KR20160105329A

KR20160105329A - 오토파지 세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160105329A
Application number: KR1020160022160A
Authority: KR
Inventors: 이병헌; 보드라 아차랴
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-24
Publication date: 2016-09-06
Also published as: EP3263584A1; US20180002380A1; KR101844571B1; WO2016137279A1; US10421780B2; EP3263584A4

Abstract

본 발명은 오토파지 세포(autophagic cell) 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 명세서에서 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드는 오토파지 세포(autophagic cell)의 세포막에 특이적으로 결합하며, 다양한 종류의 조직 및 세포에 대하여 적용 가능하고 in vitro 및 in vivo 상에서 오토파지의 검출 및 영상화 효과가 현저하다.

Description

오토파지 세포 표적용 펩타이드 및 이의 용도{Peptides for targeting autophagic cell and uses thereof}

본 발명은 오토파지 세포(autophagic cell) 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 명세서에서 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다.

오토파지(Autophagy, 자가포식), 아포토시스(apoptosis) 및 네크로시스(necrosis)는 세포 죽음(cell death)에 있어서 핵심인자(key player)이고, 이는 여러 가지 인간 질병에 있어서 중요한 역할을 하며, 이들과 관련된 경로(pathway)들을 조절하고자 하는 전략들은 다양한 질병의 치료에 성공적으로 적용되고 있다[Kepp, O., et al., Nat Rev Drug Discov, 2011.10(3):p.221-37.]. 그러나, 특히 오토파지 (Autophagy) 및 아포토시스(apoptosis) 사이의 관련성은 완전히 설명되지 못하고 있다. 이는 복잡하게 상호관련 되어있는 세포 내 현상을 특이적으로 구분할 수 있는, 정확도가 높은 도구(tool) 또는 방법의 부재에 기인한다.

다양한 방법들이 세포적인 수준(level) 및 생물학적 수준에서 오토파지를 측정하기 위하여 사용되어왔다. 구체적으로 LC3의 전환(LC3 conversion), LC3-II 반점(puncta) 형성 및 오토파지성 유동(autophagic flux)의 측정은, 현재 오토파지 검출을 위해 널리 사용되는 방법이다.

상기 LC3의 전환 측정은, 면역블로팅(immunoblotting)을 이용하여 LC3-I의 LC3-II로의 변환을 검출하는 것으로, LC3-II 자체가 자가포식에 의하여 분해되어 상대적인 양을 정량하기 어려운 문제점을 가지고 있으며 LC3-II 항체의 민감도가 LC3-I 보다 훨씬 높아서 둘 사이의 상대적인 양 비교가 불가능한 단점이 있다.

상기 LC3-II 반점(puncta) 형성의 측정은, GFP-LC3 융합단백질을 세포에 트랜스펙션(trasnfection)에 의하여 인위적으로 발현시켜서 자가포식소체(autophagosome) 형성시 나타나는 형광점 모양을 관찰하는 방법으로, 이 방법은 자가포식이 발생한 세포외 정상세포에서도 상당부분의 점모양이 관찰되어서 자가포식 활성화된 세포와 정상세포를 구분하기에 난해하다는 단점이 있다. 또한 세포내에서 발현된 GFP-LC3 단백질의 과발현은 자가포식과는 무관하게 정상세포에서도 형광점을 발생시킨다는 단점이 있고 GFP-LC3 단백질 발현 자체가 자가포식을 유도한다는 문제점이 있다 (Mizushima N. et al., Cell 2010, 140, 313-326.). 또한 GFP-LC3 단백질은 리소좀과 융합된 후 생성되는 autolysosome에서는 표지력이 현저히 감소하는 문제점도 있다.

또한 리소좀 억제제인 클로로퀸(chloroquine)등을 세포에 처리하여 오토파지성 유동(autophagic flux)을 측정하는 방법이 있으나, 상기 클로로퀸은 실험 대상 세포에 아포토시스에 의한 세포사(cell death)를 유발할 수 있는 단점이 있다(Chuandong Fan et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, Volume 14, Issue 9, pp.32183222).

또한 형광 염료인 monodanysylcadaverine(MDC)는 오토파지 액포(autophagic vacuoles)의 염색에 널리 사용되지만, 이의 특수함(특이성)은 불명확한 채로 남아있다. 상기 기술한 대부분의 방법은 in vitro 또는 ex-vivo 이미징(imaging)에서 오토파지를 측정하기 위해 사용된다.

오토파지의 in vivo 이미징은, 현재 주로 GFP와 융합된 LC3를 전신성(systemically)으로 발현하는 형질전환 쥐를 사용하는 방법으로 어느 정도 수득되고 있는 실정이다[Tian, F.F., et al.2010; Mizushima, N., et al., 2004]. 다른 방법은 심근 내에서 오토파지성 유동(autophagic flux)을 측정하기 위하여 MDC 및 클로로퀸(chloroquine)을 주입하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 오토파지를 모니터(monitor)하기 위한 완전한 방법은 없는 실정이다[Mizushima, N., et a;, 2010].

이처럼 당업계에는 오토파지의 분자적 이미징에 있어서, 다양한 조직에 접근 및 투과할 수 있을 뿐만 아니라 in vitro 및 in vivo 상에서 모두 사용될 수 있는 보편적인 분자적 프로브(molecular probe)에 대한 요구가 충족되지 못하고 있다.

