KR20160146795A - 유기 화합물에 대한 반합성 경로 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향료에 사용되는 화합물을 포함하는 산업적으로 가치 있는 화합물을 제공하기 위해 유기 중간체의 미생물 생산 및 후속 합성 형질전환을 조합한 공정에 관한 것이다.

Description

유기 화합물에 대한 반합성 경로{SEMISYNTHETIC ROUTES TO ORGANIC COMPOUNDS}

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2014년 4월 10일에 출원된 미국 가출원 61/978,176의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용이 본 명세서에서 인용-참조된다.

분야

본 발명은 산업적으로 가치있는 화합물을 제공하기 위해 유기 중간체의 생합성 생산 및 후속 합성 형질전환(synthetic transformation)을 조합한 공정에 관한 것이다.

지방산 유도체는 산업 약품(industrial agent)의 성분으로서 다수의 상업적 용도를 갖는다. 하지만, 이를 생산하는 순수한 화학적 방법들은 유해 시약의 사용을 요구할 수 있고, 및/또는 에너지 집약적 또는 환경 비친화적일 수 있다. 반대로, 석유화학 또는 유지화학 공급원료(oleochemical feedstock)로부터의 기존의 순수 발효 경로는 화학적 생산 방법들에 비해 여전히 너무 고가일 수 있고, 만들어질 수 있는 제품들의 타입이 제한적이다.

향료 성분(fragrance ingredient)의 현재 공급은 세 가지 경로에 기초한다: (i) 식물 또는 동물로부터의 추출, (ⅱ) 석유화학제로부터의 총 화학적 합성, 및 (ⅲ) 유지화학물질의 진균 생물형질전환(fungal biotransformation). 식물 또는 동물로부터 얻어지는 향료는 천연 향료로 간주되고, 이러한 것으로서 높은 소비자 수요가 있으며, 고가에 팔린다. 하지만, 통상적으로 이러한 향료 화합물들은 간혹 희귀 식물 또는 야생 동물에 미량으로만 존재하고, 또한 조절하기 어려운 요인들, 예를 들어 날씨의 영향 및 식물 질병의 위험에 강하게 의존하기 때문에, 공급이 제한된다. 향료 성분에 대한 단연 가장 일반적인 경로는 석유화학 전구체들로부터의 총 화학적 합성과 천연 재료의 추출 및 정제이다. 이러한 향료들이 천연 향료들의 공급 문제를 피해 가더라도, 이들은 합성이고, 소비자가 천연이라고 여기지 않으며, 또한 예를 들어 천연 암브레톨리드 대 합성 이소암브레톨리드와 같이, 대부분의 경우 천연 향료와 구조 면에서 동일하지 않다. 진균 생물형질전환으로부터 유래되는 향료 화합물은 천연으로 간주될 수 있지만, 이러한 화합물은 비싼 유지화학 공급원료를 이용하고, 이 방법에 의해 접근가능한 향료 화합물들의 수가 제한되기 때문에 다소 수익성이 없다(rather marginal).

대조적으로, 탄소계 공급원료로부터 미생물-유래된 지방산 유도체를 통한 본 화학-효소 방법(chemo-enzymatic method)은, 조절되고 비용-효율적인 공정을 이용함으로써 많은 천연 향료 성분을 상당량 생산할 수 있다. 이러한 향료 성분은, 탄소계 공급원료를 이용하여 생물, 즉 미생물로부터 유래되기 때문에 천연이다.

요약

몇몇 측면들에서, 본 명세서에 개시된 구현예들은 하나 이상의 변경된 효소 기능성을 포함하는 하나 이상의 대사 변형(metabolic modification)을 포괄하는 재조합 미생물을 배양하는 단계 - 미생물은 생체 내에서(in vivo) 적어도 하나의 타입의 지방산 유도체를 생산하고, 배양은 탄소계 공급원료로 수행됨 -, 및 락톤 또는 매크로사이클릭 케톤(macrocyclic ketone)을 생산하기에 충분한 조건들 하에서 시약과 지방산 유도체를 생체 외에서(ex vivo) 접촉시키는 단계를 포함하는 향료 성분을 생성하는 화학-효소 공정들에 관한 것이다. 일 구현예에서, 탄소계 공급원료는 단순한 탄소원을 포괄한다. 또 다른 구현예에서, 탄소계 공급원료는 재생가능한 탄소원을 포괄한다.

본 발명의 일 측면은 대사 변형을 갖는 재조합 미생물을 배양하는 단계 - 미생물은 생체 내에서 적어도 하나의 타입의 지방산 유도체를 생산하고, 배양은 탄소계 공급원료로 수행됨 -, 및 락톤 또는 매크로사이클릭 케톤을 생산하기에 충분한 조건들 하에서 시약과 지방산 유도체를 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함하는 향료 성분을 생성하는 화학-효소 공정을 제공한다. 일 측면에서, 대사 변형은 변경된 효소 기능성을 포함한다. 일 구현예에서, 변경된 효소 기능성은 E.C. 3.1.2.- 또는 E.C. 2.1.1.5의 티오에스테라아제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변경된 효소 기능성은 E.C. 3.1.2.- 또는 E.C. 2.1.1.5의 티오에스테라아제와 E.C. 2.3.1.20의 에스테르 신타아제 둘 모두를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변경된 효소 기능성은 E.C. 1.14.15.3의 오메가-하이드록실라아제 또는 옥시게나아제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변경된 효소 기능성은 E.C. 1.14.15.3의 오메가-하이드록실라아제 또는 옥시게나아제와 EC 1.1.1.1/2, EC 1.1.3.13, EC 1.1.3.20, EC 1.2.1.3/4/5 또는 EC 1.2.3.1의 옥시다아제 또는 디하이드로게나아제 둘 모두를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대사 변형은 미생물 내에 포화 또는 불포화 지방산 유도체를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 지방산 유도체는 홀수 탄소 사슬, 메틸-분지(methyl-branching) 또는 이의 조합을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 향료 성분은 락톤 또는 매크로사이클릭 케톤이다. 또 다른 구현예에서, 향료 성분은 감마-락톤(γ-락톤), 델타-락톤(δ-락톤) 또는 이의 조합이다. 또 다른 구현예에서, 향료 성분은 C₈ 내지 C₁₈ 매크로락톤이다.

본 발명의 또 다른 측면은 접촉시키는 단계 이전에 지방산 유도체를 분리(isolate)시키는 단계를 더 포함하는 화학-효소 공정(위 참조)을 제공한다. 일 구현예에서, 접촉시키는 단계는 탈수화, 락톤화 또는 이의 조합을 포함한다. 또 다른 측면에서, 적어도 하나의 타입의 지방산 유도체는 재조합 미생물로부터 분비되고, 접촉시키는 단계는 배양하는 단계로부터 지방산 유도체를 분리하지 않고 수행된다. 일 구현예에서, 시약은 염산, 황산, 인산 및 회수가능한 수지산(recoverable resin acid)을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 양자성 산(protic acid)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 화학제(agent)는 오가노스태난 에스테르교환반응 촉매(organostannane transesterification catalyst), 구리 또는 아연 염, 실버 트리플레이트(silver triflate) 및 제올라이트를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 루이스 산(Lewis acid)이다. 또 다른 구현예에서, 시약은 펩티드 커플링제(peptide coupling agent)이다.

본 발명의 또 다른 측면은 화학-효소 공정(위 참조)을 제공하고, 지방산 유도체의 타입은 불포화 지방산, 불포화 지방산 에스테르, 오메가-하이드록시 지방산(ω-OH FA), 오메가-하이드록시 불포화 지방산(불포화 ω-OH FA), 오메가-하이드록시 지방산 에스테르(ω-OH 지방산 에스테르), 오메가-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 ω-OH 지방산 에스테르), 3-하이드록시 지방산(3-OH FA), 3-하이드록시 불포화 지방산(불포화 3-OH FA), 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르), 3-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 3-OH 지방산 에스테르), 알파-오메가-이산(α,ω-이산), 불포화 알파-오메가-이산(불포화 α,ω-이산), 알파-오메가-이산 에스테르(α,ω-이산 에스테르), 불포화 알파-오메가-이산 에스테르(불포화 α,ω-이산 에스테르), 및 이의 조합을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 일 구현예에서, 불포화 지방산은 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 불포화 지방산 에스테르는 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 불포화 지방산 에스테르는 불포화 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 불포화 지방산 에틸 에스테르(FAEE)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 불포화 FAME 또는 FAEE는 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 오메가-하이드록시 불포화 지방산(불포화 ω-OH FA)은 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 불포화 지방산 에스테르는 불포화 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 불포화 지방산 에틸 에스테르(FAEE)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르)는 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)이다. 또 다른 구현예에서, 오메가-하이드록시 지방산 에스테르(ω-OH 지방산 에스테르)는 오메가-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(ω-OH FAME) 또는 오메가-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(ω-OH FAEE)이다. 또 다른 구현예에서, 오메가-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 ω-OH 지방산 에스테르)는 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 단일불포화 오메가-하이드록시 지방산 에스테르(단일불포화 ω-OH 지방산 에스테르)는 오메가-하이드록시 단일불포화 지방산 메틸 에스테르(ω-OH 단일불포화 FAME) 및 오메가-하이드록시 단일불포화 지방산 에틸 에스테르(ω-OH 단일불포화 FAEE)를 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또 다른 구현예에서, 3-하이드록시 불포화 지방산(불포화 3-OH FA)은 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르)는 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)이다. 또 다른 구현예에서, 3-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 3-OH 지방산 에스테르)는 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 단일불포화 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르)는 3-하이드록시 단일불포화 지방산 메틸 에스테르(단일불포화 3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 단일불포화 지방산 에틸 에스테르(단일불포화 3-OH FAEE)이다. 또 다른 구현예에서, 불포화 알파-오메가-이산(불포화 α,ω-이산) 또는 불포화 알파-오메가-이산 에스테르(불포화 α,ω-이산 에스테르)는 단일불포화된다. 또 다른 구현예에서, 단일불포화 알파-오메가-이산 에스테르(단일불포화 α,ω-이산 에스테르)는 반산 에스테르(half-acid ester)이다. 또 다른 구현예에서, 반산 에스테르는 메틸 또는 에틸 에스테르이다. 또 다른 구현예에서, 단일불포화 알파-오메가-이산 에스테르(단일불포화 α,ω-이산 에스테르)는 디에스테르(diester)이다. 또 다른 구현예에서, 디에스테르는 메틸 디에스테르 또는 에틸 디에스테르이다.

상세한 설명

본 명세서에 개시된 구현예들은, 부분적으로, 델타(δ) 및 감마(γ) 락톤, 또는 매크로사이클릭 락톤- 및 매크로사이클릭 케톤 산물의 효율적인 제조를 제공하기 위해 합성 유기 화학적 형질전환과, 조작된(engineered) 생합성 경로를 이용하여 지방산 유도체를 합성할 수 있는 재조합 미생물의 배양을 조합한 공정들로 지향된다. 특히, 본 공정들은 재생가능한 바이오매스 유래 재료(즉, 재생가능한 공급원료), 예컨대 옥수수, 사탕수수 또는 목질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)로부터의 탄수화물; 또는 글리세롤, 플루-가스(flu-gas), 합성-가스(syn-gas)와 같은 폐기물(waste product); 또는 바이오매스 또는 천연 가스 또는 이산화탄소와 같은 유기 재료의 개량물(reformation)로부터 고급 중간 화합물(advanced intermediate compound)의 생산을 제공한다. 이는 이러한 중요한 화학물질의 생산을 위해 비용 효율적이고 재생가능한 대안적 소스를 제공한다. 본 공정들이 단순 재생가능한 공급원료로부터 양호한 선택성으로 고급 화합물을 제공하기 때문에, 종래의 합성 다단계 화학 합성과 비교할 때, 비용, 작동 단순성 및 환경적 이점 면에서 경제적인 장점이 있다.

본 명세서에 개시된 재조합 미생물은, 불포화, 수산화 및 에스테르화를 포함하는 변화된 유도체 기능성을 갖고, 짝수, 홀수 사슬 또는 메틸-분지쇄형 사슬을 포함하는, C₈ 내지 C₁₈ 사이의 또는 더 많은 탄소 원자들의 상이한 사슬 길이를 갖는 상업적인 양(commercial quantity)의 여러 다양한 지방산 유도체를 생산하도록 조작될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 명세서에 개시된 재조합 미생물은, 배양물로부터 분리 없이 제 자리에서(in situ) 합성 조작(synthetic manipulation)을 가능하게 하거나 산물 분리를 단순화하기 위해, 배양 배지(culture medium) 또는 발효 브로쓰(fermentation broth) 내로 결과적인 지방산 유도체를 분비할 수 있다. 본 명세서에 개시된 재조합 미생물에서 조작된 경로를 통한 지방산 유도체의 생산은, 자연적으로 발생하는 생합성 경로를 통하는 것보다 또는 종래의 합성 유기 화학 기술들을 통하는 것보다 높은 생산 수율을 야기할 수 있기 때문에 유용하다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 본문에 명확히 달리 명시되지 않는다면 복수의 지시대상(referent)을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "숙주 세포"에 대한 언급은 이러한 2 이상의 숙주 세포를 포함하고, "지방산"에 대한 언급은 하나 이상의 지방산 또는 지방산의 혼합물을 포함하며, "핵산 서열"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산 서열을 포함하고, "효소"에 대한 언급은 하나 이상의 효소를 포함하는 등이다.

"향료 성분"이라는 용어는, 명세서 및 청구항을 위해, 단독으로 사용될 수 있거나, 향료 또는 향수를 생성하기 위해 정유(essential oil) 및/또는 아로마 화합물 및/또는 보류제(fixative) 및/또는 용매의 혼합물 또는 조성물에 첨가될 수 있는 재료를 의미한다. 향료 또는 향수는 인체, 동물, 식품군, 물체 및/또는 생활 공간에 기분 좋은 향기를 더하는 데 사용된다. (매크로락톤을 포함하는) 락톤 및 매크로사이클릭 케톤은 향료 성분들의 예시이다. 다른 향료 성분들은 www.ifraorg.org의 웹사이트 IFRA(International Fragrance Association)에 나열되어 있다.

"매크로락톤"은 여하한의 매크로사이클릭 락톤이다. 일 구현예에서, 매크로락톤은 고리 내에 10 개를 초과하는 원자들을 갖는 락톤이다.

"반산 에스테르(half-acid ester)"는 "디카르복실산의 절반 에스테르"와 교환가능하게 사용되고, 이는 카르복실기 중 하나가 에스테르화되는 디카르복실산이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "미생물(microbial)", "미생물 유기체(microbial organism)" 또는 "미생물(microorganism)"이라는 용어는, 고세균(archaea), 박테리아 또는 진핵생물(eukarya)의 범주 내에 포함되는 미시 세포(microscopic cell) 또는 단세포 유기체로서 존재하는 여하한의 유기체를 의미하도록 의도된다. 그러므로, 상기 용어는 원핵 또는 진핵 세포, 또는 미시적 크기를 갖는 유기체를 포괄하도록 의도되고, 효모 및 균류와 같은 진핵 미생물뿐만 아니라, 모든 종의 박테리아, 고세균, 진정세균(eubacteria)을 포함한다. 또한, 상기 용어는 생화학의 생산을 위해 배양될 수 있는 여하한의 종의 세포 배양물을 포함한다.

"재조합 미생물"이라는 용어는, 예를 들어 숙주 세포 내의 특정 효소 활성이 모 세포(parent cell) 또는 원래 숙주 세포(native host cell)에 대해 변경, 추가 및/또는 결실되도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 지칭한다. 유전적으로 변형된 숙주 세포는 재조합 미생물의 일 예시이다. 이와 같이, "변형된 또는 변경된 수준의 단백질 활성"은, 예를 들어 동일한 변형이 부재하는 모 또는 원래 숙주 세포에 대해 결정된 활성의 하나 이상의 특징의 차이를 지칭한다. 통상적으로, 활성의 차이는 변형된 활성을 갖는 재조합 숙주 세포와, 그 변형된 활성을 갖지 않는 대응하는 야생형 숙주 세포 사이에서 결정된다(예를 들어, 대응하는 야생형 숙주 세포에 대해 재조합 숙주 세포의 배양물을 비교). 예를 들어, 변형된 활성은 (예를 들어, 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 증가 또는 감소된 수의 복제, 단백질을 코딩하는 증가 또는 감소된 수의 mRNA 전사체, 및/또는 mRNA로부터의 단백질의 증가 또는 감소된 양의 단백질 번역의 결과로서) 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 변형된 양의 단백질; 단백질의 구조 변화[예를 들어, 기질 특이성의 변화, 관찰되는 운동 파라미터(kinetic parameter)들의 변화를 야기하는 단백질 코딩 서열에 대한 변화와 같은 일차 구조에 대한 변화]; 및 단백질 안정성의 변화(예를 들어, 단백질의 증가 또는 감소된 분해)의 결과일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 설명된 폴리펩티드들 중 어느 하나의 돌연변이체 또는 변이체이다. 특정 경우에서, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드들에 대한 코딩 서열은 특정 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 예를 들어, 대장균의 발현에 대하여, 하나 이상의 코돈이 최적화될 수 있다(Grosjean 외 (1982) Gene 18:199-209 참조).

"지방산"이라는 용어는 화학식 RCOOH를 갖는 카르복실산을 의미한다. R은 지방족기(aliphatic group), 바람직하게는 알킬기를 나타낸다. R은 약 4 내지 약 22 개의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 지방산은 분지쇄형 사슬 또는 직쇄형 사슬을 가질 수 있고, 포화, 단일불포화 또는 다중불포화될 수 있다.

