KR20160132152A - 항노화 효과를 갖는 미숙과 찔레열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미숙과 찔레열매 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 용매를 이용하여 미숙과 찔레열매를 추출하고, 농축 및 동결건조하여 제조된 미숙과 찔레열매 추출물을 0.001 ~ 1.0중량%를 함유하며 활성산소 소거효과, 피부 주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 광노화 방지 효과, 미백효과, 여드름 방지효과, 모발 손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 미숙과 찔레열매 추출물은 활성산소 소거효과뿐만 아니라, 사람 섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진에 의한 피부 탄력 및 주름 개선효과, 광노화 방지효과, 미백효과, 여드름 방지효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 나타낸다.

Description

항노화 효과를 갖는 미숙과 찔레열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{A cosmetic composition for anti-aging comprising immature fruits extracts of Rosa multiflora}

본 발명은 미숙과 찔레열매 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 미숙과 찔레열매 추출물을 유효성분으로 0.001 ~ 1.0중량%로 함유하는 것을 특징으로 하며 활성산소 소거효과, 피부 주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 광노화 방지효과, 미백효과, 여드름 방지효과, 모발손상 방지효과, 탈모 방지 및 육모 효과가 우수한 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest . Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am . Acad . Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고, 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종뿐만 아니라 기질 금속단백질 분해효소(Matrix metallopretease; MMP)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

다음은 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부는 태양광의 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 정상적으로 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 피부 세포의 일종인 멜라노싸이트에서 생성되고, 피부 표면에 분포되어 인체에 유해한 자외선을 차단하는 자연적인 스크리닝 기능을 나타낸다. 멜라닌 생성 기전에는 멜라노싸이트에서 합성되는 티로시나제라는 효소가 있다. 티로시나제는 티로신이라는 아미노산을 기질로 하여 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(Dopaquinone)을 생성하며, 도파퀴논으로부터 여러 단계의 산화 축합반응으로 흑색 색소인 멜라닌이 생성된다. 이미 아스코르빈산(일본특허공개 평4-9320), 하이드로퀴논(일본특허공개 평6-192062), 코지산(일본특허공개 소56-7710), 알부틴(일본특허공개 평4-9315) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있으나, 조성물 중에서 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취 발생, 생체 수준에서의 효능·효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고, 시험관 내에서 티로시나제의 억제효과는 입증되었으나, 실제 생체 수준과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 증대하고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허 공개 평9-672662는 히알루로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다.

또한, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 활발해지면 생성된 과잉 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭 내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5-알파-리덕타아제(5-α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하는 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사하는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH가 필요하다. 또한, 테스토스테론은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론은 여드름, 피지 증가, 탈모 및 전립선 비대증 등의 해당 조직에 관여한다. 특히, 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5-알파-리덕타아제에 의하여 생성되는 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5-알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 탈모방지 및 여드름 방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 커지고 있다.

1. 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0041616호 2. 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0025680호

본 발명의 목적은 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과, 피부탄력 개선효과, 광노화 방지효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용시 자외선 조사 등에 의한 미백효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용시 우수한 모발손상 방지효과, 탈모 방지효과, 육모효과 및 여드름 방지효과를 갖는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

이에 본 발명자들은 오랜 연구 끝에 미숙과 찔레열매를 선정하고 이로부터 추출물을 제조하여, 활성산소 소거효과, 피부 주름 개선효과, 탄력 개선효과, 광노화 방지효과, 미백효과, 여드름 방지효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 측정한 결과, 그 효과가 우수하여 화장료로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

