KR20170003591A - 인간 및 사이노몰구스 cd3 엡실론에 결합하는 항체 - Google Patents

Abstract

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위해, 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)를 포함하는 방법을 사용하는 것이다.

Description

인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론에 결합하는 항체{ANTIBODIES BINDING TO HUMAN AND CYNOMOLGUS CD3 EPSILON}

본 발명은 교차-반응성 항체의 분야에 속한다. 본원에 인간 사이노몰구스(cynomolgus) 교차-반응성 항체를 생성하기 위한 방법 및 이의 용도가 보고된다.

T 세포는 적응성 면역 반응의 핵심 효과자로서, 병원체 및 자가면역 질환의 제거에 다수의 중요한 역할을 한다. T 세포의 수 개의 하위집합이 존재하고, 각각 구별되는 기능을 갖는다.

T 세포의 표면 상에서 발견되는 TCR(T-세포 수용체)은 알파 및 베타 폴리펩티드 쇄(대략 TCR 집단의 95%를 구성함), 또는 감마 및 델타 폴리펩티드 쇄로 이루어진 이종이량체이다[피처(Pitcher) 및 반 오에르스(van Oers), 2003; 말리센(Malissen), 2008]. 각각의 폴리펩티드는 불변성(C) 및 가변성(V) 영역을 함유한다. 불변성 영역은 세포 막에 고정되지만, 가변성 영역은 세포밖으로 연장되고 항원에 결합하는 원인이 된다. TCR의 짧은 세포질 꼬리는 신호전달 능력이 부족하다. 세포내 신호전달은 CD3 단백질 착체에 의해 개시되고, 이러한 착체는 세포내 면역수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine activation motif)를 포함한다.

CD3(분화 클러스터 3) T-세포 공동-수용체는 단백질 착체이고 4개의 별개의 쇄로 이루어진다. 포유동물에서, 착체는 CD3γ(감마) 쇄, CD3δ(델타) 쇄, 및 2개의 CD3ε(엡실론) 쇄를 함유한다. 이들 쇄는 TCR 및 ζ-쇄(제타-쇄)와 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR, ζ-쇄, 및 CD3 분자는 함께 TCR 착체를 구성한다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄는 세포외 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 상위계열의 고도로 연관된 세포-표면 단백질이다.

TCR은 자유 에피토프/항원에 결합할 수 없고, 그 대신 TCR은 인간에서 인간 백혈구 항원(HLA) 시스템과 동일한 주요 조직적합성 착체(MHC: major histocompatibility complex)와 회합되는 더 큰 폴리펩티드의 효소적으로 분할된 단편에 결합한다[루드(Rudd) 1990; 가오(Gao) 등, 2002]. 이러한 상호작용은 면역학적 시냅스(synapse)로서 공지된 공간에서 발생된다. MHC 부류 I 분자는 신체의 모든 유핵 세포 상에서 발현되어 항원을 세포독성 T 세포에 제공하고, 이들 세포 상의 CD8은 MHC/TCR 상호작용을 안정화시킨다. 세포독성 T 세포의 활성화는 후속적으로 (바이러스에 의해) 감염된 세포의 파괴를 일으킨다.

MHC 부류 II는 대식세포, B 세포 및 수지상(dendritic) 세포 상에서 발견된다. 이들 면역 세포는 항원을 헬퍼(helper) T 세포에 제공하고, CD4는 MHC/TCR 상호작용을 안정화시킨다. MHC 부류 II 및 TCR 사이의 상호작용은 궁극적으로 항체 중재된 면역 반응을 일으킨다. 다른 공동-자극 분자, 예컨대 CD45, CD28 및 CD2는 면역 시냅스에서 T 세포 활성화를 돕고, 세포내 신호전달의 원인이 되는 거대분자 단백질 착체인 TCR 시그날로솜(signalosome)의 형성을 개시한다.

인간 CD3 엡실론에 결합하는 몇몇 항체는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 항체 OKT3[예를 들어 쿵(Kung, P.) 등의 문헌 "Science 206 (1979) 347-349"; 살메론(Salmeron, A.) 등의 문헌 "J Immunol 147 (1991) 3047-3052)" 참조], 항체 UCHT1[예를 들어 칼라드(Callard, R.E.) 등의 문헌 "Clin Exp Immunol 43 (1981) 497-505" 참조] 또는 항체 SP34[예를 들어 페사노(Pessano, S.) 등의 문헌"EMBO J 4 (1985) 337-344" 참조]이다. 이들로부터, 외견상으로 단지 항체 SP34만이 인간 사이노몰구스 교차-반응성으로 보인다[콘라드(Conrad M.L.) 등의 문헌 "Cytometry A 71 (2007) 925-933" 참조].

국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호는 교차-종-특이성 항체를 포함하는 조성물 및 이의 용도를 보고한다. 수영 양(Soo Young Yang) 등의 문헌[LN USA 137 (1986) 1097-1100]에서, CD3-Ti 착체 및 CD2 양 적혈구 수용체 결정인자 둘다가 관여된 T 림프구 활성화를 위한 공통의 경로가 보고되어 있다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 2012/158818호는 다중-특이적 Fab 융합 단백질 및 사용 방법을 보고한다. DD 제272473호에, 인간 T 림프구의 CD3 항원의 엡실론 쇄에 대항하는 단일클론성 항체의 생산 방법이 보고되어 있다.

본 발명은 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위한 방법 및 이의 용도를 제공한다.

인간 이외의 실험-동물을 오로지 사이노몰구스 항원으로만 면역화시킴으로써, 즉 실험-동물을 그 전 후로 인간 동족체로 면역화시키지 않고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 수득될 수 있음을 발견하였다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산/생성/수득하는데 있어서의, 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 인간 이외의 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법의 용도이다.

하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나는 인간 항원의 주요 면역원성 자리/에피토프이다. 하나의 실시태양에서, (고유의 사이노몰구스) 항원은 CD3 엡실론이고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 2의 (고유의) 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 하나의 실시태양에서, 인간 이외의 실험-동물은 1회 이상 1차 사이노몰구스 PBL로 면역화되고, 여기서 PBL은 (임의적으로) T 세포에 대해 강화된다. 하나의 실시태양에서, 면역화가 제1 단계로서의 피내 적용(주사), 제2 단계로서의 근육내 적용(주사) 및 제3 단계로서의 피하 적용(주사)을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 이러한 방법은 변성제를 사용하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론, 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시킨다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산/생성/수득하는데 있어서의, 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 (임의적으로) T 세포에 대해 강화되된 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 인간 이외의 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법의 용도이고, 여기서 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3[예를 들어 쿵(Kung, P.) 등의 문헌 "Science 206 (1979) 347-349"; 살메론(Salmeron, A.) 등의 문헌 "J Immunol 147 (1991) 3047-3052" 참조], 항체 UCHT1[예를 들어 칼라드(Callard, R.E.) 등의 문헌 "Clin Exp Immunol 43 (1981) 497-505" 참조] 또는 항체 SP34[예를 들어 페사노(Pessano, S.) 등의 문헌 "EMBO J 4 (1985) 337-344" 참조]와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않고, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하며(/하거나) 인간 T 세포를 활성화시킨다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 인간 이외의 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위한 방법이다.

하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나는 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프이다. 하나의 실시태양에서, 인간 이외의 실험-동물은 1회 이상 1차 사이노몰구스 PBL로 면역화되고, 여기서 PBL은 (임의적으로) T 세포에 대해 강화된다. 하나의 실시태양에서, 면역화는 제1 단계로서의 피내 적용, 제2 단계로서의 근육내 적용 및 제3 단계로서의 피하 적용을 포함한다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 인간 이외의 실험-동물을 3회 1차 사이노몰구스 PBL로 면역화시키는 단계를 포함하는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하는 방법이고, 여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 (임의적으로) T 세포에 대해 강화시키고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않고, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고(/하거나) 인간 T 세포를 활성화시킨다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않고/않거나 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이다

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 인간 이외의 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시킴(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 (임의적으로) T 세포에 대해 강화시킴)으로써 수득가능하거나/수득되는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이고, 여기서 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않고, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고(/하거나) 인간 T 세포를 활성화시킨다.

발명의 상세한 설명

T 세포는 적응성 면역 반응의 핵심 효과자로서, 병원체 및 자가면역 질환의 제거에 다수의 중요한 역할을 한다. T 세포의 수 개의 하위집합이 존재하고, 각각 구별되는 기능을 갖는다.

T 헬퍼 세포는 B 세포의 혈장 세포 및 기억(memory) B 세포로의 돌연변이, 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯하여, 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는다. 이들 세포는 또한 CD4+ T 세포로서도 공지되는데, 이들이 이들 표면 상에 CD4 당단백질을 발현하기 때문이다. T 헬퍼 세포는, 이들에 펩티드 항원이 제공될 경우, APC의 표면 상에서 발현되는 MHC 부류 II 분자에 의해 활성화된다. 일단 활성화되면, 이들은 신속히 분할되고, 활성 면역 반응을 규제하거나 돕는 사이토킨으로 지칭되는 작은 단백질을 분비한다.

세포독성 T 세포는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. 이들 세포는 CD8+ T 세포로서도 공지되는데, 이들이 이들 표면 상에 CD8 당단백질을 발현하기 때문이다. 이들 세포는, 모든 유핵 세포의 표면 상에 제공되는 MHC 부류 I과 연관된 항원에 결합함으로써 이들 표적을 인식한다.

기억 T 세포는 감염이 해결 된 후 장기간 지속되는 항원-특이적 T 세포의 하위집합니다. 이들은 이들의 동족 항원에 재노출될 경우 많은 수의 효과자 T 세포로 신속히 팽창되고, 이에 따라 지나간 감염에 대한 "기억"을 갖는 면역 시스템에 제공한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다.

이전에 억제자 T 세포로서 공지된 조절 T 세포는 면역학적 내인성의 유지를 위해 중요하다. 이들의 주요 역할은 T 세포-중재된 면역을 면역 반응의 종결로 정지시키고, 흉선에서 음성적 선택의 과정을 벗어나는 자가반응성 T 세포를 억제하는 것이다.

자연 살해 T 세포는 적응성 면역 시스템과 선천적 면역 시스템의 가교역할을 한다. 주요 조직적합성 착체(MHC) 분자에 의해 제공된 펩티드 항원을 인식하는 종래의 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d로 지칭되는 분자에 의해 제공되는 당지질 항원을 인식한다. 일단 활성화되면, 이들 세포는 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포 둘 다에 귀속된 기능(즉, 사이토킨 생산 및 세포융해/세포 살해 분자의 방출)을 수행할 수 있다.

TCR과 펩티드-MHC 착체의 상호작용 이후, TCR 공동-수용체 CD4 및 CD8은 Src 키나아제 LCK의 그의 기질과 아주 가까운 곳으로의 전달[바일레테(Veillette) 등의 문헌 "1988, Cell"]: TCR-회합된 CD3 및 제타-쇄 면역수용체 티로신-기제 활성화 모티프(ITAM)[아르티오모브(Artyomov) 등의 문헌 "2010, Proc. Natl Acad. Sci. USA"]를 표적화하는데 있어서 중요하다. 자극되지 않은 살아있는 T 세포는 혈장 막의 지질 이중층에 묻힌 이들의 CD3ε ITAM의 잔기인 티로신, 및 로이신 또는 이소로이신 특징을 갖는 것으로 보였다. 활성화될 경우, 이들 막간 도메인은 지질 이중층으로부터 방출되고 LCK에 대한 기질로서 이용가능해 진다[수(Xu) 등의 문헌 "2008, Cell"]. 무엇이 CD3 엡실론 세포질 도메인의 해리를 유발시키는지는 분명하지 않지만, TCR 결합에 대한 국부 액체 환경에서의 일시적 변화[수(Xu) 등의 문헌 "2008, Cell"], 또는 펩티드-MHC 착체에 결합하는 TCR에 의한 CD3 엡실론 쇄 상에 부과되는 토크(torque)의 기계적 감지가 가능한 원인으로 추정되고 있다[김(Kim) 등의 문헌 "2012, Front. Immunol."]. 동력학적 격리 모델로부터, TCR 신호전달은 TCR이 LCK에 풍부하고 막간 포스파타아제 CD45가 결핍된 지질 막의 영역으로 분배된 결과로서 유발됨을 알 수 있다.

TCR의 유발, LCK의 다량함유, 및 이의 조절인자의 다량함유 및 위치는 LCK의 표적이 인산화되는 정도를 지시한다[로바트(Lovatt) 등의 문헌 "2006, Mol. Cell. Biol"]. 이들 표적은 TCR-회합된 CD3 감마 쇄, CD3 델타 쇄, CD3 엡실론 쇄 및 제타-쇄의 ITAM중의 티로신 잔기, 및 SYK 계열 키나아제 ZAP70(70 kDa의 제타-쇄 회합된 단백질 키나아제)를 포함한다. 결과로서, 몇몇 주요 신호전달 분지는 활성화될 수 있고[아쿠토(Acuto) 등의 문헌 "2008, Nature Rev. Immunol."]: 세포 접착을 촉진시키는 인테그린(integrin) 친화도의 상향 조절; T 세포 성장 및 분화에 필수적인 유전자의 발현에 중요한 전사 인자의 핵으로의 조정된 동원(mobilization); 및 T 세포 활성화, T 세포의 효과자 T 세포로의 증식, 접착 및 분화에 필수적인 액틴(actin) 재구성을 일으킨다[더 많은 세부사항을 위해 브라운리에(Brownlie) & 자모이스카(Zamoyska)의 문헌 "2013, Nat Rev Immunol." 검토].

다양한 연구로부터, CD3 분자는 알파 베타 TCR의 적절한 세포 표면 발현 및 정상 T 세포 발달을 위해 중요한 것으로 밝혀졌다[베르크하우트(Berkhout) 등의 문헌 "1988, J. Biol. Chem."; 왕(Wang) 등의 문헌 "1998, J. Exp. Med."; 카페스(Kappes)의 문헌 "1995, Curr. Opin. Immunol."]. 시스테인이 풍부한 스톡(stalk)이 CD3 이량체화를 구동시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났지만[Su, loc. cit., Borroto, 1998, J. Biol. Chem.], CD3 엡실론(CD3e) 및 CD3 감마의 세포외 도메인(ECD)에 의한 상호작용은 이들 단백질과 TCR 베타의 조립을 위해 충분하다[마놀리오스(Manolios)의 문헌 "1994, Eur. J. Immunol."; 마놀리오스(Manolios) 및 리(Li)의 문헌 "1995, Immunol. Cell Biol"]. TCR의 화학량론은 필시 하나의 알파 베타 TCR, 하나의 CD3 엡실론 감마 이종이량체, 하나의 CD3 엡실론 델타 이종이량체 및 하나의 CD3 제타 동종이량체를 포함할 것이다. 면역 반응에서 인간 CD3 엡실론 감마 이종이량체의 중심 역할이 제공되어, 치료학적 항체 OKT3에 결합된 이러한 착체의 결정 구조가 설명되었다[크제르-닐슨(Kjer-Nielsen)의 문헌 "2004, PNAS"].

다수의 치료학적 전략은, 특별히 임상적으로 사용되는 항-인간 CD3 단일클론성 항체에 의해, TCR 신호전달을 표적화함으로써 T 세포 면역을 조절한다. 동물 연구에 따르면, 항-CD3 항체는 동종이식에 대해 내인성을 유도하고[니콜스(Nicolls) 등, 1993], CD3 엡실론에 대항하여 유도되는 항-CD3 항체인 OKT3은 거부의 예방 및 치료 목적으로 실질 기관 이식에서 면역억제를 유도하기 위해 인간에서 사용하도록 임상적으로 승인되었다[노르만(Norman), 1995]. 흥미롭게도, 유형 I 당뇨병에 대한 감수성은 CD3 엡실론 유전자자리와 연관되고[웡(Wong) 등, 1991] 항-CD3 항체는 유형 I 당뇨병 및 기타 자가면역 질환의 증후를 완화시키는 것으로 보였다[스프랑거스(Sprangers) 등, 2011]. CD3 특이성 항체[투나클리프(Tunnacliffe)의 문헌 "1989, Int. Immunol."]는 다양한 T 세포 반응, 예컨대 림포카인 생산[본 우소우(Von Wussow)의 문헌 "1981, J. Immunol."; 팔라시오스(Palacious)의 문헌 "1982, J. Immunol."], 증식[반 와우베(Van Wauve)의 문헌 "1980, J. Immunol."] 및 억제자-T 세포 유도[쿠니카(Kunicka)의 문헌 "1986, Lymphocyte Typing II"]를 유도할 수 있다. 실험 조건에 따라서, CD3 특이적 단일클론성 항체는 세포독성을 저해하거나 유도할 수 있다[리웬버그(Leewenberg)의 문헌 "1985, J. Immunol."; 필립스(Phillips)의 문헌 "1986, J. Immunol."; 플랫소우카스(Platsoucas)의 문헌 "1981, Proc. Natl Acad. Sc"; 이토우(Itoh)의 문헌 "1987, Cell. Immunol."; 멘처(Mentzer)의 문헌 "1985, J. Immunol."; 란데그렌(Landegren)의 문헌 "1982, J. Exp. Med."; 초이(Choi)의 문헌 "2001, Eur. J. Immunol."; 수(Xu)의 문헌 "2000, Cell Immunol."; 킴볼(Kimball)의 문헌 "1995, Transpl. Immunol."].

몇몇 연구의 보고에 따르면, 가장 널리 사용되는 CD3 엡실론 단일클론성 항체 OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 및 Leu-4는 CD3-엡실론 쇄로 단일 형질감염된 세포에 결합하지 않았다. 그러나, 이들 항체는 CD3 엡실론 + CD3 감마 또는 CD3 델타의 조합물로 2중으로 형질감염된 세포를 오염시켰다[투나클리프(Tunnacliffe)의 문헌 "1989, Int. Immunol."; 로우(Law)의 문헌 "2002, Int. Immunol."; 살메론(Salmeron)의 문헌 "1991, J. Immunol."; 쿨리에(Coulie)의 문헌 "1991, Eur. J. Immunol."]. 두 번째로 더 작은 그룹에서, 입체배좌 에피토프는 CD3 엡실론 서브유닛 그 자체내에 형성된다. 이러한 그룹의 일원은 예를 들면 mAb APA 1/1이고, 이는 변성된 CD3 엡실론에 대항하여 상승되었다[리수에노(Risueno)의 문헌 "2005, Blood"]. 합쳐서 생각하면, 당분야에 기재된 대부분의 CD3 엡실론 항체는 CD3의 둘 이상의 서브유닛 상에 자리잡은 입체배좌 에피토프를 인식하고, 이에 따라 TCR의 고유의 맥락에서 CD3 엡실론만을 인식한다.

