KR20160067578A - 유기태화 셀렌 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 비가열 제조방법 - Google Patents

유기태화 셀렌 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 비가열 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글라이코마크로펩타이드 분말과 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말을 혼합한 후, 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 및 상기 제1반응 단계의 반응물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법에 관한 것으로, 종래 합성 N-아세틸뉴라민산에 비하여 항균 활성이 우수하고, 항균 활성을 부여함과 동시에 유기태화 미네랄의 공급원으로 사용할 수 있다는 점에서 식품 또는 사료 등의 첨가제로서 활용될 수 있다.

Description

유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법 {Preparation method for glycomacropeptide hydrolysate with high content of organic mineral}
본 발명은 항균 활성을 갖는 유기태 미네랄 공급원의 제조방법에 관한 것이다. 특히 헬리코박터 파이롤리에 대한 항균 활성이 뛰어나면서 유기태 미네랄 공급원을 될 수 있는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
동식물의 정상적인 성장에는 필수적으로 일정량의 미네랄이 필요하다. 인간을 포함하는 동물에서도 칼슘, 아연, 마그네슘, 칼륨, 철, 구리, 셀렌, 크롬, 몰리브덴 및 요오드 등의 미네랄 필요하고, 이러한 미네랄은 동물 조직에서 차지하는 비율은 대단히 적지만 골격을 형성하고, 체내 삼투압을 조절하며, 체액의 산-염기 평형을 유지시키고, 효소계의 활성제로 또는 효소 자체의 구성성분으로 관여하는 등 그 역할이 다양하다.
그러나 미네랄은 체내에서 합성될 수 없으므로 외부로부터 공급되어야 하며, 주로 염산염, 황산염, 질산염, 인산염, 탄산염 등의 무기태 미네랄의 형태로 공급되지만, 무기태 미네랄은 생체 이용율이 매우 낮다.
반면에 유기태 미네랄은 생체 이용율은 높지만 가격이 높거나 위생적인 문제로 인하여 식품, 의약, 사료, 비료 등의 미네랄 급원으로 널리 사용하는데에는 한계에 직면해 있다.
한국특허공보 제10-0513011호는 칼슘과 고분자 핵산물질을 결합시킨 가용성 칼슘-핵산물질 복합체를 제조하고 있으나, 연어 정소에서 추출한 고분자 핵산물질을 사용하여 위생상 문제가 있을 수 있고, 제조방법이 복잡하며, 생산비용은 높은 반면 생산수율이 낮고, 칼슘 이외의 다른 미네랄의 유기태화가 가능한지 불확실하다는 한계가 있었다.
또한 한국특허공보 제10-1166546호는 살균처리되지 않은 유청 분말에 칼슘을 결합시켜 유기태화 칼슘 강화 유단백질을 제조하고 있으나, 원료가 되는 살균처리되지 않은 유청 분말의 확보가 용이하지 않고, 생산수율이 낮으며, 가열 공정이 포함되어 에너지 비용이 상승하고, 칼슘 이외의 다른 미네랄의 유기태화가 가능한지 불확실하다는 한계가 있었다.
본 발명은 글라이코마크로펩타이드에 미네랄을 결합시켜 생체이용율이 높은 유기태화 미네랄이 강화되고, 동시에 항균 활성을 갖는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 글라이코마크로펩타이드 분말과 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말을 혼합한 후, 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%로 조정하는 에탄올 혼합 단계; 및 상기 에탄올 혼합 단계에서 얻어진 침전물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
상기 제2반응 단계의 침전물 또는 그 침전물을 물로 희석한 희석액에 잔류하는 에탄올 함량은 5 중량% 이하일 수 있다.
상기 글라이코마크로펩타이드 분말에 포함된 유단백 100 중량부에 대하여, 상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말 5 내지 500 중량부 첨가할 수 있다.
상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말의 1 내지 50 배 중량의 물을 혼합할 수 있다.
상기 제1반응 단계의 반응은 10 내지 100 ℃에서 15 분 내지 5일 동안 수행될 수 있다.
상기 미네랄은 칼슘, 아연, 마그네슘, 칼륨, 철, 구리, 셀렌, 크롬, 몰리브덴 및 요오드 중에서 선택되는 어느 하나의 미네랄 또는 둘 이상의 복합 미네랄일 수 있다.
상기 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 유기태화 미네랄 0.1 내지 10 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 99 중량%를 함유할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조되고, 유기태화 미네랄 0.1 내지 10 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 99 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 제공한다.
본 발명은 글라이코마크로펩타이드에 미네랄을 결합시켜 생체이용율이 높은 유기태화 미네랄이 강화되고, 동시에 항균 활성을 갖는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공한다. 상기 제조된 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 식품, 의약, 사료 또는 비료 등 광범위한 분야에서 무기태 미네랄을 대체하면서, 무기태 미네랄에 비해 생체이용율이 뛰어나므로 소량 사용만으로도 충분한 미네랄 공급 효과를 달성하면서 과량의 무기태 미네랄 사용으로 인한 변색, 이미, 이취의 발생을 방지할 수 있고, 동시에 뛰어난 항균 활성을 나타낼 수 있다.
