KR20160112485A

KR20160112485A - 엔테로박테리아세아 유래 세포 투과 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160112485A
Application number: KR1020150038282A
Authority: KR
Inventors: 현성희; 김민준; 강상순
Original assignee: 을지대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2016-09-28
Also published as: KR101705603B1

Abstract

본 발명은 세포투과성 기능이 있는 엔테로박테리아세아 과로부터 유래된 OmpA를 포함하는 운반체에 관한 것으로, 세포의 손상 없이 다양한 물질을 세포막을 투과하여 세포 내로 이동시킬 수 있는 운반체 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.

Description

엔테로박테리아세아 유래 세포 투과 단백질 및 이의 용도{cell-penetrating protein from enterobacteriacea and use thereof}

본 발명은 세포 투과 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 엔테로박테리아세아(enterobacteriacea) 과(familly)로부터 유래한 OmpA 단백질은 세포막을 파괴하지 않고 여러 물질을 세포질이나 핵에 전달할 수 있으며, 세포 내 물질의 전달을 요하는 실험 및 약물 전달을 통한 질병 치료 등 다양한 분야에 응용될 수 있다.

진핵세포의 세포막은 친소수성의 이중지질막으로 구성되어 있다. 친수성 물질은 세포막을 통과하여 세포질 또는 핵으로까지 이동하기 위해서는 특별한 기전이 필요하다. 특히 친수성 잔기를 가진 큰 단백질 또는 펩티드는 대부분 세포내로 전달되기 어렵고, 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포질로 전달될 수 있으나 이 경우 세포질에서 라이소좀에 의해 분해되는 것이 일반적이다.

세포내로 여러 물질을 전달하는 문제를 해결하기 위해서 물리, 화학적, 생물학적 방법 및 다양한 전달체에 대한 연구가 이루어져 왔으나 세포막의 파괴, 세포 내 면역작용, 세포 독성, 전달 물질의 조절, 목표 위치에 도달의 어려움 등 여전히 극복해야 할 문제가 남아있었다. 최근에는 짧은 아미노산으로 구성된 다양한 세포 투과성 펩티드(cell-penetrating peptide, CPP)를 발견 및 개발하여 연구에 활용하고 있다.

세포투과성 펩티드는 다양한 단백질을 세포내로 전달할 수 있는 유용한 수단이기는 하나, 전달하고자 하는 물질과의 결합 및 세포의 종류에 따른 세포 투과정도는 세포투과성 펩티드의 아미노산 서열 및 구조에 의해 제한될 수 있다. 또한 세포투과성 펩티드를 포함한 융합 단백질 등 여러 운반체 및 운반 방법에 대한 연구도 활발히 이뤄지고 있다.

본 발명은 세포투과성 펩티드를 다수 포함하는 세포투과성 단백질에 관한 것으로서 특별한 화학적 결합이 없어도 다양한 물질을 세포 내로 이동시킬 수 있으며, 세포투과성 펩티드의 기능이 억제되더라도 세포 내로 물질을 전달시킬 수 있어 유용한 전달체로 다양한 분야에서 응용될 수 있다.

대한민국 등록특허 1444197

본 발명은 엔테로박테리아세아(enterobacteriaceas) 과(family)로부터 유래된 세포투과성 기능을 가진 OmpA 단백질이 외래 물질과 결합하여 세포막을 투과하는 것을 특징으로 하는 OmpA 및 이를 포함하는 세포막 투과용 운반체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 엔테로박테리아세아(enterobacteriaceas) 과(family)로부터 유래된 OmpA 단백질을 포함하는 형질전환용 운반체를 제공하는 것이다.

본 발명은 엔테로박테리아세아(enterobacteriacea) 과(family)로부터 유래된 OmpA 단백질이 외래 물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과용 운반체를 제공한다.

본 발명은 엔테로박테리아세아(enterobacteriacea) 과(family)로부터 유래된 OmpA 단백질이 외래 물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체를 제공한다.

본 발명에 따른 OmpA를 포함한 운반체는, 일반적으로 세포막을 투과할 수 없는 친수성 거대 분자, 단백질, 펩티드, 핵산 및 약물 등을 세포를 손상시키거나 세포독성을 일으키지 않고 효율적으로 세포 내로 이동시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 다양한 물질을 세포 내로 이동시켜 이를 통한 여러 가지 실험을 위한 연구 목적의 달성 및 질병의 치료, 진단에 유용하게 응용하여 다방면의 산업분야에 이용될 수 있다.