종 특이성은 인간 질환의 치료를 위한 치료제로서의 항체를 개발하는데 있어서 상당한 걸림돌이다. 판매 승인을 얻기 위해, 임의의 신규 후보 약제는 임상전 및 임상 상을 통과해야 한다: 후자가 인간 환자에서 수행되는 반면, 전자는 동물에서 수행된다. 임상전 시험의 목적은 약물 후보가 원하는 활성을 갖고 가장 중요하게는 안전함을 입증하는 것이다. 약물 후보의 동물에서의 안전성 및 가능한 효능이 임상전 시험에서 달성된 때에만, 이러한 약물 후보는 개개의 규제 당국에 의해 인간에서의 임상적 시험을 인가받을 것이다. 바람직하게는 사이노몰구스와 같이 더 하등한 영장류가 면역 시스템을 간섭하는 약물 후보의 안전성 시험을 위해 사용되는데, 이는 침팬지가 멸종위기에 이른 종이고, 이들의 인간-유사 성질에 기인하여, 이러한 동물을 약물 안정성 시험에 사용하는 것은 유럽에서 금지되며 다른 곳에서도 매우 제한되기 때문이다.

많은 CD3 항체는 종-특이적인 것으로 밝혀졌다. CD3 착체에 특이적인 가장 널리 사용되고 가장 잘 특징화된 단일클론성 항체중 하나는 OKT-3이다. 이러한 항체는 침팬지 CD3과 반응하지만, 다른 영장류, 예컨대 마카크(macaque)(예를 들어 사이노몰구스 원숭이)의 CD3 동족체, 또는 개 CD3과는 반응하지 않는다[산두스키(Sandusky) 등의 문헌 "1986, J. Med. Primatol"]. 항-CD3 단일클론성 항체 UCHT-1은 또한 침팬지로부터의 CD3 뿐만 아니라 마카크로부터의 CD3과도 반응한다. 한편, 마카크 항원을 인식하지만, 이들의 인간 대응물을 인식하지 않는 단일클론성 항체의 예들이 존재하고, 예컨대 항체 FN18이다.

상기 언급된 바와 같이, CD3 착체의 서브유닛인 CD3 엡실론(CD3e)을 경유하여 인간 T 세포에 결합하고 이를 활성화시키는 입수가능한 소수의 항체가 존재한다: OKT3[쿵(Kung) 등의 문헌 "1979, Science"; 살메론(Salmeron)의 문헌 "1991, J Immunol."], UCHT1[칼라드(Callard) 등의 문헌 "1981, Clin Exp Immunol."], 그의 유도체 V9[주(Zhu) 및 카터(Carter)의 문헌 "1995, J Immunol."] 및 SP34[페사노(Pessano) 등의 문헌 "1985, EMBO J"]. OKT3, 및 UCHT1(= 유도체 V9)은 사이노몰구스 T 세포에 대해 교차-반응성이 아니다. 사이노몰구스 T 세포에 결합하고 이를 활성화시키는 유일한 항체는 SP34 항체인 것으로 보인다[콘라드(Conrad) 등의 문헌 "2007, Cytometry A"].

적합한 항체의 생성은, 예를 들면 재조합적으로 발현된 CD3e이 인공적 입체배좌를 갖는 동종이량체를 형성하므로, 고유의 입체배좌를 갖는 재조합 단량체 CD3e를 수득하기 어렵다는 사실에 의해 크게 방해받는다[수(Su) 등의 문헌 "2009, Int J Mol Med"]. 또한, CD3e내의 소포체에 대한 보유 신호는 세포내 축적을 초래하여, 세포에서 재조합적으로 발현된다면 CD3e는 세포 표면에 도달하지 않게 된다[브로되르(Brodeur) 등의 문헌 "2009, Int Immunol."]. 더 나쁘게는, 세포내 꼬리에서 고도로 하전된 아미노산은 또한 세포내에서 및 세포 상에서의 적절한 재조합 발현을 방해한다[콜(Call) 및 운쉐르프페니그(Wucherpfennig)의 문헌 "2005, Annu Rev Immunol."].

추가로, 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론 ECD의 72%의 동일한 아미노산이라는 낮은 서열 유사성은 작용적 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생성하는것을 꽤 힘들게 만든다.

본 발명은, 적어도 부분적으로는, 인간 이외의 실험-동물을 오로지 사이노몰구스 항원으로만 면역화시킴으로써, 즉 실험-동물을 그 전 후로 인간 동족체로 면역화시키지 않고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 수득될 수 있다는 발견에 기초한다. 숙련가라면 실험-동물로서의 사이노몰구스 원숭이를 면역화하는 것이 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 수득하기 위해 적합하지 않을 것임, 즉 인간 이외의 실험-동물이 또한 사이노몰구스 이외의 실험-동물임을 이해한다.

따라서, 본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위해 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법이다. 하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 상응하는 인간 항원에 대해 80% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 60%의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 70%의 서열 동일성을 갖는다.

인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체은 인간 항원에서 고도로 면역원성인 아미노산 연장부가 면역화를 위해 방지될 경우 수득될 수 있음이 밝혀졌다. 하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나는 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프이다.

하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 T 세포 항원이다. 하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 CD3 엡실론이다. 하나의 실시태양에서, 고유의 사이노몰구스 항원은 CD3 엡실론이고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 2의 (고유의) 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드(YPRGSKPEDANFYLYLRARV)에 특이적으로 결합한다.

하나의 실시태양에서, 실험-동물은 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL은 임의적으로 T 세포에 대해 강화된다. 하나의 실시태양에서, 실험-동물은 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 3회 면역화되고, 여기서 PBL은 임의적으로 T 세포에 대해 강화된다.

T 세포를 활성화시키는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 실험-동물을 고유 형태로 존재하는, 즉 변성되지 않은 항원으로 면역화시킴으로써 생성될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본 방법은 변성제를 사용하지 않는다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 완전 프로이드 보조제(complete Freud's adjuvant)를 사용하지 않는다.

본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 뿐만 아니라 사이노몰구스 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 추가로 T 세포를 활성화시킬 수 있음이 밝혀졌다. T-세포 활성화는 칼슘 플럭스(flux) 검정을 사용하여 제시될 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 바와 같은 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론, 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시킨다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)를 포함하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하는 방법이고, 여기서 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 T 세포를 활성화시킨다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)를 포함하는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위한 방법이고, 여기서 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다. 게다가, 항체는 또한 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/042261호에 보고된 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는,

a) 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 본원에 보고된 바와 같은 방법에 의해 생산하는 단계,

b) 단계 a)에서 생산된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,

c) 단계 b)의 세포를 배양하는 단계,

d) 세포 또는 배양 상청액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함함으로써 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하는 방법이다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는,

a) 항체를 본원에 보고된 바와 같은 방법에 의해 생산하는 단계,

b) 단계 a)에서 생산된 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계,

c) 임의적으로 항체를 인간화시키는 단계,

d) 단계 b)에서 단리되거나 단계 c)에서 수득된 항체를 인코딩하는 핵산을 발현 벡터에서 클로닝하는 단계,

e) 단계 d)에서 수득된 발현 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계,

f) 단계 e)의 세포를 배양하는 단계,

g) 세포 또는 배양 상청액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함함으로써 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하는 방법이다.

본원에 보고된 바와 같은 또 다른 양태는 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이다.

본원에 보고된 바와 같은 추가의 양태는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이다.

하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 번호 6 내지 서열 번호 8로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 6 내지 서열 번호 8로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 9의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 10 및 서열 번호 11로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 14의 VH 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 15의 VL 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 14의 VH 서열 및 서열 번호 15의 VL 서열을 포함한다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 본원에 보고된 바와 같은 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역컨주게이트(immunoconjugate)이다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 본원에 보고된 바와 같은 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제제이다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시킴(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)으로써 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이고, 여기서 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 T 세포를 활성화시킨다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 양태는 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시킴(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)으로써 수득되는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체이고, 여기서 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는다.

당분야의 숙련가라면, 사이노몰구스 유래된 항원이 사용될 경우 실험-동물은 면역 반응을 수득하기 위해 사이노몰구스 이외의 실험-동물이어야 한다는 사실을 인식한다.

정의

본원의 목적을 위해 "억셉터(acceptor) 인간 골격구조"는, 아래에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스(consensus) 골격구조로부터 유래된 경쇄 가변성 도메인(VL) 골격구조 또는 중쇄 가변성 도메인(VH) 골격구조의 아미노산 서열을 포함하는 골격구조이다. 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스 골격구조"로부터 유래된" 억셉터 인간 골격구조는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이는 아미노산 서열 변화를 가질 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇몇 실시태양에서, VL 억셉터 인간 골격구조는 서열면에서 VL 인간 면역글로불린 골격구조 서열 또는 인간 컨센서스 골격구조 서열과 동일하다.

용어 "항-CD3 엡실론 항체" 및 "CD3 엡실론에 결합하는 항체"는 CD3 엡실론을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 CD3 엡실론에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 관련되지 않은, 비-CD3 엡실론 단백질로의 항-CD3 엡실론 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 의해 측정될 경우 인간 및/또는 사이노몰구스 CD3 엡실론으로의 항체의 결합의 약 10% 미만이다.

용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 결합하는"은 비아코어 검정(BIAcore 검정)(SPR)에서 결정될 경우 10^-5 M (M=몰/ℓ) (예를 들어 10^-6 M) 미만의 K_D 값으로 항체가 항원에 결합함을 지칭한다.

용어 "인간 CD3 엡실론"은 본원에 사용될 경우 인간 CD3 엡실론의 전장 아미노산 서열의 세포외 도메인을 의미하고, 즉 신호 서열, 막간 도메인 또는 세포질의 도메인을 포함하지 않고, 아미노산 서열 DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD(서열 번호 2)을 갖는다.

용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고 다양한 항체 구조물, 예컨대 제한되지 않지만 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편을, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 내포한다.

"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 제한되지 않지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함된다.

용어 "인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체"는 인간 항원 뿐만 아니라 상응하는 사이노몰구스 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다.

본원에 보고된 바와 같이 CD3 엡실론에 결합하는 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는, 예를 들어 X-선 결정학에 의해 또는 펩티드 스캔에서 결정될 경우 CD3 엡실론의 동일한 아미노산 잔기에 결합하고/이와 상호작용하는 항체를 지칭한다.

용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원 또는 종으로부터 유래되는 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 근원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.

항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 소유되는 불변성 도메인 또는 불변성 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이고, 이들중 몇몇은 추가로 하위부류(이소타입: isotype)으로 나눠지며, 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂이다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다.

용어 "세포독성제"는 본원에 사용될 경우 세포 기능을 저해 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제로는, 제한되지 않지만, 방사성 동위원소(예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈스크린, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입 제제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵용해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소(이의 단편 및/또한 변형물 포함); 및 이후 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.

"효과자 기능"은 항체 이소타입에 따라 상이한, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물 활성을 지칭한다. 항체 효과자 기능의 예로는: Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식세포작용, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.

제제, 예를 들어, 약학 제형의 "효과량"은 원하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 시간의 기간 동안 및 투여량에서의 효과적인 양을 지칭한다.

용어 "Fc 영역"은 본원에서 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 고유의 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역중 아미노산 잔기의 번호매김은 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같이, EU 색인으로도 지칭되는 EU 번호매김 체제에 따른다.

"골격구조" 또는 "FR"은 과가변성 영역(HVR) 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기를 지칭한다. 가변성 도메인의 FR은 일반적으로 다음의 4가지 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 사용된다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손체를 비롯하여 외래성 핵산이 도입되어진 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하고, 이는 계대배양의 수와 무관하게 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유도된 자손체를 포함한다. 자손체는 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택될 때 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손체가 본원에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 인간 항체 레퍼토리(repertoiry) 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 인간 이외의 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 항체이다. 인간 항체에 대한 이러한 정의는 인간 이외의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 배제한다.

"인간 컨센서스 골격구조"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격구조 서열의 선택시 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격구조이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변성 도메인 서열의 하위군으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 카밧 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 하위군 카파 I이다. 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 하위군은 상기 카밧 등의 문헌에서와 같은 하위군 III이다.

"인간화된" 항체는 인간 이외의 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 2개의 가변성 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)은 인간 이외의 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 인간 이외의 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.

용어 "과가변성 영역" 또는 "HVR"은, 본원에 사용될 경우 서열에서 과가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 루우프(loop)("과가변성 루우프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변성 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함한다; VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(L1, L2, L3).

본원에서 예시적인 HVR은 다음을 포함한다:

(a) 아미노산 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2), 91 내지 96(L3), 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2), 및 96 내지 101(H3)에서 초래되는 과가변성 루우프[코티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)의 문헌 "J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)"];

(b) 아미노산 잔기 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2), 89 내지 97(L3), 31 내지 35b(HI), 50 내지 65(H2), 및 95 내지 102(H3)에서 초래되는 CDR[카밧 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)"];

(c) 아미노산 잔기 27c 내지 36(L1), 46 내지 55(L2), 89 내지 96(L3), 30 내지 35b(HI), 47 내지 58(H2), 및 93 내지 101(H3)에서 초래되는 항원 접촉부[맥칼럼(MacCallum) 등의 문헌 "J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)"]; 및

(d) HVR 아미노산 잔기 46 내지 56(L2), 47 내지 56(L2), 48 내지 56(L2), 49 내지 56(L2), 26 내지 35(H1), 26 내지 35b(H1), 49 내지 65(H2), 93 내지 102(H3), 및 94 내지 102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합물.

달리 지시되지 않는 한, 가변성 도메인에서 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 상기 카밧 등에 따라 본원에서 번호매겨진다.

"면역컨주게이트"는 하나 이상의 이종성 분자(들), 제한되지 않지만, 예로서 세포독성제에 컨주게이트되는 항체이다.

용어 "단일클론성 항체"는 본원에 사용될 경우 실질적으로 동종성인 항체들의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 포함하거나 단일클론성 항체 제제의 생산 동안 야기된 가능한 변형 항체는 제외하고, 이러한 변형체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제제와 대조적으로, 단일클론성 항체 제제의 각각의 단일클론성 항체는 항원 상의 단일한 결정인자에 대해 유도된다. 이와 같이, 한정어 "단일클론성"은, 항체의 실질적으로 동종성인 모집단으로부터 수득된 항체의 특성을 지시하고, 이는 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론성 항체는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있고, 제한되지 않지만, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-표시 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자이식 실험 동물을 이용하는 방법이 포함되고, 이러한 방법 및 단일클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.

용어 "말초 혈액 림프구" 또는 "PBL"은, 본원에 사용될 경우, 기관(예컨대 비장 또는 림프절)에 편재화되기 보다는 혈액에서 순환하는 성숙한 림프구를 의미한다. PBL은 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함한다.

기준 폴리펩타이드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요할 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당분야의 숙련가라면, 비교되는 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성% 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 제조되고, 원시 코드(source code)는 사용자 기록문서와 함께 워싱턴 디.씨. 20559 소재의 미국 저작권 사무소(Copyright Office)에 보관되어 있고, 여기서 이는 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크 인크.로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여, UNIX 작동 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달라지지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의, 또는 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성%(이는 다르게는 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의 또는 B에 대한 특정한 아미노산 서열 동일성%을 갖거나 포함한 소정의 아미노산 서열 A로서도 표현됨)은 다음과 같이 계산된다:

X/Y 분율×100

여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일 부합성으로서 계산된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성%과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 특별히 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성% 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.

용어 "약학 제형"은 이에 포함된 활성 구성성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여되는 피험체에 허용되지 않도록 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 피험체에 무독성인 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체로는, 제한되지 않지만, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함된다.

용어 "가변성 영역" 또는 "가변성 도메인"은 항원으로의 항체의 결합에 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변성 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격구조 영역(FR) 및 3개의 과가변성 영역(HVR)을 포함한다[예를 들어, 킨드트(Kindt, T.J.) 등의 문헌 "Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007) page 91" 참조]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 포르토라노(Portolano, S.) 등의 문헌[J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; 클락슨(Clackson, T.) 등의 문헌[Nature 352 (1991) 624-628]을 참조한다.

용어 "벡터"는, 본원에서 사용될 경우, 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조물, 뿐만 아니라 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로서 본원에 지칭된다.

A. 예시적 항-CD3 엡실론 항체

하나의 양태에서, 본 발명은 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, 항-CD3 엡실론 항체는

⊙ 서열 번호 1의 폴리펩티드에 결합하고/하거나,

⊙ 인간(서열 번호 2) 및 사이노몰구스(서열 번호 28) CD3 엡실론의 ECD에 결합하고/하거나,

⊙ 인간 및/또는 사이노몰구스 T 세포를 활성화시키고/시키거나,

⊙ CD3 엡실론의 작용물질이고/이거나,

⊙ 그의 항원에 ≤ 10 μΜ의 친화도로 결합한다.

하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 번호 6 내지 서열 번호 8로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 6 내지 서열 번호 8로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 9의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 10 및 서열 번호 11로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 14의 VH 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 15의 VL 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 서열 번호 14의 VH 서열 및 서열 번호 15의 VL 서열을 포함한다.

추가의 실시태양에서, 임의의 상기 실시태양에 따른 항-CD3 엡실론 항체는 단일클론성 항체이고, 키메라성 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체가 포함된다.

하나의 실시태양에서, 항-CD3 엡실론 항체는 항체 단편이고, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')₂ 단편이 포함된다.

또 다른 실시태양에서, 항체는 전장 항체이고, 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 온전한 IgG1 항체 또는 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.

추가의 실시태양에서, 임의의 상기 실시태양에 따른 항-CD3 엡실론 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같이, 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 가질 수 있다:

1. 항체 친화도

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 100 μΜ 또는 ≤ 10 μΜ(예를 들어 10^-5 M 이하)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.

또 다른 실시태양에 따르면, Kd 값은 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 비아코어(등록상표) T100[GE 헬쓰케어(GE Healthcare)]을 사용하여, 25℃에서 CM4 칩 상에 고정화된 항원에 의해 측정된다. 예를 들면, 포획 시스템[10 ㎍/㎖의 염소 항 토끼 IgG Fc 단편 특이적; 명령 코드(Order Code): 111-005-046; 잭슨 이뮤노 리써치(Jackson Immuno Research)]의 대략 2000 공명 단위(RU: resonance unit)는 CM4 칩(GE 헬쓰케어, BR-1005-34) 상에서 pH 5.0하에 아민 커플링 키트(GE 헬쓰케어에 의해 공급)를 사용하여 커플링된다. 고정화를 위한 이동 완충액은 HBS-N pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, GE 헬쓰케어, BR-1006-70)였다. 수반되는 동력학적 검정을 위해 이동 및 희석 완충액은 HBS-P pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4, GE 헬쓰케어, BR-1006-71)였다. 유동 세포는 25℃로 설정되고- 샘플 블럭은 12℃로 설정됨 -, 이동 완충액으로 2회 전처리된다. 클론 645 항체는 1 ㎍/㎖ 용액을 60 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 주입함으로써 포획된다. 용액중 다양한 농도로 인간 CD3e(스톡)Fc-노브(Knob)-CD3d(스톡)Fc홀(Hole) 또는 사이노몰구스 CD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀을 180초 동안 30 ㎕/분의 유속으로 1350 nM로 출발하여 주입하고, 이어서 1:1.5의 희석률 및 추가로 1:3의 희석률로 주입함으로써 회합이 측정된다. 해리 상은 300 초 이하 동안 모니터링되고 샘플 용액으로부터 이동 완충액으로 전환시킴으로써 개시된다. 표면은, 글리신 pH 1.7 용액으로 60 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 2회 연속 주입하여 세척함으로써 재생된다. 벌크 굴절 지수(bulk refractive index) 차이는 염소 항 토끼 IgG Fc 표면으로부터 수득된 반응을 차감함으로써 보정된다. 블랭크(blank) 주입을 또한 차감한다(= 2중 참조). 회합 속도(k_회합) 및 해리 속도(k_해리)는, 단순 1 대 1 랑뮤(Langmuir) 결합 모델[비아코어(등록상표) 소프트웨어 버전 3.2]을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는 k_해리/k_회합 비로 계산된다. 예를 들어, 첸(Chen, Y.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881]을 참조한다.

