KR20160077965A - Pna 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법 - Google Patents

Pna 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PNA 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성을 판별하기 위한 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 이를 이용한 표적 인공합성 올리고의 염기 변성 판별방법과 PNA 프로브를 포함하는 표적 인공합성 올리고의 염기 변성 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 인공합성 올리고의 품질 검사방법 및 인공합성 올리고의 염기의 염기변이(mutation) 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질 검사방법을 사용할 경우 유전자 진단 제품의 합성 올리고 이상 여부와 DNA 혹은 RNA 구조의 인공합성 올리고의 합성문제로 발생할 수 있는 염기서열 이상과 같은 비정상적인 합성 결과를 빠른 시간 내에 확인할 수 있으므로, 인공합성 올리고의 품질 검사 및 유전자 진단제품의 관리가 매우 편리하며, 인공합성 올리고의 품질을 모니터링하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

PNA 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법{Method for Ensuring Quality of Synthetic Oligo Using Peptide Nucleic Acid Probe}
본 발명은 PNA 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성을 판별하기 위한 리포터 및 소광자가 결합된 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 이를 이용한 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성 판별방법과 PNA 프로브를 포함하는 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 인공합성 올리고의 품질 검사방법 및 인공합성 올리고 염기의 염기변이(mutation) 검출방법에 관한 것이다.
1950년도 왓슨과 크릭(James D. Watson & Francis Crick)의 DNA 구조 확인을 시작으로 2000년도의 경우 대용량의 자동 DNA 합성기계를 바탕으로 분자생물학의 다양한 방면에서 활용되고 있다. 예시로 DNA 혼성화를 이용한 탐침(DNA hybridization probes), 프라이머를 이용한 DNA 염기서열 분석(primers for DNA sequencing), DNA 증폭(DNA ampification), 올리고를 이용한 유전자 합성(Oligos for gene synthesis) 등에 사용된다. 이들 중 특히 프라이머(primer)와 프로브(probe)는 인공합성 올리고들 중 가장 활발하게 사용 및 연구되어지고 있으며, 다양한 진단 분야에 활용하여 사용 중에 있다. 인공합성 올리고의 경우 자동 합성기계(Automatic DNA synthesis machine)에서 모두 제작되며, 합성 중 비정상적인 합성을 제어하고자 아세트산 무수물(acetic anhydride) 및 N-메틸이미다졸(N-methylimidazole)을 이용하여 캡핑(Capping)단계를 진행하고 있다. 이러한 캡핑의 단계는 결과적으로 제작하고자 하는 합성 올리고의 결실(deletion)을 방지할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 현재까지 사용되는 모든 자동 DNA 합성기계의 경우 3' 말단을 기준으로 합성이 진행되므로 최초 합성된 올리고의 3' 말단의 염기의 치환은 실질적으로 불가능하다. 하지만 염기서열의 순서는 기계의 프로그램에서 제어가 진행되며 기계의 문제가 발생 시 비정상적으로 합성될 확률은 매우 높다.
진단에서 사용되고 있는 DNA 중 프로브 및 프라이머는 결과 판독의 매우 중요한 역할을 한다. 프로브의 경우 특정 유전자의 유무를 확인하는데 사용하며 프라이머의 경우 특정 유전자의 증폭을 위하여 필요하다. 하지만 합성 DNA 올리고들(프로브 및 프라이머)의 제작 시 비정상적 합성이 발생할 경우 결과 판독에 문제가 발생한다. 또한, 합성 DNA 올리고의 경우 장기간 실험에 따라서 보관의 온도, 산도(pH)등의 영향에 따라 변성(degradation)이 발생하며, 이 또한 결과 판독에 문제가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 결과 판독에 사용하는 다양한 원료의 QC 테이터(Quality Control data)를 요청하거나 반복실험을 진행하게 된다.
인공합성 DNA 올리고의 QC(Quality Control)는 합성 염기의 개수를 확인하는 단계와 상기 합성된 염기의 정확한 염기서열을 확인하는 단계로 구성되어 있다. 합성 염기의 개수를 확인하기 위한 QC로는 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동 (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), HPLC 분석, MALDI-TOF 분석방법이 사용된다. 하지만 정확한 염기서열을 확인하는 QC로는 합성 올리고를 증폭(PCR: Polymerase Chain Reaction, amplification)한 다음, 이를 다시 백터(vector)에 클로닝(cloning)하고, 마지막으로 염기서열분석(sequencing)을 통하여 확인할 수 있다. 사실상 합성된 올리고의 정확한 염기서열분석은 불가능한 실정이며 비용과 시간 그리고 절차 등에서 많은 문제점을 가지고 있다. 또한, 합성 올리고의 염기의 개수를 확인하기 위한 작업 역시 시간적, 비용적 면에서 동일한 문제점을 안고 있다.
