ES2837044T3

ES2837044T3 - Preparación de microesferas de PLGA cargadas con péptidos con características de liberación controlada

Info

Publication number: ES2837044T3
Application number: ES14717411T
Authority: ES
Inventors: Evangelos Karavas; Efthymios Koutris; Katerina Minioti; Sotiria Chaitidou; Georgia Papanikolaou; Theofanis Mantourlias
Original assignee: Pharmathen SA
Current assignee: Pharmathen SA
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2034-03-31
Also published as: PT3125871T; BR112016022550B1; KR102218655B1; KR20160137608A; HRP20210058T1; LT3125871T; EA201691884A1; MX2016012846A; CY1124037T1; CA2944561A1; EP3125871A1; ZA201607413B; SI3125871T1; RS61209B1; JP6494657B2; AU2014389015A1; JP2017509661A; US9943483B2; MX371139B; EP3125871B1

Abstract

Un procedimiento para la preparación de microesferas de polímero de poli(D,L-lactida-co-glucólido) de acetato de octreótido, que comprende: a. disolver acetato de octreótido en al menos un disolvente orgánico miscible en agua, y que contiene opcionalmente también agua, para formar una fase acuosa; b. formar una emulsión de aceite en agua o agua en aceite en una fase aceitosa adecuada que comprende una solución orgánica del polímero poli(D,L-lactida-co-glucólido), siendo la solución no miscible con la fase acuosa en donde dicha solución orgánica del polímero poli(D,L-lactida-co-glucólido) se enfría a 5ºC o menos; c. evaporar al menos un disolvente orgánico utilizado en la etapa (a) de la emulsión para formar las microesferas controlando la temperatura durante la etapa de evaporación y aumentar la temperatura durante la etapa de evaporación con un ritmo de 0,1°C/min a 1°C/min; en donde las características de liberación in vivo e in vitro del acetato de octreótido de las microesferas se controlan mediante la selección del ritmo de aumento de la temperatura durante la etapa de evaporación.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de microesferas de PLGA cargadas con péptidos con características de liberación controlada

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de microesferas de poli(D,L-lactida-co-glucólido) "PLGA" biodegradables que comprenden ingredientes farmacéuticos peptídicos activos y a cómo lograr características de liberación controlada. En particular, la presente invención se refiere al método de extracción/evaporación del disolvente en emulsión donde la liberación de péptido de la matriz polimérica se controla mediante el perfil de temperatura durante la etapa de evaporación del disolvente.

Antecedentes de la invención

Los fármacos peptídicos se administran habitualmente por vía general, p. ej. por vía parenteral debido a su mala absorción oral y gran inestabilidad en los líquidos gástricos. Sin embargo, la administración parenteral puede ser dolorosa y causar molestias, especialmente para administraciones diarias repetidas. Para minimizar el número de inyecciones a un paciente, la sustancia farmacéutica se administra mejor como una formulación de liberación lenta. La administración parenteral de fármacos peptídicos como una formulación de liberación lenta en un polímero biodegradable, p. ej. como microesferas o implantes, se ha propuesto que permiten su liberación sostenida después de un tiempo de residencia en el polímero que protege al péptido contra las influencias enzimáticas e hidrolíticas del medio biológico. Un inconveniente común de las formulaciones de liberación lenta inyectable es la fluctuación de las concentraciones plasmáticas, tales como las concentraciones máximas elevadas, que provocan reacciones secundarias farmacológicas no deseadas junto con concentraciones plasmáticas cercanas a cero durante todo el período de liberación. Es difícil conseguir una concentración en sangre terapéuticamente relevante durante un período de tiempo prolongado y en la práctica sólo se obtienen características satisfactorias de liberación de péptidos en muy pocos casos.

Los factores identificados que controlan las características de liberación de péptidos de un medicamento de liberación lenta parenteral en forma de microesferas de PLGA incluyen la forma peptídica (es decir, péptido libre, forma de sal), tipo de polímero (es decir, peso molecular, relación lactida a glucólido, estructura lineal o ramificada, grupos terminales), la carga del fármaco, el tamaño de partícula y la porosidad de las partículas y la distribución del fármaco en la matriz del polímero (documento de EE.UU n° 5.538.739).

Hay pocas formulaciones comerciales de microesferas de fármacos de liberación de acción prolongada disponibles en el mercado. SANDOSTATINA LAR® es una formulación de liberación lenta parenteral disponible en el mercado que comprende el péptido activo acetato de octreótido. Está indicado, entre otras cosas, para el tratamiento de mantenimiento de larga duración en pacientes con acromegalia y el tratamiento de la diarrea grave y el rubor asociados a tumores carcinoides malignos y tumores de péptidos intestinales vasoactivos (tumores vipoma). Aprobado en dosis de 10, 20 y 30 mg (y hasta 40 mg para pacientes con acromegalia en ciertos países como los EE. UU. y Japón), Sandostatina LAR® permite la inyección intraglútea una vez al mes. Las características farmacocinéticas de octreótido después de la inyección de Sandostatina LAR® refleja las características de liberación de la matriz polimérica y su biodegradación. Después de una sola inyección i.m. en seres humanos, la concentración de octreótido alcanza un pico inicial transitorio 1 hora después de la administración, seguido de una disminución progresiva a una baja concentración indetectable en 24 horas. Después de esta liberación inicial el día 1, octreótido permanece en concentraciones subterapéuticas en la mayoría de los pacientes durante los 7 días siguientes. A partir de entonces, la concentración de octreótido aumenta de nuevo y alrededor del día 14 (aproximadamente 2-3 semanas después de la inyección) alcanza concentraciones de meseta que se mantienen durante las siguientes 3 a 4 semanas, luego sigue un período de disminución de 6 semanas (Compendio de las características del producto para Sandostatina LAR ® 10 mg, 20 mg o 30 mg de polvo y disolvente para suspensión para inyección intramuscular, 2013). De acuerdo con lo anterior y según los datos bibliográficos disponibles, las características de liberación esperadas de Sandostatina LAR en ratas sigue el mismo patrón (AAPS PharmSciTech, vol. 12, n° 4 (2011)).

