KR20160137608A

KR20160137608A - 제어된 방출 특성을 갖는 펩티드 적재된 plga 마이크로스피어의 제조방법

Info

Publication number: KR20160137608A
Application number: KR1020167029649A
Authority: KR
Inventors: 에반겔로스 카라바스; 에프티미오스 코우트리스; 카테리나 미니오티; 소티리아 차이티도우; 조지아 파파니콜라우; 테오파니스 만투어리아스
Original assignee: 파마덴 에스.에이.
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2016-11-30
Also published as: AU2014389015A1; LT3125871T; ES2837044T3; KR102218655B1; CN114191538A; AU2014389015B2; HUE052289T2; HRP20210058T1; BR112016022550A2; ZA201607413B; CN106170284A; EP3125871A1; JP6494657B2; MX2016012846A; CA2944561A1; DK3125871T3; BR112016022550B1; EP3125871B1; SI3125871T1; RS61209B1

Abstract

본 발명은 펩티드 활성 제약 성분을 포함하는 생분해성 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜리드)마이크스피어에 기초된 장시간 작용하는 주사가능한 조성물의 제조방법을 제공한다.

Description

제어된 방출 특성을 갖는 펩티드 적재된 PLGA 마이크로스피어의 제조방법{PREPARATION OF PEPTIDE LOADED PLGA MICROSPHERES WITH CONTROLLED RELEASE CHARACTERISTICS}

본 발명은 펩티드 활성 제약 성분을 포함하는 생분해성 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜리드) "PLGA" 마이크로스피어의 제조방법 및 제어된 방출 특성을 얻게하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 에멀젼 용매 추출/증발 방법에 관한 것이고, 여기서 폴리머 매트릭스로부터 펩티드의 방출은 용매 증발 단계 동안 온도 프로파일에 의해 제어되는 것이다.

펩티드 약물은 일반적으로 이들의 나쁜 경구 흡수와 위액(gastric fluids)에서의 높은 불안정성으로 인하여 계통적으로, 예를 들면, 비경구적으로 투여된다. 그러나, 비경구 투여는 고통스러울 수 있으며 불편함, 특히 반복적인 매일 투여에 따른 불편함을 야기할 수 있다. 환자에게 주사 회수를 최소화하기 위해, 약물 물질은 디포 제형(depot formulation)으로 투여되는 것이 이롭다. 생분해성 폴리머, 예를 들면, 마이크로스피어 또는 임플란트 중에 디포 제형으로서 펩티드 약물의 비경구적 투여는 생물학적 매질의 효소적 및 가수분해적 영향에 대해 펩티드를 보호하는 폴리머에서 잔류 시간 후에 이들의 지속적 방출을 가능하게 하여 제안되고 있다. 주사가능한 디포 제형의 일반적인 단점은 전체적인 방출 기간 동안 제로로 가까워지는 플라즈마 레벨과 함께 바람직하지 않은 약리학적학적 부작용의 원인인 하이 피크 레벨(high peak levels)과 같은 플라즈마 레벨에서의 변동이다. 확장된 시간 동안 치료학적으로 관련된 혈액 레벨을 성취하는 것이 어렵고, 만족스러운 펩티드 방출 프로파일은 극소수의 케이스에서만 실제 얻어진다.

PLGA 마이크로스피어 형태에서 비경구적 디포의 펩티드 방출 특성을 제어하는 확인된 인자는 펩티드 형태(즉, 프리 펩티드, 염 형태), 폴리머 유형(즉, 분자량, 락타이드 대 글리콜리드 비율, 선형 또는 분지형 구조, 엔드-터미널 그룹), 약물 적재, 입자 크기 및 입자 다공성 및 폴리머 매트릭스로의 약물의 분포(US 5,538,739)을 포함한다.

몇몇의 상업적인 장기간-작용하는 방출 약물 제형의 마이크로스피어는 시판되고 있다. SANDOSTATIN LAR®은 옥트레오티드(octreotide) 아세테이트 활성 펩티드를 포함하는 시판되는 비경구적 디포 제형이다. 이것은 그중에서도 선단 비대증(acromegalic) 환자에서 및 악성 카르시노이드 종양과 관련된 심한 설사 및 홍조 및 혈관 활성 소장 펩티드 종양(asoactive intestinal peptide tumors, vipoma tumors)의 치료에서 장기간 치료 지속성을 나타낸다. 10, 20 및 30 mg(및 미국이나 일본과 같은 특정 국가에서 선단비대증 환자를 위해 최대 40 mg)의 승인된 투여량으로, Sandostatin LAR®이 한달에 한번 엉덩이 주사(intragluteal injection)로 허용된다. Sandostatin LAR®의 주사후 옥트레오티드의 약물동력학적 프로파일은 폴리머 매트릭스로부터 방출 프로파일과 이것의 생분해성을 반영한다. 사람에게 단일 i.m. 주입 후에, 옥트레오티드 농도는 투여후 1시간 내에 일시적인 초기 피크에 도달하고, 이어서 점차적으로 24시가 내에 검출할 수 없는 낮은 레벨로 감소한다. 1일에 초기 방출 후, 옥트레오티드는 이어지는 7일 동안 대부분의 환자에서 하위-치료적 레벨(sub-therapetuic levels)로 남는다. 이후에, 옥트레오티드 농도는 다시 증가하고, 14일쯤(약 2-3주 후반-주사)에는 이어지는 3 내지 4주 동안 유지되는 안정적인 레벨(plateau levels)에 도달하고, 이어서 6주의 쇠퇴기가 이어진다(Sandostatin LAR® 10 mg, 20 mg 또는 30 mg 분말 및 근육내 주사를 위한 현탁 용매에 대한 상품 특성의 요약, 2013). 상기와 일치하여 및 유용한 문헌 데이터에 따르며, Sandostatin LAR에 대한 래트(rats)들에서 기대된 방출 프로파일은 동일한 패턴을 따른다(AAPS PharmSciTech, Vol. 12, No 4 (2011)).