[1]Kepp, O., et al., Cell deat has says for drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2011.10(3):p.221-37. [2]Mizushima, N., T. Yoshimori, and B. Levine, Methods in mammalian autophagy research.Cell,2010.140(3):p.313-26. [3]Tian, F.F., et al., In vivo imaging of autophagy in a mouse stroke model. Autophagy, 2010.6(8):p.1107-1114. [4]Mizushima, N., et al., In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.MolecularBiologyoftheCell,2004.15(3):p.1101-1111. [5] Acharya, B., et al., Invivo imaging of myocardial cell death using a peptide probe and assessment of long-term heart function. J Control Release,2013.172(1):p.367-73. [6]Nishida, K., et al., The role of autophagy in the heart.Cell Death Differ,2009.16(1):p.31-8. [7]Matsui, Y., et al., Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion :roles of AMP-activated protein kinase and Beclin1 in mediating autophagy.CircRes,2007.100(6):p.914-22. [8]Jimenez, R.E., D.A. Kubli, and A.B. Gustafsson, Autophagy and mitophagy in the myocardium: therapeutic potential and concerns. BrJPharmacol,2014.171(8):p.1907-16 [9]Sciarretta, S., et al., Is autophagy in response to ischemia and reperfusion protective or detrimental for the heart? PediatrCardiol,2011.32(3):p.275-81.

이에 본 발명의 발명자들은 in-vitro(및 ex-vivo)를 비롯하여 in vivo상에서도 적용가능하며 다양한 조직에 대하여 오토파지 세포를 특이적으로 표적할 수 있는 감도 높은 프로브(probe)를 탐색하던 중, 오토파지 세포(autopagic cell)의 세포막에 특이적으로 결합하는 펩타이드들을 발굴하고 상기 펩타이드가 in vitro 및 in vivo 상에서 오토파지의 검출 및 영상화 효과가 현저한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 다음의 서열 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이의 용도를 제공하는 것이다;

(I)[아미노 말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C- 카복시 말단)

상기 C는 시스테인이고,

상기 X1은 라이신, 글루타민, 아스파라긴 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X2는 히스티딘, 글루타민, 트레오닌 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X3은 히스티딘, 트레오닌, 글라이신 및 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X4는 류신, 라이신, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X5는 글라이신, 아스파라긴, 프롤린 및 아스파트르산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X6은 알라닌, 타이로신 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X7은 아이소류신, 타이로신, 글루탐산 및 세린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 서열 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다;

(I)[아미노 말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C- 카복시 말단)

상기 C는 시스테인이고,

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형절전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포(autophagic cell) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 상기 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 오토파지 세포(autophagic cell)의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 영상화용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)"는 "단백질" 또는 “펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명에서 "폴리뉴클레오타이드" 또는 “핵산”은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오타이드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오타이드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 용어 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:

A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.

본 명세서에서 용어‘오토파지(augophagy)’는‘자가포식(자기포식)’, ‘자가소화(자기소화)’등과 호환성 있게 사용되며, 세포 내에서 리소좀에 의한 분해과정을 이용하여 손상된 세포소기관(organelle)이나 오랜 수명으로 기능을 다한 단백질 등을 재활용하는 생명현상을 의미한다. 구체적으로 오토파지 초기에, 세포질 및 세포 내 기관들은 오토파고좀(autophagosome)이라는 이중-막-결합 구조로 퇴화한다. 그 후 오토파고좀은 리소좀과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하고, 상기 퇴화된 물질은 리소좀 가수분해효소에 의해 분해되어 재사용된다.

본 명세서에서 용어 '오토파지 세포(autophagic cell)'는 상기 오토파지 현상이 발생 또는 진행되고 있는 상태의 세포를 의미한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 다음의 서열 일반식(I)로 표시되며, 오토파지 세포( autophagic cell )와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다;

(I)[아미노 말단-C- X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 -C- 카복시 말단)

단, 상기 C는 시스테인이고,

상기 X1 은 라이신, 글루타민, 아스파라긴 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X2 는 히스티딘, 글루타민, 트레오닌 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X3 은 히스티딘, 트레오닌, 글라이신 및 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X4 는 류신, 라이신, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X5 는 글라이신, 아스파라긴, 프롤린 및 아스파트르산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X6 은 알라닌, 타이로신 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며; 상기 X7 은 아이소류신 , 타이로신 , 글루탐산 및 세린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이다.

바람직하게 본 발명의 폴리펩타이드는, 상기 서열 일반식(I)에대하여 상기 X1은 라이신 또는 글루타민이며; 상기 X2는 히스티딘 또는 글루타민이며; 상기 X3은 히스티딘 또는 트레오닌이며; 상기 X4는 류신 또는 라이신이며; 상기 X5는 글라이신 또는 아스파라긴이며; 상기 X6은 알라닌 또는 타이로신이며; 상기 X7은 아이소류신 또는 타이로신인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드일 수 있다.

더욱 바람직하게 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드일 수 있다.

상기한 바와 같이 특수 조합의 아미노산 서열로 구성되는 본 발명의 폴리펩타이드는 오토파지 세포를 특이적으로 표적하며, 오토파지 세포의 세포막(cell membrane)에 결합하는 것이 특징이다. 본 발명의 오토파지 세포 특이적 폴리펩타이드는 기존에 세포내 오토파지 측정 및 탐지를 위하여 사용되었던 여러 분자적 수단들과 비교하여, in vitro 및 in vivo에서 다양한 종류의 조직 및 세포에 대하여 적용 가능하며, 오토파지 현상에 대한 정확한 정보를 제공할 뿐만아니라 초기(early stage) 단계의 세포내 오토파지를 검출할 수 있다. 특히, 세포에서 초기에 오토파지를 검출 및 진단하는 것은 해당 조직에서 세포의 운명(fate)를 예측가능하게 하는 수단으로서, 오랜기간 동안 오토파지 현상이 세포 내에서 지속된다면 세포들은 오토파지를 견디지 못하고 죽기 때문에, 오토파지의 초기 검출(또는 진단)은 오토파지 관련 질환의 진단 및 연구에 있어서 매우 중요하다.