도 1은 KpOmpA와 상호작용하는 인간 유래 단백질들을 분석한 결과로, 23개의 양성 클론이 확인되었고 이 중에서 9개의 단백질이 확인되었으며, 최종적으로 게놈 콘티그와 스캐폴드를 제외한 페리틴, 글루쿠로니다아제, 알돌레이즈 및 셀렌단백질 4개의 인간 유래 단백질이 KpOmpA와 상호작용하는 단백질인 것으로 분석되었다.
도 2는 KpOmpA와 페리틴의 상호작용을 면역침전법 및 히스 풀-다운 분석한 결과이다.
도 3은 HEp-2 세포에서 세포투과성을 확인하기 위하여 KpOmpA 및 이와 상호작용하는 페리틴의 위치를 관찰한 결과이다.
도 4는 세포투과성 억제물질인 사이토칼라신 D를 처리한 HEp-2 세포에서 야생형의 KpOmpA 및 돌연변이 KpOmpA의 세포투과성을 확인한 결과이다.
도 5는 KpOmpA에서 CPP인 TAT의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 6은 KpOmpA에서 CPP인 RDT의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 7은 KpOmpA에서 CPP인 FGF4의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 8은 KpOmpA에서 CPP인 RVG의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 9은 KpOmpA에서 Penetratin인 TAT의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 10은 KpOmpA에서 CPP인 SynB3의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 11은 KpOmpA에서 CPP인 SynB1의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 12은 KpOmpA에서 CPP인 SynB5의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 13은 KpOmpA에서 CPP인 Angiopep-2의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 14은 KpOmpA에서 CPP인 Angiopep-5의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 15은 KpOmpA에서 CPP인 (RXRRBRR)2XB의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 16은 KpOmpA에서 CPP인 HC의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 17은 KpOmpA에서 CPP인 TP의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 18은 KpOmpA에서 CPP인 TP10의 염기서열과 상보적인 부분을 나타낸 것이다.
도 19는 HEp-2 세포에서 OmpA에 의한 세포투과성을 확인하기 위하여 GUSB유전자를 OmpA와 함께 전달하여 GUSB의 유전자 발현위치를 관찰한 결과이다.

이하에서 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서 전체에서 새롭게 정의하지 않는 용어는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진자가 이해할 수 있는 의미로 해석되는 것이 바람직하며, 본 발명에 대한 설명 및 도면에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 공지의 내용은 기재하지 않을 수 있다.

OmpA 단백질은 그람 음성 박테리아의 주요 외막단백질(Outer Membrane proetin) 중 하나로 박테리아의 동일 과(family)에 매우 잘 보존되어 있는 단백질에 해당하며, 주로 세포의 면역 반응을 유도하는 단백질 및 사이토카인 발현을 증가시킨다고 알려져 있다.

본 발명에서는 OmpA의 세포투과성 기능을 새롭게 밝히고, OmpA가 다른 여러 물질과 결합하여도 세포투과성이 유지되며 결합한 물질과 함께 세포막을 투과할 수 있는 특징을 이용하여 다양한 물질이 세포막을 투과하여 이동될 수 있는 세포막 투과용 운반체를 제공한다.

본 발명에서 세포투과성이란 세포막을 투과하여 이동할 수 있는 성질을 의미하며, 세포막은 세포외부와 세포의 경계를 결정하는 막 뿐만 아니라 세포 내에 포함되어 있는 세포소기관들의 막까지 의미하는 것은 자명한 것이다.

본 발명에서 CPP(cell penetrating peptide)는 일반적으로 10 내지 30개 정도의 짧은 아미노산으로 구성되어 있는 펩티드로서 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포질이나 핵에 도달할 수 있는 물질로서 다양한 CPP가 알려져있다.

본 발명에서 세포투과성 기능을 가지는 OmpA는 엔테로박테리아세아 과에 속하는 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)으로부터 유래되는 OmpA인 KpOmpA가 바람직하나 OmpA는 동일 과에서 널리 보존되어 있는 단백질이므로 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 OmpA의 세포투과성 기능은 CPP(cell penetrating peptide) 및 명확하지 않으나 OmpA가 지니고 있는 특이적인 세포막 투과 기작을 통해 일어나는 것으로 보인다.