"지방산 유도체"는 부분적으로 생산 숙주 유기체의 지방산 생합성 경로로부터, 또한 부분적으로 아실-ACP 또는 아실-CoA로부터 만들어지는 산물이다. 상기 용어는 여하한의 지방산(추가 화학 기능성을 갖고, 유도체 C₆ 내지 C₃₅를 포함할 수 있는 C₆ 내지 C₂₄)을 포괄하도록 의도된다. 지방산 유도체는 불포화, 수산화, 베타 및 오메가 수산화, 및/또는 에스테르화 중 하나 이상을 가질 수 있다. 예시적인 지방산 유도체는 포화 또는 단일불포화 지방산 또는 에스테르, 오메가 수산화 지방산 또는 에스테르 등을 포함한다. 예시적인 추가 지방산 유도체는 아실-CoA, 지방산, 지방족 알데히드, 짧은 및 긴 사슬 알코올, 지방족 알코올, 탄화수소, 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르, 지방족 에스테르), 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대사 변형"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 상태와 상이하도록 대사 또는 생합성 경로의 변화를 지칭하도록 의도된다. 대사 변형은, 예를 들어 반응에 참여하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 기능적 파괴(disruption)에 의한 생화학 반응 활성의 제거 또는 감쇠를 포함할 수 있다. 또한, 이는 반응에 참여하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 상향조절(upregulate)하거나 과발현함에 의한 생화학 반응 활성의 증가를 포함할 수 있다. 또한, 이는 반응에 참여하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 외인성으로 발현함에 의한 생화학 반응 활성의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 미생물의 유전적, 물리적 또는 화학적 조작이나 그 환경을 통해 달성될 수 있다.

"변경된 효소 기능성"이라는 용어는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 효소 활성을 지칭한다. 변경된 효소 기능성의 일 예시는 세포에 자연적으로 발견되지 않는 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 외인성으로 발현된 유전자이다. 변경된 효소 기능성의 또 다른 예시는 증가된 발현 수준에서 세포에 자연적으로 발견되지 않는 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 과발현된 유전자이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생체 내에서 지방산 유도체를 생산"한다는 용어는 탄수화물 등과 같은 재생가능한 공급원료로부터 생육가능한(viable) 및/또는 유전적으로 변형된 숙주 세포에서 지방산 유도체를 생산함을 의미하며, 재생가능한 공급원료는 숙주 세포가 발효 시 탄소원을 흡수(take up)하고 대사할 수 있도록 탄소원으로서 발효 브로쓰에 첨가된다. 이는 지방산 유도체가 시험관 내에서(in vitro) 생산되는 방법들과 상이하고, 정제된 효소 또는 세포 용해물(cell lysate)이 사용되며, 효소 전환을 위한 직접적 기질, 예를 들어 지방산 또는 지방산 유도체가 정제된 효소 또는 세포 용해물 용액에 첨가된다. 또한, 이는 지방산 유도체가 생물형질전환으로 생산되는 방법들과 상이하고, 휴지 세포(resting cell)가 사용되며, 효소 전환을 위한 직접적 기질, 예를 들어 지방산 또는 지방산 유도체가 휴지 세포에 외인성으로 첨가된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 생합성 경로"라는 용어는 지방산 및 지방산 유도체를 생산하는 생합성 경로를 의미한다. 이러한 지방산 유도체의 예시들은, 제한 없이, ω-수산화 지방산 및 에스테르 유도체, ω-불포화 지방산 및 에스테르 유도체, 및 3-하이드록시 지방산 및 에스테르 유도체를 포함한다. 지방산 생합성 경로는, 의도한 특징들을 갖는 ω-수산화 지방산 및 에스테르 유도체, ω-불포화 지방산 및 에스테르 유도체, 및 3-하이드록시 지방산 및 에스테르 유도체와 같은 지방산 유도체를 생산하기 위해 본 명세서에 논의된 것들 이외에 효소 활성을 갖는 추가 효소 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

효소 분류(Enzyme Classification: EC) 번호는 생화학 및 분자생물학 국제 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB)의 명명 위원회(Nomenclature Committee)에 의해 제정되며, 이의 설명은 월드 와이드 웹의 IUBMB 효소 명명 웹사이트에서 이용가능하다. EC 번호는 효소-촉매화 반응에 따라 효소들을 분류한다. 예를 들어, (예컨대, 상이한 유기체들로부터의) 상이한 효소들이 동일한 반응을 촉매화하는 경우, 이 효소들은 동일한 EC 번호로 분류된다. 또한, 수렴 진화(convergent evolution)를 통해, 상이한 단백질 접힘(protein fold)이 동일한 반응을 촉매화할 수 있으며, 그러므로 동일한 EC 번호가 할당된다(Omelchenko 외 (2010) Biol . Direct 5:31 참조). 진화적으로 관련이 없고(evolutionarily unrelated) 동일한 생화학 반응을 촉매화할 수 있는 단백질들은 때때로 상사 효소(analogous enzyme)[즉, 상동 효소(homologous enzyme)와 반대됨]로서 지칭된다. EC 번호는, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열에 의해 단백질을 특정(specify)하는 UniProt 식별자와 상이하다.

"수탁 번호" 또는 "NCBI 수탁 번호" 또는 "GenBank 수탁 번호"라는 용어는 특이적 핵산 서열을 나타내는 번호를 지칭한다. 본 명세서에서 논의되는 서열 수탁 번호는 미국 국립보건원에 의해 유지되는 NCBI(미국 국립 생물공학 정보센터)에 의해 제공되는 데이터베이스로부터 그리고 스위스 생물정보학 연구소에 의해 제공되는 UniProt 지식베이스(UniProtKB) 및 Swiss-Prot 데이터베이스로부터 얻어졌다(또한, UniProtKB 수탁 번호라고도 지칭됨).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"라는 용어는 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 인산기로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 단위체 단위를 지칭한다. 자연적으로 발생하는 염기들[구아닌(G), 아데닌(A), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)]은 통상적으로 퓨린 또는 피리미딘의 유도체들이지만, 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 염기 유사체(base analog)들도 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 자연적으로 발생하는 당은 펜토오스(5-탄당)의 (DNA를 형성하는) 디옥시리보오스 또는 (RNA를 형성하는) 리보오스이지만, 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 당 유사체들도 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 핵산은 통상적으로 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 인산 결합을 통해 연결되지만, 많은 다른 연결들(예를 들어, 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트 등)이 해당 기술분야에 알려져 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA)의 중합체를 지칭하고, 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 비-자연적 또는 변경된 뉴클레오티드들을 함유할 수 있다. "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용되고, RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 여하한의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이러한 용어들은 분자의 일차 구조를 지칭하고, 따라서 이중 및 단일 가닥의 DNA, 및 이중 및 단일 가닥의 RNA를 포함한다. 이 용어들은 메틸화된 및/또는 캡핑된(capped) 폴리뉴클레오티드(단, 이로 제한되지 않음)와 같은 변형된 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체를 등가물로서 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 바이러스성, 염색체의, EST, cDNA, mRNA 및 rRNA를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 여하한 형태로 존재할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 데 교환가능하게 사용된다. "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 기술들에 의해 생산된 폴리펩티드를 지칭하며, 일반적으로 발현된 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA는 숙주 세포를 형질전환하여 폴리펩티드를 생산하는 데 사용되는 적합한 발현 벡터(expression vector) 내로 삽입된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "동족체(homolog)" 및 "상동(homologous)"이라는 용어는 대응하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50 퍼센트(%) 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 바람직하게, 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 대응하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 약 99 % 상동성(homology)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 서열 "상동성" 및 "서열 동일성"이라는 용어는 교환가능하게 사용된다. 해당 기술분야의 당업자라면, 2 이상의 서열 간의 상동성을 결정하는 방법들을 잘 알고 있을 것이다. 간명하게, 두 서열 간의 "상동성"의 계산은 다음과 같이 수행될 수 있다. 서열은 최적의 비교를 위해 정렬된다[예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭(gap)이 도입될 수 있으며, 비교를 위해 비-상동 서열은 무시될 수 있다]. 바람직한 일 구현예에서, 비교를 위해 정렬되는 제 1 서열의 길이는 제 2 서열의 길이의 적어도 약 30 %, 바람직하게는 적어도 약 40 %, 더 바람직하게는 적어도 약 50 %, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60 %, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 70 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 또는 약 100 %이다. 이후, 제 1 및 제 2 서열들의 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제 1 서열에서 위치가 제 2 서열에서 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 상동성은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는, 갭의 개수 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 개수의 함수이다. 두 서열 간의 퍼센트 상동성의 결정 및 서열의 비교는 BLAST와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다(Altschul 외 (1990) J. Mol . Biol. 215(3):403-410). 또한, 두 아미노산 서열 간의 퍼센트 상동성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 어느 하나, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량(length weight)을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(Needleman 및 Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:444-453). 또한, 두 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 상동성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 그리고 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.

해당 기술분야의 당업자는 초기 상동성 계산을 수행할 수 있으며, 이에 따라 알고리즘 파라미터들을 조정할 수 있다. 바람직한 파라미터들의 세트(및 분자가 청구항들의 상동성 제한 내에 있는지 여부를 결정하기 위해 어떤 파라미터들이 적용되어야 하는지에 대한 확신이 없는 경우에 사용되어야 하는 파라미터들의 세트)는 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 확장 페널티 및 5의 프레임시프트 갭 페널티(frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)이다. 서열 정렬의 추가 방법들이 생물공학 분야에 알려져 있다(예를 들어, Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics 6:278; Altschul 외 (2005) FEBS J. 272(20):5101-5109 참조).

"오솔로그(ortholog)"는 직계 비속(vertical descent)에 의해 관련되고 상이한 유기체들에서 실질적으로 동일하거나 같은 기능들을 담당하는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 쥐의 에폭시드 하이드로라아제(epoxide hydrolase) 및 인간의 에폭시드 하이드로라아제가 에폭시드의 가수분해의 생물학적 기능을 위한 오솔로그로서 간주될 수 있다. 유전자는, 예를 들어 유전자가 상동임을 나타내기에 충분한 양의 서열 유사성을 공유하는 경우 직계 비속에 의해 관련되거나, 공통 선조로부터의 진화에 의해 관련된다. 또한, 유전자는, 서열 유사성에 필수적인 것은 아니지만, 일차 서열 유사성이 식별가능하지 않을 정도로 유전자가 공통 선조로부터 진화되었음을 나타내기에 충분한 양의 3-차원 구조를 공유하는 경우 오솔로그로서 간주될 수 있다. 오솔로그는 약 25 % 내지 100 %의 아미노산 서열 동일성의 서열 유사성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 또한, 25 % 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질을 코딩하는 유전자는, 3-차원 구조 또한 유사성을 나타내는 경우 직계 비속에 의해 발생했다고 간주될 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성화인자(tissue plasminogen activator) 및 엘라스타아제(elastase)를 포함하는 효소들의 세린 프로테아제 계열(serine protease family)의 요소(member)들은 공통 선조로부터 직계 비속에 의해 발생했다고 간주된다. 오솔로그는, 예를 들어 진화를 통해 구조 또는 전체 활성에서 분기(diverge)한 유전자 또는 그 코딩된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 종이 2 개의 기능을 나타내는 유전자 산물을 코딩하고, 이러한 기능이 제 2 종에서 별개의 유전자로 분별(separate)되었다면, 3 개의 유전자 및 그 대응하는 산물이 오솔로그라고 간주된다. 생화학 산물의 성장-결합 생산(growth-coupled production)을 위하여, 해당 기술분야의 당업자는 파괴(disrupt)될 대사 활성을 숨기고 있는(harbor) 오솔로그 유전자가 비-자연적으로 발생하는 미생물의 구조를 위해 선택되어야 함을 이해할 것이다. 분별가능한 활성을 나타내는 오솔로그의 일 예시는, 별개의 활성이 2 이상의 종 사이에 또는 단일 종 내에 별개의 유전자 산물로 분별된 경우이다. 특정 예시는, 세린 프로테아제 활성의 두 가지 타입인 엘라스타아제 단백질가수분해 및 플라스미노겐 단백질가수분해의, 플라스미노겐 활성화인자 및 엘라스타아제로서의 별개의 분자로의 분별이다. 제 2 예시는 미코플라즈마 5'-3' 엑소뉴클레아제 및 드로소필라(Drosophila) DNA 폴리메라아제 Ⅲ 활성의 분별이다. 제 1 종으로부터의 DNA 폴리메라아제는 제 2 종으로부터의 엑소뉴클레아제 또는 폴리메라아제 중 어느 하나 또는 둘 모두에 대한 오솔로그라고 간주될 수 있으며, 그 역도 가능하다.

이와 대조적으로, "파랄로그(paralog)"는, 예를 들어 복제(duplication)에 후속되는 진화 분기(evolutionary divergence)에 의해 관련되는 동족체이고, 동일하지 않은, 유사하거나 공통적인 기능을 갖는다. 파랄로그는, 예를 들어 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터 발생하거나 유래할 수 있다. 예를 들어, 마이크로솜 에폭시드 하이드로라아제(에폭시드 하이드로라아제 I) 및 가용성 에폭시드 하이드로라아제(에폭시드 하이드로라아제 II)는, 별개의 반응을 촉매화하고 동일한 종에서 별개의 기능을 갖는 공통 선조로부터 공동-진화(co-evolve)된 2 개의 구별되는 효소들을 나타내기 때문에 파랄로그로서 간주될 수 있다. 파랄로그는 서로에 대해 상당한 서열 유사성을 갖는 동일한 종으로부터의 단백질이고, 이는 상동이거나, 공통 선조로부터 공동-진화를 통해 관련됨을 시사한다. 파랄로그 단백질 계열 그룹들은 HipA 동족체, 루시퍼라아제 유전자, 펩티다아제 등을 포함한다.

비-오솔로그 유전자 전위(nonorthologous gene displacement)는 상이한 종에서 기준 유전자 기능(referenced gene function)을 위해 치환할 수 있는 한 종으로부터의 비-오솔로그 유전자이다. 치환은, 예를 들어 상이한 종에서 기준 기능과 비교하여 원래의 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 기능을 수행할 수 있게 하는 것을 포함한다. 일반적으로, 비-오솔로그 유전자 전위는 기준 기능을 코딩하는 알려진 유전자와 구조적으로 관련되는 것으로서 식별가능할 것이지만, 구조적으로 덜 관련되나 기능적으로 유사한 유전자 및 그 대응하는 유전자 산물은 이것이 본 명세서에서 사용될 때 그럼에도 여전히 용어의 의미 내에 속할 것이다. 기능적 유사성은, 예를 들어 치환되도록 추구된 기능을 코딩하는 유전자와 비교하여, 비-오솔로그 유전자의 활성 부위 또는 결합 영역에서 적어도 어느 정도의 구조적 유사성을 요구한다. 그러므로, 비-오솔로그 유전자는, 예를 들어 파랄로그 또는 비관련 유전자를 포함한다.

그러므로, 지방산 유도체의 생산을 위해 본 명세서에 개시되는 비-자연적으로 발생하는 미생물 유기체를 식별하고 구조화(construct)함에 있어서, 해당 기술분야의 당업자는, 특정 종에 본 명세서에 제공된 교시 및 안내를 적용하여, 대사 변형의 식별이 오솔로그의 식별 및 파괴를 포함해야 한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 파랄로그 및/또는 비-오솔로그 유전자 전위가 유사한 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매화하는 효소를 코딩하는 기준 미생물에 존재하는 정도로, 해당 기술분야의 당업자는 효소 활성의 여하한의 기능적 중복(redundancy)이 설계된 대사 변형을 단락(short circuit)시키기 않도록 보장하기 위해 이 진화적으로 관련된 유전자를 파괴할 수 있다. 오솔로그, 파랄로그 및 비-오솔로그 유전자 전위는 해당 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 방법들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 2 개의 폴리펩티드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 검사는 비교되는 서열들 간의 서열 동일성 및 유사성을 나타낼 것이다. 이러한 유사성에 기초하여, 해당 기술분야의 당업자는 유사성이, 단백질이 공통 선조로부터 진화를 통해 관련됨을 나타내기에 충분히 높은지를 결정할 수 있다. Align, BLAST, Clustal W 등과 같이 해당 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 알고리즘들은 원래(raw) 서열 유사성 또는 동일성을 비교 및 결정하고, 또한 중량 또는 스코어가 할당될 수 있는 서열 내의 갭의 존재 또는 중요도(significance)를 결정할 수 있다. 또한, 이러한 알고리즘은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 뉴클레오티드 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는 데 유사하게 적용가능하다. 통계적 유사성을 계산하는 잘 알려진 방법들 또는 무작위 폴리펩티드의 유사한 매칭을 찾아낼 가능성 및 결정되는 매칭의 중요도에 기초하여, 관련성을 결정하기에 충분히 유사한 파라미터들이 연산된다. 요구된다면, 2 이상의 서열의 컴퓨터 비교가 해당 기술분야의 당업자에 의해 시각적으로 최적화될 수 있다. 관련 유전자 산물 또는 단백질은 높은 유사성, 예를 들어 25 % 내지 100 % 서열 동일성을 갖는 것으로 예상될 수 있다. 관련되지 않은 단백질은, 충분한 크기의 데이터베이스가 스캔되는 경우, 우연히 발생하는 것으로 예상되는 것과 본질적으로 같은 동일성을 가질 수 있다(약 5 %). 5 % 내지 24 %의 서열은 비교되는 서열이 관련된다고 결론짓기에 충분한 상동성을 나타낼 수 있거나 나타낼 수 없다. 데이터 세트의 크기가 주어지면 이러한 매칭의 중요도를 결정하기 위해 추가 통계 분석이 수행될 수 있어, 이러한 서열의 관련도를 결정한다. 예를 들어, BLAST 알고리즘을 이용하여 2 이상의 서열의 관련성을 결정하는 예시적인 파라미터들이 아래에 설명되는 바와 같이 있을 수 있다. 간명하게, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 다음의 파라미터들: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈(gap open): 11 ; 갭 익스텐션(gap extension): 1; x_드롭오프(dropoff): 50; 익스펙트(expect): 10.0; 워드사이즈(wordsize): 3; 필터: 온(on)을 이용하여 수행될 수 있다. 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 다음의 파라미터들: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 익스텐션: 2; x_드롭오프: 50; 익스펙트: 10.0; 워드사이즈: 11; 필터: 오프(off)를 이용하여 수행될 수 있다. 해당 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 비교의 엄격성(stringency)을 증가 또는 감소시키고, 2 이상의 서열의 관련성을 결정하기 위해, 상기의 파라미터들에 대해 어떤 변형 및 업데이트가 행해질 수 있는지를 알 것이다.

"이종"이라는 용어는 상이한 종으로부터 또는 상이한 유기체로부터 유래됨을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이는 특정 유기체에 자연적으로 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 이종 발현은 단백질 또는 폴리펩티드가 그 단백질을 정상적으로 발현하지 않는 세포에 실험적으로 추가됨을 의미한다. 이와 같이, 이종은 전달된 단백질이 수용자(recipient)와 상이한 세포 타입 또는 상이한 종으로부터 초기에 유래된 사실을 지칭한다. 예를 들어, 식물 세포에 대해 내인성인 폴리뉴클레오티드 서열이 재조합 방법들에 의해 박테리아 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 이때 식물 폴리뉴클레오티드는 재조합 박테리아 숙주 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드이다.

