KR20160115441A

KR20160115441A - 미강 효소 분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160115441A
Application number: KR1020150043135A
Authority: KR
Inventors: 임승택; 권민정; 김성민
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2016-10-06
Also published as: KR101753848B1

Abstract

본 발명은 미강을 60 내지 80 ℃의 온도로 24 내지 50 시간 동안 스팀처리한 뒤, 세포벽 분해효소, 당분해효소 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 가수분해효소로 가수분해한 뒤, 물, 알콜 또는 이들의 혼합물로 추출된 미강 추출물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 미강 추출물은 페놀산의 함량이 크게 증대되었으며, 인체에 흡수되기 어려운 형태의 페놀 등의 생리활성 성분들이 효소처리 과정을 통해 인체에 흡수되기 쉬우면서도 피부에 자극이 없는 형태로 전환되어 높은 항산화, 항노화, 피부 미백 또는 주름개선 또는 예방의 효과가 있다.

Description

미강 효소 분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부미백 및 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for antioxidation, skin-whitening, and anti-wrinkle which comprises rice bran enzyme treatment extracts as an active ingredient}

본 발명은 미강을 효소로 분해하여 추출함으로써 항산화, 피부미백 또는 주름개선에 효과를 나타내는 미강 추출물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

미강(rice bran)은 현미를 백미로 도정할 때 얻어지는 과피, 종피 및 호분층의 분쇄물을 의미하며, 쌀이 가지고 있는 기능성 성분의 95%는 미강과 쌀눈에 함유되어 있다고 알려져 있다.

미강은 양질의 단백질, 식이섬유, 각종 비타민과 미네랄이 함유되어 있을 뿐만 아니라 생리활성 물질인 페놀 화합물(phenolic compounds), 페룰린산(ferulic acid), 감마 오리자놀(gamma-oryzanol), GABA, 세라마이드(ceramide), 토코트리에놀(tocotrienol), 식물성 스테롤(phytosterols) 등의 천연 항산화 물질이 풍부하다.

이러한 미강은 예로부터 훌륭한 영양의 보고이자 미용효과 또한 탁월하다 하여 미용 용도로 사용되어 왔다. 예를 들어 미강을 면이나 명주 천으로 만든 주머니 속에 넣고 얼굴, 몸 등을 닦으면 피부가 깨끗해지고 매끌매끌해지며, 미강으로 팩을 하면 얼굴의 기미 방지에 도움이 된다고 알려있고, 미강 페룰린산(ferulic acid)은 페놀산의 일종으로 화장료에 첨가되었을 때 비타민 C 등의 물질을 안정화시켜주고 피부 미백 활성을 가진다고 보고되었다. 그 이외에도, 항산화, 피부보호 기능 강화, 보습 효과, 아토피성 피부염의 완화 등 다양한 피부관련 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다.

상기와 같은 다양한 생리활성에도 불구하고, 미강은 식품이나 화장품 등의 소재로 가공 또는 상용화가 거의 이루어지지 않고 있는데, 이는 미강의 생리 활성 성분이 대부분 미강 내 섬유소, 단백질 등과 복잡하게 연결된 형태로 존재하며, 분자량이 높아 인체에서 소화·흡수가 용이하지 못해 생체 내 이용률이 낮으며, 쉽게 산폐되는 문제점을 안고 있다.

대한민국 공개특허 제2014-0121668호에서는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 이들 2종 이상의 혼합 용액 중에서 선택되는 유기용매와 물을 30-70 : 70-30의 부피비로 혼합하여 제조된 추출용매를 흑미강 분말 1 중량비에 대하여 1 내지 10 중량비로 혼합하여 추출물을 유효성분으로 포함하여 화이트닝, 주름개선 등에 효과를 나타내는 천연 기능성 화장품 조성물에 관하여 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제1468921호에서는 미강 분말에 0.01N HCl 용액을 주입한 후, 90℃ 내지 110℃에서 3시간 내지 9시간 동안 환류추출하여 추출액을 제조하고, 친화성 크로마토 그래피용 비드가 적층된 컬럼에 상기 추출액을 투입하고, 용출용매로 1% 염산 수용액을 이용하여 피틴산을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 이를 이용한 기능성 화장품 조성물에 관하여 개시되어 있다.