구체적으로, CPP는 세포투과성 기능을 지닌 물질 또는 서열로서 이와 결합한 다른 물질을 세포 내로 이동시킬 수 있어 OmpA에 포함된 CPP도 이와 같은 기능을 하여 OmpA가 세포투과성 기능을 가지는데 도움을 주는 것으로 보인다.

또한, 본 발명에서 OmpA는 CPP의 활성이 억제되어 있는 환경 또는 CPP를 불활성 시키는 처리를 하여도 외래 물질과 결합 또는 외래 물질을 코팅하는 방식으로 세포 내로 투과시킬 수 있으므로 OmpA의 세포투과성은 CPP에만 의존하는 것은 아니며, CPP를 포함하고 있어 보다 효율적으로 세포 내로 물질을 이동시킬 수 있는 것으로 보인다.

본 발명의 일 실시예에서 KpOmpA는 서열번호 1의 DNA 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어져 있고, 세포투과성 기능을 나타내는 CPP를 다수 포함하고 있다. 서열번호 2는 KpOmpA의 아미노산 서열이고, 14개의 CPP와 동일하거나 상동성(homology)을 가지는 부분이 존재한다. 구체적으로, CPP인 TAT의 아미노산 서열인 YGRKKRRQRRR(서열번호 3)과 상동성인 부분이 존재하고(도 5), CPP인 RDP의 아미노산 서열인 KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG(서열번호 4)와 상동성인 부분이 존재하고(도 6), CPP인 FGF4의 아미노산 서열인 AAVLLPVLLAAP(서열번호 5)와 동일한 부분이 존재하고(도 7), CPP인 RVG의 아미노산 서열인 YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(서열번호 6)과 상동성인 부분이 존재하고(도 8), CPP인 penetratin의 아미노산 서열인 RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 7)와 동일한 부분이 존재하고(도 9), CPP인 SynB3의 아미노산 서열인 RRLSYSRRRF(서열번호 8)과 상동성인 부분이 존재하고(도 10), CPP인 SynB1의 아미노산 서열인 RGGRLSYSRRRFSTSTGR(서열번호 9)와 상동성인 부분이 존재하고(도 11), CPP인 SynB5의 아미노산 서열인 RGGRLAYLTTTWAVLGR(서열번호 10)과 상동성인 부분이 존재하고(도 12), CPP인 Angiopep-2의 아미노산 서열인 PFFYGGSGGNRNNYLREEY(서열번호 11)과 상동성인 부분이 존재하고(도 13), CPP인 Angiopep-5의 아미노산 서열인 RFFYGGSTGKRNNFRTEEY(서열번호 12)와 상동성인 부분이 존재하고(도 14), CPP인 (RXRRBR)2XB인 RXRRBRRXRRBRXB(서열번호 13)과 상동성인 부분이 존재하고(도 15), CPP인 HC의 아미노산 서열인 QYIKANSKFIGITEL(서열번호 14)와 상동성인 부분이 존재하고(도 16), CPP인 TP의 아미노산 서열인 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(서열번호 15)와 상동성인 부분이 존재하고(도 17), CPP인 TP10의 아미노산 서열인 AGYLLGKINLKALAALAKKIL(서열번호 16)과 상동성인 부분이 존재한다(도 18).

상기와 같이 KpOmpA에 포함된 상기 서열번호 3 내지 16으로 이루어진 CPP중 어느 하나 이상에 의해 세포의 세포막을 통과하여 세포질이나 핵에 여러 물질을 이동시킬 수 있다. 또한, KpOmpA에 상기 서열번호 3 내지 16으로 이루어진 CPP가 포함되어 있는 것을 통해 엔테로박테리아세아 과에 속하는 다른 박테리아의 OmpA에도 상기 본 발명 일 실시예의 서열번호 3 내지 16으로 이루어진 CPP 중 어느 하나 이상뿐만 아니라 다른 CPP도 다수 포함되어 있을 수 있고, 이를 통해 다양한 물질을 이동시킬 수 있다.

본 발명에서 OmpA의 특징인 세포투과성은 CPP를 포함하고 있으나, CPP에 의존적으로 세포투과성 기능을 가지는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, KpOmpA에 CPP를 억제하는 물질을 처리하였을 경우에도, 상기 KpOmpA는 여전히 세포투과성 기능을 유지하며 여러 단백질을 세포막을 투과하여 이동시킬 수 있는 것이 확인되었다.