PLGA 마이크로스피어에서 펩티드의 마이크로캡슐화에 대한 다수의 기술들이 있다. 실험실 규모 및 상업적 생산 규모 모두에서 가장 광범위하게 사용된 기술은 상 분리/코아세르베이션 기술, 스프레이 건조 및 단일 또는 이중 에멀젼/용매 증발 기술(PDA J Pharm Sci and Tech 2008, 62 125-154; Microencapsulation Methods and Industrial Applications Second Edition)을 포함한다.

1. 상-분리 또는 코아세르베이션 기술에서, 펩티드/프로테인의 수성 용액은 에멀젼화되거나, 선택적으로 펩티드/프로테인은 디클로로메탄 및 PLGA를 함유하는 용액중에 고형 형태로 분산된다. 실리콘 오일은 규정된 비율로 이 분산액에 첨가되고, 그의 용매중에 폴리머의 용해성이 감소한다. 폴리머-풍부한 액체 상(코아세르베이트)은 분산된 펩티드/프로테인 분자를 캡슐화하고, 초기 마이크로스피어는 경화되고, 헵탄을 이용하여 세정된다. 상기 프로세스는 폴리머 특성에 매우 민감하고, 잔류 용매는 또한 중요한 이슈이다.

2. 스프레이-건조 기술에서, 폴리머는 휘발성 유기 용매, 예를 들면 디클로로메탄 또는 아세톤중에서 용해된다. 프로테인은 고형물로서 현탁되거나, 수성 용액으로 유기 용액중에서 균질화(homogenisation)를 통해 에멀젼화된다. 후에, 얻어지는 분산액은 (가열된) 노즐을 통해 가열된 에어 플로(air flow)로 미진화된다. 유기 용매는 증발하고, 이것에 의해 전형적으로 1 내지 100 m의 디멘젼으로 마이크로스피어를 형성한다. 마이크로스피어는 사이클론 분리기에서 수집된다. 유기 용매의 완벽한 제거를 위해, 진공-건조 또는 동결 건조 단계가 아래로 뒤따른다. 얻어지는 폴리머성 마이크로스피어의 초기 구조는 저장소 또는 매트릭스 타입의 제품의 형성에 이르는 스프레이 건조 전의 폴리머 중에서의 펩티드/프로테인의 용해성에 의존한다. 초기 분산액 용액인 경우, 스프레이 건조 후에 얻어진 최종 제품은 매트릭스 또는 모노리식(monolithic) 유형, 즉 활성 성분의 용해된 또는 분산된 상태를 갖는 폴리머 입자(마이크로스피어로 규정)이다. 반면에, 초기 분산액이 현탁액인 경우, 얻어진 제품은 저장소 유형, 즉 용해된 활성 성분의 액체 코어를 캡슐화한 구별된 폴리머성 엔벨로프/쉘(마이크로스피어로 규정)이다.

3. 수중유(o/w) 및 유수중수(water-in-oil-water, w/o/w)는 2개의 대표적인 수화기술이며, 이것은 마이크로스피어 제조 동안 각각 단일 및 이중 에멀젼을 형성한다. 이들 프로세스에서, 펩티드/프로테인은 유기 용매(예를 들면, 알콜) 중에 용해되거나, 수성 용액중에 용해되고, 이어서 폴리머의 유기 용액(물과 비혼화성)과 혼합되거나 에멀젼화되어 용액 또는 유중수(w/o) 에멀젼을 각각 형성한다. 디클로로메탄은 PLGA를 위한 유기 용매로서 제공하고, o/w 일차 에멀젼은 고전단 균질화 또는 초음파를 사용하여 형성된다. 이 일차 에멀젼은 이어서 빠르게 안정화제, 일반적으로 폴리비닐 알콜(PVA)를 함유하는 과량의 수성 배지로 이동된다. 다시 균질화 또는 집중적인 교반이 w/o/w의 이중 에멀젼을 형성하기 위해 초기에 요구된다. 열, 진공 또는 둘 모두에 의한 유기 용매의 후속적인 제거(증발에 의한)는 폴리머의 상분리를 초래하고 마이크로스피어를 만들기 위해 속을 파낸다. 용매 증발 대신, 안정화제 있이 또는 없이 다량의 물로의 용매 추출이 펩티드/프로테인을 함유하는 마이크로스피어를 얻기 위해 착수될 수 있다. 비록 w/o/w 마이크로캡슐화 기술은 개념적으로 수행하기 단순할 것처럼 보이지만, 입자 형성 프로세스는 매우 복잡하고, 주된 프로세스 파라미터는 펩티드/프로테인-적재된 PLGA 마이크로스피어의 특성에 영향을 받거나 미친다.

지금까지, 에멀젼/용매 증발 기술에서 증발 단계 동안 적용된 바와 같은 온도 프로파일은 폴리머 매트릭스로부터 펩티드의 방출 특성에 영향을 미치는 중요한 프로세스 파라미터로 확인되고 있지 않았다. 반면에 유기 용매의 비등점을 약간 웃도는 일정한 온도 하에서 프로세싱이 일반적으로 적용된다(또는 감소된 압력/진공이 용매의 증발을 촉진하기 위해 적용되는 경우 용매의 증기압을 약간 웃돈다).

이들 유형의 제형을 위한 전형적인 방출 메카니즘은 초기 방출 상(the initial release phase, 상 1), 수화 상(the hydration phase, 상 2), 및 폴리머 매트릭스의 부식에 의해 제어되지만 촉진되는 확산인 일차 방출 상(primary release phase, 상 3)으로서 일반적으로 나타내어질 수 있는 세개의 상을 포함한다. 약물 방출은 폴리머 분자량이 임계 값 이하로 떨어지는 경우 래그 타임(lag time) 후에 시작하고, 따라서 질량 손실이 일어날 수 있다(Faisant N, Siepmann J, Benoit JP. PLGA-based microspheres: elucidation of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. Eur J Pharm Sci. 2002 May; 15(4):355-66; Korber M. PLGA erosion: solubility-or diffusion-controlled? Pharm Res. 2010 Nov; 27(11):2414-20). 마이크로스피어의 폴리머 매트릭스로부터 펩티드 약물 물질의 방출 프로파일을 제어하기 위한 개선된 제조 방법에 대한 이 분야에 요구가 있다.

