KR20160085910A - Fgfr3병의 예방 및 치료제 및 그 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 유효 성분으로서 HMG-CoA 환원 효소 저해약을 포함하는 FGFR3병의 치료 및/또는 예방용 의약, HMG-CoA 환원 효소 저해약을 투여하는 것을 포함하는 FGFR3병을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법, FGFR3병의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 HMG-CoA 환원 효소 저해약의 사용, 및 FGFR3병의 치료약 및/또는 예방약을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

FGFR3병의 예방 및 치료제 및 그 스크리닝 방법{PROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC AGENT FOR FGFR3 DISEASES AND METHOD FOR SCREENING SAME}
본 발명은, 섬유아 세포 증식 인자 수용체 3(FGFR3) 병의 치료제 및/또는 예방제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, FGFR3병의 치료제에 관한 것이다.
치사성 골이형성증(TD)이나 연골 무형성증(ACH) 등의 뼈 형성 이상(異常)과 관련된 질환은, 일반적으로 섬유아 세포 증식 인자 수용체 3(FGFR3)병으로 불리우며, FGFR3 중의 기능 획득형 돌연변이에 의해 일으켜지는 질환인 것으로 여겨지고 있다. 따라서, 이들 질환의 치료를 행하는 데 있어서 분자 표적으로서, FGFR3 및 그 하류의 시그널 전달 경로에 관한 각종 분자가 주목되고 있고, FGFR3로부터의 과잉의 시그널 전달을 저해하는 다양한 방법이 시도되어 왔다.
예를 들면, Jonquoy 등은, 티로신키나제 저해제(비특허 문헌 1)에 의해, Rauchenberger등은, FGFR3의 중화 항체(비특허 문헌 2)에 의해, 및 Yasoda등은, c형 나트륨 이뇨 펩티드(CNP)(비특허 문헌 3)에 의해, FGFR3로부터의 과잉의 시그널 전달을 저해하는 방법에 대해 보고하고 있다. 이들 방법 중 몇 가지는, 실제로, FGFR3와 관련된 연골 이형성 모델 마우스에서의 뼈 성장을 회복시키고 있다. 그러나, 변이형 FGFR3을 도입한 형질 전환 세포에서의 확인에 머물러, 적절한 인간 세포 모델을 사용한 유효성은 확인되고 있지 않으며, FGFR3병에 대하여 충분한 치료를 행할 수 있는지에 대해서는 불명한 점도 많기 때문에, 더 한층의 신규 치료약의 개발이 절실하게 요망되고 있다.
한편, 재생 의료 분야 등에서는, 생체 재료로서 편리성이 있는 세포로부터 원하는 세포형으로 전환하는 기술이 요구되고 있고, 최근에 있어서는, 마우스 및 인간의 인공다능성줄기세포(iPS 세포)가 수립되어 있다. Yamanaka등은, 인간의 피부 유래 섬유아 세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 4가지 유전자를 도입함으로써, iPS 세포를 수립하는 것에 성공하였다(특허 문헌 1 및 비특허 문헌 4). 이와 같이 하여 얻어지는 iPS 세포는, 치료 대상이 되는 환자 유래의 세포를 사용하여 제작된 후, 각각의 조직의 세포로 분화시킬 수 있으므로, in vitro로 병의 용태를 재현할 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 그러나, 현재까지는, FGFR3병 환자 유래의 체세포를 사용하여 iPS 세포의 제작에 성공한 예에 대해서는 보고되어 있지 않다.
WO 2007/069666
Jonquoy, A., et al., Hum Mol Genet 21: 841-851(2012) Rauchenberger, R., et al., J Biol Chem 278: 38194-38205(2003) Yasoda, A., et al., Endocrinology 150: 3138-3144(2009) Takahashi, K, et al., Cell. 131: 861-872(2007)
본 발명의 과제는, 섬유아 세포 증식 인자 수용체 3(FGFR3)병의 치료제 및/또는 예방제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 과제는 또한, FGFR3병의 치료제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기한 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과, FGFR3병 환자의 체세포 유래의 iPS 세포를 연골 형성적으로 분화 유도시킴으로써, FGFR3병의 용태를 재현하는 것에 성공하였다. 즉, FGFR3병 환자의 체세포 유래의 iPS 세포는, 정상 개체 유래의 iPS 세포와 비교하여, 연골 세포로의 분화가 억제되는 경향을 발견하였다. 또한, FGFR3병의 치료제 및/또는 예방제를 발견하기 위해 FGFR3병 환자의 체세포 유래의 iPS 세포를 사용하여 스크리닝을 행한 결과, 고지혈증의 치료에 사용되고 있는 약제가 연골 세포로의 분화 유도를 촉진하는 것이 발견되었다. 본 발명은 이와 같은 지견에 기초하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 하기의 사항을 제공하는 것이다.
[1] 유효 성분으로서 HMG-CoA 환원 효소 저해약을 포함하는, FGFR3병의 치료 및/또는 예방용 의약.
[2] 상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, [1]에 기재된 의약.
[3] 상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, [1] 또는 [2]에 기재된 의약.
[4] FGFR3병을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, HMG-CoA 환원 효소 저해약을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
[5] 상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, [4]에 기재된 방법.
[6] 상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, [4] 또는 [5]에 기재된 방법.
[7] FGFR3병의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 HMG-CoA 환원 효소 저해약의 사용.
[8] 상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, [7]에 기재된 사용.
[9] 상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, [7] 또는 [8]에 기재된 사용.
[10] 하기 공정을 포함하는, FGFR3병의 치료약 및/또는 예방약을 스크리닝하는 방법:
(a) FGFR3에 변이를 가지는 인공다능성줄기(iPS) 세포를, 피험 물질과 접촉시키는 및 접촉시키지 않는 조건 하에서 연골 세포로 분화시키는 공정,
(b) 공정(a)에서 얻어진 배양물 중에 있어서의 연골 세포외 매트릭스의 양, 연골 세포 마커 유전자 및 섬유아 세포 마커 유전자의 발현량으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 지표를 측정하는 공정, 및
(c) 피험 물질과 접촉시키는 조건 하에 있어서, 접촉시키지 않는 조건 하 보다 연골 세포외 매트릭스의 양 또는 연골 세포 마커 유전자가 증가한 경우, 또는 섬유아 세포 마커 유전자의 발현량이 감소한 경우, 상기 피험 물질을 FGFR3병의 치료약 또는 예방약으로서 선출하는 공정.
[11] 상기 공정(a)에서의 연골 세포로의 분화가 하기 공정을 포함하는, [10]에 기재된 방법:
(i) 다능성줄기세포를 접착 배양함으로써 중배엽 세포를 유도하는 공정,
(ii) 상기 공정(i)에서 얻어진 세포를 bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ, GDF5 및 피험 물질을 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정, 및
(iii) 상기 공정(ii)에서 얻어진 세포를 아스코르브산, BMP2, TGFβ, GDF5 및 피험 물질을 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정.
[12] 상기 연골 세포 마커 유전자가, SOX9, AGGRECAN 및 COL2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자인, [10] 또는 [11]에 기재된 방법.
[13] 상기 섬유아 세포 마커 유전자가, COL1A1 및/또는 COL1A2인, [10] 또는 [11]에 기재된 방법.
[14] 상기 FGFR3의 변이가, FGFR3 중의 Arg248Cys 또는 Gly380Arg 변이인, [10] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[15] 상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, [10] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[16] FGFR3병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 HMG-CoA 환원 효소 저해약.
[17] 상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, [16]에 기재된 HMG-CoA 환원 효소 저해약.
[18] 상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, [17] 또는 [18]에 기재된 HMG-CoA 환원 효소 저해약.
본 발명에 의해, 신규한 툴을 사용한 FGFR3병의 치료제 및/또는 예방제의 스크리닝이 가능하게 된다. 또한, 본 발명에 의해, 상기 스크리닝에 의해 얻어진 FGFR3병의 치료제 및/또는 예방제를 제공하는 것이 가능하게 된다.
도 1은, TD-iPSC의 특성을 확인한 결과를 나타낸다. (a) 좌측 도면은, TD-iPSC(TD714-3)의 위상 화상을 나타내고, 우측 도면은, SSEA4 및 TRA1-60에 대한 TD-iPSC(TD714-3)의 형광상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (b) TD-iPSC(TD10749-2)의 SCID 마우스로의 이식 후에 형성된 테라토마의 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다.
도 2는, 연골 형성적으로 분화시킨 TD-iPSC 및 WT-iPSC를 나타낸다. (a) 각 iPSC를 연골 세포 분화 유도한 42일째에서의 파티클의 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. HE는, 헤마톡실린-에오진 염색을 나타내고, Safranin O는, Safranin O-fast green-iron hematoxylin staining을 나타낸다. (b) 각 iPSC 주로부터 유도한 파티클 중 임의의 10개에 대하여, 실질적으로 사프라닌 O로 염색된 파티클 수를 계수한 결과를 나타낸다. WT-iPSC의 각각으로부터 제작된 10종류의 파티클 모두는, 연골 유사 조직이며, 한편, TD-iPSC 주의 각각으로부터 제작된 모든 파티클은, 연골 유사 조직은 없었다.
도 3은 TD-iPSC 및 WT-iPSC로부터 분화 유도한 연골 세포의 분석 결과를 나타낸다. (a) 각 iPSC로부터의 연골 세포로의 분화 유도 28일째에서의 각 연골 세포 마커 유전자(SOX9, COL2 및 AGGRECAN) 및 섬유아 세포 마커 유전자(COL1A1 및 COL1A2)의 리얼타임 RT-PCR 발현 해석의 결과를 나타낸다. (b) iPSC로부터의 연골 세포로의 분화 유도 42일째에서의 면역 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (c) TD-iPSC(TD-714-3) 및 WT-iPSC(409 B2) 유래의 연골 파티클에서의 II형 콜라겐에 대한 면역 염색상을 나타낸다.
도 4는 TD-iPSC 및 WT-iPSC로부터 분화 유도한 연골 세포의 분석 결과를 나타낸다. (a) TD-iPSC 및 WT-iPSC의 연골 형성 분화의 과정에서의 FGFR3 mRNA의 리얼타임 RT-PCR 발현 해석의 결과를 나타낸다. 양성 대조군으로서의 연골 세포(Chondondrocyte)는, Cell Applications, Inc.로부터 구입한 인간 태아 연골 세포(402RD-R10f)의 결과를 나타내고, 음성 대조군으로서 섬유아 세포(Fibroblast)의 결과를 나타낸다. (b) TD-iPSC 및 WT-iPSC 유래의 연골 분화 28일째에서의 FGFR3 mRNA의 발현량을 정량(定量) PCR로 측정한 결과를 나타낸다. 결과는, 3개의 TD-iPSC주와 3개의 WT-iPSC주의 값의 평균을 t-검정으로 비교하고 있다. *P<0.05. (c) TD-iPSC 및 WT-iPSC 유래의 연골 분화 28일째에서의 FGFR3 단백질의 면역 블로팅의 결과를 나타낸다. (d) 각 마커 유전자(OCT3/4, T, KDR, SOX5, SOX6, SOX9, COL2A1 및 ACAN) 발현을 경시적(經時的)으로 정량 PCR로 측정한 결과를 나타낸다. 값은, 3회 측정한 평균값을 나타낸다.