도 1은 참고예 3에서 제조된 유기태화 미네랄 강화 유단백질의 사진이다.
도 2의 A는 농도별로 에탄올을 혼합한 시료의 사진이고, B는 A의 시료를 원심분리 한 후의 사진으로, 1은 제조예 1-1, 2는 제조예 2-7, 3은 제조예 2-6, 4는 제조예 2-5, 5는 제조예 2-4, 6은 제조예 2-3, 7은 제조예 2-2 및 8은 제조예 2-1의 사진이다.
도 3의 좌측 사진은 제조예 3-1, 우측 사진은 제조예 3-2이고, A는 GMP와 염화칼슘 분마을 혼합하고 물을 혼합하여 60 분 동안 교반한 제1단계 반응물의 사진이며, B는 제1단계 반응물에 반응물과 에탄올의 중량비율이 4:6이 되도록 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이고, C는 침전물을 동결건조한 후의 사진이며, D는 상등액을 동결건조한 후의 사진이다.
도 4는 제조예 4에서 상기 N-아세틸뉴라민산의 함량을 측정한 크로마토그램을 나타낸 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 5는 제조예 4에서 입도 분석 결과를 나타낸 그래프로서, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 6은 제조예 4에서 XRD를 통해 결정구조분석을 실시한 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 7의 A는 제조예 5에서 제1단계 반응 후의 사진이고, B는 제1단계 반응물에 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이다. 1부터 4까지는 각각 제조예 5-1-1부터 제조예 5-1-4이고, 5부터 9까지는 각각 제조예 5-2-1부터 제조예 5-2-5까지이고, 10 및 11은 각각 제조예 5-3-1 및 5-3-2이다.
도 8은 실험예 2에서, A는 무처리구, B는 GMP 처리군, C는 S-NANA 처리군, D는 CaNANA-GMP 처리군의 24 시간 배양 후의 플레이트 사진이고, 2-1부터 2-4까지는 GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 3-1부터 3-2까지는 S-NANA를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 4-1부터 4-2까지는 CaNANA-GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이다.
본 발명은 글라이코마크로펩타이드 분말과 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말을 혼합한 후, 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%로 조정하는 에탄올 혼합 단계; 및 상기 에탄올 혼합 단계에서 얻어진 침전물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
상기 글라이코마크로펩타이드는 카파-카제인의 친수성 부분으로, 이를 분리하는 방법은 산업적으로 잘 확립되어 있다. 예를 들어 치즈의 제조를 위해 우유로부터 카제인 분획을 분리하거나 또는 우유를 응유효소, 예를 들어 송아지 키모신("레닛")과 배양시킨다. 키모신은 상기 카파-카제인의 Phe(105)-Met(106) 펩타이드 결합을 매우 선택적으로 절단하므로, 상기 효소 반응에 의해 상기 카파-카제인의 친수성 글라이코마크로펩타이드 부분을 절단하며 이에 의해 상기 카제인 분획이 즉시 응집되고 침전된다. 이때 카파-카제인의 글라이코마크로펩타이드 부분이 잘라짐에 따라, 친수성 글라이코마크로펩타이드는 용액 중에서 다양한 유청 단백질들과 함께 남아 소위 치즈 또는 스위트 유장을 형성한다. 상기 치즈 또는 스위트 유장의 다른 유청단백질로부터 글라이코마크로펩타이드가 분리될 수 있다.
상기 글라이코마크로펩타이드 분말의 유단백 함량은 50 내지 100 중량%, 바람직하게는 75 내지 95 중량%으로, 원료의 종류, 제조방법 및 제조사에 따라 유단백 함량은 변화할 수 있다.
상기 글라이코마크로펩타이드 분말에 포함된 유단백 100 중량부에 대하여, 상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말 5 내지 500 중량부, 바람직하게는 20 내지 250 중량부, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 중량부 첨가된다. 상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말 함량이 상기 하한치 미만이 경우에는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 유기태화 미네랄 함량을 원하는 수준으로 증가시키는데에 한계가 있고, 상기 상한치를 초과하더라도 미네랄의 유기태화에 소요되는 기질인 유단백 함량이 한계에 다다를 수 있어 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 유기태화 미네랄 함량이 더 증가하지 않고, 투입된 무기태 미네랄 대비 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드의 생산수율이 오히려 감소한다.
