KR20160145779A - FcRn 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물 - Google Patents

FcRn 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn(Neonatal Fc Receptor의 약자로, 태아 Fc-수용체, FcRP, FcRB 또는 Brambell 수용체라고도 불린다)에 특이적인 항체인 분리된 항-FcRn 항체, 이의 제조방법, 상기 항체를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물 및 상기 항체를 이용한 자가면역질환의 치료 및 진단 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 IgG와 비경합적으로 결합하여 혈중 내 병인성 자가항체의 양을 감소시킴으로써 자가면역질환(auto-immune disease)에 대한 치료에 활용 가능하다.

Description

FcRn 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물 {Antibody Binding to FcRn for Treating Autoimmune Diseases}
본 발명은 IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn (Neonatal Fc Receptor의 약자로, 태아 Fc-수용체, FcRP, FcRB 또는 Brambell 수용체라고도 불린다)에 특이적인 항체인 분리된 항-FcRn 항체, 이의 제조방법, 상기 항체를 포함하는 자가면역질환 치료용 조성물 및 상기 항체를 이용한 자가면역질환의 치료 및 진단 방법에 대한 것이다. 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 IgG와 비경합적으로 결합하여 혈중 내 병인성 자가항체(auto-antibody)의 양을 감소시킴으로써 자가면역질환에 대한 치료에 활용 가능하다.
항체는 특정 항원에 결합하는 면역 단백질로 인간 및 생쥐를 비롯한 대부분의 동물에서 중쇄(heavy chain)과 경쇄(light chain)의 폴리펩타이드가 쌍을 이루고 있으며, 각 쇄는 가변영역(variable domain) 및 불변영역(constant domain)으로 지칭되는 2개의 구별되는 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항체 간에 상당한 서열 다양성을 나타내고, 표적 항원에 특이적 결합 특성을 담당하며 불변영역은 항체 간 서열 다양성이 적고, 중요한 생화학적 반응을 유도하는 다수의 천연 단백질에의 결합을 담당한다.
정상적인 조건 하에, 혈청 내에서 IgG3 아이소타입(isotype)을 제외한 대부분의 IgG의 반감기는 인간에서 약 22-23일로, 이는 다른 혈장 단백질의 혈청 반감기에 비하여 비교적 길다. 이러한 긴 IgG의 혈중 반감기로 인하여 세포흡수작용(pinocytosis)에 의해 세포속으로 들어온 IgG는 pH 6.0 조건의 엔도좀(endosome)에서 Fc 감마 수용체의 일종인 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor, FcRn)에 강하게 결합하여 분해성 리소좀 경로를 회피할 수 있으며, 다시 세포막으로 순환하면 IgG는 약한 염기성 pH(~7.4)인 혈류내에서 FcRn으로부터 급속하게 해리된다. 이러한 수용체-매개된 재순환 메커니즘(receptor mediated recycling mechanism)에 의해 FcRn은 리소좀에서 IgG의 분해를 효과적으로 차단하여 IgG의 반감기를 연장하는 것으로 알려져 있다 (Roopenian et al. J. Immunol. 170:3528, 2003).
FcRn은 쥐 신생아 장에서 모유로부터 IgG 항체의 흡수를 매개하는 기능을 하고 순환계로 이의 수송을 촉진하는 것으로도 밝혀져 있다. FcRn은 인간 태반에서도 분리되었는데, FcRn은 모계 IgG의 흡수와 태아 순환(fetal circulation)으로의 수송을 매개하는 것으로 알려져 있다. 성인에서, FcRn은 폐, 장, 신장의 상피 조직, 코, 질, 및 담관 가지(biliary tree) 표면을 비롯한 다수의 조직에서 발현된다.
FcRn은 전형적으로, 내피세포와 상피세포의 엔도좀 내에 거주하는 비-공유 이형이합체이다. FcRn은 세개의 중쇄 알파 도메인(α1, α2와 α3)과 하나의 수용성 경쇄 β2-microglobulin(β2m) 도메인을 갖는 막결합 수용체이다. 구조적으로, 이는 공통 경쇄로서 β2m을 보유하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 1 분자의 집단에 속한다. αFcRn 쇄는 α1, α2와 α3 세개의 중쇄 도메인과 β2m 경쇄 도메인을 포함하고 하나의 당사슬을 가지는 세포외 도메인(ectodomain), 단일-통과 막간(single-pass transmembrane), 그리고 상대적으로 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)로 구성되어 약 46kD의 분자량을 가진다.
IgG 항상성(homeostasis)에 대한 FcRn의 역할을 확인하기 위해 생쥐의 β2m과 FcRn 중쇄를 인코딩하는 유전자를 "녹아웃(knockout)"시켜 이들 단백질이 발현되지 않도록 조작했을때, 이들 생쥐에서, IgG의 혈청 반감기와 농도가 급격하게 감소하였는데, 이는 IgG 항상성에 대한 FcRn 의존성 메커니즘을 암시한다. 또한, 항-인간 FcRn 항체가 이들 FcRn 녹아웃 생쥐에서 산출될 수 있고, 이들 항체가 FcRn에 IgG의 결합을 예방할 수 있는 것으로 제안 되었다. FcRn에 대한 IgG 결합의 저해로 인하여 IgG 혈청 반감기를 감소시켜 자가항체에 의한 자가면역질환을 치료할 수 있다는 가능성은 자가면역 피부 수포성 질병의 생쥐 모형에서 밝혀졌다. (Li et al. J. Clin. Invest. 115:3440, 2005). 따라서, FcRn과 IgG의 결합을 차단하거나 길항하는 작용제는 IgG에 의해 매개되는 자가면역질환 및 염증 질환 등을 치료 또는 예방하는 방법에 이용될 수 있다.
자가면역질환은 원인을 알 수 없는 면역체계 이상으로 면역체계가 자신의 정상적인 조직, 기관 또는 기타 체내 성분 등을 공격하게 되어 발생하는 질환을 총칭하며, 신경계, 위장관계, 내분비계, 피부, 골격계, 혈관 조직 등 거의 모든 신체 부위에 발생할 수 있는 전신적인 질환이다. 전 세계적으로 인구의 약 5~8%에게서 자가면역질환이 나타나는 것으로 알려져 있으나, 자가면역질환에 대한 이해 및 진단 방법의 한계성으로 인해 유병률이 실제 수준보다 낮게 보고되는 것으로 알려져 있다.
자가면역질환의 원인은 유전적, 환경적 및 면역학적인 관점에서 오랜 기간 연구가 진행되어 왔으나, 여전히 명확한 질병의 발생 원인은 밝혀지지 않고 있다. 최근 많은 연구를 통해 다수의 자가 면역 질환들이 IgG 형태의 자가항체에 의해 발생하는 것으로 밝혀지고 있으며, 실제로 자가면역질환의 진단 및 치료 연구에서 질환 특이적인 자가항체들의 존재 유무와 감소에 따른 치료효과와의 연관성이 널리 규명되고 있다. 따라서, 현재 많은 수의 자가면역질환은 질환 특이적인 자가항체의 존재 및 그것의 병리적 역할이 많이 규명되고 있으며, 해당 자가항체를 혈중에서 제거할 경우 신속한 질병 치료효과를 얻을 수 있다.
자가면역질환 및 동종면역질환은 병원성 항체에 의해 매개되는 질환으로는 면역성 호중구감소증(immune neutropenia), 길랑바레 신드롬(Guillain-Barrㅹ syndrome), 간질, 자가면역 뇌염(autoimmune encephalitis), 아이삭 신드롬(Isaac's syndrome), 모반 신드롬(nevus syndrome), 심상성천포창(Pemphigus Vulgaris), 낙엽성천포창(Pemphigus foliaceus), 수포성류천포창(Bullous pemphigoid), 후천성표피수포증(epidermolysis bullosa acquisita), 임신성 유사수포창(pemphigoid gestationis), 뮤코스 막 유사수포창(mucous membrane pemphigoid), 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병(autoimmune Grave's disease), 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 중증근무력증(myasthenia gravis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 루프스(lupus) 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura, ITP), 루프스 신염(lupus nephritis), 막성 신병증(membranous nephropathy)등이 있다.
예를 들어 중증근무력증(myasthenia gravis, MG)의 경우, 수의근의 신경근 접합부에 위치한 아세틸콜린 수용체(acetylcholine receptor, AChR)에 대한 자가항체에 의해 해당 수용체가 파괴 또는 차단되어 수의근의 수축 기능을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 자가항체를 감소시킬 경우 근육의 기능이 회복되는 것으로 알려져 있다.
특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP) 경우는 특정 혈소판 막당단백질에 결합하는 자가항체의 발생에 의해 말초의 혈소판 파괴가 진행되어 발생되는 질환이다. 항혈소판 항체는 혈소판을 옵소니화하고 망상세포(예를 들면 대식세포)에 의한 급속한 혈소판 파괴를 가져온다.
일반적으로 ITP를 치료하기 위해 면역계를 억제하여 혈소판 농도를 높이는 시도가 행해지고 있다. ITP는 남성보다 여성에서 유병율이 높고, 또 성인보다 소아에서 많이 발생하며, 유병율은 인구 1만명당 1명이다. 만성적 ITP는 성인과 소아의 양쪽에 있어서 주요한 혈액질환의 하나이다. 또한, 미국 및 전세계에 있어 거액의 입원료 및 치료비용을 발생시키는 원인이 되고 있다. 매년 미국에서 2만건의 새로운 증례가 발생하고 있으며, ITP의 치료 및 특별요법에 관련되는 비용 또한 막대하다. 대부분의 ITP 소아환자는 매우 낮은 수의 혈소판을 가져 돌연의 출혈(전형적인 증상으로서, 좌상, 피부의 작은 붉은 반점, 코피, 및 잇몸 출혈)이 일어난다. 소아는 때론 치료하지 않아도 회복하는 경우가 있지만 많은 의사들이 면밀한 관찰과 완화 및 감마글로불린의 점적 정맥 주사에 의한 치료를 추천하고 있다.
전신성 홍반성 루프스 신염(lupus nephritis)의 경우는 자가면역질환의 일종으로 항핵항체(antinuclear antibodies)와 같은 자가항체의 부적절한 과잉 생산으로 인해 증가된 면역 복합체(Immune-Complex)가 전신의 장기에 축적되어 염증 반응을 일으키는 것이 중요한 병인으로 알려져 있다. 이러한 루프스 환자의 약 40~70%는 신장을 침범하여, 약 30%는 루프스 신염으로 발전하는데 이것은 루프스의 병태 중 악성 예후인자로 알려져 있으며, 기존의 면역억제제를 통한 치료법이 시도되고 있으나 약 22%에서는 면역억제제 사용시에도 관해가 오지 않고, 관해가 온 경우에도 면역억제제를 줄이면 10~65% 환자가 재발하는 것으로 보고되어 있다. 결국 증증의 루프스 신염(WHO class III and IV)환자는 10년 후에 5-10%가 사망하며, 5~15%는 말기 신부전에 이르게 되는 심각한 질환으로서 아직까지 적절한 루프스 신염의 치료가 이루어 지지 못하고 있다.