도 5는, TD-iPSC 및 WT-iPSC로부터 분화 유도한 연골 세포의 분석 결과를 나타낸다. (a) TD-iPSC(TD714-3) 및 WT-iPSC(409B2) 유래의 연골 분화 28일째에 BrdU 처리한 후, 항BrdU 항체에서의 면역 염색상을 나타낸다. (b) BrdU 양성 세포수를 계측한 결과를 나타낸다. (c) 분화 유도 21일째에서의 iPSC 유래 파티클의 TUNEL 에세이의 결과를 나타낸다. 스케일 바는 50 ㎛이다. (d) TD-iPSC 및 WT-iPSC의 연골 세포 분화 유도 과정에서의, 전체 세포당의 TUNEL 양성 세포수의 비율을 나타낸다. (e) TD-iPSC(TD714-3) 및 WT-iPSC(409B2) 유래의 연골 분화 28일째에서의 cleaved-caspase 3에 대한 면역 염색상을 나타낸다. (f) iPSC로부터 분화 유도한 연골 세포에서의 p21의 정량 PCR에 의한 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 6은, FGFR3 shRNA를 도입한 TD-iPSC(TD714-3)로부터의 연골 세포 분화 유도의 해석 결과를 나타낸다. (a) FGFR3 shRNA PB 벡터의 개요를 나타낸다. (b) FGFR3의 3개의 상이한 부위를 표적으로 하는 shRNA PB 벡터(shFGFR3 1, shFGFR3 3 및 shFGFR3 5)를 각각 도입한 293 세포에 있어서, 항FGFR3 항체를 사용한 이뮤노블로팅의 결과를 나타낸다. (c) 3개의 상이한 FGFR3 shRNA(shFGFR3 1, shFGFR3 3 및 shFGFR3 5) 및 음성 대조군인 루시페라아제 서열을 표적으로 하는 shRNA(shLuciferase)를 도입한 TD-iPSC주의 연골 세포로의 분화 유도 42일째에서의 파티클의 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (d) FGFR3 shRNA 및 shLuciferase를 도입한 iPSC주로부터 유도한 파티클 중 임의의 10개에 대하여, 실질적으로 사프라닌 O로 염색된 파티클 수를 계수한 결과를 나타낸다. (e) 각 iPSC(shFGFR3 1, shFGFR3 3, shFGFR3 5, shLuciferase 및 WT-iPSC(WT))의 분화 유도 28일째에서의 연골 세포, 미분화 iPSC 및 연골 세포(Chondondrocyte, 402RD-R10f)에서의 마커 유전자(SOX9, COL2, AGGRECAN, COL1A1 및 COL1A2)의 리얼타임 RT-PCR 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 7은, FGFR3 중화 항체를 첨가하고 TD-iPSC(TD714-3)를 연골 세포 유도한 결과를 나타낸다. (a) TD-iPSC의 연골 세포 분화 유도 중에 FGFR3 중화 항체를 배지에 가하여 배양한 42일째에서의 파티클의 조직상을 나타낸다. FGFR3 중화 항체 대신 IgG를 가하여, 음성 대조군으로서 사용하였다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (b) FGFR3 중화 항체(Anti- FGFR3) 및 음성 대조군(IgG)을 첨가한 TD-iPSC로부터 유도한 파티클 중 임의의 3개에 대하여, 실질적으로 사프라닌 O로 염색된 파티클 수를 계수한 결과를 나타낸다. (c) 각 iPSC(Anti-FGFR3, IgG를 첨가한 TD-iPSC 및 WT-iPSC(WT))의 분화 유도 28일째에서의 연골 세포, 미분화 iPSC 및 연골 세포(Chondondrocyte, 402RD-R10f)에서의 마커 유전자(SOX9, COL2, AGGRECAN, COL1A1 및 COL1A2)의 리얼타임 RT-PCR 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 8은, 피험 물질의 존재 하에서 TD-iPSC(TD714-3)를 연골 세포 유도한 결과를 나타낸다. (a) TD-iPSC의 연골 세포 분화 유도 공정에 있어서, 피험 물질을 배지에 가하여 배양한 42일째에서의 파티클의 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (b) 각 피험 물질을 첨가한 TD-iPSC로부터 유도한 파티클 중 임의의 10개에 대하여, 실질적으로 사프라닌 O로 염색된 파티클 수를 계수한 결과를 나타낸다. (c) 각 iPSC(FGF inhibitor(FGFR inh), IGF1R inhibitor(IGFRinh), CNP, NF449 및 기질(Vehicle)을 첨가한 TD-iPSC 및 WT-iPSC(WT))의 분화 유도 28일째에서의 연골 세포, 미분화 iPSC 및 연골 세포(402RD-R10f)(Chondondrocyte)에서의 마커 유전자(SOX9, COL2, AGGRECAN, COL1A1 및 COL1A2)의 정량 PCR에 의한 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 9는, 로바스타틴의 존재 하에서 TD-iPSC(TD714-3)를 연골 세포 유도한 결과를 나타낸다. (a) TD-iPSC의 연골 세포 분화 유도 공정에 있어서, 로바스타틴을 배지에 가하여 배양한 42일째에서의 파티클의 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (b) 로바스타틴 또는 기질을 첨가한 TD-iPSC로부터 유도한 파티클 중 임의의 10개에 대하여, 실질적으로 사프라닌 O로 염색된 파티클 수를 계수한 결과를 나타낸다. (c) 각 iPSC(로바스타틴(Lova) 및 기질(Vehicle)을 첨가한 TD-iPSC 및 WT-iPSC(WT))의 분화 유도 28일째에서의 연골 세포, 미분화 iPSC 및 연골 세포(402RD-R10f)(Chondondrocyte)에서의 마커 유전자(SOX9, COL2, AGGRECAN, COL1A1 및 COL1A2)의 정량 PCR에 의한 발현 해석의 결과를 나타낸다.
도 10은, 스타틴의 존재 하에서 TD-iPSC를 연골 세포 유도한 결과를 나타낸다. (a) 로바스타틴의 존재 하 또는 비존재 하에서 분화 유도한 28일째에 BrdU 처리한 후, 항BrdU 항체에서의 면역 염색상을 나타낸다. 스케일 바는, 50㎛이다. (b) BrdU 양성 세포수를 계측한 결과를 나타낸다. (c) 각 스타틴(메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 및 플루바스타틴) 및 기질(Vehicle)을 첨가하여 TD-iPS를 연골 분화 유도한 42일째의 파티클의 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. 스케일 바는, 50㎛이다. (d) 파티클의 모든 영역에 대한 사프라닌 O 양성 영역을 산출한 결과를 나타낸다. (e) WT-iPSC, TD-iPSC 및 로바스타틴 처리한 TD-iPSC의 분화 유도 28일째 및 293FT 세포에서의 FGFR3 항체 및 인산화 MAPK 항체를 사용한 면역 블로팅의 결과를 나타낸다. (f) 로바스타틴 첨가 또는 비첨가에서의 TD-iPSC의 연골 분화 유도 28일째의 FGFR3의 발현을 정량 PCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은, 로바스타틴 또는 CNP의 존재 하에서 ACH-iPSC를 연골 세포 유도한 결과를 나타낸다. (a) ACH-iPSC의 연골 세포 분화 유도 중에, 기질(Vehicle), 로바스타틴 또는 CNP를 배지에 가하여 배양한 42일째에서의 파티클의 조직상을 나타낸다. 스케일 바는, 50 ㎛이다. (b) 로바스타틴, CNP 또는 기질(Vehicle)을 첨가한 TD-iPSC로부터 유도한 파티클 중 임의의 3개에 대하여, 실질적으로 사프라닌 O로 염색된 파티클 수를 계수한 결과를 나타낸다.
도 12는, ACH 모델 마우스(FGFR3Ach)에 로수바스타틴을 투여한 경우의 뼈 성장의 해석 결과를 나타낸다. (a) 두부(頭部)의 수평 방향, 몸체의 전후 방향 및 후지(後肢)의 X선 화상을 나타낸다. 스케일 바는 2㎜이다. (b) 두개골의 전후 방향에서의 길이(Cranial A-P), 척골(尺骨)(Ulna)의 길이, 대퇴골(Femur)의 길이 및 경골(Tibia)의 길이를 측정한 결과를 나타낸다. 각각의 값을 t-검정으로 비교하였다.
도 13은, ACH 모델 마우스(FGFR3Ach)에 로수바스타틴을 투여한 경우의 몸체의 크기의 해석 결과를 나타낸다. 각 군에서의 최대 중량(Highest) 및 최소 중량(Lowest)의 X선 화상을 나타내고, 그 체중을 도면의 아래에 기재한다. 스케일 바는, 10 ㎜이다.
도 14는, ACH 모델 마우스에 로바스타틴을 투여한 경우의 뼈 성장의 해석 결과를 나타낸다. FGFR3Ach 마우스에 대하여 출생 후 3일부터 28일까지 로바스타틴을 복강내 투여한 29일째의 결과를 나타낸다. (a) 마우스 전신의 외관 및 X선 화상을 나타낸다. (b) 후지 골격의 X선 화상을 나타낸다. (c) 마우스 두부의 외관 및 X선 화상을 나타내며, 측면 상을 나타내고 있다. (d) 마우스 두부의 외관 및 X선 화상을 나타내면, 전후 상을 나타내고 있다.
15는, 로바스타틴으로 처리된 FGFR3Ach 마우스에서의 뼈의 각각의 부위의 길이의 측정 결과를 나타낸다.
도 16은, 로바스타틴을 첨가하여 연골 세포를 배양한 결과를 나타낸다. (a) 중족골의 원시 연골을 기관 배양한 7일째의 상을 나타낸다. (b) 기관 배양 1일째 및 7일째의 원시 연골의 길이를 측정한 결과를 나타낸다. (c) 중족골의 원시 연골을 기관 배양한 7일째에 BrdU로 처리한 후의 BrdU 항체에서의 염색상 및 사프라닌 O에서의 염색상을 나타낸다. (d) BrdU 양성 세포의 함유율을 해석한 결과를 나타낸다. (e) 펠릿 배양 14일째에서의 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. (f) 펠릿 배양 14일째(Sox9, Col2a1 및 Acan) 및 28일째(Runx2 및 Col10a1)에서의 정량 PCR의 측정 결과를 나타낸다. (g) 야생형 및 FGFR3Ach 마우스의 초대 연골 세포를 로바스타틴의 존재 하에서 MG132 또는 Bafilomycun A1(Baf A1)을 첨가하여 배양한 후의 FGFR3 항체를 사용한 면역 블로팅의 결과를 나타낸다.
본 명세서에 있어서, 「FGFR3병」은, FGFR3 중에 돌연변이를 가지는 것에 의해 뼈 형성 이상이 발생하는 모든 뼈 형성 질환을 의미한다. FGFR3병은, 바람직하게는, 뼈 계통 질환의 국제 분류(Warman et al., Am J Med Genet 155 A(5): 943-68 (2011))에 기재된 FGFR3병군에 속하는 일련의 질환을 의미하고, 예를 들면, 치사성 골이형성증(TD), 연골 무형성증(ACH), 연골 저형성증, Camptodactyly, tall stature, and hearing loss syndrome(CATSHL), Crouzon-like craniosynostosis with acanthosis nigricans(Crouzonodermoskeletal), 두개골 조기 유합증(癒合症) 등이 있다. FGFR3 중에 생기는 돌연변이는, 기능 획득형 또는 기능 결손형 중 어느 변이일 수 있지만, 바람직하게는, 기능 획득형 돌연변이일 수 있다.
iPS 세포의 제조 방법
본 발명에 있어서, iPS 세포는, 어느 특정의 핵초기화 물질을, DNA 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입하는 것에 의해, 또는 약제에 의해 상기 핵초기화 물질의 내재성의 mRNA 및 단백질의 발현을 상승시키는 것에 의해 제작할 수 있는, ES 세포와 거의 동등한 특성, 예를 들면, 분화 다능성과 자가 복제에 의한 증식능을 가지는 체세포 유래의 인공 줄기세포이다(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676, K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872, J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920, M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106, 국제 공개 WO 2007/069666 및 국제 공개 WO 2010/068955). 핵초기화 물질은, ES 세포에 특이적으로 발현하고 있는 유전자 또는 ES 세포의 미분화 유지에 중요한 역할을 행하는 유전자 또는 그 유전자 산물이면 되며, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Esrrb, Esrrg, Glis1 등이 예시된다. 이들 초기화 물질은, iPS 세포 수립 시에는, 조합되어 사용될 수도 있다. 예를 들면, 상기 초기화 물질을, 적어도 1개, 2개 또는 3개 포함하는 조합이며, 바람직하게는 4개 또는 5개를 포함하는 조합이다.
상기한 각 핵초기화 물질의 마우스 및 인간 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 상기 cDNA에 코딩되는 단백질의 아미노산 서열 정보는, WO 2007/069666에 기재된 NCBI accession numbers를 참조하는 것에 의해, 또한 L-Myc, Lin28, Lin28b, Esrrb, Esrrg 및 Glis1의 마우스 및 인간의 cDNA 서열 및 아미노산 서열 정보에 대해서는, 각각 하기 NCBI accession numbers를 참조함으로써 취득할 수 있다. 당업자는, 상기 cDNA 서열 또는 아미노산 서열 정보에 기초하여, 통상적인 방법에 의해 원하는 핵초기화 물질을 조제할 수 있다.