"내인성" 폴리펩티드는 재조합 세포가 조작되거나 유래되는 숙주 세포(예를 들어, 모 미생물 세포)의 게놈에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 지칭한다. 그러므로, "내인성"이라는 용어는 숙주에 자연적으로 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 코딩 핵산(encoding nucleic acid)의 발현에 관련하여 사용될 때 상기 용어는 자연 미생물 유기체 내에 함유된 코딩 핵산의 발현을 지칭한다.

"외인성" 폴리펩티드는 모 미생물 세포의 게놈에 의해 코딩되지 않은 폴리펩티드를 지칭한다. 변이(즉, 돌연변이) 폴리펩티드는 외인성 폴리펩티드의 일 예시이다. "외인성"은 기준 분자 또는 기준 활성이 숙주 미생물 유기체 내로 도입됨을 의미하도록 의도된다. 그러므로, 코딩 핵산의 발현에 관련하여 사용된 경우 상기 용어는 미생물 유기체 내로의 발현가능한 형태의 코딩 핵산의 도입을 지칭한다. 생합성 활성에 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 숙주 기준 유기체 내로 도입되는 활성을 지칭한다. 소스는, 예를 들어 숙주 미생물 유기체 내로의 도입에 후속하여 기준 활성을 발현하는 상동 또는 이종 코딩 핵산일 수 있다. 따라서, 본 명세서의 코딩 핵산의 외인성 발현은 이종 또는 상동 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 모두를 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "단편(fragment)"이라는 용어는 4 개의 아미노산 잔기에서부터 1 개의 아미노산 잔기를 뺀 전체 아미노산 서열에 이르는 크기 범위를 갖는 전체-길이 폴리펩티드 또는 단백질의 더 짧은 부분을 지칭한다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 단편은 폴리펩티드 또는 단백질의 도메인(예를 들어, 기질 결합 도메인 또는 촉매 도메인)의 전체 아미노산 서열을 지칭한다.

"돌연변이유발(mutagenesis)"이라는 용어는 유기체의 유전 정보가 안정한 방식으로 변화되는 과정을 지칭한다. 단백질 코딩 핵산 서열의 돌연변이유발은 돌연변이 단백질을 생산한다. 또한, 돌연변이유발은 변형된 단백질 활성을 야기하는 비-코딩 핵산 서열의 변화를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자"라는 용어는 RNA 산물 또는 단백질 산물 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라, RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 주는 작동가능하게-연결된(operably-linked) 핵산 서열[예를 들어, 이러한 서열은 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhancer) 서열을 포함함(단, 이로 제한되지 않음)] 또는 RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 주는 서열을 코딩하는 작동가능하게-연결된 핵산 서열[예를 들어, 이러한 서열은 리보솜 결합 부위 또는 번역 조절 서열을 포함함(단, 이로 제한되지 않음)]을 지칭한다.

발현 조절 서열은 해당 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여 제공되는 프로모터, 인핸서, 아데닐산중합반응 신호(polyadenylation signal), 전사 종결자(transcription terminator), 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry sites: IRES) 등을 포함한다. 발현 조절 서열은 전사에 관련된 세포성 단백질과 특이적으로 상호작용한다(Maniatis 외 (1987) Science 236:1237-1245). 예시적인 발현 조절 서열은, 예를 들어 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif(1990)에 기술되어 있다. 본 발명의 방법들에서, 발현 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된"이라는 것은, 적절한 분자들(예를 들어, 전사 활성화인자 단백질들)이 발현 조절 서열(들)에 결합될 때, 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현 조절 서열(들)이 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된 프로모터는, 전사 및 번역의 방향에 관련하여, 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 상류에 위치된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 선택된 폴리뉴클레오티드의 상류, 내부 또는 하류에 위치될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 벡터가 연결된 다른 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드 서열을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 유형의 유용한 벡터는 에피솜(episome)[즉, 염색체외 복제(extra-chromosomal replication)가 가능한 핵산]이다. 유용한 벡터는 벡터가 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다. 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 칭해진다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술들에 유용한 발현 벡터는 흔히 "플라스미드"의 형태로 되어 있으며, 이는 일반적으로 벡터 형태로 염색체에 결합되지 않는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터임에 따라, "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 본 명세서에서 교환가능하게 사용된다. 하지만, 등가의 기능들을 제공하고, 이후에 해당 기술분야에 알려지는 이러한 다른 형태들의 발현 벡터도 또한 포함된다. 몇몇 구현예들에서, 재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 프로모터는 발달-조절된(developmentally-regulated), 세포소기관-특이적(organelle-specific), 조직-특이적(tissue-specific), 유도성(inducible), 구성적(constitutive), 또는 세포-특이적 프로모터이다. 재조합 벡터는 통상적으로, (a) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열; (b) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; (c) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; (d) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); (e) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열(secretion sequence); 및 (f) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적 서열(targeting sequence)을 포함하는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정하게 통합되며, 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 구역의 조절을 받는다. 본 명세서에 설명되는 발현 벡터는 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 형태로 된 본 명세서에 설명되는 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 해당 기술분야의 당업자라면, 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 의도한 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 이러한 인자들에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 설명되는 발현 벡터는 본 명세서에 설명되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생산하기 위하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 흔히, 원핵생물, 예를 들어 대장균에서 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 대부분 융합 또는 비-융합 폴리펩티드 중 어느 하나의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터들로 수행된다. 융합 벡터는 그 안에 코딩된 폴리펩티드에, 통상적으로는 재조합 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복시-말단(terminus)에 다수의 아미노산을 추가한다. 이러한 융합 벡터는 통상적으로 다음의 세 가지 목적: (1) 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고; (2) 재조합 폴리펩티드의 용해도를 증가시키며; (3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것 중 하나 이상을 제공한다. 흔히, 융합 발현 벡터에서, 단백질분해 절단 부위(proteolytic cleavage site)가 재조합 폴리펩티드 및 융합 모이어티의 접합부에 도입된다. 이는 융합 폴리펩티드의 정제 후 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분별을 가능하게 한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지(bacteriophage) T5로부터 유래된 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 효모 세포이고, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 S. 세레비지에의 발현을 위한 벡터의 예시는 pYepSecl(Baldari 외 (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa(Kurjan 외 (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88(Schultz 외 (1987) Gene 54: 113-123), pYES2(Invitrogen Corp., San Diego, CA), 및 picZ(Invitrogen Corp., San Diego, CA)를 포함한다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 곤충 세포이고, 발현 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)에서 단백질의 발현을 위해 이용가능한 배큘로바이러스 벡터는, 예를 들어 pAc 계열(series)(Smith 외 (1983) Mol . Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 계열(Lucklow 외 (1989) Virology 170:31-39)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열이 포유류 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포에 발현될 수 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 모두에 적합한 다른 발현계들이 해당 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook 외, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) 참조).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아실-CoA"는 조효소 A(CoA)의 4'-포스포판테테이닐 모이어티의 술피드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에서 형성되는 아실 티오에스테르를 지칭하고, 이는 화학식 R-C(0)S-CoA를 가지며, 여기서 R은 적어도 4 개의 탄소 원자를 갖는 여하한의 알킬기이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아실-ACP"는 아실기 운반 단백질(ACP)의 포스포판테테이닐 모이어티의 술피드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에서 형성되는 아실 티오에스테르를 지칭한다. 포스포판테테이닐 모이어티는 홀로(holo)-아실기 운반 단백질 신타아제(ACPS)인 포스포판테테이닐 트랜스퍼라아제의 작용에 의해 ACP 상의 보존된 세린 잔기에 번역후(post-translationally) 부착된다. 몇몇 구현예들에서, 아실-ACP는 완전히 포화된 아실-ACP의 합성에서 중간체이다. 다른 구현예들에서, 아실-ACP는 불포화된 아실-ACP의 합성에서 중간체이다. 몇몇 구현예들에서, 탄소 사슬은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 탄소들을 가질 것이다. 이러한 아실-ACP의 각각은 이를 지방산 유도체로 전환시키는 효소에 대한 기질이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "클론"이라는 용어는 통상적으로 단일 공통 선조와 본질적으로 유전적으로 동일하고 이의 자손인 세포 또는 세포들의 그룹, 예를 들어 단일 박테리아성 세포에서 발생하는 클로닝된 박테리아성 콜로니(cloned bacterial colony)의 박테리아를 지칭한다.

통상적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조절 서열(regulatory sequence)"이라는 용어는 궁극적으로 단백질의 발현을 조절하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열들에 작동가능하게-연결된, DNA의 염기 서열을 지칭한다. 조절 서열의 예시는 RNA 프로모터 서열, 전사 인자 결합 서열, 전사 종결 서열, (인핸서 요소와 같은) 전사의 조절인자(modulator), RNA 안정성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열, 및 번역 조절 서열[예컨대, 리보솜 결합 부위(예를 들어, 원핵생물의 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence) 또는 진핵생물의 코작 서열(Kozak sequence)), 개시 코돈, 종결 코돈]을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배양물"이라는 용어는 통상적으로 생세포(viable cell)를 포함하는 액체 배지를 지칭한다. 일 구현예에서, 배양물은 조절된 조건들 하에서 사전설정된 배양 배지에서 번식하는 세포, 예를 들어 선택된 탄소원 및 질소를 포함하는 액체 배지에서 성장되는 재조합 숙주 세포의 배양물을 포함한다. "배양하는" 또는 "배양"은 액체 또는 고체 배지의 적절한 조건들 하에서 재조합 숙주 세포의 개체군을 성장시키는 것을 지칭한다. 특정 구현예들에서, 배양은 최종 산물로의 기질의 발효성 생물전환을 지칭한다. 배양 배지는 잘 알려져 있으며, 이러한 배양 배지의 개별 성분들은, 예를 들어 DIFCO™ 및 BBL™ 상표의 상용 공급원(commercial source)으로부터 이용가능하다. 비-제한적인 일 예시에서, 수성 영양 배지는 YP 배지와 같이 질소, 염 및 탄소의 복합원을 포함하는 풍부한 배지(rich medium)이며, 이는 이러한 배지의 10 g/L의 펩톤 및 10 g/L 효모 추출물을 포함한다. 추가적으로, 배양물의 숙주 세포는 미국 특허 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; 5,602,030; WO 2010127318에 설명된 방법들에 따라, 탄소를 효율적으로 동화시키고, 탄소원으로서 셀룰로오스 물질을 사용하도록 조작될 수 있다. 또한, 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 인베르타아제를 발현하도록 조작되어, 수크로오스가 탄소원으로서 사용될 수 있도록 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하기에 효과적인 조건들 하에서"라는 용어는 숙주 세포가 의도한 지방산 유도체를 생산하게 하는 여하한 조건들을 의미한다. 예시들은 ω-수산화 지방산 및 에스테르 유도체, ω-불포화 지방산 및 에스테르 유도체, 및 3-하이드록시 지방산 및 에스테르 유도체이다. 적합한 조건들은, 예를 들어 발효 조건들을 포함한다.

"변경된 수준의 발현" 및 "변형된 수준의 발현"이라는 용어는 교환가능하게 사용되며, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 대사물질 또는 산물(예를 들어, 지방산 유도체, ω-하이드록시 지방산 유도체)가 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포의 농도에 비해 조작된 숙주 세포에서 상이한 농도로 존재함을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "역가(titer)"라는 용어는 숙주 세포 배양물의 단위 부피당 생산된 지방산 유도체의 양을 지칭한다. 지방산 유도체의 예시는 ω-지방산 유도체 및 3-하이드록시 지방산 유도체이다. 따라서, 역가는 특정(오메가) ω-지방산 유도체 또는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생산된 ω-지방산 유도체들의 조합을 지칭할 수 있다. 유사하게, 역가는 특정 3-하이드록시 지방산 유도체 또는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생산되는 3-하이드록시 지방산 유도체의 조합을 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생산성"이라는 용어는 단위 시간당 숙주 세포 배양물의 단위 부피당 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 양을 지칭한다. 지방산 유도체의 예시는 ω-지방산 유도체 및 3-하이드록시 지방산 유도체이다. 생산성은 특정 ω-수산화 지방산 또는 에스테르 유도체, ω-불포화 지방산 또는 에스테르 유도체, 또는 3-하이드록시 지방산 또는 에스테르 유도체, 또는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생산되는 이러한 지방산 유도체들의 조합을 지칭할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "글루코오스 이용률"이라는 용어는 그램/리터/시간(g/L/hr)으로 기록되는 단위 시간당 배양물에 의해 사용되는 글루코오스의 양을 의미한다.

단독으로 또는 "소스"에 관련하여 사용될 때 "탄소계"라는 용어는 탄소원으로부터 유래됨을 지칭한다. 탄소원은, 유지화학물질(즉, 지방산, 지방산 에스테르, TAG, 하이드록시 지방산 등과 같이 식물 및 동물로부터의 정제유) 및 석유화학물질(즉, 알칸, 알켄 등과 같이 석유로부터 유래된 화학물질)을 제외하고 탄소가 유래되는 (재생가능한 공급원료 및/또는 바이오매스를 포함하는) 여하한의 생물학적 재료를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "탄소계"라는 용어는 유지화학물질 및 석유화학물질로부터 유래되는 탄소를 제외한다. 일 구현예에서, 탄소원은 단순 탄소원이다. 몇몇 구현예들에서, 탄소원은 당 또는 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류)을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 탄소원은 글루코오스 및/또는 수크로오스이다. 다른 구현예들에서, 탄소원은 옥수수, 사탕수수 또는 목질계 바이오매스로부터의 탄수화물; 또는 글리세롤, 플루-가스, 합성-가스와 같은 폐기물; 또는 바이오매스 또는 천연 가스와 같은 유기 재료의 개량물; 또는 광합성적으로 고정된(fixed photosynthetically) 이산화탄소와 같은 재생가능한 공급원료들로부터 유래된다. 다른 구현예들에서, 바이오매스는 탄소원으로 처리되며, 이는 생물전환에 적합하다. 또 다른 구현예들에서, 바이오매스는 탄소원으로의 추가적인 처리를 요구하지 않으며, 탄소원으로서 바로 사용될 수 있다. 이러한 바이오매스의 예시적인 탄소원은 스위치그래스(switchgrass)와 같은 식물성 물질 또는 식생(vegetation)이다. 또 다른 예시적인 탄소원은 동물성 물질[예를 들어, 우분(cow manure)]과 같은 대사 노폐물을 포함한다. 또 다른 예시적인 탄소원은 조류(algae) 및 다른 해양 식물을 포함한다. (바이오매스를 포함하는) 또 다른 탄소원은 발효 폐기물, 발효 바이오매스, 글리세롤/글리세린, 목초, 짚, 목재, 오수, 쓰레기, 마니플 고체 폐기물(maniple solid waste), 셀룰로오스 도시 폐기물 및 음식 쓰레기를 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 산업, 농업, 임업 및 가정으로부터의 폐기물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 산물(예를 들어, 지방산 유도체)에 대하여 "분리된"이라는 용어는, 세포 성분, 세포 배양 배지, 또는 화학적 또는 합성 전구체로부터 분별된 산물을 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 설명된 유기체에 의해 생산된 ω-수산화 지방산 또는 에스테르 유도체, ω-불포화 지방산 또는 에스테르 유도체, 또는 3-하이드록시 지방산 또는 에스테르 유도체는 발효 브로쓰에서 그리고 세포질에서 상대적으로 혼합되지 않을 수 있다. 그러므로, 지방산 유도체는 세포내 또는 세포외에서 유기 상(organic phase)으로 수집될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, ω 지방산 유도체는 세포외에서 수집, 즉 분비된다. 본 명세서에 설명되는 바와 같이, 미생물 유기체에 관련하여 사용될 때 "분리된"이라는 용어는 기준 미생물 유기체가 자연적으로 발견될 때 적어도 하나의 성분이 실질적으로 유리된(free) 유기체를 의미하도록 의도된다. 상기 용어는 미생물 유기체가 그 자연 환경에서 발견될 때 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 또한, 상기 용어는 미생물 유기체가 비-자연적으로 발생하는 환경에서 발견될 때 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 그러므로, 분리된 미생물 유기체는, 미생물 유기체가 자연적으로 발생할 때 또는 미생물 유기체가 비-자연적으로 발생하는 환경에서 성장, 저장 또는 존속될 때 다른 물질과 부분적으로 또는 완전히 분별된다. 분리된 미생물 유기체의 특정 예시는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비-자연적으로 발생하는 배지에서 배양되는 미생물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정제한다", "정제된" 또는 "정제"라는 용어는, 예를 들어 분리 또는 분별에 의해 그 환경으로부터 분자의 제거 또는 분리를 의미한다. "실질적으로 정제된" 분자는 이것이 연계된 다른 성분들로부터 적어도 약 60 % 유리(예를 들어, 적어도 약 70 % 유리, 적어도 약 75 % 유리, 적어도 약 85 % 유리, 적어도 약 90 % 유리, 적어도 약 95 % 유리, 적어도 약 97 % 유리, 적어도 약 99 % 유리)된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어들은 또한 샘플로부터 오염물의 제거를 지칭한다. 예를 들어, 오염물의 제거는 샘플에서 지방산 유도체의 백분율의 증가를 야기할 수 있다. 예를 들어, 지방산 유도체가 재조합 숙주 세포에서 생산될 때, 지방산 유도체는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 샘플 내의 지방산 유도체의 백분율이 증가된다. "정제한다", "정제된" 및 "정제"라는 용어는 절대 순도를 요구하지 않는 상대적인 용어이다. 따라서, 예를 들어 지방산 유도체가 재조합 숙주 세포들에서 생산될 때, 정제된 지방산 유도체는 다른 세포 성분(예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 또는 다른 탄화수소)과 실질적으로 분별되는 지방산 유도체이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에 개시되는 미생물 유기체 또는 미생물에 관련하여 사용될 때 "비-자연적으로 발생하는"이라는 용어는 유기체가 기준 종의 야생형 균주를 포함하는 기준 종의 자연적으로 발생하는 균주에서 정상적으로 발견되지 않는 적어도 하나의 유전적 변경을 갖는 것을 의미하도록 의도된다. 유전적 변경은, 예를 들어 대사 폴리펩티드를 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입하는 변형, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실, 및/또는 미생물 유전 재료의 다른 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어 기준 종에 대한 이종, 상동 또는 이종 및 상동 폴리펩티드 둘 모두에 대해 코딩 영역 및 이의 기능적 단편을 포함한다. 추가 변형은, 예를 들어 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩티드들은 티오에스테라아제, 에스테르 신타아제, 오메가 하이드록실라아제, 및 옥시다아제 또는 디하이드로게나아제를 포함하는(이로 제한되지 않음) 지방산 유도체 생합성 경로 내의 효소들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "CoA" 또는 "조효소 A"라는 용어는 보조인자 또는 보결분자단(prosthetic group)(효소의 비단백질 부분)을 의미하는 것으로 의도되고, 이의 존재는 활성 효소계를 형성하기 위해 다수의 효소의 활성에 요구된다. 예를 들어, 특정 축합 효소에서 조효소 A 기능은 아세틸 또는 다른 아실기 전달 및 지방산 합성 및 산화에 작용한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 배양 또는 성장 조건에 관련하여 사용될 때 "실질적으로 혐기성"이라는 용어는 산소의 양이 액체 배지 내 용존 산소에 대한 포화도의 약 10 % 미만임을 의미하도록 의도된다. 또한, 상기 용어는 약 1 % 미만의 산소 분위기로 유지되는 액체 또는 고체 배지의 기밀 챔버를 포함하도록 의도된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자 파괴"(또는 이의 문법적 등가물)이라는 용어는 코딩된 유전자 산물을 비활성화하는 유전적 변경을 의미하도록 의도된다. 유전적 변경은, 예를 들어 전체 유전자의 결실, 전사 또는 번역에 요구되는 조절 서열의 결실, 코딩된 유전자 산물을 비활성화하는 다수의 돌연변이 전략 중 어느 것에 의한 또는 절단된 유전자 산물의 결과를 갖는 유전자의 일부분의 결실일 수 있다. 유전자 파괴의 특히 유용한 한 가지 방법은 완전한 유전자 결실이며, 이는 이것이 본 발명의 비-자연적으로 발생하는 미생물에서 유전적 리버션(genetic reversion)의 발생을 감소 또는 제거하기 때문이다. 또한, "유전자 파괴"라는 용어는 야생형 유기체에서 주어진 유전자 산물의 활성을 그 활성에 대해 낮추는 유전자 변경을 의미하도록 의도된다. 이 활성의 감쇠는, 예를 들어 코딩된 유전자 산물을 그 자연적인 형태보다 덜 활성화하는 다수의 돌연변이 전략 중 어느 하나 또는 절단된 유전자 산물을 야기하는 유전자의 일부분의 결실, 유전자의 더 낮은 또는 덜 효율적인 발현을 야기하거나, 유전자가 정상 배양 조건들 하에서보다 덜 높게 발현되는 조건 하에서 유기체를 배양하거나, 유전자의 상보적 mRNA 분자와 상호작용하고 그 발현을 변경시키는 안티센스(antisense) RNA 분자를 도입하는 프로모터 서열의 교체 또는 돌연변이에 기인할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "진핵 유기체"라는 용어는 염색체 내로 조직화된 유전 재료를 에워싸는 막-결합 핵(membrane-bound nucleus) 및 세포질 내에 특수화된 세포소기관을 갖는 세포 유형을 갖는 여하한의 유기체를 지칭한다. 상기 용어는 효모 또는 균류와 같은 진핵 미생물 유기체를 포함하는 모든 진핵 유기체를 포괄하도록 의도된다. 또한, 상기 용어는 진핵 종이 반드시 미생물 유기체일 필요는 없는 생화학의 생산을 위해 배양될 수 있는 여하한의 진핵 종의 세포 배양물을 포함한다. "진핵 미생물 유기체", "진핵 미생물 유기체" 또는 "진핵 미생물"은 진핵생물의 범주 내에 포함되는 미세 세포(microscopic cell)로서 존재하는 여하한의 진핵 유기체를 의미하도록 의도된다.