따라서, 병원성 자가항체를 제거하여 자가면역질환을 치료하는 신규 작용기전의 항체를 통하여, 심상성천포창, 시신경척수염(neuromyelitis optica), 중증근무력증과 같은 병원성 항체 유도 자가면역질환(Pathogenic IgG-mediated autoimmune diseases)을 포함하며, 루프스 신염이나 막성 신병증과 같은 면역 복합체 유발 신장계 질병(Immune complex-mediated glomerular diseases)으로 치료 효과의 확장도 기대한다.
다양한 자가면역질환에 과량의 IgG를 점적정맥투여(IVIG)하여, 자가면역질환을 치료하는 방법이 널리 사용되고 있다. (Arnson, Autoimmunity 42:553, 2009). IVIG 효과는 다양한 기작에 의해 설명되지만 그 중 하나는 FcRn에 대한 내인성 IgG와의 경합에 의해 병원성 항체의 클리어런스(clearance)를 증가시키는 기작으로도 설명된다. 대량의 인간면역글로불린의 정맥투여(IVIG)는 면역성 ITP에 고통받는 소아의 혈소판 수를 증가시키며, 복수의 다른 자가면역질환의 치료에 유익하다는 것이 증명되었다. 많은 연구로, IVIG의 자가면역질환 치료에 있어서 효과를 발휘하는 메커니즘이 규명되었다. ITP와 관련하여, 초기 연구에서 IVIG의 효과는 주로 항체-옵소닌화 혈소판의 식균작용에 관여하는 Fc 수용체를 차단하여 발생하는 것이라고 알려져 왔다. 그 뒤의 연구는 Fc-결손 IVIG는 일부 ITP 환자에 있어서 혈소판 수의 증가를 가져온다는 것이 밝혀졌고, 최근에는 IVIG의 효과는 혈소판 탐식의 저해에 연결되는 대식세포(macrophage) 세포상의 FcγRIIb 발현을 자극하는 것에 기인한다는 보고도 있다.
그렇지만 이와 같은 IVIG치료는 큰 부작용을 가지고 투여에 상당히 큰 비용이 든다. 또한 IVIG 이외의 자가면역/동종 면역성 질환의 치료에 사용되는 다른 치료법으로는 폴리클로날 항-D 면역글로불린, 부신피질 스테로이드 및 화학요법제를 포함하는 면역억제제 등을 이용하는 방법, 사이토카인 혈장 분리교환법, 체외 항체 흡착(예를 들면 Prosorba 칼럼을 사용하는 방법) 또는 비장적출 등의 외과적 처치 등이 포함된다. 그렇지만 IVIG와 마찬가지로, 이러한 치료법 역시 충분하지 않은 효력 및 고비용 때문에 그 이용이 제한적일 수 밖에 없다. 또한, IVIG가 FcRn 결합을 저해하는 가상 기작의 경합적 저해는 IgG의 생리학적 pH(즉, pH 7.2~7.4)에서 FcRn에 대한 낮은 친화성으로 인해, 병원성 항체의 클리어런스의 실질적인 증가를 가져오기 위해서 상당히 다량의 IVIG이 요구되는데, IVIG의 전형적인 임상용량은 2g/kg정도이다.
IgG의 FcRn에 대한 결합을 경합적으로 억제함으로써 자가면역질환을 치료하는 개념을 가지는 저해제를 이용하는 것은 유망한 치료법 중 하나이지만, 현재로서는 내인성 IgG의 FcRn에 대한 고친화성 및 혈중의 내인성 IgG의 농도로 인해 상당히 많은 양의 저해제가 필요하고, 그로 인해 현재의 IVIG 치료법과 동일한 한계를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, 항-FcRn 항체는 WO2006/118772, WO2007/087289, WO2009/131702, WO2012/167039에 개시되어 있으나, FcRn에 대한 높은 친화력으로 적은 양으로 병인성 항체를 제거할 수 있으며, 면역원성을 줄일 수 있는 보다 향상된 인간 항체에 대한 개발 필요성이 절실한 상황이다.
상기와 같은 문제를 해결하고자 본 발명은 효과적으로 ITP를 포함한 자가면역질환을 효율적이고 근본적으로 치료할 수 있는 치료제를 제공하기 위하여, FcRn에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체 및 그러한 항체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체는 FcRn에 특이적이며 pH 비의존적으로 결합하여 FcRn에 대한 항체 Fc의 결합을 비경합적(non-competitive)으로 방해하여 자가면역질환의 원인인 생체내 자가항체를 감소시킴으로써 자가면역질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 FcRn 특이적 항체를 함유하는 면역성 호중구감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성천포창, 낙엽성천포창, 수포성류천포창, 후천성표피수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 루프스 신염, 막성 신병증 등의 자가면역질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40 및 서열번호 43으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40 및 서열번호 43으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 본 발명은 추가적으로, 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및
상기 생성된 항체를 분리 및 정제하여 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 단편, 및 검출 라벨을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 단편을 사용하는 것을 포함하는 시험관 내 또는 생체 내에서 FcRn를 검출하는 방법을 제공한다.
IgG에 고친화성을 갖는 수용체인 FcRn에 특이적인 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은 높은 친화도 및 특이성을 가지고 있으며, 면역원성으로 인한 문제가 거의 없고, FcRn에 IgG등과 비경합적으로 결합하여, 혈중 내 병인성 자가항체의 양을 감소시키는 특성을 가지고 있으므로, 자가면역질환의 치료 및 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 CHO-S세포를 이용한 항체 발현과 Protein A 정제를 통하여 확보된 HL161A, HL161B, HL161C 및 HL161D 항체 단백질을 SDS-PAGE 젤 상에서 환원 또는 비환원 상태로 분석한 결과를 나타내는 도면으로, 각각의 HL161항체들은 비환원 상태에서 약 160kDa의 완전한 형태의 인간 IgG1 유형의 구조를 이루는 것을 확인하였으며, 환원 상태에서 중쇄는 약 55kDa, 그리고 경쇄는 약 25kDa으로 전형적인 항체 구조 단위로 이루어졌음을 확인하였다. 도 1에서 Lane 1은 M.W. marker, Lane 2는 비환원 상태(*NEM-treated) 2㎍, Lane 3은 환원 상태 2㎍을 나타낸다.
도 2는 FcRn에 결합하는 네 종의 anti-FcRn 항체, HL161A, HL161B, HL161C 및 HL161D의 키네틱 분석(Kinetic Dessociation, KD)를 결정하기 위해 SPR 기기를 이용한 분석 결과를 나타낸 도면으로, Proteon GLC chip과 Proteon XPR36 (Bio-Rad) 장비를 사용하여 인간 FcRn과 HL161A, HL161B, HL161C 또는 HL161D 항체의 상호반응을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 분석하였다:
도 2a는 인간 FcRn과 HL161A 항체의 상호반응을 pH 6.0에서 분석한 결과이다.
도 2b는 인간 FcRn과 HL161A 항체의 상호반응을 pH 7.4에서 분석한 결과이다.
도 2c는 인간 FcRn과 HL161B 항체의 상호반응을 pH 6.0에서 분석한 결과이다.
도 2d는 인간 FcRn과 HL161B 항체의 상호반응을 pH 7.4에서 분석한 결과이다.
도 2e는 인간 FcRn과 HL161C 항체의 상호반응을 pH 6.0에서 분석한 결과이다.
도 2f는 인간 FcRn과 HL161C 항체의 상호반응을 pH 7.4에서 분석한 결과이다.
도 2g는 인간 FcRn과 HL161D 항체의 상호반응을 pH 6.0에서 분석한 결과이다.
도 2h는 인간 FcRn과 HL161D 항체의 상호반응을 pH 7.4에서 분석한 결과이다.
도 3은 선별된 2종 항체의 세포 표면의 인간 FcRn(hFcRn)에 대한 결합능을 나타내는 도면으로, 세포 표면에 존재하는 인간 FcRn에 결합하는 선별된 HL161A와 HL161B 항체들을 인간 FcRn이 과발현되는 HEK293세포에 처리하여 pH 6.0과 pH 7.4에서 세포 표면 FcRn에 결합하는 항체를 확인한 결과이다. HL161A와 HL161B 항체의 인간 FcRn 결합은 각 항체를 pH별로 세포에 처리한 후 Alexa488 표지(labelled)된 항-인간 염소 항체(anti-human goat antibody)를 사용하여 형광 활성화 세포 분류기(Flurescent activated cell sorter, FACS) 분석을 통해 MFI 값으로 표현하였다.
도 4는 pH 6.0 조건에서 인간 IgG와 인간 FcRn 발현 세포 결합 억제능 분석 결과로, 세포 표면 인간 FcRn에 결합하는 선별된 2종의 항체가 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 저해할 수 있는지를 세포수준에서 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 인간 FcRn이 과발현되는 HEK293 세포에 결합하는 것이 확인된 HL161A와 HL161B 항체를 각각 200nM부터 4배 순차적 희석을 통하여 Alexa488 표지된 인간 IgG의 인간 FcRn에 대한 결합 억제능력에 대한 프로파일을 확보하였다.
도 5a 및 도 5b는 인간 FcRn이 발현되는 형질감염 마우스인 Tg32(hFcRn+/+, hβ2m+/+, mFcRn-/-, mβ2m-/-)에서 선별된 항체인 HL161A와 HL161B 항체가 hIgG1의 이화작용에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타내는 도면으로, 0시간에 5mg/kg의 biotin-hIgG와 495mg/kg의 인간 IgG를 복강 투여하여 체내의 IgG를 포화시켰다. 약물의 투여는 biotin-IgG의 투여 후 24, 48, 72, 96시간 후에 5, 10 그리고 20mg/kg의 용량으로 인간 IgG1, HL161A, HL161B 또는 PBS를 1일 1회 복강주사(ip)하여 수득한 결과이다. 시료채취는 biotin-IgG의 투여 후 24, 48, 72, 96, 120, 168시간 후에 진행하였으며, 24, 48, 72, 96시간에는 약물 투여 전 채혈을 하여 ELISA 방법으로 biotin-IgG의 잔존량을 확인하였다. 결과는 24시간 채혈 샘플의 잔존량을 100%로 하여 각 시간대의 잔존량을 상대적인 비율로 나타내었다.
도 6은 인간 FcRn과 96% 서열 상동성를 가진 시노몰구스 원숭이를 이용하여 HL161A와 HL161B, 2종의 항체 투여에 의한 원숭이 IgG의 혈액내 변화량을 분석한 결과를 나타내는 도면으로, HL161A와 HL161B 항체를 시노몰구스 원숭이에 5, 20 mg/kg의 용량으로 주 1회 정맥투여한 결과 원숭이 IgG의 경우, 0시간 대비 최대 70 % 까지 감소하였으며, 29일까지 30 % 정도 감소하였다:
도 6a는 HL161A와 HL161B 항체 농도별 원숭이 혈액내 IgG 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 6b는 HL161A와 HL161B 항체(5mg/kg농도)의 원숭이 개체별 혈액내 IgG 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 6c는 HL161A와 HL161B 항체(20mg/kg농도)의 원숭이 개체별 혈액내 IgG 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 시노몰구스 원숭이를 이용한 시험에서 HL161A 및 HL161B의 약동학적 프로파일을 분석한 결과를 나타내는 도면으로, 전체적으로 HL161A에 비해서 HL161B가 반감기, AUC 및 Cmax가 높은 경향을 나타내었다.
