CN112135836A - 抑制细胞自噬的组合物和包含其的用于预防或治疗肿瘤性疾病或抑制抗癌药耐药性的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对细胞中的自噬具有抑制活性的多肽，以及包含其作为抑制细胞(特别是肿瘤细胞)中的自噬的活性成分的组合物，更具体地，涉及用于抑制细胞中的自噬的组合物，其包括抑制调节自噬的机制的作为活性成分的多肽；以及涉及包含其的用于预防或治疗肿瘤性疾病或抑制抗癌药耐药性的药物组合物。根据本发明，根据本发明的多肽调节自噬相关蛋白(p‑AMPK，ATG5‑ATG12，Beclin1，p‑Beclin1，LC3‑I，LC3‑II，p‑mTOR和p62)的表达，从而抑制自噬，因此有效预防或治疗肿瘤性疾病，并且还可以抑制抗癌药耐药性。

Description

抑制细胞自噬的组合物和包含其的用于预防或治疗肿瘤性疾 病或抑制抗癌药耐药性的药物组合物
技术领域
本发明涉及具有抑制细胞自噬的活性的多肽，含有该多肽作为活性成分的用于抑制自噬的组合物，以及含有该多肽的药物组合物。更具体地，本发明涉及一种抑制细胞(特别是肿瘤细胞)自噬的组合物，其包含抑制自噬的控制机制的多肽作为活性成分，以及用于预防或治疗肿瘤性疾病或抑制对抗癌药的耐药性的药物组合物，其含有该多肽。
背景技术
自噬是从细胞中去除不必要或受损的细胞器和蛋白质的过程，它有助于维持细胞稳态，并且是细胞存活的机制。
众所周知，自噬在多种疾病中发挥着多种作用，特别是在癌症，炎症性疾病，神经退行性疾病，免疫性疾病等多种疾病中。特别是，许多研究表明，自噬根据癌症的进展、类型、基因型等等而具有复杂的作用，因此与癌症密切相关。
当癌症由细胞的迅速增加形成时，由于周围环境中营养物质的不适当供应，细胞将挨饿。此时，通过回收有害的蛋白质沉积物和受损的细胞器而通过自噬为细胞提供营养，并且在不利于癌症生长的环境中通过自噬的能量供应促进了癌细胞的存活。
在这些情况下，已知参与细胞存活的蛋白质是AMP激活的蛋白激酶(AMPK)。众所周知，AMP在能量消耗、细胞外基质释放、活性氧增加和缺氧的条件下被激活，在诱导代谢作用中起重要作用。另外，已知活化的AMPK抑制自噬信号传导系统中的雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)的作用。
mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PI3K相关激酶家族，并且已知调节细胞生长和增殖，存活，迁移，蛋白质合成和转录，并抑制自噬。已发表的许多研究报告说，mTOR机制不仅与癌症有关，而且与多种疾病有关，例如代谢疾病，神经退行性疾病，心血管疾病等。
Beclin1是BECN1基因编码的蛋白质，是自噬诱导物。Beclin1在肿瘤抑制中起着重要作用，已知这种肿瘤抑制功能与自噬的程序性细胞死亡有关。
最近，对自噬在肿瘤的形成，生长和治疗中起重要作用的研究结果的兴趣与日俱增。自噬在癌症中的作用是如此复杂，以至于它具有两种相反的功能，即抑癌剂或促癌剂。因此，区分和适当调节自噬在各种癌症病状下的作用已成为癌症治疗的一种新的策略方法，研究结果表明抑制自噬降低了对抗癌药的耐药性，耐药性是各种化学疗法的癌症疗法的主要问题(2017,Nature Reviews Cancer 17,528-542)。
在这些情况下，本发明人努力开发能够控制在癌症中起重要作用的自噬的多肽。结果，他们确认了包含作为活性成分的抑制自噬控制机制的多肽的用于抑制细胞(特别是肿瘤细胞)中自噬的组合物，以及包含所述多肽的用于预防或治疗肿瘤性疾病或抑制抗癌药耐药性的药物组合物，通过激活抑制自噬的mTOR并通过使诱导自噬的AMPK和Beclin1失活来抑制自噬，具有抑制自噬引起的肿瘤生长的促进作用并降低对抗癌药的耐药性，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多肽，该多肽具有通过激活抑制自噬的mTOR并通过使诱导自噬的AMPK和Beclin1失活来抑制自噬，从而具有抑制由自噬引起的促进肿瘤生长作用并降低细胞(尤其是肿瘤细胞)对抗癌药的耐药性的活性。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其用于使用该多肽抑制细胞(特别是肿瘤细胞)中的自噬。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其用于使用该多肽预防或治疗肿瘤性疾病。