상기와 같은 추출 공법들은 추출 수율이 낮고, 미강 내 폐놀 화합물들이 단단한 구조의 매트릭스(rigid structural matrix)로부터 쉽게 유리되지 못하기 때문에 생체 이용률이 낮다는 문제점이 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 항산화, 항노화에 효과적이며, 티로시나제 효소활성 저해 및 엘라스타제 효소활성 저해능이 우수하여 항산화, 피부미백 또는 주름개선용 화장료 조성물로 이용 가능한 미강 추출물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1) 스팀처리 장치에 미강을 투여하고 스팀처리하는 단계; 2) 스팀처리된 미강을 세포벽 분해효소, 전분 분해효소 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 가수분해효소로 가수분해하는 단계; 3) 상기 가수분해효소를 실활시키는 단계; 및 4) 상기 가수분해된 미강을 물, 탄소수 1 내지 4의 알콜 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 용매로 추출하는 단계;를 포함하는 미강 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 1) 단계의 스팀처리는 스팀처리 장치 내부 온도를 60 내지 80 ℃로 유지하며 24 내지 50 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 세포벽 분해효소는 셀룰라아제, 펙티나아제, 헤미셀룰라아제, 아라비나아제, 베타-글루카나아제 및 자일란나아제 중에서 선택되는 1종 이상이며,

상기 전분 분해효소는 아밀라아제 및 아밀로글루코시다아제 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 2) 단계는 25 내지 60 ℃로 2 내지 24 시간 동안 처리하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 2) 단계는 미강 100 중량부에 대하여 가수분해효소 0.1 내지 20 중량부로 첨가되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 4) 단계는 30 내지 80 ℃ 온도 범위에서 1 내지 12 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

상기 제조방법에 따라 제조된 미강 추출물은 피부 미백, 피부 주름 개선, 항산화 및 항노화로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상에 활성을 나타낸다.

한편, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 피부 미용 기능성은 구체적으로 피부 미백 활성, 주름 개선, 항산화 및 항노화로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 화장료 조성물은 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방향제, 보존제, 중화제, 에몰리언트제, 피부보호제 및 피부컨디셔닝제로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상을 더 포함할 수있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 화장료는 스킨, 유액, 에센스, 로션, 미용액, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림 중에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 미강 추출물은 스팀처리 과정을 통해 페놀 성분의 함량이 크게 증대되고, 인체에 흡수되기 어려운 형태의 페놀 등의 생리활성 성분들이 효소처리 과정을 통해 인체에 흡수되기 쉬우면서도 피부에 자극이 없는 형태로 전환되어 높은 항산화, 항노화, 피부 미백 또는 주름개선 또는 예방의 효과가 있다. 따라서 상기한 미강 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 미백, 주름개선, 항산화 및 피부 노화방지 등의 기능성을 요구하는 피부미용제품 또는 화장료의 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 1) 스팀처리 장치에 미강을 투여하고 스팀처리하는 단계; 2) 스팀처리된 미강을 세포벽 분해효소, 전분 분해효소 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 가수분해효소로 가수분해하는 단계; 3) 상기 가수분해효소를 실활시키는 단계; 및 4) 상기 가수분해된 미강을 물, 탄소수 1 내지 4의 알콜 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 용매로 추출하는 단계;를 포함하는 미강 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, '미강'이란 쌀을 도정하는 과정에서 생기는 과피, 종피, 호분층 등의 분쇄혼합물을 의미하는 것으로, 쌀 품종의 제한은 없으며, 도정 직후에 발생된 미강을 그대로 이용할 수도 있으나, 냉장 또는 냉동 보관된 미강, 동결건조 또는 진공 건조된 미강을 사용할 수도 있고, 산화를 방지하기 위하여 볶거나 고온 또는 고압으로 단시간 처리하여 산폐처리한 미강을 이용할 수도 있다.

또한, 상기 미강은 편의상 균일한 입자크기를 가지도록 분쇄과정을 거친 후에 사용할 수도 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 미강을 얻기 위하여 도정하는 방법으로는 특별히 제한은 없으며, 예를 들어, 수직형 연삭식 또는 마찰식 도정기를 이용하여 0.5 내지 5 분간 도정하여 수득한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 1) 단계의 스팀처리는 스팀처리 장치 내부 온도를 60 내지 80 ℃로 유지하며 24 내지 50 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

상기 스팀처리는 미강 내의 섬유소 등 단단한 결합 조직(rigid structural matrix)을 해리시켜 미강 내에 존재하는 페놀화합물 등의 생리활성 성분이 쉽게 유리될 수 있도록 한다. 특히, 상기 미강을 스팀처리한 후, 상기 가수분해효소로 가수분해하면 총 페놀류의 함량이 높고, 항산화 활성, 피부 미백, 주름 예방 또는 개선 효과가 우수한 미강 추출물을 얻을 수 있어 바람직하다.