Existen varias técnicas para la microencapsulación de péptidos en microesferas de PLGA. Las técnicas más utilizadas tanto a escala de laboratorio como para producciones comerciales incluyen la técnica de separación/coacervación de fases, el secado por atomización y la técnica de evaporación de emulsión/solvente simple o doble (PDA J. Pharm. Sci. and Tech. 2008, 62 125-154; Microencapsulation Methods and Industrial Applications segunda edición).

1. En la técnica de separación de fases o coacervación, se emulsiona una solución acuosa de péptido/proteína o, alternativamente, el péptido/proteína se dispersa en forma sólida en una solución que contiene diclorometano y PLGA. Se añade aceite de silicona a esta dispersión a una velocidad definida, reduciendo la solubilidad del polímero en su disolvente. La fase líquida rica en polímero (coacervado) encapsula las moléculas de péptido/proteína dispersas y las microesferas embrionarias se someten a endurecimiento y lavado con heptano. El proceso es bastante sensible a las propiedades del polímero y el disolvente residual también es un problema importante.2

2. En la técnica de secado por pulverización, se disuelve un polímero en un disolvente orgánico volátil como diclorometano o acetona. La proteína se pone en suspensión en forma sólida o se emulsiona como solución acuosa en esta solución orgánica mediante homogeneización. Después de eso, la dispersión resultante se atomiza a través de una boquilla (calentada) en una corriente de aire caliente. El disolvente orgánico se evapora, formando así microesferas con dimensiones de 1 a 100 m generalmente. Las microesferas se recogen en un separador ciclónico. Para la eliminación completa del disolvente orgánico,se puede seguir una etapa de secado al vacío o liofilización aguas abajo. La estructura interna de las microesferas poliméricas resultantes depende de la solubilidad del péptido/proteína en el polímero antes de secarse por pulverización, lo que conduce a la formación de productos del tipo de depósito o matriz. Cuando la dispersión inicial es una solución, el producto final obtenido tras el secado por atomización es de tipo matriz o monolítico, es decir, partículas de polímero con naturaleza disuelta o dispersa del principio activo (definidas como microesferas). Por el contrario, cuando la dispersión inicial está en suspensión, el producto obtenido es de tipo depósito, es decir, una envoltura/carcasa polimérica distinta que encapsula un núcleo líquido de principio activo disuelto (definido como microcápsulas).

3. Aceite en agua (o/w) y agua en aceite-agua (w/o/w) son las dos técnicas hidratadas que representan, respectivamente, la formación de emulsión simple y doble durante la preparación de microesferas. En estos procesos, los péptidos/proteínas se disuelven en un disolvente orgánico (p. ej., alcohol) o en una solución acuosa y luego se mezclan o emulsionan con una solución orgánica (no miscible en agua) del polímero para formar una solución o emulsión de agua en aceite (w/o), respectivamente. El diclorometano sirve como disolvente orgánico para el PLGA y la emulsión primaria o/w se forma utilizando homogeneización por gran cizallamiento o ultrasonidos. Esta emulsión primaria se transfiere luego rápidamente a un medio acuoso en exceso que contiene un estabilizador, generalmente alcohol polivinílico (PVA). De nuevo, es necesaria una homogeneización o una agitación intensa para formar inicialmente una emulsión doble de w/o/w. La eliminación posterior (por evaporación) del disolvente orgánico por calor, vacío o ambos da como resultado la separación de fases del polímero y el núcleo para producir microesferas. En lugar de la evaporación del disolvente, también se puede realizar la extracción del disolvente con una gran cantidad de agua con o sin un estabilizador para producir microesferas que contienen péptido/proteína. Aunque la técnica de microencapsulación w/o/w parece ser conceptualmente sencilla de llevar a cabo, el proceso de formación de partículas es bastante complicado y una gran cantidad de parámetros del proceso influyen o afectan las propiedades de las microesferas de PLGA cargadas con péptidos/proteínas.

Hasta ahora, la curva de temperatura aplicada durante la etapa de evaporación en las técnicas de evaporación de emulsión/disolvente no se ha identificado como un parámetro de proceso crítico que afecte las características de liberación del péptido de la matriz polimérica. Por el contrario, generalmente se aplica el tratamiento a temperatura constante ligeramente por encima del punto de ebullición del disolvente orgánico (o ligeramente por encima de la presión de vapor del disolvente cuando se aplica una presión reducida/vacío para acelerar la evaporación del disolvente).