본 발명은 펩티드 약물, 특히 옥트레오티드를 포함하는 지속된 방출 PLGA 마이크로스피어의 제조를 위한 단일 또는 이중 에멀젼 용매 증발 기술에 관한 것이고, 여기서 폴리머 매트릭스로부터 펩티드의 방출은 용매 증발 단계 동안 적용된 온도 프로파일에 의해 제어된다. 다른 펩티드로는 엑센티드(exenatide), 레프롤레인(leuporelin), 고세렐린(goserelin), 리래그루티드(liraglutide) 및 테더글루티드(teduglutide)를 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 용매 증발 단계가 마이크로스피어의 고형화를 초래하는 증발 단계 동안 온도를 올리는 제어된 온도 하에서 수행된다. 얻어지는 마이크로스피어는 체가름에 의해 수집되고, 세정되고, 흐름 없는 분말을 제공하기 위해 필터 건조기에서 진공하 최종적으로 건조된다.

본 발명자들은 펩티드의 폴리(D,L 락타이드-코-글리콜리드) 폴리머 마이크로스피어의 제조방법을 본 발명의 특징으로서 제시하고, 여기서 펩티드는 제약학적으로 허용가능한 염 형태일 수 있으며, 상기 방법은

a) 수상을 형성시키기 위해, 수혼화성이고, 선택적으로 물을 함유할 수 있는 적어도 하나의 유기 용매중에 상기 펩티드 또는 그의 염을 용해시키는 단계;

b) 폴리(D,L 락타이드-코-글리콜리드) 폴리머의 유기 용액을 포함하는 적합한 오일 중에서 수중유 또는 유수중수 에멀젼(water-in-oil-water emulsion)을 형성시키는 단계, - 여기서, 상기 용액은 수상과 불혼화성임.-;

c) 증발단계 동안 온도를 제어하는 것으로 마이크로스피어를 형성하기 위해 에멀젼으로부터 a) 단계에서 사용된 적어도 하나의 유기 용매를 증발시키고, 증발 단계 동안 온도를 증가시키는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 시험관내 및 생체내 데이터에 의해 증명된 바와 같이, 마이크로스피어의 방출 특성은 용매 증발 단계 동안 증가하는 온도 정도에 의해 제어된다. 보다 상세하게, 15 내지 25℃, 바람직하게는 약 20℃의 개시 온도로부터 온도를 증가시키는 것에 의해 용매 증발 동안 온도가 증가된다. 바람직하게 성취된 최대 온도는 38℃ 또는 38°까지이다. 온도는 20분 내지 3시간의 기간에 걸쳐 상승된다. 건조는 온도 증가의 기간 후에 연장된 기간 동안 계속될 수 있다. 바람직하게, 온도 증가율은 0.1℃/분 내지 1℃/분이다. 온도 상승은 기간 또는 단계 동안 일정해질 수 있다. 단계 동안은 각각의 변화가 온도에서 단계 변화라는 것이고, 온도가 다음 변화 전에 일정 기간 동안 고정된다는 것을 의미한다. 증발 단계 동안 단계 및 일정한 온도 변화가 혼합될 수도 있다.

"방출 특성(release charcteristics)"이라는 용어는 단일 근육내 주사후 랫트에서 제형의 생체내 PK 프로파일과 관련된 방법에서 제형의 용해 프로파일을 의미한다. 하나의 양태에서, 시험관내 생체내 유형 A 상관관계(correlation)는 하나의 구분(compartment) 모델을 적용하여 랫트에서의 플라즈마 농도 커브의 단계적 추이로부터 계산되어지는 바와 같이 시험관내 용해 프로파일과 생체내 방출 프로파일 사이에서 구축되어진다.

보다 상세하게, "용해 프로파일(dissolution profile)"은 37℃에서 아세테이트 완충액 1mM pH 4.0에서 시간의 함수로서 마이크로스피어로부터 방출된 옥트레오티드의 정량 또는 양을 말한다.

방출 특성은 개시 버스트(burst)(상 1), 래그-타임(상 2) 및 일차 방출 상(상 3)의 기간 및 기울기에 의해 표현되어진다. 보다 상세하게, 용해 프로파일은 다음의 식에 의해 맞추어지고, 여기서 상수 y_o는 개시 버스트를 반영하고, 상수 x_o는 래그 타임을 반영하고, 상수 a 및 b는 일차 방출 상을 나타낸다.

본 발명은 제약적 활성 펩티드를 포함하는 PLGA 마이크로스피어의 제조를 위한 에멀젼(단일 또는 이중)/용매 증발 방법에 관한 것이고, 여기서 용매 증발 단계 동안 온도 증가율은 동봉된 펩티드의 방출 특성을 제어하기 위해 사용되어진다. 보다 상세하게, 용매 증발 단계 동안 온도 증가율은 마이크로스피어의 용해 프로파일의 계산된 x_o 상수에 의해 표현된 펩티드 방출 프로파일의 래그 타임을 조절하기 위해 사용된다. 얻어지는 마이크로스피어의 방출 프로파일의 래그 타임은 37℃에서 아세테이트 완충액 1mM pH 4.0에서 테스트되어진다.

보다 상세하게, 단일 에멀젼/용매 증발 기술은 다음의 단계를 포함한다(도 1):

ⅰ. 옥트레오티드는 알맞은 양의 적합한 용매, 바람직하게 메탄올 중에서 용해된다.

ⅱ. 폴리머(D,L 락타이드-코-글리콜리드) 폴리머는 디클로로메탄중에서 용해되고, 용액은 10℃ 또는 그 이하, 바람직하게는 5℃ 또는 그 이하로 냉각되어진다.

ⅲ. 2개의 용액이 분산된 상기 오일 상을 형성하기 위해 격렬한 교반하에서 함께 혼합되어진다.