이와 같은 본 발명 폴리펩타이드의 효과는, 본 명세서의 실시예에 잘 나타나있다.

본 발명의 일 실시예에서는 M13 파지 라이브러리의 스크리닝을 통하여 오토파지 세포에 특이적으로 결합하는 CKHHLGAIC(AtgPep-1, 서열번호 1), CQQTKNYYC(AtgPep-2, 서열번호 2), CNTGSPYEC(AtgPep-3, 서열번호 3) 및 CPPNTDRSC(AtgPep-4, 서열번호 4)의 4종류의 펩타이드를 발굴하고(실시예 1 참조), 상기 펩타이드들의 오토파지 세포에 대한 결합 특이성을 확인하였다(실시예 2 참조). 그 결과 본 발명의 펩타이드들은 아포토시스(apoptosis) 유발 세포에는 결합하지 않으며, 세포 내 오토파지 유발 초기에도 오토파지 세포에 특이적으로 결합하여 이를 검출 가능하게 하였다. 또한 본 발명에서는 in vitro 뿐만 아니라 동물 모델에서도 오토파지 특이적으로 표적 및 결합 하는 것을 확인하였다. 그 결과, 생체영상에서 본 발명의 펩타이드가 오토파지 유도 후 유의하게 높은 수준으로 종양에 표적되는 것을 확인하였으며, 조직에서도 마찬가지로 본 발명의 펩타이드가 주사된 종양 조직에서 나타난 표적신호가 대조군에 비해 높게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 폴리펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 폴리펩타이드 합성 방법(유전공학적 방법, 화학적 합성)을 이용하여 합성될 수 있다. 유전공학적 방법에 의한 작제는, 예를들어, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, 서열번호 5 내지 8의 폴리뉴클레오타이드)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제 할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 전술한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

경우에 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 한 폴리뉴클레오타이드를 구성하는 염기 조합이 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함하여 단쇄 또는 이중쇄의 형태의 핵산분자로서 제공될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며, 서열번호 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며, 서열번호 4의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8의 염기서열을 가지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것으로, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제기원을 포함한다.

본 발명은 상기 벡터로 형절전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)을 이용할 수 있다.

상기 용어‘형질전환체’는‘숙주세포’등과 호환성 있게 사용될 수 있으며, 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 형질전환체는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물, 효모 등의 하등 진핵세포 미생물과 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 당업자가 목적하는 바에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다. 일례로 본 발명에서 형질전환체로 이용되는 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 미생물(Streptomyces spp.), 슈도모나스 속 미생물(Pseudomonas spp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스 속 미생물(Staphylococcus spp.), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 등 일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포( autophagic cell ) 검출용 조성물을 제공한다. 바람직하게 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드의 오토파지 세포 결합 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: ¹⁸F, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ⁶⁷Ga), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 자기공명 영상물질(예: Gadolinium(Gd, 가도리늄), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles))일 수 있다.

표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다. 아울러, 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.

본 발명은 (a) 상기 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계; (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 오토파지 세포( autophagic cell )의 검출 방법을 제공한다. 이 때, 상기 (c) 단계에서 본 발명의 폴리펩타이드의 오토파지 세포와 결합 여부 및 위치를 확인하기위하여 수행되는 펩타이드의 검출 방법은 상기에서 기재한 바 또는 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명에서 상기 용어‘시료’는 생물학적 시료를 의미하는 것으로서, 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 폴리펩타이드는 오토파지 세포와 특이적으로 결합하는 효과가 뛰어나므로, 약물을 상기 오토파지 세포에(궁극적으로 in vivo 상에서 상기 오토파지 세포가 존재하는 질환성 부위에) 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 특이적 약물 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 약물 전달용 조성물은, 병리적인 오토파지 현상을 수반하는 오토파지 관련 질환의 환부에 특이적으로 약물을 전달하는 것이 가능하며, 상기 오토파지 관련 질환은 당업계에 공지된 오토파지 관련 질환이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를들어 퇴행성 신경질환, 뇌졸중, 종양성 질환, 심근증, 심근경색, 노화, 타입II PCD(type II programmed cell death), 제2형 당뇨병 및 박테리아 감염증 등을 포함한다.

구체적으로, 상기 퇴생성 신경질환은 예를들어, 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 픽병(Pick's Disease) 및 파킨슨-ALS(amyotrophic lateral sclerosis)-치매 복합증 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한 상기 종양성 질환은 악성 종양에 의해 병리적 증상을 보이는 질환으로서, 예를들어 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 부갑상선암, 식도암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종, 비인두암, 후두암, 부신암, 결장암, 요관암, 담낭암, 방광암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 두경부암, 악성흑색종, 백혈병, 복합 골수종, 만성 골수성 백혈병, 신경아종 및 재생불량성 빈혈 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

좀 더 구체적으로, 상기 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 폴리펩타이드를 종래 항-종양성 질환 제제, 뇌졸중 치료제 및 심근경색 치료제 등의 약제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 폴리펩타이드에 의해 상기 제제가 종양세포, 뇌졸중 부위, 심근경색 부위 등의 질환 부위(환부)에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 본 발명의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 항- 종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물, 상기 본 발명의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물, 상기 본 발명의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드에 연결 될 수 있는 항-종양성 질환 제제는 공지의 종양 치료물질이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin) 마리마스타트(Marimastat) 및 트로케이드(Trocade) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것 일 수 있다.