Un mecanismo de liberación típico para este tipo de formulaciones incluye tres fases que generalmente se pueden representar como la fase de liberación inicial (fase 1), la fase de hidratación (fase 2) y la fase de liberación primaria (fase 3) que está controlada por difusión, pero facilitada por erosión de la matriz polimérica. La liberación del fármaco comienza después de un lapso de tiempo cuando el peso molecular del polímero cae por debajo de un valor crítico y, por lo tanto, puede producirse una pérdida de masa (Faisant N., Siepmann J., Benoit J. P. PLGA-based microspheres: elucidation of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. Eur. J. Pharm. Sci. Mayo de 2002; 15 (4): 355-66; Korber M. PLGA erosion: solubility or diffusion controlled? Pharm. Res. nov. 2010; 27 (11): 2414-20).

El documento WO 2005/110369 describe un procedimiento para preparar microesferas de PLGA cargadas con octreótido que comprende disolver PLGA en diclorometano, disolver acetato de octreótido en metanol, mezclar para formar una emulsión y por último evaporar el disolvente controlando la temperatura y aumentándola en 42°C.

El documento US 2010/0086591 describe un procedimiento para producir microesferas de PLGA de octreótido de rotura lenta. El PLGA se disuelve en diclorometano, el octreótido se disuelve en metanol, los dos se mezclan para formar una emulsión, la suspensión concentrada se lava con agua a temperatura ambiente y luego se evapora aumentando la temperatura del agua de lavado a 34-37°C°C. El documento US 2011/0262545 describe formulaciones de liberación lenta que comprenden octreótido.

Hay necesidad en la técnica de un método de fabricación mejorado para controlar las características de liberación de la sustancia farmacológica peptídica de la matriz polimérica de las microesferas.

Compendio de la invención

La presente descripción se refiere a una técnica de evaporación de emulsión/disolvente simple o doble para la preparación de microesferas de PLGA de liberación sostenida que comprenden fármacos peptídicos, en particular Octreótido, donde la liberación del péptido de la matriz polimérica está controlada por la curva de temperatura aplicada durante la etapa de evaporación del disolvente. Otros péptidos incluyen; exenatida, leuporelina, goserelina, liraglutida y teduglutida. Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento según la reivindicación 1.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método en el que la etapa de evaporación del disolvente se realiza a una temperatura controlada, temperatura que aumenta durante la etapa de evaporación para dar como resultado la solidificación de microesferas. Las microesferas resultantes se recogen por tamizado, se lavan y por último se secan al vacío en un secador de filtro para proporcionar un polvo suelto.

Se describe un procedimiento para la preparación de microesferas de polímero de poli(D,L-lactida-co-glucólido) de un péptido, péptido que también puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, que comprende:

a. disolver el péptido, o una de sus sales, en al menos un disolvente orgánico miscible en agua, y que contiene opcionalmente también agua, para formar una fase acuosa;

b. formar una emulsión de aceite en agua o agua en aceite y agua en una fase aceitosa adecuada que comprende una solución orgánica del polímero poli(D,L-lactida-co-glucólido), siendo la solución inmiscible en la fase acuosa;

c. evaporar al menos un disolvente orgánico usado en a. de la emulsión para formar las microesferas controlando la temperatura durante la etapa de evaporación y aumentando la temperatura durante la etapa de evaporación.

En otro aspecto, las características de liberación de las microesferas, como se demuestra por los datos in vitro e in vivo, se controlan mediante el grado de aumento de temperatura durante la etapa de evaporación del disolvente. Más concretamente, aumentando la temperatura durante la evaporación del disolvente desde una temperatura inicial de 15 a 25°C, preferiblemente alrededor de 20°C. Preferiblemente, la temperatura máxima alcanzada es de hasta 38°C. La temperatura se eleva durante un período de tiempo de 20 minutos a 3 horas. El secado puede continuar durante un período prolongado después del período de elevación de la temperatura. Preferiblemente, el ritmo de aumento de temperatura es de 0,1°C/min a 1°C/min. El aumento de temperatura puede ser constante durante el período o por etapas. Por etapas significa que cada cambio es un cambio escalonado en la temperatura y luego esa temperatura se mantiene durante un período antes del siguiente cambio. También puede haber una mezcla de cambios de temperatura constantes y por etapas durante la etapa de evaporación.

La expresión "características de liberación" se refiere al perfil de disolución de las formulaciones en un método que se correlaciona con las características de PK in vivo de las formulaciones en ratas tras una única inyección intramuscular. En un aspecto, se ha creado una correlación in vitro in vivo de tipo A entre las características de disolución in vitro y las características de liberación in vivo calculadas a partir de la descirconvolución de las curvas de concentración plasmática en ratas aplicando un modelo de un compartimento. Más concretamente, "características de disolución" se refiere a la cantidad o número de octreótidos que se libera de las microesferas en función del tiempo en tampón acetato 1 mM pH 4,0 a 372C.

Las características de liberación se expresan por la rotura inicial (fase 1), el lapso de tiempo (fase 2) y la duración y pendiente de la fase de liberación primaria (fase 3). Más concretamente, la curva de disolución se ajusta mediante la siguiente ecuación donde la constante yo refleja la rotura inicial, la constante xo refleja el lapso de tiempo y las constantes a y b describen la fase de liberación primaria.