OmpA의 세포투과성 기능의 정확한 메커니즘은 불분명하나, 세포투과성 기능이 CPP에 의존적인 것은 아니며, CPP의 활성 및 OmpA가 소수성 성질을 가지고 자발적으로 서로 응집할 수 있는 성질이 함께 세포투과에 있어 상승효과로 작용하고 다양한 외래 물질을 세포 내로 이동시킬 수 있는 것으로 보인다.

OmpA는 다른 여러 물질과 결합하거나 서로 응집하면서 여러 물질을 코팅하는 형상을 이룰 수 있고, 상기와 같은 상태에서도 세포투과성 기능이 유지되기 때문에 in vivo 및 in vitro에서 다양한 외래 물질을 세포 내로 이동시킬 수 있으며, 이동 간에 세포에 손상을 주지 않아 매우 효과적인 세포 내 물질 이동의 수단이 될 수 있다.

본 발명에서 외래 물질은 주로 세포막의 투과가 용이하지 않은 물질을 의미하며, 바람직하게는 친수성 거대 분자, 단백질, 핵산, DNA, RNA, 펩티드 또는 약물을 의미하며 OmpA의 세포투과성 기능에 의해 이들 물질들이 세포내로 용이하게 이동될 수 있다.

구체적으로, 형질전환을 위해 필요한 세포의 화학적 또는 물리적인 처리의 필요 없이 플라스미드 DNA등을 OmpA에 의해 직접 세포내로 도입시켜 형질전환을 유도할 수 있으며 또한, 특별한 벡터 등을 사용하지 않고 OmpA를 이용해 여러 핵산 물질을 세포내로 이동시킬 수 있어 OmpA를 포함한 운반체를 이용한 형질전환도 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 인간유래 단백질 중 페리틴(Ferritin), 글루쿠로니다아제(Glucuronidase), 알돌라아제(Aldolase), 셀렌단백질(Selenoprotein)가 OmpA와 결합하는 것을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면 유전자가 도입된 플라스미드 DNA가 OmpA와 결합하여 세포내로 도입되어 유전자가 발현되는 것을 통해 OmpA를 통한 형질전환이 가능한 것을 확인하였다.

본 발명에서 결합이란 친수성 거대 분자, 단백질, 펩티드, 핵산과 같은 물질과 화학적, 물리적, 전기적 또는 유전적인 방법을 통해 결합되어 있는 것만이 아니라, OmpA가 서로 응집하면서 상기 물질들의 외부를 코팅하여 쉘과 같은 구조를 형성하는 방식의 결합도 포함한다.

본 발명은 OmpA를 포함하는 운반체를 제공하는 것으로서, OmpA의 세포투과성에 의해 다양한 외래 물질을 세포 내로 이동시킬 수 있다. 운반체는 OmpA를 포함하는 여러 융합단백질, 키트, 벡터 등으로 이용할 수 있으며, 공지의 분자생물학 기술에 의해 다양하게 제작 및 응용될 수 있다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하며, 실시예는 본 발명의 실시를 위한 설명 및 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예로 한정되거나 제한되어 해석되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

클로닝( Cloning )

폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae) ATCC 17883로부터 OmpA(Outer Membrane Protein A) 유전자를 PCR 기반 클로닝 방법을 사용하여 클로닝하였다. Klebsiella pneumoniae 게놈 DNA 조각을 주형으로 정방향 프라이머 (5'-CCA AGA ATT CAT GAA AAA GAC AGC TAT CGC-3'), 역방향 프라이머(5'-AAC CGT CGA CAA GCC GCC GGC TGA GTT AC-3')를 사용하였다. PCR 산물은 EcoRI 및 Sa1I 처리 후 pEGFP-C2 플라스미드 벡터에 라이게이션 하여 제조합벡터 OmpA-pEGFPC2를 제조하였다.

OmpA 와 상호작용하는 단백질 분석

효모 단백질 잡종법(yeast two hybridization)을 통해 Klebsiella pneumoniae OmpA(KpOmpA)와 상호작용하는 인간 단백질을 스크리닝하였다.