유전자명 마우스 인간
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
Glis1 NM_147221 NM_147193
이들 핵초기화 물질은, 단백질의 형태로, 예를 들면, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합, 현미경하 주사법 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입할 수도 있고, 또는 DNA의 형태로, 예를 들면, 바이러스, 플라스미드, 인공 염색체 등의 벡터, 리포펙션, 리포솜, 현미경하 주사법 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입할 수 있다. 바이러스 벡터로서는, RNA 종양 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터(이상, Cell, 126, pp.663-676, 2006: Cell, 131, pp.861-872, 2007: Science, 318, pp.1917-1920, 2007), 아데노바이러스 벡터(Science, 322, 945-949, 2008), 아데노 수반 바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터(Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009) 등이 예시된다. 또한, 인공 염색체 벡터로서는, 예를 들면, 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC, PAC) 등이 포함된다. 플라스미드로서는, 포유동물 세포용 플라스미드를 사용할 수 있다(Science, 322: 949-953, 2008). 벡터에는, 핵초기화 물질이 발현 가능하도록, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 터미네이터, 폴리아데닐화 사이트 등의 제어 서열을 포함할 수 있다. 사용되는 프로모터로서는, 예를 들면, EF1α 프로모터, CAG 프로모터, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(사이토메갈로 바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV(몰로니마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘키나제) 프로모터 등이 사용된다. 그 중에서도, EF1α 프로모터, CAG 프로모터, MoMuLV LTR, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등을 예로 들 수 있다. 또한, 필요에 따라, 약제 내성 유전자(예를 들면, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등), 티미딘키나제 유전자, 디프테리아톡신 유전자 등의 선택 마커 서열, 녹색 형광 단백질(GFP), β글루크로니다제(GUS), FLAG 등의 리포터 유전자 서열 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터에는, 체세포로의 도입 후, 핵초기화 물질을 코딩하는 유전자 또는 프로모터와 거기에 결합하는 핵초기화 물질을 코딩하는 유전자를 함께 절제(切除)하기 위하여, 이들의 전후에 LoxP 서열을 가질 수도 있다. 다른 바람직한 일실시형태에 있어서는, 가동성 유전 인자를 사용하여 염색체에 도입 유전자를 도입한 후에, 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 세포에 전이 효소를 작용시켜, 도입 유전자를 완전히 염색체로부터 제거하는 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 가동성 유전 인자로서는, 예를 들면, 인시목(Lepidoptera) 곤충 유래의 가동성 유전 인자인 piggyBac 등이 있다(Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775, Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770, WO 2010/012077). 또한, 벡터에는, 염색체로의 도입이 없어도 복제되어, 에피소말로 존재하도록, 림프 친화 헤르페스 바이러스(lymphotropic herpes virus), BK 바이러스 및 소유두종(Bovine papillomavirus)의 기점(起点)과 그 복제에 관련된 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들면, EBNA-1 및 oriP 혹은 Large T 및 SV40ori 서열을 포함하는 것을 들 수 있다(WO 2009/115295, WO 2009/157201 및 WO 2009/149233). 또한, 복수의 핵초기화 물질을 동시에 도입하므로, 다시스트론성(polycistronic)으로 발현시키는 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 다시스트론성으로 발현시키기 위해서는, 유전자를 코딩하는 서열 사이에는, IRES 또는 구제역 바이러스(FMDV) 2A 코딩 영역에 의해 결합되어 있어도 된다(Science, 322: 949-953, 2008 및 WO 2009/092042 2009/152529).
핵초기화에 있어서, iPS 세포의 유도 효율을 높이기 위하여, 상기한 인자 외에, 예를 들면, 히스톤디아세틸라제(HDAC) 저해제[예를 들면, 발프로산(VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)), 트리코스타틴 A, 부티르산 나트륨, MC 1293, M344 등의 저분자 저해제, HDAC에 대한 siRNA 및 shRNA(예를 들면, HDAC1 siRNA Smartpool(등록상표)(Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1(OriGene) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제(예를 들면, 5'-아자시티딘(5'-azacytidine))(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)), G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제 저해제[예를 들면, BIX-01294(Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)) 등의 저분자 저해제, G9a에 대한 siRNA 및 shRNA(예를 들면, G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], L-channel calcium agonist(예를 들면, Bayk8644)(Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), p53 저해제(예를 들면, p53에 대한 siRNA 및 shRNA)(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), Wnt Signaling activator(예를 들면, soluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), LIF 또는 bFGF 등의 증식 인자, ALK5 저해제(예를 들면, SB431542)(Nat. Methods, 6: 805-8 (2009)), mitogen-activated protein kinase signalling 저해제, glycogen synthase kinase-3 저해제(PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)), miR-291-3p, miR-294, miR-295 등의 miRNA(R. L. Judson et al., Nat. Biotech. , 27: 459-461 (2009)), 등을 사용할 수 있다.
약제에 의해 핵초기화 물질의 내재성(內在性)의 단백질의 발현을 상승시키는 방법을 사용할 수도 있으며, 이와 같은 약제로서는, 6-bromoindirubin-3'-oxime, indirubin-5-nitro-3'-oxime, valproic acid, 2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-lH-pyrazol-4-yl)-1, 5-naphthyridine, 1-(4-methylphenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone HBr(pifithrin-alpha), prostaglandin J2, prostaglandin E2 등이 예시된다(WO 2010/068955).
iPS 세포 유도를 위한 배양 배지로서는, 예를 들면, (1) 10∼15 % FBS를 함유하는 DMEM, DMEM/F12 또는 DME 배지(이들 배지에는 또한, LIF, penicillin/streptomycin, puromycin, L-글루타민, 비필수 아미노산류, β-메르캅토에탄올 등을 적절하게 포함할 수 있다.), (2) bFGF 또는 SCF를 함유하는 ES 세포 배양용 배지, 예를 들면, 마우스 ES 세포 배양용 배지(예를 들면, TX-WES 배지, 트롬보 X사) 또는 영장류 ES 세포 배양용 배지(예를 들면, 영장류(인간&원숭이) ES 세포용 배지(리프로셀, 쿄토, 일본), mTeSR-1) 등이 포함된다.
배양법의 예로서는, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 존재 하에서, 10% FBS 함유 DMEM 또는 DMEM/F12 배지 중에서 체세포와 핵초기화 물질(DNA 또는 단백질)을 접촉시키고 약 4∼7 일간 배양하고, 그 후, 세포를 피더 세포(예를 들면, 마이토마이신 C 처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에 다시 파종하고, 체세포와 핵초기화 물질의 접촉으로부터 약 10일 후부터 bFGF 함유 영장류 ES 세포 배양용 배지로 배양하고, 상기 접촉으로부터 약 30∼약 45일 또는 그 이상이 경과한 후에 ES 세포 유사 콜로니를 생기게 할 수 있다. 또한, iPS 세포의 유도 효율을 높이기 위하여, 5∼10 %로 낮은 산소 농도의 조건 하에서 배양할 수도 있다. 이 때 피더 세포 대신 세포외 매트릭스를 사용할 수도 있고, 상기 세포외 매트릭스로서, 콜라겐, 젤라틴, 라미닌(예를 들면, 라미닌 111, 411 또는 511, 또는 그 단편), 헤파란 황산 프로테오글리칸, 또는 엔탁틴, 및 이들의 단편, 또는 이들의 조합이 예시된다.
또는, 그 대체 배양법으로서, 피더 세포(예를 들면, 마이토마이신 C 처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에서 10% FBS 함유 DMEM 배지(여기에는 또한, LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산류, β-메르캅토 에탄올 등을 적절하게 포함할 수 있다.)로 배양하여, 약 25∼약 30일 또는 그 이상 경과한 후에 ES 유사 콜로니를 생기게 할 수 있다.
상기 배양하는 동안에는, 배양 개시 2일째 이후부터 매일 1회 신선한 배지와 배지 교환을 행한다. 또한, 핵초기화에 사용하는 체세포의 세포수는, 한정되지 않지만, 배양 디쉬 100 cm2당 약 5×103∼약 5×106 세포의 범위이다.
마커 유전자로서 약제 내성 유전자를 포함하는 유전자를 사용한 경우에는, 대응하는 약제를 포함하는 배지(선택 배지)로 배양을 행함으로써 마커 유전자 발현 세포를 선택할 수 있다. 또한 마커 유전자가 형광 단백질 유전자인 경우에는 형광 현미경으로 관찰함으로써, 발광 효소 유전자인 경우에는 발광 기질을 가함으로써, 또한 발색 효소 유전자인 경우에는 발색 기질을 가함으로써, 마커 유전자 발현 세포를 검출할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용하는 「체세포」는, 포유동물(예를 들면, 인간, 마우스, 원숭이, 돼지, 래트 등) 유래의 생식 세포 이외의 어떠한 세포라도 되고, 예를 들면, 각질화하는 상피 세포(예, 각질화 상피 세포), 점막 상피 세포(예, 혀 표층의 상피 세포), 외분비선 상피 세포(예, 유선 세포), 호르몬 분비 세포(예, 부신수질 세포), 대사·저장용 세포(예, 간세포), 경계면을 구성하는 내강 상피 세포(예, I형 폐포 세포), 내쇄관의 내강 상피 세포(예, 혈관 내피 세포), 운반능을 가지는 섬모가 있는 세포(예, 기도 상피 세포), 세포외 매트릭스 분비용 세포(예, 섬유아 세포), 수축성 세포(예, 평활근 세포), 혈액과 면역계의 세포(예, T임파구, 비T 세포), 감각에 관한 세포(예, 간상 세포(rod cell)), 자율 신경계 뉴런(예, 콜린 작동성 뉴런), 감각 기관과 말초 뉴런의 지지 세포(예, 수반(隨伴) 세포), 중추신경계의 신경 세포와 글리아 세포(예, 아스트로 글리아 세포), 색소 세포(예, 망막 색소 상피 세포), 이들의 선구 세포(조직 선구 세포) 등을 들 수 있다. 세포의 분화의 정도나 세포를 채취하는 동물의 나이 등에 특별히 제한은 없고, 미분화 선구 세포(체성 줄기 세포도 포함함)라도, 최종 분화한 성숙 세포라도, 마찬가지로 본 발명에서의 체세포의 기원으로서 사용할 수 있다. 여기서 미분화 선구 세포로서는, 예를 들면, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 치수 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포(체성 줄기 세포)를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, FGFR3병 환자 유래의 iPS 세포를 제조하기 위해서는, 혈액 세포 또는 섬유아 세포, 특히 인간 피부 섬유아 세포(HDF)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 체세포를 채취하는 유래가 되는 포유동물 개체는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간이다.
본 발명에 있어서, FGFR3병을 앓는 대상 유래의 체세포로부터 제작된 iPS 세포는, FGFR3 유전자 중에 FGFR3병 환자에 특유한 돌연변이를 가질 수 있다. FGFR3병 환자에 특유한 돌연변이는, TD의 경우에는, Arg246Cys, Arg248Cys, Ser249Cys, Gly370Cys, Ser371Cys, Thr373Cys, Lys650Glu, X807Arg, X807Cys 등을 예로 들 수 있고, ACH의 경우에는, Gly380Arg, Gly375Cys 등을 예로 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
연골 세포로의 분화 유도법
iPS 세포로부터 연골 세포를 분화 유도하는 방법으로서는, 당 분야에 있어서 사용되는 임의의 방법을 채용할 수 있으며, 본원 출원시에 있어서 당업자에게 알려져 있는 방법뿐만 아니라, 본원 출원 후에 있어서 개발된 분화 유도 방법을 채용하는 것도 가능하다. 연골 세포를 분화 유도하는 방법으로서, 예를 들면, Koyama, N. et al. Stem cells and development 22, 102-113 (2013), Hwang, N. S., et al. PLoS ONE 3, e2498 (2008), Oldershaw, R. A. et al. Nat. Biotechnol. 28, 1187-1194 (2010), Bai, H. Y., et al. Journal of biomedical materials research. Part A 94, 539-546 (2010), Yamashita, A. et al. Scientific Reports 3 (2013) 등에 기재된 방법이 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서 「연골 세포」는, 콜라겐 등 연골을 구성하는 세포외 매트릭스를 생산하는 세포, 또는 이와 같은 세포가 되는 선구 세포를 의미한다. 또한, 이와 같은 연골 세포는, 연골 세포 마커를 발현하는 세포라도 되며, 연골 세포 마커로서 II형 콜라겐(COL2A1), SOX9 또는 AGGRECAN이 예시된다. 본 발명에 있어서, COL2A1에는, NCBI의 액세션 번호(Accession Number)로서, 인간의 경우, NM_001844 또는 NM_033150, 마우스의 경우, NM_001113515 또는 NM_031163에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다. 본 발명에 있어서, SOX9에는, NCBI의 액세션 번호로서, 인간의 경우, NM_000346, 마우스의 경우, NM_011448에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다. 본 발명에 있어서, AGGRECAN에는, NCBI의 액세션 번호로서, 인간의 경우, NM_001135 또는 NM_013227, 마우스의 경우, NM_007424에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명에서의 연골 세포외 매트릭스는, 사프라닌 O 및 그 유사체에 의해 염색될 수 있는 세포외 매트릭스이다. 본 발명에 있어서 바람직하게는, 연골 세포는, 상기 연골 세포로부터 발생된 세포외 매트릭스로 이루어지는 배양물(파티클) 상태(연골 유사 조직)라도 된다.
연골 세포로의 분화 유도에는, 예를 들면, 하기의 프로토콜에 따라 행해지고(Oldershaw, R. A. et al. Nat. Biotechnol. 28, 1187-1194 (2010)), 이 때, 임의의 분화 유도 인자가 사용된다. 본 발명에 있어서 사용되는 분화 유도 인자는, 예를 들면, Wnt3A, 액티빈(Activin), FGF2, BMP4, 폴리스타틴(Follistatin), GDF5 및 NT4 등이 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 인자는, 연골 세포로의 분화 배양 공정의 임의의 단계에 있어서, 임의의 조합으로 첨가할 수 있으며, 바람직하게는, (1) iPS 세포를 Wnt3A, 액티빈 및 FGF2를 첨가한 기초 배지로 배양하는 공정, (2) (1)에서 얻어진 세포를 FGF2, BMP4, 폴리스타틴 및 NT4를 첨가한 기초 배지로 배양하는 공정, 및 (3) (2)에서 얻어진 세포를 FGF2, BMP4, GDF5 및 NT4를 첨가한 기초 배지로 배양하는 공정을 포함하는 방법이 예시된다. 공정을 통하여, 세포는, 배양 용기에 접착한 상태로 배양할 수도 있고, 배양액에 부유한 상태로 배양할 수도 있다. 상기 접착 배양에 있어서는, 예를 들면, 마트리겔(BD), I형 콜라겐, IV형 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 또는 엔탁틴, 및 이들의 조합을 사용하여 코팅 처리된 배양 용기를 사용할 수 있다.