상기 물은 식품, 의약, 사료 또는 비료나 그 첨가제에 사용되는 물이면 특별히 제한할 필요가 없으나, 바람직하게는 다른 금속염의 영향을 적게하기 위해 탈이온수를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 제1반응 단계에서 혼합하는 물의 양은 상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말의 1 내지 50 배, 바람직하게는 5 내지 40 배, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 배이다. 상기 혼합하는 물의 양이 너무 적은 경우 상기 글라이코마크로펩타이드 분말과 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말을 용해시키기 어려울 수 있고, 혼합하는 물의 양이 너무 많을 경우 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말과 물의 혼합에 따른 발열 반응이 충분치 못하여 별도의 가열 공정이 필요하게 되므로 제조비용이 상승할 수 있다.
상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말은 표준 상태에서의 물에 대한 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말로, 바람직하게는 용해엔탈피가 -400 내지 - 5 kJ/mol, 더욱 바람직하게는 -200 내지 -10 kJ/mol로서 물에 용해되어 발열반응을 일으킨다.
상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말은 목표로 하는 유기태화 미네랄의 종류에 따라 미네랄의 종류를 통상의 기술자가 선택할 수 있다. 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄의 경우 수용액 상에서 반응하게 될 경우, 특히 소량의 물과 혼합되었을 때 이온화되지 않고 발열 반응을 일으키면서 미네랄과 유단백질의 킬레이트 결합이 형성될 수 있도록 한다.
상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말은 복수의 서로 다른 미네랄을 순차적으로 또는 동시에 혼합할 수 있다. 복수의 서로 다른 미네랄 분말을 혼합하는 경우 그 중의 적어도 하나의 미네랄 분말만 본 발명의 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말이면 충분하고, 그 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말이 다른 미네랄의 킬레이트 결합을 촉진한다.
상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말은 통상의 기술자에게 널리 알려져 있고, 예를 들어 염화칼슘(CaCl2 , CaCl2·H2O, CaCl2·2H2O) 분말, 염화마그네슘(MgCl2, MgCl2·2H2O, MgCl2·4H2O) 분말, 염화알루미늄(AlCl3, AlCl3·6H2O) 분말 등의 염화물 분말, 황산마그네슘(MgSO4, MgSO4·H2O, MgSO4·4H2O), 황산 알루미늄(Al2(SO4)3), 황산칼슘(CaSO4, CaSO4·1/2 H2O, CaSO4·2 H2O) 등의 황산염 분말, 산화칼슘(CaO) 분말, 이산화셀레늄(SeO2) 분말 등의 산화물 분말 등이 필요에 따라 선택될 수 있다.
상기 제1반응 단계의 반응은 10 내지 100 ℃에서 10 분 내지 5일 동안 수행될 수 있다. 별도의 가열처리 없이 상온에서 반응시킬 수 있고, 별도의 가열처리가 없더라도 제1반응은 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말과 물의 혼합에 따른 발열 반응의 반응열에 의해 반응 온도가 상승한다. 별도의 가열처리 없이 반응시켜 얻은 제1반응 단계의 반응물은 반응물의 생성을 육안으로 확인하기 어렵지만 원심분리, 예를 들어 500 ~ 50,000 rpm에서 1 ~ 60 분 원심분리를 통해 명확한 침전을 형성하지는 않지만 하부에 겔상이 형성된다.,
상기 제1반응 단계의 반응을 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 70 내지 90 ℃에서 가열할 경우, 반응물은 원심분리를 하지 않더라도 겔상의 반응물을 형성한다.
상기 제1반응 단계의 가열처리하지 않은 반응물 또는 가열처리한 반응물은 원심분리, 예를 들어 500 ~ 50,000 rpm에서 1 ~ 60 분 원심분리를 통해 침전물과 상등액이 명확히 구별되지 않고 뿌연 흰색 겔상이 형성된다. 상기 제1반응 단계에서 생성되는 미네랄이 킬레이트 결합된 글라이코마크로펩타이드가 상기 겔상의 물질을 형성하는 것으로 보이나, 원심분리 rpm을 증가시키더라도 이를 명확히 분리하기는 어렵고, 따라서 상업적으로 활용가능한 수준으로 생산 수율을 증가시킬 수 없다.
본 발명에서 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 생산수율을 증대시키기 위해서 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%, 바람직하게는 60 내지 80 중량%로 조정하는 에탄올 혼합 단계를 수행한다.
상기 에탄올 농도 미만에서는 제1반응 단계의 반응물이 겔상을 유지하여 명확히 침전물로 분리되기 어렵고, 상기 에탄올 농도 초과 범위를 위해서는 에탄올의 사용량이 너무 많아 다음 공정에서 에탄올 제거에 비용이 오히려 증가한다.
상기 에탄올로는 주정을 사용할 수 있고, 상기 에탄올 수용액은 70 내지 100 중량%의 에탄올을 함유하는 에탄올 수용액, 바람직하게는 75 내지 98 중량%의 에탄올을 함유하는 에탄올 수용액을 사용할 수 있다.