찔레나무(Rosa multiflora)는 높이가 1~2m이고 밑에서 가지가 많이 갈라져서 엉키며 가시가 있다. 잎은 어긋나고 우상복엽이다. 작은 잎은 5~9개이고 타원형 또는 도란형이며 표면에는 털이 없고 뒷면에 잔털이 있으며 가장자리에 잔 톱니가 있다. 턱잎은 하반부가 잎자루 기부에 붙으며 빗살 같은 톱니가 있다. 꽃은 5월에 피고 백색 또는 다소 붉은빛이 돌며 원추꽃차례에 달린다. 작은 꽃줄기에 선모(腺毛)가 있는 경우도 있으며 꽃받침 조각은 젖혀지며 안쪽에 털이 밀생한다. 꽃잎은 도란형이며 끝이 파지고 향기가 있다. 열매는 둥글며 지름 8mm 정도로 9월에 붉게익는다. 수과(瘦果)는 길이가 3mm 정도로 백색이고 털이 있다. 잎과 꽃 이삭에 선모가 많은것을 털찔레(Rosa multiflora var. adenochaeta), 작은 잎의 길이가 2cm 이하이고 꽃이 작은 것을 좀찔레(Rosa multiflora var. quelpaertensis), 턱잎의 가장자리가 거의 밋밋하고 암술대에 털이있는 것을 제주찔레(Rosa multiflora luciae), 꽃이 붉은색이고 턱잎의 가장자리에 톱니가 있는것을 국경 찔레(Rosa multiflora jaluana)라고 한다. 한국, 일본, 중국 등의 산기슭이나 볕이 잘 드는 냇가와 골짜기에 서식한다. 효능은 노인이 소변을 잘 보지 못할 때와 전신이 부었을 때, 건망증, 불면증 및 꿈이 많고 쉽게 피로하고 성기능이 감퇴되었을 때 효과가 있다. 종기, 악창에 활용이 되며, 식욕증가, 정력개선에도 유효하다. 또, 관상동맥을 확장시키고 체내에서 지방과 단백질 대사를 개선하며 죽상동맥경화 형성을 억제한다. 설사약이나 창독, 변비, 신장염에도 쓰인다.

본 발명은 미숙과 찔레열매 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 상기 미숙과 찔레나무는 성숙과와 달리 녹색의 열매를 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 상기 미숙과 찔레열매 추출물은 화장료 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001~1.0중량%로 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 1.0중량% 이상인 경우 세포독성이 있고, 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 미숙과 찔레열매를 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미숙과 찔레열매 추출물이 미숙과 찔레나무를 상온에서 추출하고 냉침 및 여과한 후 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스, 립스틱, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 미숙과 찔레열매 추출물은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화 제제 등의 약학 조성물로 제제화할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다.

상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전 정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.

본 발명에 따른 미숙과 찔레열매 추출물은 활성산소 소거효과, MMP 저해 효과, 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과 및 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 미숙과 찔레열매 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등의 미백작용을 나타내었다.

또한, 미숙과 찔레열매 추출물은 모발손상 및 탈모방지 효과와 여드름 방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5-알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 미숙과 찔레열매 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 주름 개선효과, 광노화 방지효과, 미백, 여드름 방지, 모발손상 방지, 탈모 방지 및 육모 효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 가짐을 알 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 미숙과 찔레열매 추출물 제조

세절하여 음건한 미숙과 찔레열매를 정제수에 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 6시간 환류 추출하고 냉각한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하여 분말상 추출물을 제조하였다.

비교예 1: 성숙과 찔레열매 추출물 제조

세절하여 음건한 성숙과 찔레열매를 정제수에 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 6시간 환류추출하고 냉각한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하여 분말상 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량 비교

상기 실시예 1에서 수득한 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물의 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량을 비교하기 위해 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법으로 측정하였으며, 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno et al. (2000)의 방법을 변형하여 측정하였다.