2. 항체 단편

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편으로는, 제한되지 않지만, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, 및 scFv 단편, 및 아래에 기재된 기타 단편이 포함된다. 특정 항체 단편에 대한 고찰을 위해, 허드슨(Hudson, P.J.) 등의 문헌[Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조한다. scFv 단편에 대한 고찰을 위해, 예를 들어 플럭천(Pluckthun, A.)의 문헌[The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315]을 참조하고; 또한 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/16185호; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 에피토프 잔기에 결합하는 새비지(salvage) 수용체를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편에 대한 논의를 위해, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다.

디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 자리를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EP 제404,097호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 1993/01161호; 허드슨(Hudson, P.J.) 등의 문헌[Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 홀린거(Hollinger, P.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 허드슨(Hudson, P.J.) 등의 문헌 [Nat. Med. 9 (2003) 129-134]에 기재되어 있다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변성 도메인의 전체 또는 일부, 또는 경쇄 가변성 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다[도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 왈탐 소재; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조].

항체 단편은 다양한 기법, 예로서 제한되지 않지만 온전한 항체의 단백질분해적 소화, 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포[예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 또는 파아지]에 의한 생산에 의해 제조될 수 있다.

3. 키메라성 항체 및 인간화된 항체

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 키메라성 항체이다. 특정한 키메라성 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 모리슨(Morrison, S.L.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라성 항체는 인간 이외의 가변성 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변성 영역) 및 인간 불변성 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라성 항체는 "부류-전환된(class switched)" 항체이고, 여기서 부류 또는 하위부류는 모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 바뀐다. 키메라성 항체로는 이의 항원-결합 단편이 포함된다.

특정 실시태양에서, 키메라성 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 인간 이외의 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소된 반면, 인간 이외의 모 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다.

일반적으로, 인간화된 항체는, HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부분)이 인간 이외의 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 일부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변성 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의적으로 또한 인간 불변성 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복하거나 향상시키기 위해, 인간 이외의 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기에 의해 치환된다.

인간화된 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 알마그로(Almagro, J.C.) 및 프란손(Fransson, J)의 문헌[Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 리에흐만(Riechmann, I.) 등의 문헌[Nature 332 (1988) 323-329]; 퀸(Queen, C.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 카쉬미르(Kashmiri, S.V.) 등의 문헌[Methods 36 (2005) 25-34](SDR (a-CDR) 그라프팅에 대해 기재); 패들란(Padlan, E.A.)의 문헌[Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재보수(resurfacing)"에 대해 기재); 달라쿠아(Dall'Acqua, W.F.) 등의 문헌[Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링(shuffling)"에 대해 기재); 및 오스본(Osbourn, J.) 등의 문헌[Methods 36 (2005) 61-68] 및 클림카(Klimka, A.) 등의 문헌[Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근에 대해 기재)에 기재되어 있다.

인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격구조 영역으로는, 제한되지 않지만 다음이 포함된다: "최적합(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 골격구조 영역[예를 들어, 심스(Sims, M.J.) 등의 문헌 "J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308" 참조]; 경쇄 또는 중쇄 가변성 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격구조 영역[예를 들어, 카터(Carter, P.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289"; 및 프레스타(Presta, L.G.) 등의 문헌 "J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632" 참조]; 인간 성숙(신체적으로 성숙된) 골격구조 영역 또는 인간 생식계열 골격구조 영역[예를 들어, 알마그로(Almagro, J.C.) 및 프란손(Fransson, J.)의 문헌 "Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633" 참조]; 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 골격구조 영역[예를 들어, 바카(Baca, M.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684" 및 로속(Rosok, M.J.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618"].

4. 인간 항체

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 반 디지크(van Dijk, M.A.) 및 반 데 윈켈(van de Winkel, J.G.)의 문헌[Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 론베르그(Lonberg, N.)의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 기재되어 있다.

인간 항체는 온전한 인간 항체 또는 인간 가변성 영역을 갖는 온전한 항체를 항원 챌린지(challenge)에 반응하여 생산하도록 변형된 유전자이식 실험-동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 함유하고, 이는 내생성 면역글로불린 유전자자리를 대체하거나, 또는 염색체밖에 존재하거나 동물의 염색체내로 무작위로 통합된다. 이러한 유전자이식 마우스에서, 내생성 면역글로불린 유전자자리는 일반적으로 불활성화된다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법에 대해 검토하기 위해, 론베르그(Lonberg, N.)의 문헌[Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE: 상표명) 기술을 기재하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 후마브(HUMAB: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429호; 케이-엠 마우스(K-M MOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 제US 2007/0061900호를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변성 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변성 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.

인간 항체는 또한 하이브리도마에 기초한 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다[예를 들어, 코즈보(Kozbor, D.)의 문헌 "J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005"; 브로되르(Brodeur, B.R.) 등의 문헌 "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]; 및 뵈르너(Boerner, P.) 등의 문헌 "J. Immunol. 147 (1991) 86-95" 참조]. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 리(Li, J.) 등의 문헌[Proc. Natl Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562]에 기재되어 있다. 추가의 방법으로는, 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 니(Ni, J.)의 문헌[Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 방법이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술[트리오마(Trioma) 기술]은 또한 볼머스(Vollmers, H.P.) 및 브란들레인(Brandlein, S.)의 문헌[Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 볼머스(Vollmers, H.P.) 및 브란들레인(Brandlein, S.)의 문헌[Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 기재되어 있다.

인간 항체는 또한 인간-유래된 파아지 디스플레이(phage display) 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변성 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서 이러한 가변성 도메인 서열은 원하는 인간 불변성 도메인과 조합될 수 있다.

항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법은 아래에 기재되어 있다.

5. 라이브러리-유래된 항체

본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대하여 조합적 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특징을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom, H.R.) 등의 문헌[Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에서 검토되고, 추가로, 예를 들어, 맥카퍼티(McCafferty, J.) 등의 문헌[ Nature 348 (1990) 552-554]; 클락손(Clackson, T.) 등의 문헌[Nature 352 (1991) 624-628]; 마크스(Marks, J.D.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; 마크스(Marks, J.D.) 및 브라드베리(Bradbury, A.)의 문헌[Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; 시드후(Sidhu, S.S.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; 리(Lee, C.V.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; 펠라우스(Fellouse, F.A.)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 리(Lee, C.V.) 등의 문헌[J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 기재되어 있다.

특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이는 윈터(Winter, G.) 등의 문헌[Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파아지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 항체 단편을, 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작성할 필요 없이 높은-친화도 항체를 면역원에 제공한다. 다르게는, 그리피쓰(Griffiths, A.D.) 등의 문헌[EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 기재된 바와 같이, 나이브(naive) 레퍼토리는 클로닝되어(예를 들어, 인간으로부터) 어떠한 면역화없이도 항체의 단일 공급원을 광범위한 비-자가 및 자가-항원에 제공할 수 있다. 최종적으로, 후겐붐(Hoogenboom, H.R.) 및 윈터(Winter, G.)의 문헌[J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 기재된 바와 같이, 매우 가변성인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해, 나이브 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 구획을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 기재하는 특허 공보로는, 예를 들면: 미국 특허 제5,750,373호, 및 미국 특허 공보 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호가 포함된다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 고려된다.

6. 다중특이성 항체

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 자리에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론성 항체이다. 특정 실시태양에서, 결합 특이성중 하나는 CD3 엡실론에 대해서이고 및 나머지는 임의의 다른 항원에 대해서이다. 특정 실시태양에서, 이중특이성 항체는 CD3 엡실론의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 CD3 엡실론을 발현하는 세포에 세포독성제를 편재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편로서 제조될 수 있다.

다중특이성 항체를 제조하기 위한 기법으로는, 제한되지 않지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄의 재조합 공동-발현[밀스타인(Milstein, C.) 및 쿠엘로(Cuello, A.C.)의 문헌 "Nature 305 (1983) 537-540", 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/08829호, 및 트라우네커(Traunecker, A.) 등의 문헌 "EMBO J. 10 (1991) 3655- 3659"], 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)이 포함된다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 조종 효과를 조작함으로써(국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/089004호); 둘 이상의 항체 또는 단편을 가교-결합함으로써[예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호, 및 브레난(Brennan, M.) 등의 문헌 "Science 229 (1985) 81-83" 참조]; 이중특이성 항체를 생산하기 위해 로이신 지퍼(zipper)를 사용함으로써[예를 들어, 코스텔니(Kostelny, S.A.) 등의 문헌 "J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553"]; 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바이" 기술을 사용함으로써[예를 들어, 홀리거(Holliger, P.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448" 참조]; 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써[예를 들어 그루버(Gruber, M) 등의 문헌 "J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374" 참조]; 예를 들어, 투트(Tutt, A.) 등의 문헌[J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 기재된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.

"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 비롯하여, 3개 이상의 작용성 항원 결합 자리를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다(예를 들어 US 제2006/0025576호 참조).

본원에서 항체 또는 단편으로는 또한 CD3 엡실론 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 자리를 포함하는 "이중 작용 Fab(Dual Acting Fab)" 또는 "DAF"가 포함된다(예를 들면, US 제2008/0069820호 참조).

본원에서 항체 또는 단편으로는 또한 국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/080251호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/080252호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/080253호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/080254호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2010/112193호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2010/115589호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2010/136172호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2010/145792호, 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2010/145793호에 기재된 다중특이성 항체가 포함된다.

7. 항체 변형체

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변형체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 요망될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변형체는 항체를 인코딩하는 누클레오티드 서열내로 적절한 개질을 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질로는, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 서열 내로의 삽입 및/또는 서열내 잔기의 치환이 포함된다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 작성물에 도달되도록 이루어질 수 있지만, 단 최종 작성물은 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합 특징을 소유해야 한다.

1. 치환, 삽입, 및 결실 변형체

특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변형체가 제공된다. 치환적 돌연변이생성을 위해 흥미로운 자리는 HVR 및 FR을 포함한다. 예시적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 표제하에 표 1에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 대해서는 하기 추가로 기재된 바와 같다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 표 1에 제시된다. 아미노산 치환은 흥미로운 항체에 도입되고 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된다.

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함을 수반할 것이다.

치환적 변형체의 한가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 과가변성 영역 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변형체(들)는, 모 항체에 비하여 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 개질(예를 들어 개선)될 수 있고/있거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환적 변형체는 친화도 성숙된 항체이고, 이는 편리하게, 예를 들어, 파아지 디스플레이(phage display)에 기초한 친화도 성숙 기법, 예컨대 본원에 기재된 기법에 의해 생성될 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고 변형 항체는 파아지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.

변경(예를 들어, 치환)은 HVR에서 이루어져서, 예를 들어, 항체 친화도를 개선시킬 수 있다. 이러한 변경은 HVR "돌연변이다발점(hotspot)", 즉 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기[예를 들어, 초우드허리(Chowdhury, P.S.)의 문헌 "Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196" 참조], 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어지고, 생성된 변형체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 작성 및 재선택에 의한 친화도 돌연변이는, 예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom, H.R.) 등의 문헌[Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 기재되어 있다. 친화도 돌연변이의 몇몇 실시태양에서, 돌연변이를 위해 채택된 변형가능한 유전자내로 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-발생 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고누클레오티드-유도된 돌연변이생성)에 의해 다양성이 도입된다. 이어서 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서 라이브러리는 스크리닝되어 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변형체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-유도된 접근법을 포함하고, 여기서 수 개의 HVR 잔기(예를 들어, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링(modeling)을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특별히 종종 표적화된다.

특정 실시태양에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 초래될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 만들어 진다. 이러한 변경은 HVR "돌연변이다발점" 또는 SDR의 바깥쪽일 수 있다. 상기 제공된 변형체 VH 및 VL 서열의 특정 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다.

돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는 유용한 방법은 커닝햄(Cunningham, B.C.) 및 웰스(Wells, J.A.)의 문헌[Science, 244 (1989) 1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"으로 지칭된다. 이러한 방법에서, 표적 잔기들중 하나의 잔기 또는 기(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)는, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별되거나 대체된다. 초기 치환에 대한 작용적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 항원-항체 착체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 식별한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변형체는 이들이 원하는 특성을 포함하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실 말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변형으로는 효소(예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드로의 항체의 N- 또는 C-말단의 융합이 포함된다.

b) 글리코실화 변형체

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체로의 글리코실화 자리의 첨가 또는 이의 결실은 하나 이상의 글리코실화 자리가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유의 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297로의 N-결합에 의해 일반적으로 결합된 분지화된 2촉각 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 롸이트(Wright, A.) 및 모리슨(Morrison, S.L.)의 문헌[TIBTECH 15 (1997) 26-32]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc: N-acetyl glucosamine), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2촉각 올리고당 구조의 "줄기"에 있는 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체중 올리고당의 개질은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변형체를 생성하기 위해 이루어진다.

한 실시태양에서, Fc 영역에 결합되는(직접적으로 또는 간접적으로) 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변형체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%이다. 푸코스의 양은 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정되는 경우, Asn 297에 결합된 모든 당구조물(예를 들어, 착체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대한, Asn297에서의 당류 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 297 위치(Fc 영역 잔기의 Eu 번호매김)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 약간의 서열 변형에 기인하여 297 위치의 약 ± 3의 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294 내지 300 위치에 위치될 수 있다. 이러한 푸코실화 변형체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 제2003/0157108호; 및 제2004/0093621호를 참조한다. "푸코스제거된" 또는 "푸코스-부족" 항체 변형체에 관한 문헌의 예로는: US 제2003/0157108호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2000/61739호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2001/29246호; US 제2003/0115614호; US 제2002/0164328호; US 제2004/0093621호; US 제2004/0132140호; US 제2004/0110704호; US 제2004/0110282호; US 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085119호; 제WO 2003/084570호; 제WO 2005/035586호; 제WO 2005/035778호; 제WO 2005/053742호; 제WO 2002/031140호; 오카자키(Okazaki, A.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249]; 야만-오누키(Yamane-Ohnuki, N.) 등의 문헌[Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622]이 포함된다. 푸코스제거된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포[리프카(Ripka, J.) 등의 문헌 "Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545"; 미국 특허 출원 제2003/0157108호; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호(특히 실시예 11)], 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포[예를 들어, 야만 오누키(Yamane-Ohnuki, N.) 등의 문헌 "Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622"; 칸다(Kanda, Y.) 등의 문헌 "Biotechnol. Bioeng., 94 (2006) 680-688"; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085107호 참조]가 포함된다.

2등분된 올리고당을 갖는 항체 변형체가 추가로 제공되고, 예를 들어, 여기서 항체의 Fc 영역에 결합된 2촉각 올리고당은 GlcNAc에 의해 2등분된다. 이러한 항체 변형체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변형체의 예는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/011878호; 미국 특허 제6,602,684호; 및 US 제2005/0123546호에 기재되어 있다. Fc 영역에 결합된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변형체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변형체는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형체는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 1997/30087호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 1998/58964호; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 1999/22764호에 기재되어 있다.

c) Fc 영역 변형체

특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역내로 도입되어, Fc 영역 변형체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변형체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함한다.

특정 실시태양에서, 본 발명은 몇몇의, 그러나 전부는 아닌 효과자 기능을 갖는 항체 변형체를 고려하는데, 이는 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 효과자 기능(예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용분야에서 이를 바람직한 후보군으로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행되어 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 검정이 수행되어 항체가 FcγR 결합(이에 따라 아마도 ADCC 활성)이 결핍되지만, FcRn 결합 능력을 보유함을 확인할 수 있다. ADCC를 중재하기 위한 1차 세포, NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 라베취(Ravetch, J.V.) 및 키네트(Kinet, J.P.)의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다. 흥미로운 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호[예를 들어 헬스트롬(Hellstrom, I.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063"; 및 헬스트롬(Hellstrom, I. 등)의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502" 참조]; 미국 특허 제5,821,337호[브루게만(Bruggemann, M.) 등의 문헌 "J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361" 참조]에 기재되어 있다. 다르게는, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있고, 예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI(상표명) 비-방사성 세포독성 검정[셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴뷰]; 및 사이토톡스 96(CytoTox 96: 등록상표) 비-방사성 세포독성 검정[프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨]을 참조한다. 이러한 검정을 위한 유용한 효과자 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 다르게는, 또는 추가적으로, 흥미로운 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 예컨대 클라이네스(Clynes, R.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 또한 항체가 Clq에 결합할 수 없고 이에 따라 CDC 활성이 결핍됨을 확인하기 위해 실행될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/029879호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/100402호에 기재된 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다[예를 들면, 가차노-산토로(Gazzano-Santoro, H.) 등의 문헌 "J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171"; 크라그(Cragg, M.S.) 등의 문헌 "Blood 101 (2003) 1045-1052"; 및 크라그(Cragg, M.S.) 및 글레니에(M.J. Glennie)의 문헌 "Blood 103 (2004) 2738-2743" 참조]. FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정은 또한 당분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다[예를 들어, 페트코바(Petkova, S.B.) 등의 문헌 "Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769" 참조].

효과자 기능이 감소된 항체로는 하나 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329에서 치환을 갖는 항체가 포함된다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체로는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 둘 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함되고, 265 및 297 잔기가 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 있다(미국 특허 제7,332,581호).

FcR로의 결합이 향상되거나 감소된 특정 항체 변형체가 기재되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호, 및 쉴즈(Shields, R.L.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604" 참조].

특정 실시태양에서, 항체 변형체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번호매김)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/51642호, 및 이두소기에(Idusogie, E.E.) 등의 문헌[J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]에 기재된 바와 같이, Fc 영역이 변경되어, 변경된(즉, 향상되거나 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)이 초래된다.

반감기가 증가되고, 모체 IgG의 태아로의 전달에 책임이 있는 신생아 Fc 수용체(FcRn)[구이어(Guyer, R.L.) 등의 문헌 "J. Immunol. 117 (1976) 587-593", 및 킴(Kim, J.K.) 등의 문헌 "J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434"]로의 결합이 향상된 항체가 US 제2005/0014934호에 기재되어 있다. 이들 항체는 Fc 영역의 FcRn으로의 결합을 향상시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변형체로는, Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434중 하나 이상에서 치환된, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434에서 치환된 변형체가 포함된다(미국 특허 제7,371,826호).