아울러, 뇌졸중 치료제, 심근경색 치료제는 종래 이들 질환의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며,예컨대, 상기 뇌졸중 및 심근경색 질환에서 혈관을 막고 있는 혈전을 제거하기 위해 사용되고 있는 혈전용해제(thrombolytic drug)인 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase) 등의 약물이 있다. 또한 심근세포 보호제인 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제 및 에리트로포이에틴(erythropoietin) 등이 있다. 또한 뇌신경세포 보호제인 NMDA(N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제 등이 있다.

상기 제제와 본 발명의 펩타이드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 폴리펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 폴리펩타이드의 양은 결합되는 상기 치료제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 폴리펩타이드는 표적 기관에 결합하였는지 여부 확인, 검출 및 정량을 용이하기 하기 위하여 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 펩타이드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀, 생분해성 나노입자 등이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용 할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 물질량(amount of substance)을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 1 mg 내지 1000 mg의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.

아울러, 본 발명의 폴리펩타이드는 오토파지 세포와 특이적으로 결합하므로, 임의의 표지수단(영상화용 수단)과 함께 오토파지가 진행되고 있는 환부를 in vivo (및 ex-vivo)상에서 영상화 할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 영상화용 조성물을 제공한다.

상기 오토파지 영상화라 함은 오토파지 관련 질환의 환부(還付)의 영상화 및 진단으로서 당업자에게 이해될 수 있으며, 오토파지 관련 질환에 대해서는 전술한 바와 같다. 구체적으로 예를들어, 본 발명의 영상화용 조성물은 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 또는 진단용 조성물, 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 또는 진단용 조성물, 또는 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물로서 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이 때, 질환의 영상화 및 진단은, 이에 한정되지는 않으나, 질환의 초진 목적 뿐만아니라, 진행 경과, 치료에 대한 치료 경과, 치료제에 대한 반응 모니터링 등을 포괄하여 사용할 수 있다. 상기 본 발명의 펩타이드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.

본 발명의 펩타이드는 오토파지 세포(autophagic cell)의 세포막에 특이적으로 결합하며, 다양한 종류의 조직 및 세포에 대하여 적용 가능고 in vitro 및 in vivo 상에서 오토파지의 검출 및 영상화 효과가 현저하다.

도 1은 A549, HT1376, MDA-MB-231, BEAS-2B 및 HeLa의 여러 가지 세포주에 대하여, 이들의 기본적인 오토파지 수준 및 라파마이신에 의해 유도된 오토파지 수준과 리소좀 억제제인 클로로퀸을 라파마이신과 함께 처리할 때 유도되는 오토파지 수준을 LC3 I 및 LC3 II 단백질의 웨스턴 블랏팅을 통하여 조사한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 사용된 파지 라이브러리 스크리닝 전략(직접적 바이오패닝)을 도시하는 모식도이다.
도 3은 HeLa 세포(A) 및 MDA-MB-231 세포(B)에 직접적 바이오패닝 방법으로 파지 라이브러리를 스크리닝하는 과정에있어서, 각 라운드(R1, R2, R3, R4)에서 산출된 역가(tilter)를 보여준다.
도 4는 선별된 4개의 파지 클론(phage clone)에 대하여, 이들이 오토파지 세포에 특이적으로 결합함을 면역형광염색을 통해 확인한 결과를 나타낸다(Rapa: 라파마이신).
도 5는 로다민 B(rhodamine B)로 표지된 본 발명의 펩타이드들이 아포토시스(apoptosis)가 유발된 세포와는 비결합함을 확인한 결과를 나타낸다(FITTC-APoPep1: FITTC로 표지된 APoPep1 처리군으로서, 아포토시스 세포에만 특이적으로 결합).
도 6은 로다민(rhodamine B)로 표지된 본 발명의 펩타이드 AtgPep-1 내지 AtgPep-4가 초기(early stage) 오토파지 세포에 특이적으로 결합함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 오토파지가 유발된 MDA-MB-231 세포에서, 본 발명의 펩타이드가 세포막에 결합된 것을 보여주는 single cell 이미지이다(RB: 로다민B 표지).
도 8은 오토파지가 유발된 HeLa cell, Chang cell 및 BEAS 2B cell에서, 본 발명의 펩타이드가 세포막에 결합된 것을 보여주는 single cell 이미지이다(RB: 로다민B 표지).
도 9는 종양 동물모델을 대상으로 라파마이신을 투여하여 오토파지를 유도한후, 본 발명의 펩타이드가 생체내 종양조직에서 오토파지가 일어난 부위로 표적이 되는 것을 근적외선 형광물질인 FPR675로 표지하여 생체 근적외선형광영상을 촬영한 것이다(CNSSSVDKC: CNSSSVDKC 펩타이드를 주입한 대조군, CQQTKNYYC: CQQTKNYYC 펩타이드(AtgPep-2)를 주입한 군).
도 10은 오토파지 마커의 하나인 LC3 항체염색 및 형광 표지된 펩타이드를 형광현미경으로 관찰한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