本发明的又一个目的是提供一种药物组合物，其用于使用该抑制自噬的组合物来抑制对抗癌药的耐药性。
根据本发明的一方面，提供了具有抑制细胞中的自噬的活性的多肽，其由以下序列的通式表示：
[通式]X3-X1-T-X1-K-X2
其中，在上述序列的通式中，
T是苏氨酸
K是赖氨酸；
X1是选自由丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸和缬氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；
X2是选自由丙氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；和
X3是选自由丙氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺和甘氨酸组成的组中的至少一种氨基酸，或不存在。
通过细胞存活机制在应激下的细胞中诱导自噬。尽管自噬在癌症发作之前或在癌症发展期间抑制肿瘤，但是一旦癌症发展，它就有助于肿瘤细胞的存活。因此，据认为自噬可以通过抑制癌症已发展的肿瘤细胞中的自噬机制来降低肿瘤细胞的活性。
在这方面，本发明人已经发明了一种用于抑制在癌症已发展的细胞(特别是在肿瘤细胞)中的自噬的多肽，并确认了通式代表的多肽可以通过抑制自噬，抑制由自噬引起的肿瘤生长的促进以及减少对抗癌药的耐药性，从而完成本发明。
在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，所述细胞可以是肿瘤细胞。
如本文所使用的，术语“在肿瘤细胞中”可以是指癌症发生后的肿瘤细胞，并且可以指实体癌。另外，术语“肿瘤细胞”可以指对抗癌药具有耐药性的肿瘤细胞。
在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，X1可以是非极性的并且具有脂肪族R基团的氨基酸，优选X1可以是丙氨酸，且X2可以是非极性的并且具有不带电荷的R基团的氨基酸，优选X2可以是丙氨酸。
另外，在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，X1可以是非极性的且具有脂肪族R基团的氨基酸，且优选是脯氨酸，X2可以是极性且具有不带电荷的R基团的氨基酸，且优选是苏氨酸。
另外，在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，X1可以是非极性的且具有脂肪族R基团的氨基酸，且优选是异亮氨酸，X2可以是极性且具有不带电荷的R基团的氨基酸，且优选是苏氨酸。
在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，X3可以是谷氨酰胺或苏氨酸。
另外，在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，X3可以是丝氨酸。
在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，X3可以是甘氨酸，天冬酰胺或苏氨酸。
本发明的具有抑制自噬活性的多肽通过减少选自由p-AMPK，ATG5-ATG12，Beclin1，p-Beclin1，LC3-I和LC3-II组成的组中的至少一种蛋白质的表达来抑制细胞中的自噬。
根据一实施方案，作为确认在非小细胞肺癌细胞系之间蛋白质参与自噬机制的关联的结果，确认了与非小细胞肺癌细胞系相比，在对抗癌药耐药的非小细胞肺癌细胞系中p-AMPK、ATG5和ATG5-ATG12的表达增加，p62蛋白的表达降低。
p-AMPK是增加肿瘤生长和自噬引起的抗癌药耐药性的因子，而ATG5-ATG12是负责自噬中自噬体形成的重要因子，因此p-AMPK、ATG5和ATG5-ATG12的表达增加意味着根据本发明的多肽参与癌细胞的耐药性(参见实施例1以及图1至3)。即，根据本发明的一实施方案，p-AMPK、ATG5和ATG5-ATG12的表达的增加意味着参与癌细胞的耐药性(参见实施例1以及图1至3)。