개관(General Overview)

미생물적으로-유래된(microbially-derived) 지방산으로부터 향료 성분으로서 적합한 화학 화합물의 생산을 위해 새롭고 환경-친화적인 화학-효소 공정의 개발은 해당 산업에 대한 상당한 개선을 나타낸다. 특히, 상기 방법은 옥수수, 사탕수수 또는 목질계 바이오매스로부터의 탄수화물; 글리세롤, 플루-가스, 합성-가스와 같은 폐기물; 또는 바이오매스 또는 천연 가스 또는 이산화탄소와 같은 유기 재료의 개량물과 같은 탄소계 공급원료로부터 이러한 화학적 화합물의 생산을 제공한다. 이는 향료 성분과 같은 화학물질의 생산을 위해 깨끗하고 환경적으로 지속가능한 공정을 제공한다. 또한, 상기 공정은 화합물들이 단순 재생가능한 공급원료로부터 생산되게 하기 때문에, 비용 및 작업 단순성에 대해 확연한 경제적 장점이 존재한다.

예를 들어, 화학-효소 공정은, 재생가능한 탄소계 공급원료로부터 미생물적으로 지방산 유도체를 생산하고, 이후 지방산 유도체를 향료 성분과 같은 화학 화합물로 합성적으로(synthetically) 전환하는 2-단계 방법을 포함한다. 이 공정의 장점은, 이 공정이 제 1 단계로서 비싼(또한 때로는 다수의) 화학적 및/또는 생체촉매 공정보다는 미생물 발효를 이용하기 때문에 더 단순하고 더 비용 효율적인 생산 방법이라는 것이다. 또 다른 장점은 상기 공정이 더 적은 폐기물이 발생되기 때문에 더 깨끗하다는 것이다. 또 다른 장점은 상기 공정이 원료 소스(raw source material)로서 재생가능한 공급원료를 사용하기 때문에 더 지속가능하다는 것이며, 이는 글리세롤과 같은 폐기물도 포함할 수 있다. 또 다른 장점은 새로운 특이적 표적 산물, 즉 향료로서 적합한 신규한 조성물의 선택적 제조이다. 또한, 또 다른 장점은 신규한 향료에 대한 기반을 제공하는 다양한 화학적 조성에 대한 급격한 접근(sudden access)이다.

향료 성분은 특이적 후각적 특징을 가지며, 그 생산은 지금까지 자연적으로 발생하는 화합물 또는 석유화학 또는 유지화학 전구체들을 이용함에 의해 제한되었다. 본 발명은 기질로서 지방산 유도체를 이용함으로써 신규한 화학적 구조의 합성을 허용하는 화학-효소 공정을 제공한다. 특히, 발효는 이중 결합의 위치 및 구성을 변경시킬 수 있고, 메틸 분지를 도입할 수 있으며, 지방산 유도체의 탄소 사슬 길이를 변동시킬 수 있다. 이후, 지방산 유도체는 향료 성분을 만들기 위한 전구체로서 사용될 수 있다. 이는 잠재적으로 더 강한 또는 변경된 후각적 특징을 갖는 신규한 화학 구조체의 합성을 허용한다. 이와 관련하여, 이중 결합의 추가 및/또는 그 구성 또는 위치의 변경이 화합물의 휘발성에 영향을 준다는 것이 해당 기술분야에 잘 알려져 있다. 이는 화합물에 강화된 또는 변경된 향료를 제공할 수 있다.

일 예시는 글로발라이드(globalide)[또한, 하바놀라이드(habanolide)로서 알려짐]이며, 이는 금속향이 나는 상쾌하고 밝은 사향(fresh radiant musk)이다. 글로발라이드는, 시스(cis) (z-) 또는 트랜스(trans) (e-) 이성질체로서 또한 C₁₁ 또는 C₁₂ 위치 중 어느 하나에서 하나의 이중 결합을 갖는 C₁₅ 사이클릭 매크로라이드(cyclic macrolide)의 비-천연(즉, 합성) 혼합물[e-11 사이클로펜타데세놀라이드(cyclopentadecenolide), z-11 사이클로펜타데세놀라이드, e-12 사이클로펜타데세놀라이드 및 z-12 사이클로펜타데세놀라이드의 혼합물]이다. 그 이중 결합의 구성 및 위치는 설계되는 것이 아니라, 그 합성을 위해 사용되는 이용가능한 화학 공급원료, 즉 사이클로도데칸온 및 부타디엔에 의해 결정된다. 화학-효소 공정은 정의된 위치에 이중 결합을 갖는 이성질체적으로(isomerically) 순수한 하바놀라이드, 예를 들어 z-11 사이클로펜타데세놀라이드, z-12 사이클로펜타데세놀라이드, z-7 사이클로펜타데세놀라이드 및 z-8 사이클로펜타데세놀라이드의 합성을 허용하며, 이들은 합성 글로발라이드에 비해 잠재적으로 우수한 후각적 특징을 갖는 신규한 화합물이다.

또 다른 예시는 암브레톨리드 계열이다. 암브레톨리드는 약간 달콤한 향이 나는 사향이다. 이는 암트레트 시드(ambrette seed)에서 자연적으로 발생하며, 이는 하나의 이중 결합(z-7 사이클로헥사데세놀라이드)을 갖는 C₁₆ 매크로라이드이다. 암브레트 시드의 제한된 공급으로 인해, 이는 통상적으로 화학적으로 합성된다. 하지만, 천연 구조는 화학적 합성을 통해 접근가능하지 않다. 화학적 합성은 그 포화된 유사체(analog), 디하이드로암브레톨리드(dihydroambrettolide)(사이클로헥사데세놀라이드)(이는 열등한 후각적 특징을 가짐), 또는 트랜스-9 이성질체, 이소암브레톨리드(e-9 사이클로헥사데세놀라이드)로 제한된다. 후자의 화합물의 이중 결합의 구성 및 위치는 설계되는 것이 아니라, 화학 공급원료[이 경우, 이는 알류리틱 애시드(aleuritic acid)임]에 의해 결정된다. 본 화학-효소 공정은 z-9 사이클로헥사데세놀라이드, 즉 천연 암브레톨리드와 동일한 이중 결합 구성을 갖는 이소암브레톨리드의 합성을 허용하며, 이는 합성 이소암브레톨리드에 비해 잠재적으로 우수한 후각적 특징을 갖는 신규한 화합물이다.

또 다른 예시는 불포화 매크로사이클릭 케톤 계열이다. 수 개의 매크로사이클릭 케톤만이, 예를 들어 사향노루 또는 사향쥐로부터 자연적으로 발생하는 무스콘((-)-(R)-3-메틸사이클로펜타데칸온)이며, 그 공급이 제한된다. 매크로사이클릭 케톤은 통상적으로 고리 확장(ring extension) 또는 올레핀 복분해(olefinic metathesis)에 의해 사이클로도데칸온으로부터 화학적으로 합성된다. 이는 통상적으로 완전히 포화된, 예를 들어 로만온(romanone)[엑살톤(exaltone)이라고도 알려짐](사이클로펜타데칸온)이다. 본 화학-효소 공정은, 불포화 디카르복실산, 예를 들어 1,15 펜타데센디오익산(pentadecenedioic acid) 또는 1,16 헥사데센디오익산이 지방산-유도체 전구체로서 사용될 때, 불포화 매크로사이클릭 케톤, 예를 들어 사이클로펜타데센온 또는 사이클로헥사데센온의 합성을 허용한다. 이는 대응하는 합성 포화 매크로사이클릭 케톤에 비해 잠재적으로 우수한 후각적 특징을 갖는 신규한 화합물들이다.

또 다른 예시는 감마 또는 델타 락톤(γ- 또는 δ-락톤) 계열, 예를 들어 C₁₂ γ-락톤 및 γ-도데카락톤이다. 불포화 γ-락톤은 화학적 합성을 통해 접근가능하지 않다. 피마자유(castor oil) 또는 리시놀레산(ricinoleic acid)과 같은 비싼 유지화학 공급원료를 이용하는 생물형질전환은 C₂ 위치, 예를 들어 γ-도덱(dodec)-2-에놀락톤(enolactone)에서만 이중 결합을 허용한다. 또한, 후자의 공정은 조절하기 어려우며, γ-도덱-2-에놀락톤은 다르게 포화된 도데카락톤의 최소 부분(minor fraction)만이다. 본 화학-효소 공정은, 불포화 3-하이드록시 지방산 또는 3-하이드록시 지방산 에스테르, 예를 들어 3-하이드록시 도덱-5-에노익산 또는 3-하이드록시 도덱-5-에노익산 메틸 에스테르가 지방산-유도체 전구체로서 사용될 때 γ-도덱-5-에놀락톤의 합성을 허용한다. 또한, 화학-효소 공정은, 대응하는 메틸-분지 불포화 지방산 또는 지방산 에스테르가 지방산-유도체 전구체로서 사용될 때, 메틸-분지 γ-락톤, 예를 들어 9-메틸-γ-도데카락톤, 10-메틸-γ-도데카락톤 및 10-메틸-γ-운데카락톤(undecalactone)의 합성을 허용한다. 이들은 합성 또는 반합성 γ-락톤에 비해 잠재적으로 우수한 후각적 특징을 갖는 신규한 화합물들이다.

미생물들

본 발명은, 탄수화물, 폐기물 또는 바이오매스와 같은 재생가능한 탄소계 공급원료를, 향료 성분의 생산을 위해 미생물적으로-유래된 전구체로서 역할하는 특이적 지방산 유도체로 선택적으로 전환하도록 조작된 재조합 미생물을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은, 향료 성분의 생산을 위해 미생물적으로-유래된 전구체로서 역할하는 특이적 지방산 유도체, 예를 들어 지방산 및 지방족 에스테르로의 중간체의 전환을 위해 조작된 미생물 지방산 대사를 통해 변경된 효소 기능성을 포함하는 대사 변형을 포괄하는 미생물들을 고려한다. 재조합 미생물은 향료 성분의 생산을 더 비용 효율화하는 대규모 및 고-효율(high-throughput) 발효 공정을 허용한다.

지방산 합성은 박테리아 생합성 기구의 대부분 보존된 시스템들 중 하나이다. 지방산 합성(FAS) 다중-효소 복합체가 모든 박테리아 및 진핵생물에 존재한다. FAS 관련 유전자들의 대부분은 세포 성장 및 생존에 필수적이다. 진핵생물 및 박테리아 FAS는 본질적으로 동일한 타입의 생화학적 형질전환을 구현한다. 진핵생물에서, FAS는 FAS I로 지칭되고, 그 촉매 도메인들의 대부분은 하나의 폴리펩티드 사슬(비-해리성)에 의해 코딩된다. 박테리아와 같은 원핵생물에서, FAS는 FAS II로 지칭되고, 그 개개의 효소들 및 운반 단백질들은 별개의(해리성) 단백질들을 코딩하는 별도의 유전자들에 의해 코딩된다.

FAS 경로에서 효소들과 함께 아실기 운반 단백질(ACP)이 원래의(native) 유기체에서 생산된 지방산들의 길이, 포화도 및 분지를 조절한다. 이 경로에서의 단계들이 아세틸-CoA 카르복실라아제(ACC) 유전자 계열들 및 지방산 생합성(FAB)의 효소들에 의해 촉매화된다. 예를 들어, FAS 경로에 포함될 수 있는 효소들은 AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, FabI, FabK, FabL, FabM, FabB 및 FabF를 포함한다. 의도한 지방산 유도체 산물에 따라, 이러한 유전자들 중 하나 이상이 감쇠되거나 과발현될 수 있다. 이와 같이, 미생물은 글루코오스 또는 다른 탄소원과 같은 재생가능한 공급원료로부터 지방산 유도체들의 생산을 증가시키도록 조작되었다. 여기서, 주요 목표는, 박테리아 균주를, 지방산, 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 지방산 에틸 에스테르(FAEE)를 포함하는 지방산 유도체 생산을 위한 미생물 공장(microbial factory)으로 전환시키기 위해, 지방산 유도체들의 생산을 조절하는 핵심 조절 효소들의 활성을 증가시키는 것이다(예를 들어, 본 명세서에 인용 참조되는 미국 특허 8,283,143 참조).

미생물 또는 미생물 세포들은 미생물 전구체로서 역할하는 바람직한 지방산 유도체들의 생산을 위한 효소 경로를 변형시키기 위해 효소 기능의 폴리펩티드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 발현한다. 본 명세서에서 효소 수탁 번호(EC 번호)에 의해 식별되는 이러한 폴리펩티드들은 지방산 유도체들의 생산을 야기하는 지방산 경로들을 조작하는 데 유용하다. 아래의 표 1은 이러한 지방산 경로들의 조작에 유용한 효소들의 EC 번호를 나타낸다.

표 1: 효소 활성

화학-효소 공정을 위한 미생물 전구체로서 역할할 바람직한 지방산 유도체의 예시가 아래에 설명된다. 이러한 지방산 유도체는 본 발명의 재조합 미생물에 의해 생산된다. 아래에 설명되는 효소 기능성 및 생화학 경로는 미생물이 어떻게 조작될 수 있는지에 관한 예시이며, 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 당업자라면, 지방산 유도체의 생산을 달성하기 위해 조합될 수 있는 특정 효소 기능성의 대안적인 구현예들이 존재한다는 것을 인식할 것이다.

홀수 및 짝수 사슬 지방산 유도체

대장균 세포는 막 생합성(membrane biosynthesis)을 위한 짝수 직쇄형 사슬 지방산을 자연적으로 합성한다. 하지만, 재조합 미생물(예를 들어, 대장균)은 탄소계 공급원료로부터 홀수-사슬 지방산 유도체를 생산하도록 조작될 수 있다. 또한, 특정 변형들을 갖는 균주들이 홀수 직쇄형 사슬 지방산 유도체를 생산하기 위해 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 탄소계 공급원료로부터 우세하게 홀수 직쇄형 사슬 지방산을 합성하는 재조합 대장균 균주는 내인성 아세틸-CoA 특이적 3-옥소아실-[아실기-운반-단백질] 신타아제 Ⅲ(FabH)(EC 2.3.1.180)의 활성이 감쇠되게 하고, 광범위한 기질 특이성을 갖는 3-옥소아실-[아실기-운반-단백질] 신타아제 Ⅲ가 증가되게 하며, 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 FabHl가 과발현될 수 있다. 다른 구현예들에서, 변형된 균주들은, 트레오닌 생합성 경로의 효소들, 예를 들어 아스파르테이트 키나아제 I/ 호모세린 디하이드로게나아제 I(ThrA), 호모세린 키나아제(ThrB) 및 트레오닌 신타아제(ThrC)의 추가 변형된 활성, 및/또는 류신 생합성 경로의 효소들, 예를 들어 3-이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(LeuB), 이소프로필말레이트(IPM) 이소메라아제 및 이소프로필말레이트(IPM) 이소메라아제(LeuD)의 변형된 활성, 및/또는 트레오닌 데아미나아제(IlvA) 또는 트레오닌 디히드라타아제(TdcB)의 변형된 활성을 가질 수 있다. 또한, 이러한 균주들은, 예를 들어 메타노코커스 잔나스치(Methanococcus jannaschii)로부터 시트라말레이트 신타아제(CimA)가 과발현되게 할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 8,372,610 참조).