오토파지 세포를 특이적으로 표적하는 펩타이드의 발굴

<1-1> 파지 스크리닝을 위한, 세포주 선별

라파마이신 1 (FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 희석하여 제공) 또는 라파마이신(1 )과 더불어 리소좀 억제제인 클로로퀸(20 )을 4시간동안 처리하여 A549, HT1376, MDA-MB-231, HeLa 및 BEAS-2B 세포주에 오토파지를 유도하였다. 4시간 후에, 세포들을 1X PBS로 두 번 세척하였고, LC3 I 및 LC3 II(이하, LC3 I/II로 표기) 단백질을 조사하기 위하여 웨스턴 블랏팅이 수행되었다. 웨스턴 블랏팅을 수행하기 위하여, 먼저 상기 약물 처리된 세포에 1/ml protease inhibitor cocktail과 함께 RIPA buffer를 이용하여 세포를 용해하였다. 전체 세포 추출물(whole cell extract)은 SDS-PAGE에 의하여 분획(fractionation)되었으며, dry blot(Bio-Rad)을 이용하여 nitrocellulose membrane으로 트랜스퍼(transfer) 되었다. 멤브레인을 5% nonfat milk가 포함된 TBST (10 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% Tween 20)와 함께 60분동안 배양한 후, 상기 맴브레인을 TBST로 1회 세척하였고, 토끼에서 분리한 사람 LC3I/II에 대한 항체(abcam사)를 처리하여 교반해주며 4℃에서 오버나잇(overnight) 배양하였다. 상기 맴브레인은 TBST로 10분동안 3회 세척되었으며, 그 후 이차항체로서 마우스로부터 분리한 토끼 항체에 대한 HRP 표지 항체(mouse anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz사)의 1:3000 희석물과 함께 1시간동안 배양되었다. 그 후 TBST로 3회 세척하고, ECL 시스템(Amersham Biosciences)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 디벨로핑(developing)하였고, luminescent image analyzer(LAS 100Plus, Fujifilm, Japan)로 검출하였다.

도 1은 상기 A549, HT1376, MDA-MB-231, HeLa 및 BEAS-2B 세포주에서의 기본적인 오토파지 수준, 및 본 실험에서 라파마이신에 의해 유도된 오토파지 수준을 LC3 II 단백질의 생성 증가를 통해 보여준다. 세포주에 따라 기본적인 오토파지 수준이 다른 것으로 나타났다. HT1376 및 A549 세포들은 기본적인 오토파지 수준이 낮은 것을 보여주었고, MDA-MB-231 및 HeLa cell은 기본적인 오토파지 수준이 높았다. MDA-MB-231 및 HeLa cell은 또한 라파마이신으로 오토파지를 유도하였을 때에도 HT1376 및 A549 세포에 비하여 높은 오토파지 유도 수준을 보였기 때문에, 상기 MDA-MB-231 및 HeLa cell이 후술하는 연구를 위하여 선택되었다. 한편, 리소좀 억제제인 클로로퀸을 라파마이신과 함께 처리하였을 경우에는 LC3 II 단백질의 생성이 더욱 증가하는 것이 모든 세포에서 관찰되어 상기 오토파지의 유도가 리소좀 기능 저하로 인한 비특이적인 것이 아니고 오토파지 특이적인 것임을 확인하였다.

<1-2> 파지 라이브러리의 바이오패닝(Biopanning)- 직접 스크리닝 방법

pIII 단백질과 융합된 CX7C (C:시스테인, X: 임의의 아미노산) 랜덤(random) 펩타이드가 디스플레이되어 있는 M13 phage library는 New England Biolabs (Ipswich, MA)로부터 구매하였고, 바이오패닝에 사용되었다. 본 발명에서 바이오패닝 전략의 구성도(schematic diagram)가 도 2에 도시된다. 구체적인 과정은 다음과 같다. HeLa 또는 MDA-MB-231 세포는 35 mm culture dish에 분주되었고, 다음날 70~80%의 세포포화상태(confluence)에 도달하였다. 상기 세포들을 1 라파마이신(FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 희석)으로 4시간동안 처리하였다. 2x10¹¹ pfu(plaque-forming unit)의 파지 라이브러리를 라파마이신 비처리된 HeLa/MDA-MB-231 세포와 4℃에서 1시간동안 배양하였고(negative selection 또는 subtraction 과정), 이들 세포에 비결합된 파지들을 회수하여 라파마이신이 처리된 HeLa 또는 MDA-MB-231 세포와 함께 부드럽게 교반해주며 4℃에서 1시간동안 배양되었다. 그 후 비결합된 파지들은 10mg/ml BSA(bovine serum albumin)이 포함된 DMEM으로 세척되었다. 세포에 결합된 파지들은 1 mg/ml BSA가 포함된 0.2 mol/L glycineHCl(pH 2.2) 200 와 상온에서 10분동안 배양함으로서 용출되었다. 용출물은 1 M TrisHCl(pH 9.1)로 즉시 중화되었다. 상기 용출물 중 10를 역가측정(titration)에 사용하였으며, 나머지 용출물의 파지 클론들은 1ml DMEM 에 용해하여 전술한 방법과 같이 라파마이신 비처리 세포와 함께 배양하고, 후에 비부착 파지들을 다시 라파마이신 처리된 세포와 배양하였다. 이러한 과정을 총 4 라운드 반복하였다. 파지의 역가(titer)는 상기 용출물의 연속적 희석물(serial dilution)을 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), X-gal 및 tetracycline이 포함된 LB 배지에서 대장균에 접종하고 37℃에서 오버나잇(overnight) 배양한 후, 콜로니(colony)의 갯수를 카운팅하는 것에 의하여 결정되었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 오토파지 세포에 특이적인 파지 클론 선별 가능성을 높이기 위하여, 파지 라이브러리를 라파마이신 처리된 세포와 배양하기에 앞서 라파마이신 비처리된 세포와 배양하는 것에 의하는 negative selection (또는subtraction) 과정을 포함하였다. 고전적인 파지 증폭(amplification) 및 파지 증대법(phage enrichment method)과 대조적으로, 본 연구는 직접적인 스크리닝 방법을 사용하여, 증폭과정 없이 모든 파지 클론들을 다음 라운드에 사용하는 방식을 사용하였다. 도 3은 각 라운드에서의 파지 역가(titler)를 나타내는 것으로, 파지클론의 배수적 감소(fold reduction)는 4라운드에 도달하였을 때 각각 1.9x10³ fold (HeLa cells) 및 6.5x10³ fold (MDA-MB-231 cells) 까지 감소하였다. 3라운드 및 4라운드로부터의 총 90 클론들에 대하여 서열분석이 수행되었다(HeLa 세포로부터 37개의 파지클론, MDA-MB-231 세포로부터 53개의 파지클론).