최근 연구되고 있는 염기다형성 분석에 사용하는 PNA(Peptide Nucleic Acid)의 경우 인공핵산(artificial nucleotide)으로 DNA 혹은 RNA와의 상보적 결합력이 탁월하다. 또한, 핵산 분해효소 및 단백질 분해효소 등에 대한 생물학적 안정성이 뛰어나며 화학적 안정성과 수용해도 또한 다른 인공합성된 올리고 보다 뛰어난 장점을 가지고 있다.
이 중 PNA의 가장 큰 특징은 다른 합성 올리고들과 달리 온도, pH 등에 매우 안정하여 한 번 합성된 PNA는 구조적으로 거의 변하지 않는 특징을 가지고 있다. 이와 같은 장점은 염기다형성을 확인할 수 있는 좋은 원료로 사용할 수 있다.
더욱이 PNA의 경우 높은 온도의 안정성과 짧은 길이의 합성이 가능하여 단일염기 불일치를 구분하는 우수한 특이성을 가지고 있다. 이러한 장점은 합성 중 발생할 수 있는 염기의 변성, 즉 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion)을 효과적으로 구분할 수 있다.
다만, 합성 올리고를 활용한 다양한 방면의 진단제품은 확장되는 추세이지만 합성 과정의 오류에 대한 정확한 정보를 제공하는 방법은 정체되어 있으며 더욱이, 인공합성 올리고의 5' 또는 3' 말단에서 1개 내지 2개의 염기의 변성(degradation)을 찾아내는 방법은 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성을 효과적으로 검출하기 위해 예의 노력한 결과, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하면 용해곡선 분석을 통해 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성을 효과적으로 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 표적 인공합성 올리고의 말단 염기 변성(degradation)을 판별하기 위하여 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, PNA 프로브와 말단 염기가 변성된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별방법 및 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법 및 검사용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법 및 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하는 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별을 위한 융해곡선 분석방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 판별하는 단계를 포함하는 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적 인공합성 올리고의 품질을 판별하는 단계를 포함하는 말단 염기가 변성(degradation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 말단 염기가 변성(degradation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적 인공합성 올리고의 염기변이 유무를 검출하는 단계를 포함하는 염기가 염기변이(mutation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 염기가 염기변이(mutation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질 검사방법을 사용할 경우 유전자 진단 제품의 합성 올리고 이상 여부와 DNA 혹은 RNA 구조의 인공합성 올리고의 합성문제로 발생할 수 있는 염기서열 이상과 같은 비정상적인 합성 결과를 빠른 시간 내에 확인할 수 있으므로, 인공합성 올리고의 품질 검사 및 유전자 진단제품의 관리가 매우 편리하며, 인공합성 올리고의 품질을 모니터링하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 인공합성 올리고와 PNA를 이용하여 인공합성 올리고의 변성여부를 확인할 수 있는 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 인공합성 올리고와 PNA 프로브의 결합 위치에 따른 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 인공합성 올리고와 변성여부를 확인하기 위한 PNA 프로브를 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time을 이용하여 수행을 위한 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 인공합성 올리고 변성을 확인하기 위한 융해곡선 온도 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이 여부를 확인하기 위하여 변성을 가장한 올리고를 인위적으로 합성하고 이를 이용하여 융해곡선 및 융해온도를 분석한 그래프이다.
도 6은 리포터와 소광자가 결합된 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이 여부를 확인하기 위하여 리포터와 소광자가 결합된 변성을 가장한 올리고를 인위적으로 합성한 것을 이용하여 융해곡선 및 융해온도를 분석한 그래프이다.
도 7은 3', 5' 말단에 2개의 염기(base)를 추가한 각각의 인공합성 올리고와 PNA 프로브의 결합 범위를 예측하여 각각의 융해곡선 및 융해온도를 분석한 그래프이다.
도 8은 정상적인 인공합성 올리고와 변성을 가장한 인공합성 올리고의 비율을 변경하면서 PNA 프로브를 이용하여 융해곡선 및 융해온도 분석을 진행한 그래프이다.