또한 Fc 영역 변형체의 다른 예와 관련된 던칸(Duncan, A.R.) 및 윈터(Winter, G.)의 문헌[Nature 322 (1988) 738-740]; US 제5,648,260호; US 제5,624,821호; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 94/29351호를 참조한다.

d) 시스테인 조작된 항체 변형체

특정 실시태양에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특별한 실시태양에서, 치환된 잔기는 항체의 허용가능한 자리에서 초래된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체의 허용가능한 자리에 위치되고, 다른 작용성부분(moiety), 예컨대 약물 작용성부분 또는 연결기-약물 작용성부분에 항체를 컨주게이션하여 면역컨주게이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 하기 잔기들중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호매김); 중쇄의 A118(EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호매김). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

e) 항체 유도체

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 당분야에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비-단백질성 작용성부분을 함유하도록 추가로 개질될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 작용성부분으로는, 제한되지 않지만 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체의 비제한적인 예로는, 제한되지 않지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸레이트화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 수중 안정성에 기인하여 제작시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 보다 많은 중합체가 부착된다면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 제한되지 않지만 개선되어야 할 항체의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에 치료법에 사용될 것인지의 여부 등을 비롯한 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 선택적으로 방사선에 노출되어 가열될 수 있는 항체 및 비-단백질성 작용성부분의 컨주게이트가 제공된다. 하나의 실시태양에서, 비-단백질성 작용성부분은 탄소 나노튜브(nanotube)이다[캄(Kam, N.W.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605"]. 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 제한되지 않지만, 정상적인 세포에 해를 끼치지 않지만 항체-비-단백질성 작용성부분에 근접한 세포가 파괴되는 온도로 비-단백질성 작용성부분을 가열하는 파장이 포함된다.

재조합 방법 및 조성물

항체는, 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본원에 기재된 항-CD3 엡실론 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코딩할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시태양에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 실시태양에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들어, 다음에 의해 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 하나의 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 림프성 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 항-CD3 엡실론 항체의 제조 방법이 제공되고, 여기서 이 방법은, 상기 제공된 바와 같이, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 임의적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.

항-CD3 엡실론 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이, 항체를 인코딩하는 핵산은 단리되고 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입된다. 이러한 핵산은 쉽게 단리되고 종래의 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고누클레오티드 탐침자를 사용함으로써) 서열분석된다.

항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 항체는 박테리아에서, 특히 글리코실화 및 Fc 효과자 기능이 요구되지 않는 경우 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 미국 특허 제5,789,199호, 및 미국 특허 제5,840,523호를 참조한다[또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 찰톤(Charlton, K.A.)의 문헌 "In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254"을 참조한다]. 발현 후, 항체는 가용성 분별물중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.

원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 사상균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균류 및 효모가 포함된다. 게른그로스(Gerngross, T.U.)의 문헌[Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 리(Li, H.) 등의 문헌[Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조한다.

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특별히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스성(baculoviral) 균주가 식별되었다.

식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호[유전자이식 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스((PLANTIBODIES: 상표명) 기술을 기재함]를 참조한다.

척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장되도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주[예를 들어, 그라함(Graham, F.L.) 등의 문헌 "J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74" 에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포]; 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포[예를 들어, 매터(Mather, J.P.)의 문헌 "Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252"에 기재된 바와 같은 TM4 세포]; 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 뇌 암종 세포(HELA); 개과 동물 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562); TRI 세포[예를 들어, 매터(Mather, J.P.) 등의 문헌 "Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68"에 기재된 바와 같음]; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR^-CHO 세포[우를라우브(Urlaub, G.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220"]; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NSO, 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주를 고찰하기 위해, 예를 들어, 야자키(Yazaki, P.) 및 우(Wu, A.M.)의 문헌[Methods in Molecular Biology, Vol. 248 Lo. B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ(2004), pp. 255-268]을 참조한다.

약학 제형

본원에 기재된 바와 같은 항-CD3 엡실론 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써[레밍턴(Remington)의 문헌 "Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)"], 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 제한되지 않지만, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 일당류, 이당류, 및 기타 탄화수소, 예로서 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 본원에서 추가로 간질성(interstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제(hyaluronidase) 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20[하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 박스터 인터내셔널 인크.(Baxter International Inc.)]을 포함한다. 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법(rhuPH20 포함)은 미국 특허 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.

예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/044908호에 기재된 제형을 포함하고, 후자의 제형으로는 히스티딘-아세테이트 완충액이 포함된다.

제형은 본원에서 또한 치료될 특정 증상에 필수적인 하나 보다 많은 활성 구성성분들, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 구성성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 구성성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적절히 존재한다.

활성 구성성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼(microemulsion), 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼(macroemulsion)에 트래핑될 수 있다. 이러한 기법들은 레밍턴의 문헌[Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지효성(sustained-release) 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 항체를 포함한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

C. 검정

본원에 제공된 항-CD3 엡실론 항체는 당분야에 공지된 다양한 검정에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별되거나, 스크리닝되거나, 또는 특징화될 수 있다.

1. 결합 검정 및 기타 검정

하나의 양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot) 등에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.

또 다른 양태에서, 경쟁 검정이 사용되어 CD3 엡실론에 결합하기 위해 클론 645에 의해 생산되는 항체와 경쟁하는 항체를 식별할 수 있다. 특정 실시태양에서, 이러한 경쟁 항체는 클론 645에 의해 생산된 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체배좌 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑(mapping)하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)]에 제공된다.

예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 CD3 엡실론은 CD3 엡실론에 결합하는 제1의 표지화된 항체(예를 들어, 클론 645에 의해 생산되는 항체) 및 CD3 엡실론에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험되는 제2의 표지화되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 CD3 엡실론은 제1의 표지화된 항체를 포함하지만 제2의 표지화되지 않은 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 제1 항체가 CD3 엡실론에 결합하는 것을 허용하는 조건하에 항온처리한 후, 과량의 결합되지 않은 항체는 제거되고, 고정화된 CD3 엡실론과 회합된 표지의 양이 측정된다. 고정화된 CD3 엡실론과 회합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 상당히 감소된다면, 이는 제2 항체가 CD3 엡실론에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁중임을 지시한다. 할로우(Harlow, E.) 및 래인(Lane, D.)의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)]을 참조한다.

2. 활성 검정

하나의 양태에서, 검정은 생물학적 활성을 갖는 이의 항-CD3 엡실론 항체를 식별하기 위해 제공된다. 생물학적 활성으로는, 예를 들어, T 세포의 활성화가 포함된다. 이러한 생체내 및/또는 시험관내 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 항-CD3 엡실론 항체의 작용 활성을 시험하기 위해, CD3-양성[주르캣(Jurkat) E6-1] 및 CD3-음성(주르캣 RT3-T3.5) 인간 T-세포주를 사용하는 칼슘 플럭스(flux) 검정이 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, CD3-양성 주르캣 E6-1 세포 또는 CD3-음성 주르캣 RT3-T3.5는, 웰당 50 ㎕의 무혈청 배지(RPMI 1640/2 mM 글루타민/1 mM 피루브산 나트륨/10 mM HEPES/O.1 mM NEAA)중 200,000개 세포로, 흑색-벽을 갖고 바닥이 투명한 96-웰 플레이트[BD 팔콘(BD Falcon)]에 플레이팅된다. 세포에 칼슘 민감성 염료[FLIPR(등록상표) 칼슘 5 검정 키트, 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)]가 적재된다. 염료의 저장 용액은 제조업체의 지시에 따라 제조된다. 사용 직전 프로베네시드(Probenecid)가 첨가되고, 50 ㎕/웰의 희석된 염료가 세포에 첨가된다(프로베네시드의 최종 농도는 2.5 mM/웰일 것이다). 효율적인 적재를 위해, 세포는 염료와 2 시간 동안 실온에서 암실에서 항온처리된다. 후속적으로, 20 ㎕의 토끼 항-CD3 엡실론 mAb(토끼 B-세포 상청액) 또는 키메라성 V9 mAb의 연속 희석물, 즉 토끼 면역글로불린 불변성 영역 및 인간화된 항-CD3 mAb V9의 가변성 영역으로 구성된 키메라성 항-CD3 항체의 첨가에 의해 세포는 자극된다. 비특이적 다중클론성 토끼 IgG는 음성 대조군으로서 작용한다. 항-CD3 엡실론 유도된 칼슘 플럭스의 동력학은 형광(485 nm ex./530 nm em.)을 30 초 시간 간격으로 7.5 내지 10 분 동안 측정함으로써 모니터링된다. 키메라성 V9 mAb에 의해 유도된 칼슘 플럭스는 도 6A에 도시된다. 키메라성 V9 mAb는 CD3-양성 주르캣 E6-1 세포에서만 칼슘 동원을 유도하고 CD3-음성 주르캣 RT3-T3.5 세포에서는 유도하지 않는데, 이는 효과에 대한 CD3 의존성을 입증한다. 유사하게, 세포가 비특이적 토끼 IgG로 처리된 경우에도 칼슘 플럭스는 관찰되지 않는다.

D. 면역컨주게이트

본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 컨주게이션된 본원의 항-CD3 엡실론 항체를 포함하는 면역컨주게이트를 제공한다.

하나의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 항체-약물 컨주게이트(ADC: antibody-drug conjugate)이고, 여기서 항체는 하나 이상의 약물, 예컨대 제한되지 않지만 메이탄시노이드(maytansinoid)(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 제EP 0 425 235 B1호 참조); 아우리스타틴(auristatin), 예컨대 모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) 약물 작용성부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호, 및 제7,498,298호 참조); 돌라스타틴(dolastatin); 칼리케아미신(calicheamicin) 또는 이들의 유도체[미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; 힌만(Hinman, L.M.) 등의 문헌 "Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342"; 및 로데(Lode, H.N.) 등의 문헌 "Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928" 참조]; 안트라사이클린(anthracycline), 예컨대 다우노마이신(daunomycin) 또는 독소루비신(doxorubicin)[크라츠(Kratz, F.) 등의 문헌 "Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523"; 제프레이(Jeffrey, S.C.) 등의 문헌 "Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362"; 토르고브(Torgov, M.Y.) 등의 문헌 "Bioconj. Chem. 16 (2005) 717-721"; 나기(Nagy, A.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834"; 두보우치크(Dubowchik, G.M.) 등의 문헌 "Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532"; 킹(King, H.D.) 등의 문헌 "J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343"; 및 미국 특허 제6,630,579호]; 메토트렉세이트(methotrexate); 빈데신(vindesine); 탁산(taxane), 예컨대 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 테세탁셀(tesetaxel), 및 오르타탁셀(ortataxel); 트리코테센(trichothecene); 및 CC1065에 컨주게이션된다.

또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편, 예컨대 제한되지 않지만, 디프테리아(diphtheria) A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신(exotoxin) A 쇄[슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터], 리신(ricin) A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신(modeccin) A 쇄, 알파-사르신(sarcin), 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파노오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 트리코테세네스(tricothecenes)에 컨주게이션된 본원에 상기 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 방사성 원자에 컨주게이션되어 방사성컨주게이트를 형성하는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성컨주게이트의 생산에 이용가능하다. 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성컨주게이트가 검출을 위해 사용될 경우, 이는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 TC^99m 또는 I¹²³, 또는 핵자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance) 영상화(또한 자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 스핀(spin) 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

항체 및 세포독성제의 컨주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 비테타(Vitetta, E.S.) 등의 문헌[Science 238 (1987) 1098-1104]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체로의 방사성누클레오티드의 컨주게이션을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 국제 특허출원 공개공보 제W094/11026호를 참조한다. 연결기는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "분할가능한 연결기"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정성 연결기, 펩티다아제-민감성 연결기, 광불안정성 연결기, 디메틸 연결기 또는 디설파이드-함유 연결기[차리(Chari, R.V.) 등의 문헌 "Cancer Res. 52 (1992) 127-131"; 미국 특허 제5,208,020호]가 사용될 수 있다.

면역컨주게이트 또는 ADC는 본원에서, 제한되지 않지만, 상업적으로 입수가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)[예를 들어, 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.) 제품]를 비롯한 가교-결합제에 의해 제조된 이러한 컨주게이트를 명백히 고려한다.

E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물

특정 실시태양에서, 본원에 제공된 임의의 항-CD3 엡실론 항체는 생물학적 샘플에서 CD3 엡실론의 존재를 검출하는데에 유용하다. 용어 "검출하는"은 본원에 사용될 경우 정량적 또는 정성적 검출을 내포한다. 특정 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 혈액을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플에서 CD3 엡실론의 존재를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 특정 실시태양에서, 이러한 방법은 항-CD3 엡실론 항체가 CD3 엡실론에 결합하는 것을 허용하는 조건하에 본원에 기재된 바와 같은 항-CD3 엡실론 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항-CD3 엡실론 항체 및 CD3 엡실론 사이에 착체가 형성되는 지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 항-CD3 엡실론 항체는, 예를 들어 CD3 엡실론이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우, 항-CD3 엡실론 항체에 의한 치료에 적격인 피험체를 선택하기 위해 사용된다.

본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환으로는 암이 포함된다.

특정 실시태양에서, 표지화된 항-CD3 엡실론 항체가 제공된다. 표지로는, 직접적으로 검출되는 표지 또는 작용성부분(예컨대 형광, 발색, 전자-밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어, 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해, 간접적으로 검출되는 작용성부분, 예컨대 효소 또는 리간드가 포함된다. 예시적 표지로는, 제한되지 않지만, 방사성동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인(fluorescein) 및 이의 유도체, 로다민(rhodamine) 및 이의 유도체, 단실(dansyl), 엄벨리페론(umbelliferone), 루시퍼라아제(luciferase), 예를 들어, 반딧불 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제(미국 특허 제4,737,456), 루시페린(luciferin), 2,3-디하이드로프탈아진디온, 호스 래디시 퍼옥시다아제(HRP: horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 산화효소, 예를 들어, 글루코오스 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP와 커플링된 헤테로환식 산화효소, 예컨대 유리카아제(uricase) 및 잔틴 산화효소, 락토퍼옥시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴(biotin)/아비딘(avidin), 스핀 표지, 박테리오파아지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함된다.

F. 약학 제형

본원에 기재된 바와 같은 항-CD3 엡실론 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써[레밍턴(Remington)의 문헌 "Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)"], 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 제한되지 않지만, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 일당류, 이당류, 및 기타 탄화수소, 예로서 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 본원에서 추가로 간질성(interstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제(hyaluronidase) 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20[하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 박스터 인터내셔널 인크.(Baxter International Inc.)]을 포함한다. 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법(rhuPH20 포함)은 미국 특허 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.

예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/044908호에 기재된 제형을 포함하고, 후자의 제형으로는 히스티딘-아세테이트 완충액이 포함된다.

제형은 본원에서 또한 치료될 특정 증상에 필수적인 하나 보다 많은 활성 구성성분들, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 구성성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 구성성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적절히 존재한다.

활성 구성성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼(microemulsion), 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼(macroemulsion)에 트래핑될 수 있다. 이러한 기법들은 레밍턴의 문헌[Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지효성 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 항체를 포함한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

G. 치료학적 방법 및 조성물

본원에 제공된 임의의 항-CD3 엡실론 항체는 치료학적 방법에 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 암을 치료하는데에 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체가 제공된다. 특정 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체가 제공된다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 암을 앓는 개별체에게 효과량의 항-CD3 엡실론 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 개별체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체를 제공한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 이 방법은 개별체에게 효과량의, 예를 들어 아래에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 T 세포를 활성화시키는데 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 T 세포를 활성화시키기 위해 효과량의 항-CD3 엡실론 항체를 개별체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개별체에서 T 세포를 활성화시키는 방법에서 사용하기 위한 항-CD3 엡실론 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개별체"는 바람직하게는 인간이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서의 항-CD3 엡실론 항체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약제는 암을 치료하기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는 암을 앓는 개별체에게 효과량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시태양에서, 이러한 방법은 개별체에게 효과량의 적어도 1종의 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 약제는 T 세포의 활성화를 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는 T 세포를 활성화시키기 위해 효과량의 약제를 개별체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개별체에서 T 세포를 활성화시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개별체"는 인간일 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 상기 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-CD3 엡실론 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-CD3 엡실론 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-CD3 엡실론 항체 및 적어도 1종의 추가적인 치료제를 포함한다.

본 발명의 항체는 치료법에서 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 1종의 추가적인 치료제와 공동투여될 수 있다.

상기 주지된 이러한 복합 치료법은 조합된 투여(여기서 둘 이상의 치료제는 동일하거나 상이한 제형에 포함됨), 및 별도의 투여를 내포하고, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전에, 이와 동시에 및/또는 이후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 치료법과 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 항체(및 임의의 추가적인 치료제)는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 예컨대 비경구적, 폐내, 및 비강내, 바람직하다면 국소적 치료를 위해 병변내 투여가 포함된다. 비경구적 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은, 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사에 의해, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 수행될 수 있다. 제한되지 않지만 다양한 시점에 걸친 다중 투여 또는 단일 투여, 거환 투여, 및 맥동 주입 등을 비롯한 다양한 투약 계획이 본원에서 고려된다.

본 발명의 항체는 양호한 의료행위와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자로는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의료진에게 공지된 다른 인자들이 포함된다. 항체는, 필수적이지는 않지만, 해당 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 임의적으로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 효과적인 양은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 언급된 다른 인자들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량으로 및 동일한 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1% 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량은 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합하여 사용될 경우) 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 위중성 및 과정, 항체가 예방을 목적으로 투여되는지 치료를 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 치료법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 응답, 및 참여 의사의 견해에 좌우될 것이다. 항체는 적합하게는 환자에게 1회 또는 일련의 치료로 투여된다. 질환의 유형 및 위중성에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는, 예를 들면 하나 이상의 별도의 투여에 의해서인지 연속적인 주입에 의해서인지와 무관하게, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 증상에 따라서, 치료는 질환 증후의 원하는 억제가 초래될 때까지 유지될 것이다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위내일 수 있다. 이와 같이, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg중 하나 이상의 용량(또는 이의 임의의 조합)이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주마다 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어 환자가 항체를 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량으로 수여받도록). 초기에 더 높은 적재 용량이 투여된 후 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.

임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 항-CD3 엡실론 항체 대신 또는 이에 더하여 본 발명의 면역컨주게이트를 사용하여 수행될 수 있음을 알아야 한다.

III. 제품

본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제품이 제공된다. 제품은 용기, 및 용기의 위에 또는 용기와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로의, 또는 증상을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하내 주사 바늘에 의해 침투가능한 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물중 적어도 하나의 활성화제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해 사용됨을 지시한다. 게다가, 제품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기(여기서 조성물은 본 발명의 항체를 포함함); 및 (b) 조성물이 포함된 제2 용기(여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 달리는 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시태양에서 제품은 조성물이 특정 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거(Ringer) 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

임의의 상기 제품이 항-CD3 엡실론 항체 대신에 또는 이에 더하여 본 발명의 면역컨주게이트를 포함할 수 있음을 알아야 한다.

본 발명의 구체적인 실시태양

1. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하는데 있어서의, 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법의 용도.

2. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 미만의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 1에 따른 용도.

3. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 50%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 1 또는 2에 따른 용도.

4. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 60%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 1 내지 3중 어느 하나에 따른 용도.

5. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 70%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 1 내지 4중 어느 하나에 따른 용도.

6. 고유의 사이노몰구스 항원이, 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나가 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프인, 실시태양 1 내지 5중 어느 하나에 따른 용도.

7. 고유의 사이노몰구스 항원이 T 세포 항원인, 실시태양 1 내지 6중 어느 하나에 따른 용도.

8. 고유의 사이노몰구스 항원이 CD3 엡실론인, 실시태양 1 내지 7중 어느 하나에 따른 용도.