상기 제2반응 단계의 침전물 또는 그 침전물을 물로 희석한 희석액에 잔류하는 에탄올 함량은 5 중량% 이하, 바람직하게는 0.001 내지 2 중량% 이하로 잔류 에탄올 농도를 낮추어야 뉴라미니다아제 활성에 미치는 영향을 최소화할 수 있다.
상기 제2반응 단계의 침전물에서 잔류 에탄올 함량을 낮추기 위해 특별히 한정할 필요는 없으나, 감압 또는 건조 등의 방법이 활용될 수 있다.
상기 제2반응 단계에서 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 생산수율 증대를 위해 10 내지 65 ℃, 바람직하게는 35 내지 55 ℃에서 반응시킨다. 상기 반응 온도의 상한치를 초과하거나 상기 하한치 미만이 될 경우 뉴라미니다아제의 활성이 낮아, N-아세틸뉴라민산의 함량이 저하되고, 이에 따라 항균 활성이 저하될 수 있다.
더욱 바람직하게는 상기 제2반응 단계는 글라이코매크로펩타이드 3 내지 10 중량% 함유하는 제1반응 단계의 반응물에 글라이코매크로펩타이드 단위 g 당 0.05 내지 0.5 U의 뉴라미니다아제를 투입하여 pH 4 내지 6에서 35 내지 55 ℃에서 2 내지 10 시간 반응시킨 후 효소를 실활시켜 효소분해물을 제조한다.
상기 제1반응 단계 및 상기 제2반응 단계에서 반응 시간은 15 분 내지 5 일, 바람직하게는 20 분 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 25 분 내지 12 시간, 가장 바람직하게는 30분 내지 2 시간이다. 상기 제1반응 단계의 반응시간이 상기 범위를 벗어나면 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물에서 킬레이트된 미네랄 함량이 감소할 수 있고, 상기 제2반응 단계의 반응시간이 상기 범위를 벗어나면 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 N-아세틸뉴라민산의 함량이 저하될 수 있다.
상기 수용성 미네랄 분말로 염화물 또는 황산염을 사용하는 경우 미네랄이 킬레이트화되는 양이 증가함에 따라 염소 이온 또는 황산 이온의 함량이 증가한다. 이러한 증가된 염소 이온 또는 황산 이온은 물로 세척하는 공정으로 간단히 제거될 수 있다. 예를 들어 염화칼슘을 용해하기 위해 사용된 물의 부피의 0.5 ~ 10 배의 물, 바람직하게는 1 ~ 2 배의 물을 사용하여 1 ~ 5회 반복 세척을 통해 염소 이온의 농도를 무해한 수준으로 낮출 수 있다. 상기 세척은 적절한 양의 물을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제거하는 방식, 예를 들어 500 ~ 50,000 rpm에서 1 ~ 60 분 원심분리할 수 있고, 이러한 원심분리과정은 온도 조건 설정없이 실온에서 수행될 수 있으나, 25 ℃ 이하, 바람직하게는 15 ℃ 이하로 온도를 일정하게 설정하여 수행될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조되는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물을 제공한다. 상기 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 유기태화 미네랄 0.1 내지 10 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 99 중량%를 함유할 수 있다.
상기 미네랄은 칼슘, 아연, 마그네슘, 칼륨, 철, 구리, 셀렌, 크롬, 몰리브덴 및 요오드 중에서 선택되는 어느 하나의 미네랄 또는 둘 이상의 복합 미네랄일 수 있다. 바람직하게는 칼슘, 아연, 철, 구리 또는 이들 중 어느 하나와 다른 미네랄의 복합 미네랄이다.
상기 본 발명의 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 열풍건조, 분무건조, 동결건조 등 적절한 방법을 통해 건조시켜 분말 형태로 이용하는 것이 사용에 편리하다.
이하 본 발명을 참고예, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 제1반응 단계의 반응온도에 따른 킬레이트된 미네랄 분석
1) 시료의 제조방법
치즈 제조 후 생성되는 유청을 농축 후 건조하여 제조된 유청분말(매일유업, 이하 'WPS'라고도 함)을 시료로 사용하였다. 상기 유청분말의 단백질 함량은 14 중량%, 지방 함량은 7 중량%, 회분 함량은 0.5 중량%, 나머지는 탄수화물이었고, 상기 유청분말은 5 분 이상의 가열 또는 살균 처리를 행하지 않은 것이었다.
상기 WPS를 물에 25 중량%로 희석하여 혼합하고, 대조군은 WPS(CNTL)은 가열처리하지 않고, 나머지는 각각 60, 70, 80 및 90 ℃로 30 분간 가열하여, WPS가 보유한 고유의 미네랄의 킬레이트화 정도를 비교하였다. 상기 가열처리한 실험군은 25 ℃에서 3,000rpm으로 20분 원심분리에 의해 침전물과 상등액으로 구분되었다. 상기 침전물에 2 배 중량의 정제수를 혼합 및 교반한 후 상기 조건과 동일하게 원심분리하는 세척과정을 5회 반복한 후 동결건조하였다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
가열처리하지 않은 WPS(CNTL)에 포함된 WPS 고유 미네랄 함량은 칼슘 4,700ppm, 칼륨 21,910ppm, 마그네슘 988ppm, 망간 6,776ppm, 인 6,620ppm, 그리고 황 1,327ppm으로 총 42,363ppm이 검출되었고, 나머지 미네랄들은 10ppm 미만이었다.