도 9는 실시간 유전자 증폭기의 기계 유형에 따른 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이 여부를 확인하기 위하여 변성을 가장한 올리고를 인위적으로 합성하고 이를 이용하여 융해곡선 및 융해온도를 분석한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고가 결합하는 염기서열 부위의 염기변이 위치와 변이염기 수에 따른 융해곡선의 변화를 측정하였으며, 표적 인공합성 올리고와 PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 가운데 부분 및 끝 부분에 해당하는 염기를 결실시킨 경우, 결실된 염기 수가 많을수록, 결실된 염기 수에 따라 순차적으로 융해온도(Tm)가 줄어드는 것을 확인하였으며, PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 가운데 부분의 염기가 변이된 경우, 융해온도(Tm) 차이가 더 큰 것을 확인하였다(표 2).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하는 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별을 위한 융해곡선 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 변성은 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '표적 인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다. '표적 인공합성 올리고'는 본 명세서에서 사용되는 용어 '타겟 인공합성 올리고'와 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 용어 '염기 변성(degradation)'은 표적 올리고 또는 표적 인공합성 올리고의 염기서열에 변성이 일어난 것으로, 외인적 요인(올리고의 유통 및 보관 상태) 또는 내인적 요인(올리고의 염기변이(mutation))에 의해 발생할 수 있다. '염기 변성'은 본 명세서에서 사용되는 용어 '변성'과 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다. 상기 염기변이 또는 돌연변이(mutation)는 올리고 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)으로 변성이 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기가 결실, 치환 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고와 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 인공합성 올리고와 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여 표적 인공합성 올리고의 염기 변성 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 상기 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기변이가 존재하는 표적 인공합성 올리고는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고와 염기 변성을 가지는 표적 인공합성 올리고와의 융해온도(Tm)차이를 위해, 표적 인공합성 올리고의 염기변이 위치가 PNA 프로브의 끝 부분 또는 가운데 부분에 올 수 있도록 디자인할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 융해곡선 분석을 통한 표적 인공합성 올리고의 염기 변성 판별을 위하여, 완전한 혼성화를 이루는 인공합성 올리고 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 인공합성 올리고를 4종류의 프로브(FAM-, HEX-, texas Red-, Cy5-labeled)와 혼성화 되도록 제조하여 융해곡선을 분석하였으며, 표적 인공합성 올리고 전체 염기서열의 염기 변성위치에 상관없이 염기가 결실 또는 치환된 표적 인공합성 올리고는 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고(perfect match)와 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인하였으며, 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고, 염기가 결실된 표적 인공합성 올리고 및 염기가 치환된 표적 인공합성 올리고 순으로 융해온도가 낮게 나타나는 것을 확인하였다(표 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 인공합성 올리고와 PNA 프로브 위치에 따른 융해곡선을 분석하기 위하여, 인공합성 올리고의 길이를 서로 다르게 제작하여 인공합성 올리고와 PNA 프로브의 결합범위를 예측하고 각각의 융해곡선 및 융해온도를 분석한 결과 2개의 염기가 추가된 인공합성 올리고의 경우 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고(perfect match)와 융해온도(Tm) 차이가 크지 않음을 확인하였다(표 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 표적 인공합성 올리고의 불량비율을 판단하기 위해, 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고(perfect match)와 변성된 표적 인공합성 올리고의 비율을 변경하면서 융해온도 차이 측정하였고, 변성된 표적 인공합성 올리고의 비율이 높을수록 융해온도의 차이가 크게 나타남을 확인하였으며, 본 발명의 PNA를 이용한 표적 인공합성 올리고의 염기 변성을 판별하는 방법이 표적 인공합성 올리고의 변성비율을 판단할 수 있음을 확인하였다(표 5).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 판별하는 단계를 포함하는 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별방법과 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고 염기서열의 차이 판별용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 변성은 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 판별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적 인공합성 올리고의 품질을 판별하는 단계를 포함하는 말단 염기가 변성(degradation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법과 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 말단 염기가 변성(degradation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 변성은 올리고 염기의 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 분석하여 표적 인공합성 올리고의 품질을 판별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,(a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적 인공합성 올리고의 염기변이 유무를 검출하는 단계를 포함하는 염기가 염기변이(mutation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법과 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 염기가 염기변이(mutation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기변이를 가지는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염기변이는 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 염기변이는 올리고 염기의 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 염기변이는 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기변이 유무를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인공합성 올리고 구분용 프로브 제작
인공 합성 올리고의 제작과 사용 중 발생할 수 있는 결과를 예측하여 변성(degradation)을 가장한 올리고, 치환(substitution)을 가장한 올리고 그리고 결실(deletion)을 가장한 올리고를 제조하였다. 또한, 인공합성 올리고의 경우 특이적으로 탐침자(probe)로 사용되는 형광이 표기된 변성, 돌연변이 또는 결실을 가지는 올리고를 추가 제작하였다. 추가적으로 프라이머의 경우 개체 특이적으로 18mer~25mer, 프로브의 경우 25mer~35mer로 제작하기 때문에 PNA 프로브와 올리고의 결합 위치를 달리하여 인공합성 올리고를 제작하였다. 또한, 제작한 인공합성 올리고의 모든 이상 여부를 확인할 수 있는 상보적인 PNA 프로브를 제작하고자 하였다(표1).