根据本发明的多肽根据在对抗癌药具有耐药性的非小细胞肺癌细胞系上的浓度进行治疗的结果，确认了Beclin1，p-Beclin1，ATG5-ATG12，LC3-I和LC3-II蛋白(称为自噬的引发剂)的表达减少了。这些结果表明，根据本发明的多肽可通过减少蛋白质(被称为自噬的激活剂)的表达来抑制自噬，从而抑制肿瘤的生长并降低其对抗癌药的耐药性(参见实施例2和图4至6)。
在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，抑制肿瘤细胞中的自噬可以通过增加p-mTOR或p62蛋白的表达来抑制细胞中的自噬。
根据本发明的一实施方案，作为确认本发明的多肽的抑制自噬作用、抗肿瘤作用和抑制抗癌药耐药性的作用的结果，确认了当根据浓度将本发明的多肽引入小鼠时，以浓度依赖性方式降低肿瘤组织的浓度(参见实施例4和图8)。
此外，通过确认肿瘤组织中自噬相关因子的表达水平，确认了起抑制自噬作用的p-mTOR和p62蛋白的表达有所增加，而自噬激活剂p-AMPK，Beclin1和p-Beclin1蛋白的表达降低。
这些结果表明，本发明的多肽可通过使诱导自噬的p-AMPK，Beclin1和p-Beclin1失活，并通过增加抑制自噬的因子来减少肿瘤生长的促进作用，并降低对抗癌药的耐药性(参见实施例4和图9)。
在本发明的具有抑制自噬活性的多肽中，可以用选自由发色酶，放射性同位素，发色团，发光材料，荧光剂，磁共振成像(MRI)材料，超顺磁性颗粒和超超顺磁性颗粒组成的组中的任何一种标记材料标记多肽，但是，这不一定意味着多肽可以用标记材料标记。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中自噬的组合物，其包含由以下通式表示的多肽作为活性成分：
[通式]X3-X1-T-X1-K-X2
其中，在上述序列的通式中，
T是苏氨酸
K是赖氨酸；
X1是选自由丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸和缬氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；
X2是选自由丙氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；和
X3是选自由丙氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺和甘氨酸组成的组中的至少一种氨基酸，或不存在。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物，其包含由以下通式表示的多肽作为活性成分：
[通式]X3-X1-T-X1-K-X2
其中，在上述序列的通式中，
T是苏氨酸
K是赖氨酸；
X1是选自由丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸和缬氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；
X2是选自由丙氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；和
X3是选自由丙氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺和甘氨酸组成的组中的至少一种氨基酸，或不存在。
在本发明的用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物中，所述肿瘤性疾病可以选自由以下组成的组中的一种：肺癌，肝癌，结肠癌，胰腺癌，胃癌，乳腺癌，卵巢癌，肾癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，食道癌，前列腺癌，脑癌，皮肤癌，骨肉瘤，软组织肉瘤，神经胶质瘤，淋巴瘤，鼻咽癌，喉癌，肾上腺癌，结肠癌，输尿管癌，胆囊癌，膀胱癌，睾丸癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，头颈癌，恶性黑色素瘤，白血病，多发性骨髓瘤，慢性粒细胞白血病，神经母细胞瘤和再生障碍性贫血，优选是肺癌或乳腺癌，但肿瘤性疾病不限于此。