가열온도에 따른 킬레이트된 미네랄의 함량은 80 ℃ 처리군이 96,616ppm으로WPS(CNTL) 대비 2.28배의 증가하였고, 70 ℃ 처리군(91,898ppm)은 2.17배, 90 ℃ 처리군(81,413ppm)은 1.92배, 그리고 60 ℃ 처리군(77,991ppm)은 1.84배 순이였다.
WPS(CNTL) 대비 나트륨을 제외한 모든 미네랄 수치가 현저히 증가하였다. 먼저 칼슘의 경우 WPS(CNTL) 대비 4.7 내지 8 배 증가되었고, 철은 5 내지 44 배, 아연은 5.5 내지 9.4 배, 구리는 1.36 내지 105 배, 그리고 마그네슘은 2.6 내지 3.8 배 등 전체적으로 현저히 증가하였다.
따라서 제1반응 단계는 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 70 내지 90 ℃에서 수행될 수 있고, 이는 본 참고예 1과 같이 별도의 가열처리를 통해 상기 온도에서 반응이 이루어질 수도 있지만, 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말이 별도로 첨가되는 경우 상기 미네랄과 물의 발열반응에 따른 반응온도의 증가로도 상기 조건은 달성될 수 있을 것으로 예상되었다.
참고예 2: 제1반응 단계의 반응시간에 따른 킬레이트된 미네랄 분석
1) 시료의 제조방법
상기 참고예 1에서 가장 높은 미네랄 킬레이트 활성을 나타내었던 80 ℃로 반응온도를 설정하고, 반응시간은 10, 30, 60, 120 및 180 시간으로 늘려가면서 가열하여, WPS가 보유한 고유의 미네랄의 킬레이트화 정도를 비교하였다. 상기 가열처리한 실험군은 참고예 1과 동일하게 원심분리 및 세척 후 동결건조하였다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
가열시간 10분째까지는 총 미네랄 함량에서 거의 변화가 없었으나, 30 분째에는 WPS에 비해서 킬레이트된 미네랄 함량이 1.94 배로 증가하였다가, 60 분, 120 분, 180 분까지 시간이 증가하면서 1.84 배, 1.79 배, 1.75 배로 서서히 감소하였다.
따라서 가열시간은 적어도 10 분을 초과하여 15 분 이상, 바람직하게는 20 분 이상, 더욱 바람직하게는 30 분 이상 처리하는 것이 바람직하고, 그 이상 가열처리할 수도 있으나, 가열시간이 길어지면 오히려 킬레이트되는 미네랄 함량이 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다.
참고예 3: 제1반응 단계에서 미네랄 종류에 따른 킬레이트된 미네랄 분석 및 생산수율 확인
1) 시료의 제조방법
참고예 1의 WPS 5 중량부(유단백 기준 0.7 중량부)에 대하여, 수용성 미네랄 분말로 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본], 황산제1철[FeSO4·7H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말, 황산아연[ZnSO4·7H2O, 빅솔, 한국] 분말, 황산동[CuSO4·5H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말 및 이산화셀레늄[SeO2] 분말을 2 중량부 분말을 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 10 중량부를 혼합하여 500 rpm으로 10 분 동안 교반하고, 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반하였다. 상기 반응물은 참고예 1과 동일하게 원심분리할 경우 침전물과 상등액으로 분리되었고, 얻어진 침전물을 원심분리 및 세척 후 동결건조하였다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 표 3에 나타내었다. 상기 제조된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 '(사용한 미네랄)-(사용한 유제품)'으로 나타내었고, 그 사진을 도 1에 나타내었다.
Figure pat00003
상기 미네랄 강화 유단백질들은 각각 사용된 수용성 미네랄 분말의 종류에 따라 해당 미네랄이 WPS의 유단백질에 킬레이트 되어 해당 미네랄의 함량이 현저히 증가되었음을 확인할 수 있었다.
다만 사용된 WPS의 함량 대비, 5회 세척 후 동결건조하여 얻은 유기태화 미네랄 강화 유단백질의 생산수율은 6 내지 14 중량%로 매우 낮았기 때문에, 산업적 응용을 위해 생산수율을 증대시킬 수 있는 방법의 모색이 필요함을 알 수 있었다.