먼저, PNA 프로브는 인공합성 올리고의 이상 여부 확인을 위하여 직접 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브(FAM-labeled, Dabcyl)는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적 인공합성 올리고와의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 2차 구조는 피하였다. 더불어 형광이 표기된 인공합성 올리고의 구조적 특징으로 PNA 프로브 제작 시 형광 리포터와 소광자의 위치를 교차하여 제작하였다.
염기의 변이 부분의 융해온도(Tm)는 제작한 PNA 프로브를 기준으로 인공합성 올리고의 상보적인 결합에 의하여 차이가 발생할 수 있도록 제작하였다. 하기 표 1은 인공합성 올리고 구분을 위한 PNA 프로브 및 올리고 서열을 나타낸 것이다.
이름(서열번호) 서열(5'-> 3') 타입
PROBE-1
(서열번호 1)		 (Dabcyl)TCATGCCGCTGCT-O-K(HEX) PNA probe
PROBE-2
(서열번호 2)		 (HEX)TCATGCCGCTGCT-O-K(Dabcyl) PNA probe
PM
(서열번호 3)		 AGTACGGCGACGA Perfect match
PM1
(서열번호 4)		 CGAGTACGGCGACGA Perfect match (5` end 2 base more)
PM2
(서열번호 5)		 AGTACGGCGACGACG Perfect match (3` end 2 base more)
5`-1dg
(서열번호 6)		 GTACGGCGACGA 5`end 1 base degradation
5`-2dg
(서열번호 7)		 TACGGCGACGA 5`end 2 base degradation
3`-1dg
(서열번호 8)		 AGTACGGCGACG 3`end 1 base degradation
3`-2dg
(서열번호 9)		 AGTACGGCGAC 3`end 2 base degradation
MID-mu
(서열번호 10)		 AGTACGCCGACGA Inter Mutation
MID-de
(서열번호 11)		 AGTACGCGACGA Inter deletion
5`-mu
(서열번호 12)		 ACTACGGCGACGA 5` end mutation
5`-de
(서열번호 13)		 ATACGGCGACGA 5` end deletion
3`-mu
(서열번호 14)		 AGTACGGCGACCA 3` end mutation
3`-de
(서열번호 15)		 AGTACGGCGACA 3` end deletion
PM-F
(서열번호 16)		 FAM-AGTACGGCGACGA-BHQ1 report and quenching tagging perfect match
5`-1dg-F
(서열번호 17)		 FAM-GTACGGCGACGA-BHQ1 report and quenching tagging 5` end degradation
3`-1dg-F
(서열번호 18)		 FAM-AGTACGGCGACG-BHQ1 report and quenching tagging 3` end degradation
MID-mu-F
(서열번호 19)		 FAM-AGTACGCCGACGA-BHQ1 report and quenching tagging inter mutation
MID-de-F
(서열번호 20)		 FAM-AGTACGCGACGA-BHQ1 report and quenching tagging inter deletion
상기 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.
상기에서 합성한 인공합성 올리고와 이상 여부를 확인하기 위한 PNA 프로브를, 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 인공합성 올리고와 PNA 프로브를 혼합하여 용해곡선 분석을 진행하였다(도 3).
실시예 2: 인공합성 올리고의 치환( substitution ), 결실( deletion ) 및 변성( degradation )에 따른 용해곡선 분석
상기에서 합성한 인공합성 올리고의 이상 여부를 확인하기 위한 PNA 프로브와 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 인공합성 올리고와 PNA 프로브를 혼합하여 용해곡선을 이용한 분석을 진행하였다. 용해곡선 분석을 위한 조건은 다음과 같다; 총 부피가 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 SSB MeltingArrayTM 버퍼(SeaSunBio Real-Time MeltingArrayTM buffer, 시선바이오, 한국), 인공합성 올리고 1㎕/2.5pmol, PNA 프로브 0.5㎕/10pmol, 멸균된 증류수(D.W) 8.5㎕를 첨가하여 실시하였다. 용해곡선 분석을 위한 과정은 90℃에서 3분, 75℃에서 1분의 가열 단계를 거친 다음, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다(도면 4).