9. 고유의 사이노몰구스 항원이 CD3 엡실론이고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 (고유의) 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 실시태양 1 내지 8중 어느 하나에 따른 용도.

10. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 1 내지 9중 어느 하나에 따른 용도.

11. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 2회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 1 내지 10중 어느 하나에 따른 용도.

12. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 3회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 1 내지 11중 어느 하나에 따른 용도.

13. 면역화가 피내 적용, 근육내 적용 및 피하 적용을 포함하는, 실시태양 1 내지 12중 어느 하나에 따른 용도.

14. 면역화가 제1 단계로서의 피내 적용, 제2 단계로서의 근육내 적용 및 제3 단계로서의 피하 적용을 포함하는, 실시태양 1 내지 13중 어느 하나에 따른 용도.

15. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 일주일에 한번 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 1 내지 14중 어느 하나에 따른 용도.

16. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 일주일에 한번 3회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 1 내지 15중 어느 하나에 따른 용도.

17. 실험-동물이 (인간) 유전자이식 실험-동물인, 실시태양 1 내지 16중 어느 하나에 따른 용도.

18. 실험-동물이 마우스 또는 래트 또는 기니아 피그(guinea pig) 또는 토끼인, 실시태양 1 내지 17중 어느 하나에 따른 용도.

19. 실험-동물이 토끼인, 실시태양 1 내지 18중 어느 하나에 따른 용도.

20. 실험-동물이 래트인, 실시태양 1 내지 19중 어느 하나에 따른 용도.

21. 방법이 변성제를 사용하지 않는, 실시태양 1 내지 20중 어느 하나에 따른 용도.

22. 방법이 완전 프로이드 보조제를 사용하지 않는, 실시태양 1 내지 21중 어느 하나에 따른 용도.

23. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 1 내지 22중 어느 하나에 따른 용도.

24. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 1 내지 23중 어느 하나에 따른 용도.

25. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론의 잔기 30 내지 60으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는, 실시태양 1 내지 24중 어느 하나에 따른 용도.

26. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론의 잔기 1 내지 70으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는, 실시태양 1 내지 25중 어느 하나에 따른 용도.

27. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는, 실시태양 1 내지 26중 어느 하나에 따른 용도.

28. 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하는데 있어서의, 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 3회 면역화시키는 단계를 포함하고, 여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키는 방법의 용도

29. 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체(이때 이러한 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않음)를 생산하는데 있어서의, 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계를 포함하고, 여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키는 방법의 용도.

30. 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위한 방법.

31. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 미만의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 30에 따른 방법.

32. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 50%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 30 또는 31에 따른 방법.

33. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 60%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 30 내지 32중 어느 하나에 따른 방법.

34. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 70%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 30 내지 33중 어느 하나에 따른 방법.

35. 고유의 사이노몰구스 항원이, 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나가 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프인, 실시태양 30 내지 34중 어느 하나에 따른 용도.

36. 고유의 사이노몰구스 항원이 T 세포 항원인, 실시태양 30 내지 35중 어느 하나에 따른 방법.

37. 고유의 사이노몰구스 항원이 CD3 엡실론인, 실시태양 30 내지 36중 어느 하나에 따른 방법.

38. 고유의 사이노몰구스 항원이 CD3 엡실론이고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 (고유의) 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 실시태양 30 내지 37중 어느 하나에 따른 방법.

39. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 30 내지 38중 어느 하나에 따른 방법.

40. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 2회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 30 내지 39중 어느 하나에 따른 방법.

41. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 3회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 30 내지 40중 어느 하나에 따른 방법.

42. 면역화가 피내 적용, 근육내 적용 및 피하 적용을 포함하는, 실시태양 30 내지 41중 어느 하나에 따른 방법.

43. 면역화가 제1 단계로서의 피내 적용, 제2 단계로서의 근육내 적용 및 제3 단계로서의 피하 적용을 포함하는, 실시태양 30 내지 42중 어느 하나에 따른 방법.

44. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 일주일에 한번 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 30 내지 43중 어느 하나에 따른 방법.

45. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 일주일에 한번 3회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 30 내지 44중 어느 하나에 따른 방법.

46. 실험 동물이 유전자이식 실험 동물인, 실시태양 30 내지 45중 어느 하나에 따른 방법.

47. 실험-동물이 마우스 또는 래트 또는 기니아 피그 또는 토끼인, 실시태양 30 내지 46중 어느 하나에 따른 방법.

48. 실험-동물이 토끼인, 실시태양 30 내지 47중 어느 하나에 따른 방법.

49. 실험-동물이 래트인, 실시태양 30 내지 48중 어느 하나에 따른 방법

50. 방법이 변성제를 사용하지 않는, 실시태양 30 내지 49중 어느 하나에 따른 방법.

51. 방법이 완전 프로이드 보조제를 사용하지 않는, 실시태양 30 내지 50중 어느 하나에 따른 방법.

52. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 30 내지 51중 어느 하나에 따른 방법.

53. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 30 내지 52중 어느 하나에 따른 방법.

54. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론의 잔기 30 내지 60으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는, 실시태양 30 내지 53중 어느 하나에 따른 방법.

55. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론의 잔기 1 내지 70으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는, 실시태양 30 내지 54중 어느 하나에 따른 방법.

56. 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는, 실시태양 30 내지 55중 어느 하나에 따른 방법.

57. 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 3회 면역화시키는 단계를 포함하고, 여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키는, 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하기 위한 방법.

58. 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계를 포함하고, 여기서 1차 인간 PBL을 사용하지 않고 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키고 변성제를 사용하지 않고 면역원으로서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체(이때 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체는 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않음)를 생산하기 위한 방법.

59. a) 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 실시태양 30 내지 58중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생산하는 단계,

b) 단계 a)에서 생산된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,

c) 단계 b)의 세포를 배양하는 단계,

d) 세포 또는 배양 상청액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함함으로써 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하기 위한 방법.

60. a) 항체를 실시태양 30 내지 58중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생산하는 단계,

b) 단계 a)에서 생산된 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계,

c) 임의적으로 항체를 인간화시키는 단계,

d) 단계 b)에서 단리되거나 단계 c)에서 수득된 항체를 인코딩하는 핵산을 발현 벡터에서 클로닝하는 단계,

e) 단계 d)에서 수득된 발현 벡터에 의해 세포를 형질감염시키는 단계,

f) 단계 e)의 세포를 배양하는 단계,

g) 세포 또는 배양 상청액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함함으로써 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 재조합적으로 생산하기 위한 방법.

61. 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포, 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

62. 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

63. 항체가 (a) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 번호 6 내지 서열 번호 8로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는, 실시태양 61 또는 62에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

64. 항체가 (a) 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 6 내지 서열 번호 8로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 번호 9의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3를 포함하는, 실시태양 61 내지 63중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

65. (a) 서열 번호 10 및 서열 번호 11로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 실시태양 61 내지 64중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

66. 항체가 (a) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 실시태양 61 내지 65중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

67. (a) 서열 번호 14의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 번호 15의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는, 실시태양 61 내지 66중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

68. 서열 번호 14의 VH 서열을 포함하는, 실시태양 61 내지 67중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

69. 서열 번호 15의 VL 서열을 포함하는, 실시태양 61 내지 68중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

70. 서열 번호 14의 VH 서열 및 서열 번호 15의 VL 서열을 포함하는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

71. 실시태양 61 내지 70중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역컨주게이트.

72. 실시태양 61 내지 71중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.

73. 약제로서 사용하기 위한 실시태양 61 내지 72중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

74. 항체가 서열 번호 14의 토끼 VH 서열의 인간화된 변형체 및 서열 번호 15의 토끼 VL 서열의 인간화된 변형체를 포함하는, 실시태양 61 내지 73중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

75. 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체가 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 61 내지 74중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

76. 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체가 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키며 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는, 실시태양 61 내지 75중 어느 하나에 따른 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

77. 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

78. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 80% 미만의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 77에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

79. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 50%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 77 또는 78에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

80. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 60%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 77 내지 79중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

81. 고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 대해 80% 내지 70%의 서열 동일성을 갖는, 실시태양 77 내지 80중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

82. 고유의 사이노몰구스 항원이, 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나가 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프인, 실시태양 77 내지 81중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

83. 고유의 사이노몰구스 항원이 T 세포 항원인, 실시태양 77 내지 82중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

84. 고유의 사이노몰구스 항원이 CD3 엡실론인, 실시태양 77 내지 83중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

85. 고유의 사이노몰구스 항원이 CD3 엡실론이고 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 (고유의) 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 실시태양 77 내지 84중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

86. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 77 내지 85중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

87. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 2회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 77 내지 86중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

88. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 3회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 77 내지 87중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

89. 면역화가 피내 적용, 근육내 적용 및 피하 적용을 포함하는, 실시태양 77 내지 88중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

90. 면역화가 제1 단계로서의 피내 적용, 제2 단계로서의 근육내 적용 및 제3 단계로서의 피하 적용을 포함하는, 실시태양 77 내지 89중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

91. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 일주일에 한번 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 77 내지 90중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

92. 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL에 의해 일주일에 한번 3회 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는, 실시태양 77 내지 91중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

93. 실험 동물이 유전자이식 실험 동물인, 실시태양 77 내지 92중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

94. 실험-동물이 마우스 또는 래트 또는 기니아 피그 또는 토끼인, 실시태양 77 내지 93중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

95. 실험-동물이 토끼인, 실시태양 77 내지 94중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

96. 실험-동물이 래트인, 실시태양 77 내지 95중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

97. 방법이 변성제를 사용하지 않는, 실시태양 77 내지 96중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

98. 방법이 완전 프로이드 보조제를 사용하지 않는, 실시태양 77 내지 97중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

99. 항체가 인간 및 사이노몰구스 T 세포 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 77 내지 98중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

100. 항체가 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론, 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는, 실시태양 77 내지 99중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

101. 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론의 잔기 30 내지 60으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는, 실시태양 77 내지 100중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

102. 항체가 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론의 잔기 1 내지 70으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하지 않는, 실시태양 77 내지 101중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

103. 항체가 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는, 실시태양 77 내지 102중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

104. 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시킴(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)으로써 수득가능한, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 인간 T 세포를 활성화시키는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

105. 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시킴(여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴)으로써 수득가능한, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기위해 제공되고, 이의 진정한 범주는 첨부된 특허청구범위에 제시된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 제시된 절차로 변형이 이루어질 수 있음을 알아야 한다.

서열에 대한 설명

서열 번호 1 인간 CD3 엡실론 세포외 도메인의 잔기 77 내지 96의 아미노산 서열.

서열 번호 2 인간 CD3 엡실론의 세포외 도메인의 아미노산 서열.

서열 번호 3 전장 인간 CD3 엡실론의 아미노산 서열.

서열 번호 4 항체 클론 645의 HVR-H1 변형체 1의 아미노산 서열.

서열 번호 5 항체 클론 645의 HVR-H1 변형체 2의 아미노산 서열.

서열 번호 6 항체 클론 645의 HVR-H2 변형체 1의 아미노산 서열.

서열 번호 7 항체 클론 645의 HVR-H2 변형체 2의 아미노산 서열.

서열 번호 8 항체 클론 645의 HVR-H2 변형체 3의 아미노산 서열.

서열 번호 9 항체 클론 645의 HVR-H3의 아미노산 서열.

서열 번호 10 항체 클론 645의 HVR-L1 변형체 1의 아미노산 서열.

서열 번호 11 항체 클론 645의 HVR-L1 변형체 2의 아미노산 서열.

서열 번호 12 항체 클론 645의 HVR-L2의 아미노산 서열.

서열 번호 13 항체 클론 645의 HVR-L3의 아미노산 서열.

서열 번호 14 항체 클론 645의 중쇄 가변성 영역(VH)의 아미노산 서열.

서열 번호 15 항체 클론 645의 경쇄 가변성 영역(VL)의 아미노산 서열.

서열 번호 16 인간 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 17 Fc(홀)의 아미노산 서열.

서열 번호 18 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 19 인간 CD3e-스톡-Fc(노브)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 20 인간 CD3d-스톡-Fc(홀)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 21 인간 CD3gC85-스톡-Fc(홀)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 22 사이노몰구스 CD3e 스톡-Fc(노브)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 23 사이노몰구스 CD3d 스톡-Fc(홀)-Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 24 인간 CD3e-1-26-Fc(노브)Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 25 사이노몰구스 CD3e 5-26-Fc(노브)Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 26 인간 CD3e 5-26-Fc(노브)Avi 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열.

서열 번호 27 전장 사이노몰구스 CD3 엡실론의 아미노산 서열.

서열 번호 28 사이노몰구스 CD3 엡실론 세포외 도메인의 아미노산 서열.

서열 번호 29 사이노몰구스 CD3 엡실론의 잔기 69 내지 88의 아미노산 서열.

서열 번호 30 프라이머 rbHCfinal.up의 누클레오티드 서열.

서열 번호 31 프라이머 rbHCfinal.do의 누클레오티드 서열.

서열 번호 32 프라이머 rbLCfinal.up의 누클레오티드 서열.

서열 번호 33 프라이머 rbLCfinal.do의 누클레오티드 서열.

도 1: 인간 및 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀) 융합 폴리펩티드의 개략적 그림
도 2: SDS-PAGE 겔: 4 내지 12% 비스/트리스
a) 1 - 마크(Mark) 12[인비트로겐(Invitrogen)], 2 - 인간 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀) 환원됨
b) 1 - 하이마크(HiMark)(인비트로겐), 2 - CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀) 비환원됨
c) 1 - 마크 12(인비트로겐), 2 - 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀) 환원됨; 3 - 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀) 비환원됨
도 3: a) 인간 및 사이노몰구스 CD3e 스톡Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀) 융합 폴리펩티드,
b) 인간 CD3e 스톡Fc(노브)-Avi/CD3gC85-스톡-Fc(홀) 융합 폴리펩티드,
c) 인간 CD3e-1-26-Fc(노브)Avi/Fc(홀), 인간 및 사이노몰구스 CD3e 5-26-Fc(노브)Avi/Fc(홀) 융합 폴리펩티드의 개략적 그림
도 4: 대표적 SDS-PAGE 겔: 4-12% 비스/트리스
a) 1 - 마크 12(인비트로겐), 2 - 인간 CD3e 스톡Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀) 환원됨;
b) 1 - 하이마크(인비트로겐), 2 - 인간 CD3e 스톡Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀) 비환원됨
도 5: 인간 T 림프구의 발현에 대한 그래프적 표시
도 6: 인간 T 세포를 활성화시키는 시험된 항체의 능력을 평가하기 위한 칼슘 플럭스 검정(96-웰 형식)
a) 결합된 항 CD3 항체의 가교결합이 없는 칼슘 플럭스 검정
b) 개선된 감도를 위해 결합된 항 CD3 항체의 가교결합을 갖는 칼슘 플럭스 검정
도 7: 인간 T 세포를 활성화시키는 시험된 항체의 능력을 평가하기 위한 칼슘 플럭스 검정(384-웰 형식)
a) 결합된 항 CD3 항체의 가교결합이 없는 칼슘 플럭스 검정
b) 개선된 감도를 위해 결합된 항 CD3 항체의 가교결합을 갖는 칼슘 플럭스 검정
도 8: 인간 T 세포에 대한, 생성된 mAb 대 항-CD3 기준 항체(SP34-2)의 결합 비교
도 9: 사이노몰구스 T 세포에 대한, 생성된 mAb 대 항-CD3 기준 항체(SP34-2)의 결합 비교

재료 및 방법

실시예 1

1A) 제1 면역화 캠페인(campaign)을 위한 재조합 인간 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀) 및 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)의 제조

제1 면역화 캠페인을 위해, CD3g-쇄와의 융합물로 CD3e를 포함하는 인간 및 사이노몰구스 재조합 단백질을 생산하였다. 인간 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi(서열 번호 16) 및 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi(서열 번호 18)는 Fc(홀)(서열 번호 17)과 공동-발현된 C-말단 Avi-태그를 갖는 Fc(노브)에 융합된 글리신-세린 연결기((G4S)5)에 의해 연결된 CD3e 및 CD3g의 엑토도메인(ectodomain)을 갖는 재조합 단백질이다(도 1).

폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 상응하는 포유동물 발현 벡터로 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시킴으로써 상기 분자를 생산한다. 상응하는 발현 벡터에 의해 1:1 비율("벡터 항원-Fc(홀)":"벡터 항원-Fc(노브)")로 상기 세포를 형질감염시킨다.

HEK293-EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액중에 배양한다. 500 ㎖ 들이 진탕 플라스크에서 생산하기 위해, 400 밀리온의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 이전에 24 시간 종자배양한다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g로 원심분리시키고, 상청액을 미리-가온된 20 ㎖의 CD CHO 배지로 대체한다. 발현 벡터를 20 ㎖의 CD CHO 배지에서 200 ㎍의 DNA의 최종량으로 혼합한다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초 동안 와동시키고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 항온처리한다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 들이 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% C0₂ 분위기의 항온처리기에서 항온처리한다. 항온처리 시간 후, 160 ㎖의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양한다. 형질감염 후 1일에, 1 mM 발프로산 및 7% 프리드(Feed) 1을 첨가한다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 x g로 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 아지드화 나트륨을 0.01 중량/부피%의 최종 농도로 첨가하고, 4℃에서 유지시킨다.

분비된 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해, 이어서 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제한다.

친화도 크로마토그래피를 위해, 40 ㎖의 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM NaCl, 0.01% (부피/부피) 트윈(Tween)-20, pH 7.5로 평형화된 하이트랩(HiTrap) 단백질A HP 칼럼(CV=5 ㎖, GE 헬쓰케어) 상에 상청액을 적재한다. 결합되지 않은 단백질을 적어도 10개 칼럼 부피의 평형 완충액으로 세척하여 제거한다. 표적 단백질을 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM 염화 나트륨, 0.01%(부피/부피) 트윈-20, pH 3.0으로 20개 칼럼 부피에 대한 선형 pH-구배로 용출한다. 칼럼을 후속적으로 10개 칼럼 부피의 20 mM 시트르산 나트륨, 500 mM NaCl, 0.01%(부피/부피) 트윈-20, pH 3.0으로 세척한다.

단백질 용액을 1/10의 0.5M 인산 나트륨의 첨가에 의해 중화시킨다. 표적 단백질을 농축시킨 후, 0.01%(부피/부피) 트윈-20이 함유된 pH 7.4의 2 mM MOPS, 150 mM 염화 나트륨 용액으로 평형화된 하이로드 수퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 칼럼(GE 헬쓰케어) 상에 적재한다.

아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 결정한다. 항체의 순도 및 분자량을 환원제(5 mM 1,4-디티오트레이톨)의 존재 및 부재하에, 쿠마시(Coomassie)[심플블루(SimpleBlue: 상표명) 세이프스테인(SafeStain), 인비트로겐]로 염색하여 SDS-PAGE에 의해 분석한다(도 2a 내지 2c). 누파게(NuPAGE: 등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐, USA)을 제조업체의 지시에 따라 사용한다(4 내지 12%의 트리스-아세테이트 겔 또는 4 내지 12%의 비스-트리스). 항체 샘플의 응집물 함량을 25℃하에 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0.02%(중량/부피) NaN₃(pH 7.3) 이동 완충액에서 평형화된 수퍼덱스(Superdex)200 10/300GL 분석용 크기-배제 칼럼[토소(Tosoh)]에 의해 분석하였다.