% de liberación

La presente descripción se refiere a un método de evaporación de emulsión (simple o doble)/disolvente para la preparación de microesferas de PLGA que comprenden un péptido activo farmacéutico en el que se utiliza la velocidad de aumento de temperatura durante la etapa de evaporación del disolvente para controlar las características de liberación del péptido encerrado. Más concretamente, el ritmo de aumento de temperatura durante la fase de evaporación del disolvente se usa para controlar el lapso de tiempo de las características de liberación de péptidos que se expresa por la constante xo calculada de la curva de disolución de las microesferas. El lapso de tiempo de las características de liberación de las microesferas resultantes se prueba en tampón acetato 1 mM pH 4,0 a 37°C.

Más concretamente, la única técnica de evaporación de emulsión/disolvente incluye las siguientes etapas (Figura 1):

i. El octreótido se disuelve en una cantidad apropiada de disolvente adecuado, preferiblemente metanol.

ii. El polímero de poli(D,L-lactida-co-glucólido) se disuelve en diclorometano y la solución se enfría hasta 10°C o menos, preferiblemente 5°C o menos.

iii. Las dos soluciones se mezclan con agitación vigorosa para formar dicha fase oleosa dispersa.

iv. Dicha fase continua, se prepara disolviendo fosfato disódico monobásico y fosfato de potasio dibásico en una solución de PVA y se enfría hasta 10°C o menos, preferiblemente 5°C o menos.

v. Las fases dispersa y continua se mezclan, preferiblemente usando un dispersor de gran cizallamiento en línea, formando microesferas semisólidas con la distribución de tamaño de partícula deseada. La circulación de la fase continua se consigue con una bomba peristáltica mientras que la circulación de la relación de continuo se consigue mediante una bomba de jeringa.

vi. Las microesferas formadas se transfieren desde la salida a un recipiente adecuado controlado entre 15 y 25°C, preferiblemente alrededor de 20°C, bajo agitación.

vii. El endurecimiento de las microesferas se consigue aumentando gradualmente la temperatura como se describe en la presente memoria.

viii. Después de varias horas de secado total, aproximadamente 4, las microesferas secas se transfieren a un secador de filtro.

ix. Las partículas se lavan con agua en el secador de filtro, preferiblemente a temperatura ambiente, y después de drenar las microesferas se dejan secar durante al menos 12 horas, preferiblemente 24 horas, preferiblemente al vacío de 10 mbar y agitando suavemente.

Por consiguiente, la técnica de evaporación doble de emulsión/disolvente incluye las siguientes etapas (Figura 2):

i. El octreótido se disuelve en una cantidad adecuada de agua.

ii. El polímero poli(D,L-lactida-co-glucólido) se disuelve en diclorometano y la solución se enfría hasta 10°C o menos, preferiblemente 5°C o menos.

iii. Las dos soluciones se emulsionan, preferiblemente a 20.000 rpm durante 1 minuto, usando un dispersor digital T25 ULTRA-TURRAX montado en la parte superior formando dicha fase oleosa dispersa y se enfría hasta 10°C o menos, preferiblemente 5°C o menos.

iv. La fase acuosa continua se prepara disolviendo fosfato disódico monobásico y fosfato de potasio dibásico en una solución de PVA y se enfría hasta 10°C o menos, preferiblemente 5°C o menos.

v. Las fases dispersa y continua se mezclan, preferiblemente usando un dispersor de altogran cizallamiento en línea, formando microesferas semisólidas con la distribución de tamaño de partícula deseada. La circulación de la fase continua se consigue mediante una bomba peristáltica mientras que el flujo de la relación de continuo se consigue mediante una bomba de jeringa.

vi. Las microesferas formadas se transfieren desde la salida a un recipiente del reactor controlada entre 15 y 25°C, preferiblemente alrededor de 20°C, en agitación.

vii. El endurecimiento de las microesferas se consigue aumentando gradualmente la temperatura como se describe en este documento.

ix. Las partículas se lavan en el secador de filtro con agua, preferiblemente a temperatura ambiente, y después de drenar las microesferas se dejan secar durante al menos 12 horas, preferiblemente 24 horas, preferiblemente al vacío de 10 mbar y agitando suavemente.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 a: Diagrama esquemático del proceso de doble emulsificación

Figura 1b: Diagrama esquemático del proceso de emulsificación simple

Figura 2a: Gráfico de distribución del tamaño de partículas para las formulaciones 1 a-1 c

Figura 2b: Gráfico de distribución del tamaño de partículas para las formulaciones 2a-2c

Figura 3a: Imágenes SEM y SEM transversales de las formulaciones 1a-1c

Figura 3b: Imágenes SEM y SEM transversales de las formulaciones 2a-2c

Figura 4a: Curvas de disolución comparativas de Sandostatina LAR y de las formulaciones 1 a-1 c

Figura 4b: Curvas de disolución comparativas de Sandostatina LAR y de las formulaciones 2a-2c

Figura 5: Curvas de concentración plasmática en ratas de Sandostatina LAR y de las formulaciones 1a y 2c Figura 6a: Comparación de la concentración plasmática de Sandostatina LAR observada in vivo y la calculada de nuevo Figura 6b: Comparación de la concentración plasmática observada in vivo y la concentración en plasma calculada de nuevo de la formulación 1a

Figura 6c: Comparación entre la concentración plasmática observada y la prevista de la formulación 2c

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una formulación de liberación lenta de acetato de octreótido con características de liberación controladas mediante el control y el aumento de la temperatura durante la etapa de evaporación del disolvente del proceso de fabricación según la reivindicación 1.

