KR20160106109A - 수소영양 미생물에서 아미노산의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

수소영양 미생물에서 아미노산의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 H2 및 CO 및/또는 CO2 기체를 생물학적으로 높은 가치의 분자 및 생물학적 분자, 예컨대 필수 아미노산 (예를 들어 라이신, 트레오닌, 메티오닌), 및 동물 사료 등으로 활용 또는 전환시킬 수 있는 수소영양 미생물을 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

수소영양 미생물에서 아미노산의 생물학적 생산을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF AMINO ACIDS IN HYDROGENOTROPHIC MICROORGANISMS}
염기 서열에 관한 서술
본 출원과 관련된 염기 서열은 종이 사본 대신 텍스트 형식으로 포함되어 있으며, 명세서에 참조로 통합되었다. 염기 서열이 들어있는 텍스트 파일명은 910215_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일의 크기는 3.4 KB이며 2015년 1월 2일에 생성되어, EFS-웹을 통해 전자 방식으로 제출되었다.
아미노산은 세기가 바뀐 이후, 맛을 더 좋게 하는 글루탐산의 특징의 발견과 일본의 글루탐산 나트륨 마케팅과 함께 곧바로 상업적인 중요성을 가지게 되었다. 동물이나 사람에 의해서 합성되지 않는 (필수 아미노산이라고 일컬어지는) 아미노산을 포함하는 몇몇 아미노산은 동물 사료를 위한 첨가제로 사용되며, 사람에게는 음식 보충제로, 심각하게 아픈 환자에게 필요한 것을 제공하여 생명을 유지하게 해주는 정맥용 용액에 사용된다. 아미노산에 대한 미국 시장은 단독으로 전 세계 시장의 20%를 차지하고, 이 중 반 이상을 동물 사료 보충제가 차지하고 있으며 이는 2016년에 20억 달러를 넘어설 것으로 예상된다.
상업적으로 사용되는 아미노산은 일반적으로 다음 네 가지 방법으로 생산된다: 천연 원료로부터의 추출, 화학적 합성, 발효 및 효소 촉매 작용. 어떤 아미노산을 위해서는 아직도 추출이 사용되지만, 이제 추출은 예전보다는 덜 중요하게 여겨진다. 화학적 합성은 매우 큰 규모로 이루어질 수 있지만, 이러한 반응은 전형적으로 라세미 혼합물을 생산하게 되며, 이는 요구되는 거울이성체를 위한 분할 및 회수를 필요로 할 수 있다. 한 가지 예외는 필수 아미노산인 메티오닌인데, 메티오닌은 아크롤레인, 시안화수소산, 메틸 메르캅탄 및 암모니아를 시작 물질로 하여 라세미 화합물(DL-메티오닌)로 합성적으로 제조되고 이는 50년 이상 사료 첨가제로 시장에 마케팅되어 왔다. 메티오닌 라세미 화합물을 이용하는 것이 가능한데, 이는 동물들이 D-형태의 비천연 비타민을 유익한 L-형태로 바꾸는 효소를 가지고 있기 때문이다. 반대로, 이와 비교될 만한 D-형태를 바꾸는 효소 시스템은 다른 아미노산의 경우에는 존재하지 않기 때문에 메티오닌을 제외한 다른 아미노산은 순수한 L-형태로 생산되어야 한다. 그러나, 이러한 과정은 강도 높은 생산 환경을 요구하거나, 환경적으로 해로운 부산물이라는 결과를 불러일으킨다. 오늘날 아미노산을 생산하기 위해서 가장 선호되는 것은 발효와 효소 촉매 방법이다.
높은 생산성으로 설탕에서 맛을 더 좋게 하는 L-글루탐산을 생산할 수 있는 토양 박테리아 Corynebacterium glutamicum의 발견을 통해서, 아미노산 생산 방법으로서 발효의 성공의 기반을 닦았다(Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 5:193, 1957). 최근 30년 간의 급속한 아미노산 시장의 발전은, 발효 기술과 많은 아미노산을 산업적인 규모로 생산하는 것을 가능하게 한 C. glutamicum 또는 E. coli 등 아미노산을 생산하는 미생물 덕분이다 (Ikeda M (2003) Amino acid production processes. In: Scheper T, Faurie R, Thommel J (eds) Advances in biochemical engineering/biotechnology, vol 79. Springer, New York, pp 1-35; Leuchtenberger et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 69:1, 2005). 그러나 발효시장은 천연 알콜과 비천연 알콜, 특히 에탄올이 지배해 왔다. 아미노산 생산에 이용된 탄수화물 공급 원료는 동물 사료 및 바이오 연료에 직접 사용된다. 동물 관련 제품과 바이오 연료에 대한 수요의 증가는 결과적으로 탄수화물 공급 원료의 비용을 증가시켰고, 이는 결과적으로 아미노산의 제조 비용을 증가시켰다.
공급 원료의 높은 비용을 고려할 때, 생물학적으로 아미노산을 생산하는, 효율적인 비용으로 대안이 되는 개선된 방법의 기술이 필요하게 되었다. 본 발명은 그러한 요구 사항을 만족시키며, 이와 관련된 다른 이점도 제공한다.
간단한 요약
특정 면에서 본 발명은 비천연 수소영양 미생물을 제공하며, 여기에서 비천연 수소영양 미생물은 비조절 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하며, 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하도록 H2/COx 기질을 대사한다.
추가적인 측면에서 본 발명은, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하고 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하도록 H2/COx 기질을 동화하는 것이 가능한, 재조합 수소영양 미생물을 제공한다.
더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로를 제공하기에 충분한 시간동안 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물을 배양하는 것을 포함하는 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물은 (a) 모체 수소영양 미생물과 비교했을 때 증가된 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소의 변경된 조절 방식을 포함하며, 여기에서 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산(예를 들면 라이신, 트레오닌, 메티오닌)을 생산한다.
또 다른 추가적인 측면에서, 본 발명은 아스파르테이트 경로 아미노산 또는 아스파르테이트 경로 아미노산을 포함하는 식품 보충제를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 재조합 아스파르테이트 경로 아미노산을 분비하는 수소영양 미생물을 H2/COx 기질의 존재 하에 아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위해 하나 또는 그 이상의 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 폴리 뉴글레오타이드가 발현하기에 충분한 조건과 시간에서 배양하는 것을 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산은 모체 수소영양 미생물에 의해 생산된 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산 보다 높은 수준으로 생산되고 배양 배지에 축적된다.
더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 H2/COx 기질을 포함하는 기체 공급원; (a) 모체 수소영양 미생물과 비교했을 때 증가된 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소의 변경된 조절 방식을 포함하는 본 발명의 임의의 하나 또는 그 이상의 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물을 포함하는 생물반응장치; 및 기체가 생물반응장치로 흐르도록 기체 공급원과 생물반응장치 사이에 배치된 커넥터를 포함하고, 여기에서 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산(예를 들면 라이신, 트레오닌, 메티오닌)을 과잉생산하는, 아스파르테이트 경로 아미노산의 생산을 위한 시스템을 제공한다.
도 1은 라이신과 트레오닌의 존재 하에 G333R 돌연변이(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 LysC 아미노산 위치 G277에 상응)를 가지는 Methnococcus maripaludis lysC 돌연변이 Trell0-Mut333의 비조절성 성장률을 나타내며, OD600은 37°C에서 72시간동안 배양된 후 측정되었다.
도 2는 돌연변이된 내인성 아스파르토키나아제 효소를 가지는 Methnococcus maripaludis에 의한 아스파르테이트 경로 아미노산 생산의 HPLC 그래프를 나타낸다. 모 균주와 비교된 돌연변이 내의 생산 프로파일은 알라닌 (5 mg/L), 라이신 (8 mg/L), 트레오닌 (21 mg/L), 및 글라이신 (78 mg/L)이다.
상세한 설명
본 발명은 기체를 유용한 조성물, 예컨대 생물학적으로 높은 가치의 분자 (예를 들어, 아미노산), 생물학적 재료 (예를 들어, 동물 사료), 또는 그들의 조합으로 활용하거나 전환하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 합성기체가 수소영양 미생물에게 공급될 수 있는데, 이는 하나 또는 그 이상의 서로 다른 아스파르테이트 경로 아미노산을 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 접근은 수소영양 고세균 또는 박테리아가 수소 기체 및 산화탄소 (예를 들어, CO, C02)를 포함하는 공급원료를 라이신, 글라이신, 트레오닌, 메티오닌, 또는 이들의 조합으로 활용되거나 전환시키기 위해 새로운 숙주 시스템으로 활용할 수 있다.
배경 기술의 방법으로서, 아스파르테이트 경로 아미노산, 예컨대 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌 등은 하나 또는 그 이상이 피드백 조절, 유전자 발현의 억압 또는 둘 다에 적용되는 생합성 경로 내에서 몇 가지 효소를 공유한다. 예를 들어, 이렇게 산업적으로 중요한 아미노산을 탄소 유동을 생합성으로 지시하는 데에 관련하여 가장 먼저 사용되는 효소인 아스파르토키나아제는 Corynebacterium glutamicum의 트레오닌 및 라이신(Sano and Shiio , J. Gen. Appl . Microbiol . 16:373, 1970; Yoshida et al., J. Mol . Biol . 368:521, 2007)에서 알로스테릭하게 억제된다. 호모세린 데하이드로게나아제는 트레오닌/메티오닌 생합성 경로에서 가장 먼저 사용되는 효소인데, 이 효소는 라이신 생합성 경로에 사용되는 디하이드로디피콜리네이트 신타아제와 아스파르틸 세미알데히드를 위해 경쟁한다. 트레오닌/메티오닌 또는 라이신에 대한 탄소 유동의 조절은 어떤 효소가 기질을 얻는지에 따라 달라질 것이며 - 예를 들어, Corynebacterium의 경우 트레오닌에 의해서 호모세린 데하이드로게나아제 활성이 억제되고 메티오닌에 의해서 억압되는데, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제는 라이신 농도에 따라 바뀌지 않는다. 이와 유사하게, 호모세린 0-숙시닐트랜스퍼라아제는 메티오닌 및 S-아데노실 메티오닌에 따라 피드백 조절이 된다.
본 발명은, 야생형 또는 모체 생물체와 비교했을 때, 수소영양 미생물이 특정한 아미노산(예를 들어, 라이신, 트레오닌, 메티오닌)을 더 높은 수준으로 생산하기 위해 전용 전구체(redirect precursor) 및 신진대사의 유동하는 대사 공학 (유전자 변이, 유전자 발현 변이, 유전자 발현 조절 변이)을 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 수정된 수소영양 미생물을 사용하여 아미노산을 생산하는 조성물, 방법 및 시스템을 제공하며, 여기에서 수정된 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 H2/COx 기질로 하여금 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하도록 한다.
본 발명에 대해 더욱 자세히 들여다보기 전에, 여기에서 어떤 용어가 사용되는지에 대해서 그 정의가 제공되면 이해하기가 쉬울 것이다. 추가적인 정의는 본 발명 전반을 통해서 정해지는 것으로 한다.
본 서술에서, 어떤 농도 범위, 퍼센트 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 재인용된 범위 내의 정수를 포함하며, 달리 나타나지 않은 한 적절한 경우에 이에 대한 일부도 포함한다(예를 들면 정수의 10분의 1, 100분의 1)고 이해해야 한다. 또한 여기에서 달리 나타나지 않은 한 어떤 물리적 특징에 관련되어 재인용된 숫자의 범위 중에, 예를 들면 고분자의 서브유닛, 크기 또는 두께는 재인용 범위의 어떤 정수도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 여기서 사용되었듯이, 용어 "약" 은 달리 나타나지 않은 한 범위, 값, 또는 구조의 나타난 범위의 ±20%를 의미한다. "기본적으로 구성되는"이라는 용어는 청구항의 구체화된 재료나 단계의 범위를, 또는 청구항된 발명에 실질적으로 영향을 미치는 기본적으로 새로운 특징을 제한한다. 이는 여기에서 사용된 "한(a)" 및 "하나(an)"의 용어가 "하나 또는 그 이상"의 열거된 구성요소를 의미한다고 이해해야 한다. 대안적인 표현의 사용(예를 들면, "또는")은 하나, 둘 다, 또는 대안의 어떤 조합을 의미한다고 이해해야 한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "포함한다(include)," "갖는다(have)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용되었으며, 이에 대한 용어나 이형(異形)은 제한이 없다는 쪽으로 이해할 것으로 의도되어 있다.
여기에서 이용된 바와 같이, "아스파르테이트 경로 아미노산" 또는 "아미노산의 아스파르테이트 족(family)"은 라이신, 트레오닌, 메티오닌, 호모세린, 아이소류신 및 글라이신을 포함하는 아스파르테이트에서 합성된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 의미한다. 아미노산의 각 아스파르테이트 족의 생합성 경로의 단계는 나뉘거나 분기할 수 있으며, 이는 아스파르테이트 키나아제(아스파르토키나아제라고 칭해지기도 하는)에 의한 아스파르테이트의 인산화와 함께 시작된 것이다. 특정 구체예에서는 아미노산의 아스파르테이트 족의 생합성 경로에서 하나 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의해 아스파르테이트 키나아제가 피드백 억제된다. 이와 더불어, "아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위한 경로"의 단백질 또는 효소는 예를 들어, 라이신 생합성 경로 효소, 글라이신 생합성 경로 효소, 트레오닌 생합성 경로 효소, 메티오닌 생합성 경로 효소, 또는 이들의 조합을 의미할 수 있다.
여기에서 사용되었듯이 "수소영양 생물(hydrogenotroph)" 또는 "수소영양"은 대사 과정에서 H2를 소비하거나, H2를 산화하거나 H2를 다른 화합물로 전환할 수 있는 능력이 있는 미생물을 의미한다. 특정 구체예에서, 수소영양 생물은 완전 또는 조건 수소영양 생물, 강요 또는 조건 있는 혐기성 생물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 조건 혐기성 수소영양 생물은 수소를 에너지원으로서 존재하지 않는 상황에서도 성장할 수 있고, 다양한 탄소 공급원, 예를 들어 탄수화물, 아세테이트, 포름산염, 메탄올, 메틸아민, 또는 산화 탄소(예를 들어 아세토젠, Clostridium은 H2 없이도 성장할 수 있고, 아세테이트를 에너지와 탄소 공급원으로 사용하는) 중에서 하나 이상을 사용할 수 있다. 예시적인 수소 영양생물은 메탄 생성 미생물, 아세토젠, Knall-기체 박테리아 또는 그와 같은 것을 포함한다.
여기에서 사용되었듯이 "H2/COx 기질" 또는 "H2/COx 공급원료"는 이산화탄소 C02) 또는 일산화탄소 (CO), 또는 둘 다와 수소(H2)의 혼합물을 의미하는 것이며, 이는 다른 다양한 성분들, 예를 들어 암모니아 (NH3), 탄화수소 (예를 들어 메탄 (CH4)), C02, CO, 포름알데히드 (CH20), 황화수소 (H2S), 황화카르보닐, (COS), 시안화수소 (HCN), 수증기, 불활성 기체, 또는 다른 기체를 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이 "합성된 기체" 또는 "합성기체"는 일산화탄소와 수소의 혼합물을 의미하는데 이는 수소 합성, 암모니아 합성, 메탄올 합성, 제강, 또는 석탄, 바이오매스 또는 폐기물의 기화와 더불어 수증기 개질, 건조(dry) 또는 C02 개질, 자가열 개질, 촉매의 부분적 산화 또는 천연 기체 또는 액체 탄화수소의 부분적 산화로 생산될 수 있다. 특정 구체예에서 합성기체는 수분-기체 이동 반응에 의해서 추가적으로 처리될 수 있다. 합성기체는 메탄, C02, H2S, 또는 기타 기체를 CO 및 H2에 비해 상대적으로 더 적은 양으로 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이 "숙주"라는 용어는, 유전적으로 수정된 돌연변이 또는 해당 폴리펩타이드를 생산하기 위한 외인성 핵산 분자를 가지는 것(예를 들어 아스파르토키나아제)을 의미한다. 특정 구체예에서 숙주 세포는 이미 선택적으로 돌연변이된 또는 발현되는 외인성 폴리펩타이드(예를 들어 비조절)와 연관이 있거나 연관이 없는 필요로 하는 특징을 부여하는 유전자적 수정을 보유하고 있을 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 추가적인 또는 개선된 탄소 유동 활성, 경쟁 아미노산을 덜 생산, 높은 성장률, 오염 물질 또는 특정 배양 조건을 용인하거나 추가적인 탄소 기질을 대사할 수 있는 능력이나, 필요로 하는 생산품이나 중간 산물을 대사하기 위한 유전적 수정을 보유하거나 보유하도록 변이될 수 있다.
여기에서 사용되었듯이 "메탄 생성" 또는 "메탄 생성 고세균"이라는 용어는 무산소 환경에서 수소 기체 및 하나 또는 두 개의 다양한 탄소 기질(예를 들어, 이산화탄소, 아세테이트, 포름산, 포름알데히드, 일산화탄소, 메탄올, 메틸 아민류(예를 들어, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 또는 이와 같은)을 사용하여 메탄을 생산하는 것이 가능한 미생물을 의미한다. 배경 기술에서, 박테리아는 고세균이 아니고 고세균은 박테리아가 아니라고 이해되고 있다. 메탄 생성 고세균은, 메탄을 생산하기 위해서 수소 기체를 필요로 하는 "완전 수소 영양생물"일 수 있다. 여기에서 사용되었듯이 메탄 생성 고세균은 "조건 수소 영양생물"일 수 있는데 이는 수소 기체 없이도 메탄을 생산할 수 있다. 추가적으로, 메탄 생성 고세균은 중온성, 호열성, 또는 과호열성이다.
여기에서 사용되었듯이 "바이오매스"는 생물학적 근원을 가지는 세포 전체, 용해된 세포, 세포 밖의 물질, 생산된 산물 또는 이의 부분 또는 등과 같은 유기 물질을 의미한다. 예를 들어, 배양된 미생물에서 추출된 재료(예를 들어 박테리아의 또는 고세균성 배양)는 바이오매스로 고려될 수 있고, 이는 분비된 산물을 포함하고 있거나 분비된 산물일 수 있다.
여기에서 사용되었듯이, "핵산 분자"는 또한 폴리뉴클레오타이드로 알려져 있으며, 이는 뉴클레오타이드라고 부르는 공유결합된 서브유닛을 포함하는 고분자 화합물을 의미한다. 핵산 분자는 폴리리보핵산 (RNA), 폴리데옥시리보핵산 (DNA)를 포함하며, 둘 다 한 가닥 또는 두 가닥의 스트랜드를 보유하고 있다. DNA는 cDNA, 게놈의 DNA, 합성 DNA, 세미-합성 DNA 등을 포함한다.
여기에서 사용되었듯이, "내인성" 또는 "원산(native)"은 일반적으로 숙주 세포에 있는 유전자, 단백질, 화합물 또는 활성을 의미한다. 이와 더불어, 돌연변이되었거나 과발현, 셔플되었거나, 복제 또는 모체 유전자와 비교하여 변형된 유전자, 단백질 또는 활성은 그 특정한 숙주 세포에 대해서 내인성 또는 원산이라고 일컬어진다. 예를 들어, 첫 유전자로부터의 내인성 조절 서열 (예를 들면 프로모터, 번역 감쇠 서열)는 두 번째 원산 유전자 또는 핵산 분자의 발현을 변이하거나 조절하는 데에 사용될 수 있는데, 두 번째 원산 유전자나 핵산 분자의 발현 또는 조절은 모체 세포의 일반적인 발현이나 조절과는 다르다.
여기에서 사용되었듯이, "이종" 또는 "외인성" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 숙주 세포의 원산(native)이 아닌 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분을 의미하는데, 이는 숙주 세포의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분과 상동할 수 있다. 이종 원료 또는 외인성 핵산 분자의 공급원, 작제물 또는 서열은 다른 속(genus)이나 종에 따라 서로 다를 수 있다. 특정 구체예에서는, 이종 또는 외인성 핵산 분자 (예를 들어 내인성이 아니거나 원산이 아닌)가 숙주 세포나 숙주 게놈에 예를 들어 컨쥬게이션, 변화, 트랜스펙션, 전기 천공법 등을 통해서 더해졌고, 여기에서 더해진 분자는 숙주 게놈으로 통합될 수도 있고 과잉 염색체의 유전적 재료(예를 들어 플라즈미드 또는 다른 형태의 자기 복제하는 벡터)로 존재할 수도 있으며 여러 개의 복사본에도 존재할 수 있다. 추가로 "이종"은, 숙주 세포의 상동 단백질 또는 활동을 코딩하는 경우이더라도 숙주 세포에 도입된 외인성 핵산 분자에 의해 코딩된 비천연 효소, 단백질 또는 다른 활성을 의미한다.
"상동의" 또는 "상동"은 숙주 세포, 종 또는 균주 내에서 찾을 수 있거나 숙주 세포에서 파생된 분자 또는 활성을 의미한다. 예를 들어, 이종 또는 외인성 핵산 분자는 원산의 숙주 세포 유전자에 상동일 수 있고, 임의로 변경된 발현 수준, 다른 서열, 변경된 활성이나 그들의 조합을 가질 수도 있다.
여기에서 사용되었듯이 "비천연(non-natural)"은 야생형 또는 모체 세포 또는 분자와 상이한 최소한 하나의 유전적 변이를 포함하는 생명체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 의미한다. 예를 들어, "비천연"은 변이(예를 들어 부위 특이적, 또는 자발적인 돌연변이를 포함하는 무작위 돌연변이)가 발생한 미생물 또는 세포를 의미할 수 있는데, 야생형 또는 모체 미생물과 비교해서 내인성 핵산 분자 또는 유전자, 또는 유전자의 활성에 변이(예를 들어 증가, 감소, 비조절성, 활성화, 활성화된, 억압된)가 발생했을 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 오페론의 발현에 변이가 발생하게 하는 비코딩 조절 영역이 그러하다. "비천연" 생명체, 미생물, 또는 세포는 재조합 생명체, 미생물, 또는 세포를 포함할 수 있다.