기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 이들의 혼합 배지 등이 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되며, 또는 무혈청이라도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 콜라겐 전구체(前驅體), 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등 중에서 1개 이상의 혈청 대체물을 포함할 수도 있고, 지방질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등 중에서 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM/F12이다.
기초 배지에서의 Wnt의 농도는, 예를 들면, 1∼200 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 10∼50 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 160 ng/ml, 170 ng/ml, 180 ng/ml, 190 ng/ml, 200 ng/ml이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 25 ng/ml이다.
기초 배지에서의 액티빈의 농도는, 예를 들면 1∼200 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 10∼50 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 160 ng/ml, 170 ng/ml, 180 ng/ml, 190 ng/ml, 200 ng/ml이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 25 ng/ml이다. 배지에서의 액티빈의 농도는, 배양 기간 중에 변경할 수 있으며, 예를 들면, 50 ng/ml로 1일간 배양한 후, 25 ng/ml로 변경하여 1일간 배양하고, 또한 10 ng/ml로 변경하여 1일 배양하는 경우가 있다.
기초 배지에서의 FGF2의 농도는, 예를 들면, 1∼100 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 20∼40 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/m이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 20 ng/ml이다.
기초 배지에서의 BMP4의 농도는, 예를 들면, 1∼100 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 20∼40 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 40 ng/ml이다. 배지에서의 BMP4의 농도는, 배양 기간 중에 변경할 수 있고, 예를 들면, 40 ng/ml로 6일간 배양한 후, 25 ng/ml로 변경하여 2일간 배양하는 경우가 있다.
기초 배지에서의 폴리스타틴의 농도는, 예를 들면, 1∼200 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 50∼150 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 160 ng/ml, 170 ng/ml, 180 ng/ml, 190 ng/ml, 200 ng/ml이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 100 ng/ml이다.
기초 배지에서의 GDF5의 농도는, 예를 들면, 1∼100 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 20∼40 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/m이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 40 ng/ml이다. 배지에서의 GDF5의 농도는, 배양 기간 중에 변경할 수 있고, 예를 들면, 20 ng/ml로 2일간 배양한 후, 40 ng/ml로 변경하여 3일간 배양하는 경우가 있다.
기초 배지에서의 NT4의 농도는, 예를 들면, 1∼10 ng/ml의 범위 내, 바람직하게는 1∼5 ng/ml의 범위 내에 있고, 예를 들면, 1 ng/ml, 1.5 ng/ml, 2 ng/ml, 2.5 ng/ml, 3 ng/ml, 4 ng/ml, 5 ng/ml, 6 ng/ml, 7 ng/ml, 8 ng/ml, 9 ng/ml, 10 ng/ml이지만 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 2 ng/ml이다.
본 발명에 있어서는, 바람직하게는, 수정한 하기의 공정을 포함하는 iPS 세포로부터 연골 세포를 유도하는 방법인: (i) iPS 세포를 접착 배양에 의해 중배엽 세포를 유도하는 공정, (ii) 상기 공정(i)에서 얻어진 세포를 bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정 및 (iii) 상기 공정(ii)에서 얻어진 세포를 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해 행해진다.
(i) iPS 세포를 접착 배양에 의해 중배엽 세포를 유도하는 공정
본 발명에 있어서, 중배엽 세포란, 동물의 발생기의 원장배기에 있어서, 내배엽과 외배엽의 사이에서 발생하는 세포를 의미하고, 바람직하게는, BRACHYURY가 양성인 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서, BRACHYURY에는, NCBI의 액세션 번호로서, 인간의 경우, NM_001270484 또는 NM_003181, 마우스의 경우, NM_009309에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다.
본 발명에 있어서, iPS 세포로부터 중배엽 세포를 유도하는 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제를 함유하는 배양액으로 배양하는 방법이 예시된다.
본 공정(i)에서는, 바람직하게는, iPS 세포를 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에서 접착 배양하여, 적절한 크기(1×105∼2×105 세포를 함유하는 세포괴(細胞塊))가 된 시점에서, 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제를 함유하는 배양액으로 교환하여 배양하는 방법이다.
본 발명에 있어서, 접착 배양은, 세포외 기질에 의해 코팅 처리된 배양 용기를 사용하여 배양함으로써 행할 수 있다. 코팅 처리는, 세포외 기질을 함유하는 용액을 배양 용기에 넣은 후, 상기 용액을 적절하게 제거하는 것에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포외 기질이란, 세포의 밖에 존재하는 초과 분자 구조체이며, 천연 유래라도 되고, 인공물(재조합체)이라도 된다. 예를 들면, 콜라겐, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 히알론산, 테나신, 엔탁틴, 에라스틴, 피브릴린, 라미닌과 같은 물질 또는 이들의 단편이 있다. 이들 세포외 기질은, 조합하여 사용할 수도 있고, 예를 들면, BD 마트리겔(Matrigel)(TM) 등의 세포로부터의 조제물이라도 된다. 인공물로서는, 라미닌의 단편이 예시된다. 본 발명에 있어서, 라미닌이란, α쇄, β쇄, γ쇄를 각각 1개씩 가지는 헤테로 3량체 구조를 가지는 단백질이며, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, α쇄는, α1, α2, α3, α4 또는 α5이며, β쇄는, β1, β2 또는 β3이며, 및 γ쇄는, γ1, γ2 또는 γ3가 예시된다. 본 발명에 있어서, 라미닌의 단편이란, 인테그린 결합 활성을 가지고 있는 라미닌의 단편이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 엘라스타제에 의해 소화하여 얻어지는 단편인 E8 플래그먼트가 예시된다.
본 공정(i)에 있어서 사용되는 배양액은, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 이들의 혼합 배지 등이 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이라도된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 아셀렌산 나트륨, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올글리세롤 등 중에서 1개 이상의 혈청 대체물을 포함할 수도 있고, 지방질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등 중에서 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM/F12이다.
본 공정(i)에 있어서, 액티빈 A에는, 인간 및 다른 동물 유래의 액티빈 A, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, R&D systems사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 액티빈 A의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(i)에 있어서, GSK-3β 저해제는, GSK-3β의 기능, 예를 들면, 키나제 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 저해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, Wnt3a, 인디루빈 유도체인 BIO(별명, GSK-3β 저해제 IX; 6-브로모인디루빈 3'-옥심), 말레이미드 유도체인 SB216763(3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), 페닐 α브로모메틸케톤 화합물인 GSK-3β 저해제 VII(4-디브로모아세토페논), 세포막 투과형의 인산화 펩티드인 L803-mts(별명, GSK-3β 펩티드 저해제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 높은 선택성을 가지는 CHIR99021(Nature (2008) 453: 519-523) 등을 들 수 있다. 이들 화합물은, 예를 들면, Stemgent, Calbiochem나 Biomol사 등으로부터 입수 가능하며, 또한 스스로 제작해도 된다. 본 공정에서 사용하는 바람직한 GSK-3β 저해제로서는, Wnt3a를 예로 들 수 있다. Wnt3a에는, 인간 및 다른 동물 유래의 Wnt3a, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되며, 예를 들면, R&D systems사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GSK-3β 저해제의 농도는, 사용하는 GSK-3β 저해제에 따라 당업자가 적절하게 선택 가능하지만, 예를 들면, GSK-3β 저해제로서 Wnt3a를 사용하는 경우, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(i)에 있어서, 배양 온도는 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5 %, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들면, 5일 이하의 배양이며, 바람직하게는 3일이다.
(ii) 상기 공정(i)에서 얻어진 세포를 bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정
본 공정(ii)에서는, 상기 공정(i)에서 얻어진 세포 배양물의 배양액을 제거하고, bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 함유하는 배양액을 첨가하여 행할 수 있다. 따라서, 상기 공정(i)에 있어서 세포 배양물은, 배양 접시에 접착하고 있으므로, 본 공정(ii)은 접착 배양에 의해 행할 수 있다.
본 공정(ii)에 있어서 사용되는 배양액은, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 이들의 혼합 배지 등이 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되며, 또는 무혈청이라도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올글리세롤 등 중에서 1개 이상의 혈청 대체물을 포함할 수도 있고, 지방질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등 중에서 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 공정(ii)에 있어서, bFGF에는, 인간 및 다른 동물 유래의 bFGF, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, WAKO사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 bFGF의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(ii)에 있어서, 아스코르브산은, 예를 들면, Nakarai사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 아스코르브산의 농도는, 5 μg/ml500 μg/ml, 바람직하게는, 10 μg/ml∼100 μg/ml, 더욱 바람직하게는, 50 μg/ml이다.
본 공정(ii)에 있어서, BMP2에는, 인간 및 다른 동물 유래의 BMP2, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, Osteopharma사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 BMP2의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼ 50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(ii)에 있어서, TGFβ에는, 인간 및 다른 동물 유래의 TGFβ, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 TGFβ의 농도는, 0.1 ng/ml∼ 1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(ii)에 있어서, GDF5에는, 인간 및 다른 동물 유래의 GDF5, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GDF5의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(ii)에 있어서, 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5 %, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들면, 15일 이하의 배양이며, 바람직하게는 11일이다.
(iii) 상기 공정(ii)에서 얻어진 세포를 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정
본 공정(iii)에서는, 상기 공정(ii)에서 얻어진 세포 배양물을 배양 용기로부터 박리시켜, 부유 배양함으로써 행할 수 있다. 본 공정(iii)에 있어서, 세포 배양물을 박리하는 방법은, 역학적 분리 방법(피펫팅 등)에 의해 행하는 것이 바람직하고, 프로테아제 활성 및/또는 콜라게나아제 활성을 가지는 분리 용액(예를 들면, 트립신과 콜라게나아제의 함유 용액인 Accutase(TM) 및 Accumax(TM)(Innovative Cell Technologies, Inc)가 있다)를 사용하지 않는 방법이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 부유 배양이란, 세포를 배양 접시에 비접착의 상태에서 배양하는 것을 일컬으며, 특별히 한정은 되지 않지만, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예를 들면, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 배양 용기, 또는 인공적으로 접착을 억제하는 처리(예를 들면, 폴리하이드록시에틸메타크릴산(poly-HEMA)에 의한 코팅 처리)가 된 배양 용기를 사용하여 행하는 것이 바람직하다.
본 공정(iii)에 있어서 사용되는 배양액은, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 이들의 혼합 배지 등이 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되며, 또는 무혈청이라도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올글리세롤 등 중에서 1개 이상의 혈청 대체물을 포함할 수도 있고, 지방질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등 중에서 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산 나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 공정(iii)에 있어서, 아스코르브산은, 예를 들면, Nakarai사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 아스코르브산의 농도는, 5 μg/ml∼500 μg/ml, 바람직하게는, 10 μg/ml∼100 μg/ml, 더욱 바람직하게는, 50 μg/ml이다.
본 공정(iii)에 있어서, BMP2에는, 인간 및 다른 동물 유래의 BMP2, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, Osteopharma사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 BMP2의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(iii)에 있어서, TGFβ에는, 인간 및 다른 동물 유래의 TGFβ, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 TGFβ의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(iii)에 있어서, GDF5에는, 인간 및 다른 동물 유래의 GDF5, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등으로부터 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GDF5의 농도는, 0.1 ng/ml∼1000 ng/ml, 바람직하게는, 1 ng/ml∼100 ng/ml, 보다 바람직하게는, 5 ng/ml∼50 ng/ml, 더욱 바람직하게는, 10 ng/ml이다.
본 공정(iii)에 있어서, 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5 %, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들면, 10일 이상 30일 이하의 배양이며, 바람직하게는 14일 이상 28일 이하이다.
(iv) 상기 공정(iii)에서 얻어진 세포를 더욱 부유 배양하는 공정
상기 공정(iii)에 의하여, 연골 세포를 제조하는 것이 가능하지만, 보다 성숙한 연골 세포를 얻기 위하여, 상기 공정(iii)에서 얻어진 세포 배양물을 더욱 부유 배양할 수도 있다.
본 공정(iv)에 있어서 사용되는 배양액은, 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지이다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 이들의 혼합 배지 등가 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되며, 또는 무혈청이라도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토 에탄올, 3'-티올글리세롤 등 중에서 1개 이상의 혈청 대체물을 포함할 수도 있고, 지방질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등 중에서 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시형태에 있어서, 기초 배지는, 10% 혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 공정(iv)에 있어서, 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40 ℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5 %, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 특히 장기간에 걸쳐 배양하더라도 연골 세포의 제조에 문제가 생기지 않는 것을 고려하여, 예를 들면, 20일 이상의 배양 기간이 예시되며 바람직하게는 28일 이상이다.