在本发明的用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物中，所述组合物可用作用于通过抑制自噬来预防或治疗的疾病的药物组合物，并且优选用作用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于抑制对抗癌药的耐药性的药物组合物，其包含由以下通式表示的多肽作为活性成分：
[通式]X3-X1-T-X1-K-X2
其中，在上述序列的通式中，
T是苏氨酸
K是赖氨酸；
X1是选自由丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸和缬氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；
X2是选自由丙氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；和
X3是选自由丙氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺和甘氨酸组成的组中的至少一种氨基酸，或不存在。
在本发明的抑制对抗癌药的耐药性的药物组合物中，所述组合物可对用于治疗肿瘤性疾病的任何抗癌药具有耐药性，并且优选对选自由以下组成的组中的至少一种抗癌药具有耐药性：厄洛替尼，雷公藤红素，顺铂，多西他赛，奥西替尼，紫杉醇，培美曲塞和他莫昔芬。
在本发明的用于抑制抗癌药耐药性的药物组合物中，所述组合物可通过抑制自噬来抑制对抗癌药的耐药性。
根据一实施方案，通过用本发明的多肽处理PC9-ER，H1975和MCF7R(即对多种抗癌药具有耐药性的癌细胞系)的结果，确认了细胞生长受到抑制(参见图6、11和14)。
这些结果表明，本发明的多肽可以通过抑制自噬来抑制(降低)癌细胞系(其对抗癌药具有耐药性)中对抗癌药的耐药性。
此外，本发明提供由以下通式表示的多肽用于制备用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物的用途。
此外，本发明提供了一种治疗肿瘤性疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的由以下通式表示的多肽：
[通式]X3-X1-T-X1-K-X2
其中，在上述序列的通式中，
T是苏氨酸
K是赖氨酸；
X1是选自由丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸和缬氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；
X2是选自由丙氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；和
X3是选自由丙氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺和甘氨酸组成的组中的至少一种氨基酸，或不存在。
在本发明中，“受试者”可以是包括人的哺乳动物，但是这些例子不限于此。
本发明的药物组合物可以以多肽的纯形式或通过将其与药学上可接受的载体一起配制成合适的形式来提供。如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指无毒组合物，当其是生理学上可接受的并施用于人时，通常不引起变态反应例如胃肠道疾病，头晕等。载体的实例可包括各种溶剂，分散介质，水包油乳液或油包水乳液，含水组合物，脂质体，微珠和微粒体，可生物降解的纳米粒子等，但是药学上可接受的载体不限于此。
同时，根据本发明的药物组合物可以根据给药途径与药学上可接受的载体一起配制。根据本发明的施用途径可以包括口服或肠胃外施用，但是施用途径不限于此。肠胃外给药途径的实例可包括各种途径，例如透皮，经鼻，腹膜，肌肉，皮下或静脉内给药，但肠胃外给药途径不限于此。