Octreótido (también conocido como (4R, 7S, 10S, 13R, 16S, 19R)-19-[(2R) -2-amino-3-fenilpropanamido]-10-(4-aminobutil)-16-bencil-N-[(2R, 3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il]-7-(-(1-hidroxietil)-13-(1 H-indol-3-ilmetil)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-ditia-5,8,11,14,17-pentaazacicloicosano-4-carboxamida, preferiblemente en forma de sal acetato (o cualquier otra sal farmacéuticamente aceptable) o también conocida como sal acetato de disulfuro de 4D-fenilalanil-L-cisteinil-L-fenilalanil-D-triptofil-L-lisil-L-treonil-N-((1 R, 2R)-2-hidroxi-1 -(hidroximetil)propil)-L-cisteinamida cíclica (2 7)- o L-cisteinamida-D-fenilalanil-L-cisteinil-L-fenilalanil-D-triptofil-L-lisil-L-treonil-N- (2-hidroxi-1- (hidroximetil) propil) -cíclico (2-7)-disulfuro (R- (R*, R*)), la sal del acetato es un octapéptido sintético (FDhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol) análogo de la hormona somatostatina de origen natural, y está aprobado para su uso en el control de tumores en trastornos neuroendocrinos. tales como acromegalia y tumores neuroendocrinos gastroenteropancreáticos. La estructura química del acetato de octreótido se muestra a continuación:

Los polímeros adecuados disponibles en el mercado para su uso en la preparación de microesferas de PLGA según la presente invención incluyen RESOMER® y LAKESHORE BIOMATERIALS de Evonik Industries AG, Expansorb® de PCAS., PURASORB® de PURAC Biochem BV. Los polímeros PLGA usados en la presente invención pueden tener una proporción de ácido láctico y ácido glicólico en el intervalo de aproximadamente 50:50 a aproximadamente 65:35 y un peso molecular medio ponderado (Mw) en el intervalo de 10.000 a 70.000. Preferiblemente, la presente invención utiliza PLGA que tiene una proporción de monómeros de 50:50 y un peso molecular medio ponderado en el intervalo de 30.000 -50.000.

Los disolventes orgánicos para el PLGA que se pueden utilizar en la presente invención incluyen acetato de etilo, tetrahidrofurano, acetonitrilo, diclorometano, hexafluoroisopropanol, cloroformo y acetona. Más preferiblemente, en la presente invención se usa diclorometano. La concentración de polímero en el disolvente orgánico es del 10 al 40% en peso, más preferiblemente del 20 al 30% en peso.

En la presente invención, el acetato de octreótido se disuelve en un disolvente orgánico adecuado miscible en agua, preferiblemente metanol, para dar como resultado una concentración de 5-20% en peso, más preferiblemente 10% en peso. Opcionalmente se utiliza un disolvente orgánico miscible en agua con agua.

Para la preparación de la fase dispersa, la solución de acetato de octreótido se dispersa en la solución de polímero utilizando un dispersor de alto cizallamiento en modo discontinuo que opera a una velocidad de cizallamiento de 15.000 - 30.000 s-1. Más preferiblemente, se aplica una velocidad de cizallamiento de 20.000 - 25.000 s-1. Alternativamente, se añade una solución de acetato de octreótido en metanol a la solución de polímero en agitación. La fase dispersa se controla a una temperatura inferior a 20°C, más preferiblemente de 5 a 10°C.

En la presente invención, la fase continua consiste en una solución acuosa con un tensioactivo, preferiblemente alcohol polivinílico (PVA). Los ejemplos de otros tensioactivos que pueden emplearse opcionalmente incluyen uno o más tensioactivos aniónicos (tales como oleato de sodio, estearato de sodio o lauril-sulfato de sodio), tensioactivos no iónicos (tales como poloxámeros, Tweens), polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa sódica y gelatina, usados independientemente o en combinación. PVA, preferiblemente tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 150.000 Da que corresponde a un rango intervalo de viscosidad de 3 9 FC cuando se mide como una solución acuosa al 4% a 20°C, 85-89% de grado de hidrólisis y número de éster de 130-150. Los grados de PVA seleccionados que se utilizan en la presente invención incluyen Emprove PVA 4-88 (Mw 25.000-30.000; viscosidad 4% en agua: 3.,4-4.,6 FCs), PVA 8-88 (Mw aproximadamente 65,.000; viscosidad 4% en agua 6.,8- 9,2 FCs) y PVA 18-88 (Mw aproximadamente 130.000; viscosidad 4% en agua) disponibles en Merck KGaA. La cantidad de tensioactivo añadido a la fase acuosa es preferiblemente de hasta 5,0% (p/p) con respecto a la masa de la solución acuosa. Más preferiblemente, la cantidad de tensioactivo (óptimamente la cantidad de PVA) es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5% p/p. La fase continua se estabiliza térmicamente a una temperatura inferior a 20°C, más preferiblemente de 5 a 10°C.