여기에서 사용되었듯이 "재조합"은 외인성 핵산 분자 발현에 대한 도입으로 인하여 조절, 비조절성, 구성적인 방법으로 변이가 발생한 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 의미하며, 이 때 유전자적 조작의 도입으로 인해서 변이 또는 수정이 일어났을 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 효소를 코딩하는 핵산 분자(발현 조절 요소, 예를 들면 프로모터를 포함하는)를 도입하는 수정을 포함할 수 있고, 유전적 변이는 다른 핵산 분자 추가, 결실, 치환 또는 다른 기능적인 분열이나 세포의 유전적 물질의 추가가 있을 수 있다. 예시적인 수정은 참조나 모체 미생물의 이종 또는 상동 폴리펩타이드의 코딩 영역이나 기능적 단편 수정을 포함한다. 특정 구체예에서 본 발명의 생명체, 미생물, 세포는 비천연 생명체, 미생물, 세포이거나 재조합 생명체, 미생물, 세포이다. 예를 들어 비조절성 내인성 효소(아스파르토키나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제)를 발현하거나 과발현하는 비천연 수소영양 미생물은, 아스파르테이트 경로 아미노산(예를 들면 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제)의 생합성에 관련된 어떤 효소 활성을 생산하기 위해서 발현 또는 과발현된 하나 또는 그 이상의 외인성 또는 이종 핵산 분자를 포함할 수 있다.
여기에서 사용되었듯이 "변형(transformation)"은 핵산 분자(예를 들어, 외인성 또는 이종 핵산 분자)의 숙주 세포 내로 도입을 의미한다. 변형된 숙주 세포는 외인성 또는 이종 핵산 분자를 과잉 염색체 또는 염색체에 통합된 상태로 보유하고 있을 수 있다. 숙주 세포 게놈 내로 통합하고 자기 복제하는 벡터는, 변형된 핵산 분자가 일반적으로 유전적으로 안정적인 유전성(inheritance)를 가지게 되는 결과를 낸다. 변형된 핵산을 포함하는 숙주 세포는 "재조합" 또는 "유전자적으로 조작된" 또는 "변형된" 또는 "이식 유전자를 가진" 세포(예를 들어, 박테리아, 고세균)를 의미한다.
여기에서 사용되었듯이, "비조절성"이라는 용어는 모체 또는 야생형 미생물의 유전자 발현이나 활성과 비교했을 때 상대적으로 유전자 산물의 감소했거나 증가한 발현, 또는 유전자 산물(예를 들어 단백질, 효소)이 감소했거나 증가한 활성을 의미한다. 예를 들어, 미생물은 조작하기 전의 모체 또는 야생형 미생물과 대비해서 유전자 산물의 발현을 감소하거나 증가하기 위해서 유전적으로 조작(예를 들어 돌연변이되거나 유전적으로 조작)될 수 있다. 특정 구체예에서는, 타겟 유전자는 발현된 유전자 산물이 증가된 활성을 가진다는 측면에서 돌연변이가 발생했다. 예를 들어, 타겟 유전자의 코딩 영역은 발현된 유전자 산물의 활성이 증가하도록, 활성이 증가하게 하기 위해서 타겟 유전자의 복사본의 수가 증가하도록 변이될 수 있거나, 활성을 증가시키기 위해서 타겟 유전자가 과발현될 수 있거나, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 다른 구체예에서는 타겟 유전자가 발현된 유전자 산물이 피드백 억제(예를 들어 아미노산, 아스파르토키나아제, 호모세린 O- 아세틸트랜스퍼라아제 또는 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제 등 생합성 효소가 하나 또는 하나 이상의 피드백 억제제인 라이신, 트레오닌 및 메티오닌 존재 하에 비조절성)에 대해서 감소된, 최소한의, 또는 감지할 수 없는 반응을 나타내도록 돌연변이화된다. 추가적인 구체예에서, 타겟 유전자는 유전자 발현의 억압(예를 들어 아미노산 생합성 효소, 호모세린 데하이드로게나아제 등은 피드백 억제 보체인 메타오닌의 존재하에 비조절되었다)에 대해서 감소된, 최소한의, 또는 감지할 수 없는 반응을 나타내도록 돌연변이화되었다. 대안으로서, 선택적인 압력 하에 미생물은 이상에서 언급된 유전적 변이(예를 들어, 자발적인 돌연변이)를 보유하도록 확인될 수 있다. 이상에서 언급된 구체예 중에 비조절성 유전자나 비조절성 유전자 산물은 자발적인, 유도되거나 조작된 돌연변이 또는 변이체일 수 있다.
여기에서 사용되었듯이, "과발현"이라는 용어는 비천연 또는 재조합 미생물의 유전자 발현이나 유전자 산물의 수준이 같은 조건에서 성장했을 때 모체 또는 야생형 미생물에서 나타나는 유전자 발현이나 유전자 산물의 수준보다 높은 경우이다. 특정 구체예에서, 과발현은 복사 수준, 번역 수준 또는 둘 다에서 발생할 수 있고, 이는 변경된 조절 제어(예를 들면 강한 프로모터의 사용에 따른), 복사본 수의 증가 또는 둘 다에 의한 것이다.
둘 또는 그 이상의 핵산 서열 사이의 "퍼센트 동일성(percent identity)"은 갭의 수 및 각 갭이 둘 또는 그 이상의 서열의 가지런함을 최적화하기 위해 도입될 때 각각 필요로 하는 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수(예를 들어, % 동일성 = 동일한 위치의 수/전체 위치 수 x 100)이다. 서열의 비교 그리고 둘 또는 그 이상의 서열의 퍼센트 동일성을 정함은 수학적인 알고리즘을 통하여 달성할 수 있고, 이는 예를 들어 디폴트 한도(예를 들어 Altschul et al, J. Mol . Biol . 275:403, 1990; www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST의 BLASTN도 참조하라)의 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하면 가능하다.
"보전적 치환"은 배경 기술에서 하나의 아미노산이 비슷한 특징을 가지고 있는 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 예시적인 보전적 치환은 배경 기술에서 잘 알려져 있다(예를 들어 WO 97/09433의 페이지 10; Lehninger, Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990를 참조).
"억제" 또는 "억제된" 것은, 여기에서 사용된 것에 따르면 변이, 감소, 하향 조절 또는 폐기를 직간접적으로 의미하는데, 이 때 타겟 유전자 또는 타겟 분자(예를 들어 포스포에놀피루베이트 신타아제)가 조절된, 내인성, 또는 참조된 분자에 비해 상대적으로 활성화된 경우, 여기에서 변이, 감소, 하향 조절 또는 폐기가 통계적으로, 생물학적으로, 산업적으로 그리고 임상적으로 확연하다. 예를 들어, 억제되고, 비활성화되고, 또는 활성도가 떨어지는 생합성 효소(예를 들어 유전적으로 변이된)는 야생형 또는 모체 효소와 비교했을 때 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 미만의 활성을 나타낸다.
여기에서 사용되었듯이, "유도체"라는 용어는 화학적 또는 생물학적 의미로. 효소의 유무와 상관없이, 화합물의 수정을 의미하며, 이 때의 수정된 화합물은 구조적으로 모체 화합물과 유사하고(실제로 또는 이론적으로) 모체 화합물에서 유래될 수 있다. 유도체는 모체 화합물과는 서로 다른 화학적, 생물학적 또는 물리적 특성을 가지고 있을 수 있는데, 이는 모체 화합물과 비교했을 때 더욱 친수성이거나 반응성이 변이된 경우가 있을 수 있다. 유도화(수정)는 하나 또는 그 이상의 일부분의 분자와의 치환과 관련 있을 수 있다 (예를 들면, 작용기의 변화), 예를 들어, 수소는 할로겐, 예를 들어 플르오르, 염소로 치환될 수 있고 하이드록시기(-OH)는 카르복실기(-COOH)로 치환될 수 있다. 다른 예시적인 유도화는 글리코실화, 알킬화, 아실화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 에스테르화 및 아미드화를 포함한다.
"유도체"는 또한 모든 용매화물을 의미하는데, 수화물 또는 어덕트(첨가 생성물) (예를 들어 알콜이 포함된 어덕트), 활성화된 대사 물질 그리고 모체 화합물의 염 등이 그 예시가 된다. 염의 종류는 화합물의 일부분의 특징에 따라 다르다. 예를 들어, 카르복실기 등의 산 그룹, 알칼리 금속염 또는 알칼리성 토류 금속 산 그룹(나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 및 사차 암모늄 이온을 생리적으로 용인할 수 있는 염, 및 암모니아와 더불어 산 첨가염과 생리적으로 용인될 수 있는 유기염, 예를 들어 트리에틸아민, 에타놀아민 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민)을 생성할 수 있다. 염기 그룹은 예를 들어, 염산, 황산 또는 인산 등 무기산 또는 유기산 또는 아세트산, 구연산, 젖산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 파라톨루엔 술폰산 등 산과 염을 만들 수 있다. 염기 그룹과 산 그룹을 동시에 포함하는 화합물, 예를 들어, 카르복실산기는 염기 질소 원자와 더해지면 양쪽성 이온으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 무기 또는 유기 산과 염기를 용액 또는 희석액에서 섞거나 양이온 교환 또는 음이온 교환을 통한 다른 염으로 인해서 이미 알려진 배경 기술에 따른 관례적인 방법을 통해서 염을 얻을 수 있다.
수소영양 미생물 - 숙주 세포
본 발명의 모체 또는 시작 수소영양 미생물은 야생형 (천연) 균주, 돌연변이된 (비천연) 균주(예를 들어, 성장률이 증가하거나, 비조절성의, 또는 활성화된 생합성 효소), 또는 재조합 균주일 수 있고, 각각은 하나 또는 그 이상의 아미노산(예를 들어 라이신, 글라이신, 트레오닌, 메티오닌)을 생산하기 위해 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 추가적으로 수정되어야 한다. 특정 구체예에서, 수소 영양생물은 박테리아 또는 메탄 생성 고세균일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 Methanobacterium , Methanobrevibacter , Methanocalculus, Methanocaldococcus , Methanocella , Methanococcus , Methanococcoides, Methanocorpusculum , Methanoculleus , Methanofollis , Methanogenuim, Methanohalobium , Methanohalophilus , Methanolacinia , Methanolobus, Methanomethylovorans , Methanomicrobium , Methanomicrococcus , Methanoplanus , Methanopyrus , Methanoregula , Methanosaeta , Methanosalsum, Methanosarcina , Methanosphaera , Methanospirillium , Methanothermobacter, Methanothermococcus, Methanothermus , 또는 Methanotorris 등 메탄 생성 고세균인 수소영양 미생물을 제공한다.
추가적인 구체예에서, 수소영양 미생물은 특정한 메탄 생성 고세균 종이다. 예시적인 메탄 생성 고세균 종은 Methanobacterium alcaliphilum , Methanobacterium bryantii , Methanobacterium congolense, Methanobacterium defluvii , Methanobacterium espanolae , Methanobacterium formicicum , Methanobacterium ivanovii , Methanobacterium palustre, Methanobacterium thermaggregans , Methanobacterium uliginosum , Methanobrevibacter acididurans , Methanobrevibacter arboriphilicus , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter smithii , Methanobrevibacter woesei , Methanobrevibacter wolinii, Methanocella arvoryzae , Methanocella conradii , Methanocella paludicola, Methanothermobacter marburgensis , Methanothermobacter thermautotrophicum , Methanothermobacter thermoflexus , Methanothermobacter thermophilus , Methanothermobacter wolfeii , Methanothermus sociabilis , Methanocorpusculum bavaricum, Methanocorpusculum parvum , Methanoculleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus , Methanogenium frigidum , Methanogenium liminatans, Methanogenium marinum , Methanomicrococcus blatticola , Methanoplanus endosymbiosus , Methanoplanus limicola , Methanoplanus petrolearius, Methanopyrus kandleri , Methanoregula boonei , Methanosaeta concilii, Methanosaeta harundinacea , Methanosaeta pelagica , Methanosaeta thermophila, Methanosarcina acetivorans , Methanosarcina barkeri , Methanosarcina mazei , Methanosarcina thermophila , Methanomicrobium mobile, Methanococcus aeolicus , Methanococcus maripaludis , Methanococcus vannielii , Methanococcus voltae , Methanothermococcus thermolithotrophicus , Methanopyrus kandleri , Methanothermobacter thermoautotroiphicus , Methanocaldococcus fervens , Methanocaldococcus indicus , Methanocaldococcus infernus , Methanocaldococcus jannaschii, 및 Methanocaldococcus vulcanius를 포함한다.
특정 구체예에서 메탄 생성 고세균은 사이토크롬을 생산하거나 생산하지 않는다. 예를 들어, 사이토크롬을 생산하지 않는 메탄 생성 고세균은 Methanococcus maripaludis 또는 Methanococcus vannielii를 포함한다. 사이토크롬을 생산하는 메탄 생성 고세균은 Methanosarcina barkeri 또는 Methanosarcina mazei이다.
관련 구체예에서, 메탄 생성 고세균은 중온성, 호열성 또는 과호열성일 수 있다. 예시적인 중온성의 메탄 생성 미생물은 Methanobacterium , Methanobrevibacter, Methanocalculus , Methanocaldococcus , Methanococcus , Methanocorpusculum 및 Methanosarcina 등 일부 종을 포함한다. 예시적인 호열성의 메탄 생성 미생물은 Methanomicrobium, Methanosaeta , Methanosarcina , 및 Methanothermococcus의 일부 종을 포함한다. 예시적인 과호열성은 Methanocaldococcus, Methanopyrus , Methanothermus , 및 Methanotorris 등 일부 종을 포함한다.
추가적인 구체예에서, 본 발명은 박테리아인 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서 수소 영양생물은 Clostridium, Moorella , Pyrococcus , Eubacterium , Acetogenium, Acetobacterium , Desulfobacterium , Acetoanaerobium , Butyribaceterium , Carboxydothermus, 또는 Peptostreptococcus 등 합성기체 또는 CO 대사하는 미생물일 수 있다. 예시적인 Clostridium 종은 C . autoethanogenum , C. ljungdahli, C. ragsdalei , C. carboxydivorans , C. woodii , 및 C. neopropanologen를 포함하고, 예시적인 Butyribaceterium 종은 B. methylotrophicum이다. 어떤 다른 구체예에서 수소 영양생물은 Cupriavidus necator, hydrogenobacter thermophilus , hydrogenovibrio marinus , 또는 Helicobacter pylori 등 Knall-기체 박테리아일 수 있다.
특정 구체예에서, 수소영양 미생물은 완전 수소 영양생물 또는 조건 수소 영양생물이다. 추가적인 구체예에서 수소영양 미생물은 완전 혐기성 생물 또는 조건 혐기성 생물이다. 특정 구체예에서, 수소영양 조건 혐기성 생물은 H2 및 산소 또는 산화물 (예를 들어, 철 산화물, 아민 산화물, phosphine 산화물, 황산화물)의 존재 하에서 성장할 수 있다. 예시적인 수소영양 조건 혐기성 생물에는 Cupriavidus (예를 들어 C. alkaliphilus, C. basilensis , C. campinensis , C. gilardii , C. laharis , C. metallidurans , C. necator , C. numazuensis, C. oxalaticus , C. pampae , C. pauculus, C. pinatubonensis , C. respiraculi , C. taiwanensis), hydrogenobacter thermophilus, Xanthobacter autotrophicus , Rhodococcus opacus , Rhodopseudomnas sp. 및 Alicaligenes sp 등이 있다.
수소영양 미생물 - 비천연 및 재조합
본 발명 상의 수소영양 미생물은 유전적으로 조작(예를 들어 비천연)될 수 있고, 재조합 방식으로 수정되거나 대상인 폴리펩타이드를 녹아웃(knock-out), 감소, 발현 또는 과발현할 수 있으며, 이는 재조합 미생물로 하여금 다양한 H2/COx 기질 구성을 아미노산이나 영양분 공급원과 같은 다른 유용한 구성의 화합물로 바뀔 수 있도록 변환(예를 들어, 활용, 전환, 동화, 산화, 감소)한다.
비천연 수소영양 미생물을 만들기 위한 유전자 조작은 무작위(예를 들어 화학적으로 유도되거나 자발적인)의 또는 부위를 지시하는 돌연변이 유발(예를 들어 하나 또는 그 이상의 유전자 타겟), 조절 서열의 변이 또는 하나 또는 그 이상의 유전자 타겟과 연관이 있는 위치(예를 들어, 강, 약, 유도, 억압, 또는 다중 프로모터를 제거하거나 이런 프로모터를 다른 특징을 가지는 프로모터와 대체하는 것), 하나 또는 그 이상의 유전자 타겟에서 유전자 위치를 변화시키는 것, 하나 또는 그 이상의 유전자 타겟에 인접해 있는 핵산 서열을 변이시키는 것 (라이보솜 결합 부위 또는 전사 터미네이터), 하나 또는 그 이상의 유전자 타겟의 복사본의 수를 감소시키거나 증가시키는 것, 하나 또는 그 이상의 유전자 타겟의 전사 또는 하나 또는 그 이상의 유전자 산물의 번역 또는 발현을 비조절하는 방법(안티센스 핵산 분자, 짧게 방해하는 핵산 분자를 사용하거나 또는 타겟 단백질의 발현을 녹아웃하거나 차단하기 위한 다른 방법을 포함하는)과 연관된 조절 단백질, 억압제, 억제제, 개선제, 전사 활성제 등을 수정하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 유전자 조작은 비천연 수소영양 미생물이라는 결과를 나타내는 하나 또는 그 이상의 자발적인 돌연변이를 포함한다. 이런 자발적인 돌연변이는 미생물이 요구된 표현형을 가지는 돌연변이만이 성장할 수 있는 특정한 선택적 압력(예를 들어 특정한 아미노산 또는 독소가 성장 배지에 존재하지 않거나, 항생제의 존재, 특정한 대사 물질이 존재하지 않는 등) 하에 플레이싱되어 확인될 수 있다.
코돈의 사용의 다양성은 박테리아 및 고세균의 서로 다른 종에 걸쳐서 관찰되고 있으며, 이는 이종의 숙주의 재조합 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있다. (Sharp et al., Nucl . Acids Res. 33:1141, 2005; Emery and Sharp, Biol . Lett . 7: 131, 2011). 특정 구체예에서, 핵산 분자(예를 들어 아스파르테이트 경로 아미노산 생합성 효소를 코딩하는 핵산)는 여기에서 묘사되었듯이 단백질 발현을 개선하거나 최대화하려는 숙주 세포 내로의 도입 이전에 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 코돈에 의해서 코딩된 아미노산의 변이 없이, 숙주 세포에서 더 흔한 코돈 사용을 반영하기 위한, 핵산 분자 수준에서의 유전자 내의 코돈 서열이나 코딩 영역의 변이를 의미한다. 이종의 숙주에서의 유전자 발현을 위한 코돈 최적화 방법은 이미 묘사된 바 있다. (예를 들어, Welch et al., Methods Enzymol . 498:43, 2011; Henry and Sharp, Mol . Biol . Evol . 24:10, 2007; U.S. Patent Publication No. 2011/0111413 참조).
추가적인 구체예에서, 본 발명 상의 생합성 효소를 코딩하는 내인성 또는 외인성 핵산 분자에 야생형으로부터 아미노산이 변경되는 등의 변이가 발생할 수 있다. 이런 방법으로 생성된 각각의 변이체 폴리펩타이드는 최소한 50%의 활성(가급적 100% 또는 더 높은 활성)을 유지할 것이고, 대상이 되는, 또는 모체의 야생형 폴리펩타이드 서열에 대해 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 가질 것이다. 특정 구체예에서 참조 또는 모체의 야생형 효소에 대하여(상대적으로) 관심의 대상이 되는 활성을 그 변이체가 유지하는 경우(예를 들어, 카르복실라아제, 데카르복실라아제, 데하이드로게나아제, 에피머라아제, 키나아제, 리아제, 신타아제, 신타아제) 변이체 폴리펩타이드는 최소한 하나의 아미노산 치환을 포함할 것인데, (예를 들어, 최소한 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그 이상 20, 25, 또는 30 치환까지) 특정한 숫자를 넘지 않는 아미노산 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30 치환을 넘지 않는)을 포함할 것이다.
위에 언급된 바와 같이, 처음에 아스파르테이트 경로 아미노산에 사용된 효소는 아스파르토키나아제인데, 이는 하나 또는 그 이상의 라이신, 트레오닌 및 메티오닌에 따라서 피드백 조절이 된다. 예를 들어, E. coli는 세 개의 아스파르토키나아제 동위 효소를 가지는데, - 둘은 아스파르토키나아제 및 호모세린 데하이드로게나아제 활성과 함께 두 가지의 기능을 갖고, 이는 I-호모세린 데하이드로게나아제 I (AK/HD-I; thrA)와 아스파르토키나아제 II-호모세린 데하이드로게나아제 II (AK/HD-II; metL) 그리고 다른 하나는 아스파르토키나아제 활성 하나만을 가지며, 아스파르토키나아제 III (AK-III; lysC)라고 명명된다. AK/HD-I는 트레오닌(트레오닌 및 류신의 발현 억압과 마찬가지로) 조절 피드백을 따르는데, AK/HD- II는 메티오닌 단독의 조절 피드백을 따르고, AK-III는 단독으로 라이신 조절 피드백을 따른다. (Patte et al., Biochim . Biophys . Acta 136:245, 1967; Theze et al., J. Bacteriol. 117: 133, 1974 참조). 반면에, Corynebacterium glutamicum 아스파르토키나아제는 라이신 및 트레오닌 둘 다의 피드백에 따라 억제되었다. (Sano and Shiio , 1970; Yoshida et al., 2007). 호모세린 0-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 등 아스파르테이트 경로 아미노산의 생합성과 관련된 효소는, 피드백 억제에 따른다.
따라서, 본 발명은 내인성, 외인성 또는 둘 다의 활성을 가지는 아스파르토키나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 0-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제 등의 비조절성의 효소를 가지는 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서 아스파르토키나아제는 호모세린 데하이드로게나아제 활성을 선택적으로 컨쥬게이트했을 수 있다. 피드백에 저항력있는 돌연변이를 확인하는 방법은 배경 기술에서도 알려져 있는데, 예를 들어 아미노산 유사체의 존재 하에서 성장할 수 있는 능력이 있는, 라이신 유사체 S-2-아미노에틸-L-시스테인 (AEC) 또는 메티오닌 유사체 DL-메티오닌은 독성 유사체에 상응해서 아미노산 피드백에 저항력이 있다고 볼 수 있다. (Shiio et al., Agric . Bioi . Chem . 54:3275, 1990; Kumar and Gomes, Biotechnology Advances 25:41-61, 2005 참조).
특정 측면에서, 본 발명은, 비천연 수소영양 미생물로서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현 또는 과발현하고, H2/COx 기질을 대사하여 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하는 것을 제공한다. 특정 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성은 아스파르토키나아제 돌연변이로서, 하나 또는 그 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌은 피드백 억제에 대해서 저항력이 있다. 다른 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성은 자발적인 돌연변이, 무작위의 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 이 중의 어떤 것의 조합을 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해서 코딩된다.