<1-3> 파지 클론의 DNA 및 아미노산 서열 분석

상기 실시예 1-2에서 수집한 90개의 각 파지 클론들의 DNA 삽입물(DNA inserts)은 -96 pIII primer(New England Biolabs)를 이용한 자동화된 DNA sequencer (Genotech Inc., Daegeon, Korea)에 의하여 염기서열이 분석되었다. 공통서열 또는 펩타이드들 간에 공유되어있는 아미노산 모티프(motif)를 찾기 위하여, 상기 염기서열로부터 추론된 아미노산 서열은 Clustal W program을 이용하여 정렬되었다. 이들 중 일부 펩타이드를 무작위로 뽑은 다음, 각 펩타이드 서열과 높은 상동성(significant homology)이 있는 단백질들을 조사하기 위하여 NCBI protein database에 대한 BLAST search가 수행되었다.

<1-4> 파지 클론의 선별

오토파지 세포에 대한 파지 결합 ELISA (phage binding ELISA)를 통해, 오토파지 세포에 결합 특이성이 높은 파지 클론을 선별하였다. 구체적으로, in vitro 상에서 각 파지 클론들의 결합을 위하여, 세포를 96-well culture plate에 2x10⁴ cells/well씩 분주하고, 8090%의 세포포화상태(confluence)로 배양하였다. 다음으로 세포들에 1라파마이신(in serum-free medium)을 4시간 처리하고, 이후에 PBS로 세척하였으며, 상온에서 30분동안 1% BSA를 처리하여 블로킹(blocking)하였다. 다음으로 상기 처리된 세포들을 각각의 파지클론(1x10⁹ pfu/well)과 배양하였다. 파지 라이브러리의 풀(pool)이 대조군(control)으로서 사용되었다. 파지 클론과 함께 4℃에서 1시간 배양한 후에, 세포들을 다시 PBS로 세척하고 1% BSA(in DMEM)로 고정하였다. 다음으로 M13 파지에 대한 HRP 표지된 마우스 단일클론 항체(HRP-conjugated anti-M13 phage monoclonal antibody, 1:3000 희석하여 사용, NEB사)를 첨가하여, 상온에서 한시간 동안 배양하였다. 세포들은 PBS로 3회 세척되었으며, TMB 기질(100 /well)은 발색을 위하여 2-10 min 동안 처리되었고, 2M H₂S0₄를 처리하여 반응을 종결시켰다. 최종 발색산물은 windows based XFluor4 program을 이용하여 microtitration plate reader (Sunrise, Tecan Austria)로 450nm 파장에서 측정하였다.

또한, 상기와 같이 라파마이신 처리된 세포에 선별된 파지 클론을 배양한 후, M13 파지에 대한 마우스 단일클론 항체(mouse anti-M13 monoclonal antibody, 1:3000희석하여 사용) 및 이차항체로서 마우스 항체에 대한 Alexa 549 형광 표지된 항체 (Alexa 549-conjugated anti-mouse IgG antibody, abcam사)를 이용하여 통상의 방법으로 면역형광염색을 수행하여 파지 클론들의 부착 특이성 및 효과를 확인하고, 선별에 이용하였다. 4개의 파지 클론이 오토파지 세포에 대해 결합 특이성이 높은 것으로 확인되었다. 상기 4개 클론의 펩타이드 서열은 다음과 같다; CKHHLGAIC(AtgPep-1, 서열번호 1), CQQTKNYYC(AtgPep-2, 서열번호 2), CNTGSPYEC(AtgPep-3, 서열번호 3), CPPNTDRSC(AtgPep-4, 서열번호 4). 도 4는 상기 AtgPep-1 내지 AtgPep-4의 파지클론들에 대한 면역형광염색 관찰 결과를 나타내며, 상기 AtgPep-1 내지 AtgPep-4가 디스플레이 되어 있는 파지 클론들이 오토파지 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 특히, 파지 클론들은 초기(4hr) 오토파지 상태에서도 오토파지 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

<실시예 2>

본 발명 펩타이드의 오토파지 세포 특이적 결합능(binding ability) 확인

<2-1> 펩타이드 합성

(주) 펩트론(Peptron Co, Daegeon, Korea.)에 의뢰하여, N-말단에 RhodamineB가 접합된 본 발명의 펩타이드들을 제작하였다. 간략하게, 각 펩타이드들은 표준 Fmoc 방법에 의하여 합성되었고, 각 펩타이드의 N-말단에 RhodamineB가 접합되었으며, 질량분석기에 의하여 정제되었다.

<2-2> 아포토시스 ( apoptosis ) 세포에 대한 본 발명 펩타이드의 구별능 확인

상기 실시예 <2-1>에서 합성된 본 발명의 펩타이드들이 사멸세포(apoptotic cell)와 구분하여 오토파지 세포에만 특이적으로 부착하는지 조사하였다.