전술한 공정(iii) 또는 공정(iv) 후에 연골 세포를 얻기 위해서는, 부유하고 있는 세포를 선택적으로 추출하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 연골 세포는, 배양액에 부유하고 있는 세포에 그 대부분이 존재하고 있는 것을 감안하여, 배양 용기에 접착하고 있는 세포를 선택적으로 제외하고 추출하는 것이 바람직하다.
FGFR3병의 치료약 및/또는 예방약의 스크리닝 방법
본 발명은, 전술한 바와 같이 얻어진 iPS 세포 유래와 피험 물질을 접촉시키고, 각각의 지표를 사용하여, FGFR3병의 치료약 및/또는 예방약의 피험 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 태양으로서, 하기의 공정을 포함하는 방법에 의해 FGFR3병의 치료약 및/또는 예방약을 스크리닝할 수 있다:
(a) FGFR3병을 앓는 대상 유래의 체세포로부터 제작된 인공다능성줄기(iPS) 세포를, 피험 물질과 접촉시키고 및 접촉시키지 않는 조건 하에서 연골 세포로 분화시키는 공정,
(b) 공정(a)에서 얻어진 배양물 중에서의 연골 세포외 매트릭스의 양, 연골 세포 마커 유전자 및 섬유아 세포 마커 유전자의 발현량으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 지표를 측정하는 공정, 및
(c) 피험 물질과 접촉시키는 조건 하에 있어서, 접촉시키지 않는 조건 하 보다 연골 세포외 매트릭스량 또는 연골 세포 마커 유전자가 증가한 경우, 또는 섬유아 세포 마커 유전자의 발현량이 감소한 경우, 상기 피험 물질을 FGFR3병의 치료약 또는 예방약으로서 선출하는 공정.
공정(a)은, 전술한 연골 세포로의 분화 유도 공정이며, 피험 물질은, 모든 공정에 있어서 세포와 접촉시켜도 되고, 바람직하게는, 상기 공정(2) 및/또는 상기 공정(3), 또는 상기 공정(ii) 및/또는 상기 공정(iii)에 있어서 접촉시켜도 되고, 더욱 바람직하게는, 상기 공정(ii) 및 상기 공정(iii)에 있어서 세포와 접촉시켜도 된다.
여기서 사용되는 FGFR3병을 앓는 대상 유래의 체세포로부터 제작된 iPS 세포는, FGFR3 유전자 중에 FGFR3병 환자에게 특유의 돌연변이를 가질 수 있다. FGFR3병 환자에게 특유의 돌연변이는, TD의 경우에는, Arg246Cys, Arg248Cys, Ser249Cys, Gly370Cys, Ser371Cys, Thr373Cys, Lys650Glu, X807Arg, X807Cys 등을 예로 들 수 있고, ACH의 경우에는, Gly380Arg, Gly375Cys 등을 예로 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서는, 임의의 피험 물질을 사용할 수 있고, 어떠한 공지 화합물 및 신규 화합물이라도 되고, 예를 들면, 세포 추출물, 세포 배양 상청액, 미생물 발효 산물, 해양 생물 유래의 추출물, 식물 추출물, 정제 단백질 또는 조(粗)단백질, 펩티드, 비펩티드 화합물, 합성 저분자 화합물, 천연 화합물 등이 있다. 본 발명에 있어서, 피험 물질은 또한, (1) 생물학적 라이브러리법, (2) 디콘볼루션(deconvolution)을 사용하는 합성 라이브러리법, (3) 「1 비즈 1 화합물(one-bead one-compound)」 라이브러리법, 및 (4) 어피니티 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리법을 포함하는 당기술 분야에서 공지의 콘비나트리알 라이브라리법에서의 많은 어프로치 중 어느 하나를 사용하여 얻을 수 있다. 어피니티 크로마토그래피 선별을 사용하는 생물학적 라이브러리법은 펩티드 라이브러리로 한정되지만, 그 외의 4개의 어프로치는 펩티드, 비펩티드 올리고머, 또는 화합물의 저분자 화합물 라이브러리에 적용할 수 있다(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67). 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는, 당기술 분야에 있어서 발견할 수 있다(DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13: Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6: Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5: Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51). 화합물 라이브러리는, 용액(Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21을 참조) 또는 비즈(Lam (1991) Nature 354: 82-4), 칩(Fodor (1993) Nature 364: 555-6), 세균(미국 특허 제5,223,409호), 포자(미국 특허 제5,571,698호, 미국 특허 제5,403,484호, 및 미국 특허 제5,223,409호), 플라스미드(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9) 또는 파지(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 미국 특허 출원 제2002103360호)로서 제작될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서의 대상 질환으로서는, 뼈형성 이상과 관련된 질환 질환, 특히, FGFR3병일 수 있다. FGFR3병은, 보다 중증인 순서로, 치사성 골이형성증(TD), 연골 무형성증(ACH), 연골 저형성증을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 스크리닝 방법에서의 대상 질환으로서, 바람직하게는, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)이다.
본 발명에서는, 연골 세포에서의 각 마커 유전자의 발현량을 측정하는 것에 의해 이룰 수 있다. 마커 유전자로서, 연골 세포 마커 유전자 및 섬유아 세포 마커 유전자가 예시되며, 연골 세포 마커 유전자는, 예를 들면, SOX9, AGGRECAN, COL2 등이 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 섬유아 세포 마커 유전자로서는, COL1A1, COL1A2 등을 예로 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 그 외에도 연골 세포에 특이적으로 발현하고 있는 유전자(단백질)를 표적으로 하는 항체 염색 등의 방법에 의해서도, 연골 세포량을 측정할 수 있다.
본 발명에서의 연골 세포외 매트릭스의 양의 측정은, 연골 유사 조직을 특이적으로 염색하는 물질을 사용하여 행할 수 있다. 연골 유사 조직을 특이적으로 염색하는 물질은, 예를 들면, 사프라닌 O나 그의 유사체를 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.
FGFR의 변이를 가지는 질환(예를 들면, FGFR3병)의 치료제 및/또는 예방제
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 물질은, 각종 연골 질환의 치료제 및/또는 예방제의 유효 성분으로서 유용하다. 본 발명의 처치 대상이 되는 연골 질환은, 통상보다 감소한 연골의 양을 어떠한 수단에 의해 증가시킴으로써 치료 및/또는 예방이 가능한 질환이면 어떤 것이라도 된다. 본 발명의 처치 대상이 되는 연골 질환으로서, 예를 들면, 변형성 관절증, 연골 손상, 연골 형성 이상증 등이 있지만 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 처치 대상이 되는 연골 질환은, 연골의 성장 과정에서의 연골 형성 부전에 의한 질환이 적응증으로서 가장 바람직하고, 이와 같은 병의 용태이면, 어떤 질환이라도 특별히 한정되지 않지만, 예로서 FGFR(FGFR1, FGFR2 및 FGFR3)에서의 변이를 가지는 병의 용태를 들 수 있다. 이와 같은 병의 용태로서, Warman et al., Am J Med Genet 155 A(5): 943-68 (2011)에 기재된 질환이 예시된다. 본 발명에 있어서 발견된 치료제를 사용하는 데 있어서, FGFR3병이 바람직한 적응증예이다.
본 발명에 있어서, 바람직한 FGFR의 변이를 가지는 질환(예를 들면, FGFR3병)의 치료 및/또는 예방제는, HMG-CoA 환원 효소 저해약을 포함하는 의약이다. 본 발명에서의 HMG-CoA 환원 효소 저해약은, 예를 들면, 메바스타틴(콤팍틴)(USP3983140 참조), 프라바스타틴(일본공개특허 제 소57-2240호 공보(USP4346227) 참조), 로바스타틴(일본공개특허 제 소57-163374호 공보(USP4231938) 참조), 신바스타틴(일본공개특허 제 소56-122375호 공보(USP4444784) 참조), 플루바스타틴(일본특표 소60-500015호 공보(USP4739073) 참조), 아토르바스타틴(일본공개특허 평3-58967호 공보(USP5273995) 참조), 로수바스타틴(일본공개특허 평5-178841호 공보(USP5260440) 참조), 피타바스타틴(일본공개특허 평1-279866호 공보(USP5854259 및 USP5856336) 참조)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에서의 HMG-CoA 환원 효소 저해약은, 바람직하게는, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제이다.
그리고, 본 발명의 HMG-CoA 환원 효소 저해약인, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로바스타틴, 신바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴 또는 피타바스타틴은, 그의 락톤 폐환체 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염(바람직하게는, 나트륨염 또는 칼슘염 등)을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 물질을 FGFR3병의 치료제 및/또는 예방제로서 사용하는 경우, 상투(常套) 수단에 따라 제제화할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위한 조성물로서는, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제(당의정, 필름 코팅정을 포함함), 환약, 과립제, 산제(散劑), 캡슐제(소프트 캡슐제를 포함함), 시럽제, 유제, 현탁제 등을 예로 들 수 있다. 한편, 비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들면, 주사제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 링겔 주사제 등의 제형을 포함할 수도 있다. 이들의 제재는, 부형제(賦形劑)(예를 들면, 유당, 백당, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당유도체; 옥수수 전분, 감자 녹물, α전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체; 결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 아라비아 검; 덱스트란; 플루란과 같은 유기계 부형제; 및 경질 무수 규산, 합성 규산 알루미늄, 규산 칼슘, 메타 규산 알루민산 마그네슘과 같은 규산염 유도체; 인산 수소 칼슘과 같은 인산염; 탄산 칼슘과 같은 탄산염; 황산 칼슘과 같은 유산염 등의 무기계 부형제이다), 활택제(예를 들면, 스테아르산, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘과 같은 스테아르산 금속염; 탈크; 콜로이드 실리카; 비즈 왁스, 경랍(鯨蠟)과 같은 왁스류; 붕산; 아디프산; 황산나트륨과 같은 황산염; 글리콜; 푸마르산; 벤조산 나트륨; DL 류신; 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 마그네슘과 같은 라우릴 황산염; 무수 규산, 규산 수화물과 같은 규산류; 및 상기 전분 유도체임), 결합제(예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골, 및 상기 부형제와 동일한 화합물임), 붕괴제(예를 들면, 저치환도 하이드록시프로필 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 내부 가교 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 카르복시메틸 스타치, 카르복시메틸 스타치 나트륨, 가교 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 수식(修飾)된 전분·셀룰로오스류임), 유화제(예를 들면, 벤토나이트, 비감(veegum)과 같은 콜로이드성 점토; 수산화 마그네슘, 수산화 알루미늄과 같은 금속 수산화물; 라우릴 황산 나트륨, 스테아르산 칼슘과 같은 음이온 계면활성제; 염화 벤잘코늄과 같은 양이온 계면활성제; 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르와 같은 비이온 계면활성제임), 안정제(메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시벤조산 에스테르류; 클로로부탄올, 벤질알코올, 페닐에틸알코올과 같은 알코올류; 염화 벤잘코늄; 페놀, 크레졸과 같은 페놀류; 티메로살; 데하이드로아세트산; 및 소르빈산임), 교미교취제(예를 들면, 통상 사용되는, 감미료, 산미료, 향료 등임), 희석제 등의 첨가제를 사용하여 주지의 방법으로 제조된다.
본 발명의 약제의 환자에 대한 투여량은, 치료할 병태의 종류, 증상 및 질환의 중증도, 환자 연령, 성별 또는 체중, 투여법 등에 따라 상이하므로, 일의적으로는 말할 수 없지만, 의사가 전술한 상황을 고려하여 판단함으로써, 적절하게 적당한 투여량을 결정할 수 있다.
경구 투여의 경우에는, 예를 들면, 1회당 하한 0.1 mg(바람직하게는, 0.5 mg), 상한 1000 mg(바람직하게는, 500 mg)을, 비경구적 투여의 경우에는, 1회당 하한 0.01 mg(바람직하게는, 0.05 mg), 상한 100 mg(바람직하게는, 50 mg)을, 성인에 대하여 1일당 1 내지 6회 투여할 수 있다. 증상에 따라, 증량 또는 감량할 수도 있다.
실시예
본 발명을 이하의 실시예에서 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
iPS 세포의 제작
이하의 모든 실험은, 치험(治驗) 심사 위원회, 동물 실험 위원회 및 시설내 생물 안전 위원회, 및 쿄토 대학의 승인을 얻어 행해졌다.