추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위, 라이신 결합 부위, 라이신 및 트레오닌 결합 부위, 라이신 또는 트레오닌 결합 부위가 아닌 다른 위치, 이 중의 어떤 것의 조합을 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해서 코딩된다. 특정 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 thrA 유전자에 의해서 코딩된다. 다른 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성은 메티오닌 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 metL 유전자에 의해서 코딩된다.
본 발명에서 lysC 피드백에 저항력 있는 돌연변이를 언급할 때, 그 언급은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 LysC 단백질 (GenBank Accession No. CAF18822.1)에 상응하는 잔기 넘버링에 대한 것이다. 예시적인 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, 1375, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 결합 부위는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382 또는 이중의 어떤 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 및 트레오닌 결합 부위는 잔기 D294에 있다. 라이신 및 트레오닌 결합 부위 이외의 예시적인 돌연변이는 F293, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386 또는 이중의 어떤 조합을 포함한다. 앞서 언급된 돌연변이 중 하나 또는 그 이상은, 아스파르토키나아제 폴리펩타이드가 그 키나아제활성을 유지한다는 전제 하에 본 발명의 내용의 아스파르토키나아제에 포함된다.
아스파르테이트 경로 아미노산의 생합성이 효율적으로 발생하게 하기 위해서는, 일정한 양의 탄소 유동을 경로를 통해 유입해야 한다. 아스파르테이트 경로 아미노산의 생산을 신장시키거나 또는 개선하기 위해서는 본 발명에서 제공되는 대로 이 경로로 탄소 유동을 최대화해야 한다.
다른 측면에서는, 본 발명은 비천연 수소영양 미생물을 제공하며, 여기에서 비천연 수소영양 미생물은 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성, 증가한 피루베이트 키나아제 활성, 증가한 피루베이트 카르복실라아제 활성, 증가한 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성 또는 이중의 어떤 것의 조합이고, 또 여기에서 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 대사한다. 특정 구체예에서, 비천연 수소영양 미생물은 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성 또는 둘 다를 가진다. 어떤 다른 구체예에서, 비천연 수소영양 미생물은 증가된 피루베이트 카르복실라아제 활성, 증가된 피루베이트 신타아제, 증가된 아세틸- CoA 신타아제, 증가된 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성, 또는 이중의 어떤 것의 조합을 갖는다.
추가적인 구체예에서는 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물 역시 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘 다를 가진다. 더욱 추가적인 구체예에서는 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물 역시 증가된 피루베이트 카르복실라아제 활성, 증가된 피루베이트 신타아제, 증가된 아세틸-CoA 신타아제, 증가된 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성 또는 이들의 임의의 조합을 가진다. 이런 구체예 각각에서, 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 만들기 위해 H2/COx 기질을 대사한다.
여기에서 지적한 것과 같이, 피드백 조절에 따르는, 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하는 몇몇의 생합성 효소(예를 들어 아스파르토키나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제), 이러한 효소를 코딩하는 유전자는 억압에 따르고, (예를 들어 호모세린 데하이드로게나아제), 또는 둘 다(예를 들어 디하이드로디피콜리네이트 신타아제)에 따른다. 따라서, 본 발명에 제공된 대로 아스파르테이트 경로 아미노산의 생산은 조절, 억압 또는 둘 다를 보조함으로써 개선될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 비조절성 및/또는 활성화된 폴리펩타이드를 포함하고, 모체 수소영양 미생물(예를 들면 더 높은 수준의 라이신, 글라이신, 트레오닌, 메티오닌)보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 대사하는 비천연 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서 비천연 수소영양 미생물은 활성화된, 비조절성, 또는 둘 다에 해당되는 아스파르토키나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제 (예를 들면 met A), O-숙시닐호모세린 리아제 (예를 들면 metB) 또는 이들의 임의의 조합을 가진다.
추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 수소영양 미생물은 또한 아스파르테이트 족 아미노산 생합성을 위한 하나 또는 그 이상의 경로를 가진다. 더욱 추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 또한 활성화되거나, 비조절성이거나, 또는 둘 다에 해당되는 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제 (예를 들어 metA), O-숙시닐호모세린 리아제 (예를 들어 metB), 또는 이 중의 어떤 것의 조합을 가질 수 있는데, 이는 활성화되거나, 비조절성이거나, 또는 둘 다에 해당될 수 있으며, 활성화되거나, 비조절성이거나, 또는 둘 다는 자발적인 돌연변이, 무작위의 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합이든 이 중에서 하나 또는 그 이상에 의할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 과잉생산하는 것에 더하여, 생산된 아미노산의 추출이나 분리를 하지 않는 것이 유리할 것이다. 이에 따라서, 본 발명은 분리 또는 정제 방법이 단순화된 배양 배지에서 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 생산을 개선하는 방법을 제공한다.
더욱 추가적인 측면에서 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 엑스포터(exporter)을 발현 또는 과발현하며, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하기 위해 H2/COx 기질을 대사하는 비천연 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서 비천연 수소영양 미생물은 강한 발현 조절 서열에 링크되어있는 (예를 들어 nif 또는 tet 프로모터) rhtA 또는 lysE 엑스포터(exporter)등, 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산의 엑스포터를 발현 또는 과발현한다. 다른 구체예에서는, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의, 비천연 수소영양 미생물 수송체/임포터(importer)가 녹아웃 또는 억제되어 있다.
아스파르테이트 족 아미노산을 위한 특정한 생합성 경로로 탄소 유동을 보장하기 위한 방법으로는, 다른 경쟁적인 아미노산의 생산을 제거하는 것이다. 본 발명에서 제공되듯이, 수소영양 미생물은 하나 또는 그 이상의 아미노산의 영양 요구체가 될 수 있다.
또 다른 추가적인 측면에서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 위한 영양 요구체이고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해 H2/COx 기질을 대사하는 비천연 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서, 비천연 수소영양 미생물은 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 어떤 다른 구체예에서는, 비천연 수소영양 미생물이 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 몇 몇 구체예에서, 비천연 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 둘 다이다.
추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 위한 영양 요구체이다. 더욱 추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 역시 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 더욱 추가적인 구체예에서는, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 또한 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 더 추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 또한 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 둘 다이다.
특정 경우에, 단순히 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 족 아미노산을 생산하는 생합성 효소를 과발현하는 것이 본 발명의 수소영양 미생물에 유용하다.
더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 아스파르테이트 족 아미노산 생합성을 위한 하나 또는 그 이상의 경로로부터 나온 폴리펩타이드를 과발현하는 비천연 수소영양 미생물을 제공하는데, 이 때 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물 보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 대사한다. 특정 구체예에서, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제가 과발현되었거나 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제 또는 둘 다 과발현되거나, 또는 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제 또는 둘 다 과발현되거나, 또는 호모세린 0-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다가 과발현되거나, 또는 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드가 과발현된다.
추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 또한 아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위한 경로에서의 폴리펩타이드를 과발현한다. 어떤 추가적인 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제 (디하이드로디피콜리네이트 신타아제라고도 알려져 있는), LL- 디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제 (예를 들어 asd 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (예를 들어 dapA 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (예를 들어 dapB 또는 그 변이체로 코딩된), LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 (예를 들어 dapL 또는 그 변이체로 코딩된), 및 선택적으로 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제 (예를 들어 lysA 또는 그 변이체로 코딩된); 또는 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제 또는 둘 다를 과발현; 또는 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제 또는 둘 다를 과발현; 또는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다를 과발현; 또는 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 과발현한다.
미생물 유기체 내의 외인성 또는 이종의 핵산 발현을 위한 재조합 방법은 배경기술에서도 잘 알려져 있다. 이런 방법은 그 서술을 확인할 수 있는데, 예를 들어 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에서 찾을 수 있다. 예시로서, 발현 예정인 라이신 생합성과 연관된 단백질 또는 효소는, (예를 들어, 아스파르토키나아제, 아스파르토키나아제 I-호모세린 데하이드로게나아제 I, 아스파르토키나아제 II-호모세린 데하이드로게나아제 II, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제 [디하이드로디피콜리네이트 신타아제라고도 알려진], LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 메소- 디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라아제, 테트라하이드로디피콜리네이트 아세틸트랜스퍼라아제, N-숙시닐 디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 아세틸-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, N-숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라아제, N-아세틸 디아미노피멜레이트 아세틸라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합), 트레오닌 생합성 (예를 들어 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 트레오닌 신타아제, 또는 이들의 임의의 조합), 메티오닌 생합성 (예를 들어 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-신타아제, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라아제, 메티오닌 신타아제 (코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합), 또는 아미노산 생합성 경로의 아스파르테이트 기(예를 들어 피루베이트 키나아제, 피루베이트 카르복실라아제, 피루베이트 신타아제, 아세틸-CoA 신타아제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합) 내로의 탄소 유동에 영향을 주는 효소를 포함한다. 이 중에서 효소를 코딩하는 핵산 분자 또는 기능적인 단편으로의 유전적 수정은 자연적으로 발생하는 상태에서 변이된 재조합 세포에 생화학적 또는 대사하는 능력을 부여할 수 있다.
본 발명 상에서 수소영양 미생물 중 어떤 것이든, 숙주에게 새롭거나 개선된 활성(예를 들어 효소의 활성)을 제공하는 최소한 하나의 외인성 핵산을 갖도록 변형될 수 있고 내인성 유전자 기능을 배경 기술에서 이미 알려져 있는 다양한 방법으로 유전적으로 제거하거나 본질적으로 감소하도록 유전적으로 수정될 수 있다. 수소영양 메탄 생성 고세균 등의 미생물에서 이종의 핵산 분자를 이송하고 발현하는 유전적 도구는 배경 기술에서 이미 알려져 있다.(예를 들어 Rother et al., Curr . Opin. Microbiol . 8:145, 2005; Leigh et al., FEMS Microbiol . Rev. 35:511, 2011 참조). 예를 들어, DNA 운반(Dodsworth et al, Appl . Environ. Microb . 76:5644, 2010; Metcalf et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 94:2626, 1997), 셔틀 벡터 (Gardner and Whitman, Genetics 152:1439, 1999; Metcalf et al., 1997)를 위해, 이종의 유전자의 조절된 발현 (Lie and Leigh, J. Bacteriol . 184:5301, 2002; Chaban et al., Mol . Microbiol . 66:596, 2007; Guss et al., Archea 2: 193, 2008), 및 녹인(knock-in) 또는 녹아웃 유전적 교환 (Moore and Leigh, J. Bacteriol. 187:912, 2005; Pritchett et al., Appl. Environ. Microb. 70: 1425, 2004)을 위한 도구의 사용이 가능하다. 따라서, 수소영양 미생물에서, 비활성화, 녹아웃 또는 내인성 유전자 기능을 결실하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 숙주 수소영양 미생물에서 아미노산 생합성 경로 효소를 코딩하는 외인성 핵산 분자의 높은, 구성적 발현을 위한 프로모터, 코돈 최적화, 또는 둘 다가 이용될 수 있다. 특정 구체예에서는, 숙주 수소영양 미생물(예를 들어, 메탄 생성 고세균)에서의 외인성 핵산의 조절된 발현이 생합성 경로 효소 또한 활용될 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산 생합성 효소를 코딩하는 외인성 핵산 분자의 조절된 발현은, 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물의 성장률을 최적화하는 데에 요구될 수 있다. H2/COx 기질의 존재에 대한 반응으로서 아미노산 생합성 효소를 코딩하는 핵산 분자의 조절된 발현은, H2/COx 기질의 가능한 다양한 공급원 또는 비율에 비추어 그 성장을 개선할 수 있다.
여기에서 서술된 것과 같이, 하나 이상의 이종의 또는 외인성 핵산 분자는 분리된(separate) 핵산 분자로서, 개별적으로 조절된 유전자의 복수로서, 폴리시스트로닉 핵산 분자로서, 융합 단백질을 코딩하는 단독 핵산 분자로서 또는 이들의 임의의 조합으로서 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 여기에서 설명되어 있듯이, H2/COx을 대사하는 미생물은 아미노산의 아스파르테이트 족의 소망 생합성 효소를 코딩하는 둘 또는 그 이상의 이종의 또는 외인성 핵산 분자를 발현하기 위해서 수정될 수 있다. (예를 들어, 아스파르토키나아제, 아스파르토키나아제 I-호모세린 데하이드로게나아제 I, 아스파르토키나아제 II- 호모세린 데하이드로게나아제 II, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 메소- 디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 호모세린 신타아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-신타아제). 둘 또는 그 이상의 외인성 핵산 분자가 H2/COx를 대사하는 숙주 미생물에 도입되었을 경우, 두 개의 외인성 핵산 분자가 별도의 벡터에 단독 핵산 분자로 도입될 수 있으며(예를 들어 단독 벡터로), 이는 숙주 유전자의 단독 위치 또는 다중 위치에 통합될 수 있다. 참조된 이종의 핵산 분자 또는 단백질의 수는 코딩하는 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성 수를 의미하며, 숙주 세포에 도입된 각각의 핵산 분자 수를 의미하는 것은 아니다.
예를 들어, 수소영양 미생물 (예를 들어 메탄 생성 미생물)은 H2/COx 기질을 라이신, 트레오닌 또는 메티오닌 등 모체 미생물 보다 높은 수준으로 아스파르테이트 경로 아미노산을 만들기 위해서 활용, 전환 또는 대사할 수 있는 폴리펩타이드를 생산하기 위해 재조합적으로 변형될 수 있다.
배경의 방법으로서, 최소한 네 개의 서로 다른 라이신 생합성 경로가 고세균 및 박테리아에 존재하며, 네 개 모두 일반적으로 동시에 존재하지 않다고 하더라도, 하나 이상의 경로가 존재하는 것이 흔하지 않은 것은 아니다. 경로의 서로 다른 단계는 다양한 효소에 의해서 촉진되며, 이로써 이들 각각은 라이신의 생산을 진행시키기 위해서 효소의 양을 증가시키기 위해 과발현될 수 있다. 이러한 라이신 생합성 경로를 코딩하기 위해서 필요로 하는 핵산 분자는, 이 효소들이 없는, 수소영양 미생물에 재조합적으로 추가될 수 있다. 최종적으로, (a) 라이신 생산으로 연결되는 경로는 약화, 차단, 또는 녹아웃될 수 있고, (b) 라이신 생산을 개선할 수 있는 단계(예를 들어 탄소 유동을 라이신 생합성으로 이동)는 변이가 발생할 수 있고, 또는 (c) 생산된 라이신의 양을 최대로 하기 위해서 둘 다가 변경될 수 있다.
라이신 생합성을 위한 첫 번째 경로는 다음 효소들을 포함한다: 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜메이트 신타아제, 디하이드로디피콜메이트 리덕타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제. 라이신 생합성을 위한 두 번째 경로는 다음 효소들을 포함한다: 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜메이트 신타아제, 디하이드로디피콜메이트 리덕타아제, 메소- 디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제. 라이신 생합성을 위한 세 번째 경로는 다음의 효소를 포함한다: 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜메이트 신타아제, 디하이드로디피콜메이트 리덕타아제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라아제, N-숙시닐 디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, N-숙시닐 디아미노피멜레이트 데숙시닐라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제. 라이신 생합성을 위한 네 번째 경로는 다음을 포함한다: 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, 테트라하이드로디피콜리네이트 아세틸트랜스퍼라아제, 아세틸-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, N-아세틸 디아미노피멜레이트 아세틸라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제.
특정 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 추가적으로 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하고, 여기에서 서술되어 있듯이 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 라이신을 생산한다. 추가적인 구체예에서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 다른 구체예에서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정한 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하고, 여기에서 디하이드로디피콜리네이트 신타아제이 선택적으로 과발현된다. 추가적인 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제(예를 들어 asd 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제(예를 들어 dapA 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제(예를 들어 dapB 또는 그 변이체로 코딩된), LL- 디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제(예를 들어 dapL 또는 그 변이체로 코딩된), 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제(예를 들어 lysA 또는 그 변이체로 코딩된)를 코딩한다.
특정 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 추가적으로 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 이는 추가적으로 (a) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 트레오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (b) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 메티오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (c) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 글라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (d) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 라이신 저하 경로 폴리펩타이드(예를 들면 cadA), 또는 (e) 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 호모세린 데하이드로게나아제 유전자는 녹아웃되었거나 호모세린 데하이드로게나아제 돌연변이의 감소된 활성을 코딩한다.
앞서 언급된 수소영양 미생물 중 어떤 것에서든, 외인성 핵산 분자는 게놈에 통합되어 있거나 또는 자기 복제하는 벡터 안에 핵산 분자가 존재한다. 추가적으로, 앞서 언급된 비천연 수소영양 미생물 중 어떤 것에서든, 비천연 수소영양 미생물은 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
추가적인 구체예에서, 비조절성, 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 추가적으로 포함하며, 여기에서 서술되어 있듯이 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 더 높은 수준으로 트레오닌을 생산한다. 추가적인 구체예에서, 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 트레오닌 신타아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 선택된다. 특정 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다를 코딩하고, 여기에서 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다가 선택적으로 과발현되었거나 비조절되었거나 둘 다 된다.
특정 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 추가적으로 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 이는 추가적으로 (a) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (b) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 메티오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (c) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 아이소류신 생합성 경로 폴리펩타이드, (d) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 글라이신 저하 경로 폴리펩타이드, (e) 하나 또는 그 이상의 트레오닌 저하 경로 폴리펩타이드 (예를 들어 tdh), 또는 (f) 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 라이신 또는 아이소류신 생합성 경로 핵산 분자는 녹아웃되거나 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제 돌연변이 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 활성을 코딩한다.
앞서 언급된 비천연 수소영양 미생물 중 어떤 것에서든, 외인성 핵산 분자는 게놈 또는 외인성 핵산 분자 내로 통합되거나 외인성 핵산 분자는 자기 복제하는 벡터 내에 있다. 추가적으로, 앞서 언급된 비천연 수소영양 미생물 중 어떤 것에서든, 비천연 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합에 해당한다.
더욱 추가적인 구체예에서, 비조절성, 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 메티오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 추가적으로 포함하며, 여기에서 서술되어 있듯이 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 더 높은 수준으로 메티오닌을 생산한다. 추가적인 구체예에서, 메티오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제 {예를 들어 met A), O-숙시닐호모세린 리아제 (예를 들어 metB), 시스타티오닌 γ-신타아제, 시스타티오닌 β- 리아제, 0-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라아제, 메티오닌 신타아제 (코발라민 의존적 또는 비의존적), 또는 이들의 임의의 조합 중에 선택된다. 특정 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다를 코딩하고, 여기에서 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다가 선택적으로 과발현되거나, 비조절되거나 둘 다 된다.
어떤 다른 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 또는 둘 다를 코딩하는데, 여기에서 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 또는 둘 다가 선택적으로 과발현되거나 비조절되거나 둘 다 된다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 외인성 핵산 분자는 E. coli ThrA (AK/HD-I), E. coli MetL (AK/HD-II), 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O- 아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 또는 이들의 조합을 코딩하고, 여기에서 AK/HD-I, AK HD-II, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 또는 이들의 조합이 선택적으로 과발현되거나, 비조절되거나 둘 다 된다. 특정 구체예에서, E. coli ThrA (AK/HD-I)는 비조절성의 돌연변이이고, 여기에서 AK/HD-Isms 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치 G330, S345, S352, 및 G433에서 돌연변이가 발생한다.
특정 구체예에서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 비천연 수소영양 미생물은 추가적으로 메티오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 이는 추가적으로 (a) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 메티오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (b) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 트레오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (c) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 글라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (d) 녹아웃되거나 활성이 감소된 하나 또는 그 이상의 메티오닌 저하 경로 폴리펩타이드(예를 들어 metA), (e) 이들의 임의의 조합을 포함한다.
앞서 언급된 비천연 수소영양 미생물에서, 외인성 핵산 분자는 게놈에 통합되어 있거나, 외인성 핵산 분자는 자기 복제하는 벡터에 포함되어 있다. 추가적으로, 앞서 언급된 비천연 수소영양 미생물 중 어떤 것이든, 비천연 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 측면에서, 본 발명은 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하는데, 이 때 재조합 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물 보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있다. 특정 구체예에서, 수소영양 미생물은 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는데, 이는 예를 들어 하나 또는 그 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 억제에 저항력이 있는 내인성 아스파르토키나아제 돌연변이 등이다. 추가적인 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 과발현하는 첫 번째 외인성 핵산 분자 또는 비조절성의 외인성 아스파르토키나아제 활성을 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자는, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 억제에 저항성인 외인성 아스파르토키나아제 돌연변이 등이다. 특정 구체예에서, 비조절성의 외인성 아스파르토키나아제 활성은 돌연변이가 발생한 E. coli 아스파르토키나아제 유전자에 의해서 코딩되는데, 이는 예를 들어 돌연변이가 발생한 아스파르토키나아제 I-호모세린 데하이드로게나아제 I 단백질 (GenBank Accession No. BAB96579.2), 돌연변이가 발생한 아스파르토키나아제 II-호모세린 데하이드로게나아제 II 단백질 (GenBank Accession No. BAE77370.1) 또는 돌연변이가 발생한 아스파르토키나아제 III 단백질 (GenBank Accession No. BAE78026.1)이다. 특정 구체예에서 비조절된 외인성 아스파르토키나아제 활성은 아미노산 포지션 G330, S345, S352 및 G433에서 돌연변이가 발생한 E. coli 아스파르토키나아제 ThrA 단백질에 의해서 제공(GenBank Accession No. BAB96579.2)되었거나, 아미노산 위치 T342에서 돌연변이가 발생한 돌연변이 E. coli 아스파르토키나아제 lysC 단백질에 의해서 제공(GenBank Accession No. BAE78026.1)되었다. 다른 구체예에서, 비조절성의 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성은 각각 자발적인 돌연변이, 무작위의, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 돌연변이 thrA 유전자, metL 유전자, lysC 유전자 또는 이중의 조합에 의해서 개별적으로 코딩되었다.
추가적인 구체예에서, 비조절성의 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성은 트레오닌 결합 부위, 라이신 결합 부위, 라이신 및 트레오닌 결합 부위, 라이신 또는 트레오닌 결합 부위 이외의 어떤 위치, 또는 이들의 임의의 조합에 따른 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 코딩되었다. 본 발명에서 lysC 돌연변이에 대해 언급할 때는, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 LysC 단백질(GenBank Accession No. CAF18822.1)에 상응하는 잔기 넘버링을 참조로 한다. 예시적인 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, 1375, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 결합 부위 돌연변이는 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이는 잔기 D294에 있다. 라이신 및 트레오닌 결합 부위 이외의 다른 위치의 예시적인 돌연변이는 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 앞서 언급된 돌연변이 중 하나 또는 그 이상은 아스파르토키나아제 폴리펩타이드가 그 키나아제 활성을 유지한다는 전제 하에 본 발명의 아스파르토키나아제 활성에 포함될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 피루베이트 키나아제 활성을 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자, 피루베이트 카르복실라아제 활성을 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 세 번째 외인성 핵산 분자 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고 선택적으로 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성을 가지며, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있는 재조합 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘 다를 가질 수 있다. 어떤 다른 구체예에서는, 재조합 수소영양 미생물은 증가한 피루베이트 카르복실라아제 활성, 증가한 아세틸-CoA 신타아제, 증가한 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성 또는 이들의 임의의 조합이든 가질 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위한 하나 또는 그 이상의 경로에서 변이된 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산 분자를 포함하고, 여기에서 하나 또는 그 이상의 코딩된 폴리펩타이드가 비조절성의 또는 활성화되고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있는 재조합 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 활성화, 비조절성의 또는 둘 다 된 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 또는 이들의 임의의 조합을 가진다.