응집물 함량의 결정

단백질	분석용 SEC
	HMW[%]	단량체[%]	LMW[%]
인간 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)	0.95	99.05	0
사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)	0	100	0

1B) 면역화로부터 생성된 IgG의 특징화를 위한 재조합 인간 CD3e-스톡-Fc(노브)-Avi/ CD3d - 스톡 - Fc (홀), 인간 CD3e - 스톡 - Fc ( 노브 )-Avi/ CD3gC85 - 스톡 - Fc (홀), 사이노몰구스 CD3e 스톡 - Fc ( 노브 )-Avi/ CD3d - 스톡 - Fc (홀), 인간 CD3e -1-26- Fc ( 노브 )-Avi/Fc(홀), 인간 CD3e 5-26- Fc ( 노브 )-Avi/ Fc (홀) 및 사이노몰구스 CD3e 5-26-Fc(노브)Avi/Fc(홀)의 제조

면역화에 의해 생성된 CD3e에 대항하는 항체를 특징짓기 위해, 몇몇 재조합 단백질을 생산하였다(도 3a 내지 3c). 인간 CD3e-스톡-Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀)(서열 번호 19/서열 번호 20), 인간 CD3e-스톡-Fc(노브)-Avi/CD3gC85-스톡-Fc(홀)(서열 번호 19/서열 번호 21) 및 사이노몰구스 CD3e 스톡-Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀)(서열 번호 22/서열 번호 23)은, Fc(홀)에 융합된 CD3d 또는 CD3g의 엑토 도메인과 공동-발현된 C-말단 Avi-태그를 갖는 Fc(노브)에 융합된 스톡 영역을 포함하는 CD3e의 완전한 엑토도메인을 갖는 재조합 단백질이다. 인간 CD3e-1-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)(서열 번호 24/서열 번호 17), 인간 CD3e 5-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)(서열 번호 26/서열 번호 17) 및 사이노몰구스 CD3e 5-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)(서열 번호 25/서열 번호 17)은 Fc(홀)과 공동-발현된 Fc(노브)의 펩티드 융합물이다. 인간 CD3e-1-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)은 성숙한 CD3e의 처음 26개 아미노산을 포함하는 반면, 인간 및 사이노몰구스 CD3e 5-26-Fc(노브)Avi/Fc(홀)은 성숙한 CD3e의 아미노산 잔기 5 내지 26의 펩티드 융합물이다.

폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 상응하는 포유동물 발현 벡터에 의해 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시켜 상기 분자를 생산한다. 상기 세포를 상응하는 발현 벡터에 의해 1:1 비율("벡터 항원-Fc(홀)":"벡터 항원-Fc(노브)")로 형질감염시킨다.

HEK293-EBNA 세포를 CD CHO 배양 배지에서 무혈청 현탁액중에 배양한다. 500 ㎖ 들이 진탕 플라스크에서 생산하기 위해, 400 밀리온의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 이전에 24 시간 종자배양한다. 형질감염을 위해, 세포를 5 분 동안 210 x g로 원심분리시키고, 상청액을 미리-가온된 20 ㎖의 CD CHO 배지로 대체한다. 발현 벡터를 20 ㎖의 CD CHO 배지에서 200 ㎍의 DNA의 최종량으로 혼합한다. 540 ㎕의 PEI를 첨가한 후, 용액을 15 초 동안 와동시키고, 후속적으로 10 분 동안 실온에서 항온처리한다. 이후 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 500 ㎖ 들이 진탕 플라스크로 옮기고, 3 시간 동안 37℃로 5% C0₂ 분위기의 항온처리기에서 항온처리한다. 항온처리 시간 후, 160 ㎖의 F17 배지를 첨가하고, 세포를 24 시간 동안 배양한다. 형질감염 후 1일에, 1 mM 발프로산 및 7% 프리드(Feed) 1을 첨가한다. 7일 후, 배양 상청액을 정제를 위해 15 분 동안 210 x g로 원심분리함으로써 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터), 아지드화 나트륨을 0.01 중량/부피%의 최종 농도로 첨가하고, 4℃에서 유지시킨다

분비된 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해, 이어서 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제한다.

아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 결정한다. 항체의 순도 및 분자량을 환원제(5 mM 1,4-디티오트레이톨)의 존재 및 부재하에, 쿠마시[심플블루(상표명) 세이프스테인, 인비트로겐]로 염색하여 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 누파게(등록상표) 프리-캐스트 겔 시스템(인비트로겐, USA)을 제조업체의 지시에 따라 사용한다(4 내지 12%의 트리스-아세테이트 겔 또는 4 내지 12%의 비스-트리스)(도 3A 및 3B). 항체 샘플의 응집물 함량을 25℃하에 25 mM K₂HP0₄, 125 mM NaCl, 200mM L-아르기닌 일염산염, 0.02%(중량/부피) NaN₃(pH 6.7) 이동 완충액에서 평형화된 TSK겔 G3000 SW XL 분석용 크기-배제 칼럼(토소)에 의해 분석하였다.

응집물 함량의 결정

단백질	분석용 SEC
	HMW[%]	단량체[%]	LMW[%]
인간 CD3e-스톡-Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀)	4.3	95.7	0
인간 CD3e-스톡-Fc(노브)-Avi/CD3gC85-스톡-Fc(홀)	0	100	0
사이노몰구스 CD3e 스톡-Fc(노브)-Avi/CD3d-스톡-Fc(홀)	0	100	0
인간 CD3e-1-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)	0.7	86.3	13.0
사이노몰구스 CD3e 5-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)	0	100	0
인간 CD3e 5-26-Fc(노브)-Avi/Fc(홀)	0	82.9	17.1

또한, 하기 인간 및 사이노몰구스 CD3e 펩티드를 신규 항체의 에피토프의 정련을 위해 생성하였다:

a) 비오틴-연결기-인간 CD3e 아미노산 1-22

b) 인간 CD3e 아미노산 1-22-연결기-비오틴

c) 비오틴-연결기-사이노몰구스 CD3e 아미노산 1-22

d) 사이노몰구스 CD3e 아미노산 1-22-연결기-비오틴

e) 비오틴-연결기-인간 CD3e 아미노산 77-96(서열 번호 1)

f) 인간 CD3e 아미노산 77-96(서열 번호 1)-연결기-비오틴

g) 비오틴-연결기-사이노몰구스 CD3e 아미노산 69-88(서열 번호 29)

h) 사이노몰구스 CD3e 아미노산 69-88(서열 번호 29)-연결기-비오틴

모든 가능한 에피토프로의 접근성을 가능하게 하기 위해 스크리닝 검정(달리 지시되지 않는다면)에서 변형체 둘 다의 혼합물로서 사용되는 N- 또는 C-말단 비오틴에 의해 상기 4개의 펩티드를 합성하였고, 예를 들어 비오티닐화된 말단이 항체로부터의 하나의 에피토프를 차단한다면, 동일한 펩티드의 나머지 비오틴 변형체는 이러한 항체의 결합을 허용할 것이다.

실시예 2

토끼의 면역화

제1 면역화 캠페인

찰스 리버 래보레이토리즈 인터내셔널 인코포레이티드(Charles River Laboratories International, Inc.)로부터의 NZW 토끼를 면역화하기 위해 사용하였다.

재조합 인간 및 사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi 단백질을 K₃PO₄ 완충액(pH 7.0)중에 1 mg/㎖의 농도로 용해시키고, 안정한 유화액이 생성될 때까지 완전 프로이드 보조제(CFA)와 혼합하였다(1:1). 3마리의 토끼에게 2.4 ㎖의 유화액을 피내(i.d.) 주사하고, 이어서 제2의 근육내(i.m.) 주사 및 제3의 피하(s.c.) 주사를 각각 1 주일 간격으로 1.2 ㎖씩 제공하였다. 1.2 ㎖의 제4 i.m. 주사를 3주 후에 수행하고, 이어서 2회의 추가의 1.2 ㎖의 s.c. 및 i.m. 주사를 4주 간격으로 제공하였다. 사이노몰구스 재조합 단백질을 1차, 2차, 4차, 및 6차 면역화에 사용하였고, 인간 재조합 단백질을 3차 및 5차 면역화에 사용하였다.

각각의 동물의 10 ㎖의 말초 전혈 샘플을 3차, 4차, 5차 및 6차 주사후 4 일째 수집하고, FACS에서 단일 세포 분류에 사용하였다. 각각의 동물의 추가적인 0.5 ㎖의 혈청을 동일한 시간에 수집하고, 인간/사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi 특이적 항체 반응의 결정을 위해 사용하였다.

세마리 토끼로 이루어진 제2 그룹을 상기 기재된 면역화 스케쥴에 따라 4 x 10⁷의 강화된 1차 사이노몰구스/인간 T 세포(아래 참조)로 면역화시켰다. 사이노몰구스 시험관내 팽창된 T 세포를 1차, 2차, 4차, 및 6차 면역화에 사용하였고, 건강한 공여자의 PBL로부터 강화된 인간 1차 T 세포를 3차 및 5차 면역화에 사용하였다. 각각의 동물의 10 ㎖의 말초 전혈 샘플을 3차, 4차, 5차 및 6차 주사후 4 내지 6 일째 수집하고, FACS에서 단일 세포 분류에 사용하였다. 각각의 동물의 추가적인 0.5 ㎖의 혈청을 동일한 시간에 수집하고, 인간/사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi 특이적 항체 반응의 결정을 위해 사용하였다.

항체 반응

면역화에 대한 항체 반응을 ELISA를 사용하여 혈청의 연속 희석물에 의해 결정하였고, 여기서 웰당 2.5 ㎍의 재조합 인간/사이노몰구스 CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(노브)-Avi를 1 x PBS에서 4℃하에 하룻밤 맥시소브(Maxisorb) 96 웰 미량정량판[눈크(Nunc)] 상에서 항온처리하였다. 검출을 위해, 호스래디쉬 퍼옥시다아제[더 잭슨 래버레이토리(The Jackson laboratory)]에 연결된 염소 항-토끼 IgG를 1:16000 희석률로 사용하였다. 시각화를 위해 테트라메틸벤지딘(TMB)을 침전시키는 BM 블루 POD 기질을 사용준비된 용액[로슈(Roche)]으로 사용하였다. 반응을 1N HCl을 통해 중단시키고, 450/690 nm로 테칸 인피니트(Tecan Infinite)에서 측정하였다.

면역화를 위한 항원으로서의 1차 인간 T 세포의 생성

1차 인간 T 세포를, 로세테셉(RosetteSep) 인간 T 세포 강화 칵테일(Enrichment Cocktail)[스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)]에 의해 제조업체의 지시에 따라 6명의 건강한 인간 공여자의 200 ㎖의 전혈로부터 단리하였다. 생성된 T 세포의 품질 및 세포 수를 세포 계수 장치 XT-1800 iVET[시스멕스(Sysmex)]에 의해 확인하였다(표 4). 생성된 T 세포의 품질 및 순도에 대한 분석을 위해, CD3-, CD4- 및 CD8-양성 T 세포를 검출하는 BD로부터의 트리테스트(TriTest)를 이용하는 FACS 분석을 사용하였다(표 5). 또한, 이들 T 세포의 생존력을 PI(요오드화 프로피듐) FACS 염색에 의해 평가하였고, 모든 샘플의 경우 99.6% 이상이 생존가능한 세포였다. 면역화할 때까지 저장하는 동안, 시스멕스 장치에 의해 측정된 세포 수를 사용하여, T 세포를 액체 질소에서 별도로 각각의 공여자에 대해 4.6 x 10⁷ 및 1.15 x 10⁷ 세포로서 동결시켰다.

사이노몰구스 T-림프구의 제조 및 시험관내 팽창

피콜-파크(Ficoll-Paque)(GE 헬쓰케어)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 림프구를 사이노몰구스 혈액[코밴스(Covance)]으로부터 단리하였다. 간단히, 10 ㎖의 헤파린화된 혈액을 동일한 부피의 RPMI-1640 배지(인비트로겐)로 희석시키고, 5 ㎖ 분취량의 희석된 혈액을 15 ㎖의 팔콘(Falcon) 튜브중 5 ㎖의 피콜-파크의 상부 위에 적층시켰다. 800 x g에서 45 분 동안 실온에서 원심분리한 후(w/o 분리), 림프구 함유 분별물을 수거하고, 합치고, 제2 구배 원심분리하여 림프구 모집단의 순도를 증가시켰다. 이를 위해, 대략 6 ㎖의 합쳐진 분별물을 18 ㎖의 RPMI-1640 배지로 희석시키고, 6 ㎖ 분취량의 희석된 세포 상청액을 15 ㎖의 팔콘 튜브중 3 ㎖의 피콜-파크의 상부 위에 적층시켰다. 800 x g에서 30 분 동안 실온에서 원심분리한 후(w/o 분리), 림프구를 수거하고 합쳤다. PBS로 세척한 후, 림프구를 10% 태아 소 혈청, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1 x 항생제-항진균제가 보충된 RPMI-1640 배지중에 6.0E+05 세포/㎖로 재현탁시켰다(배지 및 보충제는 인비트로겐으로부터 구입함). 세포를 20 ㎍/㎖의 콘카나발린(concanavalin) A[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]의 존재하에 3 일 동안 37℃에서, 5% C0₂의 습윤화된 분위기하에 배양하였다. 이후, 배지를 교환하고 세포를 10% 태아 소 혈청, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1 x 항생제-항진균제, 및 20 U/㎖의 인간 IL-2(로슈)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 9 일 동안 배양하였다. 이러한 배양 기간 동안, IL-2 함유 배지를 2 내지 3일 마다 교환하였다. 세포 생존력 및 세포 수를 배양 기간에 걸쳐 모니터링하고, 시험관내 팽창된 사이노몰구스 T-림프구의 CD3 발현을, 항-CD3 mAb[클론 SP34; BD 파르민겐(BD Pharmingen)]를 사용하여 유세포 분석에 의해 입증하였다. 시험관내 팽창된 T-림프구(생존력 > 80 %)를 수거하고, PBS로 세척하고, 동결 배지(10% DMSO, 90% FCS)에서 1.0E+07 세포/㎖로 재현탁시켰다. 분취량의 세포를 액체 질소에서 저장하였다.

제2 면역화 캠페인

사이노몰구스 T-림프구의 제조 및 시험관내 팽창

피콜-파크(GE 헬쓰케어)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 림프구를 사이노몰구스 혈액(코밴스)으로부터 단리하였다. 간단히, 10 ㎖의 헤파린화된 혈액을 동일한 부피의 RPMI-1640 배지(인비트로겐)로 희석시키고, 9 내지 10 ㎖ 분취량의 희석된 혈액을 15 ㎖의 팔콘 튜브중 5 ㎖의 피콜-파크의 상부 위에 적층시켰다. 800 x g에서 45 분 동안 실온에서 원심분리한 후(w/o 분리), 림프구 함유 분별물을 수거하고, 합치고, 제2 구배 원심분리하여 림프구 모집단의 순도를 증가시켰다. 이를 위해, 대략 합쳐진 분별물을 희석된 초기 부피로 RPMI-1640 배지로 희석시키고, 9 내지 10 ㎖ 분취량의 희석된 세포 상청액을 15 ㎖의 팔콘 튜브중 5 ㎖의 피콜-파크의 상부 위에 적층시켰다. 800 x g에서 30 분 동안 실온에서 원심분리한 후(w/o 분리), 림프구를 수거하고 합쳤다. PBS로 세척한 후, 림프구를 10% 태아 소 혈청, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1 x 항생제-항진균제가 보충된 RPMI-1640 배지중에 6.0E+05 세포/㎖로 재현탁시켰다(배지 및 보충제는 인비트로겐으로부터 구입함). 세포를 20 ㎍/㎖의 콘카나발린 A(시그마-알드리치) 및 20 U/㎖의 인간 IL-2(로슈)의 존재하에 3 일 동안 37℃에서, 5% C0₂의 습윤화된 분위기하에 배양하였다. 이후, 배지를 교환하고 세포를 10% 태아 소 혈청, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1 x 항생제-항진균제, 및 20 U/㎖의 인간 IL-2(로슈)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 9 일 동안 배양하였다. 이러한 배양 기간 동안, IL-2 함유 배지를 2 내지 3일 마다 교환하였다. 세포 생존력 및 세포 수를 배양 기간에 걸쳐 모니터링하고, 시험관내 팽창된 사이노몰구스 T-림프구의 CD3 발현을, 항-CD3 mAb(클론 SP34; BD 파르민겐)를 사용하여 유세포 분석에 의해 입증하였다. 시험관내 팽창된 T-림프구(생존력 > 90 %)를 수거하고, PBS로 세척하고, 동결 배지(10% DMSO, 90% FCS)에서 1.0E+07 세포/㎖로 재현탁시켰다. 분취량의 세포를 액체 질소에서 저장하였다.

인간 T-림프구의 제조 및 시험관내 팽창

류코셉(Leukosep)[그라이너 바이오 원(Greiner Bio One), 227 288]을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 림프구를 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 단리하였다. 간단히, 헤파린화된 혈액을 3배 부피의 PBS로 희석시키고, 25 ㎖ 분취량의 희석된 혈액을 50 ㎖의 류코셉에 적층시켰다. 800 x g에서 15 분 동안 실온에서 원심분리한 후(w/o 분리), 림프구 함유 분별물을 수거하고, PBS에서 세척하고, 10% 태아 소 혈청, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1 x 항생제-항진균제가 보충된 RPMI-1640 배지중에 1.OE+06 세포/㎖로 재현탁시켰다(배지 및 보충제는 인비트로겐으로부터 구입함). 세포를 T175 플라스크중에서 10 ㎍/㎖의 콘카나발린 A(시그마-알드리치)의 존재하에 2 일 동안 37℃에서, 5% C0₂의 습윤화된 분위기하에 배양하였다. 이후, 배지를 교환하고 세포를 10% 태아 소 혈청, 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1 x NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1 x 항생제-항진균제, 및 20 U/㎖의 인간 IL-2(로슈)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 추가의 7 일 동안 배양하였다. 이러한 배양 기간 동안, 세포를 2 내지 3일마다 1.OE+06 세포/㎖로 분할하고 IL-2 함유 배지를 교환하였다. 세포 생존력 및 세포 수를 배양 기간에 걸쳐 모니터링하고(도 5), 시험관내 팽창된 인간 T-림프구의 CD3 발현을, 항-CD3 mAb(클론 V9)를 사용하여 유세포 분석에 의해 입증하였다. 시험관내 팽창된 T-림프구(생존력 > 90 %)를 수거하고, PBS로 세척하고, 동결 배지(10% DMSO, 90% FCS)에서 1.0E+07 세포/㎖로 재현탁시켰다. 분취량의 세포를 액체 질소에서 저장하였다.