ⅳ. 수성의 상기 연속상은 디소듐 히드로겐 포스페이트 및 포타슘 디히드로겐 포스페이트를 PVA 용액 중에서 용해시키는 것으로 만들어지고, 10℃ 또는 그 이하, 바람직하게는 5℃ 또는 그 이하로 냉각되어진다.

ⅴ. 분산된 및 연속 상은 함께 혼합되어지고, 바람직하게 인-라인 고전단 분산기를 사용하여 혼합되어지고, 요구된 입자크기 분포의 반-고형 마이크로스피어를 형성한다. 연속상의 흐름 비율이 시린지 펌프에 의해 성취되는 반면 연속상의 흐름은 정량(peristaltic) 펌프에 의해 성취된다.

vi. 형성된 마이크로스피어는 출구로부터 15 내지 25℃ 사이에서, 바람직하게는 약 20℃에서 교반하 제어된 적합한 용기로 이전된다.

vii. 마이크로스피어의 경화는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 점차적으로 증가되는 것으로 성취된다.

viii. 전체적인 건조의 수시간, 약 4시간 후, 건조된 마이크로스피어가 필터 건조기로 이전된다.

ix. 입자는 물로 필터 건조기에서, 바람직하게 실온에서 세척되고, 배수 후 마이크로스피어는 적어도 12시간, 바람직하게는 24시간 동안, 바람직하게 10mbar 진공하에서 그리고 부드러운 교반하에서 건조하기 위해 남겨진다.

따라서, 이중 에멀젼/용매 증발 기술은 다음의 단게를 포함한다(도 2):

i. 옥트레오티드는 적절한 양의 물에서 용해된다.

ii. 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜리드)폴리머는 디클로로메탄중에서 용해되고, 상기 용액은 10℃ 또는 그 이하로, 바람직하게는 5℃ 또는 그 이하로 냉각된다.

iii. 2 개의 용액은 바람직하게 20.000 rpm에서 1분 동안 분산된 오일 상을 형성하는 꼭대기에 분산기가 설치된 디지털 T25 ULTRA-TURRAX를 사용하여 에멀젼화되고, 10℃ 또는 그 이하로, 바람직하게는 5℃ 또는 그 이하로 냉각된다.

iv. 수성 연속상은 PVA 용액중에서 디소듐 히드로겐 포스페이트 및 포타슘 디히드로겐 포스페이트를 용해시키는 것에 의해 만들어지고, 10℃ 또는 그 이하로, 바람직하게는 5℃ 또는 그 이하로 냉각된다.

v. 분산된 및 연속 상은 함께 혼합되어지고, 바람직하게 인-라인 고전단 분산기를 사용하여 혼합되어지고, 요구된 입자크기 분포의 반-고형 마이크로스피어를 형성한다. 연속상의 흐름 비율이 시린지 펌프에 의해 성취되는 반면 연속상의 흐름은 정량(peristaltic) 펌프에 의해 성취된다.

도 1a는 이중 에멀젼화 프로세스의 개략도이다.
도 1b는 단일 에멀젼화 프로세스의 개략도이다.
도 2a는 제형 1a-1c에 대한 입자 크기 분포 그래프이다.
도 2b는 제형 2a-2c에 대한 입자 크기 분포 그래프이다.
도 3a는 제형 1a-1c의 SEM 및 횡단면 SEM 이미지이다.
도 3b는 제형 2a-2c의 SEM 및 횡단면 SEM 이미지이다.
도 4a는 Sandostatin LAR 및 제형 1a-1c의 비교 용해 프로파일이다.
도 4b는 Sandostatin LAR 및 제형 2a-2c의 비교 용해 프로파일이다.
도 5는 Sandostatin LAR 및 제형 1a 및 2c의 랫트에서 플라즈마 농도 프로파일이다.
도 6a는 Sandostatin LAR의 생체내 관찰된 및 역산된 플라즈마 농도의 비교이다.
도 6b는 제형 1a의 생체내 관찰된 및 역산된 플라즈마 농도의 비교이다.
도 6c는 제형 2c의 관찰된 및 예측된 플라즈마 농도의 비교이다.

본 발명은 제조 공정의 용매 증발 단계 동안 온도를 제어 및 증가시키는 것으로 제어된 방출 특성을 갖는 옥트레오티드 아세테이트의 지속 방출 제형을 제공한다.

옥트레오티드(바람직하게 아세테이트 염 형태(또는 임의의 기타 제약학적으로 허용가능한 염)의 (4R,7S,10S,13R,16S,19R)-19-[(2R)-2-아미노-3-페닐프로판아미도]-10-(4-아미노부틸)-16-벤질-N-[(2R, 3R)-1,3-디히드록시부탄-2-일]-7-(1-히드록시에틸)-13-(1H-인돌-3-일메틸)-6,9,12,15,18-펜타옥소-1,2-디티아-5,8,11,14, 17-펜타아자시클로이코산-4-카르복사미드로 알려짐, 또는 4D-페닐알라닐-L-시스테이닐-L-페닐알라닐-D-트립토필-L-리실-L-트레오닐-N-((1R,2R)-2히드록시-1-(히드록시메틸)프로필)-L-시스테인아미드 시클릭(2-7)-디설파이드 아세테이트(염) 또는 L-시스테인아미드-D-페닐알라닐-L-시스테닐-L-페닐알라닐-D-트립토필-L-리실-L-트레오닐-N-(2-히드록시-1-(히드록시메틸)프로필)-시클릭(2-7)-디설파이드(R-(R*,R*), 아세테이트(염)으로 알려짐)는 자연적으로 발생하는 호르몬 소마토스사틴의 동족체인 합성 옥타펩티드 (DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol)이고, 신경내분비 장애, 예를 들면 선단 비대증(acromegaly) 및 개스트로엔더로팬크레아틱(gastroenteropancreatic) 신경내분비 종양에서 종양 조절에 사용하기 위해 승인된다. 옥트레오티드 아세테이트의 화학 구조는 다음과 같다:

본 발명에 따른 PLGA 마이크로스피어의 제조에 사용하기 위한 적합한 상업적으로 구매가능한 폴리머는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 에보닉 인더스트리 아게(Evonic Industries AG)에서 판매되는 RESOMER® 및 LAKESHORE BIOMATERIALS, PCAS에서 판매되는 Expansorb®, PURAC Biochem BV에 의해 판매되는 PURASORB®를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 PLGA 폴리머는 락트산 대 글리콜산의 비율이 약 50:50 내지 약 65: 35이고, 중량평균분자량(Mw)가 10,000 내지 70,000의 범위를 갖는다. 바람직하게, 본 발명은 모노머 비율이 50:50이고, 30,000 내지 50,000의 범위의 중량평균분자량을 갖는 PLGA를 사용한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 PLGA를 위한 유기 용매는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 에틸아세테이트, 테트라히드로퓨란, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 헥사플루오로이소프로판, 클로로포름 및 아세톤을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 발명에서는 디클로로메탄이 사용된다. 유기 용매중의 폴리머 농도는 10 내지 40중량%이며, 가장 바람직하게는 20 내지 30중량%이다.

본 발명에서, 옥트레오티드 아세테이트는 주사용 물에 용해되어 10 내지 40중량%의 농도, 및 가장 바람직하게는 25 내지 35중량%의 농도를 갖는다. 대안적으로, 옥트레오티드 아세테이트는 물에 혼화성인 적합한 유기 용매중에 용해되며, 바람직하게는 메탄올이고, 5 내지 20중량%의 농도, 및 가장 바람직하게는 10중량%의 농도를 갖는다. 선택적으로 물과 함께 물에 혼화성인 유기 용매가 사용된다.

분산된 상을 제조하기 위해, 옥트레오티드 아세테이트 용액이 15,000 내지 30,000 s^-1의 전단률에서 작동하는 배치 모드 고전단 분산기를 사용하여 폴리머 용액중에 분산된다. 보다 상세하게, 20,000 내지 25,000 s^-1의 전단률이 적용된다. 대안적으로, 메탄올중 옥트레오티드 아세테이트 용액은 교반하에서 폴리머 용액중에 첨가된다. 분산된 상은 20℃보다 낮은 온도에서, 가장 바람직하게는 5 내지 10℃에서 제어된다.

본 발명에서, 연속상은 계면활성제, 바람직하게 폴리비닐 알콜(PVA)를 갖는 수성 용액으로 구성된다. 선택적으로 사용될 수 있는 기타 계면활성제의 실예로는 하나 이상의 음이온성 계면활성제(예를 들면, 소듐 올레이트, 소듐 스테아레이트 또는 소듐 라우릴 설페이트), 비이온성 계면활성제(예를 들면, 폴록사머, 트윈스), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸 셀룰로오스 소듐 및 젤라틴이 포함되며, 이들은 독립적으로 또는 조합해 사용될 수 있다. PVA는 바람직하게 20℃에서 4% 수성 용액으로 측정되는 경우 3-9 cP의 점도 범위에 해당하는 약 10,000 내지 약 150,000 Da의 중량평균분자량을 가지며, 85 내지 89%의 가수분해 정도 및 130 내지 150의 에스테르 수를 갖는다. 본 발명에서 사용되는 선택된 PVA 등급은 머크(Merck) KGaA에서 판매되는 Emprove PVA 4-88 (Mw 25,000-30,000; 점도 수중에서 4%: 3.4-4.6 cPs), PVA 8-88 (Mw 약 65,000; 점도 수중에서 4%; 6.8-9.2 cPs) 및 PVA 18-88 (Mw 약 130,000; 점도 수중에서 4%)를 포함한다. 수성 상에 첨가된 계면활성제의 양은 수성 용액의 질량에 대해 최대 5.0%(w/w)이 바람직하다. 보다 바람직한 계면활성제의 양(최적으로 PVA 양)은 약 0.5 내지 약 2.5% w/w이다. 연속상은 20℃보다 낮은 온도에서, 보다 바람직하게는 5 내지 10℃에서 온도조절된다.

본 발명에서 연속 오일상중에 수상의 에멀젼화는 다음의 수단중 하나로 수행된다: i) 기계적 교반, ii) 배치 분산기, iii) 인라인 분산기. 바람직하게, 에멀젼화 공정은 5,000 내지 20,000 s^-1의 전단률에서 작동하는 Kinematica에 의해 판매되는 인라인 분산기 MT-3000에 의해 일어나고, 가장 바람직하게는 10,000 내지 15,000 s^-1의 범위이며, 이에 따라서, 10 내지 250 ㎛, 가장 바람직하게는 20 내지 100 ㎛의 마이크로스피어를 형성한다. 분산된 및 연속상 사이의 중량비는 1:20 내지 1:150이고, 보다 바람직하게는 1:75 내지 1:100이다.

형성된 마이크로스피어 현탁액은 (인라인 분산기의 출구로부터) 적합한 용기(바람직하게는 온도 제어를 돕기 위해 절연된)로 이동되고, 상기 용기는 15℃ 이상의 온도, 바람직하게는 약 20℃의 온도에서 초기에 조절된다. 용매 증발 동안 온도는 15 내지 25℃의 개시 온도, 바람직하게 약 20℃의 개시온도로부터 증가된다. 바람직하게 성취된 최대 온도는 최대 35℃ 또는 38℃이다. 상기 온도는 20분 내지 30분 동안의 기간에 걸쳐 올라간다. 건조는 온도 상승 기간 후에 연장된 기간 동안 연속할 수 있다. 바람직하게, 온도 증가율은 0.1℃/분 내지 1℃/분이다. 온도 상승은 기간에 걸쳐 또는 단계별로 일정해질 수 있다. 단계별이라는 것은 각각의 변화가 온도에서 단계 변화를 의미하고, 즉 다음 단계 전에 기간 동안 온도가 고정되는 것이다. 증발 단계동안 단계화된 및 일정한 온도 변화의 혼합일 수 있다.

