 친화합물 농도를 LC/MS/MS를 사용하여 측정하고, 반응 시간에 대한 잔존률의 기울기로부터 고유 클리어런스(μL/106 cells/min)를 산출하였다.
＜어세이 조건＞
세포 농도: 1×106 cells/mL
화합물 농도: 1 μM
배지: 윌리엄 배지 E(Williams' medium E)
반응 시간: 0, 15, 30, 60, 120 및 240분
반응 정지액: 아세토니트릴/2-프로판올(4/6, v/v)
결과를 표 7에 나타낸다. 화합물 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11의 화합물은 비교예 1, 2, 3, 5, 6에 비해 랫트 간세포 대사 안정성이 향상되었다.
Figure pct00059
참고 시험예 5: TPTX 랫트 모델에서의 혈청 Ca 농도 상승작용
4주령의 암컷 Crl:CD(SD) 랫트를 일본 찰스·리버 주식회사(아츠기 사육센터)로부터 입수하여 20~26℃, 습도 35~75%의 표준 실험실 조건하에서 1주간 순화시켰다. 랫트에게는 수돗물 및 1.1% 칼슘, 1.0% 인산 및 250 IU/100 g의 비타민 D3를 포함하는 표준 설치동물 사료(CE-2)(클레어 재팬 주식회사)를 자유롭게 섭취시켰다.
5주령의 랫트에 TPTX를 실시하였다. 일부의 개체에는 겉보기수술(Sham)을 실시하였다. 사용하기 위한 TPTX 랫트는 수술 4일 후의 혈청 Ca 농도가 8 ㎎/dL 미만인 개체를 선택하였다. 수술 5일 후에, 수술 4일 후에 측정한 혈청 Ca 농도와 체중을 토대로 각 군 5마리씩 8개의 TPTX군과 하나의 Sham군으로 나누었다. Sham군 및 TPTX-비히클군에는 용매만을 10 mL/㎏의 용량으로 경구투여하였다. TPTX-각 검체군에는 각 검체 30 ㎎/10 mL/㎏의 용량으로 용매에 용해시켜 각각 경구투여하였다. 용매의 조성은 10% 디메틸설폭시드(와코 순약 공업 주식회사), 10% 크레모포르 EL(시그마알드리치 재팬 합동 회사), 20% 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(니혼 쇼쿠힝 가코 주식회사), 글리신(와코 순약 공업 주식회사)에 의해 pH 10으로 조정한 것을 사용하였다. 각각의 투여 직전에 Pre채혈을 하고, 투여 2, 6, 10 및 24시간 후에도 채혈을 실시하여 혈청 Ca 농도를 측정하였다. 각 혈액 채취는 이소플루란 흡입 마취하에서 경정맥으로부터 행하였다.
혈청의 Ca의 측정. 채취한 혈액으로부터 원심 분리에 의해 취득한 혈청을 자동 분석장치 TBA-120FR(도시바 메디컬 시스템즈 주식회사)을 사용해서 측정하였다.
동물 시험에 대한 통계 해석. 데이터를 평균값±표준오차(SE)로서 나타낸다. 통계적 유의성은 SAS 전임상 패키지(Ver.5.00.010720, SAS Institute Japan, Tokyo, Japan)를 사용해서 결정하였다. ＜0.05의 p값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 2군의 t검정에 의해 TPTX-비히클군에 대해 ＃P＜0.05, 비교예 1의 군에 대해 ＊P＜0.05, 비교예 2의 군에 대해 ∫P＜0.05로서 나타내었다.
혈청 Ca 농도의 Pre값은 Sham군에서 9.9 ㎎/dL, TPTX 각 군에서 5.3~6.2 ㎎/dL였다. 각 화합물의 투여 후 24시간까지의 혈청 Ca 농도에 대해 Pre값으로부터의 변화량을 평균한 값을 도 9에 나타내었다. 또한 각 화합물을 투여한 후의 혈청 Ca 농도의 피크는 어느 화합물에 대해서도 투여 6시간 후 또는 10시간 후였다.
랫트 간세포 대사 안정성이 높은 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8은 pre값으로부터의 양의 변화량이 크고, 경구투여에 있어서 강한 혈청 Ca 농도 상승작용이 확인되었다. 한편, 랫트 간세포 대사 안정성이 낮은 화합물 1, 비교예 1, 비교예 2의 Pre값으로부터의 양의 변화량은 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8에 비해 작았다. 특히 화합물 7, 화합물 8은 비교예 1, 비교예 2에 대해 통계상 우위였다.
또한 랫트 간세포 대사 안정성이 높은 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8은 투여 후 6시간 또는 10시간 후에 있어서 각 화합물의 최대값으로서 7.8~8.5 ㎎/dL의 값을 나타내, 부갑상선 기능저하증 환자에서의 혈청 Ca 농도의 치료 목표역 7.6~8.8 ㎎/dL를 달성하였다. 한편, 랫트 간세포 대사 안정성이 낮은 화합물 1, 비교예 1, 비교예 2는 모든 측정 시간에 있어서 이 치료 목표역에 도달하지 못하였다.
이상의 시험 결과로부터, 랫트 PTH1R을 강제 발현시킨 세포에 있어서 강한 cAMP 시그널 활성을 나타내고, 또한 랫트 간세포에서의 대사에 대해 높은 안정성을 나타내는 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8은 랫트에 있어서 경구투여하에서 강한 혈청 Ca 농도 상승작용이 확인되었다. 이들 화합물은 인간 PTH1R을 강제 발현시킨 세포에서의 cAMP 시그널 활성을 갖고, 인체 간 마이크로솜 대사 안정성이 비교 화합물에 비해 높아, 경구투여로 부갑상선 기능저하증 환자에 대한 높은 치료 효과가 기대된다. 또한 화합물 6, 화합물 7, 화합물 8과 같은 정도의 인간 PTH1R을 강제 발현시킨 세포에서의 cAMP 시그널 활성과 인체 간 마이크로솜 대사 안정성을 나타내는 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해서도 부갑상선 기능저하증 환자에 대한 높은 치료 효과가 기대된다.
본 발명에 의해 높은 대사 안정성을 갖고 강력한 PTH 유사 작용을 발휘하는 히단토인 유도체를 비침습적으로 전신 폭로 또는 국소 폭로시킴으로써 뼈·연골 동화작용을 유도시켜 골다공증, 치주병에 있어서의 골량 감소, 발치 후의 치조골 결손, 변형성관절증, 관절연골 결손, 무형성골증, 연골무형성증, 연골저형성증, 골연화증, 골절 등에 대한 예방, 치료, 회복 및 치유를 촉진하기 위한 의약이 제공된다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 뼈 및/또는 연골 동화작용(anabolism)을 유도하기 위한 의약 조성물;
    [화학식 1]
    Figure pct00060