더욱 추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 엑스포터를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하는데, 여기에서 재조합 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 추가적으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 rhtA 또는 lysE 엑스포터 등 엑스포터를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 비천연 수소영양 미생물의 수송체/임포터는 녹아웃되었거나 억제되었다.
더 추가적인 측면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 생합성을 녹아웃하는 유전적 수정을 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하는데, 여기에서 재조합 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있다. 특정 구체예에서, 재조합 수소영양 미생물은 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 어떤 다른 구체예에서는, 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 구체예에서 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체 또는 이들의 임의의 조합이다.
어떤 추가적인 측면에서, 본 발명은 아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위한 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 외인성 핵산 분자를 포함하는 재조합 수소영양 미생물을 제공하는데, 여기에서 재조합 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 경로 아미노산을 생산하기 위해서 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있다.
특정 구체예에서, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제 (디하이드로디피콜리네이트 신타아제라고도 알려져있는), LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합이 과발현되었고; 또는 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제 (예를 들어 asd 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (예를 들어 dapA 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (예를 들어 dapB 또는 그 변이체로 코딩된), LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 (예를 들어, dapL 또는 그 변이체로 코딩된), 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제 (예를 들어, lysA 또는 그 변이체로 코딩된)이 과발현되었거나; 또는 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제 또는 둘 다가 과발현되었거나; 또는 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제 또는 둘 다가 과발현되었고; 또는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다가 과발현되었거나; 또는 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드가 과발현되었다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 추가적으로 포함하며, 여기에서 서술되었듯이 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 라이신을 생산한다. 추가적인 구체예에서, 라이신 생합성 경로에서 코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 다른 구체예에서는, 라이신 생합성 경로에서 하나 또는 그 이상의 코딩된 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 구체예에서, 두 번째 외인성 핵산 분자는 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하는데, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제는 선택적으로 과발현되었고, 핵산 발현 조절 서열과 작동가능하게 링크되었거나, 또는 둘 다에 해당한다. 특정 구체예에서, 두 번째 외인성 핵산 분자는 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제 (예를 들어 asd 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (예를 들어 dap A 또는 그 변이체로 코딩된), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (예를 들어, dapB 또는 그 변이체로 코딩된), LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 (예를 들어 dapL 또는 그 변이체로 코딩된), 그리고 선택적으로 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제 (예를 들어 lysA 또는 그 변이체로 코딩된)를 코딩하며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 전체 개별적인 핵산분자가 코딩하는 서열은 선택적으로 과발현되었거나, 핵산 발현 조절 서열에 작동가능하게 링크되어 있거나, 또는 둘 다에 해당한다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 추가적으로 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 추가적으로 (a) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 트레오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (b) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 메티오닌 생합성경로 폴리펩타이드, (c) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 글라이신 생합성경로 폴리펩타이드, (d) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 라이신 저하 경로 폴리펩타이드 (예를 들어 cadA) 또는 (e) 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 호모세린 데하이드로게나아제 유전자는 녹아웃되었거나 감소된 호모세린 데하이드로게나아제 돌연변이의 활성을 코딩한다.
앞서 언급된 재조합 수소영양 미생물은, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 게놈에 통합되어 있거나 첫 번째 외인성 핵산 분자가 자기 복제하는 벡터 내에 있다. 추가적으로, 앞서 언급된 어떤 재조합 수소영양 미생물이든, 재조합 수소영양 미생물은 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
더 추가적인 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 추가적으로 가지고, 재조합 수소영양 미생물은 여기에서 서술되었듯이 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 트레오닌을 생산한다. 추가적인 구체예에서 트레오닌 생합성 경로에서 코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 트레오닌 신타아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된다. 특정 구체예에서는, 두 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다를 코딩하며, 여기에서 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다는 선택적으로 과발현되었고, 핵산 발현 조절 서열, 비조절성의, 또는 이들의 임의의 조합에 작동가능하게 링크되어있다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 추가적으로 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 추가적으로 (a) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (b) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 메티오닌 생합성경로 폴리펩타이드, (c) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 아이소류신 생합성 경로 폴리펩타이드, (d) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 글라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (e) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 트레오닌 저하 경로 폴리펩타이드 (예를 들어 tdh) 또는 (f) 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 라이신 또는 아이소류신 생합성 경로 핵산 분자는 녹아웃되었거나 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제 돌연변이, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 활성을 코딩한다.
앞서 언급된 재조합 수소영양 미생물은, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 게놈에 통합되어 있거나 첫 번째 외인성 핵산 분자가 자기 복제하는 벡터 내에 있다. 추가적으로, 앞서 언급된 어떤 재조합 수소영양 미생물이든, 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
더 추가적인 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성, 호모세린 0-아세틸트랜스퍼라아제, 또는 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제를 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 메티오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 추가적으로 가지고, 재조합 수소영양 미생물은 여기에서 서술되었듯이 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 메티오닌을 생산한다. 추가적인 구체예에서 메티오닌 생합성 경로에서 코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드는 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 0-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제 (예를 들면 metA), O-숙시닐호모세린 리아제 (예를 들면 metB), 시스타티오닌 γ-신타아제, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라아제, 메티오닌 신타아제 (코발라민 의존성 또는 비의존성, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된다. 특정 구체예에서는, 두 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다를 코딩하고, 여기에서 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다가 선택적으로 과발현되거나, 핵산 발현 조절 서열이 작동가능하게 링크되어 있거나, 비조절성이 되거나 이중의 어떤 조합으로 되어있다. 어떤 다른 구체예에서는, 두 번째 외인성 핵산 분자는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 또는 둘 다를 코딩하고, 여기에서 호모세린 0-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 또는 둘 다가 선택적으로 과발현되거나, 핵산 발현 조절 서열이 작동가능하게 링크되어 있거나, 비조절성이 되거나 이중의 어떤 조합으로 되어있다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 가지는 재조합 수소영양 미생물은 추가적으로 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 추가적으로 (a) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (b) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 트레오닌 생합성 경로 폴리펩타이드, (c) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 이상의 글라이신 생합성 경로 폴리펩타이드, (d) 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 메티오닌 저하 경로 폴리펩타이드 (예를 들어 metK) 또는 (e) 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서는, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 핵산분자는 녹아웃되었거나 감소된 활성 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합의 감소된 활성을 코딩한다.
앞서 언급된 재조합 수소영양 미생물은, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 게놈에 통합되어 있거나 첫 번째 외인성 핵산 분자가 자기 복제하는 벡터 내에 있다. 추가적으로, 앞서 언급된 어떤 재조합 수소영양 미생물이든, 재조합 수소영양 미생물은 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 구체예에서, 여기에서 서술된 바와 같이 수소영양 미생물은 아스파르토키나아제 (EC 2.7.2.4) 또는 디하이드로디피콜리네이트 신타아제(EC 4.3.3.7)를 발현하거나 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있고, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.83), 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제 (EC 1.4.1.16), 또는 둘 다를 선택적으로 발현하거나 과잉생산하기 위해서 조작된다. 특정 구체예에서, 수소영양 미생물은 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (EC 4.3.3.7), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (EC 1.3.1.26)와 LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.83)발현하거나 과잉생산하기 위해서 조작된다. 추가적 구체예서, 수소영양 미생물은 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제 (EC 1.2.1.11), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (EC 4.3.3.7), 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 (EC 1.3.1.26), LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.83), 및 선택적으로 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제 (EC 4.1.1.20)가 발현하거나 과잉생산하기 위해서 조작된다. 이런 구체예들 중에서, 수소영양 미생물은 탐지할 수 있거나 과도한 라이신을 생산하기 위해서 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제 (EC 1.2.1.11)를 추가적으로 발현하거나 과잉생산할 수 있다. 이러한 구체예들 중에서, 수소영양 미생물은 라이신에 의한 피드백 억제에 저항력이 있는, 돌연변이가 발생한 LysC (EC 2.7.2.4) 또는 돌연변이가 발생한 AK/HD-I (EC 2.7.2.4 / EC 1.1.1.3) (예를 들어, 아미노산 변화 G433R의 핵산 위치 G1297A에 일치하는)을 코딩할 수 있다.
예를 들어, 아스파르토키나아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서는, E. coli (thrA), E. coli (metL), E. coli (lysC), Corynebacterium glutamicum (lysC), 또는 Methanococcus maripaludis (lysC) 중에서 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물(예를 들어 메탄 생성 미생물)로 도입되어 발현 또는 과발현될 수 있고, 이에 따라 외인성 아스파르토키나아제 또는 기능적 단편이 생산 또는 과잉생산될 수 있다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 및 방법에 사용되는 아스파르토키나아제 폴리펩타이드는 Corynebacerium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAF18822.1), Methanococcus maripaludis S2 (Genbank Accession No. CAF30573.1), Methanocella conradii HZ254 (Genbank Accession No. AFD00291.1), Methanobrevibacter ruminantium Ml (Genbank Accession No. ADC47522.1), E. co/z K-12 substr. W3110 thrA (GenBank Accession No. BAB96579.2); E. coli K-12 substr. W3110 metL (GenBank Accession No. BAE77370.1); E. coli K-12 substr. W3110 lysC (GenBank Accession No. BAE78026.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 또는 그의 아미노산 서열 또는 기능적 단편은 E. coli K-12 substr. W3110에서 유래한 thrA, metL, 또는 lysC 아미노산 서열이며, 각각 Genbank Accession No. BAB96579.2, BAE77370.1 또는 BAE78026.1에서 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편과 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 아스파르토키나아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. BAB96579.2, BAE77370.1 또는 BAE78026.1에서 정해진 서열과 동일하거나, 아스파르토키나아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 아스파르토키나아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치 G330, S345, S352 및 G433 (예를 들어, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 또는 아르기닌에 대해)에서 돌연변이가 발생한 E. coli ThrA 단백질(GenBank Accession No. BAB96579.2)이거나 아미노산 위치 T342 (예를 들어, 아이소류신에 대해)에서 돌연변이가 발생한 E. coli LysC 단백질(GenBank Accession No. BAE78026.1)이다.
특정 구체예에서, 아스파르토키나아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 또는 Methanococcus maripaludis S2를 기초로 하였고, Genbank Accession No. CAF 18822.1 또는 CAF30573.1에 각각 정해진 서열 또는 그 기능적 단편과 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 아스파르토키나아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. BAB96579.2, BAE77370.1 또는 BAE78026.1에서 정해진 서열과 동일하거나, 아스파르토키나아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 아스파르토키나아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 아스파르토키나아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. CAF 18822.1, CAF30573.1, AFD00291.1, 또는 ADC47522.1,에서 정해진 서열과 동일하거나, 아스파르토키나아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 아스파르토키나아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
예를 들어, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Corynebacterium glutamicum (DapA), 또는 Methanococcus maripaludis ( DapA )에서부터의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 도입되거나 발현 또는 과발현되었고, 결과적으로 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 또는 생산 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산한다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 또는 방법에서 사용된 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAF20312.1), Methanococcus maripaludis S2 (Genbank Accession No. CAF30132.1), Methanocella conradii HZ254 (Genbank Accession No. AFC99231.1), 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml (Genbank Accession No. ADC47521.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Coryneb acterium glutamicum ATCC 13032 또는 Methanococcus maripaludis S2를 기초로 하였고, No. CAF20312.1 또는 CAF30132.1에 각각 정해진 서열 또는 그 기능적 단편과 최소한 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 디하이드로디피콜리네이트 신타아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. C AF20312.1, CAF30132.1, AFC99231.1 , 또는 ADC47521.1 에서 정해진 서열과 동일하거나, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
예를 들어, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Corynebacterium glutamicum (DapA), 또는 Methanococcus maripaludis 또는 Methanobrevibacter ruminantium (DapL)에서부터의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 도입되거나 발현 또는 과발현되었고, 결과적으로 LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 또는 생산 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산한다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 또는 방법에서 사용된 LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 단편은 Methanococcus maripaludis S2 (Genbank Accession No. Q6LX26.1) 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml (Genbank Accession No. ADC46792.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Methanococcus maripaludis S2 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. CAF20312.1 또는 CAF30132.1에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. Q6LX26.1 또는 ADC46792.1에서 정해진 서열과 동일하거나, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
예를 들어, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Corynebacterium glutamicum (lysC), 또는 Methanococcus maripaludis {lysC)에서부터의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 도입되거나 발현 또는 과발현되었고, 결과적으로 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제 또는 생산 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산한다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 또는 방법에서 사용된 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAF21279.1) 또는 Clostridium tetani E88 (Genbank Accession No. AA036992.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 또는 Clostridium tetani E88를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. CAF21279.1 또는 AA036992.1,에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. CAF21279.1 또는 AA036992.1에서 정해진 서열과 동일하거나, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 서술된 바와 같은 수소영양 미생물은 호모세린 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.3), 호모세린 키나아제 (EC 2.7.1.39) 또는 트레오닌 신타아제 (EC 4.2.3.1)를 발현하거나 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있다. 더 추가적인 구체예에서, 본원에 서술된 바와 같은 수소영양 미생물은 예를 들어, 탐지가능한 또는 과잉 트레오닌을 생산하기 위해 AK/HD-I (EC 2.7.2.4 / EC 1.1.1.3), 호모세린 키나아제 (EC 2.7.1.39) 또는 트레오닌 신타아제(EC. 4.2.3.1.)를 발현 또는 과잉생산하도록 조작될 수 있다. 이런 구체예 중에 어떤 것이든, 수소영양 미생물은 임의로 아스파라테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제 (EC 1.2.1.11)를 추가로 발현 과발현할 수 있다. 이런 구체예 중에 어떤 것이든, 수소영양 미생물은 돌연변이가 발생한, 트레오닌에 의한 피드백 억제에 저항력이 있는 AK/HD-I (EC 2.7.2.4. / EC 1.1.1.3.)(예를 들어, G1297A)를 코딩할 수 있다.
예를 들어, 호모세린 데하이드로게나아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Corynebacterium glutamicum (hom), 또는 Methanococcus maripaludis (hom) 에서부터의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 도입되거나 발현 또는 과발현되었고, 결과적으로 호모세린 데하이드로게나아제 또는 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산한다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 또는 방법에서 사용된 호모세린 데하이드로게나아제 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. BAB98576.1), Methanococcus maripaludis S2 (Genbank Accession No. CAF31258.1), Methanocella conradii HZ254 (Genbank Accession No. AFD00624.1), 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml (Genbank Accession No. ADC46990.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, 호모세린 데하이드로게나아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 또는 Methanococcus maripaludis S2를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. CAF20312.1 또는 CAF30132.1에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 호모세린 데하이드로게나아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession No. BAB98576.1 또는 CAF31258.1 에서 정해진 서열과 동일하거나, 호모세린 데하이드로게나아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 호모세린 데하이드로게나아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
예를 들어, 호모세린 키나아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Corynebacterium glutamicum (thrB), 또는 Methanococcus maripaludis {thrB)에서부터의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 도입되거나 발현 또는 과발현되었고, 결과적으로 호모세린 키나아제 또는 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산한다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 또는 방법에서 사용된 호모세린 키나아제 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. BAB98577.1), Methanococcus maripaludis S2 (Genbank Accession No. CAF29851.1), E. coli K-12 substr. W3110 thrB (GenBank Accession No. BAB96580.2), 또는 Methanocella conradii HZ254 (Genbank Accession No. AFC99758.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, 호모세린 키나아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 E. coli K-12 substr. W3110, Coryneb acterium glutamicum ATCC 13032 와 Methanococcus maripaludis S2를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. CAF20312.1 또는 CAF30132.1에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 호모세린 키나아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. BAB96580.2, BAB98577.1, CAF29851.1, 또는 AFC99758.1에서 정해진 서열과 동일하거나, 호모세린 키나아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 호모세린 키나아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
예를 들어, 트레오닌 신타아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, E. coli (thrC), Corynebacterium glutamicum (thrC), 또는 Methanococcus maripaludis (thrC)에서부터의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 도입되거나 발현 또는 과발현되었고, 결과적으로 트레오닌 신타아제 또는 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산한다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 또는 방법에서 사용된 트레오닌 신타아제 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. BAB99613.1), Methanococcus maripaludis S2 (Genbank Accession No. CAF29691.1), Methanocella conradii HZ254 (Genbank Accession No. AFD00584.1), E. coli K-12 substr . W3110 thrC (GenBank Accession No. BAB96581.1), 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml (Genbank Accession No. ADC47342.1)에서 유래한 것이다.
특정 구체예에서, 트레오닌 신타아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 E. coli K-12 substr. W3110, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 또는 Methanococcus maripaludis S2를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. BAB96581.1, BAB99613.1 또는 CAF29691.1에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 트레오닌 신타아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. BAB96580.2, BAB98577.1, CAF29851.1, 또는 AFC99758.1에서 정해진 서열과 동일하거나, 트레오닌 신타아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 트레오닌 신타아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
특정 구체예에서는, 수소영양 미생물은 직접적으로 H2S 등의 황 공급원을 포함하거나 직접적으로 메티오닌 생합성 경로에 포함할 수 있다. 수소영양 미생물이 사용할 수 있게 생산되었거나 존재하는 어떤 설파이드이든 호모시스테인 생합성을 진행할 수 있는데, 여기에서 O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제는 호모시스테인을 생산하기 위해서 O-아세틸호모세린에 H2S를 포함하는데, 이는 추가적으로, 메티오닌 신타아제(코발라민 의존성 또는 비의존성)에 의해서 메티오닌으로 전환될 수 있다.
예를 들어, 여기에서 서술된 대로 수소영양 미생물은 호모시스테인을 생산하기 위해서 H2S를 O-아세틸-호모세린에 포함할 수 있는 O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 (EC 2.5.1.49)를 발현 또는 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있고, 호모시스테인을 메티오닌으로 전환하기 위해서 코발이민-의존성 메티오닌 신타아제 (EC 2.1.1.13) 또는 코발이민-비의존성 메티오닌 신타아제 (호모시스테인 메틸트랜스퍼라아제라고도 알려져있는) (EC 2.1.1.14)를 발현 또는 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있다.
O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, 이런 Methanocella conradii 또는 Methanobrevibacter ruminantium를 기초로 하는 하나 또는 그 이상의 유전자가 본 발명 상의 수소영양 미생물 (예를 들어, 비천연 또는 재조합 메탄 생성 미생물)로 도입될 수 있고, 이로써 외인성 O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 그의 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산할 수 있다. 특정 구체예에서, 여기에서 설명된 조성물 및 방법을 위해서 O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 폴리펩타이드를 이용하는 방법은 Methanocella conradii HZ254 (Genbank Accession No. AFD00350.1), Methanobrevibacter ruminantium Ml (Genbank Accession No. ADC47419.1 또는 ADC46998.1), Clostridium difficile T19 (Genbank Accession No. ERM48664.1), Clostridium botulinum A str. ATCC 3502 (Genbank Accession No. CAL83417.1), Leptospira meyeri (Genbank Accession No. P94890.1), 또는 Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (Genbank Accession No. YP_351901.2)에서 유래한다.
특정 구체예에서, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Methanocella conradii HZ254 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml S2를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. AFD00350.1 또는 ADC47419.1에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 동일 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. AFD00350.1, ADC47419.1, ADC46998.1, CCL83415.1, 또는 CAL83417.1, 에서 정해진 서열과 동일하거나, hO-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
앞서 언급된 O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 중에 어떤 것이든지, 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물은 여기에서 서술되었듯이 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제를 추가적으로 발현, 과발현 및 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있다.
추가적 구체예에서, 여기에서 서술되었듯이 수소영양 미생물은 코발라민-의존성의 메티오닌 신타아제 (EC 2.1.1.13) 또는 코발라민-비의존성의 메티오닌 신타아제 (호모시스테인 메틸트랜스퍼라아제라고도 알려져있는)(EC 2.1.1.14)을 발현 또는 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있고, 또한 O-아세틸호모 세린 서프하이드릴라아제를 선택적으로 발현 또는 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있다.
예를 들어, 코발라민 의존성 메티오닌 신타아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Escherichia coli (metH), Corynebacterium glutamicum (metH), 또는 Clostridium difficile의 하나 또는 그 이상의 유전자가 수소영양 미생물 (예를 들어, 비천연 메탄 영양 세균 박테리아)내에 도입 및 수소영양 미생물 (예를 들어, 비천연 메탄 영양 세균 박테리아)에서 발현 또는 과발현될 수 있고, 이로써 코발라민 의존성 메티오닌 신타아제 또는 그 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산할 수 있다. 특정 구체예에서 여기에서 설명된 조성물 및 방법을 위하여 사용되는, 코발라민-의존성 메티오닌은 Escherichia coli K-12 아주 MG1655 (Genbank Accession No. AAC76832.1), Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. BAB98900.1), Clostridium difficile F665 (Genbank Accession No. ERM51559.1), 또는 Psuedomonas putida GB-1 (Genbank Accession No. ABY97885.1)에서 유래한다.
특정 구체예에서, 코발라민 의존성의 메티오닌 신타아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. BAB98900.1에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편과 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 코발라민 의존성의 메티오닌는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. AAC76832.1, BAB98900.1, ERM51559.1, 또는 ABY97885.1, 또는 CAL83417.1에서 정해진 서열과 동일하거나, 코발라민 의존성의 메티오닌 신타아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 코발라민 의존성 메티오닌 신타아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, 예를 들어, 코발라민 의존성의 메티오닌 신타아제를 발현 또는 과잉생산하기 위해서, Escherichia coli (metE 또는 metB12), Corynebacterium glutamicum (metE), 또는 Methanococcus maripaludis (metE)의 하나 또는 그 이상의 유전자는 수소영양 미생물 (예를 들어, 비천연 메탄 영양 세균 박테리아)내에 도입 및 수소영양 미생물 (예를 들어, 비천연 메탄 영양 세균 박테리아)에서 발현 또는 과발현될 수 있고, 이로써 외인성 코발라민-비의존성의 메티오닌 신타아제 또는 그 기능적 단편을 생산 또는 과잉생산할 수 있다. 특정 구체예에서 여기에서 설명된 조성물 및 방법을 위하여 사용되는, 코발라민 비의존성 메티오닌은 Escherichia coli K-12 아주 MG1655 (Genbank Accession No. AAC76832 .1), Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Genbank Accession No. CAF19845 .1), Methanococcus maripaludis S2 ( Genbank Accession No. NP_987521.1), Methanocella conradii HZ254 ( Genbank Accession No. AFD00421 .1), 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml ( Genbank Accession No. ADC47470 . 1)에서 유래한다.