마이크로스피어로부터 용매의 증발은 교반하 및 부분적 진공에서 적용된 온도 프로파일에 따라 일어나며, 바람직하게는 부분적 진공은 디클로로메탄의 증기압 약간 아래이다.

용매의 증발 후에, 경화된 입자들은 낮은 교반하에서 필터 건조기에서 현탁액으로부터 수집된다. 바람직하게, PSL(파우더 시스템 리미티드)로부티 필터 건조기가 사용된다. 수집된 입자들은 물로 세척되고, 이어서 약 10mbar의 진공을 적용하는 것으로 필터 건조기에서 건조된다.

최종 마이크로스피어는 아래에서 설명되는 바와 같이 입자 크기, 약물 적재, 폴리머 분자량, 잔류 용매 및 시험관내 방출에 대해서 분석되어진다. 결과는 표 1 및 2에 및 도 3 내지 4에 요약된다. 참조 제품 Sandostatin LAR과 함께 선택된 제형(즉, 1a 및 2c)는 시험관내 생체내 상관관계 모델을 구축하기 위해 랫트에서 테스트되어진다. PK 연구 및 개발을 위한 적용된 방법론 및 외관의 상세 사항이 이하에 제공된다. 생체내 결과는 도 5 내지 6에서 제공된다.

입자 크기 분포 (PSD) 분석

입자 크기 분포는 Malvern Master Sizer 2000 Hydro 2000S를 사용하여 레이저 회절에 의해 측정되었다. 평균 입자크기는 마이크론으로 부피 평균 직경(volume mean diameter)으로 표현된다.

약물 적재 결정

마이크로스피어 약 50㎎을 10㎖ 메틸렌 클로라이드중에 완전히 용해시켰다(30분 초음파). 0.1M 아세테이트 버퍼(pH 4.0) 20㎖를 수성상으로 옥트레오티드의 추출을 위해 용액에 첨가하였다. 2개의 상들을 5분동안 볼텍싱하여 철저하게 혼합하고, 5분 동안 4000 rpm에서 원심분리하여 분리시켰다. 수성상을 옥트레오티드의 함량을 결정하기 위해 HPLC 분석을 위해 샘플화하였다. 상기 샘플을 분석전에 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다. HPLC 조건은 다음과 같았다: 경사 분리는 Intertsil ODS3 컬럼(4.6 x 250 mm, 입자 크기 5㎛)으로 수행하였다; 이동 상은 증류수 중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(용리액 A) 및 아세토니트릴중에 0.1% TFA(용리액 B)로 구성되고, 18분 동안 20% 내지 35% 용리액 B로부터 선형 경사로 가동시켰다. 유속은 1.0㎖/분이고, 주입 부피는 10㎕이고, 검출 파장은 210nm였다.

평균 분자량 측정

마이크로스피어의 분자량은 직렬로 연결된 2 컬럼 PLgel 5㎛ Mixed-D 300 X 7.5mm과 굴절 인덱스(RI) 검출기가 장착된 Agilent Model GPC 50 Plus 시스템을 사용하여 겔투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 결정하였다. 이동상은 1㎖/분의 유속을 갖는 THF이고, 컬럼 온도는 30℃이다. 샘플의 분석을 위해, 10 내지 15mg의 마이크로스피어를 5㎖ THF 중에 용해시키고, 상기 용액을 교반하에서 밤새 방치시켰다. 2㎖를 회수하고, 40㎛ PTFE 필터를 통해 여과시키고 분석하였다. 주입 부피는 10㎕이다. 데이터 수집 및 분석은 Cirrus 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 162 및 371100 사이의 MW 범위를 갖는 폴리스티렌 표준이 교정(calibration)을 위해 사용된다.

시험관내 방출 방법

약 150㎎의 제형화된 마이크로스피어를 100㎖ 병에 두고, 쉐이킹 조(85rpm)에서 37℃의 30㎖ 아세테이트 버퍼(1mM, pH 4.0)에서 배양했다. 방출 배지를 다양한 시간 지점에서 샘플화하고, 0.45㎛ 시린지 필터를 통해 여과시키고, HPLC를 통해 분석하였다. HPLC 조건은 다음과 같았다: 경사 분리는 Intertsil ODS3 컬럼(4.6 x 250 mm, 입자 크기 5㎛)으로 수행하였다; 이동 상은 증류수 중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(용리액 A) 및 아세토니트릴중에 0.1% TFA(용리액 B)로 구성되고, 25분 동안 25% 내지 35% 용리액 B로부터 선형 경사로 가동시켰다. 유속은 1.0㎖/분이고, 주입 부피는 10㎕이고, 검출 파장은 210nm였다.

잔류 용매(디클로로메탄)

이것은 에탄올 및/또는 메틸렌 클로라이드가 옥트레오티드 마이크로입자들로부터 제거되었는지를 조사한 것이다. 마이크로입자들을 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중에 전체적으로 용해시켰다. 따라서, 유기 용액중에 에탄올 및 메틸렌 클로라이드의 농도는 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 정량된다. 90mg의 신선한 마이크로입자들의 양은 헤드스페이스 GC 분석 전에 GC 바이얼중에 디메틸 설폭사이드 5㎖중에 용해시켰다. 잔류 용매 증발은 GC 오븐중 100℃에서 30분 샘플 인큐베이션에 의해 성취된다. GC 분석은 GC-2010 플러스(Shimadzu, Japan)으로 수행하였다. 정지상으로서 크로스본드 5% 디페닐/95% 디메틸 폴리실록산을 사용한 RTX-5(RESTEK, USA) 분석 컬럼이 사용되었다. 용매의 양은 교정 곡선 표준을 사용하여 측정하였다. 디클로로메탄의 보유 시간은 5.75분이였다.