인공합성 올리고의 변성 및 염기변이 여부를 확인하기 위하여 예측 제작한 후 융해곡선을 분석하였다. 인공합성된 올리고의 경우 사용 중 다양한 조건에서 염기(base)의 변성(degradation)이 발생할 수 있으며, 또한 3' end의 변성이 발생할 경우 유전자 증폭에 큰 영향을 준다. 또한, 합성 과정 중 기계의 오류, 잘못된 입력 등의 이유로 치환과 결실이 발생할 수 있다. 따라서 올리고의 변성, 치환, 결실을 가장한 올리고를 인위적으로 합성하여 실험을 진행하였다(도 5).
인공합성 올리고의 변성 및 염기변이의 분석은 1개의 튜브에서 5회 반복 실시하였으며, 이들의 평균값을 산출하여 표기하였다. 하기 표 2는 인공합성 올리고의 이상 여부를 확인하기 위한 융해온도를 나타낸 것이다.
이름 타입 평균온도(℃) 융해온도 차이(℃)
PM Perfect match 62.5 -
5` 1dg 5` end 1 base degradation 60.0 - 2.5
5` 2dg 5` end 2 base degradation 52.0 - 10.5
3` 1dg 3` end 1 base degradation 60.0 - 2.5
3` 2dg 3` end 2 base degradation 54.5 - 8.0
MID-mu Inter Mutation 40.5 - 22.0
MID-de Inter deletion 38.5 - 24.0
5`-mu 5` end mutation 52.5 - 10.0
5`-de 5` end deletion 53.0 - 9.5
3`-mu 3` end mutation 57.0 - 5.5
3`-de 3` end deletion 56.5 - 6.0
그 결과, 도 5 및 표 2에 나타난 바와 같이, PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고가 결합하는 염기서열 부위의 염기변이 위치와 변이염기 수에 따른 융해곡선의 변화를 측정하였으며, 표적 인공합성 올리고와 PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 가운데 부분 및 끝 부분에 해당하는 염기를 결실시킨 경우, 결실된 염기 수가 많을수록, 결실된 염기 수에 따라 순차적으로 융해온도(Tm)가 줄어드는 것을 확인하였으며, PNA 프로브와 결합하는 염기서열의 가운데 부분의 염기가 변이된 경우, 융해온도(Tm) 차이가 더 큰 것으로 확인되었다.
실시예 3: 리포터와 소광자가 결합된 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이에 따른 용해곡선 분석
상기에서 합성한 인공합성 올리고와 이상 여부를 확인하기 위한 PNA 프로브와 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 인공합성 올리고와 PNA 프로브를 혼합하여 용해곡선을 이용한 분석을 진행하였다. 용해곡선 분석을 위한 조건은 다음과 같다; 총 부피가 20㎕이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 SSB MeltingArrayTM 버퍼(SeaSunBio Real-Time MeltingArrayTM buffer, 시선바이오, 한국), 인공합성 올리고 1㎕/2.5pmol, PNA 프로브 0.5㎕/10pmol, 멸균된 증류수(D.W) 8.5㎕를 첨가하여 실시하였다. 용해곡선 분석을 위한 과정은 90℃에서 3분, 75℃에서 1분의 가열 단계를 거친 다음, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다(도 4).
리포터와 소광자가 결합된 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이 여부를 확인하기 위하여 합성 및 사용 중 발생할 수 있는 형태로 예측 제작하여 융해곡선을 분석하였다. 일반적으로 리포터와 소광자가 결합된 인공합성 올리고의 경우 유전적 변이를 확인하기 위한 프로브로 사용된다. 리포터와 소광자는 실험조건에 따라 위치가 교차될 수 있다. 따라서, 리포터와 소광자가 결합된 형태의 인공합성 올리고를 확인하기 위해서 추가적으로 PNA 프로브 또한 형광과 소광자를 교차하여 실험을 진행하였다(도 6).
리포터와 소광자가 결합된 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이의 분석 시 1개의 튜브에서 5회 반복 실시하였으며, 이들의 평균값을 산출하여 표기하였다. 하기 표 3은 리포터와 소광자가 결합된 비정상 인공합성 올리고의 융해온도를 나타낸 것이다.