아포토시스 유발 물질(apoptotic drug)인 Trail 10ng을 하룻밤동안 처리한 MDA-MB-231 세포에, 사멸세포(apoptotic cell)를 특이적으로 표적하는 FITC-conjugated ApoPep-1(FITC로 표지된 CQRPPR 펩타이드) 또는 rhodamine B-conjugated AtgPep-1 내지 AtgPep-4를 처리하였다. 그 후 세포를 고정하고 형광현미경하에서 관찰하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 AtgPep-1 내지 AtgPep-4는 사멸세포에 결합하지 않았다.

<2-3> 오토파지 유발 초기단계( early stage )에서, 본 발명 펩타이드의 오토파지 세포 검출능 확인

pEGFP-LC3 형질주입된 MDA-MB-231 cell 세포를 eight-chamber slide 위에 배양하고, EBSS(Earl’s balanced salt solution, 오토파지 유발 물질)를 2시간 처리하여 오토파지를 유도하였다. 그 후 세포를 PBS로 세척하고, RhodamineB-표지된 AtgPep-1 내지 AtgPep-4 각각의 용액(PBS에 희석된 상태로 제공) 10μmol/L를 처리하여 4℃에서 1시간동안 배양하였으며, 그 후 1% BSA를 4℃에서 1시간동안 처리하였다. 상기 세포에 4% 파라포름알데히드를 5분동안 처리하여 고정하였다. 그 후 세포를 4V,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)와 배양하여 핵을 염색하였으며, 마운팅(mounting) 한 후에 형광현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)하에서 관찰하였다.

도 6 에서 보는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드들 중 특히 AtgPep-1 (CKHHLGAIC) 및 AtgPep-2(CQQTKNYYC)가 강한 형광 신호를 나타냈다. 이를 통하여 상기 실시예 1-4에서와 같이, 본 발명의 펩타이드들은 초기 오토파지 검출이 가능함을 확인하였다. 도 7은 오토파지가 유발된 MDA-MB-231 세포(single cell)에 rhodamineB 표지된 AtgPep-1 및 AtgPep-2가 결합한 모습을 나타내는 것으로, 본 발명의 펩타이드가 오토파지 세포의 세포막에 결합되어있는 것이 확인되었다.

상기 MDA-MB-231 세포주 이외에 다른 조직 또는 세포에 대해서도 본 발명의 펩타이드가 작용함을 검증하기 위해서, AtgPep-1 내지 AtgPep-4 중 특히 높은 신호를 나타냈던 AtgPep-1(CKHHLGAIC) 및 AtgPep-2(CQQTKNYYC)를 대표로 이용하여, 여러 종류의 세포(서로다른 조직 유래)에 오토파지를 유발하고 이들에 대한 검출능을 확인하였다. 실험방법은 상기한 바와 동일하다. 그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, HeLa cell, Chang cell, BEAS 2B cell의 각 세포주에 유발된 오토파지 강도에 따라 신호 강도의 차이는 있으나, 본 발명의 펩타이드(AtgPep-1 및 AtgPep-2)가 세포의 종류에 상관없이 오토파지 세포를 특이적으로 표적하는 것을 확인하였다.

<2-4> 동물모델에서 오토파지 특이적 표적 및 결합의 확인

펩타이드 프로브를 이용한 생체 오토파지 영상 및 모니터링을 위한 실험으로, 종양세포를 면역 결핍된 누드마우스에 이식하여 종양을 성장시킨 뒤, 실험을 위한 동물모델을 구축하였다. 본 발명의 도 7에서의 결과에서 검증된 MDA-MB-231 세포주 10⁶개를 누드마우스의 대퇴부에 주사한 후, 10일이 지난 후 종양의 크기가 80mm³ 된 것을 확인하였다. 오토파지 유도를 위하여 라파마이신을 마우스의 kg당 1.5 mg의 양으로 각각 마우스의 복강 내로 주사하였다. 라파마이신 주사 후 2시간이 지난 후, 근적외선 형광(near-infrared, NIRF)물질인 flamma 675(=FPR675, 바이오액트사, 한국)로 표지된 본 발명의 AtgPep-2(CQQTKNYYC)를 50 mM/mouse씩 꼬리 정맥을 통하여 각 마우스(N=5~7)에 투여하였으며, 혈액을 따라 순환되도록 2시간 동안 방치하고, 펩타이드 투여 후, 2시간째, 4시간째 및 5시간째의 광학 및 형광이미징을 획득하였다. 대조군으로는 flamma 675를 표지한 CNSSSVDKC 펩타이드(Control, 서열번호 10)를 같은 농도와 방법으로 주사하였다. NIRF이미징 신호는 IVIS imaging system(Caliper Life Sciences, Massachusetts, USA)을 이용하여 스캔 및 획득하였다.

그 결과 도 9에서 보는 바와 같이, 펩타이드 주입 후 4~5시간 후에 대조 펩타이드(CNSSSVDKC)를 주사한 군의 마우스에서 획득된 형광 이미징과 비교했을 때, 본 발명의 펩타이드 AtgPep-2(CQQTKNYYC)가 오토파지 유도 후 유의하게 높은 수준으로 종양에 표적(화살표로 표시)된 것을 확인하였다.

본 발명의 도 9에서 나타난 영상신호의 결과가 종양에서 오토파지가 유도되어 펩타이드의 표적이 일어난 것인지에 대한 확인을 위해 조직에서의 표적신호를 현미경으로 관찰하였다. 마우스는 5시간째 이미징 획득 후, 희생되었고 종양은 분리된 후, 조직의 동결절편을 제작하였다. 6 두께로 제작된 종양 동결 절편은 핵염색을 위해 DAPI 염색을, 오토파지 유도를 확인하기 위해 LC3 항체로 면역염색을 각각 실시하였다. 현미경상에서 flamma675(=FPR675) dye 신호(빨간색), LC3(초록색), DAPI(파란색)로 관찰하였다.