먼저, 폴리페놀 함량은 시료를 10mg/㎖ 농도로 증류수에 녹인 다음 0.2㎖을 시험관에 취하여 증류수를 첨가하여 2㎖로 만든 후, Foiln-ciocalteu's phenol reagent 0.2㎖를 첨가, 혼합하여 3분간 실온에서 반응시켰다. 여기에 Na₂CO₃ 포화용액 0.4㎖를 가하여 혼합하고 증류수를 1.4㎖ 가하여 실온에서 한 시간 동안 반응시킨 후, UV/VIS 분광광도계(ShimadzuU-1201,Japan)를 사용하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 탄닌산(Sigma Co,USA)을 10mg/㎖ 농도로 증류수에 녹이고 최종 농도가 0, 37.5, 75, 150, 300㎍/㎖ 용액이 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 검량선을 작성하고, 이를 이용하여 추출물의 폴리페놀 화합물 함량을 산출하였다. 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno et al.의 방법(2000)을 변형하여 80% 에탄올을 용매로 10mg/㎖의 농도로 희석하여 시료 0.1㎖에 10% 질산알루미늄 0.1㎖와 1M의 아세트산 칼륨 0.1㎖ 그리고 80% 에탄올 4.7㎖를 가하여 25℃에서 40분간 반응시킨 후 415nm에서 UV/VIS 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 정량은 퀘세틴(Sigma Chemical Co.)을 이용하여 최종농도가 0, 10, 25, 50, 100, 250, 500㎍/㎖가 되도록 취하여 위와 동일한 방법으로 측정한 검량선으로부터 산출하여 각 추출물에 대한 플라보노이드 화합물의 함량을 구하였으며 그 함량을 표 1에 나타내었다.

표 1에서 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물 각각의 총 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량을 분석한 결과, 미숙과 찔레열매 추출물에서 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 성숙과에 비해 많음을 확인하였다.

시료명	총 폴리페놀 함량 (mg/g)	총 플라보노이드 함량 (mg/g)
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	86.26 ± 0.21	64.65 ± 0.14
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	42.62 ± 0.57	22.01 ± 0.44

실시예 3: 세포독성 평가

본 실시예는 상기 실시예 1에서 수득한 미숙과 찔레열매 추출물 및 비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물의 피부세포에 대한 세포독성을 평가하였다.

96-웰 시험 플레이트에 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것)에 희석된 섬유아세포(fibroblast)를 1x10⁵cells/㎖씩 넣고 24시간 동안 부착하였다. 각 웰에 추출물을 적절한 농도로 희석하여 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5㎎/㎖)이 함유된 세포배양 배지 200㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 수학식 1에 의해 세포생존율(%)을 정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 추출물의 농도를 결정하였다.

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 ㎚ 흡광값

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565 ㎚ 흡광값

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565 ㎚ 흡광값

표 2와 같이, 피부 섬유아세포의 100% 생존 처리농도는 실시예 1의 미숙과 및 비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물이 0.01% 이하로, 약간의 세포 독성을 확인할 수 있었다. 하지만 이는 일반적으로 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 작은 안전한 시료인 것을 말해준다.

시료명	100% 세포 생존 농도
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.01%
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.01%

실시예 4: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 상기 실시예 1에서 수득한 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 녹차추출물을 비교시료로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가하였다. 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성하였다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였다.

0.05M Na₂CO₃(2.4㎖), 3mM 잔틴 용액(0.1㎖), 3mM EDTA 용액(0.1㎖), BSA 용액(0.1㎖), 0.72mM NBT 용액(0.1㎖)를 가하고 여기에 시료용액 0.1㎖을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치하였다. 잔틴 옥시다제 용액(0.1㎖)을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시하였다. 그 후 6mM CuCl₂ 용액(0.1㎖)을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정하였다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정하였다. 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 효소 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정하였다.

억제율은 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.

St : 시료용액의 효소 반응 후 560nm 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후 560nm 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전 560nm 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전 560nm 흡광도

표 3과 같이, 미숙과 찔레열매 추출물은 성숙과에 비해 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 항산화 활성이 우수하다고 알려진 녹차추출물과 유사한 정도의 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	함량	항산화효과 (%)
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.01중량%	98.44
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.01중량%	71.25
녹차 추출물	0.01중량%	87.88

실시예 5: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

본 실시예는 상기 실시예 1에서 수득한 미숙과 및 비교예 1에서 얻은 성숙과 찔레열매 추출물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물 같은 우수한 항산화활성을 갖는 추출물을 비교시료로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하였다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 추출물을 농도별로 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96-웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 3으로 산출하였다.