En la presente invención la emulsión de la fase acuosa en la fase oleosa continua se realiza con uno de los siguientes medios: i) agitación mecánica, ii) dispersor discontinuo, iii) dispersor en línea. Preferiblemente, el proceso de emulsificación se realiza mediante un dispersor en línea MT-3000 disponible por Kinematica que opera a una velocidad de cizallamiento de 5.000 - 20.000 s-1, lo más preferiblemente en un intervalo de 10,000 - 15,000 s-1 para dar como resultado la formación de microesferas de 10-250 pm, lo más preferiblemente de 20-100 pm. La relación en peso entre la fase dispersa y la continua es de 1:20 - 1:150, más preferiblemente de 1:75 - 1: 100.

La suspensión de microesferas formada se transfiere (desde la salida del dispersor en línea) a un recipiente adecuado (preferiblemente aislado para ayudar con el control de temperatura) que se controla inicialmente por encima de 15°C, preferiblemente a aproximadamente 20°C. La temperatura durante la evaporación del disolvente aumenta desde una temperatura inicial de 15 a 25°C, preferiblemente alrededor de 20°C. Preferiblemente, la temperatura máxima alcanzada es de hasta 35°C o 38°C. La temperatura se eleva durante un período de tiempo de 20 minutos a 3 horas. El secado puede continuar durante un período prolongado después del período de elevación de la temperatura.

El ritmo de aumento de temperatura es de 0,1°C/min - 1°C/min. El aumento de temperatura puede ser constante durante el período o por etapas. Por etapas quiere decir que cada cambio es un cambio escalonado en la temperatura y luego esa temperatura se mantiene durante un período antes del siguiente cambio. También puede haber una mezcla de cambios de temperatura constantes y por etapas durante la etapa de evaporación.

La evaporación del disolvente de la microesfera tiene lugar según el perfil de temperatura aplicado en agitación y un vacío parcial, preferiblemente el vacío parcial está ligeramente por debajo de la presión de vapor del diclorometano.

Después de la evaporación del disolvente, las partículas endurecidas se recogen de la suspensión en un secador de filtro con poca agitación. Preferiblemente, se usa un secador de filtro de PSL (Powder System Limited). Las partículas recogidas se lavan con agua y luego se secan en el secador de filtro aplicando un vacío de aproximadamente 10 mbar.

Las microesferas finales se analizan con respecto al tamaño de partícula, carga de fármaco, peso molecular del polímero, disolvente residual y liberación in vitro como se describe a continuación. Los resultados se resumen en las tablas 1 y 2 y también en las figuras 3-4. Las formulaciones seleccionadas (es decir, 1a y 2c) junto con el producto de referencia Sandostatina LAR se han probado en ratas para crear un modelo de correlación in vitro in vivo. Los detalles del estudio de PK y la metodología aplicada para el desarrollo y el externo se proporcionan a continuación. Los resultados in vivo se proporcionan en las figuras 5-6.

Análisis de distribución de tamaño de partículas (PSD)

La distribución del tamaño de partículas se midió por difracción láser usando un Malvern Master Sizer 2000 Hydro2000S. El tamaño medio de partículas se expresa como el diámetro medio volumétrico en micras.

Determinación de la carga de fármaco

Aproximadamente 50 mg de microesferas se disolvieron completamente en 10 ml de cloruro de metileno (30 min en baño de ultrasonidos). Se añadieron a la solución 20 ml de tampón acetato 0,1 M (pH 4,0) para la extracción de octreótido en una fase acuosa. Las dos fases se mezclaron a fondo agitando formando remolinos durante 5 min y luego se separaron por centrifugación a 4.000 rpm durante 5 min. Se tomaron muestras de la fase acuosa para análisis HPLC para medir el contenido de octreótido. La muestra se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 pm antes del análisis. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: la separación en gradiente se realizó con una columna Inertsil ODS3 (4,6 x 250 mm, tamaño de partícula 5 pm); la fase móvil consistía en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua destilada (eluyente A) y TFA al 0,1% en acetonitrilo (eluyente B) y se pasó con un gradiente lineal del 20% al 35% de eluyente B durante 18 min. El caudal fue de 1,0 ml/min, el volumen de inyección fue de 10 pl y la longitud de onda de detección fue de 210 nm.

Medición del peso molecular medio

El peso molecular de las microesferas se determinó por cromatografía de penetración en gel (GPC) utilizando un sistema Agilent Modelo GPC 50Plus equipado con 2 columnas PLgel 5 pm Mixed-D 300 X 7,5 mm conectadas en serie y un detector de índice de refracción (RI). La fase móvil es THF con un caudal de 1 ml/min y la temperatura de la columna es de 30°C. Para el análisis de las muestras, se disuelven 10-15 mg de microesferas en 5 ml de THF y la solución se deja durante la noche en agitación. Se extraen 2 ml, se filtran a través de filtros de PTFE de 40 pm y se analizan. El volumen de inyección es de 100 pl. La recopilación y análisis de datos se realizó mediante el programa informático Cirrus. Para la calibración se utilizan patrones de poliestireno con un intervalo de MW entre 162 y 371.100.