참고예 4: 제1반응 단계의 다종 미네랄 투입에 따른 킬레이트된 미네랄 분석 및 생산수율 확인
1) 시료의 제조방법
복수의 미네랄을 함께 혼합했을 때에도, 상기 미네랄들이 각각 유단백질에 킬레이트 되는지를 확인하기 위하여, 참고예 1의 WPS 5 중량부(유단백 기준 0.7 중량부)에 대하여, 수용성 미네랄 분말로 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본], 황산제1철[FeSO4·7H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말, 황산아연[ZnSO4·7H2O, 빅솔, 한국] 분말, 황산동[CuSO4·5H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말 및 이산화셀레늄[SeO2] 분말 중에서 선택되는 각각의 미네랄 분말 1 중량부를 2종 또는 3종 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 10 중량부를 혼합하여 500 rpm으로 10 분 동안 교반하고, 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반하였다. 상기 반응물은 참고예 1과 동일하게 원심분리할 경우 침전물과 상등액으로 분리되었고, 얻어진 침전물을 원심분리 및 세척 후 동결건조하였다.
염화칼슘만 첨가한 실험군은 Ca-WPS, 그리고 염화칼슘을 기본으로 하되 별도로 1종 또는 2종의 미네럴을 추가로 동시 유기태화 시킨 실험군을 각각 (Ca+Cu)-WPS, (Ca+Se)-WPS, (Ca+Zn)-WPS, (Ca+Fe)-WPS 그리고 (Ca+Fe+Se)-WPS로 명명하였다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 표 4에 나타내었다.
Figure pat00004
염화칼슘만을 단독으로 사용한 Ca-WPS는 칼슘 함량이 34,260ppm이었고, 2 종의 미네랄을 동시 킬레이팅시킨 (Ca+Cu)-WPS는 칼슘 30,250ppm 및 구리 27,090ppm이었고, (Ca+Se)-WPS는 셀레늄만 14,440ppm을 보유하고 있었고, (Ca+Zn)-WPS소재는 칼슘 2,100ppm 및 아연 19,040ppm이었으며, (Ca+Fe)-WPS는 칼슘 38,730ppm 및 철 39,980ppm이었다.
3 종의 미네랄을 동시에 킬레이팅시켜 제조한 (Ca+Fe+Se)-WPS는 칼슘 65,840 ppm, 철 39,020 ppm 그리고 셀레늄 114,500ppm이었다.
WPS 5 중량부에 대하여 미네랄 분말 합계 2 중량부가 혼합된 2 종 미네랄이 투입된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 WPS 함량 대비 생산수율이 4.3 내지 14.5 % 이었고, WPS 5 중량부에 대하여 미네랄 분말 합계 3 중량부가 혼합된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 32.2 %까지 생산수율이 증가하였다.
참고예 5: 제1반응 단계에서 탈지분유 기질 및 가열처리 여부에 따른 킬레이트된 미네랄 분석 및 생산수율 확인
1) 시료의 제조방법
유기태화 기질로 유청분말 대신 탈지분유(단백질 함량 35 중량%)를 사용하는 것이 가능한지 확인하였고, 제1반응 단계의 반응조건에서 80 ℃에서 30분 동안 가열처리한 실험군과 별도의 가열처리하지 않은 실험군으로 나누어 유기태화 미네랄 강화 유단백질을 제조하였다.
탈지분유 10 중량부(유단백 기준 3.5 중량부)와 수용성 미네랄 분말로 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본], 황산제1철[FeSO4·7H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말, 황산아연[ZnSO4·7H2O, 빅솔, 한국] 분말, 황산동[CuSO4·5H2O, Yakuri Pure Chemical] 분말 및 이산화셀레늄[SeO2] 분말 중에서 선택되는 각각의 미네랄 분말 5 중량부를 분말 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 100 중량부를 혼합하여 500 rpm으로 10 분 동안 교반하고, 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반한 가열처리 실험군과 500 rpm으로 10 분 동안 교반하고, 30 분 동안 150 rpm으로 교반한 비열처리 실험군으로 구분하였다. 상기 반응물은 참고예 1과 동일하게 원심분리할 경우 침전물과 상등액으로 분리되었고, 얻어진 침전물을 원심분리 및 세척 후 동결건조하였다.
상기 제조된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 '(사용한 미네랄)-(가열여부)(사용한 유제품)'으로 나타내었고, 사용한 미네랄에서 'M'은 상기 5종의 미네랄을 각 1 중량부씩 혼합하여 5 중량부 사용한 것이다.
2) 실험결과
상기 각각의 실험군에 함유된 미네랄 함량은 IPC방법으로 통해 분석하여 비열처리 실험군은 표 5에, 가열처리 실험군은 표 6에 나타내었다.
Figure pat00005
SMP는 침전물 획득이 불가능하여 생산수율이 0% 이었고, Ca-NHSMP, Fe-NHSMP 및 Cu-NHSMP는 침전물은 생성되었으나 생산수율은 2 % 미만으로 정확한 측정이 어려웠다. 그러나 Zn-NHSMP와 Se-NHSMP 그리고 5종의 미네럴을 복합 처리한 M-NHSMP처리구는 32.8%, 28.9% 그리고 77.9%의 높은 생산수율을 보였다.