도 8a 내지 도 8c는 시노몰구스 원숭이를 이용한 시험에서 HL161A와 HL161B 항체 투여에 의한 원숭이 IgM, IgA, 그리고 알부민(albumin)의 혈액내 변화량을 분석한 결과를 나타내는 도면으로, 모두 수치적으로 약간의 변화가 있었으나 시노몰구스 원숭이의 정상 범위내의 변화이기 때문에 시험물질에 의한 영향이기 보다는 개체 차이에 의한 결과로 판단되었다:
도 8a는 원숭이 혈액내 원숭이 IgM 변화를 나타낸 것이다.
도 8b는 원숭이 혈액내 원숭이 IgA 변화를 나타낸 것이다.
도 8c는 원숭이 혈액내 원숭이 알부민 변화를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 FcRn에 높은 친화도(affinity)를 가지고 특이적이고 pH 비의존적으로 결합할 수 있으며, 인간에서 유래한 서열로 이루어져 체내 투여 시 면역반응 유발이 거의 없는 항체를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 항체는 FcRn에 대한 특이성을 가지는 결합분자이다. 상기 항체는 모노클로날 항체 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 구역을 갖는 전장 항체), 다중 에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 디아바디(diabody) 및 단일쇄 분자뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 제공되는 항체는 예를 들어, 인간 FcRn에 대한 모노클로날 항체일 수 있다.
모노클로날 항체는 마우스 항체를 포함할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종 예를 들어 마우스에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬의 나머지는 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다. "인간화 항체"는 "키메라 항체"의 하위세트로 사용된다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. "인간 항체"는 인간에 의해 생산되거나, 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 가지는 항체이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체는 항원 시험 접종에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되었지만, 그의 내인성 로커스(locus)가 기능하지 않는 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역처리된 제노마우스 (xenomouse)에 항원을 투여하여 만들어질 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항체는 예를 들어, 인간 항체의 형태를 가질 수 있다.
기본 4쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진 이종 4량체 당단백질이다. 경쇄는 N-말단에서 가변영역(VL)을 가지고, 이어서 그의 다른 단부에서 불변영역을 가진다. 중쇄는 N-말단에서 가변영역(VH)을 갖고, 이어서 각각 α 및 γ 사슬에 대해 3개의 불변영역(CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 불변영역(CH)을 가진다.
'가변'은 가변영역의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 크게 상이함을 나타낸다. V 영역은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변영역 모두에서 초가변영역(HVR) 즉, CDR로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변영역의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 구역(FR)으로 불린다. 중쇄 및 경쇄 가변영역은 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 구조를 가진다.
본 발명에서는 인간 면역글로불린 형질전환 동물을 이용하여 인간 FcRn에 친화도와 특이성을 가진 항체를 수득하였다. 형질전환 동물은 동물의 Ig 생식세포(germ line) 유전자를 불활성화 시키고 인간의 Ig 생식세포 유전자 로커스를 이식하여 제조할 수 있다. 형질전환 동물을 이용한 경우 동물의 면역체계에 의해 자연적으로 항체가 최적화되어 친화도 개선(affinity maturation)이 필요하지 않아 빠른 시간 안에 면역원성이 낮고 높은 친화도를 갖는 항체 의약품 개발이 가능한 장점이 있다 (US20090098134, US20100212035, Menoret et al, Eur J Immunol, 40:2932, 2010).
본 발명에서는 인간 면역글로불린 형질전환 쥐에 대한 특허기술을 보유하고 있는 OMT사(미국)의 OmniRatTM을 활용하였다. OmniRatTM은 CH2, CH3 도메인이 쥐 유전자이고 V, D, J 영역과 CH1 도메인이 인간 유전자로 구성된 중쇄를 포함하며, 인간의 카파(kappa) 경쇄와 람다(lamda) 경쇄를 포함하여 효율적으로 인간 FcRn에 대한 친화도가 높은 항체를 선별할 수 있다 (Menoret et al, Eur J Immunol, 40:2932, 2010).
FcRn에 대한 친화도가 높은 모노클로날 항체를 얻기 위해 형질전환 쥐(OmniRatTM)에 인간 FcRn을 주사하여 면역화시킨 다음, B세포를 추출하여 골수종세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조한 뒤 제조된 하이브리도마로부터 생산된 항체를 정제하였다.
본 발명에 따른 항체는 FcRn과의 결합에 있어, IgG의 비경합적 저해제로 작용한다. 본 발명에 따른 항체와 FcRn 결합에 의해 FcRn에 대한 병원성 항체의 결합이 저해되고, 이에 따라 개체의 체내로부터 병원성 항체의 체내로부터 병원성 항체의 클리어런스, 즉 제거가 촉진되어 반감기가 감소하게 된다.
본 발명에서 사용되는 '병원성 항체'는 병적인 상태 또는 질병을 일으키는 항체를 의미한다. 이러한 항체는 예를 들어, 항혈소판 항체, 항아세틸콜린 항체, 항핵산 항체, 항인지질 항체(anti-phospholipid antibody), 항콜라겐 항체(anti-collagen antibody), 항강글리오사이드 항체(anti-ganglioside antibody), 항데스모그레인 항체(anti-desmoglein antibody) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항체는 생리학적 pH, 즉 pH 7.0~7.4에서 병원성 항체와 FcRn과의 결합을 비경합적으로 저해할 수 있다는 장점이 있다. FcRn은 그 리간드, 즉 IgG에 pH 의존적으로 결합하며, 산성이 아닌 생리학적 pH에서는 IgG에 대해 실질적으로 친화성을 나타내지 않는다. 따라서, 생리학적 pH에서 FcRn에 특이적으로 결합하는 항-FcRn 항체는 IgG와 FcRn의 결합에 비경합적 저해제로서 작용하며, 이 경우 FcRn에의 항-FcRn 항체의 결합은 IgG의 존재 여부에 영향을 받지 않는다. 따라서, pH 비의존성에 의해 IgG와 비경합적으로 FcRn과 결합하는 본 발명에 따른 항체는 경합적 저해제, 즉 IgG와 경쟁적으로 FcRn에 결합하는 기존의 항체들에 비해 훨씬 낮은 농도만으로도 IgG의 FcRn 매개 신호전달로 인한 질병의 치료가 가능하다는 장점이 있다. 또한, FcRn과 결합한 상태로 세포내 이동의 과정에 있어서, 본 발명에 따른 항 FcRn 항체는 FcRn에 대해 혈중 IgG보다 높은 친화도로 결합을 유지하므로 IgG와 FcRn이 결합할 수 있는 산성 pH 환경인 엔도좀 내에서도 IgG과 FcRn의 결합을 저해할 수 있어, IgG의 클리어런스를 촉진할 수 있는 효과를 가진다.
본 발명에 따른 항체는 IgG가 FcRn에 결합하지 못하는 환경인 생리학적 pH, 즉 pH 7.0~7.4에서도 FcRn에 친화성을 가지고 pH 6.0에서는 혈중내 IgG 보다 FcRn에 더욱 높은 친화성을 가져 비경합적 저해제로 작용한다.
일 관점에서, 본 발명은 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40 및 서열번호 43으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 요지를 이용하여 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 일부 결실, 부가 또는 치환하여도 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 이상, 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 상기 서열번호에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열과 특정 범위로 상동성을 가지는 서열 역시 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 이상, 본 발명의 범위에 포함된다. "상동성"은 서열번호 1 내지 44로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 유사한 정도를 나타내는 것으로서, 90%이상 동일한 서열을 포함하며, 바람직하게 95%이상, 96% 이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 상동성의 비교는 공지의 육안 또는 비교 프로그램을 이용하여 수행한다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 이상, pH 6.0과 pH 7.4 조건에서 KD(dissociation constant)가 0.01 내지 2nM인 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 역시 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "KD"는 항체 항원의 결합에 대한 평형 분리 상수(equilibrium dissociation constant)를 의미하며, KD=kd/ka (ka는 association rate constant를 의미하고, kd는 dissociation rate constant를 의미함)를 통해서 도출할 수 있으며, kd 또는 ka의 측정은 25℃ 또는 37℃에서 수행될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함할 수 있다.
상기 서열번호로 표시된 아미노산 서열은 중쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3에 해당하는 아미노산 서열일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는
서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열번호로 표시된 아미노산 서열은 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3에 해당하는 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은 구체적으로, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및
서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 및
서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 "단편" 또는 "항체 단편"은 전장(a full length) 항체 폴리펩타이드를 포함하지는 않으나 항체 폴리펩타이드 분자(예를 들어, 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드) 유래 폴리펩타이드를 의미하나, 여전히 전장 항체 폴리펩타이드의 적어도 부분을 포함한다. 항체 단편은 절단 단편에 한정되지 않으나, 전장 항체 폴리펩타이드의 절단 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 종종 포함한다. 항체를 참조하여 사용되는 용어로서 단편은 항체 폴리펩타이드 유래 단일쇄 폴리펩타이드 (e.g. 중쇄 또는 경쇄 항체 폴리펩타이드)를 포함하는 단편을 포함하기 때문에, 항체 단편은 그 자체로 항원에 결합하지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 항체의 단편도 포함한다. 본 발명에서의 항체의 단편은 단쇄 항체, 이중특이항체, 삼중특이항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디와 같은 다중특이항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 듀얼-특이항체, 미니바디, 스캡(scap: sterol regulatory binding protein cleavage activating protein), 킬레이팅 재조합 항체, 트리바디, 바이바디(bibodies), 인트라바디, 나노바디, SMIP(small modular immunopharmaceuticals), 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타 항체(camelized antibody), VHH 포함 항체, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역 유도체, 및 FcRn에 결합능을 보유한 단백질 스캐폴드에 기반한 합성 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
FcRn에 대한 결합 기능이 유지되는 한, 본 발명에 따른 어떠한 형태의 항체의 단편도 본 발명에 따른 항체와 동일한 특성을 나타낼 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
또한, 본 발명의 항체 또는 단편의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다. 그러한 예로서 가변영역에서의 아미노산의 보존적 치환이 일어난 항체를 들 수 있다. 보존적 치환은 원래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는데, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스파라틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 따라서, 상기와 같이 유사한 특성을 가지는 그룹 내에서의 아미노산 치환이 일어나더라도 별다른 특성 변화를 보이지 않을 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이므로, 본 발명에 따른 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 보존적 치환에 의한 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 다른 물질과 접합된 복합체(conjugate)의 형태로도 이용 가능하다. 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 접합하여 이용할 수 있는 물질로는 통상적으로 자가면역질환의 치료에 이용되는 치료제 및 FcRn의 활성을 저해할 수 있는 물질, 또는 혈액, 혈청, 림프, 또는 기타 조직의 순환계 내에서 이의 안정화 및/또는 유지를 향상시키는 모이어티(moiety)와 물리적으로 연결된다. 가령, FcRn-결합 항체는 중합체, 예를 들면, 폴리알킬렌 산화물 또는 폴리에틸렌 산화물과 같은 비-항원성 중합체와 연결될 수 있다. 적절한 중합체는 중량에 의해 실질적으로 변할 것이다. 대략 200 내지 대략 35,000 (또는 대략 1,000 내지 대략 15,000, 그리고 2,000 내지 대략 12,500) 범위의 평균분자량을 갖는 중합체가 이용될 수 있다. 가령, FcRn-결합 항체는 수용성 중합체, 예를 들면, 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들면, 폴리비닐알코올과 폴리비닐피롤리돈에 접합될 수 있다. 이런 중합체의 종류에는 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올과 같은 폴리알킬렌 산화물의 동종중합체, 공중합체, 그리고 이들의 블록 공중합체 등이 대표적인 예이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 단서로써 이들 블록 공중합체의 수 용해도가 유지되어야 한다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물, 자가면역질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 자가면역질환의 치료를 필요로 하는 환자에 유효량의 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 치료방법에 관한 것이다.