분지형 사슬 지방산 유도체

재조합 미생물(예를 들어, 대장균)은 탄소계 공급원료로부터 분지형 사슬 지방산 유도체를 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 탄소계 공급원료로부터 짝수 및 홀수 사슬 메틸-분지 지방산을 합성하는 대장균 균주는, 대장균이 홀수-사슬 지방산을 합성하게 하는 것에 더하여 변형을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 균주들은, 예를 들어 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 분지형 사슬 α-케토산 디하이드로게나아제 효소 복합체(Bkd) 및 리포아미드 디하이드로게나아제(lpd)를 과발현한다. 또한, 또 다른 구현예에서, 이러한 균주들은 이소류신 생합성 경로의 효소들, 예를 들어 아세토하이드록시산 이소메로리덕타아제(acetohydroxy acid isomeroreductase)(IlvC), 디하이드록시산 디히드라타아제(ilvD) 및 아세토하이드록시산 신타아제 II(IlvGM)의 변형된 활성을 갖는다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 8,530,221 참조). 다른 구현예들에서, 균주들은 분지형 사슬 지방산 유도체를 생산하기 위해 유사한 Bkd-유사 및 lpd-유사 효소 기능성 및/또는 이의 조합을 발현한다.

불포화 지방산 유도체

대부분의 미생물들(예를 들어, 대장균)은 포화 및 단일불포화 지방산을 자연적으로 합성한다. 재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 불포화 지방산 유도체를 많이(over)- 또는 적게 생산(underproduce)하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 포화 대 단일불포화 포화 지방산의 비율은, 특정 전사 조절자 단백질(transcriptional regulator protein), 예를 들어 FadR 및 FabR의 활성을 변형시킴으로써, 및/또는 (3R)-하이드록시미리스트올 아실기 운반 단백질 디히드라타아제(FabZ)(EC 4.2.1.-), β-하이드록시데카노일 티오에스테르 디히드라타아제/이소메라아제(FabA)(EC 4.2.1.60) 및 3-옥소아실-[아실기-운반-단백질] 신타아제 I(FabB)(EC 2.3.1.41)의 효소 활성을 직접 변형시킴으로써 변경될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 불포화 수준은 디새츄라아제(desaturase)(EC 1.14.19)의 과발현에 의해 더 증가될 수 있다. 이러한 균주들은 단일- 또는 이중-불포화 지방산을 합성할 수 있다. 또한, 또 다른 구현예에서, 이러한 균주들은 특정 페레독신 및/또는 페레독신 리덕타아제를 과발현한다. 따라서, 특이적 변형(위 참조)을 갖는 균주들이 조합될 때, 증가된 또는 감소된 양의 불포화 지방산 유도체가 생산될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 PCT 국제 공개 WO2013/019647 참조).

지방산

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 지방산을 과생산하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 미생물은 변형된 티오에스테라아제 효소 활성(EC 3.1.2.14)을 갖는다. 예를 들어, 지방산 생산은 특정 내인성 티오에스테라아제(예를 들어, TesA)를 조절해제(deregulate)하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제[예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르니 아(Umbellularia California)로부터의 FatB1]를 과발현함으로써 증가될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 출원 공개 2010/0154293 참조). 또 다른 구현예에서, 균주는 증가된 양의 지방산을 생산하기 위해 유사한(예를 들어, 티오에스테라아제-유사) 효소 기능성을 포함할 것이다.

지방산 에스테르

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 지방산 에스테르를 과생산하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 메탄올 또는 에탄올 및 탄소계 공급원료로부터 지방산 메틸 에스테르(FAME) 또는 지방산 에틸 에스테르(FAEE)와 같은 지방산 에스테르를 각각 생산하는 재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은, 예를 들어 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)로부터 에스테르 신타아제(ES)(EC 2.3.1.20)를 과발현한다. 또한, 다른 구현예들에서, 이러한 균주들은 변형된 티오에스테라아제 효소 활성(TE)(EC 3.1.2.14)을 갖고, 변형된 아실-CoA 신테타아제 활성(FadD)(EC 6.2.1.3)을 갖는다. 변형된 티오에스테라아제 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesA)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제[예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르니 아로부터의 FatB1 또는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 FatA3]를 과발현함으로써 달성될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 출원 공개 2010/0242345 및 2011/0072714 참조). 또 다른 구현예에서, 균주들은, 증가된 양의 지방산과 지방족 에스테르 둘 모두를 생산할 수 있는 티오에스테라아제와 같은 단일 효소를 과발현하기 위해 미생물을 조작함으로써, 변형된 티오에스테라아제 효소 활성 및 변형된 에스테르 신타아제 활성을 갖는다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 미국 특허 출원 공개 2010/0154293 참조).

3- 하이드록시 지방산

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 3-하이드록시 지방산을 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 3-하이드록시 지방산을 생산하는 재조합 미생물은 변형된 티오에스테라아제 효소 활성(EC 3.1.2.14)을 갖는다. 이 변형된 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesB)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제[예를 들어, 움벨루 라리아 칼리포르니아로부터의 FatB1 또는 슈도모나스 푸티다로부터의 PhaG]를 과발현함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 균주는 증가된 양의 3-하이드록시 지방산을 생산하기 위해 또 다른(예를 들어, 티오에스테라아제-유사) 효소 기능성을 포함할 것이다.

3- 하이드록시 지방산 에스테르

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 3-하이드록시 지방산 에스테르를 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 메탄올 또는 에탄올 및 탄소계 공급원료로부터 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)와 같은 3-하이드록시 지방족 에스테르를 각각 생산하는 재조합 대장균 균주들은, 예를 들어 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스로부터 에스테르 신타아제(ES)(EC 2.3.1.20)를 과발현한다. 또한, 이러한 균주들은 변형된 티오에스테라아제 활성(TE)(EC 3.1.2.14) 및 변형된 아실-CoA 신테타아제 활성(FadD)(EC 6.2.1.3)을 가질 수 있다. 변형된 티오에스테라아제 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesB)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제(예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르 니아로부터의 FatB1 또는 슈도모나스 푸티다로부터의 PhaG)를 과발현함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 균주는 증가된 양의 3-하이드록시 지방족 에스테르를 생산하기 위해 다른(예를 들어, 티오에스테라아제-유사 및/또는 에스테르 신타아제-유사) 효소 기능성을 포함할 것이다.

ω- 하이드록시 지방산

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 ω-하이드록시 지방산을 생산할 수 있다. 일 구현예에서, ω-하이드록시 지방산을 생산하는 재조합 대장균 균주들은 변형된 티오에스테라아제 효소 활성(EC 3.1.2.14)을 갖고, ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3)(아래의 표 2A 내지 2C 참조), 예를 들어 자족적(self-sufficient) 하이브리드[키메라(chimeric)] cypl53A 옥시게나아제를 과발현한다. 변형된 티오에스테라아제 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesA)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제(예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르니아로부터의 FatB1 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 FatA3)를 과발현함으로써 달성될 수 있다. 다른 구현예들에서, 균주는 증가된 양의 ω-하이드록시 지방산을 생산하기 위해 다른 효소 기능성(예를 들어, 티오에스테라아제-유사 및/또는 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제-유사)을 포함할 것이다(예를 들어, 본 명세서에서 인용 참조되는 PCT 국제 공개 WO2014/201474 A1 참조).

ω- 하이드록시 지방산 에스테르

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 ω-하이드록시 지방산 에스테르를 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 메탄올 또는 에탄올 및 탄소계 공급원료로부터 ω-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(ω-OH FAME) 또는 ω-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(ω-OH FAEE)와 같은 ω-하이드록시 지방족 에스테르를 각각 생산하는 재조합 대장균 균주들은, 예를 들어 마리노박터 하이드로 카보노클라스티쿠스로부터 에스테르 신타아제(ES)(EC 2.3.1.20), 및 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3)(아래의 표 2A 내지 2C 참조), 예를 들어 자족적 하이브리드(키메라) cypl53A 옥시게나아제를 과발현한다. 또한, 이러한 균주들은 변형된 티오에스테라아제 활성(TE)(EC 3.1.2.14) 및 변형된 아실-CoA 신테타아제 활성(FadD)(EC 6.2.1.3)을 가질 수 있다. 변형된 티오에스테라아제 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesA)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제(예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르니아로부터의 FatB1 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 FatA3)를 과발현함으로써 달성될 수 있다. 다른 구현예들에서, 균주는 증가된 양의 ω-하이드록시 지방산을 생산하기 위해 다른(예를 들어, 티오에스테라아제-유사, 및/또는 에스테르 신타아제-유사, 및/또는 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제-유사) 효소 기능성을 포함할 것이다(예를 들어, 위의 PCT 국제 공개 WO2014/201474 A1 참조).

α,ω -디카르복실산

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 α,ω-디카르복실산을 생산할 수 있다. 일 구현예에서, α,ω-디카르복실산을 생산하는 재조합 대장균 균주들은 변형된 티오에스테라아제 효소 활성(EC 3.1.2.14)을 갖고, ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3)(아래의 표 2A 내지 2C 참조), 예를 들어 자족적 하이브리드(키메라) cypl53A 옥시게나아제를 과발현한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 균주들은 추가 옥시다아제 또는 디하이드로게나아제, 예를 들어 슈도모나스 푸티다로부터의 알코올 옥시다아제(alkJ) 및 알데히드 디하이드로게나아제(alkH)(아래의 표 3A 및 표 3B 참조), 또는 이의 변형된 또는 과발현된 형태들을 포괄한다. 변형된 티오에스테라아제 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesA)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제(예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르니아로부터의 FatB1 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 FatA3)를 과발현함으로써 달성될 수 있다. 다른 구현예들에서, 균주는 증가된 양의 α,ω-디카르복실산을 생산하기 위해 다른(예를 들어, 티오에스테라아제-유사, 및/또는 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제-유사, 및/또는 디하이드로게나아제-유사, 및/또는 옥시다아제-유사) 효소 기능성을 포함할 것이다(예를 들어, 위의 PCT 국제 공개 WO2014/201474 A1 참조).

α,ω - 디카르복실 에스테르

재조합 미생물들(예를 들어, 대장균 균주들)은 탄소계 공급원료로부터 α,ω-디카르복실 에스테르를 생산할 수 있다. 일 구현예에서, 메탄올 또는 에탄올 및 탄소계 공급원료로부터 ω-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(ω-OH FAME) 또는 ω-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(ω-OH FAEE)와 같은 α,ω-디카르복실 에스테르를 각각 생산하는 재조합 대장균 균주들은, 예를 들어 마리노박터 하이드로카보노 클라스티쿠스로부터 에스테르 신타아제(ES)(EC 2.3.1.20), 및 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3)(아래의 표 2A 내지 2C 참조), 예를 들어 자족적 하이브리드(키메라) cypl53A 옥시게나아제, 및 추가 옥시다아제 또는 디하이드로게나아제, 예를 들어 슈도모나스 푸티다로부터의 알코올 옥시다아제(alkJ) 및 알데히드 디하이드로게나아제(alkH)(아래의 표 3A 및 표 3B 참조)를 과발현한다. 또한, 또 다른 구현예에서, 이러한 균주들은 변형된 티오에스테라아제 활성(TE)(EC 3.1.2.14) 및 변형된 아실-CoA 신테타아제 활성(FadD)(EC 6.2.1.3)을 갖는다. 변형된 티오에스테라아제 효소 활성은 특정 내인성 티오에스테라아제 유전자(예를 들어, TesA)를 조절해제하거나 변형시킴으로써, 또는 외인성 티오에스테라아제(예를 들어, 움벨루라리아 칼리포르니아로부터의 FatB1 또는 아라비돕시스 탈리 아나로부터의 FatA3)를 과발현함으로써 달성될 수 있다. 다른 구현예들에서, 균주는 증가된 양의 α,ω-디카르복실 에스테르를 생산하기 위해 다른(예를 들어, 티오에스테라아제-유사, 및/또는 에스테르 신타아제-유사, 및/또는 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제-유사, 및/또는 디하이드로게나아제-유사 및/또는 옥시다아제-유사) 효소 기능성을 포함할 것이다(예를 들어, 위의 PCT 국제 공개 WO2014/201474 A1 참조).

표 2A: ω- 하이드록실라아제 /ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3)의 예시

표 2B: ω- 하이드록실라아제 /ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3)의 산화환원 파트너(Redox Partner)의 예시

표 2C: 자족적 ω-1, ω-2, ω-3- 하이드록실라아제 /옥시게나아제(EC 1.14.14.1)의 예시

표 3A: 알코올 디하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1/2) 또는 알코올 옥시다아제(EC 1.1.3.13, EC 1.1.3.20)의 예시

표 3B: 알데히드 디하이드로게나아제 (EC 1.2.1.3/4/5/) 또는 알데히드 옥시다아제(EC 1.2.3.1)의 예시

변경된 효소 기능성을 통한 대사 변형

FadR(위의 표 1 참조)은 지방산 분해 및 지방산 생합성 경로들에 관련된 핵심 조절 인자이다(Cronan 외, (1998) Mol . Microbiol ., 29(4):937-943). 대장균 효소 FadD(위의 표 1 참조) 및 지방산 수송 단백질 FadL은 지방산 흡수 시스템의 구성요소들이다. FadL은 지방산의 박테리아 세포로의 수송을 매개(mediate)하고, FadD는 아실-CoA 에스테르의 형성을 매개한다. 다른 탄소 공급원이 이용가능하지 않을 때, 외인성 지방산이 박테리아에 의해 흡수되고, 아실-CoA 에스테르로 전환되며, 이는 전사 인자 FadR에 결합할 수 있고, 지방산 수송(FadL), 활성화(FadD) 및 β-산화(FadA, FadB 및 FadE)를 담당하는 단백질들을 코딩하는 fad 유전자들의 발현을 저하(depress)시킬 수 있다. 대안적인 탄소원들이 이용가능할 때, 박테리아는 아실-ACP로서 지방산을 합성하며, 이는 β-산화에 대한 기질이 아니라, 인지질 합성(phospholipid synthesis)에 사용된다. 따라서, 아실-CoA 및 아실-ACP 둘 모두는 상이한 최종 산물을 야기할 수 있는 지방산들의 독립적인 공급원들이다(Caviglia 외, (2004) J. Biol . Chem., 279(12):1163-1169).

예시적인 일 구현예에서, 경로들은 ω-하이드록시 지방산 유도체들을 생산하기 위해 글루코오스와 같은 재생가능한 공급원료를 이용한다. 글루코오스는 원래의 유기체에 의해 아실-ACP로 전환된다. 지방산 분해 효소 활성을 갖는 폴리펩티드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 의도한 산물에 따라 선택적으로 감쇠될 수 있다. 이러한 폴리펩티드들의 비-제한적인 예시들은 아실-CoA 신테타아제(FadD) 및 아실-CoA 디하이드로게나아제(FadE)이다. 표 1은 해당 기술 분야에 알려진 방법들에 따라 선택적으로 감쇠될 수 있는 다양한 지방산 분해 효소들을 포함하는, 대사 경로 내의 효소 활성의 포괄적인 목록(위 참조)을 제공한다.

또 다른 예시적인 구현예에서, 경로들은 α,ω-이산을 생산하기 위해 글루코오스와 같은 재생가능한 공급원료를 이용한다. 특정한 일 구현예에서, 전구체 중간체로서 C₁₂ 유리 지방산을 이용하거나 중간체로서 C₁₂ 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 이용하는, 2 개의 유사한 경로를 통해 아실-ACP가 α,ω-이산으로 전환될 수 있다.

또 다른 예시적인 구현예는 ω-하이드록시 지방산, ω-옥소 지방산 및 α,ω-이산을 포함하는 다양한 화학 화합물들의 생산을 고려한다. 이를 수행하기 위해, 티오에스테라아제는 아실-ACP를 유리 지방산으로 전환하는 데 이용된다. 여기서, 티오에스테라아제를 코딩하는 유전자는 tesA, 'tesA, tesB, fatB1, fatB2, fatB3, fatA1 또는 fatA일 수 있다(또한, 위의 표 1 참조). ω-옥시게나아제로서 알려진 ω-하이드록실라아제가 ω-하이드록시 지방산을 생성하는 데 사용될 수 있다. 적절한 ω-하이드록실라아제/ω-옥시게나아제(EC 1.14.15.3) 및 이의 산화환원 파트너의 예시가 표 2A 및 2B에 목록화되어 있다(위 참조). 이들은 특정 비-헴 이철 옥시게나아제(non-heme di-iron oxygenase)(예를 들어, 슈도모나스 푸티다 GPol으로부터의 alkB), 또는 시토크롬 P450으로도 알려진 특정 헴-타입 P450 옥시게나아제(예를 들어, 마리노박터 아쿠애올레이로부터의 cypl53A)이다. 시토크롬 P450은 편재하여 분포된 효소들이며, 이는 높은 복잡성을 갖고, 광범위한 활성 분야를 나타낸다. 이들은 광범위하고 다양한 기질들을 전환시키고 관심 있는 다양한 화학적 반응들을 촉매화하는 유전자들의 상과(superfamily)에 의해 코딩되는 헴단백질(hemoprotein)이다. Cyp153A는 ω-위치에 대해 높은 선택성을 갖는 탄화수소 사슬들을 수산화하는 가용성 박테리아 시토크롬 P450 계열이다(van Beilen 외 (2006) Appl. Environ. Microbiol. 72:59-65). cyp153A 계열의 요소들은, 알칸, 지방산 또는 지방족 알코올, 예를 들어 미코박테리움 종 HXN-1500으로부터의 cyp153A6(Funhoff 외 (2006) J. Bacteriol . 188:5220-5227), 미코박테리움 마리눔으로부터의 cyp153A16, 및 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.) JS666으로부터의 cyp153A(Scheps 외 (2011) Org . Biomol. Chem. 9:6727-6733), 또는 마리노박터 아쿠애올레이로부터의 cyp153A(Honda-Malca 외 (2012) Chem . Commun. 48:5115-5117)의 ω-위치를 선택적으로 수산화하기 위해, 시험관 내에서 나타내어졌다.