Klebsiella pneumoniae OmpA가 베이트(bait)로 융합된 플라스미드를 OmpA-pGBKT7으로 명명하였다. 인간의 간 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로 매치메이커 골드 이스트 투-하이브리드 시스템(Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid systerm)을 사용(Clontech, Palo Alto, CA, USA)하여 OmpA와 상호작용하는 단백질을 스크리닝 하였다. 이스트 균주 AH109에 베이트 플라스미드 OmpA-pGBKT7을 형질전환하고 약 2x10³ 형질전환체를 스크리닝하였다. 형질전환체를 높은 선택배지상에서 선택하여 MEL1 활성화에 대해 분석하였다: SD(syntheric defined) 배지 -Ade/-Hid/-Leu/-Trp/X-gal. 자이모프렙 키트(Zymoprep kit)를 사용(Clontech, Palo Alto, CA, USA)하여 양성 이스트 클론으로부터 프레이(prey) 플라스미드를 분리하였고, 엠피실린 100㎍/㎖ 첨가된 LB배지에서 DH5α 로 재형질전환하였으며, 최종적으로 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다. 형질전환체 스크리닝 결과 23개의 양성 클론이 선택되었고(도 1), 양성 클론들의 시퀀싱 결과 9개의 단백질이 확인되었다. 9개의 단백질 중에서 4개의 단백질은 페리틴(Ferritin), 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 알돌레이즈(aldolase) 및 셀렌단백질(selenoprotein)였고 나머지는 게놈 콘티그 또는 스캐폴드에 해당하였다.

in vivo 및 in vitro 에서 OmpA 와 단백질의 상호작용 확인

in vivo에서 OmpA와 단백질의 상호작용을 확인하기 위해 Klebsiella pneumoniae OmpA를 HEp-2 세포에 형질전환하고 면역침강법(immunoprecipitation)을 실시하여 페리틴과 Klebsiella pneumoniae OmpA의 상호작용을 확인하였다.

HEp-2 세포를 10% 소태아혈청, L-글루타민 2mM, 피루브산나트륨 110mg/L, 탄산수소나트륨 및 페니실린 스트렙토마이신 100U/mL가 함유된 DMEM 배지에서 5% CO₂ 가습조건 37℃에서 배양하였다. 상호면역침전(co-Immunoprecipitation)를 수행하기 위해 OmpA-pEGFPC2를 Lipofectamine 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 HEp-2 세포에 형질전환하였다. 36시간 후, 세포를 트립신-EDTA로 채취하고 RIPA 버퍼를 사용하여 밤새 배양 용해시켰다. 용해된 세포 라이세이트(lysate)를 18000×g에서 30분 동안 원심분리하였다. 이 후 상층액을 anti-GFP 또는 anti-FTH(Ferritin heavy chain) 및 FTL(Ferritin light chain) 항체와 4℃에서 1시간 동안 로테이팅 휠에서 결합 반응시켰다. 결합반응 후, 항체가 결합된 세포 라이세이트에 protein-A/G-agarose 비드(beads) 30㎕를 첨가하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 비드를 5분간 각각 저속으로 원심분리 하면서 1㎖ RIPA 버퍼로 세 번 세척하였다. 표준 방법에 따라 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅으로 비드-결합 면역복합체를 분석하였다(Harlow and Lane, 1988). 분석결과 FTH 및 FTL 항체와 결합 및 검출된 것을 통해 in vivo에서 Klebsiella pneumoniae OmpA와 페리틴이 상호작용하는 것을 알 수 있었다(도 2A, 2B).

in vitro에서 OmpA와 단백질의 상호작용을 확인하기 위해 히스 풀-다운(His pull-down assay)을 수행하였다. His-결합 레진(Novagen, Madison, WI)에 정제된 OmpA-His 융합단백질을 고정시키고 HEp-2 세포 라이세이트를 첨가하여 분석하였다. 분석결과 페리틴은 OmpA-His와 상호작용하는 것을 확인할 수 있었다(도 2C).

OmpA 의 세포투과성 확인

OmpA-pEGFPC2로 형질전환한 HEp-2 세포 및 대조군(control)으로 pEGFPC2를 형질전환한 HEp-2 세포를 준비하고 면역형광법(Immunofluorescence) 및 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 확인하였다.