상기 스팀처리시 스팀처리 장치 내부 온도가 60 ℃ 미만이면 페놀화합물의 용출이 용이하지 않아 스팀처리에 의한 효과를 기대하기 어려우며, 상기 범위를 초과하면 온도가 너무 높아 페놀류의 구조가 변질되어 미강 추출물의 항산화, 피부 미백, 주름 예방 또는 개선 효능이 저하된 추출물이 얻어질 수 있으므로 바람직하지 않다.

상기 스팀 처리 시간이 24 시간 미만이면, 페놀화합물의 용출이 용이하지 않아 스팀처리에 의한 효과를 기대하기 어려우며, 50시간을 초과하면 페놀화합물의 용출량이 증가하지 않을뿐더러 오히려 페놀류의 구조가 변질되어 미강 추출물의 항산화, 피부 미백, 주름 예방 또는 개선 효능이 저하된 추출물이 얻어질 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 2) 단계는 25 내지 60 ℃로 2 내지 24 시간 동안 처리하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 16시간 동안 처리하여 수행될 수 있다.

상기 가수분해효소로, 상기 세포벽 분해효소는 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 아라비나아제(arabinase), 베타-글루카나아제(β-glucanase) 및 자일란나아제(xylanase) 중에서 선택되는 1종 이상이며, 상기 당결합 분해효소는 아밀라아제(amylase) 및 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 가수분해효소는 바람직하게는 셀룰라아제, 베타-글루카나아제, 자일라나아에 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 가수분해가 2시간 미만으로 수행되는 경우에는 미강이 완전히 가수분해되기 어려워 페놀화합물 등 미강에 함유된 생리활성 성분이 완전히 용출되기 어려우며, 가수분해 시간이 24시간을 초과하는 경우에는 미강에 함유된 생리활성 성분이 유의한 수준으로 증가하지 않으며, 오히려 과도한 가수분해로 인하여 항산화, 피부 미백 활성이 저하된 추출물이 제조될 수 있어 바람직하지 않다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 가수분해효소로 시판중인 상업용 효소를 이용할 수도 있다. 상기 상업용 효소로는 예를 들어, 셀루클라스트(celluclast), 울트라플로 L(Ultraflo L) 및 펜토판(pentopan)을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 상기 효소 처리시, 효소의 활성을 높이기 위하여 pH를 조절할 수 있다. 상기 pH 조건은 효소의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 셀룰라아제가 주성분인 셀루클라스트를 가하는 경우에는 pH 4.35 내지 6.0일 수 있고, 베타-글루카나아제가 주성분인 울트라플로 L을 가하는 경우에는 pH 4.0 내지 6.0일 수 있으며, 펜토판을 가하는 경우에는 pH 5.0 내지 6.0의 범위로 조절될 수 있다.

가수분해효소의 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 효소량이 너무 적어 기질을 효율적으로 분해하기 어려우며, 반응속도가 너무 느리다는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 경제적이지 못하며, 과도한 가수분해로 인하여 항산화, 피부미백, 주름 개선 등의 효능이 저하될 수 있고, 제형 안정성이 낮아질 수 있는 문제점이 있다.

상기 미강을 가수분해효소로 처리한 후에는 효소의 활성을 실활시킨다. 상기 효소 활성을 실활시키는 방법으로는 특별히 제한은 없으며, 예를 들어 열살균, 초고온 순간 살균, 고온 장시간 살균, 감마선 등을 이용한 방사선 살균, 초고압살균, 자외선 살균, 초음파살균, 전자선 살균 또는 화학약품을 이용한 살균 등을 이용할 수 있다.

추출온도가 상기 온도 범위 미만인 경우에는 추출 수율이 낮으며, 상기 온도를 초과하는 경우에는 페놀류의 구조가 변질될 수 있으므로 바람직하지 않다.

상기 추출 용매로는 물, 알콜, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 알콜인 것이 페놀산 등 항산화, 피부미백, 주름 개선 등의 효능을 나타내는 활성성분을 높은 수율로 추출할 수 있어 바람직하다.

상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 80% 에탄올 수용액 또는 에탄올일 수 있다.

다음으로, 상기 추출 혼합물을 여과하여 불순물을 제거한다. 상기 여과 방법으로는 특별히 제한은 없으며, 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 여과할 수 있다. 구체적으로 미세 여과지를 통과시킴으로써 불순물이 제거된 미강 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 제조방법으로 제조된 미강 추출물은 PPH 라디칼 소거능에 효과적이어서 항산화 효과 또는 항노화에 효과적이며, 티로시나제 효소 활성 저해 및 엘라스타아제 효소 활성 저해가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 노화방지, 항산화, 미백활성 또는 주름 개선을 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 의하면 상기 조성물에서 상기 미강 추출물의 함량은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 30 중량%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.03 내지 10 중량%로 함유될 수 있다. 상기 미강 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우에는 미강 추출물 첨가에 의한 효과를 기대하기 어려우며, 상기 범위를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미미하며, 제형의 안정성이 저하되는 문제가 있다.