상기 약학 조성물에는 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 부형제 등이 추가적으로 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명에 따른 항체 등의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로도 제제화되어 제공될 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등의 형태로 제공될 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 IgG와 FcRn에 의해 매개되는 모든 자가면역질환에 적용될 수 있는데, 대표적인 질환으로는 면역성 호중구감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성천포창, 낙엽성천포창, 수포성류천포창, 후천성표피수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스 및 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 루프스 신염, 막성 신병증 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 치료방법에서 항체의 투여량은 환자의 중증도, 상태, 나이, 질병 경력 등을 고려하여 적절히 결정될 수 있으며, 예를 들어 1mg/kg 내지 2g/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 상기 항체는 단일 또는 수회 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 자가면역성 또는 동종 면역성 상태를 완화하는 방법을 제공하며, 동시에 특정 항-FcRn 요법도 제공한다.
본 발명에 따른 자가면역성 또는 동종 면역성 상태를 완화하는 방법 또는 항-FcRn 요법은 본 발명에 따른 약학 조성물을 개체에 투여함으로써 달성될 수 있는데, 본 발명에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하며, 구체적으로는 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있는데, 단회 또는 반복 투여 할 수 있다. 일반적으로 1~200mg/kg, 보다 바람직한 것은 1~40mg/kg을 자가면역성 또는 동종 면역성 증상을 가지는 환자에게 투여할 수 있고, 이러한 투여 계획은 바람직한 것은 혈청 내인성 IgG 농도를 치료전의 값의 75% 미만에 줄이도록 설계할 수 있으며, 환자의 상태 등을 감안하여 간헐적 또는 만성적(계속적) 투약 방침을 적용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편을 포함하는 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 FcRn에 결합하는 항체 또는 이의 단편은 시험관 내와 생체 내 진단적 유용성을 갖는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 FcRn 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 처리하는 단계를 포함하는 시험관내 또는 생체내에서 FcRn의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
시험관내 검출 방법은 예를 들어 (1) 샘플을 FcRn-결합 항체와 접촉시키는 단계; (2) FcRn-결합 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계; 및/또는 (3) 참고 샘플 (가령, 대조 샘플)을 항체와 접촉시키는 단계; (4) 참고 샘플에서와 비교하여 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성의 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대조 샘플 또는 개체와 비교하여 샘플 또는 개체 내에 복합체의 형성에서 변화, 예를 들면, 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 내에 FcRn의 존재를 의미할 수 있다.
생체 내 검출 방법은 (1) FcRn-결합 항체를 개체에 투여하는 단계; (2) FcRn-결합 항체와 개체 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출은 복합체 형성의 위치 또는 시점을 결정하는 것을 포함할 수 있다. FcRn-결합 항체는 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 하는 검출가능 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 적절한 검출가능 물질에는 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다. FcRn-결합 항체와 FcRn 사이에 복합체 형성은 FcRn에 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체를 측정하거나 가시화시킴으로써 검출될 수 있다. 전통적인 검출 분석, 예를 들면, 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(radioimmunoassay, RIA) 또는 조직 면역조직화학(tissue immunohistochemistry)이 이용될 수 있다. FcRn-결합 항체의 표지화에 더하여, FcRn의 존재는 검출가능 물질로 표지화된 기준 및 표지화되지 않은 FcRn-결합 항체를 이용한 경쟁 면역분석(competition immunoassay)에 의해 샘플 내에서 분석될 수 있다. 이러한 분석의 한 가지 실례에서, 생물학적 샘플, 표지화된 기준, 그리고 FcRn-결합 항체가 결합되고, 그리고 표지화되지 않은 항체에 결합된 표지화된 기준의 양이 측정된다. 샘플 내에 FcRn의 양은 FcRn-결합 항체에 결합된 표지화된 기준의 양에 반비례한다.
진단 목적으로의 사용을 위해 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은 형광단 또는 발색단으로 표지화될 수 있다. 항체 및 다른 단백질이 대략 310nm까지의 파장을 갖는 광을 흡수하기 때문에, 형광 모이어티는 310nm초과, 바람직하게는 400nm초과의 파장에서 실질적인 흡수를 갖도록 선택되어야 한다. 다양한 적절한 형광 물질과 발색단은 형광 발색단 군으로 표지화될 수 있다. 형광 발색단 군 중에서 일군의 형광물질은 크산텐(xanthene)염료인데, 여기에는 플루오레세인(fluoresceins)과 로다민(rhodamines)이 포함된다. 다른 군의 형광 화합물은 나프틸아민(naphthylamine)이다. 형광단 또는 발색단으로 일단 표지되면, 항체는 예로써, 형광 경검(microscopy) (가령, 공초점(confocal) 또는 디컨볼루션(deconvolution) 경검)을 이용하여 샘플 내에서 FcRn의 존재 또는 국지화를 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편을 이용한 FcRn의 존재 또는 국지화 여부는 조직학적 분석, 단백질 어레이(arrays), FACS(형광 활성화된 세포 분류) 등의 다양한 방법을 통해 검출이 가능하다.
본 발명에서 생체 내 FcRn 또는 FcRn-발현 조직의 존재는 in vivo 화상검출 방법을 통해 확인될 수 있다. 상기 방법은 (1) 개체 (가령, 자가면역질환 환자)에, 검출가능 마커에 접합된 항-FcRn 항체를 투여하는 단계; (ii) FcRn-발현 조직 또는 세포에 대한 검출가능 마커를 검출하기 위한 수단에 상기 개체를 노출시키는 단계를 포함한다. 가령, 개체는 예로써, NMR 또는 다른 단층촬영 수단에 의해 화상 진찰된다. 진단적 화상 진찰에 유용한 라벨의 예로는 방사성 라벨, 형광 라벨, 양전자 방출 동위원소(positron emitting isotope), 화학발광물질, 발광효소 등이 있다. 방사성 표지화된 항체는 시험관내 진단 검사에도 이용될 수 있다. 동위원소-표지화된 항체의 특이적인 활성은 반감기, 방사성 라벨의 동위원소 순도, 그리고 라벨이 항체 내로 통합되는 방법에 좌우된다.
본 발명은 또한, FcRn에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 및 진단적 용도, 예를 들면, 시험관내에서, 예를 들면, 샘플, 예를 들면, 자가면역질환 환자로부터 생검 또는 세포 내에서, 또는 생체 내에서, 예를 들면, 개체를 화상 진찰함으로써 FcRn을 검출하기 위한, FcRn-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 대한 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약, 예를 들면, 라벨 또는 추가의 진단제를 더욱 포함할 수 있다. 생체 내 이용의 경우에, 항체는 제약학적 조성물로서 조제될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 또는 서열번호 9 및/또는 본 발명에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 또는 서열번호 19이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포 및 상기 재조합 발현 벡터 및 숙주세포를 이용하여 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 특히 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 제조하는 것이 바람직한데, 구체적으로 본 발명에 따른 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 가변영역을 각각 따로, 또는 하나의 숙주세포에서 동시에 발현시켜서 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화(polyadenylation) 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간면역결핍바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니(moloney) 바이러스 프로모터, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus,CMV) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(epstein barr virus,EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(rous sarcoma virus,RSV) 프로모터 뿐 아니라, 인간 β-액틴 프로모터, 인간 헤로글로빈, 인간근육 크레아틴, 인간 메탈로티오네인(metallothionein) 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 벡터로 형질감염된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질감염된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드(cosmids)등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편을 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터의 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모세포에 유용한 발현 벡터는 2℃ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질감염체를 형성하는데, 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵세포일 수 있다.
상기 숙주세포는 바람직하게는 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있는데, 원숭이 신장세포(COS7), NSO세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포, W138, 새끼 햄스터 신장(BHK)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78세포 및 HEK293세포 등이 이용가능하며, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO세포이다.
본 발명에서 숙주세포로의 "형질감염" 또는 "형질전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질감염, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질감염 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
재조합 벡터가 발현되는 형질감염체를 영양배지에서 배양함으로써 본 발명에 따른 FcRn 특이적 항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기와 같이 재조합적으로 생산된 항체 또는 항체 단편은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 예시적으로, 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능 하지만 이에 한정되지 않으며, 특히 프로테인 A(Protein A)를 이용하여 분리, 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 선별된 항체들이 pH 7.4 조건에서 각각 약 300pM 이하와 약 2 nM 이하의 항원 결합력(KD값)을 나타내었으며, pH 6.0 조건에서는 각각 200pM 이하와 900pM 이하의 KD값을 나타내었다. 이와 같이 본 발명에서 선별된 항체들은 pH 6.0과 pH 7.4 조건에서 모두 0.01 ~ 2nM 수준의 강한 hFcRn 결합력을 가지고 있어 세포 외부에서 결합한 항체가 엔도좀까지 결합을 유지함으로서 항체와 hFcRn과의 결합을 억제하는 효과가 뛰어날 것으로 판단된다. 또한, 이와 같은 항체 및 hFcRn 결합 억제 효과는 인간 FcRn을 발현하는 세포주와 FACS를 이용한 억제능 분석에서도 확인되었다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[ 실시예 1] 형질전환 렛드를 이용한 항 FcRn 항체 발현 라이브러리 제작
총 6마리의 형질전환 렛드(OmniRat®, OMT사)을 사용하여 면역(Immunization)을 수행하였다. 면역원은 인간 FcRn을 사용하였다. 렛드의 양쪽 발바닥에 0.0075mg씩 인간 FcRn을 보강제와 함께 24일 동안 3일 간격으로 8회 면역하고 28일째 마지막으로 5~10μg의 면역원을 PBS 버퍼에 희석하여 면역하였다. 28일되는 날 렛드 혈청을 취하여 항체 역가(titer) 확인에 사용하였다. 31일이 되는 날 렛드를 안락사 시키고 오금의 림프 노드(popliteal lymph node)와 서혜의 림프 노드(inguinal lymph node)를 P3X63/AG8.653 골수종세포와 융합하기 위하여 회수하였다.
렛드 혈청상의 항체 역가를 측정하기 위하여 ELISA 분석을 실시하였다. 우선, 인간 FcRn을 PBS (pH 6.0 또는 pH 7.4) 버퍼로 희석하여 2μg/mL의 용액을 만든 뒤 96 well plate에 100μL씩 부착(coating)한 다음 4℃에서 18시간 이상 방치하였다. 세척(washing) 버퍼(0.05% Tween 20 in PBS) 300μL로 3회 세척하여 결합하지 않은 인간 FcRn을 제거한 뒤 각 well에 blocking 버퍼 200μL를 넣고 상온에서 2시간 방치(incubation) 하였다. 분석 혈청 샘플을 1/100로 희석한 뒤 이 용액을 2배 연속 희석하여 총 10개 희석배율(1/100 ~ 1/256,000)의 분석 시료를 만들었다. Blocking 후 세척 버퍼 300μL로 3회 세척한 다음 분석 시료를 넣고 상온에서 2시간 방치하였다. 3회 세척 후 2차 측정 항체를 PBS 버퍼에 1:50,000되도록 희석하여 well에 100μL씩 넣고 상온에서 2시간 동안 방치하였다. 다시 3회 세척한 후 TMB 용액을 100μL씩 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후, 1M 황산(sulfuric acid)포함 반응 종료 용액(stop solution) 50μL 을 넣고 반응을 종료시킨 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450nm의 OD값을 측정하였다. 면역에 의한 항 hFcRn IgG 역가는 대부분 1/100 희석조건에서 OD 450nm 값이 1.0 이상으로 면역하지 않은 렛드의 혈청에 비해 높게 측정되어 면역이 잘 되었음을 확인하였다.