동물 연구

결정성 만니톨(즉, 전체 중량에 대해 17% 만니톨)과 혼합 후 마이크로스피어 제형을 수컷 Sprague-Dawley 랫트에서 약물동력학 연구에 사용될 수 있도록 6와트 UV 광선원을 사용하여 180분동안 365nm에서 UV 조사에 위해 살균시켰다. 약 240 내지 250g으로 칭량되고 8 내지 12주령의 랫트(그룹당 6마리)에 테스트 제형으로 주사하였다. 주사 전에,건조 분말 샘플을 주사용 물, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 0.5중량% 및 만니톨 0.6중량%로 이루어진 살균 용매(비히클)중에 현탁시켰다. 동물들에게 0.25 ㎖/랫트의 부피의 비히클중에 3mg 옥트레오티드 활성 기질/랫트에 해당하는 약 60mg 옥트레오티드 제형(마이크로스피어)의 고정량을 단일 사이트로 1회 단일 근육내 주사로 투여하였다. 현탁액을 대퇴골(femur)의 두개골 측면에 위치된 랫트의 사두근으로 근육내로 26G의 피하(hypoderminc) 니들을 통해 투여하였다. 랫트 혈액 샘플을 약물 투여 전에 수집하였고, 이후에 0.5h, 1h, 2h, 6h, 24h, 3일, 7일, 14일, 18일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 56일 및 70일 투여 후를 포함하는 소정시간에 수집하였다. 각각의 시간 지점에서, 대략적으로 0.5㎖의 혈액을 가벼운 이소퓨란 마취하에서 레트로-오비탈 플렉서스로부터 뽑아내고, 항응고제로서 200mM K2EDTA를 함유한 라벨화된 튜브로 이동시켜 4 내지 5회 손으로 거꾸로하여 혼합하였다. 혈액 샘플을 모든 시간 동안 젖은 얼음에서 보관하고, 플라즈마를 샘플 수집 1시간 내에 원심분리에 의해 분리시켰다. 플라즈마 샘플을 입증된 LC-MS/MS 방법을 사용하는 바이오분석때까지 -60℃ 이하에서 보관하였다.

시험관내 생체내 상관관계

IVIVC 모델의 전개를 위한, 이하의 절차는 다음과 같다: (1) Sandostain LAR, 제형 1a 및 제형 2c를 포함하는 다른 방출 속도를 갖는 제형의 선택, (2) 다양한 용해 방법에 의해 시험관내 용해 프로파일의 측정, (3) 랫트에서의 단일 근육내 투여후, 제형(즉, Sandostatin LA, 제형 1a 및 제형 2c)의 생체내 플라즈마 농도 프로파일에서 PK의 측정, (4) Wagner-Nelson(일-구획 모델) 디컨볼루션(deconvoultion) 기술을 사용하여 측정된 플라즈마 농도 프로파일에 의한 생체내 방출 프로파일의 조사, (5) Sandostatin LAR 및 제형 1a 의 통합(pooled) 데이터를 사용하여 디컨볼루션된 생체내 방출 프로파일과 시험관내 용해 프로파일 사이의 상관관계의 계산, (6) 생체내 데이터에 대한 보다 높은 상관관계 및 선형 레그레션(regression) 분석을 적용하는 것에 의한 IVIVC의 구축을 갖는 적절한 용해 방법의 선택, (6) 제형 Sandostatine LAR 및 제형 1a에 대한 Wagner-Nelson 컨볼루션 모델을 사용하는 검산된 플라즈마 농도 프로파일을 비교하는 것에 의해 구축된 모델의 내부 유효성, 및 (7) 제형 2c의 시험관내 용해 프로파일에 의해 계산된 예측된 플라즈마 농도, 구축된 모델과 제형 2c의 생체내 관찰된 플라즈마 농도 프로파일를 비교하는 것으로 구축된 모델의 내부 유효성.

실시예 1a - c (단일 에멀젼)

몰비 50:50(Mw = 41,000 및 다분산성 ca 1.65)를 갖는 PURASORB 5004A의 이름으로 PURAC로부터 시판되는 4g의 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜리드)를 30g의 디클로로메탄중에 자석 교반으로 용해시켰다. 상기 폴리머 용액을 5℃로 냉각시켰다. 0.2941g의 옥트레오티드 아세테이트를 주사용 물 0.5882g 중에 혼합시키는 것에 의해 용해시켰다. 옥트레오티드 아세테이트 용액을 폴리머 용액에 첨가하고, 1분동안 20,000 rpm에서 Ultra Turrax®로 에멀젼화시켜 제 1 에멀젼(DP-분산된 상)을 형성하였다. 머크(Merck)사의 11.5g의 폴리(비닐알콜) EMROVE® 18-88을 2307g의 주사용 물에 80℃에서 용해시키고, 이어서 17.46g의 디소듐 히드로겐 포스페이트 및 4.18g의 포타슘 디히드로겐 포스페이트를 첨가하였다. 상기 용액을 5℃로 냉각시켜 연속상 (CP)를 형성하였다. 요구된 입자 크기 분포의 마이크로스피어를 CP를 2.3L/분 및 DP를 15.6ml/분으로 인라인 Kinematica MT 3000 분산기로 운반하는 것으로 제조하였다. 마이크로스피어 현탁액을 용매를 제거하기 위해 20℃에서 제어되고 격렬한 교반이 있는 이중 자켓 유리 반응 용기에 수용하였다. 용기중 온도를 다음의 표 1에 제시된 바와 같은 예정된 시간 간격에 따라 38℃로 올렸다. 4시간 후, 마이크로스피어를 유리 필터 건조기로 이동시키고, 과량의 물로 실온에서 세척하고, 10 mbar 진공하에서 남겨두고, 24시간 동안 부드러운 교반하에서 건조시켰다.