이름
타입
평균
온도(℃)
융해온도 차이(℃)
평균
온도(℃)
융해온도 차이(℃)
PROBE-1 PROBE-2
PM Perfect match 62.5 - 62.5 -
5`-1dg-F report and quenching tagging 5` end degradation 60.0 - 2.5 60.0 - 2.5
3`-1dg-F report and quenching tagging 3` end degradation 60.0 - 2.5 60.0 - 2.5
MID-mu-F report and quenching tagging inter mutation 40.5 - 22.0 41.0 - 21.5
MID-de-F report and quenching tagging inter deletion 38.5 - 24.0 38.5 - 24.0
그 결과, 도 6 및 표 3에 나타난 바와 같이, 융해곡선 분석을 통한 표적 인공합성 올리고의 염기 변성 판별을 위하여, 완전한 혼성화를 이루는 인공합성 올리고 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 인공합성 올리고를 4종류의 프로브(FAM-, HEX-, texas Red-, Cy5-labeled)와 혼성화되도록 제조하여 융해곡선을 분석하였으며, 표적 인공합성 올리고 전체 염기서열의 염기 변성위치에 상관없이 염기가 결실 또는 치환된 표적 인공합성 올리고는 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고(perfect match)와 융해온도(Tm) 차이가 발생하는 것을 확인하였으며, 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고, 염기가 결실된 표적 인공합성 올리고 및 염기가 치환된 표적 인공합성 올리고 순으로 융해온도가 낮게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 4: 인공합성 올리고와 PNA 프로브 위치에 따른 융해곡선 분석
상기에서 합성한 인공합성 올리고와 이상 여부를 확인하기 위한 PNA 프로브와 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 인공합성 올리고와 PNA 프로브를 혼합하여 용해곡선을 이용한 분석을 진행하였다. 용해곡선 분석을 위한 조건은 다음과 같다; 총 부피가 20㎕ 이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 SSB MeltingArrayTM 버퍼(SeaSunBio Real-Time MeltingArrayTM buffer, 시선바이오, 한국), 인공합성 올리고 1㎕/2.5pmol , PNA 프로브 0.5㎕/10pmol, 멸균된 증류수(D.W) 8.5㎕를 첨가하여 실시하였다. 용해곡선 분석을 위한 과정은 90℃에서 3분, 75℃에서 1분의 가열 단계를 거친 다음, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다(도 4).
인공합성 올리고의 경우 개체 혹은 염기서열의 특징에 따라서 길이는 서로 다르게 제작하였고, 인공합성 올리고와 PNA 프로브의 결합 범위를 예측하고 각각의 융해곡선 및 융해온도를 분석하였다(도 7).
인공합성 올리고와 PNA 프로브 위치에 따른 융해곡선 및 융해온도 분석 시 1개의 튜브에서 5회 반복 실시하였으며, 이들의 평균값을 산출하여 표기하였다. 하기 표 4는 인공합성 올리고와 PNA 프로브의 결합 위치에 따른 융해온도를 나타낸 것이다.

이름
타입
평균 온도(℃)
융해온도 차이(℃)
PM Perfect match 62.5 -
PM1 Perfect match
(5` end 2 base more)		 62.0 - 0.5
PM2 Perfect match
(3` end 2 base more)		 62.0 - 0.5
그 결과, 도 7 및 표 4에 나타난 바와 같이, 인공합성 올리고와 PNA 프로브 위치에 따른 융해곡선을 분석하기 위하여, 인공합성 올리고의 길이를 서로 다르게 제작하여 인공합성 올리고와 PNA 프로브의 결합범위를 예측하고 각각의 융해곡선 및 융해온도를 분석한 결과 2개의 염기가 추가된 인공합성 올리고의 경우 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고(perfect match)와 융해온도(Tm) 차이가 크지 않음을 확인하였다.
실시예 5: 변성확인을 위한 인공합성 올리고의 상대적 비율에 따른 융해곡선 분석
상기에서 합성한 인공합성 올리고와 이상 여부를 확인하기 위한 PNA 프로브와 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 인공합성 올리고와 PNA 프로브를 혼합하여 용해곡선을 이용한 분석을 진행하였다. 용해곡선 분석을 위한 조건은 다음과 같다; 총 부피가 20㎕ 이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 SSB MeltingArrayTM 버퍼(SeaSunBio Real-Time MeltingArrayTM buffer, 시선바이오, 한국), 인공합성 올리고 1㎕/2.5pmol , PNA 프로브 0.5㎕/10pmol, 멸균된 증류수(D.W) 8.5㎕를 첨가하여 실시하였다. 용해곡선 분석을 위한 과정은 90℃에서 3분, 75℃에서 1분의 가열 단계를 거친 다음, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다(도 4).
인공합성 올리고의 경우 장기간 보관 시 해리되면서 산성화된다. 산성화의 경우 인공합성 올리고의 변성(degradation)을 초래한다. 하지만 변성의 정도는 일시적으로 한 번의 반응에 의하여 일어나지 않으며 순차적으로 진행된다. 따라서 정상적인 인공합성 올리고와 변성을 가장한 인공합성 올리고의 상대적 비율로 혼합 후 PNA 프로브를 이용하여 융해곡선 및 융해온도 분석을 진행하였다(도 8).