특정 구체예에서, 코발라민 비의존성 메티오닌 신타아제 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편은 Methanococcus maripaludis S2 또는 Methanobrevibacter ruminantium Ml를 기초로 했고, 각각 Genbank Accession No. NP 987521.1 또는 ADC47470.1,에 정해진 서열 또는 그의 기능적 단편에 최소한 최소 75%, 최소 80% 동일, 최소 85% 동일, 최소 90% 동일, 최소 91% 동일, 최소 92% 동일, 최소 93% 동일, 최소 94% 동일, 최소 95% 동일, 최소 96% 동일, 최소 97% 동일, 최소 98% 동일, 또는 최소 99% 동일하다. 다른 구체예에서, 재조합 방식으로 코딩된 코발라민 의존성의 메티오닌는 숙주 세포에 코돈 최적화된 아미노산 서열을 갖거나 또는 Genbank Accession Nos. AAC76832.1, CAF19845.1, NP 987521.1, AFD00421.1, 또는 ADC47470.1, 에서 정해진 서열과 동일하거나, 코발라민 비의존성 메티오닌 신타아제의 일치하는 서열을 포함하거나, 알려진 코발라민 비의존성 메티오닌 신타아제 폴리펩타이드의 복수의 일치하는 서열을 포함한다.
앞서 언급된 메틸 트랜스퍼라아제 구체예 중에 어떤 것이든지, 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물은 여기에서 서술되었듯이 0-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제를 추가적으로 발현, 과발현 및 과잉생산하기 위해서 조작될 수 있다.
앞서 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중에서 어떤 것에 대해서든, 본 발명은 메탄 생성 고세균, 예를 들어 Methanobacteruaum , Methanobrevibacter , Methanocalculus , Methanocaldococcus, Methanocella , Methanococcus , Methanococcoides , Methanocorpusculum, Methanoculleus , Methanofollis , Methanogenium , Methanohalobium, Methanohalophilus , Methanolacinia , Methanolobus , Methanomethylovorans , Methanomicrobium , Methanomicrococcus, Methanoplanus , Methanopyrus , Methanoregula , Methanosaeta , Methanosalsum, Methanosarcina , Methanosphaera, Methanospirillium , Methanothermobacter , Methanothermococcus , Methanothermus, 또는 Methanotorris 등 메탄 생성 고세균인 수소영양 미생물을 제공한다.
앞서 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중에서 어떤 것에 대해서든, 본 발명은 특정한 메탄 생성 고세균 종에 해당하는 수소영양 미생물을 제공한다. 예시적인 메탄 생성 고세균 종, 예를 들어 Methanobacterium alcaliphilum, Methanobacterium bryantii , Methanobacterium congolense , Methanobacterium defluvii , Methanobacterium espanolae , Methanobacterium formicicum , Methanobacterium ivanovii , Methanobacterium palustre , Methanobacterium thermaggregans, Methanobacterium uliginosum , Methanobrevibacter acididurans , Methanobrevibacter arboriphilicus , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter smithii , Methanobrevibacter woesei , Methanobrevibacter wolinii, Methanocella arvoryzae , Methanocella conradii , Methanocella paludicola, Methanothermobacter marburgensis , Methanothermobacter thermautotrophicum, Methanothermobacter thermoflexus , Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter wolfeii , Methanothermus sociabilis , Methanocorpusculum bavaricum , Methanocorpusculum parvum , Methanoculleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus , Methanogenium frigidum , Methanogenium liminatans , Methanogenium marinum , Methanomicrococcus blatticola , Methanoplanus endosymbiosus, Methanoplanus limicola , Methanoplanus petrolearius , Methanopyrus kandleri , Methanoregula boonei , Methanosaeta concilii, Methanosaeta harundinacea , Methanosaeta pelagica , Methanosaeta thermophila, Methanosarcina acetivorans , Methanosarcina barkeri , Methanosarcina mazei , Methanosarcina thermophila , Methanomicrobium mobile, Methanococcus aeolicus , Methanococcus maripaludis , Methanococcus vannielii , Methanococcus voltae , Methanothermococcus thermolithotrophicus , Methanopyrus kandleri, Methanothermobacter thermoautotroiphicus , Methanocaldococcus fervens, Methanocaldococcus indicus , Methanocaldococcus infernus , Methanocaldococcus jannaschii, 및 Methanocaldococcus vulcanius 등 이다.
앞서 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어떤 것에 대해서든, 본 수소영양 미생물은 사이토크롬을 생산하거나 생산하지 않는 메탄 생성 고세균를 포함한다. 사이토크롬을 생산하지 않는 예시적인 메탄 생성 고세균 Methanococcus maripaludis 또는 Methanococcus vannielii를 포함한다. 예시적인 사이토크롬을 생산하는 메탄 생성 고세균은 Methanosarcina barkeri 또는 Methanosarcina mazei이다.
앞서 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예 중 어떤 것에 대해서든, 본 발명은 박테리아에 있는 수소영양 미생물을 제공한다. 특정 구체예에서, 수소 영양생물은 Clostridium, Moorella , Pyrococcus , Eubacterium , Acetogenium, Acetobacterium , Desulfobacterium , Acetoanaerobium , Butyribaceterium, Carboxydothermus, 또는 Peptostreptococcus 등 합성기체 또는 CO 대사하는 미생물일 수 있다. 예시적인 Clostridium 종은 C. autoethanogenum, C. ljungdahli , C. ragsdalei , C. carboxydivorans , C. woodii , 및 C. neopropanologen을 포함하며, 예시적인 Butyribaceterium 종은 B. methylotrophicum이다. 어떤 다른 구체예에서, 수소 영양생물은 Cupriavidus necator, Hydrogenobacter thermophilus , Hydrogenovibrio marinus , 또는 Helicobacter pylori 등 Knall-기체 박테리아일 수 있다.
H 2 /CO x 기질
수소 생산은 순차적인 개질, 처리 및 분리 단계를 필요로 하는데, 여기에서 그 단계 중 몇몇 (예를 들어, 증기 개질, 자가열 개질, 높은 온도로의 이동, 낮은 온도로의 이동, C02 스크러빙 및 압력 변동 흡수)은, 그 자체로서 공급원료를 제공하거나, 하나 또는 그 이상의 기체 흐름과 조합하여 이 내용의 수소영양 미생물 및 방법을 위해 유용한 공급 재료로서 H2/COx 기질을 제공할 수 있다.
배경 기술의 방법으로서, 수소 생산은 합성기체와 H2/COx 기질을 생산하기 위해서 한 단계 또는 여러 단계의 개질, 부분적인 산화 또는 기체화를 필요로 할 수도 있으며, 고온의 물 이동(water shift)(HTS) 반응 또는 저온 물 이동(water shift)(LTS) 반응, 또는 둘 다와 결합될 수 있다. 어떤 방법에서는, 압력 변동 흡수 (PSA)를 사용하여 분자체와 함께 이산화탄소가 제거되는데, 이는 본질적으로 다양한 양의 이산화탄소 (C02), 일산화탄소 (CO), 및 메탄 (CH4)과 혼재되어 있는 잔여 H2 기체를 포함하는 끝 부분(tail) 기체에서 순수한 수소 (H2) 기체 흐름을 분리한다. 특정 구체예에서, 이산화탄소는 PSA에 기체(예를 들어, 합성기체)를 종속시키기 전에 선택적으로 스크럽될 수 있다. 사용된 합성기체 생산 과정 및 이산화탄소가 스크럽된 경우의 여부에 따라, 끝 부분(tail) 기체에서 서로 다른 비율의 H2, C02, CO, 및 CH4를 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하기 위한 H2/COx 기질은 PSA 끝 부분(tail) 기체 및 H2 기체의 혼합물을 포함하는 기체 흐름이다.
예를 들어, HTS와 결합된 메탄 증기 개질은 대부분 H2 (약 75%) 및 C02 (약 20%), 적은 양의 CH4 (약 5%) 및 CO를 아주 적게 갖거나 아예 없는 기체 스팀을 생산한다. 다른 예에서, LTS와 결합된 메탄 증기는 대부분 H2 (약 75%) 및 CO (약 10%), 일부 C02 (약 5%) 및 CH4 (약 1%)을 갖는 기체 증기를 생산한다. 다른 예에서, PSA와 결합된 메탄 증기는 대부분 H2 (약 30%) 및 C02 (약 45%), 적당한 양의 CO (약 10%) 및 CH4 (약 15%)의 기체 증기를 생산한다. 마지막 구체예에서, C02 스크러빙 단계가 포함되어 있다면, 끝 부분(tail) 기체는 대부분 H2 (약 50%), CH4 (약 30%) 및 CO (약 20%), 및 적은 양의 C02 (약 1%)의 기체 증기가 생산된다. 특정 구체예에서, PSA 끝 부분(tail) 기체는, 대상이 되는, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1 비율을 가지는 등의 H2/COx 기질을 생산하기 위해서 생산된 파이프라인 H2와 혼합되었다.
메탄의 증기를 개질하는 메탄은 각각 C02 대 H2가 1:7 내지 1:15의 비율을 가지는 공급 원료를 생산할 수 있고, 여기에서 다른 조성물로서는 CO, CH4 및 H20을 포함할 수 있다. 대안적으로, 메탄은 C02와 개질될 수 있고, 이는 건조(dry) 개질이라고 불린다. 메탄의 건조(dry) 개질은 각각 C02 대 H2가 1:5 내지 1:15의 비율을 가지는 공급 원료를 생산할 수 있고, 여기에서 다른 조성물로서는 CO, CH4, 및 H20를 포함할 수 있다.
부분적인 산화(촉매 작용의, 또는 촉매 작용에 의하지 않은) 및 자가열 개질은 산소를 물 대신에 천연 기체에 상호 반응물로 사용한다. 부분적인 산화 및 자가열 개질은 C02 대 H2가 약 1:20의 비율을 가지는 공급 원료를 생산할 수 있고, 여기에서 다른 조성물로서는 CO, CH4, 및 H20를 포함할 수 있다.
기체화, 즉 탄소를 포함하는 물질을 공기 또는 산소와 함께 부분적으로 산화하는 것(예를 들어. 액화 천연 가스, 나프타, 역청, 석탄, 바이오매스, 또는 이와 같은)은, 수소영양 미생물을 사용하기 위해서, 그리고 본 발명에서의 방법을 위해 H2/COx 공급 원료를 제공할 수 있다. 예를 들어, 석탄의 기체화 C02 대 H2가 각각 약 1:1.1 에서 약 1:11의 범위를 가지는 공급 원료를 생산할 수 있고, 여기에서 다른 조성물로서는 CO, CH4, N2, 및 H20를 포함할 수 있다.
암모니아 합성은 순차적인 개질, 처리 및 분리 단계를 필요로 하는데, 여기에서 그 단계 중 네 개(증기 개질, 자가열 개질, 높은 온도로의 이동, 낮은 온도로의 이동)는, 수소영양 미생물을 이용하기 위해서, 또한 본 발명의 방법을 위해 유용한 공급 원료로서 H2/COx 기질을 제공할 수 있다. 각각의 서로 다른 단계를 위해서, C02 대 H2가 각각 약 1:3 내지 약 1:10의 범위를 가지는 공급 원료가 생산되는 경우에, 여기에서 다른 조성물로는 CO, CH4, N2, 및 H20를 포함할 수 있다.
메탄올 합성은 저온 개질, 증기 개질, 및 자가열 개질 단계를 필요로 하는데, 이러한 단계들은 모두 수소영양 미생물을 이용하기 위해서, 또한 본 발명의 방법을 위해 유용한 공급 원료로서 H2/COx 기질을 제공할 수 있다. 각각의 서로 다른 단계를 위해서, C02 대 H2가 각각 약 1:7에서 약 1:12의 범위를 가지는 공급 원료가 생산되는 경우에, 여기에서 다른 조성물로는 CO, CH4, 및 H20를 포함할 수 있다.
통합된 제강 공장은 다양한 단계를 조합하는데, 이 단계에서는 코크스 제조 가마(석탄에서 코크스를 만드는), 용광로(선철을 만들기 위해서) 및 산소 용광로 (강철을 만들기 위한) 등이 포함된다. 특정 구체예에서, 선철을 만들기 위해서 통합된 제강소로서의 직접적인 환원이 개질된 천연 가스를 환원제(코크스 대신)로 사용한다. 이러한 각각의 가마에서, (상위 기체를 생산하는) 직접적인 환원과 마찬가지로, C02 대 H2가 각각 약 8:1 (용광로 또는 산소 용광로에서)에서 약 1:32 (코크스 오븐에서)의 범위로 생산할 수 있고, 여기에서 다른 구성요소로는 CO, CH4, C2H6, C3H8, N2, 및 H20가 있다.
앞서 언급한 H2/COx 기질 원료 중에서, 이렇게 생산된 H2/COx 공급 원료는 다른 어떤 생산된 H2/COx 공급 원료, 또는 H2, C02, CO 또는 이 중의 H2:C02 비율이 4:1 또는 3:1되는 등의 어떤 조합과 대상이 되는 H2/COx 기질을 생산하기 위해서 혼합될 수 있다. 특정 구체예에서, 예를 들어, 메탄 생성 미생물과 함께 사용되는 H2/COx 기질은 H2:C02 비율이 약 5:1, 4:1, 3 1, 2:1 또는 1:1, 및 선택적으로 총 CO 양이 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.9%, 0.9%, 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0%, 5.0%, 6.0%, 7.0%, 8.0%, 9.0%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 또는 20%을 넘지 않는다. 다른 구체예에서, 예를 들어 Clostridium과 함께 사용되는 H2/COx 기질은 H2:(C02 + CO)의 비율이 약 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 또는 1:1이며 선택적으로 전체 CO 양은 최소한 약 1.0%, 5.0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상이다. 이러한 구체예 중 어떤 것에서든, H2/COx 기질은 PSA 끝 부분(tail) 기체와 함께 H2 기체의 혼합을 포함할 수 있다.
앞서 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예에서, 본 발명은 여기에서 서술되는 다양한 다른 성분들을 선택적으로 포함하는, C02 또는 CO, 또는 둘 다와 H2를 포함하는 H2/COx 기질을 활용, 대사, 산화, 또는 전환 수소영양 미생물을 생산한다. 특정 구체예에서, H2/COx 기질은 H2, C02 및 CO이고, 선택적으로 여기에서 서술된 다양한 구성요소와 함께 여기에서 CO가 CO2보다 더 많다. 추가적 구체예에서, H2/COx 기질은 H2, C02 및 CO이고, 선택적으로 여기에서 서술된 다양한 구성요소와 함께 여기에서 CO2가 CO보다 더 많다. 더 추가적 구체예에서, H2/COx 기질은 H2, C02 및 CO이고, 선택적으로 여기에서 서술된 다양한 구성요소와 함께 여기에서 CO가 CO2 및 H2 둘 다 보다 더 많다. 특정 상황에서, H2/COx를 대사하는 미생물은 H2를 에너지 원료와 COx로서 사용할 수 있으며, 여기에서 x는 탄소 원료로서 1 또는 2 이고, H2를 에너지 원료로, 그리고 COx를 탄소 원료로 사용한다.
앞서 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 구체예에서, 본 발명은 수소 생산에서, 암모니아 합성에서, 메탄올 합성에서, 제강에서 또는 석탄, 나프타, 잔유, 바이오매스 또는 폐기물의 기체화와 더불어 천연 가스 또는 액체 탄화수소 (예를 들어 에탄, 프로판, 나프타)의 증기 개질, 건조 개질, 자가열 개질, 촉매의 부분적 산화 또는 부분적 산화로 생산될 수 있는 H2/COx 기질을 제공한다. 특정 구체예에서, 앞서 언급된 개질 방법에 의해 생산된 H2/COx 기질은 추가적으로 물-기체 이동 반응에 의해 처리될 수 있다. 추가로, 앞서 언급된 하나 또는 그 이상의 방법으로 생산된 기체 줄기는 H2/COx 기질을 생산하거나 만들기 위해서 파이프라인 수소, 파이프라인 이산화탄소, 이산화탄소-스크러버 오프(off) 기체, 연통 기체, 에탄 크래커 오프 기체, 변성체 오프 기체 또는 염소 합성 오프 기체를 포함하는, 수소, 일산화탄소, 이산화탄소 등 다른 원료와 혼합될 수 있다. 추가적인 구체예에서는, C02 대 H2의 피드백 비율이 각각 약 1:3 내지 약 1:5를 나타낸다.
배양 방법
각종 배양 방법학이 여기에서 서술된 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 (예를 들어, 박테리아, 메탄 생성 고세균)을 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 수소영양 미생물은 배양 배지에서 성장하거나, 연속 배양 방법학에 따라서 성장할 수 있다. 특정 구체예에서, 배양은 발효조, 생물반응장치, 중공사 막(hollow fiber membrane) 생물반응장치, 기포 탑 생물반응장치, 트리클 베드 생물반응장치 등과 같은 조절된 배양 유닛에서 성장된다.
전통적인 배지 배양 방법은 배지의 조성이 배양의 시작부터 정해지고, 배양 단계를 진행하는 동안 외부의 변이에 따르지 않는 닫힌 시스템을 의미한다. 따라서, 배양 단계의 초기부터, 배양물은 요구되는 수소영양 미생물 (예를 들어, 메탄 생성 미생물)에 대해서 접종되고, 성장이나 대사 활성은 시스템에 무엇을 더하지 않는 범위 내에서 발생하도록 허용된다. 일반적으로, "배치(batch)" 배양은 탄소 원료의 추가, 기체 피드백 및 배지 조성에 따르는 배치(batch)이며, 여기에서 폐기되는 기체가 나갈 수 있게 되고, 이런 시도는 pH 등 다른 인자를 조절하는 데에서 만들어진다. 배치 시스템에서, 시스템의 대사 산물 및 바이오 매스 구성은 배양이 끝날 때까지 연속적으로 변화한다. 이러한 배치 배양과 함께, 세포는 고정된 유도기를 통해서 높은 성장 대수기, 그리고 최종적으로 성장률이 감소하는 정지기로 간다. 처리가 되지 않은 경우에, 정지기의 세포는 결과적으로 죽을 것이다. 대수 성장기 단계의 세포는 가끔 몇몇 시스템에서 최종 산물 또는 중간 산물의 큰 부피의 생산에 대한 책임을 질 필요가 있다. 생산의 고정기 또는 지수기 이후 단계의 생산은 다른 시스템에서 얻을 수 있다.
공급-배치 시스템은 표준 배치 시스템에 변화를 준 것이다. 공급-배치 배양 과정은 배양이 진행되는 동안 기질 및 잠재적인 배지 구성요소가 증분(increment)에 더해지는 수정이 있는 배치 시스템이다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억압이 세포의 대사작용을 억제하기에 적절한 때에, 또한 배지에 제한적인 양이 정해질 것이 요구되는 경우에 유용하다. 기체 기질 발효에서, 기체 기질(폐기물 기체가 제거될 수 있으므로)에 따라서 시스템이 계속 되고, 공급-배치는 액체(배지)에 따라서 시스템이 계속된다. 배치 및 공급-배치 배양 방법은 흔하고 배경 기술에서도 잘 알려져 있다 (예를 들어 Thomas D. Brock , Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2nd Ed. (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA; Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol . 36:221, 1992 참조).
연속 배양은 "열린" 시스템으로서, 진행 중에 한정 배양 배지가 연속적으로 생물반응장치에 더해지고, 같은 양의 처리된 배지가 동시에 제거 (바이오 매스 또는 세포 정체(retention)의 존재 또는 부존재와 무관하게)된다. 연속 배양은 일반적으로 세포를 일관되게 높은 액체 상태 밀도에 유지하게 하면서, 세포는 주로 대수 성장기에 있다. 대안적으로, 연속 배양은 바이오매스, 세포 정체(retention) 또는 공급 원료 및 영양분이 계속적으로 추가되고 높은 가치의 산물, 부산물 및 폐기 산물이 계속적으로 세포 덩어리에서 제거되는 세포 부동화를 필요로 한다. 세포 정체는 여과, 원심 분리 또는 고정 등 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 세포 부동화는 천연 및/또는 비천연 물질로 만들어진 다양한 범위의 고체 지지대를 사용함으로서 수행될 수 있다.
연속 또는 반(semi)-연속 배양은 세포 성장 또는 최종 산물을 한 요소 또는 몇 개의 요소의 조절을 가능하게 한다. 예를 들어, 한 방법은 제한적인 영양소(예를 들어 탄소 원료, 질소 농도, 수소 농도, 인 농도)을 정해진 속도로 유지할 수 있고 다른 한도를 모두 조절하게 할 수 있다. 다른 시스템에서, 배지 탁도에 의해 측정된 세포 농도가 정해진 속도로 유지될 때 성장에 영향을 미치는 몇 몇 인자들은 연속적으로 변이될 수 있다. 특정 구체예에서는, 산물 대 바이오매스비율을 증가시키기 위해서 수소영양 바이오매스 성장이 제한될 수 있다. 제품 형성 비율의 속도를 최대화하기 위한 방법과 마찬가지로 연속 배양 과정을 위한 영양소와 성장 인자를 조절하는 방법은 배경 기술에서도 널리 알려져 있다(Brock, 1989 참조).
액상 생물반응장치 (예를 들어, 교반 탱크, 충전층, 하나의 액체 상태, 두개의 액체 상태, 중공사 막)은 배경 기술에서 잘 알려져 있고 이는 수소영양 미생물의 성장에 사용될 수 있다.