在口服施用本发明的药物组合物的情况下，根据本领域已知方法，本发明的药物组合物可以与用于口服施用的药学上可接受的载体一起配制成粉剂，颗粒剂，片剂，丸剂，糖衣片，胶囊剂，溶液剂，凝胶剂，糖浆剂，混悬剂，植入剂(Wafer)等，但制剂类型不限于此。
可以根据本领域已知的方法配制本发明的药物组合物，以便在施用至哺乳动物后提供活性成分的快速，持续或延迟释放。
通过上述方法配制的药物组合物可以通过包括口服、透皮、皮下、静脉内或肌肉施用的各种途径以有效量施用。如本文所使用的，术语“有效量”是指当施用于患者时能够追踪诊断或治疗效果的物质的量。
根据本发明的药物组合物的剂量可以根据给药途径、所治疗的对象、所治疗的疾病及其严重程度、年龄、性别、体重、个体差异和疾病状态来适当选择。优选地，含有本发明多肽的药物组合物可以根据疾病的严重程度而变化，并且常规上，活性成分内容可以每天多次重复施用，每单次给药的有效剂量基于成年人为1mg至1000mg。
[本发明的有益效果]
如上所述，根据本发明的多肽具有通过抑制自噬来预防或治疗肿瘤性疾病的作用，并且在抑制抗癌药耐药性方面也是有效的。
附图简要说明
图1至3示出了根据本发明的实施例1的结果。
图4至图6示出了根据本发明的实施例2的结果。
图7示出了根据本发明的实施例3的结果。
图8和9示出了根据本发明的实施例4的结果。
图10和11示出了根据本发明的实施例5的结果。
图12至图14示出了根据本发明的实施例6的结果。
具体实施方案
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。由于这些实施例仅用于举例说明本发明，因此本发明的范围不被解释为受限于这些实施例。
实施例1：确认癌细胞系中的自噬机制
将本发明中使用的癌细胞系(PC9)在条件培养箱(37℃)中在补充有10％胎牛血清和抗生素的最小必需培养基中培养。通过长期暴露于抗癌药厄洛替尼，癌细胞系(PC9-ER)被构建为具有耐药性。
为了检查癌细胞系(PC9)和对抗癌药具有耐药性的细胞系(PC9-ER)是否包含具有控制自噬机制的蛋白质，通过蛋白质印迹法比较了AMP活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化的AMPK(p-AMPK)，自噬相关基因5(ATG5)，ATG5-ATG12和p62蛋白的表达水平，结果示于图1中。
结果，如图1所示，确认了具有抗癌药耐药性的细胞系(PC9-ER)与PC9细胞系相比表现出p-AMPK、ATG5和ATG5-ATG12的表达水平的增加，并且还确认了自噬抑制分子p62蛋白的表达水平降低。
另外，对PC9细胞系和PC9-ER细胞系进行免疫荧光染色。
具体地，将PC9细胞系和PC9-ER细胞系在室温下使用4％甲醛固定。然后，使用含0.1％BSA的PBS使细胞在室温下反应30分钟以防止不正确结合抗体，并使其在4℃下与LC3抗体反应(细胞信号转导)24小时。除去抗体后，用PBS洗涤细胞，并在室温下使其与用Alexa488荧光标记的二抗(Thermo Fisher)反应1.5小时。反应后，去除了抗体的细胞用PBS洗涤，并用DAPI(Thermo Fisher)染色1分钟。通过共聚焦显微镜确认了荧光染色，结果示于图2中。
结果，如图2中可以看出的，确认了与PC9细胞系相比，PC9-ER细胞系中的LC3斑点(puncta)的表达水平更高。
另外，进行MTT分析以确认PC9细胞系和PC9-ER细胞系对抗癌药的耐药性。
具体地，将等量的PC9细胞系和PC9-ER细胞系在96孔细胞培养板中培养，用经过1/10倍系列稀释的抗癌药处理24小时，并使用MTT确认。作为利用活细胞的线粒体中存在的NADH与MTT反应形成甲瓒(formazan)的原理的实验，将甲瓒溶解于DMSO中，并在570nm下测定吸光度，从而确认了细胞的生长活性。结果示于图3中。
结果，如图3中可以看出的，已确认与PC9细胞系相比，其中进一步激活控制自噬机制的PC9-ER细胞系对多西他赛和紫杉醇(即，已知的抗癌药)具有更高的耐药性。
实施例2：确认多肽在自噬控制中的作用
基于已知参与癌细胞系(PC9-ER)中的自噬的ATG5和ATG5-ATG12蛋白的表达的结果，尝试确认SPTPKT(多肽1)和QTATAKA(多肽2)对自噬的抑制作用。