PNA 프로브를 이용하여 변성 확인을 위한 인공합성 올리고의 상대적 비율의 분석 시 1개의 튜브에서 5회 반복 실시하였으며 이들의 평균값을 산출하여 표기하였다. 하기 표 5는 변성 인공합성 올리고의 농도에 따른 융해온도를 나타낸 것이다.

PM : 3`-1 dg -F(%)
온도(℃)
융해온도 차이(℃)
100 : 0 62.5 -
90 : 10 62.0 - 0.5
80 : 20 62.0 - 0.5
70 : 30 61.5 - 1.0
60 : 40 60.5 - 2.0
50 : 50 60.0 - 2.5
40 : 60 59.5 - 3.0
30 : 70 59.0 - 3.5
20 : 80 58.5 - 4.0
10 : 90 55.0 - 7.5
0 : 100 54.5 - 8.0
그 결과, 도 8 및 표 5에 나타난 바와 같이, 표적 인공합성 올리고의 불량비율을 판단하기 위해, 완전한 혼성화를 보이는 표적 인공합성 올리고(perfect match)와 변성된 표적 인공합성 올리고의 비율을 변경하면서 융해온도 차이를 측정하였고, 변성된 표적 인공합성 올리고의 비율이 높을수록 융해온도의 차이가 크게 나타남을 확인하였으며, 본 발명의 PNA를 이용한 표적 인공합성 올리고의 염기 변성을 판별하는 방법이 표적 인공합성 올리고의 변성비율을 판단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 인공합성 올리고의 이상 여부 확인을 위한 기계 별 융해곡선 분석
상기에서 합성한 인공합성 올리고와 이상 여부를 확인하기 위한 PNA 프로브와 융해곡선 분석을 위하여 PCR은 CFX96TM Real-Time 시스템(Bio-Rad 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 인공합성 올리고와 PNA 프로브를 혼합하여 용해곡선을 이용한 분석을 진행하였다. 용해곡선 분석을 위한 조건은 다음과 같다; 총 부피가 20㎕ 이 되도록 2X 시선바이오 리얼타임 SSB MeltingArrayTM 버퍼(SeaSunBio Real-Time MeltingArrayTM buffer, 시선바이오, 한국), 인공합성 올리고 1㎕/2.5pmol, PNA 프로브 0.5㎕/10pmol, 멸균된 증류수(D.W) 8.5㎕를 첨가하여 실시하였다. 용해곡선 분석을 위한 과정은 90℃에서 3분, 75℃에서 1분의 가열 단계를 거친 다음, 40℃에서 80℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 5초간 정지 상태를 유지하였다(도 4).
변성, 치환, 결실을 가장한 인공합성 올리고를 이용하여 분석이 가능한 실시간 유전자 증폭기(Real-Time PCR)의 기계 별 차이를 확인하고자 CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad 사)과 LightCycler®96(Roche 사)을 이용하여 분석을 진행하였다(도 9).
PNA 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 기계 별 차이 분석 시 1개의 튜브에서 5회 반복 실시하였으며 이들의 평균값을 산출하여 표기하였다. 하기 표 6은 인공합성 올리고의 이상 여부 확인을 위한 기계 별 융해온도를 나타낸 것이다.