3명의 TD 환자 유래의 HDF(TD-714, TD10749 및 TD-315H)를, 코리엘 의학 연구소 및 사이타마현립 소아 의료 센터로부터 입수했다. 이들 HDF로부터 추출한 게놈 cDNA를 서열 해석한 바, 모든 TD 환자에 있어서 FGFR3 유전자의 헤테로 접합 돌연변이(Arg248Cys)가 확인되었다. 이어서, 각 환자 유래의 HDF로부터 이하에 기재한 방법으로 iPS 세포를 제작하고(이하, TD-iPSC라고 함), 각 환자로부터 1종의 iPS 세포주(TD-714-3, TD10749-2 및 TD315H-2)를 해석에 사용하였다. 또한, 2명의 상이한 신생아 유래의 대조군 HDFs(Strain #01491 및 #01439)를 KURABO로부터 구입하고, 동일한 방법으로 초기화하고, 대조군 iPS 세포를 제작하였다(KF4009-1 및 HDF-11). 이 외에도, K. Okita 및 S. Yamanaka(쿄토 대학 iPS 세포 연구소)로부터 입수한 건강한 개체 유래의 iPS 세포주(409B2)(Okita, K., et al. Nature methods 8, 409-412 (2011))도 대조군 iPS 세포로서 사용하였다(이하, KF4009-1, HDF-11 및 409B2를, WT-iPSC라고 함).
iPS 세포의 제조는, 하기의 방법에 의해 행하였다. 상세하게는, 입수한 각각의 인간 섬유아 세포(HDF)를, 10% FBS(Invitrogen), 50 U/ml 페니실린(penicillin) 및 50 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM(Sigma)으로 배양했다. 이어서, Neon transfection system(Invitrogen)에 의해, 에피솜 유사 플라스미드 벡터(Mixture Y4: OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 및 p53 shRNA)를 각 HDF에 전기천공법(electroporation)으로 도입하였다(Okita, K., et al. Nature methods 8, 409-412 (2011)). 1주일 후에, 피더 세포를 미리 파종해 둔 100 ㎜ 디쉬에 1×105개의 상기 벡터를 도입한 HDF를 파종했다. 이어서, hiPSC 배지(20% KSR(Invitrogen), 2 mM L-글루타민(Invitrogen), 1×10-4 M 비필수 아미노산(Invitrogen), 1×10-4 M 2-메르캅토 에탄올(Invitrogen), 50 units/ml 페니실린(Invitrogen), 50μg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen), 4 ng/ml bFGF(WAKO)를 첨가한 DMEM/F12(Sigma))로 배양했다. 얻어진 각 iPS 세포는, 항SSEA4 항체(Santa Cruz, sc-5279) 및 항-TRA1-60 항체(Abcam, ab16287)를 사용한 면역 조직 화학에 의해 평가했다.
그 결과, 제작된 모든 iPSC주가 ES 세포 마커(SSEA4 및 TRA1-60)를 발현하고 있고, 3배엽을 포함하는 테라토마를 형성하는 것이 확인되었다(도 1 및 표 1).
[표 1]
Figure pct00001
mRNA의 측정
mRNA는, RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여, 각 세포로부터 단리하였다. 얻어진 전체 RNA 중 500 ng을 주형으로 하여, ReverTra Ace(TOYOBO)를 사용하여 역전사에 의해 cDNA를 합성하였다. 정량 PCR(리얼타임 PCR)을 위한 표준 곡선을 작성하여 해석을 행하였다. 리얼타임 PCR 해석은, KAPA SYBR FAST qPCR kit Master Mix ABI prism(KAPA BIOSYSTEMS)을 사용하여, Step One system(ABI)에 의해 측정하였다. 사용한 프라이머(primer)의 서열 및 어세이(Assay) ID를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pct00002
웨스턴 블로팅법
세포 용해액은, SDS-PAGE법을 사용하여 분리하고, anti-FGFR3 antibody(Cell SIgnaling사 #4574), anti-phosphorylated MAPK antibody(Cell Signaling #9109) 또는 anti β-actin antibody(Cell Signaling사 #49776)를 사용하여 면역 염색했다.
실시예 2
연골 유도
이전에 보고된 방법(Oldershaw, R. A., et al., Nat Biotechnol 28, 1187-1194 (2010))을 수정한 하기의 방법에 의해, 각 iPS 세포로부터 연골 세포에 분화 유도했다.
각 iPS 세포를 마트리겔(Invitrogen) 코팅 디쉬 상에 파종하고, Essential 8 배지(Life Technologies)에 50 units/ml 페니실린 및 50μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 배지를 가하고, 피더 프리 조건 하에서 미분화 유지 배양했다. 파종 후 10∼15 일째에, 1∼2×105 세포로 이루어지는 콜로니를 중배엽 분화 배지(DMEM/F12에 대하여 10 ng/ml Wnt3A(R&D), 10 ng/ml 액티빈 A(R&D), 1% 인슐린-트랜스페린-아셀렌산 나트륨(Invitrogen), 1% 우태아 혈청, 50 units/ml 페니실린, 50μg/ml 스트렙토마이신을 혼합하여 조제)로 교환하였다(분화 유도 0일째). 3일 후(분화 유도 3일째), 연골 분화 배지(50μg/ml 아스코르브산, 10 ng/ml BMP2(Osteopharma), 10 ng/ml TGFβ(Pepro Tech), 10 ng/ml GDF5, 1% 인슐린-트랜스페린-아셀렌산 나트륨, 1% FBS, 50 units/ml 페니실린 및 50μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12)로 교환하고, 11일 후(분화 유도 14일째)에 디쉬로부터 세포를 긁어내고, 동일한 배지를 사용하여 부유 배양에 의해 14일 후(분화 유도 28일째) 및 28일 후(분화 유도 42일째)에 형성된 파티클를 회수하고, 각 해석을 행하였다. 분화 유도중에는, 2∼7 일마다 배지를 교환하였다.
그 결과, 분화 유도 42일째에 있어서, 사프라닌 O 염색한 바, WT-iPSC 유래의 파티클에는, 연골 세포외 매트릭스 및 그 중에 산재하는 세포가 확인되었지만, TD-iPSC 유래의 파티클에는 연골 세포외 매트릭스가 확인되지 않았다(도 2의 a, b). 이러한 사실로부터, TD-iPSC 유래의 파티클은, 연골 구조에 중요한 글리코사미노글리칸을 거의 함유하지 않는 것을 나타내고 있다.
이어서, FGFR3 mRNA의 발현 레벨을 측정한 바, 분화 유도 28일째의 각 연골 세포 마커 유전자(SOX9, COL2 및 AGGRECAN) 및 I형 콜라겐 유전자의 발현을 조사한 바, TD-iPSC 유래의 세포에 있어서, 각 연골 세포 마커 유전자의 발현이 감소하고, I형 콜라겐 유전자의 발현이 증가하고 있는 것이 확인되었다(도 3의 a).
또한, 분화 유도 42일째에 있어서, 면역 조직 화학적 해석을 행한 바, WT-iPSC 유래의 파티클과 비교하여, TD-iPSC 유래의 파티클에 있어서 II형 콜라겐의 발현이 감소하고, I형 콜라겐의 발현이 증대되어 있는 것이 확인되었다(도 3의 b). 그리고, 면역 조직 화학적 해석은, 분화 유도 42일째에 파티클을 회수하고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 처리하고, 파라핀 포매한 후, 반연속 절편을 조제하여, 항I형 콜라겐 항체(southern Biotech, 1320-01)를 사용하여 검출하였다. 색소원으로서는, DAB(DAKO, K3468)를 사용하였다. 또한, 국소적인 II형 콜라겐의 침착이, TD-iPSC 유래의 파티클에 있어서 관찰되므로(도 3의 c), TD-iPSC에서는 연골 형성은 한정적이거나, 또는 초기 단계에서 형성되고 신속하게 분해되는 것이 시사되었다.
TD-iPSC로부터의 유도 과정(0주, 2주(14일째) 및 4주(28일째))에서의 FGFR3 mRNA의 발현 레벨은, WT-iPSC의 유도 과정에서의 발현보다 낮은 것이 확인되었다(도 4의 a 및 b). 이는, TD 세포에서의 FGFR3의 변이에 의한 기능 항진에 기인하는 마이너스의 피드백에 의한 것으로 여겨진다. 한편, FGFR3의 단백질량을 측정한 바, TD-iPSC 유래의 연골 세포에서는, WT-iPSC 유래의 연골 세포와 비교하여 보다 단백질량이 많은 것이 확인되었다(도 4의 c). 이로부터, 변이형 FGFR3은 분해에 대하여 저항성을 가짐으로써 수용체의 시그널 전달의 항상적인 활성으로 유도하고 있는 것이 시사되었다.
TD-iPSC의 연골 분화 유도 공정에 있어서, 이상(異常) 파티클이 어떻게 형성되는지를 조사하기 위해, WT-iPSC 및 TD-iPSC의 분화 유도 공정에서의 각 마커의 시간 경과에 따른 발현을 분석하였다(도 4의 d). WT-iPSC 및 TD-iPSC에 있어서, 다능성 마커인 OCT3/4는 3일째에 급격하게 감소하고, 중내배엽/중배엽 마커인 T 및 KDR은 3일째부터 9일째에 걸쳐 일과성(一過性)으로 발현이 증가하였다. 연골 형성에 관한 전사 인자인 SOX9, SOX5 및 SOX6은, WT-iPSC 및 TD-iPSC에 있어서 14일째까지 마찬가지로 증가하였다. 그러나, 14일째 이후에서는, WT-iPSC에서는 연골 형성에 관한 전사 인자의 발현이 계속 증가한 것에 비해, TD-iPSC에서는 감소하였다.
이 연골 형성에 관한 전사 인자는, 연골 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 전사에 관여하므로, II형 콜라겐(COL2A1) 및 아글리칸(ACAN)의 발현을 조사한 바, 양자 모두 21일째까지는, WT-iPSC 및 TD-iPSC에 있어서 서서히 증가하였다. 그러나, 28일째에 있어서 TD-iPSC에서는 감소하고, WT-iPSC에서는 계속 증가하였다. 그 결과, WT-iPSC 및 TD-iPSC는 14일째부터 21일째에 있어서는 동일한 분화 유도능을 나타내지만, TD-iPSC는, 28일째에 있어서 연골 매트릭스 유전자의 발현 감소하고, 연골 분화의 성숙이 저해되는 것이 확인되었다.
또한, BrdU로 라벨링함으로써 28일째의 TD-iPSC 및 WT-iPSC 유래의 연골 세포의 증식 속도를 측정한 바, TD-iPSC 유래의 연골 세포는 WT-iPSC 유래의 연골 세포와 비교하여 유의하게 증식 속도가 감소하고 있는 것이 나타났다(도 5의 a 및 b). 또한, 분화 유도 21일째에 있어서, TD-iPSC 유래의 연골 파티클에 대하여 TUNEL 어세이를 행한 바, TUNEL 양성 세포수의 증가 즉 아포토시스(apoptosis)를 일으킨 세포의 증가가 확인되었다(도 5의 c, d). 또한, Cleaved-caspase 3의 양성 세포수도 증가하고 있는 것이 확인되었다(도 5의 e). 따라서, TD-iPSC 유래의 연골 세포에서는 아포토시스가 항진하고 있는 것이 시사되었다. 또한, TD-iPSC 유래의 연골 세포에 있어서, p21의 발현 레벨도 증가하고 있는 것이 나타났다(도 5의 f). 이상의 결과로부터, TD-iPSC를 연골 세포로 분화 유도함으로써, FGFR3 환자나 모델에 있어서 관찰되는 세포 증식의 저하와 아포토시스의 증가의 2개의 이상이 재현되었다. 이 2개의 이상은, 42일째의 TD-iPSC 유래의 연골 파티클에서 관찰되는 연골 조직의 결손(缺損)의 원인이 되고 있는 것으로 여겨진다. 그리고, TUNEL 어세이는, in situ cell death detection kit(TMR red; Roche)를 사용하여, 제조자의 지시에 따라 행해졌다.
실시예 3
연골 형성적으로 분화시킨 TD-iPSC의 방해된 연골 형성으로부터의 회복
TD-iPSC가 FGFR3의 기능 획득형 돌연변이가, 연골 세포 분화 부전에 기인하고 있는지를 확인하기 위하여, FGFR3을 녹다운하는 실험을 행하였다.
shRNA PB 벡터 및 트랜스포사제(transposase) 발현 벡터(PBaseII, P16-25)를, A. Hotta(Center for iPS Cell Research and Application(CiRA), Kyoto University, Kyoto, Japan)로부터 입수했다. shRNA PB 벡터를 바탕으로, FGFR3의 상이한 부위를 표적으로 하는 3종류의 쇼트 헤어핀(short hairpin) RNAs(shRNA)를 포함하는 piggybac 벡터(FGFR3 shRNA PB 벡터)를 제작하였다(도 6의 a). shRNA의 콘스트럭트를 제작하기 위한 서열을 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure pct00003
FGFR3 shRNA PB 벡터 및 PBaseII를, Ncleofection(Amaxa)를 사용하여, 제조자의 지시에 따라, TD-iPSC(TD714-3)에 도입하고, FGFR3을 녹다운시킨 TD-iPSC를 제작하였다. 이어서, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 연골 세포로 분화 유도를 행하고, 분화 유도 28일째 및 42일째의 파티클에 의해 평가했다. RNA의 발현 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 따라 행해졌다.