그 결과 도 10에서 보는 바와 같이, 펩타이드 주입 후 5시간 후에 본 발명의 펩타이드 AtgPep-2(CQQTKNYYC)가 주사된 종양 조직에서 나타난 표적신호가 in vivo에서 관찰된 영상의 결과와 동일하게 대조 펩타이드 주사 군에 비해 유의하게 높은 수준으로 나타난 것이 확인되었다. 반면, LC3 면역염색결과, AtgPep-2(CQQTKNYYC) 펩타이드 주사군과 대조 펩타이드(CNSSSVDKC) 주사군 모두에서 오토파지가 잘 유도되었음을 확인하였다. 즉, 대조 펩타이드 주사군에서는 오토파지가 유도 되었으나 표적신호가 나타나지 않았고, AtgPep-2 펩타이드의 표적신호는 확인할 수 있었다. 또한, 도 9에서 나타난 생체 영상의 결과가 종양에서 실제 오토파지가 유도되어 펩타이드의 표적이 일어난 것임을 확인할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 오토파지 세포(autophagic cell) 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 명세서에서 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 검출용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물, 이를 유효성분으로 포함하는 영상화용 조성물 등에 관한 것이다.

본 발명의 펩타이드는 오토파지 세포(autophagic cell)의 세포막에 특이적으로 결합하며, 다양한 종류의 조직 및 세포에 대하여 적용 가능하고 in vitro 및 in vivo 상에서 오토파지의 검출 및 영상화 효과가 현저하므로, 산업상 이용 가능성이 높다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Peptides for targeting autophagic cell and uses thereof <130> NP16-0005 <150> 10-2015-0028567 <151> 2015-02-27 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AtgPep-1 <400> 1 Cys Lys His His Leu Gly Ala Ile Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AtgPep-2 <400> 2 Cys Gln Gln Thr Lys Asn Tyr Tyr Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AtgPep-3 <400> 3 Cys Asn Thr Gly Ser Pro Tyr Glu Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of AtgPep-4 <400> 4 Cys Pro Pro Asn Thr Asp Arg Ser Cys 1 5 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of AtgPep-1 <400> 5 tgtaagcatc atctgggtgc gatttgc 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of AtgPep-2 <400> 6 tgtcagcaga cgaagaatta ttattgc 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of AtgPep-3 <400> 7 tgtaatactg gttcgcctta tgagtgc 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of AtgPep-4 <400> 8 tgtccgccga atactgatcg ttcgtgc 27 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of ApoPep-1 <400> 9 Cys Gln Arg Pro Pro Arg 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Control <400> 10 Cys Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Cys 1 5

Claims

다음의 서열 일반식(I)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드;
(I)[아미노 말단-C-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C- 카복시 말단)
상기 C는 시스테인이고,
상기 X1은 라이신, 글루타민, 아스파라긴 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며;
상기 X2는 히스티딘, 글루타민, 트레오닌 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며;
상기 X3은 히스티딘, 트레오닌, 글라이신 및 아스파라긴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며;
상기 X4는 류신, 라이신, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며;
상기 X5는 글라이신, 아스파라긴, 프롤린 및 아스파트르산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며;
상기 X6은 알라닌, 타이로신 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며;
상기 X7은 아이소류신, 타이로신, 글루탐산 및 세린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산. .
제1항에 있어서,
상기 X1은 라이신 또는 글루타민이며;
상기 X2는 히스티딘 또는 글루타민이며;
상기 X3은 히스티딘 또는 트레오닌이며;
상기 X4는 류신 또는 라이신이며;
상기 X5는 글라이신 또는 아스파라긴이며;
상기 X6은 알라닌 또는 타이로신이며;
상기 X7은 아이소류신 또는 타이로신
인 것을 특징으로 하는 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 오토파지 세포(autophagic cell)와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 오토파지 세포의 세포막 표면에 결합하는 것을 특징으로 하는, 오토파지 세포와 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5 내지 서열번호 8로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
제7항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 검출용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 제1항의 폴리펩타이드를 시료와 혼합하는 단계;
(b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩타이드를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 폴리펩타이드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 오토파지 세포(autophagic cell)의 검출 방법.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 세포 특이적 약물 전달용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 퇴행성 신경질환, 뇌졸중, 종양성 질환, 심근증, 심근경색, 노화, 타입II PCD(type II programmed cell death), 제2형 당뇨병 및 박테리아 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 오토파지 관련 질환에 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
제13항에 있어서, 상기 퇴생성 신경질환은 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 픽병(Pick's Disease) 및 파킨슨-ALS(amyotrophic lateral sclerosis)-치매 복합증으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제13항에 있어서, 상기 종양성 질환은 폐암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 유방암, 난소암, 신장암, 갑성선암, 부갑상선암, 식도암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 골육종, 연부조직육종, 신경교종, 림프종, 비인두암, 후두암, 부신암, 결장암, 요관암, 담낭암, 방광암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 두경부암, 악성흑색종, 백혈병, 복합 골수종, 만성 골수성 백혈병, 신경아종 및 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 오토파지 영상화용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 자기공명 영상물질, 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
제16항에 있어서, 상기 조성물은 퇴행성 신경질환, 뇌졸중, 종양성 질환, 심근증, 심근경색, 노화, 타입II PCD(type II programmed cell death), 제2형 당뇨병 및 박테리아 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 오토파지 관련 질환에 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 심근경색 치료제를 유효성분으로 포함하는 심근경색 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심근경색 부위의 영상화용 조성물.
제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물.
제1항의 폴리펩타이드 및 이와 결합된 뇌졸중 치료제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항의 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 부위의 영상화용 조성물.