본 발명에 따른 화장료는 공지된 바의 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 스킨, 유액, 에센스, 로션, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형일 수 있다.

또한 각 제형의 화장료 조성물에 있어서 상기 유색미 미강 발효물 외에 다른 성분들을 사용목적 또는 제형의 특징에 따라 임으로 선정하여 배합할 수 있으며, 그 제형의 제제화에 필요에 따라 효과를 떨어뜨리지 않는 범위에서 첨가물을 더 포함할 수 있다.

상기 첨가물은 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방향제, 보존제, 중화제, 에몰리언트제, 피부보호제, 피부컨디셔닝제, 방부제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 살균제, 산화 안정화제, 실리콘, 소포제, 비타민, 곤중 기피제, 중합제, 추진제, 염기성화제, 산성화제, 착색제, 안료 및 충전제로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.

실시예

본 실험에 사용된 미강은 2013년도에 수확된 삼광 품종이며, 마찰식 도정기를 이용하여 도정한 뒤, 진공 포장하여 -80 ℃에서 보관하면서 실험에 이용하였다.

본 실험에 사용된 가수분해효소는 노보자임(Novozyme, Denmark)사의 산업용효소인 비스코자임, 터마밀, 셀루클라스트, AMC, 울트라플로 L 및 펜토판을 사용하였으며, 각 효소에 대한 특징을 하기 표 1에 나타내었다.

효소	활성성분	유래	활성pH	활성온도(℃)
비스코자임	Xylanase, cellulast, hemicellulase, feruloyl esterase, β-glucanase, arabinase	Aspergillus aculeatus	3.5-5.5	25-55
터마밀	α-amylase	Bacillus licheniformis	6.0	50-60
셀루클라스트	Cellulase	Trichoderma reesei	4.5-6.0	50-60
AMG	exo-1,4-α-glucosidase	Aspergillus niger	4.5	50-60
울트라플로 L	β-glucanase	Humicola insolens	4.0-6.0	40-60
펜토판	Xylanase	Thermomyces lanuginosus	5.0-6.0	50

제조예 1.

각각 0시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 60시간 동안 70 ℃로 스팀처리한 미강 분말 1 g에 상기 표 1의 최적 pH에 해당하는 인산염 완충 용액(50 mM) 15 ㎖ 가하여 현탁 후, 비스코자임 50 ㎕을 가하여 50 ℃에서 12 시간 동안 가수분해를 행하였다. 그 후 곧바로 끓는 물에서 10 분간 가열처리하여 효소 활성을 제거하고 15 ㎖ 의 에탄올을 추가로 첨가한 후 50 ℃의 항온 수조에서 2 시간 동안 추출하였다. 추출 완료 후, 냉각시키고 3,500 rpm 및 4 ℃에서 15 분간 원심 분리하여 상등액을 수득 및 농축하여 미강 추출물을 제조하였다.

제조예 2.

효소로 터마밀을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 방법으로 미강 추출물을 제조하였다.

제조예 3.

효소로 셀루클라스트를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 방법으로 미강 추출물을 제조하였다.

제조예 4.

효소로 아밀로글루코시데이즈(AMG)를 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 방법으로 미강 추출물을 제조하였다.

제조예 5.

효소로 울트라플로 L을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 방법으로 미강 추출물을 제조하였다.

제조예 6.

효소로 펜토판을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1의 방법으로 미강 추출물을 제조하였다.

대조군

대조군으로는 효소 처리를 하지 않고 제조예 1의 방법으로 미강 추출물을 제조하였다.

시험예 1. 미강 추출물의 항산화 활성 평가

항산화력을 나타내는 DPPH 라디칼 소거 능력 특정은 Cheng 등(Cheng LM, Cheng PCK, Ooi VEC. Antioxidant activity and total polyphenolics of edible mushroom extracts. Food chem. 2003;81:249-255.)의 방법을 변형하여 실행하였다.

농도가 1000 ppm인 미강 추출물 500 ㎕에 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 시약(6 X 10^-5 mol/L in Ethanol) 500 ㎕를 가하여 30분간 암실에서 반응시킨 뒤 UV-Vis spectrometer를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화력은 μM Trolox equivalent/g미강(Rice bran)으로 나타내었고, 이를 하기 표 2에 나타내었다.