따라서, 본 발명은 생체 내에서 α,ω-이작용성 지방산 유도체를 포함하는 ω-하이드록시 지방산 유도체를 효율적으로 그리고 선택적으로 생산할 수 있는 미생물들을 제공한다. ω-하이드록시 지방산 메틸 에스테르를 통한 α,ω-이산에 대한 루트(route), 또는 α,ω-지방산 디메틸 에스테르를 통한 α,ω-이산에 대한 루트가 유익할 수 있는데, 이는 대규모 생산 및 회수(recovery)에 대한 장점들을 제공하는 메틸 에스테르가 하전(charge)되지 않기 때문이다. 또한, 알코올 디하이드로게나아제 또는 옥시다아제는 ω-하이드록시 지방산을 ω-옥소 지방산으로 전환할 수 있다(위의 표 3A는 이 단계를 촉매화하는 데 사용될 수 있는 알코올 디하이드로게나아제 또는 옥시다아제의 효소 활성을 갖는 폴리펩티드들을 나타낸다). 예를 들어, 12-하이드록시 도데칸산 또는 12-하이드록시 도데칸산 메틸 에스테르를 12-옥소 도데칸산 또는 12-옥소 도데칸산 메틸 에스테르로 산화할 수 있는 적절한 효소들은 알코올 옥시다아제[플라빈단백질(flavoprotein), 예를 들어 슈도모나스 푸 티다로부터의 alkJ](EC 1.1.3.13, EC 1.1.3.20) 또는 NAD(P)-의존적 알코올 디하이드로게나아제(예를 들어, 로도코커스 루버로부터의 cddC)(EC 1.1.1.1)(위의 표 3A 참조)이다.

재조합 미생물 및 발효

숙주 세포를 통해 지방산 유도체를 생산하기 위해, 생산 숙주 세포들 또는 미생물들(위 참조)에 대한 다수의 변형들이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 비조작된 또는 원래의 숙주 세포들(예를 들어, 대조 세포들로서 기능하는 야생형 숙주 세포들)에 대해 지방산 생합성 경로를 제공하도록 조작된 재조합 숙주 세포들을 제공하며, 이는 예를 들어 특이적 균주 개선을 통해 달성된다. 박테리아, 시아노박테리아, 효모, 조류 또는 사상균류(filamentous fungi)와 같은 미생물들이 생산 숙주로서 사용될 수 있다. 생산 숙주로서 사용될 수 있는 미생물들의 비-제한적인 예시들은 대장균, S. 세레비지에 등(아래 참조)을 포함한다.

미생물 균주들은 글루코오스 또는 다른 재생가능한 공급원료를 지방산 또는 지방산 에스테르, 예컨대 지방산 메틸 에스테르(FAME), 지방산 에틸 에스테르(FAEE), 및 다른 지방산 유도체(위 참조)로 효율적으로 전환시킨다. 이를 달성하기 위해, 균주들이 지방산의 생산을 위해 티오에스테라아제(예를 들어, 대장균으로부터의 TesA)를 포함하거나 FAME 또는 FAEE의 생산을 위해 에스테르 신타아제(예를 들어, M. 하이드로카보노클라스티쿠스로부터의 ES9)를 포함하는 핵심 효소들을 발현하도록 세심하게 조작된다. 다양한 화합물의 생산을 위한 고밀도 발효를 위한 프로토콜들 및 절차들이 확립되었다(본 명세서에서 모두 인용 참조되는 미국 특허 8,372,610; 8,323,924; 8,313,934; 8,283,143; 8,268,599; 8,183,028; 8,110,670; 8,110,093; 및 8,097,439 참조).

유전자 조작 기술들을 이용함으로써, 생체촉매로서 기능할 수 있는 미생물 숙주 세포들에 본 명세서에 설명된 효소 단계들이 추가될 수 있다. 일 구현예에서, 발효 산물이 세포의 외부에서 분비되며, 이는 합성 방법들을 통해 향료 성분으로의 용이한 전환을 허용한다. 특이적 지방산 유도체의 직접적인 생산을 위해 미생물 세포에서 특정 재조합 효소 단계들이 조합될 수 있다. 특히, 예를 들어 글루코오스, 또는 외인성 지방산 또는 파라핀 이외의 다른 재생가능한 공급원료로부터 α,ω-이산을 포함하는 이작용성물질과 같이 ω-하이드록시 지방산 유도체를 직접적으로 또한 효율적으로 생산하는 방법들이 이제까지 존재하지 않았다. 이러한 이작용성 지방산 유도체는 향료 성분을 생성하기에 적합한 전구체들이다. ω-하이드록시 지방산 유도체를 포함하는 지방산 유도체의 생산을 위한 발효 기반 방법은 해당 기술 분야에 이용되는 화학적 방법들에 대해 빠르고 환경 친화적인 대안을 제공한다.

본 방법은 재생가능한 바이오매스 유래 재료(즉, 재생가능한 공급원료), 예컨대 옥수수, 사탕수수 또는 목질계 바이오매스로부터의 탄수화물; 또는 글리세롤, 플루-가스, 합성-가스와 같은 폐기물; 또는 바이오매스 또는 천연 가스 또는 이산화탄소와 같은 유기 재료의 개량물로부터 지방산 유도체의 직접적인 생산을 제공한다. 이 점에서, 본 방법은 이러한 중요한 중간체의 생산을 위해 대안적인 재생가능한 소스를 제공한다. 본 방법은 화합물들이 단순 재생가능한 공급원료로부터 직접적으로 또한 선택적으로 생산되게 하기 때문에, 비용 및 환경적 안전의 관점에서 확실한 장점들이 존재한다. 본 방법은, 발효 브로쓰에서 재조합 미생물(예를 들어, 숙주 세포)을 제공함으로써 지방산 유도체를 생산하는 단계; 발효 브로쓰에 재생가능한 공급원료를 첨가하는 단계; 및 지방산 유도체를, 향료 성분을 위한 빌딩 블록(building block)을 제공하는 락톤 및/또는 매크로사이클릭 케톤과 같은 화학물질로 합성적으로 전환시키기 위해, 발효 브로쓰로부터 지방산 유도체를 선택적으로 분리하는 단계를 포함한다. 예시적인 일 구현예에서, 특정 미생물의 숙주 세포는 티오에스테라아제 또는 에스테르 신타아제 및 ω-하이드록실라아제를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 2 개의 핵산 서열을 발현하도록 조작된 경로를 포함한다.

몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 약 2 g/L 내지 약 100 g/L의 재생가능한 공급원료와 같은 탄소원의 초기 농도를 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 다른 구현예들에서, 배양 배지는 약 2 g/L 내지 약 10 g/L의 탄소원, 약 10 g/L 내지 약 20 g/L의 탄소원, 약 20 g/L 내지 약 30 g/L의 탄소원, 약 30 g/L 내지 약 40 g/L의 탄소원, 또는 약 40 g/L 내지 약 50 g/L의 탄소원의 초기 농도를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 배양 배지에서의 탄소원의 수준에 대해 발효가 모니터링될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 방법은 배지에서의 탄소원의 수준이 약 0.5 g/L 미만일 때 배양 배지에 보충 탄소원을 첨가하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 배지에서의 탄소원의 수준이 약 0.4 g/L 미만, 약 0.3 g/L 미만, 약 0.2 g/L 미만, 또는 약 0.1 g/L 미만일 때, 보충 탄소원이 배양 배지에 첨가된다. 몇몇 구현예들에서, 약 1 g/L 내지 약 25 g/L의 탄소원 수준을 유지하기 위해 보충 탄소원이 첨가된다. 몇몇 구현예들에서, 약 2 g/L 이상(예를 들어, 약 2 g/L 이상, 약 3 g/L 이상, 약 4 g/L 이상)의 탄소원 수준을 유지하기 위해 보충 탄소원이 첨가된다. 특정 구현예들에서, 약 5 g/L 이하(예를 들어, 약 5 g/L 이하, 약 4 g/L 이하, 약 3 g/L 이하)의 탄소원 수준을 유지하기 위해 보충 탄소원이 첨가된다. 몇몇 구현예들에서, 약 2 g/L 내지 약 5 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 또는 약 10 g/L 내지 약 25 g/L의 탄소원 수준을 유지하기 위해 보충 탄소원이 첨가된다. 몇몇 구현예들에서, 탄소원은 글루코오스, 또는 글리세롤과 같은 다른 타입의 재생가능한 공급원료이다.

몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 약 1 g/L 내지 약 200 g/L의 농도로 생산된다. 몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 약 1 g/L 이상(예를 들어, 약 1 g/L 이상, 약 10 g/L 이상, 약 20 g/L 이상, 약 50 g/L 이상, 약 100 g/L 이상)의 농도로 생산된다. 몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 약 1 g/L 내지 약 170 g/L, 약 1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 40 g/L 내지 약 170 g/L, 약 100 g/L 내지 약 170 g/L, 약 10 g/L 내지 약 100 g/L, 약 1 g/L 내지 약 40 g/L, 약 40 g/L 내지 약 100 g/L, 약 1 g/L 내지 약 100 g/L의 농도로 생산된다.

몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 약 25 mg/L, 약 50 mg/L, 약 75 mg/L, 약 100 mg/L, 약 125 mg/L, 약 150 mg/L, 약 175 mg/L, 약 200 mg/L, 약 225 mg/L, 약 250 mg/L, 약 275 mg/L, 약 300 mg/L, 약 325 mg/L, 약 350 mg/L, 약 375 mg/L, 약 400 mg/L, 약 425 mg/L, 약 450 mg/L, 약 475 mg/L, 약 500 mg/L, 약 525 mg/L, 약 550 mg/L, 약 575 mg/L, 약 600 mg/L, 약 625 mg/L, 약 650 mg/L, 약 675 mg/L, 약 700 mg/L, 약 725 mg/L, 약 750 mg/L, 약 775 mg/L, 약 800 mg/L, 약 825 mg/L, 약 850 mg/L, 약 875 mg/L, 약 900 mg/L, 약 925 mg/L, 약 950 mg/L, 약 975 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1050 mg/L, 약 1075 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1125 mg/L, 약 1150 mg/L, 약 1175 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1225 mg/L, 약 1250 mg/L, 약 1275 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1325 mg/L, 약 1350 mg/L, 약 1375 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1425 mg/L, 약 1450 mg/L, 약 1475 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1525 mg/L, 약 1550 mg/L, 약 1575 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1625 mg/L, 약 1650 mg/L, 약 1675 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1725 mg/L, 약 1750 mg/L, 약 1775 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1825 mg/L, 약 1850 mg/L, 약 1875 mg/L, 약 1900 mg/L, 약 1925 mg/L, 약 1950 mg/L, 약 1975 mg/L, 약 2000 mg/L(2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 1O g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 1OO g/L 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정되는 범위의 역가로 생산된다. 다른 구현예들에서, ω-지방산 유도체는 1OO g/L 초과, 200 g/L 초과 또는 300 g/L 초과, 또는 500 g/L, 700 g/L, 1000 g/L, 1200 g/L, 1500 g/L 또는 2000 g/L과 같은 더 높은 역가로 생산된다. 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체의 바람직한 역가는 5 g/L 내지 200 g/L, 1O g/L 내지 150 g/L, 20 g/L 내지 120 g/L, 및 30 g/L 내지 1OO g/L이다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 ω-지방산 유도체의 역가는 약 1 g/L 내지 약 250 g/L, 더 구체적으로는 90 g/L 내지 약 120 g/L이다. 역가는 특정 지방산 유도체 또는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생산된 지방산 유도체들의 조합을 지칭할 수 있다.

다른 구현예들에서, 본 발명의 방법들에 따라 지방산 유도체들을 생산하도록 조작된 숙주 세포들은 적어도 1 %, 적어도 2 %, 적어도 3 %, 적어도 4 %, 적어도 5 %, 적어도 6 %, 적어도 7 %, 적어도 8 %, 적어도 9 %, 적어도 10 %, 적어도 11 %, 적어도 12 %, 적어도 13 %, 적어도 14 %, 적어도 15 %, 적어도 16 %, 적어도 17 %, 적어도 18 %, 적어도 19 %, 적어도 20 %, 적어도 21 %, 적어도 22 %, 적어도 23 %, 적어도 24 %, 적어도 25 %, 적어도 26 %, 적어도 27 %, 적어도 28 %, 적어도 29 % 또는 적어도 30 % 또는 적어도 40 %, 또는 상기 값들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정되는 범위의 수율을 갖는다. 다른 구현예들에서, 지방산 유도체 또는 유도체들은 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상을 초과하는 수율로 생산된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 수율은 약 30 % 이하, 약 27 % 이하, 약 25 % 이하 또는 약 22 % 이하이다. 따라서, 수율은 상기 종단점들 중 어느 두 개의 값들에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 수율은 5 % 내지 15 %, 10 % 내지 25 %, 10 % 내지 22 %, 15 % 내지 27 %, 18 % 내지 22 %, 20 % 내지 28 %, 또는 20 % 내지 30 %일 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 수율은 약 10 % 내지 약 40 %이다. 또 다른 특정 구현예에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 수율은 약 25 % 내지 약 30 %이다. 수율은 특정 지방산 유도체 또는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생산된 지방산 유도체들의 조합을 지칭할 수 있다. 또한, 수율은 사용되는 공급원료에도 의존적일 것이다.

몇몇 구현예들에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 생산성은 적어도 100 mg/L/시간, 적어도 200 mg/L/시간, 적어도 300 mg/L/시간, 적어도 400 mg/L/시간, 적어도 500 mg/L/시간, 적어도 600 mg/L/시간, 적어도 700 mg/L/시간, 적어도 800 mg/L/시간, 적어도 900 mg/L/시간, 적어도 1000 mg/L/시간, 적어도 1100 mg/L/시간, 적어도 1200 mg/L/시간, 적어도 1300 mg/L/시간, 적어도 1400 mg/L/시간, 적어도 1500 mg/L/시간, 적어도 1600 mg/L/시간, 적어도 1700 mg/L/시간, 적어도 1800 mg/L/시간, 적어도 1900 mg/L/시간, 적어도 2000 mg/L/시간, 적어도 2100 mg/L/시간, 적어도 2200 mg/L/시간, 적어도 2300 mg/L/시간, 적어도 2400 mg/L/시간, 또는 적어도 2500 mg/L/시간이다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 생산성은 500 mg/L/시간 내지 2500 mg/L/시간, 또는 700 mg/L/시간 내지 2000 mg/L/시간일 수 있다. 일 구현예에서, 생산성은 약 0.7 mg/L/h 내지 약 3 g/L/h이다. 생산성은 특정 지방산 유도체 또는 주어진 재조합 숙주 세포 배양물에 의해 생산된 지방산 유도체들의 조합을 지칭할 수 있다.

몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 균류 세포, 및/또는 사상균류 세포로부터 선택된다. 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 에스체리치 아(Escherichia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 로 도코커스(Rhodococcus) 속, 시네코코커스(Synechococcus) 속, 시네코시스티 스(Synechocystis) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 트리코데르마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium) 속, 후미콜 라(Humicola) 속, 리조무코르(Rhizomucor) 속, 클루이 베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 무코르(Mucor) 속, 미셀리오 프토라(Myceliophtora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 파네로카에 테(Phanerochaete), 플레우로투스(Pleurotus), 트라메테스(Trametes), 크리소스포 리움(Chrysosporium) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택된다.

다른 구현예들에서, 숙주 세포는 바실러스 렌투스(Bacillus lentus) 세포, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 세포, 바실러스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) 세포, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus lichenoformis) 세포, 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus) 세포, 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 세포, 바실러스 키르쿨란스(Bacillus circulans) 세포, 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 세포, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포, 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) 세포, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 세포, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포, 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 세포이다. 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 시네코코커스 종 PCC7002 , 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus) PCC 7942, 시네코시스티스 종 PCC 6803, 시네코코커스 엘롱가투스 PCC6301, 프로클로로코커스 마리누스(Prochlorococcus marinus) CCMP 1986(MED4), 아나베나 바 리아빌리스(Anabaena variabilis) ATCC29413, 노스톡 펑크티포르메(Nostoc punctiforme) ATCC29133(PCC73102), 글로에오박터 비올라세우 스(Gloeobacter violaceus) ATCC29082(PCC7421), 노스톡 종(Nostoc sp .) ATCC27893 (PCC7120), 시아노테세 종(Cyanothece sp .) PCC7425(29141), 시아노테세 종 ATCC51442, 시네코코커스 종 ATCC27264(PCC7002)이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 트리코데르마 코닌지(Trichoderma koningii) 세포, 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포, 트리코데르마 르에세이(Trichoderma reesei) 세포, 트리코데르마 롱기브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum) 세포, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 세포, 아스페르길루스 푸미가테스(Aspergillus fumigates) 세포, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus) 세포, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포, 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 세포, 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose) 세포, 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) 세포, 리조무코르 미 에헤이(Rhizomucor miehei) 세포, 또는 무코르 미에헤이(Mucor michei) 세포이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 방선균(Actinomycetes) 세포이다. 또 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포 또는 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus) 세포이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지에 세포이다.

또 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 진핵 식물, 조류, 남세균(cyanobacterium), 녹색-황 세균, 녹색 비-황 세균(green non-sulfur bacterium), 자색 황 세균, 자색 비-황 세균, 극한 생물(extremophile), 효모, 균류, 이의 조작된 유기체, 또는 합성 유기체로부터의 세포이다. 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 아라비돕시스 탈리아나, 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 미스칸투스 기간테우스(Miscanthus giganteus), 제아 메이스(Zea mays), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcuse braunii), 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii), 두나리엘라 살리나(Dunaliela salina), 서모시네코코커스 엘롱가투스, 클로로비움 테피둠(Chlorobium tepidum), 클로로프렉수스 아우란티쿠스(Chlorojlexus auranticus), 크로마티움 비노숨(Chromatiumm vinosum), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 로도박터 캡술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 파루스리스(Rhodopseudomonas palusris), 클로스트리 디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디우서모셀룸(Clostridiuthermocellum), 또는 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)으로부터의 세포이다. 다른 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지 에, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 스키조사카로마이세스 폼 베(Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다, 또는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터의 세포이다. 또 다른 구현예들에서, 숙주 세포는 시네코코커스 종 PCC 7002, 시네코코커스 종 PCC 7942 또는 시네코시스티스 종 PCC6803으로부터의 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Cvl 세포, MDCK 세포, 293 세포, 3T3 세포, 또는 PC12 세포이다. 특정 구현예들에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 대장균 세포는 균주 B, 균주 C, 균주 K, 또는 균주 W 대장균 세포이다.