3종류의 FGFR3 shRNA PB 벡터는, FGFR3 유전자의 녹다운의 기능을 가지는 것이 확인되었다(도 6의 b). 이들 FGFR3 shRNA PB 벡터를 사용하여 TD-iPSC의 FGFR3을 녹다운한 바, 연골 세포외 매트릭스를 가지는 파티클을 형성하는 것이 확인되었다(도 6의 c, d). 이 때 유전자 발현 해석을 행한 바, FGFR3 shRNA를 도입한 TD-iPSC 유래의 파티클에서는, 음성 대조군인 shLuciferase(루시페라아제 유전자 서열을 표적으로 하는 shRNA)를 도입한 경우와 비교하여, 연골 세포 마커 유전자의 발현이 증가하고, 섬유아 세포 마커 유전자(COL1A1 and COL1A2)의 발현이 감소하는 것이 발견되었다(도 6의 e).
또한, TD-iPSC의 연골 세포 분화 유도 공정에 있어서, 배지에 FGFR3 중화 항체를 가하여, FGFR3의 활성을 억제하고, 연골 세포의 형성을 확인하였다. 그리고, FGFR3 중화 항체(Santa Cruz(sc-13121))는, 1 ml의 연골 분화 배지에 1 μl의 항체 용액(200 ng /ml)을 가하여 행해졌다. 또한, 이 때 대조군으로서, IgG(Cell Signaling, #27295)을 사용하였다. 연골 세포 분화 유도는, 실시예 2에 기재된 방법에 따라 행하였고, 분화 유도 28일째 및 42일째에 평가했다.
그 결과, FGFR3 중화 항체를 첨가한 경우, FGFR3 유전자를 녹다운했을 때와 동일하게, 파티클에 연골 세포외 매트릭스가 확인되었다(도 7의 a, b). 또한, 유전자 발현 해석을 행한 바, FGFR3 중화 항체의 첨가에 의해, 연골 세포 마커 유전자의 발현이 증가하고, 섬유아 세포 마커 유전자의 발현이 감소하는 것이 발견되었다(도 7의 c).
이상으로부터, TD-iPSC로부터의 연골 세포 분화 유도의 부전은, FGFR3의 기능 획득형 돌연변이에 기인하는 것이 시사되었다.
실시예 4
TD-iPSC의 연골 세포 분화 부전을 정상화시키기 위한 기지(旣知) 약제의 평가
FGFR3병의 치료에 유효한 약제를 발견하기 위하여, TD-iPSC로부터의 연골 세포 분화를 정상화시키기 위한 물질에 대하여 스크리닝을 행하였다.
FGFR3 시그널 전달 및/또는 연골 세포 분화에 관여하는 것이 보고되어 있는 약제(CNP, NF449, FGFR inhibitor 및 IGF1R inhibitor)를 사용하여 TD-iPSC로부터의 연골 세포 분화를 정상화시킬 것인지의 여부에 대한 검토를 행하였다. 이 때, CNP(Sigma, N8768), NF449(abcam, ab120415), FGFR inhibitor(PD 173047, Cayman) 및 IGF1R inhibitor(IGF-1R inhibitor, PPP. Calbiochem, 407247)에 대하여, 각각 100μM, 50 mM, 1 mM, 1μM의 농도에서의 스톡 용액을 조제하였다. CNP, NF449, FGFR inhibitor 및 IGF1R inhibitor의 최종 농도가, 각각, 100 nM, 25μM, 1μM 및 1 nM로 되도록 스톡 용액을 연골 분화 배지에 가한 후(분화 유도 3일째), 실시예 2에 기재된 방법에 의해, 연골 세포로 분화 유도하고, 분화 유도 28일째 및 42일째에 평가했다. 대조군으로서, 등량(等量)의 물 또는 DMSO를 배지에 가했다. mRNA의 발현 해석은, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 행해졌다.
그 결과, FGFR inhibitor 및 G 단백질 안타고니스트인 NF449의 첨가는, TD-iPSC로부터 연골 세포로의 분화에 영향은 주지 않았지만, IGF1R inhibitor 및 CNP의 첨가는, TD-iPSC로부터 연골 세포 분화를 정상화시킬 수 있었다(도 8의 a, b). 이 때의 유전자 발현 해석을 행한 바, IGF1R inhibitor 및 CNP의 첨가에 의해, 연골 세포 마커 유전자의 발현이 증가하고, 섬유아 세포 마커 유전자의 발현이 감소하는 것이 확인되었다(도 8의 c).
실시예 5
TD-iPSC의 연골 세포 분화 부전을 정상화시키기 위한 약제의 탐색
스타틴은, 널리 지질 강하제로서 특징되는 약제 클래스를 형성하는 물질이며, 메발론산 합성을 저해하고, 그 결과, 전체 콜레스테롤량 및 저밀도 리포단백질(LDL) 레벨을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 모든 스타틴류는, 심혈관계 질환, 신경계, 면역계, 골격계 및 종양 성장에 대하여 유리한 영향을 미치므로, 스타틴류의 다면적인 효과에 대하여 관심이 모여지고 있다. 또한, 로바스타틴은, 골수핵으로부터 단리한 세포를 단층 배양함으로써 일어나는 탈분화에 의한 II형 콜라겐의 탈락을 억제하는 것으로 보고되어 있다(Hu et al., Artif Organs. 35, 411-416 2011).
이에, 로바스타틴이, TD-iPSC로부터의 연골 세포 분화를 정상화시킬 것인지의 여부를 검토하기 위하여, 실시예 4와 동일하게 평가를 행하였다. 그리고, 로바스타틴(TCI, L0214)은, 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시킴으로써의 스톡 용액을 조제하고, 연골 분화 배지의 최종 농도가 1μM이 되도록 사용하였다.
그 결과, 로바스타틴은, TD-iPSC로부터의 연골 세포 분화를 정상화시키는 것을 발견하였다(도 9의 a, b). 유전자 발현 해석을 행한 바, 로바스타틴의 첨가에 의해, 연골 세포 마커 유전자의 발현이 증가하고, 섬유아 세포 마커 유전자의 발현이 감소하는 것이 발견되었다(도 9의 c). 로수바스타틴의 존재 하 및 비존재 하에 있어서 배양한 TD-iPSC 유래의 연골 파티클의 BrdU의 도입을 확인한 바, 로수바스타틴 첨가군에서 BrdU 양성 세포수가 유의하게 많은 것이 확인되었다(도 10의 a 및 b). 또한, 메바스타틴(Cayman, 10010340), 아토르바스타틴(LKT A7658), 프라바스타틴(Cayman, 10010343), 로수바스타틴(BioVision, 1995-5) 및 플루바스타틴(Cayman, 10010337)을 사용하여 마찬가지로 조사한 바, 이들 약제에도 TD-iPSC 유래의 연골 세포에서의 연골 형성 이상을 개선시키는 것이 확인되었다(도 10의 c 및 d). 그리고, 이들 스타틴은, 10 mM의 DMSO 용액으로서 준비하고, 최종 농도가 1μM이 되도록 적절하게 배양액에 첨가하여 사용하였다. 이들 결과로부터, 스타틴류는 TD-iPSC 유래의 연골 세포를 회복시키는 것이 시사되었다.
스타틴에 의한 FGFR3병 모델의 개선 효과의 메카니즘을 조사하기 위해, FGFR3의 mRNA량 및 단백질량을 측정하였다. 그렇게 하였더니, 로바스타틴의 첨가에 의해, TD-iPSC 유래의 연골 세포에서의 이상 FGFR3 단백질량의 증가를 억제하는 것이 확인되었다(도 10의 e). 동시에, FGFR3 시그널의 하류인 MAPK의 인산화를 억제하는 것도 확인되었다. FGFR3의 mRNA량은, 로바스타틴의 첨가에 의해 TD-iPSC 유래의 연골 세포에 있어서 증가하므로, FGFR3 단백질량의 변화는, mRNA량을 제어하는 것에 의한 것은 아닌 것으로 확인되었다(도 10의 f).
실시예 6
ACH에 있어서의 로바스타틴의 효과
로바스타틴이 ACH에 대하여도 유효한지의 여부를 조사하기 위하여, ACH 환자 유래의 iPS 세포를 사용하여 동일하게 평가를 행하였다.
ACH 환자 유래의 iPS 세포는, FGFR3 유전자에 있어서 Gly380Arg의 헤테로 접합 돌연변이를 가지는 2명의 ACH 환자의 HDF(ACH8857 및 ACH8858), 및 ACH보다 중증인 연골 형성 부전을 나타내는 HDF(ACHhomo-8859)를 코리엘 의학 연구소로부터 입수하여 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작하였다. ACHhomo-8859는, FGFR3 유전자 중에 Gly380Arg의 호모 접합 돌연변이를 가지고 있었다. 각 환자로부터 1종류의 iPSC주(ACH8857-1, ACH8858-6 및 ACHhomo8859-3)를 제작하였다(이하, ACH8857-1 및 ACH8858-6을 ACH-iPSC라고 하고, ACHhomo8859-3을 ACHhomo-iPSC라고 함). ACH-iPSC 및 ACHhomo-iPSC는, SSEA4 및 TRA1-60을 발현하고 있고, 3배엽을 포함하는 테라토마를 형성하는 것을 확인하였다(표 4).
[표 4]
Figure pct00004
ACH-iPSC 및 ACHhomo-iPSC를 실시예 2에 기재된 방법으로 연골 세포에 분화시키고, 얻어진 파티클를 사프라닌 O로 염색한 바, 음성이었다(도 11의 a). 이 때, 실시예 5와 동일하게 로바스타틴을 첨가한 바, ACH-iPSC에서는, 연골 세포로의 분화 유도에 의한 연골 형성의 정상화가 확인되었고, ACHhomo-iPSC에서는, 부분적인 정상화가 확인되었다(도 11의 b).
이상으로부터, TD-iPSC 및 ACH-iPSC 중 어느 모델에 있어서도, 로바스타틴은 연골 형성을 정상화시키는 것이 가능한 것으로 시사되었다.
실시예 7
스타틴에 의한 ACH 모델 마우스에 있어서의 감소한 뼈 성장의 회복
스타틴이 in vivo로 FGFR3병의 표현형을 정상화할 수 있는지의 여부를 조사하였다. David Ornitz(Washington University School of Medicine)로부터 입수한 FGFR3Ach 마우스(Naski et al., Development 125, 4977-4988 (1998))를 야생형 마우스와 교잡했다(C57BL/6 background). 교잡 마우스의 출생 후 3일부터 14일까지, 1주일에 6회 1.0 mg/kg 로수바스타틴 용액을 복강 내에 투여하고, 15일째에 안락사시키고, 몸체 및 뼈 형성을 X선 이미지(Faxitron DX-50)에 의해 평가했다. 이 때, 게놈 DNA를 발끝으로부터 추출하고, 유전자형을 조사하였다. 또한 마찬가지로, 교잡 마우스의 출생 후 3일부터 28일까지, 1주일에 6회 0.4 mg/kg 로바스타틴 용액을 복강 내에 투여하고, 29일째에 안락사시키고, 몸체 및 뼈 형성을 평가했다.
그 결과, FGFR3Ach 마우스는, 소인증 유사이며, 짧은 사지골 및 짧은 코를 나타낸다. 로수바스타틴의 복강내 투여에 의해, 15일령의 FGFR3Ach 마우스의 두개골의 전후 방향에서의 길이(Cranial A-P), 척골(Ulna)의 길이, 대퇴골(Femur)의 길이 및 경골(Tibia)의 길이를 증가시켰다(도 12의 a 및 b 및 도 13). 또한, 기질을 투여한 야생형 마우스와 로수바스타틴 투여한 FGFR3Ach 마우스를 비교한 바, 유의한 차이가 관찰되지 않고, 로수바스타틴 투여에 의해 야생형과 거의 동일한 형상으로 개선된 것이 확인되었다.
마찬가지로, 로바스타틴의 투여에 의해, FGFR3Ach 마우스의 체장 및 장골의 길이의 증가가 관찰되었다(도 14의 a, b, 도 15 및 표 5). 또한, 로바스타틴의 투여에 의해, FGFR3Ach 마우스의 코의 길이가 어느 정도 정상화하는 효과가 관찰되었다(도 14의 c, d, 도 15 및 표 5). 이와 같이, FGFR3Ach 모델 마우스에 있어서도, 스타틴의 투여에 의해 뼈 형성 저해를 완화하는 것을 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00005
FGFR3Ach 모델 마우스의 원시 연골을 로바스타틴의 존재 하 또는 비존재 하에서 기관 배양한 바, 상기 연골이 로바스타틴의 첨가에 의해 길어지는 것이 확인되었다(도 16의 a 및 b). 이것은, 로수바스타틴이 직접 연골에 작용하여, 연골의 신장을 촉진하는 것을 의미하고 있다. 또한 원시 연골에서의 BrdU 도입을 확인한 바, 로바스타틴은, FGFR3Ach 모델 마우스의 원시 연골의 증식능을 증가시키는 것이 확인되었다(도 16의 c 및 d). 그리고, 기관 배양은, FGFR3Ach 모델 마우스의 중족골의 원시 연골을 로바스타틴의 존재 하에서 7일간 배양함으로써 행해졌다. 중족골은, FVB×C57Bl/6을 교배시켜 얻어진 15.5 d.p.c.의 마우스배로부터 채취하고, Ikegami, D. et al., Osteoarthritis Cartilage 19, 233-241, 2011에 따라 행하였다. 간결하게는, 유전자형을 확인한 후, FGFR3Ach 마우스배로부터의 중족골을 1μM의 로바스타틴 또는 기질로 처치함으로써 행하였다.