구분	스팀처리(h)	DPPH assay	구분	스팀처리(h)	DPPH assay
대조군	0	54.91	제조예 4	0	80.35
	12	55.19		12	81.91
	24	58.63		24	90.07
	36	63.25		36	98.18
	48	75.93		48	108.45
	60	71.68		60	105.26
제조예 1	0	68.66	제조예 5	0	80.42
	12	69.15		12	82.51
	24	78.93		24	105.04
	36	84.26		36	112.97
	48	92.19		48	120.25
	60	89.00		60	116.94
제조예 2	0	66.55	제조예 6	0	88.38
	12	68.15		12	90.01
	24	79.65		24	98.93
	36	87.48		36	115.96
	48	94.39		48	145.34
	60	93.93		60	134.91
제조예 3	0	82.64
	12	83.96
	24	98.15
	36	104.93
	48	109.55
	60	106.28

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 제조예에서 스팀처리를 하지 않은 경우에는 DPPH 라디칼 소거 능력이 스팀처리구에 비하여 낮은 것을 확인할 수 있으며, 스팀시간의 증가가 DPPH 라디칼 소거 능력을 향상시키는데 기여하는 것을 확인할 수 있다. 특히, 펜토판을 이용한 제조예 6의 미강 추출물은 48시간 스팀처리한 실험군에서 DPPH 라디칼 소거 능력능력이 큰 폭으로 향상되었다.

한편, 12시간 동안 스팀처리한 실험군에서는 DPPH 라디칼 소거 능력 증가가 낮았으며, 60시간 동안 스팀처리한 실험군에서는 48시간 동안 스팀처리한 실험군에 비하여 DPPH 라디칼 소거 능력이 오히려 감소하는 것을 확인하였다. 이에, 24 시간 내지 50 시간의 스팀처리가 DPPH 라디칼 소거 능력이 향상된 미강 추출물을 얻을 수 있는 방법임을 확인하였다.

또한, 대조군과 제조예 1 내지 6을 비교하면, 효소를 처리하지 않은 대조군이 효소 처리된 제조예 1 내지 6에 비하여 DPPH 라디칼 소거 능력이 현저히 낮은 것을 확인하였으며, 제조예 3 내지 6의 미강 추출물이 DPPH 라디칼 소거 능력이 특히 우수함을 확인하였다.

시험예 2. 총 폐놀류 함량

총 페놀류 함량은 Folin & Ciocalteu 시약을 이용하는 방법에 따라 측정하였다(George S, Brat P, Alter P, Amiot MJ. Rapid determination of polyphenols and vitamin C in plant-derived products. J Agric Food Chem. 2005;53:1370-1373). 농도가 1000 ppm인 미강 추출물 200 ㎕에 Folin & Ciocalteu reagent 800 ㎕를 가하고, 10분 후에 7.5 % Na₂CO₃ 용액 2 ml을 추가하였다. 그 후, 90 분간 암실에서 반응시킨 후 765 nm에서 UV-Vis spectrometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 총 페놀류 함량은 mg Gallic acid equivalents(GAE)/g미강(Rice bran)으로 나타내었고, 이를 하기 표 3에 나타내었다.

구분	스팀처리(h)	총페놀류 (mg GAE/g)	구분	스팀처리(h)	총페놀류 (mg GAE/g)
대조군	0	6.80	제조예 4	0	9.38
	12	7.48		12	9.42
	24	10.00		24	10.26
	36	9.90		36	10.45
	48	11.63		48	13.59
	60	10.29		60	12.18
제조예 1	0	9.26	제조예 5	0	9.82
	12	9.33		12	9.91
	24	10.02		24	10.41
	36	10.10		36	10.55
	48	13.24		48	13.63
	60	11.23		60	10.98
제조예 2	0	7.37	제조예 6	0	10.17
	12	8.16		12	10.24
	24	10.15		24	10.47
	36	10.29		36	11.38
	48	11.42		48	16.97
	60	9.98		60	12.85
제조예 3	0	9.66
	12	9.72
	24	10.16
	36	10.38
	48	13.99
	60	11.29

표 3을 참고로 하면, 대조군과 상업용 효소를 처리한 제조예 1 내지 6의 미강 추출물의 총 페놀류 함량은 효소의 종류에 따라서 용출되는 페놀성 화합물의 함량 차이가 크게 발생하였다. 스팀 미처리시, 총 페놀류의 함량은 효소의 첨가 여부 및 효소의 종류에 따라 6.80 내지 10.71 mg GAE/g 을 나타내었다. 가수분해 효소로 터마밀을 사용한 제조예 2는 대조군과 유의적 차이를 나타내지 않았으며, 오히려 장시간의 스팀처리는 대조군보다 낮은 총페놀류 함량을 나타내었다.