Método de liberación in vitro

Aproximadamente 150 mg de las microesferas formuladas se colocaron en una botella de 100 ml y se incubaron en 30 ml de tampón acetato (1 mM, pH 4,0) a 37°C en un baño con agitación (85 rpm). Se tomaron muestras del medio de liberación en varios puntos de tiempo, se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 gm y se analizó por HPLC. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: la separación en gradiente se realizó con una columna Inertsil ODS3 (4,6 x 250 mm, tamaño de partícula 5 gm); la fase móvil consistió en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua destilada (eluyente A) y TFA al 0,1% en acetonitrilo (eluyente B) y se pasó con un gradiente lineal del 25% al 35% de eluyente B durante 25 min. El caudal fue de 1,0 ml/min, el volumen de inyección fue de 10 gl y la longitud de onda de detección fue de 210 nm.

Disolventes residuales (diclorometano)

Se investigó si el etanol y/o el cloruro de metileno se eliminan de las micropartículas de octreótido. Las micropartículas están totalmente disueltas en dimetilsulfóxido (DMSO). Por lo tanto, se cuantificaron las concentraciones de etanol y cloruro de metileno en la solución orgánica por cromatografía de gases (GC). Se disolvió una cantidad de 90 mg de micropartículas frescas en 5 ml de dimetilsulfóxido en un vial de GC antes del análisis de GC del espacio de cabeza. La evaporación de los disolventes residuales se logró mediante una incubación de la muestra de 30 minutos a 100°C en el horno de GC. El análisis de GC se realizó con GC-2010 plus (Shimadzu, Japón). Se utilizó una columna de análisis RTX-5 (RESTEK, EE. UU.) que usaba Crossbond 5% difenil/95% dimetilpolisiloxano como fase estacionaria. La cantidad de disolventes se midió utilizando patrones de curva de calibración. El tiempo de retención del diclorometano es de 5,75 min.

Estudios con animales

Las formulaciones de microesferas después de mezclar con manitol cristalino (es decir, 17% de manitol con respecto al peso total) se sometieron a esterilización por radiación UV a 365 nm durante 180 min utilizando una fuente de luz ultravioleta de 6 vatios para ser utilizadas en estudios farmacocinéticos en ratas macho Sprague Dawley. Se inyectaron las formulaciones de prueba a ratas (seis por grupo) que pesaban alrededor de 240-250 gramos y de 8 a 12 semanas de edad. Antes de la inyección, las muestras de polvo seco se pusieron en suspensión en un disolvente estéril (vehículo) que consistía en agua para inyectables, carboximetilcelulosa de sodio al 0,5% en peso. y manitol al 0,6% en peso. Se administró a los animales una única inyección intramuscular en una dosis fija de aproximadamente 60 mg de formulación de octreótido (microesferas)/rata que corresponde a 3 mg de sustancia activa de octreótido/rata en un volumen de 0,25 ml/rata de un vehículo, en un único sitio. La suspensión se administró mediante una aguja hipodérmica de 26G por vía intramuscular en el músculo cuádriceps de la rata situado en la cara superior del fémur. Se recogieron muestras de sangre de rata antes de la administración del fármaco y posteriormente en puntos de tiempo predeterminados incluidos a las 0,5 h, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h, día 3, 7, 14, 18, 21,28, 35, 42, 49, 56 y día 70 después de la dosis. En cada momento, se extrajeron aproximadamente 0,5 ml de sangre del plexo retroorbitario bajo anestesia ligera con isoflurano y se transfirieron a tubos etiquetados que contenían K2EDTA 200 mM como anticoagulante y se mezclaron por inversión manual 4-5 veces. Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo húmedo en todo momento y el plasma se separó por centrifugación a la hora siguiente a la recogida de la muestra. Las muestras de plasma se almacenaron por debajo de -60°C hasta el bioanálisis utilizando un método LC-MS/MS validado.

Correlación in vitro in vivo

Para el desarrollo del modelo IVIVC, se siguió el siguiente procedimiento: (1) selección de formulaciones con diferentes velocidades de liberación incluyendo Sandostatina LAR, formulación 1a y formulación 2c, (2) medición de perfiles de disolución in vitro por varios métodos de disolución, (3) medición de las curvas de concentración plasmática in vivo de PK de las formulaciones (es decir, Sandostatina LA, formulación 1a y formulación 2c) después de una única administración intramuscular en ratas, (4) estimación de las características de liberación in vivo mediante las curvas de concentración plasmática medidas utilizando la técnica de descirconvolución de Wagner-Nelson (modelo de un compartimento), (5) cálculo de la correlación entre las características de liberación in vivo descirconvolucionadas y las curvas de disolución in vitro utilizando los datos agrupados de Sandostatina LAR y la formulación 1 a, (6) selección de la método de disolución apropiado con la mayor correlación con los datos in vivo y creación de la IVIVC aplicando validación interna por análisis de regresión lineal (6) del modelo creado mediante la comparación de las curvas de concentración plasmática calculadas de nuevo utilizando el modelo de circonvolución de Wagner-Nelson para la formulación Sandostatina LAR y la formulación 1a y (7) validación externa del modelo creado mediante la comparación de la concentración plasmática prevista calculada por el perfil de disolución in vitro de la formulación 2c y el modelo creado y la curva de concentración plasmática in vivo observada de la formulación 2c.