비-자연적으로 발생하는 미생물 숙주 세포들 또는 미생물들은 안정한 유전적 변경을 포함할 수 있다. 이러한 미생물들은 변경의 손실 없이 5 세대 이상(greater than five generations)를 위해 배양될 수 있다. 일반적으로, 안정한 유전적 변경은, 10 세대 이상을 지속하는 변형을 포함하며, 특히 안정한 변형은 약 25 세대 이상, 또는 50 세대 이상(무기한으로 포함함)을 지속할 것이다.

해당 기술분야의 당업자라면, 본 명세서에 예시된 대사 변형을 포함하는 유전적 변경이 대장균과 같은 기준 유기체 및 그 대응하는 대사 반응들에 대해 설명될 수 있음을 이해할 것이다. 하지만, 유전체학의 영역에서 높은 수준의 스킬(skill)과 여러 다양한 유기체들의 완전한 게놈 서열을 제공한다면, 해당 기술분야의 당업자는 다수의 다른 유기체들에 본 명세서에 제공된 교시 및 안내를 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 예시된 대사 변경은 기준 종 이외의 종으로부터 동일 또는 유사 코딩 핵산을 통합함으로써 다른 종에 쉽게 적용될 수 있다. 이러한 유전적 변경은, 예를 들어 종의 유전적 변경을 위해, 일반적으로 동족체, 그리고 특히 오솔로그, 파랄로그 또는 비-오솔로그 유전자 전이를 포함한다.

몇몇 구현예들에서, 하나 이상의 락톤 산물(예를 들어, 감마 또는 델타 락톤), 하나 이상의 매크로락톤 산물, 또는 하나 이상의 매크로사이클릭 케톤 산물 등을 제조하는 화학효소 공정들이 제공된다. 이러한 공정들은, (i) 지방산 유도체 생산을 위해 대사 변형의 세트를 포함하는 비-자연적으로 발생하는 미생물 유기체를 배양하는 단계 - 대사 변형의 세트는 (a) 티오에스테라아제, (b) 오메가 하이드록실라아제 및 (c) 에스테르 신타아제 중 하나 이상을 포함하고, 미생물 유기체는 하나 이상의 지방산 유도체를 제공하며, 상기 배양하는 단계는 탄소계 공급원료에서 수행되고, 지방산 유도체의 적어도 하나의 타입은 수산화, 불포화, 에스테르화, 또는 이의 조합을 포함함 -, 및 (ii) 락톤, 매크로락톤 또는 매크로사이클릭 케톤 산물을 생산하기에 충분한 조건들 하에서 비-효소 시약과 지방산 유도체를 생체 외에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 본 명세서에 개시된 방법들은 접촉시키는 단계 이전에 지방산 유도체를 분리시키는 단계를 더 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 산물이 분비되고, 지방산 유도체가 원심분리, 디캔테이션(decantation), 추출, 여과 등의 여하한의 조합에 의해 분리될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 세포로부터 분비되고, 접촉시키는 단계는 배양하는 단계로부터 지방산 유도체를 분리하지 않고 수행된다.

화학적 형질전환

I. 개시 재료(Starting Material) 및 전구체

앞서 언급된 유기체들의 이용은 지방산 유도체의 형태로 된 다수의 생합성 재료로의 접근을 제공한다. 지방산 유도체는 귀중한 원자재 화합물(commodity compound)로의 후속 합성 유기 형질전환을 위한 전구체로서 사용된다. 몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 불포화 지방산, 불포화 지방산 에스테르, ω-하이드록시 지방산, ω-하이드록시 불포화 지방산, ω-하이드록시 지방산 에스테르, ω-하이드록시 불포화 지방산 에스테르, 3-하이드록시 지방산, 3-하이드록시 불포화 지방산, 3-하이드록시 지방산 에스테르, 3-하이드록시 불포화 지방산 에스테르, 및 이의 조합을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음).

몇몇 구현예들에서, 불포화되는 지방산 유도체는 단일불포화된다. 예를 들어, 불포화 지방산 에스테르는 단일불포화될 수 있다. 이러한 몇몇 구현예들에서, 불포화 지방산 에스테르는 불포화 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 불포화 지방산 에틸 에스테르(FAEE)일 수 있다. 따라서, 단일불포화되는 불포화 FAME 또는 불포화 FAEE가 제공될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 불포화 FAME 및 불포화 FAEE로부터 선택되는 불포화 지방산 에스테르로의 접근이 제공될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 단일불포화되는 ω-하이드록시 불포화 지방산으로의 생합성 접근이 제공될 수 있다.

몇몇 구현예들에서, 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)인 3-하이드록시 지방산 에스테르로의 접근이 제공될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, ω-하이드록시 지방산 에스테르는 오메가-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(ω-OH FAME) 또는 오메가-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(ω-OH FAEE)일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 오메가-하이드록시 불포화 지방산 에스테르는 단일불포화될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 단일불포화 오메가-하이드록시 지방산 에스테르는 ω-하이드록시 단일불포화 지방산 메틸 에스테르(ω-OH 단일불포화 FAME) 및 ω-하이드록시 단일불포화 지방산 에틸 에스테르(ω-OH 단일불포화 FAEE)를 포함할 수 있다(단, 이로 제한되지 않음). 또한, 몇몇 구현예들에서, 3-하이드록시 불포화 지방산은 단일불포화될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 3-하이드록시 지방산 에스테르는 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 3-하이드록시 불포화 지방산 에스테르는 단일불포화될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 단일불포화 3-하이드록시 지방산 에스테르는 단일불포화 3-OH FAME 또는 단일불포화 3-OH FAEE일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 불포화 α,ω-이산 또는 불포화 α,ω-이산 에스테르는 단일불포화될 수 있다. 이러한 단일불포화 α,ω-이산 에스테르는 반산(half-acid) 에스테르, 예컨대 반산 메틸 또는 에틸 에스테르일 수 있다. 다른 구현예들에서, 단일불포화 α,ω-이산 에스테르는 디에스테르, 예컨대 메틸 디에스테르 또는 에틸 디에스테르일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 지방산 유도체는 홀수-번호 탄소 사슬, 메틸-분지 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

II. 시약

본 명세서에 개시된 유기체들에 의해 제공되는 지방산 유도체 개시 재료들의 다양성의 관점에서, 귀중한 유기 산물로의 접근이 쉽게 달성될 수 있다. 일반적으로, 후속 유기 형질전환은 하나 이상의 생합성-후 조작(post-biosynthesis manipulation)(들)을 포괄한다. 몇몇 구현예들에 따르면, 시약은 비-효소성일 수 있다. 일 구현예에서, 시약은 양자성 산(protic acid)이다. 양자성 산의 예시는 염산, 황산 및 인산을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또 다른 구현예에서, 시약은 회수가능한 수지산이다. 다른 구현예들에서, 시약은 루이스 산(Lewis acid)이다. 이러한 몇몇 구현예들에서, 루이스 산은 오가노스태난 에스테르교환반응 촉매, 마그네슘 구리 또는 아연 염, 실버 트리플레이트 및 제올라이트일 수 있다. 루이스 산의 예시는 LiBr, MgBr₂, CsBr, ZnBr₂, ZnCl₂, CuBr, Cu(CF₃SO₄)₂, BF_3.OEt₂, KBr, TiCl₄, SnCl₂, ScCl₃, VC_l3, AlCl₃, InCl₃, Al₂CO₃, CeCl₃, Ag₂O, ZnClO₄, LiClO₄, Ti{OCH(CH₃)₂}₄ 및 이의 여하한의 복합체 및 조합을 포함한다(이로 제한되지 않음). 또 다른 구현예들에서, 시약은 펩티드 커플링제(peptide coupling agent)일 수 있다. 이러한 몇몇 구현예들에서, 펩티드 커플링제는 배양 브로쓰에서 반응들을 직접적으로 촉진시키는 수계(aqueous system)와 화합가능할(compatible) 수 있다. 따라서, 예를 들어 이러한 시약들은 수용성 카르보디이미드 시약을 포함할 수 있다. 커플링제는 N,N-디사이클로카르보디이미드(DCC), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보네이트(EDC)와 같은 카르보디이미드를 포함할 수 있고(이로 제한되지 않음), 이는 아실 활성화제, 예컨대 하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 포스포늄 및 우로님 시약(uronim reagent), 예컨대 벤조트리아졸-1-일 옥시-트리 (디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 그 트리스-피롤리딘 변이체(PyBOP), O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N-2-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 또는 O-피리도트리아졸일 변이체(HATU), 또는 옥심계 시약, 예컨대 에틸 시아노(하이드록시이미노)아세테이트-O2)-트리-(1-피롤리딘일)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyOxim) 또는 그 디메틸아미노-모폴리노 변이체(COMU)와 함께 선택적으로 사용될 수 있다.

III. 락톤

몇몇 구현예들에서, 락톤은 감마-락톤(γ-락톤), 델타-락톤(δ-락톤), 또는 이의 조합이다. 몇몇 구현예들에서, 이러한 산물의 총 탄소 수(carbon count)는 C₈ 내지 C₁₈일 수 있다. 예를 들면, 아래의 반응식 I에 나타낸 바와 같이 불포화 지방산의 직접적 락톤화에 실버 트리플레이트가 이용되었다(예를 들어, Goossen 외 (2010) Green Chem. 12:197-200 참조).

반응식 I

또한, 양자성 산은 락톤 산물을 제공하기 위해 나타내어졌다(예를 들어, Isbell 외 (1997) J. Am. Oil Chemists Soc . 74(2):153-158 참조). 몇몇 구현예들에서, 포화 및 불포화된 γ- 및 δ-락톤으로의 접근은, 예를 들어 아래의 반응식 II에 나타내어진 바와 같이 탈수화 및 탈포합 락톤화(deconjugative lactonization)를 통해 3-하이드록시 치환 지방산 유도체로부터 접근가능할 수 있다.

반응식 II

특히, 감마 락톤은 루이스 산으로 처리 시 대응하는 베타-락톤의 고리 확장을 통해 3-하이드록시 포화 및 불포화 지방산 유도체로부터 접근가능하다(예를 들어, Mulzer 외 (1979) Angew . Chemie Int . Ed. Engl ., 18:793-794 참조). 3-하이드록시 지방산 유도체로부터의 베타 락톤 접근은 아릴술포닐 클로라이드/피리딘으로 3-하이드록시산의 처리에 의해 달성될 수 있다. 대안적인 구현예들에서, 베타 락톤 기능성은 생합성 서열 내로 구축될 수 있다. 실온에서의 마그네슘 브로마이드와 같이, 마일드한(mild) 조건들 하에서, 베타 락톤은, 아래의 반응식 III에 나타내어진 바와 같이, 대응하는 감마 락톤에 대해 루이스 산 촉매화 디오트로픽 재배열(dyotropic rearrangement)[고리 변형(ring strain)의 해제에 의해 구현됨]을 거칠 수 있다.

반응식 III

몇몇 구현예들에서, 락톤은 C₈ 내지 C₁₈ 매크로락톤이다. 매크로락톤 산물은 디락톤 산물을 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예들에서, 매크로락톤 산물에 대한 개시 재료는 포화 또는 단일불포화 오메가 하이드록시(ω-OH) 산 또는 이산, 또는 반산 에스테르를 포함할 수 있다. 아래의 반응식 Ⅳ는 이산으로부터 유래된 2 개의 에스테르 기능성을 갖는 매크로락톤 산물의 일 예시를 나타낸다.

반응식 Ⅳ

매크로락톤화에서의 한 가지 도전은 의도하지 않은 중합체 경로의 최소화였다. 이러한 부반응들을 극복하는 한 가지 방식은 높은 희석으로 수행되는 것이다. 몇몇 구현예들에서, 산물 분비를 갖는 지방산 유도체 바이오-생산은 배양 브로쓰 내로의 직접적인 시약 도입을 통해 매크로락톤화를 직접적으로 수행함으로써 받아들일 수 있는 충분한 희석 조건들을 자연적으로 제공할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 방법들은, 비-자연적으로 발생하는 유기체를 배양한 후, 배양 브로쓰 내로 직접적으로 수용성 펩티드 커플링제를 첨가함으로써, ω-하이드록시 지방산의 생합성 생산을 제공할 수 있다. 매크로락톤화에 이용되는 시약은 앞서 언급된 펩티드 커플링제(위 참조) 중 어느 것일 수 있다. 이러한 형질전환을 가져오는 다른 시약들은, 소위 야마구치 방법(Yamaguchi method)을 이용하여, 아세트산 무수물, 펜타플루오로페놀, 2,4-디클로로벤조일 클로라이드 및 2.4,6-트리클로로벤조일 클로라이드를 포함한다(예를 들어, Inanaga 외 (1989) M. Bull. Chem . Soc . Jpn. 1979:52 참조). ω-하이드록시 지방산으로부터 매크로락톤으로의 몇 가지 접근법이 설명되었다(예를 들어, 미국 특허 4,014,902 참조). 아래의 반응식 V는 앞서 언급된 시약들 및 방법들 중 어느 것을 통해 접근가능할 수 있는 불포화 ω-하이드록시 지방산(또는 에스테르)의 예시적인 매크로락톤화를 나타낸다.

반응식 V

몇몇 구현예들에서, 매크로락톤 구조체들에 접근하기 위해 중합 및/또는 해중합 접근법이 이용될 수 있다(Spanagel 외 (1935) J. Am. Chem. Soc., 57:929-934). 이 기술은 통상적으로 매크로락톤화 반응에 이용되는 용매 집중적(solvent intensive) 고 희석 조건들에 더 나은 그린 대안(greener alternative)을 제공한다. 아래의 반응식 VI은 에틸렌 글리콜에서의 포타슘 글리코레이트의 작용에 의해 벤갈렌 산(bengalene acid)이 이소암브레톨리드(시스/트랜스 혼합물)로 전환되는 알려진 공정을 나타낸다. 이론에 의해 한정되는 것을 원하는 것은 아니지만, 아세테이트 제거가 중합체 형성 이전에 일시적(transient) 단량체 종을 제공하는지가 알려지지 않는다. 또한, 반응 조건들 하에서, 중합체는 증류 중에 반응 혼합물로부터 쉽게 빼내지는 단량체 락톤 구조로 전환되는 일시적 종이다.

반응식 VI

더 예를 들면, 시스-9 ω-하이드록시 헥사데센산은 대응하는 아세테이트 유도체를 제공하기 위해 과도 무수 아세트산과 반응될 수 있다. 이후, 아세테이트 유도체는 암브레톨리드의 시스-9 이성질체를 제공하기 위해 반응식 VI에 나타내어진 바와 같은 유사한 반응을 야기하는 글리세롤 용매에서 소듐 메톡사이드로 처리된다. 시스-9 이성질체 암브레톨리드는 글리세롤의 부수적 제거로 진공 증류 중에 연속적으로 제거될 수 있다. 상 분별(phase separation) 통한 유출물(distillate)로부터 글리세롤의 제거는 암브레톨리드의 고순도 시스-9 이성질체를 야기한다.

또 다른 구현예들에서, 매크로사이클릭 락톤은 글리세릴 에스테르를 통해 접근될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 2,234,551 참조). 따라서, 글리세롤에서 ω-하이드록시 지방산의 글리세릴 에스테르의 가열은, 매크로락톤 산물 및 글리세롤 용매의 공-증류(co-distillation)를 허용한다. 유출물은 정제된 매크로락톤 산물을 제공하기 위해 물로 세척된다.

IV. 매크로사이클릭 케톤

몇몇 구현예들에서, 생합성 이산, 반산 에스테르, 또는 디에스테르는 대응하는 매크로사이클릭 케톤 산물로 전환될 수 있다. 디에스테르는 아실로인 축합을 통해 사이클릭 하이드록시 케톤으로 전환될 수 있고, 선택적으로 매크로사이클릭 케톤을 제공하기 위해 하이드록시기가 환원될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 3,963,571 참조). 매크로사이클릭 케톤을 생산하기 위한 또 다른 방법은 기체 상에서의 디크만 축합(Dieckmann condensation)이다(예를 들어, 미국 특허 7,247,753 참조). 몇몇 구현예들에서, 디크만 접근은 디카르복실화 메커니즘을 통해 짝수-사슬 지방산 유도체로부터 홀수-사슬 탄소 번호 고리 크기로의 접근을 제공한다. 아래의 반응식 VII은 디에스테르, 이산 또는 반산 에스테르 개시 재료로 도출될 수 있는 일반적인 형질전환을 나타낸다.

반응식VII

유전적으로 매크로락톤화 및 매크로사이클릭 케톤 생산을 나타내는 일반적인 반응들이 아래의 반응식 VIII 및 반응식 IX에 나타나 있다.

반응식 VIII

반응식 IX

몇몇 구현예들에서, 본 명세서에 개시된 공정들/방법들을 이용하여 얻어진 표적 산물은 향료 락톤, 예컨대 γ-락톤(예를 들어, γ-도데카락톤, γ-테트라데카락톤, γ-운데카락톤, γ-데카락톤, 및 노나락톤), δ-락톤(예를 들어, δ-도데카락톤, δ-테트라데카락톤, δ-운데카락톤, δ-데카락톤, 및 δ-노나락톤), 및 매크로락톤[예를 들어, 암브레톨리드, 이소-암브레톨리드, 디하이드로암브레톨리드, 하바놀라이드(글로발라이드), 엑살톨리드(티베톨라이드)(사이클로펜타데카놀라이드) 등]을 포함할 수 있고, 또한 다른 매크로사이클릭 케톤 향료, 예컨대 로만온(엑살톤, 사이클로펜타데칸온), 무스콘, 시베톤 등을 포함할 수 있다.

V. 추가 및 보충 방법

매크로사이클릭 화합물들의 제조를 위한 추가 및 보충 방법들 및 공정들은 촉매의 존재 시 이기능성 화학물(difunctional compound)의 응축 및 후속적 열 해중합(thermal depolymerization)을 포함한다. 열 해중합은 화학식 I의 용매에서 수행될 수 있다.