한편, 펜토판, 셀루클라스트, AMG, 울트라플로L 및 비스코자임으로 처리한 미강 추출물에서는 총페놀류 함량이 유의적으로 증가하였다. 또한, 스팀 처리 시간의 증가에 따라 총 페놀류 함량이 증가하였으며, 특히, 스팀처리 36 내지 48시간 구간에서 매우 큰 폭으로 증가하였다. 마찬가지로, 60 시간의 스팀처리에서는 오히려 총페놀류의 함량이 저하되는 결과를 확인하였다.

대조군을 참고로 하면, 스팀처리 24시간까지는 효소의 처리 없이도 총 페놀류의 함량이 꾸준히 증가하였는데, 이는 열처리 과정 중 진행된 마이야르(maillard reaction)에 의해 새로 생성된 반응물에 의한 결과로 추측된다. 그러나, 스팀 처리시간이 24시간을 초과하는 경우에는 총 페놀류의 증가가 미미한 반면, 효소를 첨가하는 경우에는 총페놀류가 큰 폭으로 증가시킬 수 있어, 본 발명에 따라 미강을 스팀 처리 후, 가수분해효소로 분해하는 것이 총 페놀류의 함량을 증대시킨 추출물을 제조할 수 있는 방법임을 확인하였다.

시험예 3. 폐놀산 분석

효소 처리에 따른 미강 추출물의 총 페놀류 중의 페놀산(phenolic acid) 함량을 HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용하여 측정하였다. 비교예와 제조예 3, 5 및 6를 70 ℃에서 스팀처리(12, 24, 36, 48 및 60 시간)한 뒤, 총 페놀산의 함량을 확인하였으며, 총 페놀산 함량은 ㎍/g 미강으로 나타내었고, 이를 하기 표 4에 나타내었다.

구분	스팀처리(h)	총페놀산(㎍/g 미강)
대조군	0	205.78
	12	212.68
	24	334.61
	36	379.36
	48	433.36
	60	398.25
제조예 3	0	329.34
	12	340.26
	24	487.32
	36	526.71
	48	577.67
	60	530.17
제조예 5	0	345.35
	12	351.19
	24	564.98
	36	585.17
	48	729.09
	60	695.98
제조예 6	0	468.93
	12	476.69
	24	560.61
	36	926.87
	48	2426.47
	60	1954.48

표 4를 참고로 하면, 스팀처리를 통하여 미강 추출물 중의 총 페놀산의 함량이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 스팀 처리 12시간 이하에서는 스팀 미처리(0 h)경우와 유의적 차이가 없었으나, 24시간 내지 48시간 처리 구간에서는 총 페놀산의 함량이 큰 폭으로 증가되어 스팀을 처리하지 않은 경우에 비하여 2 내지 5배 향상되는 결과가 나타났다. 그러나 스팀처리가 60 시간 이상 지속되는 경우에는 총 페놀산의 함량이 오히려 감소하는 결과가 나타났다.

한편, 효소로 상용효소인 펜토판을 사용하는 경우에는 다른 효소에 비하여 더욱 우수한 결과를 나타내었는데, 48시간 스팀처리 시 미강 추출물의 총 페놀산이 2426.47 ㎍/g 미강으로 나타나, 스팀 미처리에 비하여 5배나 증가된 결과를 나타내었다. 이에 48시간 동안 스팀처리한 제조예 6의 미강추출물에 대하여 페놀산 성분 분석을 하였으며, 스팀 및 효소를 처리하지 않은 경우와 비교하여 이를 하기 표 5에 나타내었다.

구분	대조군(스팀미처리)	제조예6(스팀48시간 처리)
Gallic acid	1.43	22.77
Protocathechuic acid	31.59	61.03
OH-Benzoic acid	40.41	101.79
Vanilic acid	7.46	174.76
Syringic acid	1.59	17.29
Chlorogenic acid	1.33	5.46
p-Coumaric acid	50.96	241.62
Ferulic acid	70.96	1801.45
Sinapic acid	0.26	0.30
합계	205.57	2426.47

앞에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 미강을 스팀처리 후, 가수분해효소로 처리하면 무처리(스팀 및 효소 미처리)한 경우에 비하여 약 12배의 페놀산 성분을 수득할 수 있었으며, DPPH 라디칼 소거능에 있어서도 3배가량을 향상시킬 수 있었다. 이는 스팀 처리에 의해 단단했던 미강 조직이 성겨져서 효소의 접근성이 높아졌으며, 효소에 의해 섬유와 섬유 간의 결합 또는 섬유와 유용성 성분간의 결합이 끊겨 페놀산의 용출이 더욱 증가된 결과이다.