    〔화학식 중,
    R1 및 R2는 R1과 R2가 모두 수소원자가 아니라는 조건하에 각각 독립적으로
    1) 수소원자,
    2) 할로겐원자,
    3) 1~5개의 불소원자로 치환되어 있어도 되는 탄소수 1~2개의 알킬기, 또는
    4) 1~5개의 불소원자로 치환되어 있어도 되는 탄소수 1~2개의 알콕시기
    이거나; 또는
    R1 및 R2는 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
    Figure pct00061

    (식 중 각 ＊는 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이고;
    또한 R3 및 R4는 각각 독립적으로 1~3개의 불소원자로 치환되어 있어도 되는 메틸기이거나; 또는
    R3 및 R4는 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 탄소수 3~6의 고리(여기서 고리를 형성하는 탄소원자 중 하나는 산소원자; 황원자; 또는 메틸기로 치환되어 있어도 되는 질소원자로 치환되어 있어도 된다.)를 형성한다.〕.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R1 및 R2가 아래의 조합에서 선택되고:
    1) R1이 수소원자 또는 할로겐원자이며, 또한 R2가 수소원자, 트리플루오로메틸기 또는 트리플루오로메톡시기이다(단, R1과 R2가 모두 수소원자가 되는 경우를 제외한다);
    2) R1이 트리플루오로메틸기 또는 트리플루오로메톡시기이고, 또한 R2가 수소원자 또는 할로겐원자이다;
    3) R1 및 R2가 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
    Figure pct00062