면역형광법을 위해 포-웰(four-well) 플레이트 내의 슬라이드 글라스 위에 70 내지 80%로 세포가 채워지도록 밤새 HEp-2 세포를 배양하였다. 배양 후 세포들을 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich, St Louis, USA)로 실온에서 15분간 고정시키고, 0.1% PBT로 실온에서 30분간 침투화 시켰다. 이 후 세포를 5% 소태아혈정 알부민과 함께 PBS에서 36℃, 1시간 동안 블로킹시키고, 먼저 일차 항체와 4℃, 16시간 동안 배양 후 이어서 이차 항체와 배양하였다. 마지막으로 슬라이드 상에 세포를 봉입제(mounting media) DAKO(Sigma-Aldrich, St Louis, USA) 봉하고 4℃에서 하룻밤 두고 the Carl Zeiss confocal microscopy system (Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하여 분석하였다.

분석결과 내인성 페리틴이 항-페리틴(anti-ferritin) 항체로 염색된 것을 통해 핵 주위에서 Klebsiella pneumoniae OmpA와 페리틴이 동일 영역에 위치한 것을 확인할 수 있었다(도 3A, B). OmpA-pEGFPC2 및 FTH-pDsREd2C1로 함께 연속적으로 형질전환하여 보다 선명한 결과를 확인할 수 있었다(도 3C). 또한, Klebsiella pneumoniae OmpA-His 10㎍/㎖를 Hep-2 세포에 직접처리하고 항-히스(anti-His) 단일항체로 Klebsiella pneumoniae OmpA-His의 위치 검출 및 FITC(Fluorescein　isothiocyanate) 결합된 이차 항-마우스(anti-mouse) 항체로 조사하였다. Klebsiella pneumoniae OmpA-His를 HEp-2 세포에 직접처리한 후 관찰한 결과 Klebsiella pneumoniae OmpA-His가 인공적인 벡터의 도움 없이도 HEp-2에 투과되었고, 핵 주위의 동일 위치에서 Klebsiella pneumoniae OmpA 와 페리틴이 염색되어 있는 것을 통해 내인성 페리틴과 결합한 것을 확인할 수 있었다(도 3D, E).

Klebsiella pneumoniae OmpA 에 포함된 CPP 서열분석

OmpA와 알려진 CPP와의 서열 상동성은 EMBL-EBI의 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) 사이트에서 OmpA와 각각의 CPP의 서열을 비교분석하였다.

분석결과 서열번호 2로 나타나는 Klebsiella pneumoniae OmpA의 아미노산 서열에 다수의 CPP와 상동성을 가지는 아미노산 서열이 포함되어 있었고(도 5 내지 18), 상동성을 가지는 14개의 CPP 서열을 확인하였다(표 1).

CPP 종류	아미노산 서열	서열번호
TAT	YGRKKRRQRRR	3
RDP	KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG	4
FGF4	AAVLLPVLLAAP	5
RVG	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG	6
Penetratin	RQIKIWFQNRRMKWKK	7
SynB3	RRLSYSRRRF	8
SynB1	RGGRLSYSRRRFSTSTGR	9
SynB5	RGGRLAYLTTTWAVLGR	10
Angiopep-2	PFFYGGSGGNRNNYLREEY	11
Angiopep-5	RFFYGGSTGKRNNFRTEEY	12
(RXRRBR)2XB	RXRRBRRXRRBRXB	13
HC	QYIKANSKFIGITEL	14
TP	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL	15
TP10	AGYLLGKINLKALAALAKKIL	16

OmpA 의 세포투과성이 CPP 의존인지 여부 확인

6-웰(6-Well)에서 HEp-2 세포에 CPP(cell-penetrating peptide)활성을 억제시키기 위해 사이토칼라신 D(cytochalasin D) 4㎛를 처리하고 36℃에서 1시간 동안 배양하였다. Hep-2 세포에 야생형 Klebsiella pneumoniae OmpA-His 및 돌연변이 Klebsiella pneumoniae OmpA-His로 OmpA 1-660-His와 OmpA 661-930-His을 각각 10㎍/㎖ 처리한 후 다시 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 항-히스 단일클론항체로 웨스턴 블로팅을 수행 및 밴드의 덴시토메트리(densitometry) 분석을 수행하였다. 분석결과 사이토칼라신 D를 처리한 세포 중에서 야생형 Klebsiella pneumoniae OmpA-His을 처리한 경우 38%, OmpA 1-660-His를 처리한 경우 21%, OmpA 661-930-His를 처리한 경우 30%의 투과성 감소가 나타나 Klebsiella pneumoniae OmpA에 CPP가 포함되어 있으나 세포투과가 CPP에 의해서만 일어나는 것이 아님을 알 수 있었다(도 4).