면역화

3마리 토끼를 T 세포에 대해 강화된(상기 기재된 바와 같음) 사이노몰구스 및 인간 PBL로 면역화시켰다. 각각의 면역화를 위해, 동결 세포를 해동하고, 계수하고, 원심분리에 의해 동결 배지로부터 분리하고, 주사를 위한 적절한 부피로 PBS에 재현탁시켰다. 각각의 토끼에게 0일에 PBS에 재현탁된 6 x 10⁷의 사이노몰구스 PBL을 1회 피내 적용하고; 이후 1회 근육내 및 1회 피하로 4 x 10⁷의 사이노몰구스 PBL을 7일 및 14일에 각각 적용하고, 21 일째 처음으로 채혈하였다.

각각 3 내지 5 x 10⁷ PBL에 의한 3회의 추가적인 면역화를 위해, 기원 종 뿐만 아니라 적용 경로를 변경하였고: 동물에게 인간 PBL을 7 주 및 20 주에 2회 근육내 적용하고, 사이노몰구스 PBL을 11 주에 1회 피하 적용하였다.

혈액(추정된 총 혈액 부피의 10%)을 21 일, 및 각각의 추가적인 면역화 이후 5 내지 7일째 채취하였다. FACS에 의한 역가 결정을 위해 사용되는 혈청을 제조하고, 말초 단핵 세포를 단리하였고, 이를 B 세포 클로닝 과정에서 항원-특이적 B 세포의 공급원으로서 사용하였다(실시예 3).

실시예 3

B 세포 클로닝

토끼 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단리

3마리의 토끼(실시예 "토끼의 면역화"에 기재됨)를 혈액 공급원으로서 사용하였다. EDTA 함유 전혈을 1 x PBS(PAA, 오스트리아 파슁)에 의해 2배로 희석한 다음, 제조업체의 세부사항에 따라 포유동물 림프구[세다래인 래보레이토리즈(Cedarlane Laboratories), 캐나다 온타리오주 부를링턴]를 사용하여 밀도 원심분리하였다. PBMC를 1 x PBS로 2회 세척하였다.

EL-4 B5 배지

10% FCS[하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로간], 2mM 글루타민, 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin) 용액(PAA, 오스트리아 파슁), 2mM 피루브산 나트륨, lOmM HEPES[팬 바이오텍(Pan Biotech), 독일 아이덴바흐] 및 0,05 mM b-머캅토에탄올[깁코(Gibco), 스코틀랜드 페이슬리]에 의해 보충된 RPMI 1640(팬 바이오텍, 독일 아이덴바흐)

대식세포/단핵세포의 결핍

멸균 6-웰 플레이트(세포 배양 등급)를 사용하여 비특이적 접착을 통해 대식세포 및 단핵세포를 결핍시켰다. 각각의 웰을 4 ㎖의 배지 및 면역화된 토끼로부터의 6 x l0⁶ 이하의 PBMC로 최대로 충전시키고, 항온처리기에서 1 시간 동안 37℃에서 결합하도록 허용하였다. 상청액(말초 혈액 림프구(PBL))중의 세포를 항원 패닝(panning) 단계에 사용하였다.

플레이트의 코팅

단백질 패닝을 위해, 멸균 스트렙타비딘 코팅된 6-웰 플레이트[마이크로코트(Microcoat), 독일 베른리에드]를 PBS중 2 ㎍/㎖의 비오티닐화된 인간 CD3e 단백질 변형체(표 6 참조)에 의해 3 시간 동안 실온에서 코팅하였다. 각각의 단백질 변형체를 별도로 코팅하였다. 인간 표면 CD3-세포 상에서의 패닝을 가능하게 하기 위해, CD3-양성 주르캣 T 세포를 태아 소 혈청(FCS)이 없는 멸균 세포 배양 6-웰 플레이트에서 종자배양하고 즉시 원심분리하였다. 1 내지 4 시간 배양한 후, 합류성(confluent) 세포 단층이 생성되었다. 패닝 이전에, 이들 6-웰 플레이트를 멸균 PBS로 3회 조심스럽게 세척하였다.

인간 CD3e 단백질 변형체 상에서의 B 세포의 강화

항원 특이적 말초 B 세포의 강화를 위해, 인간 CD3e 단백질 변형체로 코팅되거나 인간 CD3-양성 주르캣 T 세포가 덮힌 6-웰 조직 배양 플레이트를 4 ㎖의 배지당 6 x l0⁶ 이하의 PBL과 함께 종자배양하고, 1 시간 동안 37℃에서 5% C0₂하에 결합되도록 허용하였다. 이후, 1 x PBS로 1 내지 2회 웰을 조심스럽게 세척함으로써 비접착성 세포를 제거하였다. 남아 있는 점성의 세포를 10 분 동안 37℃에서 5% C0₂하에 트립신에 의해 탈착시켰다. 트립신화(trypsination)를 EL-4 B5 배지로 중단시켰다. 면역 형광 염색을 수행할 때까지 세포를 얼음 상에 유지시켰다.

면역 형광 염색 및 유세포 분석

항-IgG FITC[AbD 세로텍(AbD Serotec), 독일 뒤셀도르프]를 단일 세포 분류에 사용하였다. 표면 염색을 위해, 결핍 및 강화 단계로부터의 세포를 항-IgG FITC 항체와 함께 PBS에서 항온처리하고, 암실에서 45 분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 염색 후, PBMC를 빙냉된 PBS로 2회 세척하였다. 최종적으로 PBMC를 빙냉된 PBS에 재현탁시키고 즉시 FACS 분석하였다. 5 ㎍/㎖ 농도의 요오드화 프로피듐(BD 파르민겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 첨가한 후, 사세포와 생세포를 구별하기 위해 FACS 분석을 수행하였다.

컴퓨터 및 FACSDiva 소프트웨어가 구비된 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson) FACSAria[BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국]를 단일 세포 분류에 사용하였다.

B-세포 배양

토끼 B 세포의 배양을 주블러(Zubler) 등(1985)에 의해 기재된 방법과 유사한 방법에 의해 준비하였다. 간단히, 판소르빈(Pansorbin)세포(1:100000)[칼바이오켐(Calbiochem)(메르크: Merck), 독일 다름스타트], 5% 토끼 흉선 세포 상청액[charge TSN-M13(10242), 마이크로코트, 독일 베른리에드] 및 감마-조사된 뮤린 EL-4-B5 흉선종 세포(2.5 x 10⁴/웰)가 함유된 200 ㎕/웰의 EL-4 B5 배지를 갖는 96-웰 플레이트에서 단일 분류된 토끼 B 세포를 7 일 동안 37℃에서 5% C0₂의 대기하에 항온처리기에서 항온처리하였다. B-세포 배양액의 상청액을 스크리닝을 위해 제거하고, 남은 세포를 즉시 수거하고, -80℃하에 100 ㎕의 RLT 완충액[퀴아겐(Qiagen), 독일 힐덴] 중에서 동결시켰다.

V-도메인의 PCR 증폭 및 서열분석

누클레오스핀(NucleoSpin) 8/96 RNA 키트[마쉐레이&나겔((Macherey&Nagel); 740709.4, 740698]를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 제조하였다. 모든 단계를 엡모션(epMotion) 5075 액체 취급 시스템[에펜도르프(Eppendorf)] 상에서 실행하였다. RNA를 60 ㎕의 리보누클레아제 자유수(RNase free water)로 용출시켰다. 수퍼스크립트(Superscript) III 퍼스트-스트랜드 신테시스 수퍼믹스(First-Strand Synthesis SuperMix)(인비트로겐 18080-400) 및 올리고 dT-프라이머를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 역전사 반응에 의해 cDNA를 생성하기 위해 6 ㎕의 RNA를 사용하였다. 중쇄를 위해 프라이머 rbHCfinal.up 및 rbHCfinal.do를 사용하고 경쇄를 위해 rbLCfinal.up 및 rbLCfinal.do(서열 번호 30 내지 33)를 사용하여 50 ㎕의 최종 부피로 어큐프라임 수퍼믹스(AccuPrime Supermix)(인비트로겐 12344-040)에 의해 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변성 영역(VH 및 VL)을 증폭시키기 위해 4 ㎕의 cDNA를 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 5 분 동안 고온 출발; 94℃에서 20 초, 70℃에서 20 초, 68℃에서 45 초의 35회 주기, 및 68℃에서 7 분 동안의 최종 연장.

50 ㎕의 PCR 용액중 8 ㎕를 48 E-겔 2%(인비트로겐 G8008-02) 상에 적재하였다. 양성 PCR 반응물을 누클레오스핀 익스트랙트(NucleoSpin Extract) II 키트(마쉐레이&나겔; 740609250)에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 세정하고, 50 ㎕의 용출 완충액으로 용출시켰다. 12 ㎕의 정제된 PCR 생성물을, 중쇄를 위해 rbHCfinal.up 및 rbHCfinal.do를 사용하고 경쇄를 위해 rbLCfinal.up 및 rbLCfinal.do(서열 번호 30 내지 33)를 사용하여 양쪽 방향으로 직접적으로 서열분석하였다.

토끼 단일클론성 항체 및 토끼/마우스 키메라성 항체의 재조합 발현

토끼 단일클론성 항체의 재조합 발현을 위해, VH 또는 VL을 코딩하는 PCR-생성물을 cDNA로서 발현 벡터내로 오버행(overhang) 클로닝 방법에 의해 클로닝하였다[하운(RS Haun) 등의 문헌 "Biotechniques (1992) 13, 515-518"; 리(MZ Li) 등의 문헌 "Nature Methods (2007) 4, 251-256"].

토끼 카파 또는 감마 불변성 영역 및 VH 삽입물의 VL을 코딩하는 선형화된 발현 플라스미드를, 중첩 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.

정제된 PCR 생성물을, 단일-스트랜드 오버행을 생성하는 T4 DNA-폴리머라아제와 함께 항온처리하였다. 반응을 dCTP 첨가에 의해 중단시켰다.

다음 단계에서, 플라스미드 및 삽입물을 조합하고, 자리 특이적 재조합을 유도하는 recA와 함께 항온처리하였다. 재조합된 플라스미드를 이. 콜라이내로 형질전환시켰다. 다음날, 성장된 콜로니를 따고, 플라스미드 제조, 제한 분석 및 DNA-서열분석에 의해 정확히 재조합된 플라스미드에 대해 시험하였다.

항체 발현을 위해, 단리된 HC 및 LC 플라스미드를 일시적으로 HEK293 세포내로 공동-형질감염시키고, 상청액을 1 주일 후 수거하였다.

실시예 4

인간 및 사이노몰구스 T 세포에 의한 기능성 활성 검정(Ca 플럭스)

CD3 중재된 칼슘 플럭스 검정의 확립

항-CD3 mAb의 작용 활성을 스크리닝하기 위해, 칼슘 플럭스 검정을 CD3-양성(주르캣 E6-1) 및 CD3-음성(주르캣 RT3-T3.5) 인간 T-세포주에 의해 확립하였다. 검정을 96-웰 형식(2차 스크리닝)으로 또는 384-웰 형식(1차 고 처리량 스크리닝)으로 수행하였다.

96-웰 형식

CD3-양성 주르캣 E6-1 세포 또는 CD3-음성 주르캣 RT3-T3.5를 흑색-벽을 갖고 바닥이 투명한 96-웰 플레이트(BD 팔콘)에 웰당 50 ㎕의 무혈청 배지(RPMI 1640/2 mM 글루타민/1 mM 피루브산 나트륨/10 mM HEPES/O.1 mM NEAA)중 200,000개 세포로 플레이팅하였다. 세포에 칼슘 민감성 염료[FLIPR(등록상표) 칼슘 5 검정 키트, 몰레큘라 디바이시즈]를 적재하였다. 염료의 저장 용액을 제조업체의 지시에 따라 제조하였다. 사용하기 직전에 프로베네시드를 첨가하고, 50 ㎕/웰의 희석된 염료를 세포에 첨가하였다(프로베네시드의 최종 농도는 2.5 mM/웰일 것이다). 효율적인 적재를 위하여, 세포를 염료와 함께 2 시간 동안 실온에서 암실에서 항온처리하였다. 후속적으로, 20 ㎕의 토끼 항-CD3 mAb(토끼 B-세포 상청액) 또는 키메라성 V9 mAb의 연속 희석물, 즉 토끼 면역글로불린 불변성 영역 및 인간화된 항-CD3 mAb V9의 가변성 영역으로 구성된 키메라성 항-CD3 항체를 첨가하여 세포를 자극시켰다. 비특이적 다중클론성 토끼 IgG는 음성 대조군으로서 작용하였다. 형광(485 nm ex./530 nm em.)을 30 초의 시간 간격으로 7.5 내지 10 분 동안 측정함으로써 항-CD3 유도된 칼슘 플럭스의 동력학을 모니터링하였다. 키메라성 V9 mAb에 의해 유도된 칼슘 플럭스는 도 6a에 도시되어 있다. 이러한 데이터로부터, 검정이 작용물질 항-CD3 mAb를 대략 37 ng/㎖의 최소한의 농도에 의해 검출할 수 있도록 허용함을 알 수 있다(검정에서 최종 mAb 농도: 6.2 ng/㎖; 신호 대 잡음 비 > 2). 키메라성 V9 mAb는 CD3-음성 주르캣 RT3-T3.5 세포에서가 아닌 CD3-양성 주르캣 E6-1 세포에서만 칼슘 동원을 유도하였고, 이는 효과에 대한 CD3 의존성을 입증한다. 유사하게, 세포가 비특이적 토끼 IgG로 처리될 경우 칼슘 플럭스는 관찰되지 않았다.

검정의 감도를 증가시키기 위해, 추가적인 단계를 도입하여 세포 표면에 CD3 결합된 mAb를 가교결합시켰다. 따라서, 세포를 상기 기재된 바와 같이 항-CD3 mAb(토끼 B-세포 상청액 또는 키메라성 V9 mAb)에 의해 자극시켰고, 초기 CD3 중재된 칼슘 플럭스를 7.5 내지 10 분 동안 모니터링하였다. 이후 CD3 결합된 mAb를 20 ㎕의 Fc-특이적 염소 항-토끼 IgG(c=7.5 ㎍/㎖; 잭슨 이뮤노 리써치)의 첨가에 의해 가교결합시키고, 형광(485 nm ex./530 nm em.)을 추가적인 7.5 내지 10 분 동안 기록하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 2차 항-토끼 항체에 의한 세포 표면 결합된 항-CD3 mAb(키메라성 V9)의 가교결합은 초기 신호와 비교하여 향상된 신호 대 잡음 비를 가지면서 추가적인 칼슘 플럭스를 유도하였다. 검정의 변형은 검정의 감도를 향상시켰고, 항-CD3 mAb를 대략 12 ng/㎖ 만큼 낮은 농도에서 검출할 수 있도록 허용하였다(검정에서 최종 mAb 농도: 2 ng/㎖).

384-웰 형식

CD3-양성 주르캣 E6-1 세포 또는 CD3-음성 주르캣 RT3-T3.5를 흑색-벽을 갖고 바닥이 투명한 384-웰 플레이트[코닝(Corning)]에 웰당 25 ㎕의 무혈청 배지(RPMI 1640/2 mM 글루타민/1 mM 피루브산 나트륨/10 mM HEPES/O.1 mM NEAA)중 100,000개 세포로 플레이팅하였다. 세포에 칼슘 민감성 염료[FLIPR(등록상표) 칼슘 5 검정 키트, 몰레큘라 디바이시즈]를 적재하였다. 염료의 저장 용액을 제조업체의 지시에 따라 제조하였다. 사용하기 직전에 프로베네시드를 첨가하고, 25 ㎕/웰의 희석된 염료를 세포에 첨가하였다(프로베네시드의 최종 농도는 2.5 mM/웰일 것이다). 효율적인 적재를 위하여, 세포를 염료와 함께 2 시간 동안 실온에서 암실에서 항온처리하였다. 후속적으로, 세포를 10 ㎕의 토끼 항-CD3 mAb(토끼 B-세포 상청액) 또는 키메라성 V9 mAb의 연속 희석물, 즉 토끼 면역글로불린 불변성 영역 및 인간화된 항-CD3 mAb V9의 가변성 영역으로 구성된 키메라성 항-CD3 항체를 첨가하여 세포를 자극시켰다. 비특이적 다중클론성 토끼 IgG는 음성 대조군으로서 작용하였다. 형광(485 nm ex./530 nm em.)을 30 초의 시간 간격으로 7.5 내지 10 분 동안 측정함으로써 항-CD3 유도된 칼슘 플럭스의 동력학을 모니터링하였다. 키메라성 V9 mAb에 의해 유도된 칼슘 플럭스는 도 7a에 도시되어 있다. 이러한 데이터로부터, 검정이 작용물질 항-CD3 mAb를 대략 25 ng/㎖의 최소한의 농도에 의해 검출할 수 있도록 허용함을 알 수 있다(검정에서 최종 mAb 농도: 4.2 ng/㎖; 신호 대 잡음 비 > 2). 키메라성 V9 mAb는 CD3-음성 주르캣 RT3-T3.5 세포에서가 아닌 CD3-양성 주르캣 E6-1 세포에서만 칼슘 동원을 유도하였고, 이는 효과에 대한 CD3 의존성을 입증한다. 유사하게, 세포가 비특이적 토끼 IgG(이소타입 대조군)로 처리될 경우 칼슘 플럭스는 관찰되지 않았다.

검정의 감도를 증가시키기 위해, 추가적인 단계를 도입하여 세포 표면에 CD3 결합된 mAb를 가교결합시켰다. 따라서, 세포를 상기 기재된 바와 같이 항-CD3 mAb(토끼 B-세포 상청액 또는 키메라성 V9 mAb)에 의해 자극시켰고, 초기 CD3 중재된 칼슘 플럭스를 7.5 내지 10 분 동안 모니터링하였다. 이후 CD3 결합된 mAb를 10 ㎕의 Fc-특이적 염소 항-토끼 IgG(c=7.5 ㎍/㎖; 잭슨 이뮤노 리써치)의 첨가에 의해 가교결합시키고, 형광(485 nm ex./530 nm em.)을 추가적인 7.5 내지 10 분 동안 기록하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 2차 항-토끼 항체에 의한 세포 표면 결합된 항-CD3 mAb(키메라성 V9)의 가교결합은 항-CD3 mAb의 낮은 농도에서 향상된 신호 대 잡음 비를 가지면서 추가적인 칼슘 플럭스를 유도하였다. 검정의 변형은 검정의 감도를 향상시켰고, 항-CD3 mAb를 대략 10 ng/㎖ 만큼 낮은 농도에서 검출할 수 있도록 하였다(검정에서 최종 mAb 농도: 1.7 ng/㎖).