시험예 4. 스팀처리 온도에 따른 활성 평가

스팀처리 시 미강 주변의 대기 온도에 따른 영향을 알아보기 위하여, 50, 60, 70, 80 및 90 ℃로 미강을 48 시간 동안 스팀처리한 뒤, 비교예의 방법으로 미강 추출물의 생리활성을 평가하였으며, 이를 하기 표 6에 나타내었다.

(단위: DPPH 라디칼 소거능 = μM Trolox equivalent/g미강(Rice bran), 총 페놀류 = mg GAE/g 미강)

구분	미처리	50℃	60℃	70℃	80℃	90℃
DPPH 라디칼 소거능	54.91	57.33	73.49	75.93	76.81	63.24
총 페놀류	6.81	8.28	11.12	11.63	11.87	9.28

표 6에 나타낸 바와 같이, 스팀처리 온도가 50 ℃인 경우에는 미처리한 경우와 유의적 차이가 없었으며, 90 ℃로 처리한 경우에는 오히려 DPPH 라디칼 소거능 및 총 페놀류의 함량이 줄어드는 것으로 확인되어 스팀 처리온도는 60 내지 80 ℃에서 수행되는 것이 바람직한 것임을 확인하였다.

시험예 5. 피부 미용 기능성 활성 평가

시험예 5.1 FRAP ( Ferric - reducing antioxidant power ) 측정

항산화력을 나타내는 FRAP(Ferric-reducing antioxidant power)은 Tabariki & Nateghi의 방법(Tabariki & Nateghi. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of natural antioxidants from rice bran using response surface methodology. Ultrasonics Sonochemistry. 2011;18:1279-1286.)을 변형하여 실행하였다. FRAP reagent는 25 ㎖ acetate buffer(300 mM, pH 3.6)를 37 ℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma Chemical co., st. Louis, MO, USA) 2.5 ㎖을 가하여 제조하였다. 제조된 0.9 ㎖ FRAP reagent에 농도가 1000 ppm인 미강 추출물 0.03 ㎖과 증류수 0.09 ㎖을 넣은 후 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 증류수를 넣어 측정하였다. 항산화력은 μM Trolox equivalent/g미강(Rice bran)으로 나타내었고, 이를 하기 표 7에 나타내었다.

구분	대조군	제조예 3		제조예 5		제조예 6
스팀처리(h)	0	0	48	0	48	0	48
항산화력	6.27	8.68	10.28	8.72	11.19	8.93	15.12

표 7에 나타낸 바와 같이, 효소처리를 하는 경우 대조군에 비하여 항산화력이 크게 증가되는 것을 확인하였으며, 특히, 효소처리 전 스팀처리를 하는 경우 항산화력이 크게 증대되는 것을 확인하였다.

시험예 5.2 티로시나제 ( tyrosinase ) 활성 억제능

멜라닌은 동식물과 미생물계에 널리 존재하는 고분자 색소로, 페놀류의 효소 반응 및 산화와 중합 등 여러 단계를 거쳐 합성된다. 기미, 주근깨 등 피부에 생기는 색소 침착은 표피 내에서의 멜라닌 색소 증가에 기인한다. 멜라닌의 주된 생성 과정에서 결정적으로 중요한 핵심 효소는 티로시나제로, 미백 화장품의 원료 개발에 있어서 티로시나제의 활성 억제 능력은 매우 중요하다.

티로시나제 활성 억제는 Mason와 Peterson(Mason HS, Peterson EW, Melanoproteins I. Reactions between enzyme-generated quinones and amino acids. Biochem Biophys Acta. 1965;111:134-146)의 방법을 이용하여 측정하였다. 0.1 M의 potassium phosphate buffer(pH 6.8) 70 ㎕에 1000 ppm의 미강 추출물 20 ㎕와 mushroom tyrosinase 용액 30 ㎕을 가하고 30 ℃에서 5 분간 반응시켰다. 반응 후 dimethylsulfoxide(DMSO) 용액 100 ㎕을 가하고 492 nm에서 15 분 동안 1분 간격으로 흡광도를 측정하였으며, 10 분 동안 티로시나제 활성 억제 능력은 하기 [식 1] 같이 계산하여, 이를 하기 표 8에 나타내었다

[식 1]

티로시나제 활성 억제능 (%) = [(A-B)-(C-D)]/(A-B) X 100

A; with tyrosinase but without sample

B; without sample and tyrosinase

C; with sample and tyrosinase

D; with sample but without tyrosinase

구분	대조군	제조예 3		제조예 5		제조예 6
스팀처리(h)	0	0	48	0	48	0	48
티로시나제 활성 저해능 (%)	18.49	32.02	42.29	33.73	35.10	33.81	47.89