具体地，分别用多肽1和多肽2处理PC9-ER细胞系，并通过蛋白质印迹法比较Beclin1，p-Belclin1，ATG5-ATG12，LC3 I和LC3 II(即与自噬机制有关的蛋白)的表达水平，结果示于图4中。
结果，如图4中可以看出的，确认了当分别用多肽1和多肽2处理PC9-ER细胞系时，称为自噬启动子(initiator)的Beclin1和p-Beclin1以及作为自噬激活分子的ATG5-ATG12、LC3 I和LC3 II蛋白的表达水平降低了。
另外，用多肽2处理PC9-ER细胞系后，对细胞进行免疫荧光染色。
具体地，在用多肽2处理PC9-ER细胞系后24小时，使用4％甲醛在室温下固定细胞。然后，使用含0.1％BSA的PBS使细胞在室温下反应30分钟，以防止不正确结合抗体，并使其在4℃下与LC3抗体反应(细胞信号转导)24小时。除去抗体后，用PBS洗涤细胞，并在室温下使其与用Alexa488荧光标记的二抗(Thermo Fisher)反应1.5小时。反应后，去除了抗体的细胞用PBS洗涤，并用DAPI(Thermo Fisher)染色1分钟。通过共聚焦显微镜确认了荧光染色，结果示于图5中。
结果，如图5中可以看出的，确认了在PC9-ER细胞系中LC3斑点的表达水平降低。
另外，分别用多肽1，多肽2和GNTITIKT(多肽3)处理PC9-ER细胞系，并进行MTT测定以确认PC9-ER细胞系对抗癌药的耐药性。
具体地，将PC9-ER细胞系接种在96孔细胞培养板上，并用每种多肽(1至3)处理24小时。然后，用经过1/10倍系列稀释的抗癌药处理细胞24小时，并用MTT确认。作为利用活细胞的线粒体中存在的NADH与MTT反应形成甲瓒的原理的实验，将甲瓒溶解于DMSO中，并在570nm下测定吸光度，从而确认了细胞的生长活性。结果示于图6中。
结果，如图6中可以看出的，确认了在PC9-ER细胞系中，每种多肽(1至3)处理降低了对作为抗癌药的厄洛替尼(特罗凯，Tarceva)的耐药性。
这些结果表明，多肽1、多肽2和多肽3在具有抗癌药耐药性的癌细胞系中对自噬具有抑制作用。
实施例3：确认多肽的细胞内表达
与根据本发明的实施例1的免疫荧光染色方法一样，多肽2用绿色荧光(异硫氰酸荧光素；FITC)标记，并根据已知方法转染到PC9-ER细胞系中。结果示于图7中。
结果，如在图7中可以看到的，确认了FITC-多肽2以时间依赖性方式被递送到细胞中。
实施例4：确认多肽对肿瘤形成的抑制作用
基于多肽2在体内条件下通过自噬显示出抗癌作用的结果，试图确认多肽2的体内抗癌作用。
具体地，向无胸腺裸鼠(BALB/C裸鼠，5至6周龄雌性)侧部皮下注射PC9-ER细胞系(2×106细胞/小鼠)，以诱导肿瘤。当肿瘤体积达到约150mm3时，通过尾静脉总共注射5次多肽2，并检查肿瘤大小的变化。使用卡尺直接测量肿瘤体积，并通过以下公式(长度×宽度×高度×0.5)计算。为了确认多肽2对肿瘤形成的抑制作用，从第25天开始每隔3天，通过尾静脉注射肽(浓度为0μg/小鼠，50μg/小鼠，100μg/小鼠和200μg/小鼠)5次。在第41天，分离肿瘤并测量肿瘤体积的大小，并使用每种标记的抗体进行蛋白质印迹。结果示于图8和9中。
结果，如在图8中可以看到的，确认了多肽2显著减小了肿瘤的大小。
另外，如在图9中可以看到的，肿瘤组织表现出p-mTOR和p62蛋白的表达以浓度依赖的方式增加，而p-AMPK、Beclin1和p-Beclin1的表达以浓度依赖的方式降低的现象。
这些结果表明通过抑制自噬机制，多肽2具有抗癌作用。
实施例5：确认多肽对控制自噬的作用
为了通过在H1975(其是与实施例1至4不同的非小细胞肺癌细胞系)中的自噬控制蛋白来检查多肽1和多肽2的抗癌活性的作用，使用H1975细胞中的每种标记抗体进行蛋白质印迹。结果示于图10中。
结果，如在图10中可以看到的，已确认当分别用多肽1和多肽2处理时，已知参与癌症控制机制的p-AMPK的表达以及参与自噬控制机制的蛋白质p-Beclin1、ATG5、ATG5-ATG12、LC3 I和LC3 II的表达降低了。