폴리에틸렌글리콜을 사용하여 융합한 총 3개의 하이브리도마 라이브러리 A, B, C를 만들었다. 우선 형질전환 렛드 1과 5를 사용하여 하이브리도마 라이브러리 A를 만들었고, 렛드 2와 6을 사용하여 하이브리도마 라이브러리 B를, 렛드 3과 4를 이용하여 하이브리도마 라이브러리 C를 만들었다. 각 하이브리도마 라이브러리 제작을 위한 융합 혼합액은 7일 동안 HAT가 포함된 배지에서 배양하여, HAT에 의해 융합된 세포만 선별되도록 하였다. HAT 배지에서 살아남은 하이브리도마 세포들은 모아서 HT 배지에서 6일정도 배양한 뒤 상층액를 취하여 렛드 IgG ELISA 키트(RD-biotech사)를 이용한 렛드 IgG의 정량을 측정하였다. 우선, 각 시료를 1:100 희석하여 ELISA plate well에 100μL씩 넣고 페록시다아제(peroxidase)가 표지(conjugation)된 항 렛드 IgG와 섞은 후 15분 상온에서 반응시켰다. TMB 용액 100μL씩 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 뒤 1M 황산포함 반응종료 용액 50μL을 넣고 반응을 종료시킨 다음 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 OD값을 측정하였다.
[ 실시예 2] 하이브리도마 라이브러리의 항 hFcRn 항체들의 항원 결합력 및 IgG 결합 방해 능력평가
인간 FcRn에 대한 항체 결합력을 분석하기 위하여 앞에서 언급한 방법과 동일한 ELISA 분석(pH 6.0과 pH 7.4)을 실시하였다. 3종의 하이브리도마 라이브러리 (A, B, C)의 hFcRn 결합력 평가 결과는 pH 6.0 조건과 pH 7.4 조건 모두에서 A > C > B 라이브러리 순이었다.
3종의 하이브리도마 라이브러리 배양 상층액을 이용하여 5ng/mL, 25ng/mL에서 FACS를 이용한 hFcRn 결합력 평가를 pH 6.0와 pH 7.4에서 수행하였다. 인간 FcRn 발현 안정화 HEK293세포를 플라스크에서 떼어낸 뒤 반응 용액(0.05% BSA in PBS, pH 6.0 or pH 7.4)에 혼합하였다. 2 x 106cells/mL의 세포수가 되도록 희석한 뒤 50μL씩 96 well에 넣고, 여기에 10ng/mL 과 50ng/mL으로 희석한 하이브리도마 라이브러리 배양 상층액을 50μL씩 well에 넣어 혼합하여 항체를 결합시켰다. A488 rabbit anti-rIgG goat Ab를 1:200으로 반응 용액에 희석하여 100μL씩 well에 분주하여 세포 펠릿에 혼합하여 결합 반응을 진행한 후 반응 용액 150μL를 넣어 FACS(BD)에서 측정 판독하였다. ELISA 결과와 마찬가지로 하이브리도마 라이브러리 A가 가장 항원 결합력(binding affinity)가 높은 것을 확인할 수 있었다.
FACS를 이용한 하이브리도마 라이브러리의 인간 FcRn 억제능 평가는 pH 6.0에서 실시하였다. 우선, naive HEK293 세포와 인간 FcRn 과발현 HEK293세포를 반응 용액(0.05% BSA in PBS, pH 6.0)에 혼합하였다. 1 x 105 세포를 96 well에 넣은 뒤 각각의 하이브리도마 라이브러리 배양 상층액은 4nM와 이를 10배 희석한 0.4nM 농도를 처리하였다. hIgG 결합 억제능 여부를 확인하기 위하여 100nM A488-hIgG1을 각 well에 첨가한 뒤 얼음에서 90분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응 용액 100μL를 넣어 세포 펠릿을 세척하고, U자형 바닥 시험관로 옮긴 다음 FACS에서 측정 판독하였다. 인간 FcRn 과발현 안정화 세포에 100nM A488-hIgG1가 남아있는 양을 측정한 다음 결합 억제능(%)을 구하였다. 기준 대조군(Isotype control)로 hIgG1을 사용하였으며, 양성 대조군으로 이전에 개발한 HL161-1Ag 항체를 사용하여 항체 결합 억제능을 비교 평가하였다. 각 대조군은 1μM과 2μM의 농도로 분석하였고, 하이브리도마 라이브러리 시료는 0.4nM과 4nM, 두 농도에서 측정하였다. 그 결과, 하이브리도마 라이브러리 A가 가장 높은 결합 억제능 효과를 나타냄을 확인하였다.
[ 실시예 3] FACS를 이용한 하이브리도마 세포 클론 분리 및 인간 항체 확보
가장 높은 인간 FcRn 결합력과 억제능을 나타낸 하이브리도마 라이브러리 A를 사용하여 FACS로 클론을 분리하여 총 442개의 단일 클론을 확보하였다. 다시 분리된 단일 클론들을 HT 배지로 배양 후 상층액을 얻어 FACS로 hFcRn에 결합하는 항체 발현 하이브리도마 클론들을 선별한 결과, 100개의 클론들(M1-M100)이 hFcRn 발현 HEK293세포에 강하게 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
FACS 분석을 통해 선별된 100개의 single 클론의 RNA를 분리하여 시퀀스를 분석하였다. 1차 시퀀스 분석 결과 100개 중 88개의 시퀀스가 분석되었고, 이를 아미노산 서열을 기준으로 총 35개 그룹 (G1~G38)으로 나누었다. 배양액을 확보하지 못한 2개 클론(G33, G35)을 제외하고 33개 그룹의 대표 클론의 배양 상층액을 100ng/mL 농도로 희석하고 hFcRn에 대한 결합력을 ELISA로 평가하였다.
이전 실험과 동일하게 FACS를 이용한 hFcRn 결합력 평가를 pH 6.0과 7.4 조건에서 실시하였다. 클론 간 결합력 정도에 따른 순위는 pH별로 유사하게 분석되었으며, 결합 강도(intensity)는 다양한 수준으로 나타났다.
또한, 상기 33개의 클론에 대한 pH 6.0에서 hFcRn 억제능 평가를 FACS를 이용하여 분석하였다. 측정된 MFI값을 토대로 억제능(%)를 산출하였다. 1667pM 농도에서 억제능 분석 결과값을 근거로 총 4개의 그룹으로 나뉘었으며, 70 ~ 100%인 그룹을 A, 30 ~ 70%인 그룹을 B, 10 ~ 30%인 그룹을 C, 10%이하인 그룹을 D라 정하였다.
SPR을 이용한 하이브리도마 클론의 키네틱 분석은 인간 FcRn을 고정화한 후, 하이브리도마 배양액을 분석 시료로 사용하여 진행하였다. 몇몇 클론을 제외한 대부분 클론은 106M이상의 kon값을 나타내었으며, koff값은 10- 3M이하로 측정되었다. 결론적으로 모든 클론이 10-9 ~ 10-11 M의 KD값을 갖는 것으로 확인되었다.
35종의 하이브리도마 클론 중 hFcRn 억제능 결과에 따라 나눈 A와 B 그룹의 항체 서열 중 CDR 시퀀스 부위에 N-glycosylation 또는 free cysteine이 존재하지 않는 18종 클론들의 유전자를 완전한 형태의 인간 IgG 서열로 전환하였다.
우선 18종의 선별된 항체 VH와 VL과 인간 항체 점라인 (germ line) 항체군의 아미노산 서열 상동성을 NCBI의 웹페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)의 Ig BLAST 프로그램을 이용하여 조사하였다.
18종의 인간 항체 유전자를 클로닝하기 위하여 유전자 양쪽 끝에 다음과 같이 제한효소 인식부위를 삽입하였다. 중쇄 가변영역(VH)에는 EcoRI/ApaI, 경쇄 람다 가변지역(VL(λ))에는 EcoRI/XhoI을 경쇄 카파 가변지역(VL(κ))에는 EcoRI/NheI 제한효소 인식부위를 넣어 설계하였으며, 경쇄 가변지역(VL)의 경우, 유전자 클로닝시 경쇄 람다 가변 (VL(λ))유전자 서열은 인간 경쇄 불변 (LC(λ) constant region) 유전자, 그리고 경쇄 카파 가변 (VL(κ))유전자 서열은 인간 경쇄 불변 (LC(κ) constant region) 유전자에 연결하였다.
동물 세포에서 항체 발현을 위한 pCHO1.0 발현 벡터 클로닝은 경쇄와 중쇄 유전자를 EcoRV, PacI, AvrII 그리고 BstZ17I 제한효소로 절단하여 각각 삽입하였다. 총 18종의 확인된 인간 항체 유전자 포함 pCHO1.0 발현 벡터들은 합성 유전자서열과 일치하는지 확인하기 위해 유전자 염기서열 분석(DNA sequencing)을 하였다.
발현용 pCHO1.0 벡터에는 항체 경쇄와 중쇄 유전자를 모두 포함하는 동물 세포 발현 시스템으로서 완전한 인간 IgG 형태를 발현하였다. 인간 항체는 상기 각 항체의 플라스미드 DNA를 CHO-S세포에 일시적 형질감염시켜 배지로 분비된 항체를 프로테인 A 컬럼을 이용하여 정제함으로써 수득하였다.
hFcRn이 발현되는 Tg32(hFcRn+/+, hβ2m+/+, mFcRn-/-, mβ2m-/-) 마우스(Jackson Laboratory)에 인간 IgG를 주사한 후 상기 인간 IgG 서열로 전환한 18종의 인간 항체을 투여하여 인간 IgG의 이화작용에 영향을 주는지 알아보았다.
앞선 항원에 대한 결합력(KD)과 FACS를 이용한 인간 FcRn 결합력 및 억제능 분석 등의 in vitro 분석 결과와 Tg32 마우스를 이용한 in vivo 인간 IgG의 이화작용에 가장 효과적으로 작용한 4종의 인간 항 FcRn 항체, HL161A, HL161B, HL161C 그리고 HL161D 항체 단백질을 확보하였다(도 1). 또한, HL161B 항체의 중쇄 가변 프레임워크(Framework) 영역 83번째 Asparagine(N)을 Lysine(K)로 치환하여 N-glycosylation site를 제거한 HL161BK 항체를 확보하였다. 이들의 각각의 경쇄와 중쇄 가변영역의 유전자 염기 서열과 아미노산 서열 및 CDR 서열은 다음 표 1, 2, 3와 같다.