A: 본 발명의 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 4와 같이, 실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물은 비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물에 비해 우수한 자유라디칼 소거활성을 나타내며, 항산화 활성이 우수한 녹차추출물보다 더 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	함량	항산화효과 (%)
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.01중량%	91.32
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.01중량%	63.17
녹차 추출물	0.01중량%	85.91

실시예 6: 자외선 조사 후 미숙과 찔레열매 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 수득한 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물의 UV 조사 및 시료첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주 된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 시료이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응하였다. 이차항체인 알칼라인 포스파타제 결합된 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응한 후, 알카린 포스파타제 기질용액(다이에탄올아민 완충용액 내에 1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 함유)을 상온에서 30분간 반응하고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

표 5와 같이, 자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 미숙과 찔레열매 추출물은 0.005중량%에서 61% 이상의 억제율을 보였으며, 대조군으로 사용한 레티놀과 성숙과의 억제율에 비해 상당히 우수한 효과를 확인하였다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
음성 대조군	-
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물 0.005중량%	61
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물 0.005중량%	45
레티놀	49

실시예 7: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 수득한 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물을 피부세포 배양액에 각각 첨가한 후 피부 기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1) 배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴ cell/㎖ 농도로 배양하였다. 70~80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다. 프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48-웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 각각의 시료를 적절한 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101,Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

표 6과 같이, 실시예 1의 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물은 0.005중량%의 농도에서 28% 정도의 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 나타내어 양성 대조군으로 사용한 비타민 C에 비해 낮지만, 성숙과에 비해서는 우수한 활성을 나타내었다.

시료명	함량	MMP-1 발현 억제율
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.005중량%	28.4%
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.005중량%	18.3%
Vitamin C	0.005중량%	34.2%

실시예 8: 자외선 조사에 의한 피부세포 광손상 방어효과 확인 실험

본 실시예에서는 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 수득한 미숙과 및 성숙과 찔레열매 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하였다. 섬유아세포 (fibroblast)를 96-웰 시험 플레이트에 1x10⁵cells/㎖ 개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 24시간 후 평가하고자 하는 추출물을 처리하여 동일한 배양조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사,Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 200㎕을 첨가하였다. 여기에 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지를 함유하는 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 200㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 100㎕씩 넣어주었다. 2분간 진탕하여 세포를 용해하고 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다.

수학식 4와 같이 세포생존율(%)을 측정하고, 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 5와 같이 계산하였다.

Bo : 세포 배양배지만을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포 생존율

표 7과 같이, 실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물은 0.001% 농도에서 자외선에 의한 세포독성을 12.1% 완화하여 자외선에 의한 세포손상을 방어함을 알 수 있었다.

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.005	12.1
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.005	4.3

실시예 9: 티로시나제 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 시료의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 확인하고, 미백효과를 평가한 것이다.

티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실시예는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem., 24: 161 - 168, 1996)을 응용하여 미백효과를 평가하였다.

각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 50mM 인산 완충액(pH 6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/㎖, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응 시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 수학식 6에 따라 계산하였으며, IC₅₀ 값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

A : 시료를 넣은 웰의 반응 전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응 후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응 전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응 후 흡광도

표 8과 같이, 실시예 1 미숙과 찔레열매 추출물의 IC₅₀ 값은 0.01%로 나타나 비교예 1의 성숙과보다 우수한 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내었다.

시료명	티로시나제 저해 효과 (IC50)
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.05%
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.1%
알부틴	0.01%

실시예 10: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 합성억제 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 평가한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2x10⁶ cells/㎖ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 세포 펠릿을 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH{10% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 포함}를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 7에 의하여 계산하였다.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

표 9과 같이, 미숙과 찔레열매 추출물의 멜라닌 합성 저해효과는 41%로 기존의 미백제인 알부틴과 비교하여 유사한 효과를 나타내었다.

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(%)
실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물	0.005	41%
비교예 1의 성숙과 찔레열매 추출물	0.005	13%
알부틴	0.1	47%

실시예 11: 여드름균에 대한 항균력 측정

실시예 1에서 수득한 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인인 피부 상재균 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화하기 위하여 BHI 액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균 배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%; 한천 1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후, 건조하였다. 실시예 1에서 수득한 추출물을 각각 95% 에탄올 수용액에 12%(w/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓은 후 이것을 35㎕ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다.