另外，在分别用多肽1、多肽2和多肽3处理之后，进行MTT测定以便确认对抗癌药奥西替尼(泰瑞沙，Tagrisso)的耐药性。
具体地，将相等数量的H1975细胞系的细胞接种到96孔细胞培养板中，并用多肽(1至3)处理24小时。然后，将细胞用经过1/10倍系列稀释的抗癌药奥西替尼(Tagrisso)处理24小时，并使用MTT确认。作为利用活细胞的线粒体中存在的NADH与MTT反应形成甲瓒的原理的实验，将甲瓒溶解于DMSO中，并在570nm下测定吸光度，从而确认了细胞的生长活性。结果示于图11中。
结果，如在图11中可以看到的，已确认每种多肽(1至3)降低了对抗癌药奥西替尼(Tagrisso)的耐药性。
这些结果表明，多肽1、多肽2和多肽3通过抑制自噬而具有抗癌活性。
另外，已确认当用不同浓度的多肽2处理细胞时，对抗癌药奥西替尼(Tagrisso)的耐药性以浓度依赖性方式降低。
实施例6：确认多肽的抗癌活性的作用
通过长时间暴露于雷公藤红素而将具有抗癌药耐药性的MCF7R癌细胞系构建成具有耐药性。
为了检查多肽1和多肽2对自噬控制机制蛋白的作用，使用MCF7R细胞系中的每种标记抗体进行了蛋白质印迹。结果示于图12中。
结果，如在图12中可以看到的，已确认当分别用多肽1和多肽2处理时，自噬抑制分子p62蛋白的表达水平升高，而自噬激活分子p-Beclin1、ATG5、ATG5-ATG12、LC3 I和LC3 II蛋白的表达水平降低。
另外，在MCF7R细胞系中用多肽2处理后，进行了免疫荧光染色。
具体地，在MCF7R细胞系上处理多肽2 24小时后，使用4％甲醛在室温下固定细胞。然后，使用含0.1％BSA的PBS使细胞在室温下反应30分钟，以防止不正确结合抗体，并使其在4℃下与LC3抗体反应(细胞信号转导)24小时。除去抗体后，用PBS洗涤细胞，并在室温下使其与用Alexa488荧光标记的二抗(Thermo Fisher)反应1.5小时。反应后，去除了抗体的细胞用PBS洗涤，并用DAPI(Thermo Fisher)染色1分钟。通过共聚焦显微镜确认了荧光染色，结果示于图13中。
结果，如在图13中可以看到的，确认了当在MCF7R细胞系上处理多肽2时，LC3斑点的表达水平降低。
另外，在MCF7R细胞系中分别用多肽1、多肽2和多肽3处理后，进行MTT测定以确认对抗癌药的耐药性。
具体地，将相等数量的H1975细胞系的细胞接种到96孔细胞培养板中，并用多肽(1至3)处理24小时。然后，用经过1/10倍系列稀释的抗癌药处理细胞24小时，并用MTT确认。作为利用活细胞的线粒体中存在的NADH与MTT反应形成甲瓒(formazan)的原理的实验，将甲瓒溶解于DMSO中，并在570nm下测定吸光度，从而确认了细胞的生长活性。结果示于图14中。
结果，如在图14中可以看到的，已确认在MCF7R细胞系中，每种多肽(1至3)均降低了对各种抗癌药(例如是雷公藤红素，顺铂，多西他赛等)的耐药性。
[本发明的有益效果]
如上所述，根据本发明的多肽具有通过抑制自噬来预防或治疗肿瘤性疾病的作用，并且在抑制抗癌药耐药性方面也是有效的。
[工业实用性]
如上所述，根据本发明的多肽具有通过抑制自噬来预防或治疗肿瘤性疾病的作用，并且在抑制抗癌药耐药性方面也是有效的，因此可以用作预防或治疗肿瘤性疾病的组合物。
<110> L基础有限公司
<120> 抑制细胞自噬的组合物和包含其的用于预防或治疗肿瘤性疾病或抑制抗癌药耐药性的药物组合物
<130> DP-2018-0061-KR
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肿瘤-睾丸抗原蛋白（cancer-testis antigen protein）
<400> 1
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1 5
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肿瘤-睾丸抗原蛋白（cancer-testis antigen protein）
<400> 2
Gln Thr Ala Thr Ala Lys Ala