이름
타입
평균
온도(℃)
융해온도 차이(℃)

평균
온도(℃)
융해온도 차이(℃)

CFX96TM
LightCycler®96
PM Perfect match 62.5 - 65.66 -
5`-1dg-F report and quenching tagging 5` end degradation 60.0 - 2.5 63.55 - 2.11
3`-1dg-F report and quenching tagging 3` end degradation 60.0 - 2.5 63.54 - 2.12
MID-mu-F report and quenching tagging inter mutation 40.5 - 22.0 46.71 - 18.95
MID-de-F report and quenching tagging inter deletion 38.5 - 24.0 44.80 - 20.86
그 결과, 도 9 및 표 6에 나타난 바와 같이, 실시간 유전자 증폭기의 기계 유형에 따른 인공합성 올리고의 변성 및 염기변이 여부를 확인하기 위하여 변성을 가장한 올리고를 인위적으로 합성하고 이를 이용하여 융해곡선 및 융해온도를 분석한 결과, 기계 유형에 따른 분석 결과의 차이는 크지 않은 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Seasunbiomaterials <120> Method for Ensuring Quality of Synthetic Oligo Using Peptide Nucleic Acid Probe <130> P14-B292 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PROBE-1 <400> 1 tcatgccgct gct 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PROBE-2 <400> 2 tcatgccgct gct 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM <400> 3 agtacggcga cga 13 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM1 <400> 4 cgagtacggc gacga 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM2 <400> 5 agtacggcga cgacg 15 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5`-1dg <400> 6 gtacggcgac ga 12 <210> 7 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5`-2dg <400> 7 tacggcgacg a 11 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3`-1dg <400> 8 agtacggcga cg 12 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3`-2dg <400> 9 agtacggcga c 11 <210> 10 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MID-mu <400> 10 agtacgccga cga 13 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MID-de <400> 11 agtacgcgac ga 12 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5`-mu <400> 12 actacggcga cga 13 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5`-de <400> 13 atacggcgac ga 12 <210> 14 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3`-mu <400> 14 agtacggcga cca 13 <210> 15 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3`-de <400> 15 agtacggcga ca 12 <210> 16 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PM-F <400> 16 agtacggcga cga 13 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5`-1dg-F <400> 17 gtacggcgac ga 12 <210> 18 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3`-1dg-F <400> 18 agtacggcga cg 12 <210> 19 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MID-mu-F <400> 19 agtacgccga cga 13 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MID-de-F <400> 20 agtacgcgac ga 12

Claims (59)

  1. 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 이용하는 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별을 위한 융해곡선 분석방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변성은 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 융해곡선 분석방법.
  9. 다음 단계를 포함하는 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별방법:
    (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 판별하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 변성은 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  17. 제9항에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 판별하는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별방법.
  18. 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 PNA 프로브와 말단 염기가 변성(degradation)된 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이 판별용 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이를 가지는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  20. 제18항에 있어서, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  22. 제18항에 있어서, 상기 변성은 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  23. 제18항에 있어서, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  24. 제18항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  25. 제18항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 염기서열 차이 판별용 키트.
  26. 다음 단계를 포함하는 말단 염기가 변성(degradation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법:
    (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적 인공합성 올리고의 품질을 판별하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 변성은 올리고 염기의 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 변성은 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법
  32. 제26항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  33. 제26항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  34. 제26항에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 분석하여 표적 인공합성 올리고의 품질을 판별하는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사방법.
  35. 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 말단 염기가 변성(degradation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  37. 제35항에 있어서, 상기 말단 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  38. 제35항에 있어서, 상기 변성은 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  39. 제35항에 있어서, 상기 변성은 올리고 염기의 결실, 치환 또는 삽입으로 변성이 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  40. 제35항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  41. 제35항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  42. 제35항에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기서열 차이를 분석하여 표적 인공합성 올리고의 품질을 판별하는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 품질 검사용 키트.
  43. 다음 단계를 포함하는 염기가 염기변이(mutation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법:
    (a) 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브 및 프라이머를 표적 인공합성 올리고와 혼합시켜 PNA 프로브와 표적 인공합성 올리고를 혼성화시키는 단계;
    (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하여, 표적 인공합성 올리고의 염기변이 유무를 검출하는 단계.
  44. 제43항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기변이를 가지는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 염기변이는 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 염기변이는 올리고 염기의 결실, 치환 또는 삽입인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  48. 제43항에 있어서, 상기 염기변이는 표적 인공합성 올리고를 유통 또는 보관하는 단계에서 발생하는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법
  49. 제43항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  50. 제43항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  51. 제43항에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기변이 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출방법.
  52. 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 PNA 프로브를 포함하고, 융해곡선 분석법을 이용한 염기가 염기변이(mutation)되는 것으로 추정되는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  53. 제52항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 표적 인공합성 올리고의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기변이를 가지는 표적 인공합성 올리고와는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  54. 제52항에 있어서, 상기 염기는 표적 인공합성 올리고의 5' 말단(5' end) 또는 3' 말단(3' end)에 위치하는 염기인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  55. 제52항에 있어서, 상기 염기변이는 1개 또는 2개 이상의 염기에서 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  56. 제52항에 있어서, 상기 염기변이는 올리고 염기의 결실, 치환 또는 삽입으로 변성이 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  57. 제52항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  58. 제52항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, CY3 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
  59. 제52항에 있어서, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고를 사용하고, PNA 프로브에 표지되는 리포터를 표적 인공합성 올리고 별로 다르게 하여, 2개 이상의 표적 인공합성 올리고의 염기변이 유무를 검출하는 것을 특징으로 하는 표적 인공합성 올리고의 염기변이 검출용 키트.
KR1020140188539A 2014-12-24 2014-12-24 Pna 프로브를 이용한 인공합성 올리고의 품질보증 방법 KR102266987B1 (ko)

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