칼슘 플럭스 검정

클론	칼슘 유입
417	예
426	아니오
432	아니오
446	아니오
450	예
463	아니오
590	아니오
596	아니오
621	아니오
627	예
628	아니오
632	아니오
645	예
647	아니오
659	아니오
693	예
695	예
704	예

실시예 5

인간 및 사이노몰구스 CD3 단백질 및 펩티드로의 결합

인간 및 사이노몰구스 CD3 단백질 및 펩티드로의 항-CD3 항체의 결합을 ELISA에 의해 결정하였다. 비오티닐화된 표적 단백질 및 펩티드를 DPBS[팬 바이오텍 게엠베하(PAN Biotech GmbH), 독일, 카탈로그 번호 P0436500] 중에서 4℃에서 하룻밤 항온처리함으로써 384-웰 스트렙타비딘-코팅된 미량정량판(맥시소브; 마이크로코트, 독일, 카탈로그 번호 11974998/MC1099) 상에 25 ㎕/웰로 고정화시켰다. 표적 농도는 표 8에 언급된 모든 단백질 및 펩티드에 대해 250 ng/㎖였고, 단 사이노몰구스 CD3 펩티드 1-22 및 인간 CD3 펩티드 77-96은 제외되는데, 이는 1000 ng/㎖의 농도로 고정화되었다. 사용되는 펩티드는 연결기를 통해 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부착되는 비오틴과 함께 생산되었다. 표적 결합을 위해, ELISA N- 및 C-말단 비오티닐화된 펩티드를 미량정량판 상의 고정화를 위해 1:1 비율로 혼합하고(표 8) 별도로 사용하였다(표 8). 세척 완충액[1X PBS(로슈, 카탈로그 번호 1666789)중 0.1% 트윈 20(USB, 카탈로그 번호 20605)]으로 3회 세척 단계를 수행한 후, 재조합 항-CD3 항체[25 ㎕/웰, 0.5% BSA(소 혈청 알부민 분별물 V, 지방산 없음, 로슈, #10735078001)중의 연속 희석물, 1X PBS중 0.05% 트윈 20]를 첨가하고, 회전 교반기에서 실온에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 세척 완충액(90 ㎕/웰)으로 3회 세척하였다. 항체를 1X PBS(w/0.5% BSA, w/0.05% 트윈 20)중 1:5000으로 희석된 퍼옥시다아제-연결되고, 종-특이적인 항-토끼 IgG[F(ab')2 단편, 당나귀로부터, 독일, 카탈로그 번호 NA 9340]에 의해 1 시간 동안 실온에서 검출하였다. 검출 항체를 세척 완충액으로 4회 세척하여 제거하고, TMB 기질(TMB 용액, 로슈)을 첨가하여 신호를 발생시켰다. 고정된 시간 간격 이후 EX370 nm/EM492 nm에서 흡광도를 판독하였다.

결합 ELISA로부터의 결과는, 클론 596 및 클론 645가 각각 아미노산 77 내지 96(인간 CD3e) 및 69 내지 88(사이노몰구스 CD3e)로 구성된 에피토프 영역에서 인간 및 사이노몰구스 CD3e에 결합함을 보여준다.

FACS에 기초한 세포 결합 연구: 인간 및 사이노몰구스 팽창된 T 세포로의 결합

생성된 항-CD3 항체의 세포 결합을 평가하기 위해, 인간 및 사이노몰구스 팽창된 T 세포에 의한 FACS에 기초한 결합 검정을 수행하였다. 간단히, 동결된 T 세포(실시예 2)를 해동시키고, 동결 배지로부터 원심분리에 의해 분리하고, 주르캣 세포 배지에 2 x 10⁶ 세포/㎖로 현탁시켰다. 50 ㎕의 세포 분취량을 항-CD3 항체의 연속 희석물(BD FACS 완충액중 10 ㎍/㎖ 내지 0.01 ㎍/㎖)과 함께 1 시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. BD FACS 완충액으로 세척한 후, 세포를 이들의 기원에 따라서 BD FACS 완충액중 알렉사(Alexa)488 표지화된 항-토끼 IgG H+L(인비트로겐 34732A) 또는 항-마우스 IgG H+L(인비트로겐 65E1-1) 또는 항-인간 IgG H+L(인비트로겐 A11013) 10 ㎍/㎖에 의해 1 시간 동안 4℃에서 염색하였다. 세척 및 원심분리후, 염색된 세포의 MFI 신호를 BD 바이오사이언시즈 FACS칸토(Canto) 유세포 분석기에 의해 분석하였다.

FACS에 기초한 세포 결합 연구로부터의 결과는, 클론 450, 클론 627 및 클론 645가 항-CD3 기준 항체(SP34-2= CH2527 및 H2C)에 필적할 만하게 사이노몰구스 T 세포에 결합하는 반면, OKT3 및 UCHT1 항-CD3 기준 항체가 사이노몰구스 T 세포에 결합하지 않음을 보여준다(도 8 및 도 9).

실시예 6

결합 에피토프의 특징화

N- 및 C-말단 비오티닐화된 인간 및 사이노몰구스 CD3 펩티드에 대한 항-CD3 항체 클론 645의 결합을 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결정하였다(실시예 5)

N- 및 C-말단 비오티닐화된 인간 및 사이노몰구스 CD3 펩티드에 대한 클론 645의 결합

항체	huCD3 77-96 펩티드 C-말단 비오티닐화됨	huCD3 77-96 펩티드 N-말단 비오티닐화됨	cyCD3 69-88 펩티드 C-말단 비오티닐화됨	cyCD3 69-88 펩티드 N-말단 비오티닐화됨
Mab.645	-	+	+	+
기호설명: - = 비결합 + = 결합

결합 ELISA로부터의 결과는, 클론 645가 C-말단 융합된 비오틴을 경유하여 스트렙타비딘-코팅된 미량적량판 상에 고정화된 인간 CD3 77-96 펩티드에 결합하지 않음을 보여준다. 그러나, 클론 645는 N-말단으로 고정화될 경우 동일한 펩티드에, 뿐만 아니라 사이노몰구스 CD3 펩티드 69 내지 88 둘 다에 비오틴 융합 자리와 무관하게 결합된다.

실시예 8

항-CD3e 항체의 결합 친화도 KD 값

비아코어 T100 기기(GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 클론 645 항체의 인간 및 사이노몰구스 CD3e에 대한 결합을 조사하였다. 대략 2000 공명 단위(RU)의 포획 시스템(10 ㎍/㎖의 염소 항 토끼 IgG Fc 단편 특이적; 명령 코드: 111-005-046; 잭슨 이뮤노 리써치)을, GE 헬쓰케어에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 CM4 칩(GE 헬쓰케어, BR-1005-34) 상에 pH 5.0에서 커플링하였다. 고정화를 위한 이동 완충액은 HBS-N pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, GE 헬쓰케어, BR-1006-70)였다. 수반되는 동력학적 검정을 위해 이동 및 희석 완충액은 HBS-P pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4, GE 헬쓰케어, BR-1006-71)였다. 유동 세포를 25℃로 설정하고- 샘플 차단을 12℃로 설정함 -, 이동 완충액으로 2회 전처리하였다. 1 ㎍/㎖의 용액을 60 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 주입하여 클론 645 항체를 포획하였다. 용액중 다양한 농도로 인간 CD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀 또는 사이노몰구스 CD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀을 180 초 동안 30 ㎕/분의 유속으로 1350 nM에서 출발하여 주입하고, 이후 1:1.5배 희석률 및 추가로 1:3 희석률로 주입함으로써 회합을 측정하였다. 해리 상을 300 초까지 모니터링하고, 동일한 용액으로부터 이동 완충액으로 전환시킴으로써 개시하였다. 글리신 pH 1.7 용액으로 60 초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 2회 연속 주입하여 세척함으로써 표면을 재생시켰다. 염소 항 토끼 IgG Fc 표면으로부터 수득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절 지수 차이를 보정하였다. 블랭크 주입을 또한 차감하였다(= 2중 참조). KD 및 다른 동력학적 매개변수를 계산하기 위해, 랑뮤 1:1 모델을 사용하였다.

클론 645의 CD3e에 대한 동력학적 친화도

	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(μM)
인간 CD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀	1.7E+04	0.104	6.1
사이노몰구스 CD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀	2.1E+04	0.013	0.62

표면 플라스몬 공명에 의해 인간 및 사이노몰구스 표적, huCD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀 및 cyCD3e(스톡)Fc-노브-CD3d(스톡)Fc홀과 상호작용하는 클론 645를 측정한다. 상기 표는 단일 측정으로부터 유도된 값을 보여준다(k_a: 회합 속도; k_d: 해리 속도; K_D: 친화도).

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies binding to human and cynomolgus CD3 epsilon <130> P32142-WO <140> PCT/EP2015/061457 <141> 2015-05-22 <150> EP14170140.9 <151> 2014-05-28 <150> EP14180572.1 <151> 2014-08-11 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Arg Ala Arg Val 20 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro 20 25 30 Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys 50 55 60 Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg 85 90 95 Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 100 105 <210> 3 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 HVR-H1-1 <400> 4 Ser Phe Ser Gly Thr Tyr Trp Ile Cys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 HVR-H1-2 <400> 5 Gly Thr Tyr Trp Ile 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-H2-1 <400> 6 Cys Ile Ser Thr Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-H2-2 <400> 7 Thr Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-H2-3 <400> 8 Thr Asp Ser 1 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-H3 <400> 9 Ser Ala Tyr Ala Ser Glu Gly Tyr Ala Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-L1-1 <400> 10 Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-L1-2 <400> 11 Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Asn Asn Asn 1 5 10 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-L2 <400> 12 Tyr Ala Ser Thr Leu Ala 1 5 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645HVR-L3 <400> 13 Thr Gly Trp Lys Ser Ile Thr Thr Asp Gly Met Gly Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 VH <400> 14 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Leu Thr Leu Thr Cys Leu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser 35 40 45 Gly Thr Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Cys Ile Ser Thr Asp Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr 85 90 95 Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Asn 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Ala Ser Glu Gly Tyr Ala Leu Trp Gly 115 120 125 Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr 145 150 155 <210> 15 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 VL <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 15 Met Asp Xaa Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser 20 25 30 Lys Ser Val Pro Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Glu Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Thr Gly Trp Lys Ser Ile Thr Thr Asp Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly 115 120 125 Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu 130 135 140 Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile 145 150 155 160 Val Cys Val Ala Asn Lys 165 <210> 16 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(knob)-Avi <400> 16 Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu 1 5 10 15 Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr 20 25 30 Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys 35 40 45 Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln 50 55 60 Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly Asn Glu Glu Met 100 105 110 Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr 115 120 125 Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln 130 135 140 His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly 145 150 155 160 Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln 165 170 175 Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala 180 185 190 Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val Gly Ser Glu Gln Leu Tyr 195 200 205 Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg 340 345 350 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu 435 440 445 Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 450 455 460 <210> 17 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc(hole) <400> 17 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 18 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cynomolgus CD3g(G4S)5CD3e-AcTev-Fc(knob)-Avi <400> 18 Gln Ser Phe Glu Glu Asn Arg Lys Leu Asn Val Tyr Asn Gln Glu Asp 1 5 10 15 Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys His Val Lys Asn Thr Asn Ile Thr Trp 20 25 30 Phe Lys Glu Gly Lys Met Ile Asp Ile Leu Thr Ala His Lys Asn Lys 35 40 45 Trp Asn Leu Gly Ser Asn Thr Lys Asp Pro Arg Gly Val Tyr Gln Cys 50 55 60 Lys Gly Ser Lys Asp Lys Ser Lys Thr Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met 100 105 110 Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr 115 120 125 Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln 130 135 140 His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro 145 150 155 160 Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 165 170 175 Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg 180 185 190 Val Gly Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala 195 200 205 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 210 215 220 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 225 230 235 240 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 245 250 255 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 260 265 270 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 275 280 285 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 290 295 300 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 305 310 315 320 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 325 330 335 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 340 345 350 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 355 360 365 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 370 375 380 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 385 390 395 400 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 405 410 415 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 420 425 430 Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile 435 440 445 Glu Trp His Glu 450 <210> 19 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3e-stalk-Fc(knob)-Avi <400> 19 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro 20 25 30 Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys 50 55 60 Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 65 70 75 80 Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg 85 90 95 Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser 100 105 110 Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 115 120 125 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 130 135 140 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 145 150 155 160 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 165 170 175 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 180 185 190 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 195 200 205 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 210 215 220 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 225 230 235 240 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 245 250 255 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 260 265 270 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 275 280 285 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 290 295 300 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 305 310 315 320 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 325 330 335 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 340 345 350 Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 355 360 <210> 20 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3d-stalk-Fc(hole)-Avi <400> 20 Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys 1 5 10 15 Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr 50 55 60 Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln 65 70 75 80 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 85 90 95 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 100 105 110 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 115 120 125 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 130 135 140 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 145 150 155 160 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 165 170 175 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 180 185 190 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 195 200 205 Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 210 215 220 Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 225 230 235 240 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 245 250 255 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 260 265 270 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 275 280 285 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 290 295 300 Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 305 310 315 320 Ile Glu Trp His Glu 325 <210> 21 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3gC85-stalk-Fc(hole)-Avi <400> 21 Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu 1 5 10 15 Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr 20 25 30 Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys 35 40 45 Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln 50 55 60 Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Met Cys Gln Asn Gly Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Lys Thr 85 90 95 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 100 105 110 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 115 120 125 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 130 135 140 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 145 150 155 160 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 165 170 175 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 180 185 190 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 195 200 205 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 210 215 220 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 225 230 235 240 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 245 250 255 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 275 280 285 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 290 295 300 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 315 320 Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His 325 330 335 Glu <210> 22 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cynomolgus CD3e stalk-Fc(knob)-Avi <400> 22 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu 20 25 30 Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser 35 40 45 Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly 50 55 60 Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His 65 70 75 80 His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln 85 90 95 Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr 100 105 110 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 130 135 140 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 145 150 155 160 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 165 170 175 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 180 185 190 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 195 200 205 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 210 215 220 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 225 230 235 240 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 245 250 255 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 260 265 270 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 275 280 285 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 290 295 300 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 305 310 315 320 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly 325 330 335 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 340 345 350 <210> 23 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cynomolgus CD3d-stalk-Fc(hole)-Avi <400> 23 Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Lys Cys 1 5 10 15 Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Thr 20 25 30 Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Ala 50 55 60 Val Gln Val His Tyr Arg Met Ser Gln Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu 65 70 75 80 Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys 85 90 95 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 100 105 110 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 115 120 125 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 130 135 140 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 145 150 155 160 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 165 170 175 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 180 185 190 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 195 200 205 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser 210 215 220 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys 225 230 235 240 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 245 250 255 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 260 265 270 Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 275 280 285 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 290 295 300 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly 305 310 315 320 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 325 330 <210> 24 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3e 1-27 - Fc(knob)Avi <400> 24 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Gly Ser Glu Gln Leu 20 25 30 Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys 35 40 45 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 50 55 60 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 65 70 75 80 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 85 90 95 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 100 105 110 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 115 120 125 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 130 135 140 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 145 150 155 160 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys 165 170 175 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys 180 185 190 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 195 200 205 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 210 215 220 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 225 230 235 240 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 245 250 255 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly 260 265 270 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 275 280 285 <210> 25 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cynomolgus CD3e 6-27 - Fc(knob)Avi <400> 25 Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Thr Val Ile Leu Thr Gly Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 35 40 45 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 50 55 60 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 65 70 75 80 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 85 90 95 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 115 120 125 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 130 135 140 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 145 150 155 160 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 165 170 175 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 180 185 190 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 195 200 205 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 210 215 220 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 225 230 235 240 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 245 250 255 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe 260 265 270 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 275 280 <210> 26 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3e 6-27 - Fc(knob)Avi <400> 26 Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Thr Val Ile Leu Thr Gly Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly 20 25 30 Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 35 40 45 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 50 55 60 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 65 70 75 80 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 85 90 95 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 115 120 125 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 130 135 140 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 145 150 155 160 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 165 170 175 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 180 185 190 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 195 200 205 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 210 215 220 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 225 230 235 240 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 245 250 255 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe 260 265 270 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 275 280 <210> 27 <211> 197 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 27 Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 50 55 60 Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 100 105 110 Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 115 120 125 Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 130 135 140 Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 165 170 175 Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 180 185 190 Leu Asn Gln Arg Arg 195 <210> 28 <211> 96 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 28 Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln 1 5 10 15 Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu 20 25 30 Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser 35 40 45 Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly 50 55 60 Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His 65 70 75 80 His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp 85 90 95 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 29 Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Lys Ala Arg Val 20 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rbHCfinal.up <400> 30 aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rbHCfinal.do <400> 31 ccattggtga gggtgcccga g 21 <210> 32 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rbLCfinal.up <400> 32 aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rbLCfinal.do <400> 33 cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26 <210> 34 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD3e(D1-5) stalk-Fc(knob)-Avi <400> 34 Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu 20 25 30 Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn 35 40 45 Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu 50 55 60 Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val Ser Glu Asn Cys 85 90 95 Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp 100 105 110 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 130 135 140 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 145 150 155 160 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 165 170 175 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 180 185 190 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 195 200 205 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 210 215 220 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 225 230 235 240 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 245 250 255 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 260 265 270 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 275 280 285 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 290 295 300 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 305 310 315 320 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 330 335 Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 340 345 350 Trp His Glu 355

Claims (15)

1. 인간 사이노몰구스(cynomolgus) 교차-반응성 항체를 생산하는데 있어서의, 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 인간 이외의 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는 방법의 용도.
2. 제1항에 있어서,
   고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나가 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프인 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   고유의 사이노몰구스 항원이 분화 클러스터 3(CD3: cluster of differentiation 3) 엡실론이고, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 서열 번호 2의 (고유의) 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 용도.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
   인간 이외의 실험-동물이 1차 사이노몰구스 말초 혈액 림프구(PBL: peripheral blood lymphocyte)로 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는 용도.
5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
   면역화가 제1 단계로서의 피내 적용, 제2 단계로서의 근육내 적용, 및 제3 단계로서의 피하 적용을 포함하는 용도.
6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
   방법이 변성제를 사용하지 않는 용도.
7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
   인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체가 인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론, 및 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키는 용도.
8. 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체를 생산하는데 있어서의, 인간 이외의 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계를 포함하고, 여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키는 방법의 용도.
9. 유일한 항원으로서 고유의 사이노몰구스 항원으로 인간 이외의 실험-동물을 면역화시키는 단계를 포함하는, 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체의 제조 방법.
10. 제9항에 있어서,
    고유의 사이노몰구스 항원이 상응하는 인간 항원에 존재하는 하나 이상의 (인접한) 아미노산 연장부가 결핍되고, 여기서 상응하는 인간 항원에서 결핍된 (인접한) 아미노산 연장부중 하나가 인간 항원의 주요 면역원성 에피토프인 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    인간 이외의 실험-동물이 1차 사이노몰구스 PBL로 1회 이상 면역화되고, 여기서 PBL이 임의적으로 T 세포에 대해 강화되는 방법.
12. 제9항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    면역화가 제1 단계로서의 피내 적용, 제2 단계로서의 근육내 적용, 및 제3 단계로서의 피하 적용을 포함하는 방법.
13. 인간 이외의 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키는 단계를 포함하고, 여기서 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시키는, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체의 제조 방법.
14. 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고 인간 T 세포를 활성화시키는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.
15. 인간 이외의 실험-동물을 1차 사이노몰구스 PBL로 3회 면역화시키되, 1차 인간 PBL을 면역원으로서 사용하지 않고 변성제를 사용하지 않으면서 PBL을 임의적으로 T 세포에 대해 강화시킴으로써 수득가능한, 서열 번호 2의 인간 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열 번호 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, 인간 및 사이노몰구스 T 세포에 특이적으로 결합하고, 인간 T 세포를 활성화시키며, 항체 OKT3, 항체 UCHT1 및/또는 항체 SP34와 동일한 에피토프에 결합하지 않는 인간 사이노몰구스 교차-반응성 항체.

Images