여드름균에 대한 항균력을 측정한 결과, 미숙과 찔레열매 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 19㎜, 성숙과 찔레열매 추출물의 균 성장저지환은 11mm인 것으로 나타났다.

실시예 12: 미숙과 찔레열매 추출물의 5 알파- 리덕타아제 활성 억제력 평가실험

상기 실시예 1에서 수득한 추출물의 5 알파-리덕타아제 활성 억제력을 평가하였다. 5 알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5 알파-리덕타아제는 포피 유래의 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 10,000개의 섬유아세포가 들어가도록 접종한 후 배양하였다. 각 홀마다 3H(트리튬)으로 방사선 표지(radiolabelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하여 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정하였다. 미숙과 찔레열매 추출물이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼았다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이클로헥산(cyclohexane) 1:1 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻는다. 얻어진 스테로이드를 박막크로마토그래피 판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액98/2(v/v)로 전개시킨다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 8에 의해 5 알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.

A: 테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 미첨가시)

B: 테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 첨가시)

표 10과 같이, 미숙과 찔레열매 추출물은 5 알파-리덕타아제 저해효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물 농도(%)	0.05	0.025	0.001	0.0005	0.0025	0.001	0.0005
저해율(%)	65.4	56.8	41.4	35.3	12.1	10.2	8.2

실시예 13: 피부 탄력 개선 및 주름 개선 효과 시험

상기 실시예 1에서 수득한 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 2와 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 11에 나타낸 바와 같다. 우선 표 11에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 13, 비교예 2)을 제조하였다. 실험자(20세~35세의 여성) 15명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 표 12에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7 값은 피부의 점탄성(viscoelasticity) 성질을 나타낸다.

표 12와 같이, 실시예 1의 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 크림은 피부 탄력 개선효과가 우수함을 알 수 있다.

구 분		실시예 13	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도레실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	미숙과 찔레열매 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위 : 중량%

실험제품	피부탄력효과 (R7)
실시예 13 (실시예 1 미숙과 찔레열매 추출물 함유)	0.35
비교예 2	0.11

n=20, p<0.05

실험자(20세~35세의 여성) 15명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과는 표 13에 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수로 나올수록 주름 개선효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 13에서 나타나듯 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 실시예 13의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 13	-0.21	-0.17	-0.11	-0.08	-0.06
비교예 1	-0.11	-0.07	-0.06	-0.05	-0.02
R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

실시예 14: 미백효능 임상 평가

실시예 13에서 수득한 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 크림 제형의 화장료를 사용하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2와 비교실험을 행하여 평가하였다. 실험자 (20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마미터(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안 관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 표 14에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

미백 효능 육안 평가 기준 : -3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선

표 14와 같이, 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

	피부색의 밝기 변화(L)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 13	비교예 2	실시예 13	비교예 2	실시예 13	비교예 2
평균값	7.89	3.58	4.3	2.6	4.7	2.7

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 14 내지 16과 같이 제조하였다. 이들 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 활성산소 소거효과, 피부 주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 광노화 방지효과, 미백효과, 여드름 방지효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 14: 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 미숙과 찔레열매 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 15: 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 미숙과 찔레열매 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 16: 미숙과 찔레열매 추출물을 함유한 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 미숙과 찔레열매 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims (14)

1. 미숙과 찔레열매 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 미숙과 찔레열매는 녹색의 열매를 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 미숙과 찔레열매 추출물은 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 ~ 1.0 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 또는 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 미숙과 찔레열매 추출물은 미숙과 찔레열매를 상온에서 추출하고 냉침 및 여과한 후 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 활성산소 소거효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 탄력 개선효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 광노화 방지효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 미백 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
11. 청구항 1에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 여드름 방지 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
12. 청구항 1에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 모발 손상 방지효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
13. 청구항 1에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 탈모 방지 및 육모 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
14. 청구항 1에 있어서,
    상기 화장료 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스, 립스틱, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 화장료 조성물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.