SMP에 함유된 칼슘은 10,800ppm, 철은 4ppm, 아연은 31.6ppm, 구리는 0ppm, 셀레늄은 4.61ppm 등을 나타내었다.
Ca-NHSMP는 생산수율은 낮았지만 칼슘 함량이 70,520 ppm으로 SMP의 약 7 배이상 증가하였고, 역시 생산수율이 낮았던 Fe-NHSMP의 경우도 철 함량이 14,000 ppm으로 약 3,500배, Cu-NHSMP는 구리 함량이 약 36,000ppm이상으로 현저히 증가하였다.
생산수율이 약 33%로 높았던 Zn-NHSMP는 아연 함량이 16,000ppm으로 SMP 대비 약 508배, Se-NHSMP는 56,310ppm으로 약 13,000배 이상을 상회하였으며, 가장 높은 생산수율(77.9%)을 보였던 복합미네랄 처리군인 M-NHSMP의 경우는 5종 미네럴중 칼슘은 59,690ppm, 철은 12,910ppm 그리고 셀레늄의 함유량이 47,900ppm으로 높게 나타났는데 아연과 구리이온의 경우는 낮게 나타남으로서, 투입된 미네랄들에서 이온경쟁성을 나타내는 것으로 추정되었다.
상기 결과로부터 제1반응 단계에서 칼슘, 철, 구리 미네랄 분말의 경우 생산수율이 낮았지만, 제조된 유기태화 미네랄 강화 유단백질은 현저히 증진된 미네랄 함량을 나타내므로, 생산수율만 증진시킬 수 있다면 제1반응 단계를 비열처리 조건으로 수행하는 것도 가능할 것으로 판단하였다.
제1반응 단계를 비열처리가 아닌 가열처리하였을 때의 킬레이트된 미네랄 함량과 생산수율을 확인하였다.
Figure pat00006
비열처리 조건에서 생산수율이 2 % 미만으로 측정이 어려웠던, 칼슘, 철, 구리의 경우에도 가열처리 조건에서는 Ca-HSMP는 41.4%, Fe-HSMP 42.8% 그리고 Cu-HSMP처리구는 39%로 생산수율이 현저히 증가하였음을 확인하였다.
그러나 비열처리 조건에서 이미 생산수율이 높았던 아연, 셀레늄 및 복합미네랄에서는 Zn-HSMP 41.8%, Se-HSMP 32.8%, M-HSMP 84%로 비열처리 조건에 비해 5 내지 10 % 정도의 생산수율 증가만 확인할 수 있었다.
따라서 제1반응 단계에서 가열처리를 생산수율 향상은 생산수율이 낮았던 특정 미네랄에서만 효과가 크게 나타났다.
또한 가열처리 조건과 비열처리 조건의 킬레이트된 미네랄 함량을 비교한 결과 미네랄을 단독으로 사용했을 때에는 가열처리 조건이 생산수율은 증가하지만 해당 미네랄의 킬레이트된 함량은 오히려 감소하는 경향을 나타내었고, 유일하게 복합미네랄을 혼합한 M-HSMP에서만 비열처리 조건에 비해 가열처리 조건에서 칼슘은 28%(76,780ppm), 철은 33%(17,150ppm), 아연은 83%(567ppm), 구리는 73%(3,570ppm) 그리고 셀레늄의 경우는 36%(65,330ppm)으로 증가하는 것을 알 수 있었다.
다만 비열처리 조건에서 킬레이트되었던 구리는 가열처리 조건인 Cu-HSMP에서 구리가 검출되지 않아 오히려 가열처리 조건에서 제거됨을 알 수 있었다.
상기 결과로부터 유청분말은 물론 유단백을 함유한 탈지분유 역시 유기태화 미네랄 강화 미네랄 제조의 기질로 활용할 수 있음을 확인하였고, 제1반응 단계에서는 생산수율에 차이가 있을 수는 있으나 가열처리 조건은 물론 비열처리 조건도 미네랄의 킬레이트화는 진행되므로 비열처리 조건으로 진행하는 것도 가능함을 확인하였다.
제조예 1: 제1반응 단계에서 글라이코마크로펩타이드 기질 및 가열처리 여부에 따른 성상 확인
1) 시료의 제조방법
치즈 유청으로부터 얻은 단백질 함량 80 중량%인 글라이코마크로펩타이드(이하, 'GMP'라고도 함) 분말 100 g 및 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본] 20 g을 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 200 g을 혼합하여 500 rpm으로 60 분 동안 교반하여 제1단계 반응물(제조예 1-1)을 제조하였다.
상기 제조예 1-1과 동일하게 제조하되 500 rpm에서 60 분 동안 교반한 후 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반하여 제1단계 반응물(제조예 1-2)를 제조하였다.