표 1. 선별된 인간 FcRn 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
표 2. 선별된 인간 FcRn 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열
Figure pct00004
표 3. 선별된 인간 FcRn 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR 서열
Figure pct00005
[ 실시예 4] HL161A / HL161B / HL161C / HL161D의 SPR을 통한 항체의 항원 결합력 측정
SPR을 통한 HL161A, HL161B, HL161C, 및 HL161D 항체의 결합력은 수용성 hFcRn를 리간드로 Proteon GLC chip(Bio-Rad)에 고정화하여 친화도를 측정하는 방법으로 진행하였다. 키네틱 분석은 Proteon XPR36 장비를 사용하였으며, shFcRn을 GLC chip에 고정화시키고, 항체 시료를 5 농도로 반응시킨 후, 센소그램(sensogram) 결과를 확보하였다. 키네틱 분석은 1:1 Langmuir binding model을 적용하였으며, pH 6.0, pH 7.4 각 조건에서 6회 반복 분석하여 평균 KD값을 구하였다. 고정화 단계에 따라 활성화(activation)는 EDAC/NHS 0.5 X, 30μL/min, 300sec 조건에서 chip 활성화를 진행한 후, 고정화는 아세테이트 버퍼 (pH 5.5)를 사용하여 shFcRn을 2μg/mL, 250μL로 제조하여 30μL/min로 흘려 주면서 고정화 수준 200~300 RU에 해당할 때, 반응을 중지하였다. 이후 비활성화는 에탄올아민(ethanolamine)을 사용하여 30μL/min, 300sec 진행하였다. 각 HL161 항체는 10nM 농도를 기준으로 5nM, 2.5nM, 1.25nM, 0.625nM, 0.312nM 등 1/2씩 단계 희석하여 시료를 준비하였다. 시료 희석은 분석 pH에 따라 1X PBST(pH 7.4) 또는 1X PBST(pH 6.0) 버퍼를 사용하여 진행하였다. 시료 분석 조건은 결합은 50μL/min, 200sec 반응시키고, 해리 단계는 50μL/min, 600sec로 진행한 후, 글라이신(glycine) 버퍼 (pH 2.5)를 사용하여 100μL/min, 18sec 반응시켜 재생(regeneration) 하였다. 시료당 6회 키네틱 분석 후, 평균 항원 결합력(KD)를 측정하였다. SPR 분석 결과로 나온 항체의 키네틱 파라미터(kinetic parameter)는 표 4에 나타내었다 (도 2a 내지 2h).
표 4. 인간 FcRn 고정화 SPR 이용 항체 키네틱 분석 결과
Figure pct00006
[ 실시예 5] HL161A / HL161B의 FACS를 이용한 항체의 인간 FcRn 결합 분석
인간 FcRn을 발현하는 HEK293 안정화 세포를 대상으로 FcRn에 대한 pH별 결합 정도를 FACS 시스템을 사용하여 분석하였다. FACS를 이용한 FcRn 결합 시험은 평가하려는 pH에 따라 반응 용액을 pH 6.0와 pH 7.4 조건에서 실시하였다. 우선 100,000개의 인간 FcRn 안정화 HEK293 cell을 PBS 버퍼로 세척하고 탁상용 마이크로 원심분리기에서 4500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿으로 만들었다. pH 6.0 또는 pH 7.4 PBS/10mM EDTA 100μL에 항체를 첨가하였다. 남아있는 세포 펠릿에 반응 용액을 넣어 혼합하고 세포 계수(cell counting)을 진행하였다. 세포현탁액 10μL를 slide에 넣어 TC10 기기에서 세포수를 계수하고, 2 x 106 cell/mL이 되도록 반응 용액으로 희석하였다. 각 항체 시료는 500nM로 희석한 뒤, pH 6.0 분석의 경우 96 well v-bottom plate에서 20nM로 희석하고 50μL씩을 취하여 각 well에 분주하도록 하였다. pH 7.4 분석의 경우는 500nM 항체 시료를 3배 연속 희석법(3 fold serial dilution)으로 희석하여 최종 250nM부터 0.11nM농도 구간에서 분석하였다. 2 x 106 cell/mL로 희석된 세포를 50μL씩 넣어 혼합하였다. 플레이트(plate)는 4℃에 설치된 rotator에 안착시켜 15도 각도, 10rpm으로 90분간 회전시켰다. 반응이 끝나면 플레이트를 꺼내어 2000rpm으로 10분간 원심분리 시키고, 상층액을 제거하였다. A488 anti-hIgG Goat Ab를 1:200으로 반응 용액에 희석하여 100μL씩 well에 분주하여 혼합하였다. 다시 플레이트를 4℃에 설치된 rotator에 안착시켜 15도 각도, 10rpm으로 90분간 회전시켰다. 반응이 끝나면 플레이트를 꺼내어 2000rpm으로 10분간 원심분리 시키고, 상층액을 제거하였다. 이 세척과정을 한번 더 진행한 뒤, 반응 용액 100μL 를 넣어 세포 펠릿을 풀어 blue test tube로 옮겼다. 여기에 반응 용액 200μL를 첨가한 다음 FACS에서 측정 판독하였다. FACS 측정 조건은 FS 108 volts, SS 426 volts, FL1 324 volts, FL2 300 volts이다. 이들 세포는 BD FACSDivaTM v6.1.3 소프트웨어(BD Bioscience)를 이용한 FACS로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity: MFI)로서 표시되었다 (도 3). HL161A와 HL161B 항체는 10nM 농도, pH 6.0 조건에서 각각 10.59와 8.34의 MFI 값을 나타냈으며, pH 7.4 조건의 0.11~250 nM 농도 구간에서는 MFI값을 이용한 4인자 로지스틱 회귀분석(4 parameter logistic regression)을 통하여 EC50(Effective Concentration 50%) 값을 분석한 결과 각각 2.46nM과 1.20nM 값을 나타내었다.
[ 실시예 6] HL161A / HL161B의 FACS를 이용한 항체의 억제능 기능 분석
세포 표면 인간 FcRn에 대한 결합능 분석을 진행한 2종의 항체를 세포 표면에 hFcRn이 발현되는 HEK293세포에 처리하고, Alexa-Fluo-488 형광표지된 hIgG1의 결합이 감소되는 것으로 항체의 억제능 효과를 확인하였다. 분석 과정을 자세히 설명하면 다음과 같다.
Naive HEK293 cell과 인간 FcRn 과발현 안정화 HEK293세포들에 각각 1 x TE 2mL을 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 1분간 방치하였다. 플라스크로부터 세포를 회수한 다음 pH 6.0 반응 용액 8mL을 넣어 혼합해주어 50mL cornical tube로 옮겼다. 2000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 각각의 세포 펠릿에 pH 6.0 반응 용액을 1mL씩 넣어 혼합한 다음 새로운 1.5mL Eppendorf tube로 옮겼다. 다시 4000rpm으로 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하고, 남은 세포 펠릿에 pH 6.0 반응 용액을 첨가하여 혼합한 세포현탁액의 세포수를 계측하였다. 최종적으로 세포현탁액을 2.5 x 106 cell/mL이 되도록 반응 용액으로 희석하였다.
각 항체 시료는 400nM로 희석한 뒤, 96 well v-bottom plate에서 4배 연속 희석법을 진행하였다. 최종 분석 농도가 200nM에서 0.01nM이 되도록 희석한 시료를 각 well에 50μL씩 분주하였다. 여기에 1μM 로 pH 6.0 반응 용액에 희석된 Alex488-hIgG1 10μL씩을 분주하였다. 마지막으로 2.5 x 106cell/mL로 희석된 세포를 40μL씩 넣어 혼합하였다. 플레이트는 4℃에 설치된 rotator에 안착시켜 15도 각도, 10rpm으로 90분간 회전시켰다. 반응이 끝나면 플레이트를 꺼내어 2000rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 반응 용액 100μL를 넣어 세포 펠릿을 풀어주고 blue test tube로 옮긴 다음, 반응 용액 200μL를 첨가하여 FACS에서 측정 판독하였다. FACS 측정 조건은 FS 108 volts, SS 426 volts, FL1 324 volts, FL2 300 volts이다. 이들 세포는 BD FACSDivaTM v6.1.3 소프트웨어(BD Bioscience)를 이용한 FACS로 분석되었다. 결과는 평균 형광 강도(MFI)로서 표시되었다. 실험군의 MFI는 세포만을 통해 측정된 MFI값(background signal)을 빼준 후 처리하였다. 대조 튜브 (Alexa Fluor 488 단독, 그리고 경합인자 없음)의 MFI를 100%로 환산하여 경합인자 포함 튜브의 MFI의 백분율을 환산하였다.
인간 IgG1의 경합인자 포함 튜브의 MFI 보다 낮은 경우에 경합 항체의 경합률이 높은 것으로 판단하였으며, pH 6.0조건, 0.01~200nM 농도 구간에서 HL161A와 HL161B 항체의 억제능 측정값(%)을 이용하여 4인자 로지스틱 회귀분석을 실시하였다.
결과적으로 HL161A와 HL161B 항체의 IC50(Inhibitory Concentration 50%) 값은 각각 0.92nM과 2.24nM 값을 나타내었다 (도 4).
[ 실시예7 ] mFcRn -/- hFCRN 형질전환 32( Tg32 ) 마우스에서 HL161A / HL161B의 효력시험
인간 FcRn이 발현되는 Tg32(hFcRn+/+, hβ2m+/+, mFcRn-/-, mβ2m-/-) 마우스(Jackson Laboratory)에 인간 IgG를 주사한 후 HL161A과 HL161B 및 인간 IgG를 투여하여 인간 IgG의 이화작용에 영향을 주는지 알아보았다.
HL161A와 HL161B 항체들과 인간 IgG(Greencross, IVglobulinS)를 5, 10, 그리고 20mg/kg 용량으로 4일 투여를 위해 분주하여 보관하였고, 전달체와 20mg/kg IgG1 대조물질로 pH 7.4의 PBS 버퍼을 사용하였다. 인간 FcRn Tg32 마우스는 약 7일간 적응시켜서 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도(23±2℃), 습도(55±5%) 및 명암주기(12시간)는 자동으로 조절되도록 하였다. 각 군마다 4마리로 실험을 진행하였다. 인간 IgG을 추적물질로 사용하기 위해 Biotin이 접합된 hIgG를 kit(Pierce, Cat#. 21327)를 사용하여 제조하였다. 0시간에 5mg/kg의 biotin-hIgG와 495mg/kg의 인간 IgG를 복강 투여하여 체내의 IgG를 포화시켰다. 약물의 투여는 biotin-IgG의 투여 후 24, 48, 72, 96시간 후에 5, 10 그리고 20mg/kg의 용량으로 1일 1회 복강주사하였다. 채혈은 포란액(Isoflurane, JW pharmaceutical)을 이용하여 가볍게 마취시킨 후, 헤파린 처리된 마이크로-헤마토그리트 튜브(Heparinized Micro-hematocrit capillary tube, Fisher)를 사용하여, 안와정맥총에서 채혈을 진행하였다. biotin-IgG의 투여 후 24, 48, 72, 96, 120, 168시간 후에 진행하였으며 24, 48, 72, 96시간에는 채혈 진행 후 약물을 투여하였다. 0.1mL의 전혈을 Eppendorf tube에 받은 후 바로 원심분리기로 혈장을 분리하여 분석 전까지 딥 프리저(deep freezer, Thermo)에 -70℃ 상태로 보관하였다.
채혈된 혈액속 biotin-hIgG1양은 다음과 같이 ELISA 방법에 의해 분석되었다. 96 well plate(Costar, Cat. No: 2592)에 1.0μg/ml 농도가 되도록 100μL 뉴트라비딘(Neutravidin, Pierce, 31000)를 주입한 후, 4℃에서 16시간 고정화하였다.