Ejemplo 1a - c (emulsión única) (No según las reivindicaciones)

4 g de poli(D,L-lactida-co-glucólido) con una relación molar de 50:50 (Mw = 41.000 y polidispersidad aprox. 1,65), disponible en el mercado en PURAC con el nombre PURASORB 5004A, se disolvió en 30 g de diclorometano con agitación magnética. La solución de polímero se enfría a 5°C. Se disolvieron 0,2941 g de acetato de octreótido en 0,5882 g de agua para inyectables con mezcla. La solución de acetato de octreótido se añadió a la solución de polímero y se emulsionó mediante un Ultra Turrax® durante 1 minuto a 20.000 rpm para formar la primera emulsión (FD-fase dispersa). Se disolvieron 11,5 g de alcohol polivinílico EMROVE® 18-88 de Merck en 2.307 g de agua para inyectables a 80°C seguido de la adición de 17,46 g de fosfato disódico monobásico y 4,18 g de fosfato potásico dibásico. La solución se enfrió a 5°C formando la fase continua (FC). Se prepararon microesferas con la distribución de tamaño de partícula deseada administrando a la FC 2,3 l/min y a la FD 15,6 ml/min, en un dispersor Kinematica MT 3000 en línea. La suspensión de microesferas se recibió en un recipiente reactor de vidrio de doble camisa, controlado a 20°C y con agitación vigorosa, con el fin de eliminar el disolvente. La temperatura en el recipiente se aumentó a 38°C de acuerdo con los intervalos de tiempo predefinidos como se presenta en la siguiente tabla (Tabla 1). Después de 4 horas, las microesferas se transfirieron a un secador de filtro de vidrio, se lavaron con un exceso de agua a temperatura ambiente y se dejaron a un vacío de 10 mbar y con agitación suave durante 24 horas para que se secasen.

Tabla 1: Propiedades de las formulaciones 1a-1c

Ejemplo 2a-c (emulsión doble)

4 g de poli(D,L-lactida-co-glucólido) con una relación molar de 50:50 (Mw = 41.000 y polidispersidad aprox. 1,65), disponible en el mercado en PURAC con el nombre PURASORB 5004A, se disolvió en 30 g de diclorometano con agitación magnética. La solución de polímero se enfría a 5°C. La solución de polímero se esteriliza por filtración a través de un filtro de jeringa y se enfría a 5°C. Se disolvieron 0,2941 g de acetato de octreótido en 2,941 g de metanol con mezcla. La solución de acetato de octreótido se añadió a la solución de polímero y se mezcló con agitación para formar la fase oleosa (fase dispersa FD). Se disolvieron 11,5 g de alcohol polivinílico EMROVE® 18-88 de Merck en 2.307 g de agua para inyectables a 80°C seguido de la adición de 17,46 g de fosfato disódico monobásico y 4,18 g de fosfato potásico dibásico. La solución se enfrió a 5°C formando la fase continua (FC). Se prepararon microesferas con la distribución de tamaño de partícula deseada administrando a la FC 2,3 l/min y a la FD 18,7 ml/min, en un dispersor Kinematica MT 3000 en línea. La suspensión de microesferas se recibió en un recipiente reactor de vidrio de doble camisa, controlado a 20°C y con agitación vigorosa, con el fin de eliminar el disolvente. La temperatura en el recipiente se aumentó a 38°C según intervalos de tiempo predefinidos como se presenta en la siguiente tabla (Tabla 2). Después de 4 horas, las microesferas se transfirieron a un secador con filtro de vidrio, se lavaron con un exceso de agua a temperatura ambiente y se dejaron a un vacío de 10 mbar y con agitación suave durante 24 horas para que se secasen.

Tabla 2: Propiedades de las formulaciones 2a-2c

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de microesferas de polímero de poli(D,L-lactida-co-glucólido) de acetato de octreótido, que comprende:

a. disolver acetato de octreótido en al menos un disolvente orgánico miscible en agua, y que contiene opcionalmente también agua, para formar una fase acuosa;

b. formar una emulsión de aceite en agua o agua en aceite en una fase aceitosa adecuada que comprende una solución orgánica del polímero poli(D,L-lactida-co-glucólido), siendo la solución no miscible con la fase acuosa en donde dicha solución orgánica del polímero poli(D,L-lactida-co-glucólido) se enfría a 5°C o menos; c. evaporar al menos un disolvente orgánico utilizado en la etapa (a) de la emulsión para formar las microesferas controlando la temperatura durante la etapa de evaporación y aumentar la temperatura durante la etapa de evaporación con un ritmo de 0,1°C/min a 1°C/min;

en donde las características de liberación in vivo e in vitro del acetato de octreótido de las microesferas se controlan mediante la selección del ritmo de aumento de la temperatura durante la etapa de evaporación.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico es metanol y se añade agua.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polímero de poli(D,L-lactida-co-glucólido) se disuelve en diclorometano.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la evaporación en la etapa (c) se inicia por encima de 15°C y durante la etapa de evaporación la temperatura de la emulsión se eleva a más de 35°C.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la temperatura se eleva durante un período de tiempo de 20 minutos a 3 horas.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el secado adicional continúa durante un período prolongado después del período de elevación de la temperatura.