다상 생물반응장치가 본 발명의 방법 (예를 들어, 기포탑 반응기, 삼상층(trickle bed) 반응기, (고정되었거나 패킹된 베드), 유동층 베드 반응기)에서 사용될 수 있다. 기포탑은 버블 형태의 기체가 액체와 만나게 되는 디바이스이다. 삼상층 반응기는 기체와 액체의 동방향 또는 역방향 유동을 사용하여 배양을 성장시킨다. 유동층 베드 반응기는 유동체(기체 또는 액체)를 통과하는 것을 포함하는데, 과립의 고체 물질에서 충분히 높은 속도로 통과하도록 해서 고체가 유동체인 것처럼 행동하게 한다. 이러한 다상 생물반응장치의 목적은 고상과 기상을 혼합하기 위해서이며, 여기에서 수소영양 미생물에 의해서 질량 이송 및 화학 반응의 강도에 따라 더 크거나 적은 범위에서 소비된다. 각종 다상 생물반응장치가 당업계에 알려져 있으며 본 발명의 방법에 사용된 수소영얀 미생물의 성장을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 서술되었듯이 수소영양 미생물은, 성장에 도움을 주는 이종의 수소를 영양소로 하지 않는 미생물과 함께, 혼합된 배양을 생성하기 위한 하나 또는 그 이상의 서로 다른 종류나 종과 함께, 분리된 순종의 배양으로 성장될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 아스파르테이트 경로 아미노산 또는 경로 아미노산을 포함하는 사료 첨가제의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 앞서 언급된 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물을 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 만들기 위해 충분한 시간동안 배양하는 것을 포함하고, 여기에서 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물은: (a) 모체 수소영양 미생물에 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 모체 수소영양 미생물과 비교했을 때 하나 또는 그 이상의 변경된 조절을 포함하며, 여기에서 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산한다.
특정 구체예에서, 본 발명은, 하나의 아스파르테이트 경로 아미노산 또는 하나의 아스파르테이트 경로 아미노산을 포함하는 식품 첨가제의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 H2/COx 기질의 존재 하에 아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위한 하나 또는 그 이상의 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 발현하기에 충분한 시간동안 재조합 아스파르테이트 경로 아미노산을 분비하는 수소영양 미생물을 배양하는 것을 포함하며, 여기에서 모체 수소영양 미생물에 의해 생산된 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산보다 더 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산이 생산되고 배양 배지에서 축적된다.
앞서 언급된 어떤 방법에서든, 수소영양 미생물은 액상, 기포탑, 또는 삼산층 베드 생물반응장치 등의 발효조 또는 생물반응장치에서 배양될 수 있다.
앞서 언급한 방법 중에, 여기에서 설명되었듯이 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 (예를 들어 메탄 생성 미생물)을 이용하여 아스파르테이트 경로 아미노산을 만드는 방법에서, 기체 피드백은 H2/COx이고, 여기에서 피드백은 CO2 또는 CO, 또는 둘 다와 함께 H2를 포함하고, 선택적으로 여기에서 서술되었듯이 다양한 다른 구성요소들도 포함한다. 특정 구체예에서, H2/COx 기질은 합성기체이며 이러한 합성기체는 개질, 건조 개질, 자가열 개질, 촉매의 부분적 산화 또는 물-기체 이동 반응, 암모니아 합성, 메탄올 합성, 제강, 또는 석탄, 바이오매스 또는 폐기물의 기체화로 처리된 기체화로 생산된 합성기체이다.
앞서 언급한 방법 중에, 여기에서 설명되었듯이 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물 (예를 들어 메탄 생성 미생물)을 이용하여 아스파르테이트 경로 아미노산을 만드는 방법에서, 기체 기질은 H2/COx 기질이고, 수소 생산, 암모니아 합성, 메탄올 합성과 함께, 이는 증기 개질, 건조 개질, 자가열 개질, 촉매의 부분적 산화 또는 물-기체 이동 반응, 제강 또는 석탄, 나프타, 잔유, 바이오 매스 또는 폐기물로 처리된 천연 가스 또는 경질 탄화수소(예를 들어, 에탄, 프로판, 나프타)의 부분적 산화에 의해 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, H2/COx 기질은 하나 또는 그 이상의 원료로서, 파이프라인 수소, 파이프라인 이산화탄소, 이산화탄소 스크러버 오프-기체, 연통 기체, 에탄 크래커 오프-기체, 변성체 오프-기체, 염소 합성 오프-기체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수소, 일산화탄소, 이산화탄소를 원료로 하는 어떤 기체 줄기의 혼합물이다.
앞서 언급된 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물(예를 들어, 메탄 생성 미생물)을 이용하여 여기에서 설명된 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위한 방법에서, 배양되는 수소영양 미생물은 methanobacterium , Methanobrevibacter , Methanocalculus, Methanocaldococcus , Methanocella , Methanococcus , Methanococcoides, Methanocorpusculum , Methanoculleus , Methanofollis , Methanogenium, Methanohalobium , Methanohalophilus , Methanolacinia , Methanolobus, Methanomethylovorans , Methanomicrobium , Methanomicrococcus , Methanoplanus , Methanopyrus, Methanoregula , Methanosaeta , Methanosalsum , Methanosarcina , Methanosphaera, Methanospirillium , Methanothermobacter , Methanothermococcus, Methanothermus , 또는 Methanotorris 등 메탄 생성 고세균이다.
특정 구체예에서, 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물은 Methanobacterium alcaliphilum , Methanobacterium bryantii , Methanobacterium congolense , Methanobacterium defluvii , Methanobacterium espanolae, Methanobacterium formicicum , Methanobacterium ivanovii , Methanobacterium palustre , Methanobacterium thermaggregans , Methanobacterium uliginosum , Methanobrevibacter acididurans , Methanobrevibacter arboriphilicus , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter smithii , Methanobrevibacter woesei , Methanobrevibacter wolinii, Methanocella arvoryzae , Methanocella conradii , Methanocella paludicola, Methanothermobacter marburgensis , Methanothermobacter thermautotrophicum , Methanothermobacter thermoflexus , Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter wolfeii , Methanothermus sociabilis , Methanocorpusculum bavaricum , Methanocorpusculum parvum , Methanoculleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus , Methanogenium frigidum , Methanogenium liminatans, Methanogenium marinum , Methanomicrococcus blatticola , Methanoplanus endosymbiosus, Methanoplanus limicola , Methanoplanus petrolearius , Methanopyrus kandleri , Methanoregula boonei , Methanosaeta concilii, Methanosaeta harundinacea , Methanosaeta pelagica , Methanosaeta thermophila, Methanosarcina acetivorans , Methanosarcina barkeri , Methanosarcina mazei , Methanosarcina thermophila , Methanomicrobium mobile, Methanococcus aeolicus , Methanococcus maripaludis , Methanococcus vannielii , Methanococcus voltae , Methanothermococcus thermolithotrophicus , Methanopyrus kandleri, Methanothermobacter thermoautotroiphicus , Methanocaldococcus fervens, Methanocaldococcus indicus , Methanocaldococcus infernus , Methanocaldococcus jannaschii, 및 Methanocaldococcus vulcanius일 수 있다.
추가적인 구체예에서, 수소영양 미생물은 합성기체 대사 박테리아다. 특정 구체예에서, 합성기체 대사 박테리아는 Clostridium autoethanogenum , Clostridium ljungdahli , Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxydivorans , Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium woodii, Clostridium neopropanologen, 또는 이들의 임의의 조합이다.
앞서 언급된 방법에서, 수소영양 미생물은 중온성, 호열성, 과호열성, 또는 그 중의 어떤 조합이다. 앞서 언급된 어떤 방법이든, 수소영양 미생물은 완전 혐기성 또는 조건 혐기성이다. 앞서 언급된 방법 중 어떤 것에서든, 수소영양 미생물은 완전 수소 영양생물 또는 조건 수소 영양생물이다.
특정 구체예에서, 여기에서 제공되는 H2/COx 기질을 대상이 되는 아스파르테이트 경로 아미노산으로 전환하는 방법은 최소 약 또는 최대 1 킬로그램 (kg), 최소 약 또는 최대 1 킬로그램 (kg), 최소 약 또는 최대 10 kg, 최소 약 또는 최대 100 kg, 최소 약 또는 최대 1,000 kg, 최소 약 또는 최대 10,000 kg, 최소 약 또는 최대 50,000 kg, 최소 약 또는 최대 100,000 kg, 최소 약 또는 최대 250,000 kg, 최소 약 또는 최대 500,000 kg, 또는 그 이상의 관심/일의 아미노산보다 더 많다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산은 1년에 약 100,000 미터톤 (MT) (예를 들어, 1년에 100,000,000 kg 또는 300,000 kg/일), 1년에 약 75,000 MT (또는 225,000 kg/일), 1년에 약 50,000 MT (또는 150,000 kg/일), 약 25,000 MT (또는 75,000 kg/일), 또는 1년에 약 10,000 MT (또는 30,000 kg/일)가 생산된다.
아미노산 제조를 위한 시스템
추가적인 측면에서, H2/COx 기질을 포함하는 기체 공급원; (a) 모체 수소영양 미생물과 비교하였을 때 증가된 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소의 변경된 조절을 포함하는 임의의 하나 또는 그 이상의 상기 언급한 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물을 포함하는 생물반응장치; 및 생물반응장치에 기체가 유동될 수 있도록 기체 공급원과 생물반응장치 사이에 배치된 커넥터를 포함하며; 여기에서 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 과잉생산하기 위해서 H2/COx 기질을 대사하는, 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위한 시스템을 제공한다.
앞서 언급된 어떤 시스템에 의해서든, H2/COx 기질은 동물 사료 또는 비료 등의 생물학적 물질로 전환된다. 특정 구체예에서, H2/COx 기질은 하나 또는 그 이상의 라이신, 트레오닌, 메티오닌, 이들의 임의의 조합 등 아스파르테이트 족 아미노산을 풍부히 하는 생물학적 재료로 흡수될 수 있다. 추가적 구체예에서, 그 결과로 생긴 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 족 아미노산은 정화되어 가축 사료, 식품 첨가제 또는 영양 보충제로 사용된다. 또 다른 구체예에서는, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 족 아미노산으로 풍부화된 바이오매스는 가축 사료, 식품 첨가제 또는 영양 보충제로 사용된다.
여기에서 설명된 것과 같이 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물(예를 들어 메탄 생성 미생물)을 사용하는 앞서 언급된 시스템 중 어떤 것에서든, 기체 공급 원료는 H2/COx 기질이고, 여기에서 공급 원료는 H2와 CO2 또는 CO, 또는 둘 다를 포함하며, 선택적으로 여기에서 서술된 다양한 다른 요소들을 포함한다. 특정 구체예에서, H2/COx 기질은 증기 개질, 건조 개질, 자가열 개질, 촉매의 부분 산화 또는 천연 기체 또는 경질 탄화수소(예를 들어, 에탄, 프로판, 나프타)의 부분적 산화로 생산된, 물-기체 이동 반응으로 처리된, 암모니아 합성, 메탄올 합성, 제강, 또는 탄소의 기체화, 나프타, 잔유, 바이오 매스 또는 폐기물 등과 함께 생산된 합성기체이다. 특정 구체예에서, H2/COx 기질은 파이프라인 수소, 파이프라인 이산화탄소, 이산화탄소 스크러버 오프-기체, 연통 기체, 에텐 크래서 오프 기체, 변성체 오프 기체, 염소 합성 off-기체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 수소, 일산화탄소, 이산화탄소 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 또는 그 이상을 원료로 하여 생산된 기체 줄기의 혼합이다.
여기에서 설명된 것과 같이 생산 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위해 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물(예를 들어 메탄 생성 미생물)을 사용하는 앞서 언급된 시스템 중 어떤 것에서든, 배양되는 수소영양 미생물은 Methanobacterium , Methanobrevibacter, Methanocalculus , Methanocaldococcus , Methanocella , Methanococcus, Methanococcoides , Methanocorpusculum , Methanoculleus , Methanofollis, Methanogenium , Methanohalobium , Methanohalophilus , Methanolacinia, Methanolobus , Methanomethylovorans , Methanomicrobium , Methanomicrococcus , Methanoplanus , Methanopyrus , Methanoregula , Methanosaeta , Methanosalsum, Methanosarcina , Methanosphaera , Methanospirillium , Methanothermobacter, Methanothermococcus , Methanothermus , 또는 Methanotorris. 등 메탄 생성 고세균이다.
특정 구체예에서, 비천연 또는 재조합 수소영양 미생물은 Methanobacterium alcaliphilum , Methanobacterium bryantii , Methanobacterium congolense , Methanobacterium defluvii , Methanobacterium espanolae, Methanobacterium formicicum , Methanobacterium ivanovii , Methanobacterium palustre , Methanobacterium thermaggregans , Methanobacterium uliginosum , Methanobrevibacter acididurans , Methanobrevibacter arboriphilicus , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter smithii , Methanobrevibacter woesei , Methanobrevibacter wolinii, Methanocella arvoryzae , Methanocella conradii , Methanocella paludicola, Methanothermobacter marburgensis , Methanothermobacter thermautotrophicum , Methanothermobacter thermoflexus , Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter wolfeii , Methanothermus sociabilis , Methanocorpusculum bavaricum , Methanocorpusculum parvum , Methanoculleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus , Methanogenium frigidum , Methanogenium liminatans, Methanogenium marinum , Methanomicrococcus blatticola , Methanoplanus endosymbiosus , Methanoplanus limicola , Methanoplanus petrolearius, Methanopyrus kandleri , Methanoregula boonei , Methanosaeta concilii, Methanosaeta harundinacea , Methanosaeta pelagica , Methanosaeta thermophila, Methanosarcina acetivorans , Methanosarcina barkeri , Methanosarcina mazei , Methanosarcina thermophila , Methanomicrobium mobile, Methanococcus aeolicus , Methanococcus maripaludis , Methanococcus vannielii , Methanococcus voltae , Methanothermococcus thermolithotrophicus , Methanopyrus kandleri, Methanothermobacter thermoautotroiphicus , Methanocaldococcus fervens, Methanocaldococcus indicus , Methanocaldococcus infernus , Methanocaldococcus jannaschii 및 Methanocaldococcus vulcanius일 수 있다.
앞서 언급된 시스템 중 어떤 것에서든, 수소영양 미생물은 중온성, 호열성, 과호열성, 또는 그 중에 어떤 조합이다. 앞서 언급된 방법 중에 어떤 것에서든, 수소영양 미생물은 완전 혐기성 또는 조건 혐기성이다. 앞서 언급된 방법 중 어떤 것에서든, 수소영양 미생물은 완전 수소 영양생물 또는 조건 수소 영양생물이다.
실시예
실시예 1
수소영양 미생물의 LYSC 돌연변이
첫 번째 단계는 M. maripaludis의 피드백 저항성 lysC (아스파르토키나아제)를 분리하는 것이다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 특정 돌연변이가 M. maripaludis의 아스파르토키나아제 유전자 안에 조작되거나 자발적인 아스파르토키나아제 돌연변이가 야생형 또는 모체 M. maripaludis를 S-2-아미노에틸-L-시스테인 (AEC) 등의 독성있는 라이신 유사체에 노출시킴으로서 확인되거나, AEC(저항성 있는)의 존재 하에 성장할 수 있는 능력이 있는 M. maripaludis를 확인한다. 독성있는 유사체에 대한 저항성은 자발적일 수 있거나, EMS 등의 돌연변이 유발 요인을 이용하여 유도될 수 있다. 독성 유사체는 독성 유사체에 저항성이 있는 한 M. maripaludis 돌연변이를 선택하기 위해서 메티오닌 또는 트레오닌 등 다른 아미노산 유사체와 결합될 수 있거나, 또는 단독으로 사용될 수 있다. 추가적으로, 피드백 저항성 있는 (비조절성) 아스파르토키나아제는 트레오닌, 라이신 또는 그 둘의 조합 등의 조절의 존재 하에 더 이상 성장 억제에 민감할 수 없는 돌연변이를 확인하는 방법으로 선택될 수 있다. 또한, 이 피드백 저항성 역시 자발적이거나, 화학적 돌연변이 유발 요인에 의해 유도되거나, 부위-특이적으로 도입될 수 있다.
간략히 말하면, 야생형 Methanococcus maripaludis Trell0은 37°C, OD600 값 약 0.20에서 카사미노산 없는 배지(배지 만드는 법은 Sarmiento et al., Methods Enzymol. 494:44, 2011를 참조; 여기서는 배지 McCV에 대하여, 카사미노산 또는 이스트 추출물 없이 사용되었다)에서 25 mL McCas에서 성장되었다. 배양물 5 mL가 무산소의 Balch 튜브 내로 공급되었다. 한 튜브에는 0.3 mL의 에틸 메탄설포네이트 (EMS, McCas no Cas에서 1:50 희석)가 첨가되었고, 두 번째 튜브에는 0.3 mL McCas no cas가 첨가되었다(대조군). 튜브는 H2/CO2의 80/20 믹스로 40 PSIG로 압력이 가해졌고, 진탕없이 37°C에서 한 시간동안 배양되었다. 한 시간의 배양이 끝난 후, 압력은 방출되었고, 각 튜브의 0.5 mL가 제거되어 살생률을 결정하기 위해서 McCas 아가에 플레이팅되었다.
잔여 배양물은 5 (EMS 처리) 또는 2 (대조군), 1.5 멸균 무산소 마이크로 원심분리 튜브에 제공되었고 1000g에서 15 분동안 원심분리되었다. 상청액이 제거되었고, 1 mL McCas no Cas를 재현탁하여 세포 알갱이를 씻고, 1000g에서 15 분 동안 다시 원심분리되었다. 이러한 세척은 EMS의 흔적을 모두 제거하기 위해서 2회 반복되었다. 마지막 세척 다음에, 추출된 세포는 200μl, McCas no Cas에서 현탁되었고 회수를 위해서 5 mL McCas no Cas에 이송되었다. 1 mL 2.5% Na2S x 9H20가 각 튜브에 첨가되었고, 각 튜브는 80/20 H2/C02로 40 PSIG까지 가압되었고, 37°C에서 밤새 회수될 수 있게 두었다. 다음날 아침, 각 배양은 원심분리로 O.1 mL까지 농축되었고, 0.1M 트레오닌 및 0.02M AEC를 포함하는 McCas no Cas 플레이트에 플레이팅되었다. 플레이트는 옥소이드 무산소 자에서 37°C에 80/20 H2/C02 기체 혼합물의 10PSIG와 함께 배양되었다. 이런 선택 작업은 EMS 처리된 세포로 접종된 경우에만 집단이 자랐기 때문이다. 모든 작업은 다른 언급이 없는 한 무산소 조건에서 진행되었다.
도 1은 EMS 생산된 lysC 돌연변이 TrellO- Mut333의 성장 속도를 나타내며, 이는 G333R 돌연변이(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 LysC 아미노산 위치 G277와 일치하는)를 갖고, 라이신 및 트레오닌 (37°C에서 72시간의 배양 후에 OD6oo가 측정된)의 존재에 영향을 받지 않고 성장한다 - 즉, 돌연변이가 발생한 Trell0-Mut333의 아스파르토키나아제는 라이신 및 트레오닌의 피드백 억제에 따르지 않는다는 의미이다. 도 2는 Trell0-Mut333 돌연변이에 의해 생산되고 HPLC로 확인된 아스파르테이트 경로 아미노산을 나타낸다. 유도체 합성 물질인 오르토-프탈알데히드(OPA)는 오토샘플러에서의 유도체 합성 반응에 사용되었고, 전치칼럼으로 수행되었다. 반응 혼합물은 pH 10.2 (Borate Buffer을 통해서) 완충되었고, 산 하이드롤화 단백질/펩타이드 샘플의 직접적인 유도체 합성을 가능하게 했다. 대상이 되는 아미노산은 3-머캅토프로피온산 (3-MPA)을 사용하는 OPA와 첫 번째로 반응되었다. 인돌로의 3-MPA 포함은 소수성을 감소하고, 그럼으로써 OPA-유도체는 크로마토그라피 분석으로 녹여서 분리된다. 모체 종류와 비교하여 생산된 Trell0-Mut333 돌연변이의 개요는 이하와 같다(그리고 일반적으로 확인된 모든 돌연변이에서 유사, 데이터는 표시되지 않았음): 알라닌 (5 mg/L), 라이신 (8 mg/L), 트레오닌 (21 mg/L), 및 글라이신(78 mg/L).
M. maripaludis lysC에서의 돌연변이는 Qiagen DNAeasy Blood & Tissue Kit를 사용하여 그램 음성 박테리아를 위한 프로토콜에 따라 게놈의 DNA 추출하는 방법으로 입증되었다. LysC 타겟은 순방향 프라이머(LysCforl - 5'GGGACGGCGCAACAAATGG3'; 서열번호 1) 및 역 프라이머 (LysCrevl -5'GGAGATAGTGAGACCCCTGGAGT3'; 서열번호 2)와 함께 Easy-A 고충실도 폴리머레이즈를 이용하여 증폭되었다. 증폭된 DNA는 LysCforl 또는 LysCrevl와 혼합되어 시퀀싱되었다(Operon). 하나의 자발적인 돌연변이 및 8개의 화학적으로 유도된 돌연변이가 확인되었다. 추가로, 위치 G277에서의 이전에 Corynebacterium (이 경우, G277R)에서 확인된 돌연변이는, 이전에 Corynebacterium에서 확인되지 않았던 새로운 돌연변이 위치를 찾았고, 이는 S302P 및 G359E를 포함한다(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 LysC의 아미노산 위치의 넘버링에 따른다).
Methanococcus vannielii에서도 유사한 접근법이 사용되었는데, 여기에서 Methanococcus vannielii SB (DSMZ 1224)의 군집 분리가 사용되었고, Trell5라고 언급되었다. Methanococcus vannielii 단계는 M. maripaludis에서 행해진 단계와 유사했는데, 단지 트레오닌 없이 0.02M AEC로 선택되었다는 점에서 차이가 있었다. 액체 크로마토그래피(LC) 결과는 AEC 저항성 있는 돌연변이에서의 증가된 라이신 생산을 나타냈다. 시퀀싱은 추정되는 LysC 단백질에서 두 개의 Trell5 돌연변이를 나타냈다. 특히, F339G 및 K380Q 위치 (M. vannielii 단백질에 일치하는 아미노산)에서 그러했다.
Trell5 LC 데이터는 0 (검출할 수 없는) mg/L 라이신, 50 mg/L 글라이신, 2.5 mg/L 트레오닌의 아미노산 프로파일을 나타낸데 반해, Trell5-Mut 339는 8.6 mg/L 라이신, 37.5mg/L 글라이신 및 6.1 mg/L 트레오닌을, Trell5-Mut380는 4.3 mg/L 라이신, 41.5 mg/L 글라이신, 및 6.0 mg/L 트레오닌의 아미노산 프로파일을 나타내었다.