또한, FGFR3Ach 마우스로부터 채취한 초대 연골 세포를 펠릿 배양한 바, 로바스타틴의 존재 하에서는, 보다 강하게 사프라닌 O로 염색되는 것이 확인되었다(도 16의 e). 또한, 펠릿 배양 개시 후 2주째에 Sox9, Col2al 및 Acan의 mRNA의 발현이 상승하고, 배양 개시 후 4주째에 Runx2 및 Col10a1의 mRNA의 발현이 상승하고 있는 것이 확인되었다(도 16의 f). 그리고, 펠릿 배양은 하기의 방법으로 행하였다. 배양에 사용한 초대 연골 세포는, FGFR3Ach 마우스로부터 Gosset, M et al., Nature protocols 3, 1253-1260, 2008에 기재된 방법에 의해 입수하였다. 이어서, 5×105개의 초대 연골 세포를 15 ml 튜브로 옮기고, 200 g으로 10분간 원심분리함으로써 얻어진 펠릿을 1μM의 로바스타틴의 존재 하 또는 비존재 하에서 2주 또는 4주 인큐베이트함으로써 행해졌다. 이상의 결과로부터, 스타틴의 첨가에 의해, Sox9 및 Runx2의 발현을 증가시킴으로써, 연골 분화 유도를 촉진하고, 나아가서는 비대화에 의해 연골을 성숙시키는 것이 시사되었다.
이어서, FGFR3Ach 마우스의 초대 연골 세포에 있어서 FGFR3의 발현량을 조사한 바, 야생형 마우스의 초대 연골 세포보다 FGFR3가 많이 검출되었다(도 16의 g). 이 때 로바스타틴의 첨가에 의해 FGFR3Ach 마우스의 연골 세포에 있어서의 FGFR3의 양이 감소하지만, 프로테아솜 저해제인 MG132(Sigma)의 추가에 의해 FGFR3의 양은 증가하였다. 마찬가지로, 리소좀 저해제인 Bafilomycin A1(Baf A1)(Sigma)의 추가에 의해서도 FGFR3의 양이 약간 증가하였다. 그리고, 저해제의 효과에 대한 검토는, 하기와 같이 실시되었다. 2.5×105개의 초대 연골 세포를 6 well plate의 각 well에 파종하고, 1μM 로바스타틴의 존재 하 또는 비존재 하에서 2일간 배양했다. 이어서, 10 mM MG132, 100 nM Baf A1 또는 기질을 첨가하였다. 2시간 후, 50 ng/ml FGF9(Peprotech)를 더 첨가하고, 4℃에서 2시간 인큐베이트했다. 얻어진 세포를 웨스턴블로팅법에 의해 분석하였다. 이상의 결과로부터, 스타틴에 의한 FGFR3의 분해 촉진은, 프로테아솜계를 개입시키는 것이 시사되었다.
[산업상 이용가능성]
본 발명은, FGFR3병 환자의 체세포 유래의 iPS 세포를 연골 세포로 분화 유도를 통하여 연골 형성함으로써, FGFR3병의 병태의 재현에 성공한 것에 기초한 것이다. 따라서, 상기 세포를 사용하여 FGFR3병의 치료제 및/또는 예방제의 스크리닝을 행할 수 있다. 또한, 본 발명은, 상기 스크리닝의 결과 얻어진 연골 세포로의 분화를 촉진하는 물질을 제공하는 것이며, FGFR3병의 새로운 치료제 및/또는 예방제로서 이용 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University <120> PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR FGFR3 RELATED SKELETAL DYSPLASIA AND METHOD FOR SCREENING THEREOF <130> K29F5162 <150> JP 2013-249221 <151> 2013-12-02 <150> JP 2014-171078 <151> 2014-08-26 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 1 tggcaccaca ccttctacaa tgagc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 2 gcacagcttc tccttaatgt cacgc 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 3 agacctttgg gctgccttat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 4 tagcctccct cactccaaga 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 5 tgaggagggc tggaacaagt acc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggaggtggta attgcaggga aca 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 7 tttcccaggt caagatggtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 8 cttcagcacc tgtctcacca 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 9 gtcgagggcc aagacgaag 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 10 cagatcacgt catcgcacaa c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 11 aattggagct gttggtaacg c 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 12 caccagtaag gccgtttgc 19 <210> 13 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 13 gatcctacac ctgcgtcgtg gagaacaagt ttgtgaagca gatgaaactt gttctccacg 60 acgcaggtgt atttttg 77 <210> 14 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 14 aattcaaaaa tacacctgcg tcgtggagaa caagtttcat ctgcttcaca aacttgttct 60 ccacgacgca ggtgtag 77 <210> 15 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 15 gatccgatgc tgaaagacga tgccactgac aacatctgct tcacttgtca gtggcatcgt 60 ctttcagcat ctttttg 77 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 16 aattcaaaaa gatgctgaaa gacgatgcca ctgacaagtg aagcagatgt tgtcagtggc 60 atcgtctttc agcatcg 77 <210> 17 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 17 gatccctgca cacacgacct gtacatgatc atcatctgct tcacatgatc atgtacaggt 60 cgtgtgtgca gtttttg 77 <210> 18 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 18 aattcaaaaa ctgcacacac gacctgtaca tgatcatgtg aagcagatga tgatcatgta 60 caggtcgtgt gtgcagg 77 <210> 19 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 19 gatccgtgcg ttgttagtac taatcctatt tgtgaagcag atgaaatagg gttggtacta 60 gcaacgcact ttttg 75 <210> 20 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 20 aattcaaaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctatttcatc tgcttcacaa ataggattag 60 tactaacaac gcacg 75

Claims (15)

  1. 유효 성분으로서 HMG-CoA 환원 효소 저해약을 포함하는, FGFR3병의 치료 및/또는 예방용 의약.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, 의약.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, 의약.
  4. FGFR3병을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서,
    HMG-CoA 환원 효소 저해약을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, 방법.
  7. FGFR3병의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 HMG-CoA 환원 효소 저해약의 사용.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 HMG-CoA 환원 효소 저해약이, 메바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴 및 로바스타틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제인, 사용.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, 사용.
  10. 하기 공정을 포함하는, FGFR3병의 치료약 및/또는 예방약을 스크리닝하는 방법:
    (a) FGFR3에 변이를 가지는 인공다능성줄기(iPS) 세포를, 피험 물질과 접촉시키는 조건 및 접촉시키지 않는 조건 하에서 연골 세포로 분화시키는 공정,
    (b) 공정(a)에서 얻어진 배양물 중에서의 연골 세포외 매트릭스의 양, 연골 세포 마커 유전자 및 섬유아 세포 마커 유전자의 발현량으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 지표를 측정하는 공정, 및
    (c) 피험 물질과 접촉시키는 조건 하에 있어서, 접촉시키지 않는 조건 하보다 연골 세포외 매트릭스의 양 또는 연골 세포 마커 유전자가 증가한 경우, 또는 섬유아 세포 마커 유전자의 발현량이 감소한 경우, 상기 피험 물질을 FGFR3병의 치료약 또는 예방약으로서 선출하는 공정.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 공정(a)에 있어서의 연골 세포로의 분화가 하기 공정을 포함하는, 방법:
    (i) 다능성줄기세포를 접착 배양함으로써 중배엽 세포를 유도하는 공정,
    (ii) 상기 공정(i)에서 얻어진 세포를 bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ, GDF5 및 피험 물질을 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정, 및
    (iii) 상기 공정(ii)에서 얻어진 세포를 아스코르브산, BMP2, TGFβ, GDF5 및 피험 물질을 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 연골 세포 마커 유전자가, SOX9, AGGRECAN 및 COL2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자인, 방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 섬유아 세포 마커 유전자가, COL1A1 및/또는 COL1A2인, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FGFR3의 변이가, FGFR3 중의 Arg248Cys 또는 Gly380Arg 변이인, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 FGFR3병이, 치사성 골이형성증(TD) 및/또는 연골 무형성증(ACH)인, 방법.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3260536B1 (en) * 2015-02-19 2022-10-26 Kyoto University Novel method for inducing chondrocyte
EP3311809B1 (en) * 2015-06-18 2020-05-13 Kaohsiung Medical University Use of pharmaceutical composition in preparation of drug for promoting chondrocyte generation
EP3400022A1 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
BR112018011008A2 (pt) 2016-01-08 2018-12-04 Ascendis Pharma Growth Disorders As agonistas de cnp de liberação controlada com ligação a npr-c baixa
AU2017205273C1 (en) 2016-01-08 2022-12-01 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release CNP agonists with reduced side-effects
EP3400019B1 (en) 2016-01-08 2022-09-28 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with carrier attachment at the ring moiety
JP6908283B2 (ja) * 2016-04-01 2021-07-21 国立大学法人京都大学 Ｆｇｆｒ３病の予防または治療剤
KR102531327B1 (ko) * 2016-09-29 2023-05-11 아센디스 파마 그로우쓰 디스오더스 에이/에스 조절 방출 cnp 아고니스트를 사용한 병용 요법
JP2019201584A (ja) * 2018-05-23 2019-11-28 国立大学法人神戸大学 糖尿病予防又は治療剤スクリーニング方法、及び当該方法に用いる細胞
JP7269620B2 (ja) * 2019-01-22 2023-05-09 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から軟骨組織を製造する方法
JP7180458B2 (ja) 2019-03-07 2022-11-30 マツダ株式会社 構造部材およびその製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2007103366A2 (en) * 2006-03-07 2007-09-13 Osteoscreen Ip, Llc Hmg co-a reductase inhibitor enhancement of bone and cartilage

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5612114B2 (ko) 1974-06-07 1981-03-18
US4231938A (en) 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
US4444784A (en) 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
ZA81703B (en) 1980-02-04 1982-09-29 Merck & Co Inc New antihypercholesterolemic compounds,intermediates and processes
DK149080C (da) 1980-06-06 1986-07-28 Sankyo Co Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre
JPS572240A (en) 1980-06-06 1982-01-07 Sankyo Co Ltd Ml-236b derivative
US4739073A (en) 1983-11-04 1988-04-19 Sandoz Pharmaceuticals Corp. Intermediates in the synthesis of indole analogs of mevalonolactone and derivatives thereof
JPS60500015A (ja) 1982-11-22 1985-01-10 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト メバロラクトン同族体とその誘導体、これらの製造法およびこれらを含有する製薬学的組成物
JP2569746B2 (ja) 1987-08-20 1997-01-08 日産化学工業株式会社 キノリン系メバロノラクトン類
US5854259A (en) 1987-08-20 1998-12-29 Nissan Chemical Industries Ltd. Quinoline type mevalonolactones
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
US20020103360A1 (en) 1998-09-01 2002-08-01 Yang Pan Novel protein related to melanoma-inhibiting protein and uses thereof
IL128380A0 (en) 1999-02-04 2000-01-31 Yeda Res & Dev A method of screening for agonists and antagonists of FGFR
US20040109850A1 (en) 2000-12-18 2004-06-10 Neelam Jaiswal Treatment of bone disorders by modulation of fgfr3
US20090247576A1 (en) 2005-11-22 2009-10-01 Eisai R & D Management Co., Ltd. Anti-tumor agent for multiple myeloma
US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
US8129187B2 (en) 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
WO2009092042A1 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Nevada Cancer Institute Reprogramming of differentiated progenitor or somatic cells using homologous recombination
JP2011516042A (ja) 2008-03-17 2011-05-26 へルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘン−ドイチェス・フォルシュングスツェントルム・ヒューア・ゲズントハイト・ウント・ウムヴェルト（ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング） 部位特異的組み換えを用いて無ベクター誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製するベクターおよびその方法
EP3447128A1 (en) 2008-06-04 2019-02-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
EP2300611B1 (en) 2008-06-13 2017-08-09 Whitehead Institute for Biomedical Research Programming and reprogramming of cells
WO2009157201A1 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Osaka University Method and kit for preparing ips cells
WO2010012077A1 (en) 2008-07-28 2010-02-04 Mount Sinai Hospital Compositions, methods and kits for reprogramming somatic cells
US9045737B2 (en) 2008-12-13 2015-06-02 Dnamicroarray, Inc. Artificial three-dimensional microenvironment niche culture

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2007103366A2 (en) * 2006-03-07 2007-09-13 Osteoscreen Ip, Llc Hmg co-a reductase inhibitor enhancement of bone and cartilage

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jonquoy, A., et al., Hum Mol Genet 21: 841-851(2012)
Rauchenberger, R., et al., J Biol Chem 278: 38194-38205(2003)
Takahashi, K, et al., Cell. 131: 861-872(2007)
Yasoda, A., et al., Endocrinology 150: 3138-3144(2009)

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