    (식 중 각 ＊는 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이다;
    또한 R3 및 R4가 메틸기이거나; 또는
    R3 및 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
    Figure pct00063

    (식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성하는 의약 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R1, R2가 아래의 조합에서 선택되고:
    1) R1이 트리플루오로메톡시기이며, 또한 R2가 불소원자이다;
    2) R1이 브롬원자이고, 또한 R2가 수소원자이다;
    3) R1이 트리플루오로메틸기이고, 또한 R2가 불소원자이다;
    4) R1이 불소원자이고, 또한 R2가 트리플루오로메톡시기이다;
    5) R1이 트리플루오로메틸기이고, 또한 R2가 수소원자이다;
    6) R1이 수소원자이고, 또한 R2가 트리플루오로메톡시기이다;
    7) R1, R2는 서로 결합하여 형성되는 하기 식:
    Figure pct00064

    (식 중 각 ＊는 페닐 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)으로 표시되는 기이다;
    또한 R3 및 R4가 메틸기이거나; 또는
    R3 및 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
    Figure pct00065

    (식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성하는 의약 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R3 및 R4가 메틸기인 의약 조성물.
  5. 제1항에 있어서,　
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 R3 및 R4가 그들이 결합하는 탄소원자와 함께 아래에서 선택되는 고리:
    Figure pct00066

    (식 중 ＊는 이미다졸리딘-2,4-디온 부분과의 결합 위치를 나타낸다.)를 형성하는 의약 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    아래의 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물:
    1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
    1-(4-(2-((2-(3-브로모페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온:
    1-(4-(2-((2-(4-플루오로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
    1-(4-(2-((2-(3-플루오로-4-(트리플루오로메톡시)페닐)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
    1-(4-(2-((2-(2,2-디플루오로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-4-옥소-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)-3,5-디메틸페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
    1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온;
    1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온);
    1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온;
    1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-8-메틸-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데칸-2,4-디온;
    5-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-2-옥사-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-6,8-디온; 및
    4-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-4,6-디아자스피로[2.4]헵탄-5,7-디온.
  7. 제1항에 있어서,
    화합물이 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(3-(트리플루오로메틸)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염인 의약 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    화합물이 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-5,5-디메틸이미다졸리딘-2,4-디온 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염인 의약 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    화합물이 1-(3,5-디메틸-4-(2-((4-옥소-2-(4-(트리플루오로메톡시)페닐)-1,3,8-트리아자스피로[4.5]데카-1-엔-8-일)설포닐)에틸)페닐)-1,3-디아자스피로[4.4]노난-2,4-디온 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염인 의약 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    의약 조성물이 골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료, 또는 골절의 회복 촉진용인 의약 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 의약적으로 유효한 양을 골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료, 또는 골절의 회복 촉진을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 뼈 및/또는 연골 동화작용의 유도방법.
  12. 제11항에 있어서,
    뼈 및/또는 연골 동화작용의 유도방법이 골다공증의 예방 또는 치료방법, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선방법, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진방법, 변형성관절증의 예방 또는 치료방법, 관절연골 결손의 회복 촉진방법, 무형성골증의 예방 또는 치료방법, 연골무형성증의 예방 또는 치료방법, 연골저형성증의 예방 또는 치료방법, 골연화증의 예방 또는 치료방법, 또는 골절의 회복 촉진방법인 방법.
  13. 골다공증의 예방 또는 치료, 치주병에 있어서의 골량 감소의 개선, 발치 후의 치조골 결손의 회복 촉진, 변형성관절증의 예방 또는 치료, 관절연골 결손의 회복 촉진, 무형성골증의 예방 또는 치료, 연골무형성증의 예방 또는 치료, 연골저형성증의 예방 또는 치료, 골연화증의 예방 또는 치료, 또는 골절의 회복 촉진을 위한 의약 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 사용.
  14. 뼈 및/또는 연골 동화작용을 유도하기 위한 의약 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 사용.
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