OmpA 를 이용한 DNA 형질전환

형질전환 하루 전 HEp2 세포를 60mm 배양접시(고농도 포도당 DMEM 5mL)에 세포를 분주하여 준비하였다. 150mM NaCl 300㎕에 GUSB (β-glucuronidase)유전자가 도입된 플라스미드DNA인 GUSB-pEGFPC2 3㎍과 KpOmpA-His 3㎍을 넣고 10초간 혼합하여(혼합비율, DNA 1㎍ : KpOmpA-His 1㎍ : 150mM NaCl 100㎕) A 용액을 제조하였다. 150mM NaCl 300㎕에 100mM SDC(sodium desoxycholate) 10㎕을 넣어 10초간 혼합하여 SDC가 혼합된 B 용액을 준비하였다. 상기 DNA와 KpOmpA-His가 혼합된 A 용액을 상기 SDC가 혼합된 B 용액에 혼합하여 섞어주고(vortex-mix) 상온에서 15 내지 30분간 놓아두어 혼합액을 준비하였다. 혼합액을 HEp2 세포가 배양된 60mm 배양접시에 골고루 떨어뜨린 후 상하좌우로 천천히 흔들어 주었다. 이 후 37℃, 5% CO₂에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, cold 1 X PBS 500㎕로 빠르게 2회 세척한 후 3% PFA(Paraformaldehyde) 500㎕ 첨가하여 상온에서 20분간 고정한 후 다시 cold 1 X PBS 500㎕로 빠르게 2회 세척하여 면역침전법 및 공초점 현미경 관찰을 위한 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플을 슬라이드 글라스에 봉입제(DakoCytomation Fluorescent) 4㎕을 떨어뜨려 슬라이드를 커버글라스를 봉입하여 샘플이 마를 때까지 암실에서 하루 밤 보관한 다음 면역침전법 및 공조첨 현미경을 통해 형질전환 결과를 관찰하였다. 형질전환 관찰결과 획스트(Hoechst)로 염색되어 푸른색을 나타내는 핵(도 19A) 주위에서 녹색을 나타내는 KpOmpA-His(도 19B) 및 붉은색을 나타내는 GUSB(β-glucuronidase)(도 19C)가 동일한 지점에서 확인(도 19E)되는 것을 통해 플라스미드 DNA는 KpOmpA-His를 통한 형질전환에 있어 다른 처리 없이 GUSB유전자가 도입된 플라스미드 DNA와 결합하여 HEp-2 세포내로 투과되었고 KpOmpA를 통한 형질전환이 이루어진 것을 확인하였다.