실시예 2
수소영양 미생물의 아미노산 과잉생산
lysC 돌연변이를 확인하기 위한 초기 단계는 실시예 1에 서술된 바와 같다. 라이신을 과잉생산하기 위한 두 번째 단계는 라이신 분과의 하류 경로를 비활성화하는 것이다. 예를 들어, 호모세린 데하이드로게나아제, 또는 호모세린 데하이드로게나아제 하류의 임의의 유전자가 비활성화되었으며, 이는 트레오닌 생합성 및/또는 메티오닌 생합성을 위한 유전자를 포함할 수 있다. 여기에서 서술되었듯이, 비활성화 또는 감소된 활성은 유전자 결실 또는 호모세린, 트레오닌, 및/또는 자발적인 돌연변이 또는 화학적으로 유도된 돌연변이에 의한 메티오닌 영양 요구체에 의한 것이다.
선택적으로, lysC, 비조절성 lysC , asd , dapA , dapB , dapL , lysA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 라이신 생합성 경로의 임의의 유전자가 과발현되었다. 예를 들어 원산 프로모터는 하나 또는 그 이상의 강력한 프로모터로, 또는 그 원산 프로모터에 의해서 발현된 유전자의 추가적인 복사본을 제공하거나 둘 다에 의해 대체된다. 예를 들어, Methanococcus voltae로부터의 히스톤-유사 프로모터(hmv)는 여기에서 서술되었듯이 M. maripaludis 종류를 변형하기 위해서 사용되는 플라스미드 다중 복사본을 만들어 내기 위해 dap A, dapAB 또는 dapABL 유전자를 포함하는, 다양한 해당 유전자에 작동가능하게 링크되어있다. 그 중 한 균주인 Trell0-Mut333은 피드백 저항성이 있는 아스파르토키나아제를 코딩하는 염색체에 돌연변이가 발생한 lysC 유전자이다. 표 2는 DapA, DapAB, 또는 DapABL를 과발현하는 lysC 돌연변이에 의해 생산되는 아스파르테이트 아미노산을 나타낸다. 표 1에 예시적으로 수정된 Methanococcus maripaludis가 제공되어 있다.
수정된 Methanococcus maripaludis S2
균주명 상대적 표현형 / 유전형
Trel10 야생형 Methanococcus maripaludis S2
Trel10-tA Trel10로 변형된 E.coli 유래 thrA
Trel10-Mut333 피드백 저항성을 가지는 아스파르토키나아제를 갖는 Trel10
Trel10-333dA Trel10에서 DapA를 발현하는 플라스미드를 갖는 Trel10-Mut333
Trel10-333dAB Trel10에서 DapAB를 발현하는 플라스미드를 가지는 Trel10-333UR
Trel10-333UR upp:repA를 갖는 Trel10-333UR; 대략적으로 Trel10-Mut333와 같은 아미노산 생산을 가지며; 변경은 유전자조작을 촉진한다.
Trel10-333UR-tABC E. coli 유래 thrABC를 포함하는 플라스미드를 갖는 Trel10-333UR
Trel10-333UR-AtABC E. coli 유래 thrABC, 및 M. maripaludis 유래 asd를 포함하는 플라스미드를 갖는 Trel10-333UR
Trel10-333dABL DapABL을 포함하는 플라스미드를 갖는 Trel10-333UR
Trel10-333UR-ΔdA dapA 결실을 갖는 Trel10-333UR; 성장을 위해서 라이신을 필요로 한다.
또한, 대체 라이신 생합성 경로를 위한 효소를 코딩하는 외인성 유전자가 수소영양 미생물(예를 들어, M. maripaludis) 내에 도입되었다. 예를 들어, 라이신 생합성을 위한 ddh 경로가 일반적으로 이 경로를 가지지 않거나 사용하지 않는 수소영양 미생물에 삽입되었다. Methanococcus maripaludis의 변형은 Sarmiento et al., 2011에 서술된 대로 진행된다. Qiagen 플라스미드 DNA 추출 키트를 이용해서 플라스미드 DNA를 정제하는 것은 제조사에 의해서 서술되어 있다.
실시예 3
수소영양 미생물에서 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제 결실 및 REPA 삽입
플라스미드 변형 효율성을 개선하기 위해서, lysC 돌연변이 Methanococcus maripaludis Trell0-Mut333가, 게놈 수준에서 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제 (upp) 유전자 (Locus MMP0680)를 Trell0-333UR라고 칭하는 유전자 코딩 복제 단백질 A(rep A, 그 자체의 프로모터와 함께)로 대체하는 방법으로 수정되었다. rep A는, repA를 포함하는 pURB500 플라스미드에서 유래되거나 이를 기초로 하는 것과 같은 repA를 갖는 임의 플라스미드의 효율적인 변형을 가능하게 한다(Tumbula et al., J. Bacteriol. 179:2976, 1997 참조). 우라실 포스포리복실트랜스퍼라아제 활성의 감소는 수정된 M. maripaludis에 6-아자우라실 저항성 표현형을 나타낸다.
간략히 말하면, repA 유전자는(그 프로모터와 함께) Methanococcus maripaludis S001 (Walters et al., App . Environ. Microbiol . 77:2549, 2011)의 게놈 DNA에서 프라이머 TKH_038 (5'aaattatgaggcgcgcctccctgaagaagaagagag3', 서열번호 3) 및 TKH_039 (5'tgcttattcggcgcgccagttccattttaccacc3', 서열번호 4)와 함께 증폭되었다. 증폭된 repA 단편은 In-fusion® HD 클로닝 키트 (Clontech)을 이용하여 Ascl와 라이닝된 pCR® 2.1-TOPO® TA 벡터내에 복제되었다. 최종 플라스미드는 pKH11라고 명명하였다. pKH11에서의 Xbal-BamHl 단편은 pMEVl (Gardner WL (2000) Expression Vectors for the methane-producing archaeon Methanococcus maripaludis. Dissertation, University of Georgia) 안에 제한 효소 Nhel 및 BgHl과 함께 라이닝되어 그 안에 복제되었다. 퓨로마이신 저항성 유전자를 보유하는 결과의 자살 벡터는 pKH20라고 명명하였다.
플라스미드 pKH20는 기본적으로 Sarmiento et al.(2011)에서 서술된 대로 Trell0-Mut333 내로 변형되었고, 형질변환체는 퓨로마이신(2.5 mg/L)을 포함하는 McCAS 플레이트에서 선택되었다. 퓨로마이신의 존재 하에 성장한 형질변환체 집단은 6-아자우라실 (0.25 mg/ml)로 보충된 McCAS 액체 배지에 이송되어 밤새 성장되었다. 밤샘 배양된 일부가 0.5 mg/ml 6-아자우라실로 보충된 새로운 McCAS 배지로 이송되었고 또 다시 밤새 배양되었다. 배양물은 희석되어 0.25 mg/ml 6-아자우라실을 포함하는 McCAS 플레이트에 전개되었다. 5일 후, 개별적인 콜로니는 퓨로마이신의 존재 하에 또는 부재 하에서, McCAS 플레이트에 중복 플레이팅되었다. 퓨로마이신의 존재 하에 성장이 실패한 콜로니는 6-아자우라실 (0.25 mg/ml)로 보충된 McCAS 액체 배지에 이송되어 저항성이 확인되도록 했다. Trell0-Mut333 게놈에서의 upp 유전자의 rep A 유전자로의 대체는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR로 확인되었다: uptdelconfl (5'-caattactgaacccaaagaccat-3', 서열번호 5) 및 uptdelconf2 (5'-aatagttaccggcgttacaatca-3', 서열번호 6). repA 유전자로의 upp 유전자 대체가 확인된 6-아자우라실 저항성/퓨로마이신 민감성 콜로니는 Trell0-333UR라고 명명하였다.
실시예 4
수소영양 미생물에서의 DAPA 결실
Trell0-333UR-AdA의 작제 - 증가된 메티오닌 및 트레오닌 생산을 위한 dap A 결실은 기본적으로 Sarmiento et al. (2011)에 서술된 동일한 마커가 존재하지 않는 유전자 변형의 방법을 사용하여 생성되었다. 상류 및 하류 영역과 함께 dap A 유전자를 포함하는 M. maripaludis S2 (TrellO) 게놈에서의 약 2.4 kb 단편은 프라이머 DapAfor2 (5'-tccctgatcgatagaaagtgtagt-3') (SEQ ID NO: 12) 및 DapArev2 (5 - ttgccgatgaaattaaagtgaaa-3') (SEQ ID NO: 13)를 이용하는 PCR을 통해서 합성되었고, pJB012를 제조하기 위해 플라스미드 pTOPO 내로 복제되었다. dapA 유전자의 프레임 내의 결실 단편이 5' Ascl 위치를 둘 다 포함하는 프라이머 DapAdelfor2 (5'-gcgggcgcgccgcataattacaccttatgcgttc-3', 서열번호 14) 및 DapAdelrev2 (5'-gcgggcgcgcctaatcacggttcgtgatactat-3', 서열번호 15)을 사용하는 외향 PCR을 이용해서 생성되었다. PCR 산물은 정제되었고, Ascl과 소화되고 pJB013를 생성하기 위해 연결되었다. 최종적으로, upp::neo 유전자를 포함하는 단편은 pJB015를 생성하기 위해서, pKH14에서의 프라이머 ppneoF (5'- attacgccaagcttggtaccactctcttcttcttcaggga-3', 서열번호 16) 및 uppneor (5'- gtggatccgagctcggtacctgagatccccgcgctggagg-3', 서열번호 17)을 PCR 증폭하여 pJB013의 Kpnl 위치 내에 복제되었다.
pJB015는 아가 플레이트에서 네오마이신(500ug mg/ml) 저항성 콜로니를 선택하기 위해 Trell0-333UR 내로 (앞서 서술되었듯이) 변형되었다. 염색체의 dapA 유전자에서 하나의 교차형 이벤트가 PCR에 의해서 확정되었다. 단독 교차형을 가진 콜로니는 24시간동안 비선택적으로 이중 교차형 이벤트를 위해서 성장되었고, lOOmg/L 라이신 및 0.25ug/ml 6-아자우라실을 포함하는 McC 배지에 플레이팅되었다. 콜로니는 라이신의 존재 또는 라이신의 부재 하에 McC 플레이트에 패치되었다. dap A 결실의 확정은 성장에 라이신을 필요로 하는 콜로니에서 PCR 확정되었다. 이런 하나의 콜로니는 Trell0-333UR-ΔdA로 지정되었다.
실시예 5
수소영양 미생물에서 글라이신 및 트레오닌 생산의 개선
글라이신 및 트레오닌 생산의 개선은 OAA에서 트레오닌의 유동을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 플라스미드 pAW42(Walters et al., 2011에서 서술되었 듯이)는 Methanococcus maripadulis(Professor Chong of University of York, Wentworth, York YO10 5 DD, United Kingdom에서 획득되었다)의 복제 플라스미드로서 사용될 수 있다.
pKH24 ( pAW42 - thrA *) 작제
트레오닌(아미노산 돌연변이 G433R)에 피드백 저항성 있는 이중 기능 효소 아스파르테이트 키나아제/호모세린 데하이드로게나아제를 코딩하는 thrA* 유전자는 E. coli. ATCC 21277 게놈에서 프라이머 TKH 094 (5'aactaataggtgaaacgcgtacaggaaacacagaaaaaagcc3', 서열번호 7) 및 TKH 095 (5'gatctcctaggcgcgcctcagactcctaacttccatgagagggtac3', 서열번호 8)을 이용하여 증폭되었고, Ascl 및 Nsil와 linearize되어 pAW42 내로 복제되었다.
pKH27 ( pAW42 - thrA *BC) 작제
트레오닌 피드백에 저항성 있는 아스파르토키나아제/호모세린 데하이드로게나아제 (ThrA*), 호모세린 키나아제 (ThrB), 및 트레오닌 신타아제 (ThrC)를 코딩하는 유전자 덩어리는 E. coli ATCC 21277의 게놈의 DNA에서 프라이머 TKH 094 (서열번호7) 및 TKH 103 (5'gatctcctaggcgcgccttactgatgattcatcatcaatttacgcaacgca3', 서열번호 9)와 함께 증폭되었다. PCR 산물은 Nsil 및 Asel과 라이닝된 pAW42내에 복제되었다. 그 결과에 따른 플라스미드는 pKH27라고 명명하였다.
pKH32 ( pAW42 - thrA *BC- asd ) 작제
Methanococcus maripaludis의 asd 유전자는 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나아제를 코딩한다. 유전자와 그의 상류 서열(RBS 포함)은 숙주 게놈에서 프라이머 TKH115 (5'gatctcctaggcgcgccttaaaggtatttttgaacgaataattcagc3', 서열번호 10) 및 TKH116 (5'catcagtaaggcgcg tttttatccaaaggtgaaagaatgaa3', 서열번호 11)와 함께 증폭되었다. 그 결과에 따른 PCR 산물은 pKH27에 클로닝되었고 pKH32를 생산하기 위해서 Asel과 라이닝되었다.
아미노산 분석을 위한 발효 프로토콜
Methanococcus maripaludis 재조합체가 balch 튜브내 퓨로마이신(2.5 mg/L)이 보충된 5 ml McCAS 배지에서 H2:C02 (4:1)로 40 psi까지 기체화되어 37°C 에서 밤새 진탕하면서 성장되었다. 두 번째 날에, 밤새 배양된 배양물 100 μl가 balch 튜브 또는 100 ml 세럼 배지에서 5 ml의 최소 배지(MM)를, 각각 40 및 20 psi의 압력까지 H2:C02 (4:1)로 기화하여 접종하기 위해서 종 배양물로 사용되었다. 배양은 37°C에서 72 시간동안 진탕하면서 유지되었다; 배양이 시작될 때 H2:C02 (4:1) 기체가 전체 압력으로 리필되었다. 발효 후, 배양물 1.8 ml이 Eppendorf 튜브로 이송되었고, 세포들은 12000xg에서 제거되었고 그 결과에 따른 상청액은 0.2 μm 필터를 통과했다. 여과된 액체는 HPLC를 사용하여 아미노산 함량에 대해 분석되었다. 필요한 경우에, 종과 발효 배지 둘 다는 퓨로마이신(2.5 mg/L)으로 보충되었다.
세럼 튜브에서 아미노산 생산
균주 아미노산 (mg/L)
글라이신 트레오닌 라이신 메티오닌
Trel 10 7 31 ND ND
Trel10-tA 111.4 33.6 9.3 ND
Trel10-Mut333 208 24 22 ND
Trel10-333dA 43 45 18 ND
Trel10-333dAB 86 31 41 ND
Trel10-333UR 149 10 12 ND
Trel10-333UR-tABC 178 10 ND ND
Trel10-333UR-AtABC 197 10 ND ND
Trel10-333dABL 227 57 118 ND
Trel10-333UR-ΔdA 166 17 NA 3
추가로, 비천연 및 재조합 Methanococcus maripaludis은 실시예 9에서 서술된 대로 생물반응장치에서, 단 CO의 추가 없이 성장되었다. 96시간동안의 발효 후에, 배양물 1.8 ml가 Eppendorf 튜브로 이송되었고, 세포는 12000xg에서 제거되어 남은 상청액은 0.2 μm 필터로 통과되었다. 이 여과된 액체는 HPLC에 의해 아미노산 함량에 대해 분석되었다. 필요한 경우, 종 및 발효 배지가 퓨로마이신(2.5 mg/L)으로 보충되었다.
생물반응장치에서 아미노산 생산
균주 아미노산(mg/L)
글라이신 트레오닌 라이신 총계
Trel10 0 6 0 6
Trel10-Mut333 233 30 32 295
Trel10-333UR-AtABC 1084 845 5 1934
표 3에서 명백한 바와 같이, 외인성 ThrABC 활성을 추가하는 것은 야생형 Methanococcus maripaludis에 존재하는 수준보다 훨씬 크게 트레오닌 및 글라이신의 생산을 보조한다.
실시예 6
수소영양 미생물에서의 아미노산 엑스포트
M. maripaludis에서의 후보군 rhtA (트레오닌) 또는 lysE (라이신) 엑스포트 유전자는 기능성을 위해 분리되고 검토된다. 추가적 돌연변이가 기능을 증가시키기 위해서 선택적으로 도입되거나 엑스포트 유전자가 더 강한 프로모터에 작동가능하도록 링크되거나, 또는 기능적 외인성 rhtA 또는 lysE 유전자가 M. maripaludis 안에 도입된다. 과잉생산된 아스파르테이트 경로 아미노산은 쉽게 배양 배지에서 회수 및/또는 분리될 수 있다.
실시예 7
수소영양 미생물의 아미노산 생산을 위한 탄소 유동 변경
수소영양 미생물 (예를 들어, M. maripaludis)의 주된 탄소 유동은 다양한 방법으로 아스파르테이트 아미노산 생합성 경로에 더 많은 탄소를 제공하기 위해서 이동될 수 있을 것이다. 예를 들어, 피루베이트에서 포스포에놀피루베이트(PEP)로 탄소의 유동을 제한하는 것은, PEP 신타아제 유전자를 비활성화하거나 하향 조절하는 방법으로 달성할 수 있다. 추가로, 아이소류신 경로(있는 경우)는 선택적으로 녹아웃되며, 이 경로에 의해서 피루베이트 및 아세틸 CoA이 보존된다. 유전자 조작 (예를 들어, 유전자 또는 유전자 부분 결실)에 의해, 또는 돌연변이의 비활성을 위해 선택하는(예를 들어 자발적인 또는 유도된) 방법으로 특정 효소의 활동이 비활성화되거나 감소될 수 있다. 대안적으로 피루베이트 카르복실라아제 유전자는 피루베이트에서 옥살로아세테이트(OAA)에 더 많은 탄소를 이동시키기 위해 선택적으로 과발현되었다. 추가적으로, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자가 선택적으로 더 많은 OAA를 아스파르테이트로 전환하기 위해서 선택적으로 과발현된다. 과발현은 예를 들어, 더 강한 발현을 제공하기 위해서 여러 개의 유전자 복사본을 제공하거나, 프로모터 영역을 변형함으로서 달성될 수 있다.
실시예 8
비천연 및 재조합 수소영양 미생물의 배양
M. maripaludis가 기포탑 생물반응장치에서 무산소 조건에서 약 72시간 내지 120시간동안 정지 상태에 도달할 때까지 배양되었는데, 이는 매우 큰 부피의 밀도 높은 배양이 도달할 수 있도록 일련의 연속 용기의 부피 증가(예를 들어, 50 ml에서 시작하여 이 배양을 사용하여 10L 시드로, 이후에는 이 배양을 사용하여 300L 또는 그 이상의 시드로 배정)로서 수행되었다. 이 동안, 시스템은 공급 배치 모드로 진행될 것이고, 합성기체는 연속적으로 발효 브로스에 공급된다. 브로스 자체는 교환되지 않을 것이다. 적절한 값의 OD600에 도달(분광 광도계에 의해 측정되어)되면, 연속 배양 과정이 시작될 것이며, 여기에서 배지/브로스의 교환이 시작될 것이다. 교환률은 발효조 내 배양물의 OD600을 고려하여 결정될 것이다. 예를 들어, 약 1.5 에서 약 3.0의 완전한 부피의 브로스가 매일 교환된다.
배양은 약 37°C의 온도에서 유지되지만, 약 35°C에서 약 40°C의 범위에서 pH 약 7.0-7.2(필요에 따라 HC1 및/또는 NaOH를 사용하여 pH 조절)로 유동적으로 유지될 수 있고, OD600 값이 1.5 내지 약 2.0로 유지될 수 있다. 합성기체는 약 4:1 내지 약 3:1 비율의 H2:C02를 포함하며, 일산화탄소를 약 0% 내지 5%의 범위에서 포함(1%가 가장 최적값)할 수 있고, 다른 오염물질을 포함할 수 있다. 합성기체 유동률은 공정에 사용된 기포 또는 트리클 칼럼의 구체적인 디자인에 의해서 좌우될 수 있다.
실시예 9
CO와 함께 비천연 및 재조합 수소영양 미생물의 배양
Trell0-333UR이 3.0L의 연속 교반 탱크 생물반응장치에서 배양이 정지 상태 조건을 갖추게 될 때까지 무산소 조건에서 배양되었다. 배양은, 반응기의 종 배양을 위해서 100 ml 봉인 및 무산소 세럼 병에 포함되어 있는 배지 25 ml를 접종하기 위해서 글리세롤 스톡 분취액으로부터 시작되었다. 세럼 병은 4:1 비의 H2/C02 기체로 20 psig 까지 가압되었다. 이 두 병은 약 37°C 및 pH 7.0-7.2에서 유지되는 1.5L의 배지를 접종하기 위해서 사용되었다. 종 배양은 주된 반응기를 접종하기 위해 사용되기 전에 16 시간동안 성장되도록 두었다. 이 시간동안, 4:1 비의 H2/C02가 주 용기에 살포되었다. 추가로, 600 rpm의 지속적인 교반이 Rushton 및 scoping blade 조합을 이용하여 유지되었다. 대략적으로 주 용기의 접종 8시간 전에, 200ppm H2S 기체 블리드가 주 용기에 살포되었다. 추가로, 접종 시에, 1%(부피로)의 CO 블리드가 역시 주된 용기에 살포되었다. 배양은 48시간에서 56시간 내에 OD 최대값에 도달했고, 이는 같은 OD에 도달하기 위해서 CO 없는 발효에서 필요로 하는 시간과 같은 양이다.
CO 없이 56시간에 Trell0-333UR과 함께 아스파르테이트 아미노산의 발효 적정 농도는 120mg/L 글라이신, 25.4mg/L 트레오닌이고, CO가 있는 경우에는 56시간에 83mg/L 글라이신 및 50mg/L 트레오닌이었다.
이상에서 서술된 다양한 구체예는 추가적 구체예를 제공하기 위해서 결합될 수 있다. 본원 명세서에서 참조되었거나 출원 데이터 시트에 목록이 있는 모든 특허 및 비특허 문헌은 본원에서 참조로서 그 전체가 원용되었다. 구체예의 측면은 수정될 수 있고, 필요한 경우에 다양한 특허, 적용 및 문헌의 개념을 이용할 수 있다.