버퍼 A(0.05 % Tween-20, 10mM PBS, pH 7.4)을 이용하여 3회 플레이트를 세척 후, 1% BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액으로 2시간 상온에서 반응시켰다. 버퍼 A를 이용하여 3회 플레이트를 세척한 후, 1μg/ml 에 해당하도록 0.5 % BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액으로 뉴트라비딘 플레이트를 제조하였다. 각 well에 버퍼 B(100mM MES, 150mM NaCl, 0.5% BSA IgG-free, 0.05 % Tween-20, pH 6.0)를 이용하여 혈액 시료를 500배에서 1000배 범위로 순차적 희석을 진행하여 각 150μL씩 플레이트에 주입하였다. 주입된 시료는 상온에서 1시간 반응시켰다. 버퍼 A를 이용하여 3회 플레이트를 세척한 후 HRP가 접합된 항 인간 IgG 염소항체를 1nM로 제조한 후 200μL씩 주입하여 37도에서 2시간 반응시켰다. 얼음을 이용하여 냉각된 버퍼 B를 사용하여 3회 플레이트를 세척 후, 기질 용액인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, RnD, Cat. No: DY999)를 100μL 주입한 후 상온에서 15분 반응시켰다. 1.0M 황산 용액(삼전, Cat. No: S2129) 50μL를 주입하여 반응을 중지한 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
24시간(마우스에서 biotin-IgG의 대략적인 Tmax이자, biotin-IgG의 이화작용이 일어나기 전 시간) 경과 후의 biotin-IgG의 농도를 100%로 고정하고, 나머지 시간의 농도를 %로 표시한 결과는 도 10에 도시되어 있다. 분석 결과 전달체군과 20mg/kg IgG1 대조물질의 반감기는 각각 103시간과 118시간이었다. 반면, 앞서 in vitro 분석 상에서 인간 FcRn 결합력 및 억제능이 우수하며, 인간 FcRn 형질 전환 Tg32 마우스에서 가장 빠른 IgG 이화작용을 나타낸 HL161A 항체의 혈액내 IgG 반감기는 용량별로 각각 30, 23, 그리고 18시간이었다. 뿐만 아니라, HL161B 항체도 용량별 각각 41, 22, 그리고 21시간의 IgG 반감기를 나타내었다. 이를 통해 hFcRn에 pH 비의존적, Fc 비경합적인 항체가 내인성 항체의 이화작용 증가에 효력이 있다는 것을 확인하였다 (도 5a 및 도 5b).
[ 실시예 8] 원숭이에서 HL161A / HL161B의 효력시험
인간 FcRn과 96% 상동성을 가진 시노몰구스 원숭이를 이용하여 HL161A와 HL161B 항체 투여에 의한 원숭이 IgG, IgA, IgM, 알부민 수준을 확인하고 약동학적(Pharmacokinetics, PK) 프로파일을 확인하였다.
1) 원숭이 혈액내 IgG 항체 변화량 분석 결과
우선, 원숭이 IgG은 ELISA 분석을 통하여 변화를 측정하였다. 96 well plate(Costar, Cat. No: 2592)에 4.0μg/mL농도가 되도록 100μL 항-인간 IgG Fc항체 (BethylLab, A80-104A)를 로딩한 후, 4℃에서 16시간 고정화하였다. 세척 용액 (0.05% Tween-20, 10mM PBS, pH 7.4)을 이용하여 플레이트를 3회 세척한 후, 1% BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액으로 2시간 실온에서 반응시켰다. 표준품인 원숭이 IgG는 3.9~500ng/mL 농도, 그리고 혈액 시료는 1% BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액을 사용하여 80,000배 희석한 후 플레이트에 로딩하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 세척 용액을 이용하여 플레이트를 3회 세척한 후, hIgG에 대한 항체(Biorad, 201005)를 20,000배 희석하여 100μL를 로딩하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 각 플레이트를 세척 후, 기질 용액인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, RnD, Cat. No: DY999)를 100μL 주입하여 실온에서 7분 반응시키고, 1.0M 황산 용액(삼전, Cat. No: S2129) 50μL를 주입하여 반응을 중지하였다. 분석 결과는 450과 540nm의 흡광도 판독기(MD, 모델명:VersaMax)를 이용하여 흡광도(OD)를 측정하였다. 결과적으로 HL161A와 HL161B 항체를 시노몰구스 원숭이에 5, 20mg/kg의 용량으로 주 1회 정맥투여한 결과 원숭이 IgG는 투여용량에 따라 용량의존적으로 감소하였고, IgG-FcRn 상호작용을 HL161 항체가 효과적으로 차단함을 확인하였다. 5mg/kg의 HL161A의 경우 최대 9일째에 47.1%까지 감소시켰으며, 20mg/kg는 10일째에 29.6 %까지 감소시켰다. HL161B의 5 mg/kg의 경우 10일째에 53.6 %까지 감소시켰으며, 20mg/kg의 경우는 9일째에 31%까지 감소시켜 두 항체에서 유사한 결과가 확인되었다(표 5와 도 6a 내지 도 6c). 또한, HL161A와 HL161B의 정맥투여에 의한 원숭이 IgG의 개체별 변화를 비교한 결과 각 개체별로 매우 유사하게 원숭이 IgG가 감소하는 경향을 보였다.
표 5. HL161A와 HL161B 투여에 의한 원숭이 IgG의 변화( % )
Figure pct00007
2) 원숭이 혈액내 HL161A / HL161B의 약동학적 프로파일( Pharmacokinetic profile) 분석 결과
HL161A와 HL161B의 정맥 투여 후 시간에 따른 혈중 약동학적 프로파일은 경쟁적 ELISA 방법을 이용하여 분석하였다. 우선, 뉴트로아비딘(Neutravidin) 2μg/mL의 용액을 만든 뒤 96 well plate에 100μL씩 고정화(coating) 한 다음 4℃에서 18시간 방치하였다. 세척 버퍼(0.05% Tween 20 포함 10mM PBS, pH 7.4) 300μL로 3회 세척한 후 각 well에 1% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4) 용액으로 25℃에서 2시간 상온에서 반응시켰다. Biotin 결합 hFcRn을 PBS로 희석하여 1μg/mL의 용액을 만든 뒤 96 well plate에 100μL씩 분주한 다음 다시 25℃에서 1시간 동안 반응하였다. 세척 버퍼 300μL로 3회 세척하여 결합하지 않은 hFcRn을 제거한 뒤 기준 시료(0.156~20 ng/mL)을 넣고 25℃에서 2시간 반응하였다. 다시 세척 버퍼로 3회 세척 후 이차 항체(detection antibody)를 PBS에 1:10,000되도록 희석하여 well에 100μL씩 넣고 25℃에서 1.5시간 동안 반응하였다. 마지막으로 3회 세척한 다음 TMB 용액 100μL씩 넣고 상온에서 5분간 반응시킨 후 1M 황산 반응 종료 용액 50μL 을 넣고 반응을 종료시킨 뒤 흡광도 판독기로 450nm의 흡광도를 측정하였다. HL161A 및 HL161B의 분석결과는 표 6과 같았으며, 용량의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 반감기(T1/2)는 약 6일~12일로 일반적으로 알려진 항체의 반감기에 비하여 짧았으며, 전체적으로 보았을때 HL161A에 비해서 HL161B가 반감기, AUC 및 Cmax가 높게 나타났다 (도 7a 및 도 7b).
표 6. HL161A와 HL161B의 용량별 약동학적 프로파일 분석 결과
Figure pct00008
3) 원숭이 혈액내 IgM 및 IgA 항체 변화량 분석 결과
원숭이 혈액내 IgM과 IgA을 측정하기 위한 ELISA 분석은 IgG 측정을 위한 ELISA 방법과 유사하게 진행하였다. 우선, 96 well plate에 2.0μg/mL 농도가 되도록 100μL 항 원숭이 IgM 항체(Alpha Diagnostic, 70033) 또는 IgA 항체(Alpha Diagnostic, 70043)를 분주한 다음 4℃에서 16시간 고정화하였다. 세척 용액(0.05% Tween-20 포함 10mM PBS, pH 7.4)을 이용하여 플레이트를 3회 세척한 후, 1% BSA가 포함된 PBS (pH 7.4) 용액으로 2시간 실온에서 반응시켰다. 표준품인 원숭이 IgM은 7.8 ~ 1,000ng/mL 농도 구간, 그리고 IgA은 15.6~2,000ng/mL 농도 구간으로 분석하였으며, 혈액 시료는 1% BSA가 포함된 PBS(pH 7.4) 용액을 사용하여 10,000 또는 20,000배 희석한 후 각 well에 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 세척 용액을 이용하여 플레이트를 3회 세척한 다음, 원숭이 IgM에 대한 이차 항체(Alpha Diagnostic, 70031)와 원숭이 IgA에 대한 이차 항체(KPL, 074-11-011)를 각각 5,000배 희석하여 100μL를 실온에서 1시간 반응시켰다. 마지막으로 3회 세척한 후 기질 용액인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, RnD, Cat. No: DY999)를 100μL를 주입하여 실온에서 7분 반응시키고, 1.0M 황산 용액(삼전, Cat. No: S2129) 50μL를 주입하여 반응을 중지하였으며, 450, 540nm의 흡광도 판독기(MD, 모델명:VersaMax)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
4) 원숭이 혈액내 알부민 변화량 분석 결과
혈액내 원숭이 알부민 변화량 분석은 상용화된 ELISA 키트(Assaypro, Cat. No: EKA2201-1)를 이용하여 분석하였다. 방법을 간단히 요약하자면, 분석 시료인 원숭이 혈청을 4,000배 희석한 다음 원숭이 알부민과 결합할 수 있는 항체가 고정화된 96 well plate에 25μL씩 분주하였다. Biotin이 결합된 원숭이 알부민 용액을 25μL넣어 섞어주고 25℃에서 2시간 동안 반응하였다. 세척 버퍼 200μL로 3회 세척 후 스트랍타아비딘-페록시다아제(streptavidin-peroxidase)가 결합된 이차 항체를 1:100 희석한 용액 50μL씩을 각 well에 넣고 25℃에서 30분 동안 반응하였다. 마지막으로 3회 세척한 후 기질을 50μL씩 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 반응 종료 용액 50μL을 넣고 450nm의 흡광도를 측정하였다. 결론적으로 HL161A와 HL161B 항체 투여에 의한 원숭이 IgM, IgA, 그리고 알부민은 전 시험기간 동안 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았다(도 8a 내지 도 8c). 따라서, HL161 항체는 IgG에만 관여하며, 그 외 IgM과 IgA의 농도에는 영향을 주지 않아 면역글로불린 농도 감소에 의한 면역 저하에 영향이 적을 것으로 판단되었다. 또한, 원숭이 알부민의 농도도 전 시험기간 동안 큰 변화가 관찰되지 않아 HL161A와 HL161B 항체가 IgG-FcRn 상호작용 만을 특이적으로 차단한다는 것을 의미하였다.