R¹－(O－CH₂－CH₂)_n－OR²

여기서, R¹ 및 R²는, 작용기를 갖거나 갖지 않는 1 개 내지 6 개의 원자를 갖고 500 내지 3000의 수 평균 분자량(number average molecular weight: Mn)을 갖는, 동일한 또는 상이한 지방족 탄화수소 라디칼을 나타내고, 이로부터 n의 값은 50 hPa 미만의 압력에서 또한 200℃ 내지 300℃의 온도에서, 축합된 이기능성 화합물의 중량부(part by weight)당 사용되는 5 내지 1000 중량부의 용매를 따른다(예를 들어, 미국 특허 5,717,111 참조).

열 해중합을 위해 사용되는 고비점 배지(high boiling medium)는 약 500 내지 3000의 수 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 디알킬 에테르를 포괄한다. 일 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 디알킬 에테르는 약 1000 내지 2000의 수 평균 분자량(Mn)을 갖는다. 폴리에틸렌 글리콜 디알킬 에테르의 말단 OH기는 C_1-6 알킬기로 에테르화된다. 폴리글리콜을 에테르화하는 알킬기 R¹ 및 R²는, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필, n-프로필, n-부틸 또는 이차(sec)-부틸기일 수 있다. 또한, 알킬기 R¹ 및 R²는 작용기들로 치환될 수 있고, 작용기들은 중합에 참여하지 않을 수 있다. 상이한 폴리에틸렌 글리콜 디알킬 에테르 및 상이한 알킬기에 의해 에테르화된 폴리에틸렌 글리콜 디알킬 에테르의 혼합물이 사용될 수 있다. 축합된 이기능성 화합물의 1 중량부당 5 내지 1000 중량부, 바람직하게는 10 내지 100 중량부의 폴리에틸렌 글리콜 디알킬 에테르가 사용될 수 있다.

선형 올리고머의 해중합 및 고리화(cyclization)에서, 마그네슘 염, 망간 염, 카드뮴 염, 철 염, 코발트 염, 주석 염, 납 염, 알루미늄 염, 티타늄 염을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 알칼리 금속 및 이의 염과 같은 종래의 촉매들이 이용될 수 있다. 사용되는 대응 타입에 따라 촉매의 양은 약 0.1 내지 20 중량 %이다. 일 구현예에서, 촉매의 양은 축합된 이기능성 화합물의 100 중량 %에 기초하여 약 0.5 내지 10 중량 %이다. 또 다른 구현예에서, 본 공정은 먼저 이기능성 화합물의 축합에 의해 개시되며, 이는 촉매를 갖거나 갖지 않고 상승된 온도에서 종래의 방법들에 따라 수행될 수 있다. 일 구현예에서, α,β-하이드록시카르복실산 또는 α,β-디카르복실산 또는 에스테르가 글리콜과 반응된다. 공비제(entrainer)를 이용하거나 약간의 진공의 도움으로, 이 공정에서 형성된 알코올 또는 물이 희석될 수 있거나, 제거될 수 있다.

본 방법들은 매크로사이클릭 화합물들을 형성하기 위해 고리 닫힘(ring closure)과 동반되는 선형 폴리에스테르의 해중합을 포함한다. 이 공정에서 사용될 수 있는 폴리에스테르는 해당 기술분야의 당업자에 의해 알려진 바와 같은 종래의 방법들에 의해 얻어지고, 종래의 디카르복실산, 디올 및 하이드록시모노카르복실산으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 디카르복실산은 지방족이고, 포화되거나, 올레핀 불포화를 함유하며, 분지형 또는 직쇄형 사슬이다. 또 다른 구현예에서, 지방족 디카르복실산은 3 개에서 약 18 개 이하의 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 지방족 디카르복실산은 약 8 개 내지 14 개의 탄소 원자를 함유한다. 유용한 디카르복실산은 말론산, 말레산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산(pimelic acid), 아젤라산(azelaic acid), 세바스산(sebacic acid), 운데칸디오익산, 도데칸디오익산, 브라실산 및 펜다데칸디오익산을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또한, 2 이상의 디카르복실산의 혼합물이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리에스테르는 방향족 또는 지방족고리(alicyclic) 디카르복실산으로부터 유래된다.

폴리에스테르는 2 개 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 일차 지방족 디올인 디올로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 지방족 디올은 2 개 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 디올은 포화되고, 직쇄형 사슬이다. 또 다른 구현예에서, 디올은 포화되고, 분지형이다. 유용한 디올은 에틸렌 글리콜; 1,2- 또는 1,3-프로판디올; 1,2-, 1,3-, 또는 1,4-부탄디올; 1,6-헥산디올; 3-메틸-l,5-펜탄디올; 2,3-디메틸-2,3-부탄디올; 1,8-옥탄디올; 2-에틸헥산디올; 1,10-데칸디올; 1,12-도데칸디올; 디에틸렌 글리콜; 및 트리에틸렌 글리콜을 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 또한, 1,4-사이클로헥사디메탄올과 같은 지방족고리 디올이 사용될 수 있다.

또한, 폴리에스테르는 에틸렌 글리콜, 및 디-, 트리- 및 테트라에틸렌 글리콜로부터 유래될 수 있다. 또한, 폴리에스테르는 15-하이드록시펜타데칸산, 16-하이드록시헥사데칸산, 10-옥사-16-하이드록시헥사데칸산, 11-옥사-16-하이드록시헥사데칸산, 12-옥사-16-하이드록시헥사데칸산, 10-티아(thia)-16-하이드록시헥사데칸산, 11-티아-16-하이드록시헥사데칸산, 및 12-티아-16-하이드록시헥사데칸산을 포함하는(단, 이로 제한되지 않음) 하이드록시모노카르복실산으로부터 유래될 수 있다.

해중합 및 고리화에 적합한 몇몇 축합된 이기능성 화합물이 설명되었다(예를 들어, 미국 특허 4,709,058 참조). 축합된 이기능성 화합물은 반응기 내로 연속적으로 전달될 수 있고, 이 안으로 촉매 성분과 함께 고비점 배지가 도입될 수 있다. 해중합 및 고리화는 고온에서 발생한다. 일 구현예에서, 해중합 및 고리화는 약 200℃ 내지 300℃에서 또한 50 hPa 미만의 진공에서 발생한다. 또 다른 구현예에서, 해중합 및 고리화는 약 220℃ 내지 265℃에서 또한 50 hPa 미만의 진공에서 발생한다. 이러한 조건들 하에서, 표적 산물은 해중합으로부터 발생하는 글리콜(예를 들어, 에틸렌 글리콜), 아니면 사이클릭 구성요소(cyclic component)를 동반(entrain)하는 의도적인 과도한 글리콜을 증류한다. 상 분별 후, 분별된 글리콜은 반응의 시작 시 축합으로 피드백될 수 있다. 다수의 매크로사이클릭 화합물이 이 공정에 의해 만들어질 수 있으며, 이는 에스테르, 락톤, 락탐, 에테르락톤, 디락톤 및 에테르디락톤를 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 이 공정은 6 개 내지 20 개, 또는 더 바람직하게는 8 개 내지 15 개의 탄소 원자를 갖는 매크로사이클릭 에스테르 및 락톤의 제조에 적합하며, 이는 이러한 화합물들이 향수로서의 사용에 유익한 비교적 순수한 형태로 생산되기 때문이다.

해중합 공정에 의해 생산될 수 있는 매크로사이클릭 화합물들의 예시는, 3,6,9-트리데카메틸렌 말로네이트, 도데카메틸렌 말로네이트, 데카메틸렌 말로네이트, 에틸렌 수베레이트, 에틸렌 아젤레이트, 3-옥사-펜타메틸렌 아졸레이트, 3-메틸펜타메틸렌 세바케이트, 에틸렌 운데칸디오에이트, 에틸렌 도데칸디오에이트, 에틸렌 브라실레이트, 에틸렌-알파-메틸브라실레이트, 에틸렌-알파,알파-디메틸브라실레이트, 에틸렌-알파-에틸브라실레이트, 펜타데카놀라이드, 12-옥사-펜타데카놀라이드, 12-티아-펜타데카놀라이드, 헥사데카놀라이드, 10-옥사-헥사데카놀라이드, 11-옥사-헥사데카놀라이드, 11-티아-헥사데카놀라이드, 및 12-옥사-헥사데카놀라이드를 포함한다(단, 이로 제한되지 않음). 본 공정은 폴리에틸렌 브라실레이트의 해중합에 의해 에틸렌 브라실레이트를 제조할 수 있다. 유사하게, 본 공정은 폴리에틸렌 도데칸디오에이트의 해중합에 의해 에틸렌 도데칸디오에이트를 제조할 수 있다(예를 들어, 위의 미국 특허 5,717,111 참조)

실시예

다음의 예시들은 본 발명을 더욱 예시하며, 어떠한 방식으로도 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 : 매크로락톤화를 위한 실험 절차

(발효로부터 얻어진) 16-하이드록시-헥사데칸산 및 16-하이드록시-7(Z)-헥사데센산을 함유하는 혼합물(30 g)이 비등을 위해 가열되고, 물을 제거하기 위해 에틸렌 글리콜이 4 시간 이상 서서히 증류된다. 테트라부틸 티타네이트(0.5 g)가 에틸렌 글리콜 에스테르 및 에틸렌 글리콜 내의 하이드록실산 올리고머 에스테르의 결과적인 혼합물에 첨가된다. 이후, 이는 250C 및 10 torr의 진공에서 폴리에틸렌 글리콜 디메틸 에테르(50 g, 1500 내지 2000 Mn)를 함유하는 반응기에 4 시간 이상 서서히 첨가된다. 매크로락톤은 이 첨가 중에 에틸렌 글리콜과 공증류(co-distill)된다. 사이클로헥산으로의 유출물의 추출 및 및 물 세척은 매크로락톤의 사이클로헥산 용액을 산출한다. 농축은 미정제 매크로락톤(crude macrolactone)을 제공한다. 진공 증류는 16-헥사데카락톤 및 16-7(Z)-헥사데세락톤의 정제된 혼합물을 산출한다.

해당 기술분야의 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않고 상기 측면들 및 구현예들의 다양한 변형 및 변동이 행해질 수 있다. 이러한 변형 및 변동은 본 발명의 범위 내에 있다.

Claims (41)

1. 향료 성분(fragrance ingredient)을 생성하는 화학-효소 공정(chemo-enzymatic process)에 있어서,
   대사 변형(metabolic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계 - 상기 미생물은 생체 내에서(in vivo) 적어도 하나의 타입의 지방산 유도체를 생산하고, 상기 배양은 탄소계 공급원료로 수행됨 -; 및
   락톤 또는 매크로사이클릭 케톤(macrocyclic ketone)을 생산하기에 충분한 조건들 하에서 생체 외에서(ex vivo) 시약과 상기 지방산 유도체를 접촉시키는 단계를 포함하는 화학-효소 공정.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 대사 변형은 변경된 효소 기능성을 포함하는 화학-효소 공정.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 변경된 효소 기능성은 E.C. 3.1.2.- 또는 E.C. 2.1.1.5의 티오에스테라아제를 포함하는 화학-효소 공정.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 변경된 효소 기능성은 E.C. 2.3.1.20의 에스테르 신타아제를 더 포함하는 화학-효소 공정.
5. 제 2 항에 있어서,
   상기 변경된 효소 기능성은 E.C. 1.14.15.3의 오메가-하이드록실라아제 또는 옥시게나아제를 포함하는 화학-효소 공정.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 변경된 효소 기능성은 EC 1.1.1.1/2, EC 1.1.3.13, EC 1.1.3.20, EC 1.2.1.3/4/5 또는 EC 1.2.3.1의 옥시다아제 또는 디하이드로게나아제를 더 포함하는 화학-효소 공정.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 대사 변형은 상기 미생물 내에서 불포화 지방산 유도체를 증가시키는 화학-효소 공정.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 향료 성분은 상기 락톤 또는 상기 매크로사이클릭 케톤을 포함하는 화학-효소 공정.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 접촉시키는 단계 이전에, 상기 지방산 유도체를 분리하는 단계를 더 포함하는 화학-효소 방법.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 상기 재조합 미생물로부터 분비되고, 상기 접촉시키는 단계는 상기 배양하는 단계로부터 상기 지방산 유도체를 분리하지 않고 수행되는 화학-효소 방법.
11. 제 1 항에 있어서,
    상기 시약은 염산, 황산, 인산, 및 회수가능한 수지산(recoverable resin acid)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 양자성 산(protic acid)을 포함하는 화학-효소 방법.
12. 제 1 항에 있어서,
    상기 시약은 루이스 산(Lewis acid)을 포함하는 화학-효소 방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 루이스 산은 오가노스태난 에스테르교환반응 촉매(organostannane transesterification catalyst), 구리 또는 아연 염, 실버 트리플레이트(silver triflate) 및 제올라이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화학-효소 방법.
14. 제 1 항에 있어서,
    상기 시약은 펩티드 커플링제(peptide coupling agent)인 화학-효소 방법.
15. 제 1 항에 있어서,
    상기 향료 성분은 감마-락톤(γ-락톤), 델타-락톤(δ-락톤) 또는 이의 조합인 화학-효소 방법.
16. 제 1 항에 있어서,
    상기 향료 성분은 C₈ 내지 C₁₈ 매크로락톤인 화학-효소 방법.
17. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 불포화 지방산, 불포화 지방산 에스테르, 오메가-하이드록시 지방산(ω-OH FA), 오메가-하이드록시 불포화 지방산(불포화 ω-OH FA), 오메가-하이드록시 지방산 에스테르(ω-OH 지방산 에스테르), 오메가-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 ω-OH 지방산 에스테르), 3-하이드록시 지방산(3-OH FA), 3-하이드록시 불포화 지방산(불포화 3-OH FA), 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르), 3-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 3-OH 지방산 에스테르), 알파-오메가-이산(α,ω-이산), 불포화 알파-오메가-이산(불포화 α,ω-이산), 알파-오메가-이산 에스테르(α,ω-이산 에스테르), 불포화 알파-오메가-이산 에스테르(불포화 α,ω-이산 에스테르), 및 이의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화학-효소 방법.
18. 제 17 항에 있어서,
    상기 불포화 지방산은 단일불포화되는 화학-효소 방법.
19. 제 17 항에 있어서,
    상기 불포화 지방산 에스테르는 단일불포화되는 화학-효소 방법.
20. 제 17 항에 있어서,
    상기 불포화 지방산 에스테르는 불포화 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 불포화 지방산 에틸 에스테르(FAEE)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화학-효소 방법.
21. 제 20 항에 있어서,
    상기 불포화 FAME은 단일불포화되는 화학-효소 방법.
22. 상기 불포화 FAEE는 단일불포화되는 화학-효소 방법.
23. 제 17 항에 있어서,
    상기 오메가-하이드록시 불포화 지방산(불포화 ω-OH FA)은 단일불포화되는 화학-효소 방법.
24. 제 17 항에 있어서,
    상기 불포화 지방산 에스테르는 불포화 지방산 메틸 에스테르(FAME) 및 불포화 지방산 에틸 에스테르(FAEE)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화학-효소 방법.
25. 제 17 항에 있어서,
    상기 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르)는 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)인 화학-효소 방법.
26. 제 17 항에 있어서,
    상기 오메가-하이드록시 지방산 에스테르(ω-OH 지방산 에스테르)는 오메가-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(ω-OH FAME) 또는 오메가-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(ω-OH FAEE)인 화학-효소 방법.
27. 제 17 항에 있어서,
    상기 오메가-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 ω-OH 지방산 에스테르)는 단일불포화되는 화학-효소 방법.
28. 제 27 항에 있어서,
    상기 단일불포화된 오메가-하이드록시 지방산 에스테르(단일불포화 ω-OH 지방산 에스테르)는 오메가-하이드록시 단일불포화 지방산 메틸 에스테르(ω-OH 단일불포화 FAME) 및 오메가-하이드록시 단일불포화 지방산 에틸 에스테르(ω-OH 단일불포화 FAEE)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화학-효소 방법.
29. 제 17 항에 있어서,
    상기 3-하이드록시 불포화 지방산(불포화 3-OH FA)은 단일불포화되는 화학-효소 방법.
30. 제 17 항에 있어서,
    상기 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르)는 3-하이드록시 지방산 메틸 에스테르(3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 지방산 에틸 에스테르(3-OH FAEE)인 화학-효소 방법.
31. 제 17 항에 있어서,
    상기 3-하이드록시 불포화 지방산 에스테르(불포화 3-OH 지방산 에스테르)는 단일불포화되는 화학-효소 방법.
32. 제 31 항에 있어서,
    상기 단일불포화된 3-하이드록시 지방산 에스테르(3-OH 지방산 에스테르)는 3-하이드록시 단일불포화 지방산 메틸 에스테르(단일불포화 3-OH FAME) 또는 3-하이드록시 단일불포화 지방산 에틸 에스테르(단일불포화 3-OH FAEE)인 화학-효소 방법.
33. 제 17 항에 있어서,
    상기 불포화 알파-오메가-이산(불포화 α,ω-이산) 또는 상기 불포화 알파-오메가-이산 에스테르(불포화 α,ω-이산 에스테르)는 단일불포화되는 화학-효소 방법.
34. 제 33 항에 있어서,
    상기 단일불포화되는 알파-오메가-이산 에스테르(단일불포화 α,ω-이산 에스테르)는 반산 에스테르(half-acid ester)인 화학-효소 방법.
35. 제 34 항에 있어서,
    상기 반산 에스테르는 메틸 또는 에틸 에스테르인 화학-효소 방법.
36. 제 33 항에 있어서,
    상기 단일불포화 알파-오메가-이산 에스테르(단일불포화 α,ω-이산 에스테르)는 디에스테르(diester)인 화학-효소 방법.
37. 제 36 항에 있어서,
    상기 디에스테르는 메틸 디에스테르 또는 에틸 디에스테르인 화학-효소 방법.
38. 제 1 항에 있어서,
    상기 접촉시키는 단계는 탈수화, 락톤화 또는 이의 조합을 포함하는 화학-효소 방법.
39. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 홀수 탄소 사슬, 메틸-분지(methyl-branching) 또는 이의 조합을 포함하는 화학-효소 방법.
40. 제 1 항에 있어서,
    상기 탄소계 공급원료는 단순한 탄소원을 포함하는 화학-효소 방법.
41. 제 1 항에 있어서,
    상기 탄소계 공급원료는 재생가능한 화학-효소 방법.