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 肿瘤-睾丸抗原蛋白（cancer-testis antigen protein）
<400> 3
Gly Asn Thr Ile Thr Ile Lys Thr
1 5

Claims (18)

1.具有抑制细胞中的自噬的活性的多肽，由以下序列的通式表示：
[通式]X3-X1-T-X1-K-X2
其中，在上述序列的通式中，
T是苏氨酸
K是赖氨酸；
X1是选自由丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，脯氨酸和缬氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；
X2是选自由丙氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺和丝氨酸组成的组中的至少一种氨基酸；和
X3是选自由丙氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺和甘氨酸组成的组中的至少一种氨基酸，或不存在。
2.如权利要求1所述的多肽，其中X1和X2是丙氨酸。
3.如权利要求1所述的多肽，其中X1是脯氨酸；以及X2是苏氨酸。
4.如权利要求1所述的多肽，其中X1是异亮氨酸；以及X2是苏氨酸。
5.如权利要求1所述的多肽，其中X3是谷氨酰胺或苏氨酸。
6.如权利要求1所述的多肽，其中X3是丝氨酸。
7.如权利要求1所述的多肽，其中X3是甘氨酸，天冬酰胺或苏氨酸。
8.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽通过减少选自由p-AMPK，ATG5-ATG12，Beclin1，p-Beclin1，LC3-I和LC3-II组成的组中的至少一种蛋白质的表达来抑制细胞中的自噬。
9.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽通过增加p-mTOR或p62蛋白的表达来抑制细胞中的自噬。
10.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽用选自由发色酶，放射性同位素，发色团，发光材料，荧光剂，磁共振成像(MRI)材料，超顺磁性颗粒和超超顺磁性颗粒组成的组中的任何一种标记材料标记。
11.如权利要求1所述的多肽，其中所述细胞是肿瘤细胞。
12.一种用于抑制细胞中自噬的组合物，其包含如权利要求1所述的多肽作为活性成分。
13.用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物，其包含如权利要求1所述的多肽作为活性成分。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述肿瘤性疾病选自肺癌，肝癌，结肠癌，胰腺癌，胃癌，乳腺癌，卵巢癌，肾癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，食道癌，前列腺癌，脑癌，皮肤癌，骨肉瘤，软组织肉瘤，神经胶质瘤，淋巴瘤，鼻咽癌，喉癌，肾上腺癌，结肠癌，输尿管癌，胆囊癌，膀胱癌，睾丸癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，头颈癌，恶性黑色素瘤，白血病，多发性骨髓瘤，慢性粒细胞白血病，神经母细胞瘤和再生障碍性贫血。
15.用于抑制对抗癌药的耐药性的药物组合物，其包含如权利要求1所述的多肽作为活性成分。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物对至少一种选自由厄洛替尼，雷公藤红素，顺铂，多西他赛，奥西替尼，紫杉醇，培美曲塞和他莫昔芬组成的组中的抗癌药具有耐药性。
17.如权利要求1所述的多肽用于制备用于预防或治疗肿瘤性疾病的药物组合物的用途。
18.一种治疗肿瘤性疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求1所述的多肽。
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