5) 혈액 생화학적 수치 및 뇨 성분 분석결과
마지막으로 항체 투여에 의한 혈액생화학적 검사 및 뇨검사를 시험 14일차에 시료를 이용하여 실시하였다. 혈액생화학적 표지 인자는 Aspartate aminotransferase(AST), Alanine aminotransferase(ALT), Alkaline phosphatase(ALP), Creatine phosphokinase(CPK), Total bilirubin(TBIL), Glucose(GLU), Total cholesterol(TCHO), Triglyceride(TG), Total protein(TP), Alumine(Alb), Albumine/globulin(A/G), Blood urea nitrogen(BUN), Creatinine(CRE), Inorganic phosphorus(IP), Calcium(Ca), Natrium(Na), Kalium(K), Chloride(Cl)를 Hitachi 7180 기기를 이용하여 분석하였으며, 뇨 분석을 위한 표지 인자는 Leukocyte(LEU), Nitrate(NIT), Urobilinogen(URO), Protein(PRO), pH, Occult blood(BLO), Specific gravity(SG), Ketone body(KET), Bilirubin(BIL), Glucose(GLU), Ascorbic acid(ASC)를 Mission U120 기기를 이용하여 변화를 측정하였다. 전반적으로 약간의 수치 변화는 있었으나, 시노몰구스 원숭이의 정상 수치 범위 내에 포함되는 수치로 측정되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Hanall Biopharma Co., Ltd. <120> FcRn Specific Human Antibody and Composition for Treatment of Autoimmune Diseases <130> 250 <150> US 61/986,742 <151> 2014-04-30 <160> 44 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161A <400> 1 gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcctgcgccg cctccgagtt caccttcggc agctgcgtga tgacctgggt ccgacaggct 120 cccggcaagg gcctggaatg ggtgtccgtg atctccggct ccggcggctc cacctactac 180 gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagaccccc 300 tggtggctgc ggtccccctt cttcgattac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tcc 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161A <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Gly Ser Cys 20 25 30 Val Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Pro Trp Trp Leu Arg Ser Pro Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161B <400> 3 caactgttgc tccaggaatc cggtcctggt cttgtaaagc catctgagac tctctccctt 60 acctgtaccg ttagcggagg aagtctttcc tcaagcttct cctactgggt gtggatcaga 120 cagcctcccg gaaaagggtt ggagtggatt ggcacaatat actactccgg caacacttac 180 tataacccca gcctgaagag caggctgact atctctgtcg acaccagtaa aaatcacttt 240 tctctgaatc tgtcttcagt gaccgcagcc gacaccgccg tgtattattg cgctcggcgc 300 gccgggattc tgacaggcta tctggattca tggggccagg ggacattggt tacagtgtct 360 agt 363 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161B <400> 4 Gln Leu Leu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Ser Tyr Trp Val Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe 65 70 75 80 Ser Leu Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161BK <400> 5 cagctgctgc tgcaagaatc cggccctggc ctggtgaaac cctccgagac actgtccctg 60 acctgcaccg tgtccggcgg ctccctgtcc tccagcttct cctactgggt ctggatccgg 120 cagccccctg gcaagggcct ggaatggatc ggcaccatct actactccgg caacacctac 180 tacaacccca gcctgaagtc ccggctgacc atctccgtgg acacctccaa gaaccacttc 240 agcctgaagc tgtcctccgt gaccgccgct gacaccgccg tgtactactg tgccagaagg 300 gccggcatcc tgaccggcta cctggactct tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360 tcc 363 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161BK <400> 6 Gln Leu Leu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Ser Tyr Trp Val Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161C <400> 7 caggtgcagc tcgtgcagtc cggcgcagag gtcaaaaagc ctggtgcatc tgtgaaagtg 60 agttgcaagg ctagcggcta cacctttacc ggatgttata tgcattgggt acgccaagcc 120 cccggacaag gcttggaatg gatggggcgt atcaacccaa actctggcgg gactaattac 180 gcccagaagt ttcagggaag ggtgactatg acaagggaca catccatatc caccgcttat 240 atggacctgt ctcgactgcg gtctgatgat acagccgttt attactgcgc cagagactac 300 agcggatgga gcttcgatta ttgggggcag ggtactttgg tcacagtttc aagt 354 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161C <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Cys 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Trp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161D <400> 9 cagctgcagt tgcaggagtc aggccccggt ttggttaagc cttctgaaac cctttctctc 60 acatgcacag tatccggtgg ctccatctcc agttcaagtt actactgggg atggatccgg 120 caacccccag gaaaagggct ggagtggatt ggcaatatat attactctgg gtccacctat 180 tacaaccctt ccctgatgag tagagtgacc atcagcgtgg acacaagcaa aaaccaattc 240 agcctgaagc tttctagcgt gaccgctgcc gacacagctg tctattactg tgcccgccag 300 cttagttata actggaatga taggctgttt gattactggg gccaggggac tctcgttaca 360 gtcagcagc 369 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv of HL161D <400> 10 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Met Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gln Leu Ser Tyr Asn Trp Asn Asp Arg Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161A <400> 11 tcttacgtgc tgacccagcc cccctccgtg tctgtggctc ctggccagac cgccagaatc 60 acctgtggcg gcaacaacat cggctccacc tccgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtggt gcacgacgac tccgaccggc cttctggcat ccctgagcgg 180 ttctccggct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg ccaagtgcga gactcctcct ccgaccacgt gatcttcggc 300 ggaggcacca agctgaccgt gctgggccag cctaaggccg ctccctccgt gaccctg 357 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161A <400> 12 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Thr Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val His 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu 115 <210> 13 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161B <400> 13 tcttacgtgc tgacccagtc cccctccgtg tccgtggctc ctggccagac cgccagaatc 60 acctgtggcg gcaacaacat cggctccaag tccgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtggt gtacgacgac tccgaccggc cctctggcat ccctgagcgg 180 ttctccgcct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gactcctcct ccgaccacgt ggtgttcggc 300 ggaggcacca agctgaccgt gctgggccag cctaaggccg ctccctccgt gaccctg 357 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161B <400> 14 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu 115 <210> 15 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161BK <400> 15 tcttacgtgc tgacccagtc cccctccgtg tccgtggctc ctggccagac cgccagaatc 60 acctgtggcg gcaacaacat cggctccaag tccgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtggt gtacgacgac tccgaccggc cctctggcat ccctgagcgg 180 ttctccgcct ccaactccgg caacaccgcc accctgacca tctccagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg ccaagtgtgg gactcctcct ccgaccacgt ggtgttcggc 300 ggaggcacca agctgaccgt gctgggccag cctaaggccg ctccctccgt gaccctg 357 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161BK <400> 16 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu 115 <210> 17 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161C <400> 17 gacatccaga tgacccagtc accatcatcc ctttccgcat ctgtcggaga tagagtgact 60 atcacctgca gggcttctca aggtatttcc aactacctcg cctggttcca gcaaaagcca 120 ggtaaagccc caaagagctt gatctacgcc gcttctagtc tgcagagtgg agttcctagt 180 aagttctccg gctctggcag tggcacagat tttaccttga ccatttccag cctgcagtct 240 gaggatttcg ctacctacta ttgtcagcag tatgacagct atccccccac atttgggggg 300 ggcactaagg tggagataaa acggacagtg gctgcccctt ctgtctttat t 351 <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161C <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile 115 <210> 19 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161D <400> 19 agctatgagc tgacccagcc tctgagcgta tctgtcgctc tcggccagac agccagaatt 60 acctgtggcg gcaataacat aggatccaaa aatgttcact ggtatcagca aaaacctggc 120 caagctcccg tgctcgtgat ctaccgggac tctaaccgac ccagtggaat ccccgaacgc 180 tttagcggtt ccaactctgg aaatacagct actctgacta tctccagggc tcaggccggg 240 gatgaggccg attactactg ccaggtgtgg gactcaagca cagtggtctt cggcggaggt 300 accaagttga ctgttcttgg gcagccaaag gccgcacctt cagtgaccct g 351 <210> 20 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv of HL161D <400> 20 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Thr Leu 115 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR1 of HL161A <400> 21 Ser Cys Val Met Thr 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR2 of HL161A <400> 22 Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR3 of HL161A <400> 23 Thr Pro Trp Trp Leu Arg Ser Pro Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR1 of HL161A <400> 24 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Thr Ser Val His 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR2 of HL161A <400> 25 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR3 of HL161A <400> 26 Val Arg Asp Ser Ser Ser Asp His Val Ile 1 5 10 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR1 of HL161B or HL161BK <400> 27 Phe Ser Tyr Trp Val 1 5 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR2 of HL161B or HL161BK <400> 28 Thr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR3 of HL161B or HL161BK <400> 29 Arg Ala Gly Ile Leu Thr Gly Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR1 of HL161B or HL161BK <400> 30 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR2 of HL161B or HL161BK <400> 31 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR3 of HL161B or HL161BK <400> 32 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val 1 5 10 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR1 of HL161C <400> 33 Gly Cys Tyr Met His 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR2 of HL161C <400> 34 Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR3 of HL161C <400> 35 Asp Tyr Ser Gly Trp Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR1 of HL161C <400> 36 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR2 of HL161C <400> 37 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR3 of HL161C <400> 38 Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR1 of HL161D <400> 39 Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR2 of HL161D <400> 40 Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hv CDR3 of HL161D <400> 41 Gln Leu Ser Tyr Asn Trp Asn Asp Arg Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR1 of HL161D <400> 42 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His 1 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR2 of HL161D <400> 43 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lv CDR3 of HL161D <400> 44 Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 1 5

Claims (25)

  1. 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40 및 서열번호 43으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
    서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
    서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는
    서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
    서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3,
    서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는
    서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및
    서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  5. 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 36, 서열번호 39 및 서열번호 42로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 34, 서열번호 37, 서열번호 40 및 서열번호 43으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 41 및 서열번호 44로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편.
  6. 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  8. 제6항에 있어서, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  9. 제6항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역, 및
    서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  10. 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함하는 분리된 항-FcRn 항체 또는 이의 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, pH 6.0과 pH 7.4 조건에서 0.01 내지 2nM의 KD(dissociation constant) 값으로 FcRn에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 마우스 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 단편.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전장항체, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 도메인 항체, 듀얼-특이항체, 바이바디(bibodies), 미니바디, 트리바디, 스캡 (scap: sterol regulatory binding protein cleavage activating protein), 이중특이항체, 삼중특이항체, 다중특이항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 인트라바디, 나노바디, SMIP (small modular immunopharmaceuticals), 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 낙타 항체(camelized antibody), 또는 VHH 포함 항체를 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체를 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 19로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 90%이상의 상동성을 나타내는 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  19. 제18항의 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포.
  20. 제19항의 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및
    상기 생성된 항체를 분리 및 정제하여 FcRn에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 단편의 제조방법.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  22. 제21항의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환 환자를 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 자가면역질환은 면역성 호중구감소증, 길랑바레 신드롬, 간질, 자가면역 뇌염, 아이삭 신드롬, 모반 신드롬, 심상성천포창, 낙엽성천포창, 수포성류천포창, 후천성표피수포증, 임신성 유사수포창, 뮤코스 막 유사수포창, 항인지질 신드롬, 자가면역 빈혈, 자가면역 그래이브 병, 굿파스튜어 증후군, 중증근무력증, 다발성경화증, 류마티스성 관절염, 루프스, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP), 루프스 신염 및 막성 신병증으로 구성된 군에서 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편, 및 검출
    라벨을 포함하는 조성물.
  25. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 사용하는 것을 포함하는 시험관 내 또는 생체 내에서 FcRn를 검출하는 방법.
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