<110> EuljiUniversity <120> Cell-penetrating protein from eneterobacteriacea and use thereof <130> 1463-01 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1068 <212> DNA <213> Enterobacteriaceae <400> 1 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gcttcgctac cgtagcgcag 60 gccgctccga aagataacac ctggtatgca ggtggtaaac tgggttggtc ccagtatcac 120 gacaccggtt tctacggtaa cggtttccag aacaacaacg gtccgacccg taacgatcag 180 cttggtgctg gtgcgttcgg tggttaccag gttaacccgt acctcggttt cgaaatgggt 240 tatgactggc tgggccgtat ggcatataaa ggcagcgttg acaacggtgc tttcaaagct 300 cagggcgttc agctgaccgc taaactgggt tacccgatca ctgacgatct ggacatctac 360 acccgtctgg gcggcatggt ttggcgcgct gactccaaag gcaactacgc ttctaccggc 420 gtttcccgta gcgaacacga cactggcgtt tccccagtat ttgctggcgg cgtagagtgg 480 gctgttactc gtgacatcgc tacccgtctg gaataccagt gggttaacaa catcggcgac 540 gcgggcactg tgggtacccg tcctgataac ggcatgctga gcctgggcgt ttcctaccgc 600 ttcggtcagg aagatgctgc accggttgtt gctccggctc cggctccggc tccggaagtg 660 gctaccaagc acttcaccct gaagtctgac gttctgttca acttcaacaa agctaccctg 720 aaaccggaag gtcagcaggc tctggatcag ctgtacactc agctgagcaa catggatccg 780 aaagacggtt ccgctgttgt tctgggctac accgaccgca tcggttccga agcttacaac 840 cagcagctgt ctgagaaacg tgctcagtcc gttgttgact acctggttgc taaaggcatc 900 ccggctggca aaatctccgc tcgcggcatg ggtgaatcca acccggttac tggcaacacc 960 tgtgacaacg tgaaagctcg cgctgccctg atcgattgcc tggctccgga tcgtcgtgta 1020 gagatcgaag ttaaaggcta caaagaagtt gtaactcagc cggcggct 1068 <210> 2 <211> 356 <212> PRT <213> Enterobacteriaceae <400> 2 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Ala Gly Gly 20 25 30 Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Tyr Gly Asn Gly 35 40 45 Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln Leu Gly Ala Gly 50 55 60 Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly Phe Glu Met Gly 65 70 75 80 Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gly 85 90 95 Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro 100 105 110 Ile Thr Asp Asp Leu Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp 115 120 125 Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly Val Ser Arg Ser 130 135 140 Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly Gly Val Glu Trp 145 150 155 160 Ala Val Thr Arg Asp Ile Ala Thr Arg Leu Glu Tyr Gln Trp Val Asn 165 170 175 Asn Ile Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro Asp Asn Gly Met 180 185 190 Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu Asp Ala Ala Pro 195 200 205 Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Ala Thr Lys His 210 215 220 Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn Lys Ala Thr Leu 225 230 235 240 Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr Thr Gln Leu Ser 245 250 255 Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu Gly Tyr Thr Asp 260 265 270 Arg Ile Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser Glu Lys Arg Ala 275 280 285 Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly Ile Pro Ala Gly Lys 290 295 300 Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val Thr Gly Asn Thr 305 310 315 320 Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu Ile Asp Cys Leu Ala Pro 325 330 335 Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly Tyr Lys Glu Val Val Thr 340 345 350 Gln Pro Ala Ala 355 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-TAT <400> 3 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-RDP <400> 4 Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu 1 5 10 15 Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-FGF4 <400> 5 Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-RVG <400> 6 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-Penetratin <400> 7 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-SynB3 <400> 8 Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-SynB1 <400> 9 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-SynB5 <400> 10 Arg Gly Gly Arg Leu Ala Tyr Leu Thr Thr Thr Trp Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Arg <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-Angiopep-2 <400> 11 Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Asn Arg Asn Asn Tyr Leu Arg 1 5 10 15 Glu Glu Tyr <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-Angiopep-5 <400> 12 Arg Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Thr Gly Lys Arg Asn Asn Phe Arg Thr 1 5 10 15 Glu Glu Tyr <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-(RXRRBR)2XB <400> 13 Arg Xaa Arg Arg Asx Arg Arg Xaa Arg Arg Asx Arg Xaa Asx 1 5 10 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-HC <400> 14 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-TP <400> 15 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CPP-TP10 <400> 16 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ile Leu 20 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 ccaagaattc atgaaaaaga cagctatcgc 30 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 aaccgtcgac aagccgccgg ctgagttac 29

Claims

엔테로박테리아세아(enterobacteriacea) 과(family)로부터 유래된 OmpA 단백질이 외래 물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과용 운반체.
제1항에 있어서,
상기 OmpA는 서열번호 3 내지 16 중 어느 하나로 이루어진 CPP(cell penetrating peptide)서열을 하나 이상 포함하는 세포막 투과용 운반체.
제2항에 있어서,
상기 OmpA는 서열번호 3 내지 16 중 어느 하나로 이루어진 CPP가 하나 이상 불활성 상태로 외래 물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과용 운반체.
제1항에 있어서,
상기 OmpA는 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)으로부터 유래된 KpOmpA인 세포막 투과용 운반체.
제4항에 있어서,
상기 KpOmpA는 서열번호 2로 이루어진 세포막 투과용 운반체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 외래 물질은 친수성 거대 분자, 단백질, 핵산, DNA, RNA, 펩티드 또는 약물인 세포막 투과용 운반체.
제6항에 있어서,
상기 단백질은 페리틴, 클루쿠로니다아제, 알돌레이즈 및 셀렌단백질로 이루어진 군에서 선택되는 세포막 투과용 운반체.
엔테로박테리아세아(enterobacteriacea) 과(family)로부터 유래된 OmpA 단백질이 외래 물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 운반체.
제8항에 있어서,
상기 OmpA는 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae)으로부터 유래된 KpOmpA인 형질전환용 운반체.
제9항에 있어서,
상기 KpOmpA는 서열번호 2로 이루어진 형질전환용 운반체.