이상의 상세한 설명을 감안하여 구체예에 대해 이러한 변경 또는 다른 변경이 행해질 수 있다. 일반적으로 이하의 청구범위에서, 사용된 용어가 청구범위를 청구항 및 명세서에 기재된 특정 구체예로 제한하기 위한 것으로 이해하여서는 안되고, 대신 이러한 청구범위가 권리를 부여하는 전 범위의 등가물과 함께 모든 가능한 구체예를 포함하도록 해석해야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Trelys, Inc. Bradshaw, Jill Hu, Zhihao Kouba, Jay <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR BIOLOGICAL PRODUCTION OF AMINO ACIDS <130> 910215.401WO <140> US <141> 2015-01-02 <150> US 61/923,120 <151> 2014-01-02 <160> 17 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 gggacggcgc aacaaatgg 19 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 ggagatagtg agacccctgg agt 23 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 3 aaattatgag gcgcgcctcc ctgaagaaga agagag 36 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 4 tgcttattcg gcgcgccagt tccattttac cacc 34 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 5 caattactga acccaaagac cat 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 6 aatagttacc ggcgttacaa tca 23 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 7 aactaatagg tgaaacgcgt acaggaaaca cagaaaaaag cc 42 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 8 gatctcctag gcgcgcctca gactcctaac ttccatgaga gggtac 46 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 9 gatctcctag gcgcgcctta ctgatgattc atcatcaatt tacgcaacgc a 51 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 10 gatctcctag gcgcgcctta aaggtatttt tgaacgaata attcagc 47 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 11 catcagtaag gcgcgttttt atccaaaggt gaaagaatga a 41 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 12 tccctgatcg atagaaagtg tagt 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 13 ttgccgatga aattaaagtg aaa 23 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 14 gcgggcgcgc cgcataatta caccttatgc gttc 34 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 15 gcgggcgcgc ctaatcacgg ttcgtgatac tat 33 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 attacgccaa gcttggtacc actctcttct tcttcaggga 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 gtggatccga gctcggtacc tgagatcccc gcgctggagg 40

Claims (154)

  1. 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하도록 H2/COx 기질을 대사하는 비천연 수소영양 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 하나 또는 그 이상의 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌에 의한 피드백 억제에 저항성이 있는 아스파르토키나아제 돌연변이인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 돌연변이 thrA 유전자, metL 유전자, lysC 유전자 또는 이들의 조합에 의해 코딩되고, 이들은 각각 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 트레오닌 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 트레오닌 결합 부위 돌연변이가 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, 1375, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 라이신 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 라이신 결합 부위 돌연변이가 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032에서의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 라이신 및 트레오닌 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이가 잔기 D294에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 라이신 또는 트레오닌 결합 부위 외의 위치에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위 외의 위치에서의 돌연변이가 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 라이신을 생산하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  14. 제12항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  16. 제15항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제가 과발현되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제를 코딩하는 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성의 호모세린 데하이드로게나아제 돌연변이를 코딩하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 게놈에 통합된 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  21. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 자기 복제 벡터 내에 있는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 트레오닌을 생산하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  24. 제23항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 트레오닌 신타아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  25. 제23항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다를 코딩하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  26. 제25항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다가 과발현되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다가 비조절되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 아이소류신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  31. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 글라이신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 라이신 또는 아이소류신 생합성 경로 핵산 분자가 녹아웃되었거나, 감소된 활성의 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제 돌연변이, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 게놈에 통합된 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  34. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 자기 복제 벡터에 있는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  35. 제23항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  36. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 메티오닌을 생산하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  37. 제36항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-신타아제, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라아제, 메티오닌 신타아제 (코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  38. 제36항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다를 코딩하거나, 또는 첫 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다를 코딩하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  39. 제38항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다가 과발현되거나, 또는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다가 과발현되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다가 비조절되거나, 또는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다가 비조절되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 디하이드로디피콜메이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성의 디하이드로디피콜메이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 게놈에 통합된 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  45. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 자기 복제 벡터에 있는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 수소영양 미생물이 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 둘 다인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘 다를 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 피루베이트 카르복실라아제 활성, 증가된 피루베이트 신타아제, 증가된 아세틸-CoA 신타아제, 증가된 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가지는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, H2/COx 기질이 H2, CO, 및 C02인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, H2/COx 기질이 합성기체 또는 물-기체 이동 합성기체인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, C02 대 H2의 비가 각각 약 1:50 내지 약 10:1의 범위인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  52. 제49항 또는 제50항에 있어서, C02 대 H2의 비가 각각 약 1:2 내지 약 1:4 의 범위인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, CO의 총량이 약 1%를 넘지 않는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 수소영양 미생물이 박테리아인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  55. 제54항에 있어서, 박테리아가 합성기체 대사 박테리아인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  56. 제55항에 있어서, 합성기체 대사 박테리아가 Clostridium, Moorella , Pyrococcus , Eubacterium, Desulfobacterium , Carboxydothermus , Acetogenium , Acetobacterium, Acetoanaerobium , Butyribaceterium , Peptostreptococcus , 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  57. 제55항에 있어서, 합성기체 대사 박테리아가 Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium autoethanogenum , Clostridium ljungdahli , Clostridium ragsdalei , Clostridium carboxydivorans , Clostridium woodii , Clostridium neopropanologen , 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  58. 제54항에 있어서, 박테리아가 Knall-기체 박테리아인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  59. 제58항에 있어서, Knall-기체 박테리아가 Cupriavidus necator , Hydrogenobacter thermophilus , Hydrogenovibrio marinus, 또는 Helicobacter pylori인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  60. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  61. 제60항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 Methanobacterium , Methanobrevibacter, Methanocalculus , Methanocaldococcus , Methanocella , Methanococcus , Methanococcoides, Methanocorpusculum , Methanoculleus , Methanofollis , Methanogenium, Methanohalobium , Methanohalophilus , Methanolacinia , Methanolobus, Methanomethylovorans , Methanomicrobium , Methanomicrococcus , Methanoplanus , Methanopyrus , Methanoregula , Methanosaeta , Methanosalsum , Methanosarcina, Methanosphaera , Methanospirillium , Methanothermobacter , Methanothermococcus, Methanothermus, 또는 Methanotorris 중에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  62. 제61항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 Methanobacterium alcaliphilum , Methanobacterium bryantii , Methanobacterium congolense , Methanobacterium defluvii, Methanobacterium espanolae , Methanobacterium formicicum , Methanobacterium ivanovii , Methanobacterium palustre , Methanobacterium thermaggregans , Methanobacterium uliginosum , Methanobrevibacter acididurans , Methanobrevibacter arboriphilicus , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter smithii , Methanobrevibacter woesei , Methanobrevibacter wolinii, Methanocella arvoryzae , Methanocella conradii , Methanocella paludicola, Methanothermobacter marburgensis , Methanothermobacter thermautotrophicum , Methanothermobacter thermoflexus , Methanothermobacter thermophilus, Methanothermobacter wolfeii , Methanothermus sociabilis , Methanocorpusculum bavaricum , Methanocorpusculum parvum , Methanoculleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus , Methanogenium frigidum , Methanogenium liminatans, Methanogenium marinum , Methanomicrococcus blatticola , Methanoplanus endosymbiosus, Methanoplanus limicola , Methanoplanus petrolearius , Methanopyrus kandleri , Methanoregula boonei , Methanosaeta concilii, Methanosaeta harundinacea , Methanosaeta pelagica , Methanosaeta thermophila, Methanosarcina acetivorans , Methanosarcina barkeri , Methanosarcina mazei , Methanosarcina thermophila , Methanomicrobium mobile, Methanococcus aeolicus , Methanococcus maripaludis , Methanococcus vannielii , Methanococcus voltae , Methanothermococcus thermolithotrophicus , Methanopyrus kandleri, Methanothermobacter thermoautotroiphicus , Methanocaldococcus fervens, Methanocaldococcus indicus , Methanocaldococcus infernus , Methanocaldococcus jannaschii, 및 Methanocaldococcus vulcanius로 구성되는 그룹에서 선택되는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 사이토크롬을 생산하지 않는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  64. 제63항에 있어서, 메탄 생성 고세균을 생산하지 않는 사이토크롬이 Methanococcus maripaludis 또는 Methanococcus vannielii인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  65. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 사이토크롬을 생산하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  66. 제65항에 있어서, 사이토크롬을 생산하는 메탄 생성 고세균이 Methanosarcina barkeri 또는 Methanosarcina mazei인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 엑스포터를 발현 또는 과발현하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 엑스포터를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 엑스포터가 rhtA 또는 lysE 유전자인 것인, 비천연 수소영양 미생물.
  70. 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 첫 번째 외인성 핵산 분자를 포함하며, 유전자적으로 변경되지 않은 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하도록 H2/COx 기질을 동화할 수 있는 능력이 있는, 재조합 수소영양 미생물.
  71. 제70항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성을 발현하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  72. 제71항에 있어서, 비조절성 내인성 아스파르토키나아제 활성이 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌 중 하나 이상에 의한 피드백 억제에 저항성이 있는 아스파르토키나아제 돌연변이인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자가 비조절성 아스파르토키나아제 돌연변이를 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  74. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 비조절성 아스파르토키나아제 돌연변이가 라이신, 트레오닌, 및 메티오닌 중 하나 이상에 의한 피드백 억제에 저항성인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 아스파르토키나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 과발현하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성이 개별적으로 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되거나, 외인성 아스파르토키나아제 활성이 개별적으로 돌연변이 thrA 유전자, metL 유전자, lysC 유전자 또는 이들의 조합에 의해 코딩되고, 각각은 자발적인 돌연변이, 무작위 돌연변이, 부위 특이적 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성이 트레오닌 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 개별적으로 코딩되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  78. 제77항에 있어서, 트레오닌 결합 부위 돌연변이가 잔기 I272, D274, G277, E278, A279, D294, Q298, N372, N374, 1375, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  79. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성이 개별적으로 라이신 결합 부위에 있는 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  80. 제79항에 있어서, 라이신 결합 부위 돌연변이가 잔기 I291, I293, D294, T361, S381, E382, 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  81. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성이 개별적으로 라이신 및 트레오닌 결합 부위에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해 코딩되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  82. 제81항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위 돌연변이가 잔기 D294에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  83. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성, 내인성 또는 둘 다의 아스파르토키나아제 활성이 개별적으로 라이신 및 트레오닌 결합 부위 외에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 lysC 유전자에 의해서 코딩되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  84. 제83항에 있어서, 라이신 및 트레오닌 결합 부위 외에서의 돌연변이가 잔기 F283, N299, S301, S302, T308, T311, T336, G359, F364, M365, T380, R384, S386 또는 이들의 임의의 조합에 있고, 여기에서 잔기 넘버링은 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 lysC에 의해 코딩된 잔기 위치에 상응하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  85. 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 코딩 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 포함하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 라이신을 생산하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  86. 제85항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 코딩 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타아제, LL-디아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라아제, 디아미노피멜레이트 에피머라아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  87. 제85항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 코딩 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 디하이드로디피콜메이트 신타아제, 디하이드로디피콜메이트 리덕타아제, 메소-디아미노피멜레이트 데하이드로게나아제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 외인성 핵산 분자가 디하이드로디피콜메이트 신타아제를 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  89. 제88항에 있어서, 디하이드로디피콜메이트 신타아제를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자가 핵산 발현 조절 조절 서열에 작동가능하게 링크되어 있는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 디하이드로디피콜메이트 신타아제가 과발현되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  91. 제85항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 내인성 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  92. 제85항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 내인성 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제를 코딩하는 내인성 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성의 호모세린 데하이드로게나아제 돌연변이를 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  94. 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물의 게놈에 통합된 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  95. 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물의 자기 복제 벡터에 있는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  96. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  97. 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 트레오닌을 생산하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  98. 제97항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서 코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 트레오닌 신타아제, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  99. 제97항에 있어서, 두 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제 또는 둘 다를 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  100. 제99항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자가 핵산 발현 조절 서열에 작동가능하게 링크되어 있는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  101. 제100항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다가 과발현되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다가 비조절되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  103. 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  104. 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  105. 제97항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 아이소류신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  106. 제97항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 글라이신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분가는 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 라이신 생합성 경로 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성의 0-아세틸트랜스퍼라아제 돌연변이, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  108. 제97항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물의 게놈에 통합된 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  109. 제97항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물의 자기 복제 벡터에 있는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  110. 제97항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 영양 요구체, 메티오닌 영양 요구체, 아이소류신 영양 요구체, 글라이신 영양 요구체, 또는 이들의 임의의 조합인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  111. 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 두 번째 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하고, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 메티오닌을 생산하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  112. 제111항에 있어서, 메티오닌 생합성 경로에서의 하나 이상의 코딩 폴리펩타이드가 아스파르토키나아제, 아스파르틸 세미알데히드 데하이드로게나아제, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, 호모세린 O-트랜스숙시닐트랜스퍼라아제, O-숙시닐호모세린 리아제, 시스타티오닌 γ-신타아제, 시스타티오닌 β-리아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제, 호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라아제, 메티오닌 신타아제 (코발라민 의존성 또는 비의존성), 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  113. 제111항에 있어서, 두 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제 또는 둘 다를 코딩하거나, 두 번째 외인성 핵산 분자가 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다를 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  114. 제113항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 호모세린 키나아제, 또는 둘 다를 코딩하는 두 번째 핵산 분자가 핵산 발현 조절 서열에 작동가능하게 링크되어 있는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  115. 제114항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다가 과발현되거나, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다가 과발현된 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  116. 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 호모세린 데하이드로게나아제, 세린 아세틸트랜스퍼라아제, 또는 둘 다가 비조절되거나, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제, O-아세틸호모세린 서프하이드릴라아제 또는 둘 다가 비조절된 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  117. 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  118. 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 트레오닌 생합성 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 또는 그 이상의 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제, 트레오닌 데하이드라타아제, 트레오닌 알돌라아제, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 핵산 분자가 녹아웃되었거나 감소된 활성의 디하이드로디피콜리네이트 신타아제 돌연변이, 트레오닌 데하이드라타아제 돌연변이, 트레오닌 알돌라아제 돌연변이, 세린 하이드록시메틸 트랜스퍼라아제 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  120. 제111항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 비천연 수소영양 미생물의 게놈에 통합된 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  121. 제111항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 분자가 재조합 수소영양 미생물의 자기 복제 벡터에 있는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  122. 제111항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 라이신 영양 요구체, 트레오닌 영양 요구체, 또는 둘 다인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  123. 제70항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 포스포에놀피루베이트 신타아제 활성, 증가된 피루베이트 키나아제 활성, 또는 둘 다를 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  124. 제70항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 피루베이트 카르복실라아제 활성, 증가된 피루베이트 신타아제, 증가된 아세틸-CoA 신타아제, 증가된 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 가지는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, H2/COx 기질이 H2, CO, 및 C02인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, H2/COx 기질이 합성기체 또는 물-기체 이동 합성기체인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  127. 제125항 또는 제126항에 있어서, C02 대 H2 비의 범위가 각각 약 1:50 내지 약 10:1인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  128. 제125항 또는 제126항에 있어서, C02 대 H2 비의 범위가 각각 약 1:2 내지 약 1:4인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  129. 제125항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, CO의 총량이 1%를 넘지 않는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  130. 제70항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 수소영양 미생물이 박테리아인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  131. 제130항에 있어서, 박테리아가 합성기체 대사 박테리아인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  132. 제131항에 있어서, 합성기체 대사 박테리아가 Clostridium, Moorella , Pyrococcus , Eubacterium, Desulfobacterium , Carboxydothermus , Acetogenium , Acetobacterium, Acetoanaerobium , Butyribaceterium , Peptostreptococcus , 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  133. 제131항에 있어서, 합성기체 대사 박테리아가 Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium autoethanogenum , Clostridium ljungdahli , Clostridium ragsdalei , Clostridium carboxydivorans , Clostridium woodii , Clostridium neopropanologen , 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  134. 제130항에 있어서, 박테리아가 Knall-기체 박테리아인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  135. 제134항에 있어서, Knall-기체 박테리아가 Cupriavidus necator , Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenovibrio marinus, 또는 Helicobacter pylori인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  136. 제70항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 수소영양 미생물이 메탄 생성 고세균인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  137. 제136항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 Methanobacterium , Methanobrevibacter , Methanocalculus, Methanocaldococcus , Methanococcus , Methanococcoides, Methanocorpusculum , Methanoculleus , Methanofollis , Methanogenium, Methanohalobium , Methanohalophilus , Methanolacinia , Methanolobus, Methanomethylovorans , Methanomicrobium , Methanomicrococcus , Methanoplanus , Methanopyrus, Methanoregula , Methanosaeta , Methanosalsum , Methanosarcina , Methanosphaera, Methanospirillium , Methanothermobacter , Methanothermococcus , Methanothermus, 또는 Methanotorris 중에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  138. 제137항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 Methanobacterium alcaliphilum , Methanobacterium bryantii , Methanobacterium congolense , Methanobacterium defluvii , Methanobacterium espanolae , Methanobacterium formicicum , Methanobacterium ivanovii , Methanobacterium palustre , Methanobacterium thermaggregans, Methanobacterium uliginosum , Methanobrevibacter acididurans , Methanobrevibacter arboriphilicus , Methanobrevibacter gottschalkii , Methanobrevibacter olleyae , Methanobrevibacter ruminantium , Methanobrevibacter smithii , Methanobrevibacter woesei , Methanobrevibacter wolinii, Methanothermobacter marburgensis , Methanothermobacter thermautotrophicum, Methanothermobacter thermoflexus , Methanothermobacter thermophilus , Methanothermobacter wolfeii , Methanothermus sociabilis , Methanocorpusculum bavaricum , Methanocorpusculum parvum , Methanoculleus chikuoensis, Methanoculleus submarinus , Methanogenium frigidum , Methanogenium liminatans, Methanogenium marinum , Methanomicrococcus blatticola , Methanoplanus endosymbiosus, Methanoplanus limicola , Methanoplanus petrolearius , Methanopyrus kandleri , Methanoregula boonei , Methanosaeta concilii , Methanosaeta harundinacea , Methanosaeta pelagica , Methanosaeta thermophila , Methanosarcina acetivorans , Methanosarcina barkeri , Methanosarcina mazei , Methanosarcina thermophila , Methanomicrobium mobile, Methanococcus aeolicus , Methanococcus maripaludis , Methanococcus vannielii , Methanococcus voltae , Methanothermococcus thermolithotrophicus , Methanopyrus kandleri, Methanothermobacter thermoautotroiphicus , Methanocaldococcus fervens, Methanocaldococcus indicus , Methanocaldococcus infernus , Methanocaldococcus jannaschii, 및 Methanocaldococcus vulcanius로 구성된 그룹에서 선택되는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  139. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 사이토크롬을 생산하지 않는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  140. 제63항에 있어서, 메탄 생성 고세균을 생산하지 않는 사이토크롬이 Methanococcus maripaludis 또는 Methanococcus vannielii인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  141. 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄 생성 고세균이 사이토크롬을 생산하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  142. 제141항에 있어서, 사이토크롬을 생산하는 메탄 생성 고세균이 Methanosarcina barkeri 또는 Methanosarcina mazei인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  143. 제70항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 엑스포터를 발현 또는 과발현하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  144. 제70항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산의 엑스포터를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 추가로 포함하는 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 엑스포터가 rhtA 또는 lysE 유전자인 것인, 재조합 수소영양 미생물.
  146. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 비천연 수소영양 미생물을 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기에 충분한 시간동안 배양하는 단계를 포함하는 아스파르테이트 경로 아미노산의 생산 방법으로서, 여기서 비천연 수소영양 미생물은 (a) 모체 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 효소의 변경된 조절을 포함하고, 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하는 것인 방법.
  147. 제1항 내지 제22항 및 제47항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 비천연 수소영양 미생물을 라이신을 생산하기에 충분한 시간동안 배양하는 단계를 포함하는 라이신의 생산 방법으로서, 여기서 비천연 수소영양 미생물은 (a) 모체 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 라이신 생합성 경로 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 라이신 생합성 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 라이신 생합성 경로 효소의 변경된 조절을 포함하고, 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 라이신을 생산하는 것인 방법.
  148. 제1항 내지 제11항, 제23항 내지 제35항 및 제47항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 비천연 수소영양 미생물을 트레오닌을 생산하기에 충분한 시간동안 배양하는 단계를 포함하는 트레오닌의 생산 방법으로서, 여기서 비천연 수소영양 미생물은 (a) 모체 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 트레오닌 생합성 경로 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 트레오닌 생합성 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 트레오닌 생합성 경로 효소의 변경된 조절을 포함하고, 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 트레오닌을 생산하는 것인 방법.
  149. 제1항 내지 제11항 및 제36항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 비천연 수소영양 미생물을 메티오닌을 생산하기에 충분한 시간동안 배양하는 단계를 포함하는 메티오닌의 생산 방법으로서, 여기서 비천연 수소영양 미생물은 (a) 모체 수소영양 미생물과 비교할 때 증가된 활성을 가지는 하나 또는 그 이상의 메티오닌 생합성 경로 효소를 발현하거나; (b) 하나 또는 그 이상의 메티오닌 생합성 경로 효소를 과발현하거나; 또는 (c) 하나 또는 그 이상의 메티오닌 생합성 경로 효소의 변경된 조절을 포함하고, 비천연 수소영양 미생물은, 모체 수소영양 미생물보다 높은 수준으로 메티오닌을 생산하는 것인 방법.
  150. 제70항 내지 제145항 중 어느 한 항에 따른 아스파르테이트 경로 아미노산을 분비하는 재조합 수소영양 미생물을 아스파르테이트 족 아미노산의 생합성을 위해서 하나 또는 그 이상의 경로에서의 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드의 발현에 충분한 조건 및 시간 하에 H2/COx 기질의 존재에서 배양하는 단계를 포함하는, 아스파르테이트 경로 아미노산 또는 아스파르테이트 경로 아미노산-함유 식품 보충제의 제조 방법으로서, 여기서 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산은 모체 수소영양 미생물에 의해 생산된 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산 보다 높은 수준으로 생산되고 배양 배지에 축적되는 것인 방법.
  151. (a) H2/COx 기질을 포함하는 기체 공급원;
    (b) 아스파르테이트 생합성 경로 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 비천연 수소영양 미생물을 포함하는 생물반응장치; 및
    (c) 생물반응장치 내로 기체 유동이 가능하게 기체 공급원과 생물반응장치 사이에 배치된 커넥터를 포함하고,
    여기에서 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 과잉생산하도록 H2/COx 기질을 대사하는,
    아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위한 시스템.
  152. (a) H2/COx 기질을 포함하는 기체 공급원;
    (b) 아스파르테이트 생합성 경로 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산 분자를 포함하는 제70항 내지 제145항 중 어느 한 항에 따른 재조합 수소영양 미생물을 포함하는 생물반응장치; 및
    (c) 생물반응장치 내로 기체 유동이 가능하게 기체 공급원과 생물반응장치 사이에 배치된 커넥터를 포함하고,
    여기에서 비천연 수소영양 미생물은 모체 수소영양 미생물과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아스파르테이트 경로 아미노산을 과잉생산하도록 H2/COx 기질을 대사하는,
    아스파르테이트 경로 아미노산을 생산하기 위한 시스템.
  153. 제151항 또는 제152항에 있어서, 생물반응장치가 액상, 기포탑, 또는 트리클 베드 생물반응장치인 것인 시스템.
  154. 제151항 또는 제152항에 있어서, H2/COx 기질이 합성기체 또는 물-기체 이동 합성기체인 것인 시스템.
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