제형	시간 20- 38℃ (분)	약물 적재 (%)	Mw (g/mol)	입자크기분포	잔류 DCM (%)	전체 불순물 (%)	용해
Sandostatin LAR®		5.0	64,200	d(0.1) 36.7 d(0.5) 50.7 d(0.9) 69.8	0.30	3	x₀(래그타임) 25.4 y₀(초기방출) 4.3 a(최종방출) 90.0 b(기울기) 6.28
1a	20	4.83	39,600	d(0.1) 27.56 d(0.5) 44.097 d(0.9) 71.158	0.31	2.23	x₀(래그타임) 22.1 y₀(초기방출) 0.4 a(최종방출) 77.4 b(기울기) 2.6
1b	60	5.15	40,200	d(0.1) 29.907 d(0.5) 51.017 d(0.9) 84.049	0.26	1.29	x₀(래그타임) 25.8 y₀(초기방출) 0 a(최종방출) 82.0 b(기울기) 2.3
1c	180	4.85	40,850	d(0.1) 31.148 d(0.5) 48.22 d(0.9) 74.301	0.18	1.95	x₀(래그타임) 31.5 y₀(초기방출) 0.4 a(최종방출) 80.6 b(기울기) 2.2

실시예 2a - 2c (이중 에멀젼 )

몰비 50:50(Mw = 41,000 및 다분산성 ca 1.65)를 갖는 PURASORB 5004A의 이름으로 PURAC로부터 시판되는 4g의 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜리드)를 30g의 디클로로메탄중에 자석 교반으로 용해시켰다. 상기 폴리머 용액을 5℃로 냉각시켰다. 폴리머 용액을 시린지 필터를 통해 여과에 의해 살균시키고 5℃로 냉각시켰다. 0.2941g의 옥트레오티드 아세테이트를 메탄올 2.941g 중에 혼합시키는 것에 의해 용해시켰다. 옥트레오티드 아세테이트 용액을 폴리머 용액에 첨가하고, 오일상(DP-분산된 상)을 형성하기 위해 교반으로 혼합하였다. 머크(Merck)사의 11.5g의 폴리(비닐알콜) EMROVE® 18-88을 2307g의 주사용 물에 80℃에서 용해시키고, 이어서 17.46g의 디소듐 히드로겐 포스페이트 및 4.18g의 포타슘 디히드로겐 포스페이트를 첨가하였다. 상기 용액을 5℃로 냉각시켜 연속상 (CP)를 형성하였다. 요구된 입자 크기 분포의 마이크로스피어를 CP를 2.3L/분 및 DP를 18.7ml/분으로 인라인 Kinematica MT 3000 분산기로 운반하는 것으로 제조하였다. 마이크로스피어 현탁액을 용매를 제거하기 위해 20℃에서 제어되고 격렬한 교반이 있는 이중 자켓 유리 반응 용기에 수용하였다. 용기중 온도를 다음의 표 2에 제시된 바와 같은 예정된 시간 간격에 따른 38℃로 올렸다. 4시간 후, 마이크로스피어를 유리 필터 건조기로 이동시키고, 과량의 물로 실온에서 세척하고, 10 mbar 진공하에서 남겨도고, 24시간 동안 부드러운 교반하에서 건조시켰다.

제형	시간 20- 38℃ (분)	약물 적재 (%)	Mw (g/mol)	입자크기분포	잔류 DCM (%)	전체 불순물 (%)	용해
Sandostatin LAR®		5.0	64,200	d(0.1) 36.7 d(0.5) 50.7 d(0.9) 69.8	0.30	3	x₀(래그타임) 26.5 y₀(초기방출) 7.4 a(최종방출) 84.7 b(기울기) 5.2
2a	20	4.79	41,050	d(0.1) 26.682 d(0.5) 42.577 d(0.9) 68.198	0.23	2.22	x₀(래그타임) 19.4 y₀(초기방출) 0 a(최종방출) 82.3 b(기울기) 4.2
2b	60	4.8	39.780	d(0.1) 28.281 d(0.5) 46.96 d(0.9) 76.958	0.38	1.52	x₀(래그타임) 23.7 y₀(초기방출) 0 a(최종방출) 81.5 b(기울기) 3.9
2c	180	5.03	40,230	d(0.1) 28.644 d(0.5) 46.742 d(0.9) 75.041	0.19	0.85	x₀(래그타임) 31.7 y₀(초기방출) 5.0 a(최종방출) 84.1 b(기울기) 3.9

Claims

펩티드의 폴리(D,L 락타이드-코-글리콜리드) 폴리머 마이크로스피어의 제조방법에 있어서, 상기 펩티드는 제약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있고, 상기 방법은
a) 수상을 형성시키기 위해, 수혼화성이고, 선택적으로 물을 함유할 수 있는 적어도 하나의 유기 용매중에 상기 펩티드 또는 그의 염을 용해시키는 단계;
b) 폴리(D,L 락타이드-코-글리콜리드) 폴리머의 유기 용액을 포함하는 적합한 오일상 중에서 수중유 또는 유수중수(water-in-oil-water) 에멀젼을 형성시키는 단계, - 여기서, 상기 용액은 수상과 불혼화성임.-;
c) 증발단계 동안 온도를 제어하는 것으로 마이크로스피어를 형성하기 위해 에멀젼으로부터 a) 단계에서 사용된 적어도 하나의 유기 용매를 증발시키고, 증발 단계 동안 온도를 증가시키는 단계를 포함하는 펩티드의 폴리(D,L 락타이드-코-글리콜리드) 폴리머 마이크로스피어의 제조방법
제1항에 있어서, 상기 펩티드 활성 물질은 옥트레오티드 아세테이트(octreotide acetate)인 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 유기 용매는 메탄올이고, 물이 첨가되는 것인 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리(D,L 락타이드-코-글리콜라이드) 폴리머는 디클로로메탄중에서 용해되는 것인 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 b) 단계의 용액은 5℃ 또는 그 이하로 냉각되는 것인 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 증발 단계 c)는 15℃ 이상에서 개시되고, 증발 단계 동안 에멀젼의 온도가 35℃보다 더 높이 올라가는 것인 제조방법.
제1항 내지 제6항중 어느 하나의 항에 있어서, 온도는 20분 내지 3시간의 시간 동안 올라가는 것인 제조방법.
제7항에 있어서, 온도 상승 기간 후에 연장된 기간 동안 계속적으로 더 건조하는 단계를 포함하는 제조방법.
제1항 내지 제8항중 어느 하나의 항에 따른 제조방법으로 얻어질 수 있는 마이크로스피어 집단.