표 8에 나타낸 바와 같이, 효소 처리된 제조예가 대조군에 비하여 티로시나제 활성 저해능이 증가하였으며, 스팀처리한 후 효소를 처리한 경우 티로시나제 활성 저해능이 2배 이상 증가되는 것을 확인하였다. 특히, 효소로 펜토판을 이용하는 경우에는 티로시나제 활성 저해능이 대조군에 비하여 약 2.6배가량 증가되는 것으로 나타난 바, 상기 조건으로 제조된 미강 추출물이 미백 기능성 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

시험예 5.3 엘라스타제 ( elastase ) 활성 억제능

엘라스타제는 주름 생성 및 피부 탄력과 관련이 있다. 엘라스타제의 활성 억제는 James 등(James AEK, Timothy DW, Gordon L. Inhibition of human leukocyte and porcine pancreatic elastase by homologues of bonice pancreatic trypsin inhibitor. Biochem. 1996;35:9090-9096)의 방법을 이용하여 측정하였다. 0.2 M의 Tris-HCl buffer(pH 8.0)와 10 ㎍/㎖의 porcine pancreatic elastase(PPE) type Ⅳ(Sigma-Aldrich., ST. Louis, USA)을 각각 0.5 ㎖을 가하여 혼합한 후 25 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 반응 후 0.8 mM의 N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide(Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, Bachem Feinchemikalien AG., Budendorf, Switzerland)을 1.0 ㎖을 가하고 37 ℃에서 반응시킨 후 214 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 엘라스타제 활성 억제능은 식 2의 방법으로 계산하여, 이를 하기 표 9에 나타내었다.

[식 2]

엘라스타제 활성 억제 능력 (%) = (A-B)/A X 100

A; with elastase but without sample

B; with sample and elastase

구분	대조군	제조예 3		제조예 5		제조예 6
스팀처리(h)	0	0	48	0	48	0	48
엘라스타제 활성 저해능 (%)	14.79	19.21	33.84	20.24	35.10	22.43	38.32

표 9에 나타낸 바와 같이, 효소 처리된 제조예가 대조군에 비하여 엘라스타제 활성 저해능이 증가하였으며, 스팀처리한 후 효소를 처리한 경우 티로시나제 활성 저해능이 2배 이상 증가되는 것을 확인하였다. 특히, 효소로 펜토판을 이용하는 경우에는 엘라스타제 활성 저해능이 대조군에 비하여 약 2.6배가량 증가되는 것으로 나타난 바, 상기 조건으로 제조된 미강 추출물이 항주름 효과가 있으며, 주름개선 또는 예방용 기능성 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

Claims

1) 스팀처리 장치에 미강을 투여하고 스팀처리하는 단계;
2) 스팀처리된 미강을 세포벽 분해효소, 전분 분해효소 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 가수분해효소로 가수분해하는 단계;
3) 상기 가수분해효소를 실활시키는 단계; 및
4) 상기 가수분해된 미강을 물, 탄소수 1 내지 4의 알콜 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 용매로 추출하는 단계;를 포함하는 미강 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서,
상기 1) 단계의 스팀처리는 스팀처리 장치 내부 온도를 60 내지 80 ℃로 유지하며 24 내지 50 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 미강 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서,
상기 세포벽 분해효소는 셀룰라아제, 펙티나아제, 헤미셀룰라아제, 아라비나아제, 베타-글루카나아제 및 자일란나아제 중에서 선택되는 1종 이상이며,
상기 전분 분해효소는 아밀라아제 및 아밀로글루코시다아제 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미강 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서,
상기 2) 단계는 25 내지 60 ℃로 2 내지 24 시간 동안 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 미강 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서,
상기 2) 단계는 미강 100 중량부에 대하여 가수분해효소 0.1 내지 20 중량부로 첨가되는 것을 특징으로 하는 미강 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서,
상기 4) 단계는 30 내지 80 ℃ 온도 범위에서 1 내지 12 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 미강 추출물의 제조방법.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 미강 추출물.

미강 효소 분해 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미용 기능성 화장료 조성물로서, 상기 미강 효소 분해 추출물은 미강을 스팀처리 후, 세포벽 분해효소, 전분 분해효소 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 가수분해효소로 분해시킨 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제8항에 있어서,
상기 피부미용 기능성은 피부미백 활성, 주름개선, 항산화 및 항노화로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제9항에 있어서,
상기 화장료는 스킨, 유액, 에센스, 로션, 미용액, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제9항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방향제, 보존제, 중화제, 에몰리언트제, 피부보호제 및 피부컨디셔닝제로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.