2) 실험결과
상기 제조예 1-1 및 1-2의 반응물은 25 ℃에서 3,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 7에 나타내었다. 성상 평가(침전, 용해, 응고, 부착, 겔화 현상)를 비교하였는데, 매우심함(+++), 심함(++), 초기현상 발생(+), 변화없음(-)으로 구분하여 결과를 확인하였다.
구분 성상 평가(원심전/원심후) 혼합 30분 후온도(℃)
침전 응고 부착 부유 겔화 색상
제조예1-1 ++/+ +/- +/+ ++/- -/+++ 투명/흰색 55
제조예1-2 -/- -/- +/+ +++/- +++/+++ 흰색/흰색 55
상기 제조예 1-1의 제1단계 반응물은 원심분리 전에는 약간의 침전이 있는 투명 액상이었으나, 원심분리 후 침전물과 상등액이 명확히 구분되지 않는 겔상을 형성함이 확인되었고, 제조예 1-2의 제1단계 반응물은 원심분리 전부터 겔상을 형성하고 있었다.
제조예 2: 제1반응 단계의 반응물의 에탄올 첨가 비율에 따른 성상, 생산수율 및 유기태화 미네랄 함량 확인
1) 시료의 제조방법
상기 제조예 1-1의 제1단계 반응물에 에탄올을 첨가하여 에탄올 첨가 비율에 따른 성상, 생산수율 및 유기태화 미네랄 함량을 측정하였다.
상기 제조예 1-1의 제1단계 반응물과 에탄올의 중량비율이 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7 및 2:8이 되도록, 에탄올을 혼합하였다(각각 제조예 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6 및 2-7).
2) 실험결과
도 2의 A는 농도별로 에탄올을 혼합한 시료의 사진이고, B는 A의 시료를 원심분리 한 후의 사진으로, 1은 제조예 1-1, 2는 제조예 2-7, 3은 제조예 2-6, 4는 제조예 2-5, 5는 제조예 2-4, 6은 제조예 2-3, 7은 제조예 2-2 및 8은 제조예 2-1의 사진이다.
상기 제조예 2-1 내지 및 2-7의 반응물에 에탄올을 첨가한 후 500 rpm에서 10분 동안 혼합하고, 25 ℃에서 3,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 8에 나타내었다.
생산수율은 상기 원심분리 후, 침전물이 형성된 시료에 대해 침전물 대비 2 배 정도의 정제수를 혼합 및 현탁하여 25 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 원심분리하는 세척 과정을 5 회 실시하여 최종 동결건조후 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하여 표 8에 함께 나타내었다.
구분 성상 평가(에탄올혼합후/에탄올혼합후 원심후) 생산수율(%)
침전 응고 부착 부유 겔화 색상
제조예1-1 ++/+ +/- +/+ ++/- -/+++ 투명/흰색 NT
제조예2-1 -/+ +++/+++ -/- -/- ++/+ 흰색/흰색 NT
제조예2-2 -/- +++/+++ -/- -/- +++/+++ 흰색/흰색 NT
제조예2-3 -/- +++/+++ -/- -/- +++/+++ 흰색/흰색 NT
제조예2-4 -/- +++/+++ -/- -/- +++/+++ 흰색/흰색 NT
제조예2-5 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 122.4
제조예2-6 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 119.0
제조예2-7 -/+++ -/- +/- -/- ++/- 흰색/투명 112.0
에탄올의 중량비가 60 중량% 이상인 제조예 2-5의 반응물부터 원심분리 후 침전이 명확히 형성되었으며, 상기 침전물을 세척 및 원심분리를 반복하여 생산수율을 확인한 결과 최초 기질인 글라이코마크로펩타이드의 대부분이 침전물을 형성하였음을 확인할 수 있었다.
상기 제조예 2-5, 2-6 및 2-7의 반응물의 유기태화 미네랄 함량을 글라이코마크로펩타이드(GMP)와 비교하여 IPC 분석을 통해 표 9에 나타내었다.
Figure pat00007
상기 제조예 2-5 내지 2-7의 제1반응 단계 반응물은 글라이코마크로펩타이드에 비해서 유기태 칼슘의 함량이 1000 내지 2000 배 증가하였고, 전체 인(P)과 황(S)를 포함한 전체 미네랄 함량 역시 30 % 이상 증가하였음을 확인하였다.
제조예 3: 제1반응 단계의 반응물의 가열 여부에 따른 성상, 생산수율 및 유기태화 미네랄 함량 확인
1) 시료의 제조방법
상기 제조예 2에서 생산 수율과 유기태화 칼슘의 함량이 적합했던 제조예 2-5의 에탄올 혼합비율을 이용하여, 글라이코마크로펩타이드(이하, 'GMP'라고도 함) 분말 66 g 및 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본] 13 g을 혼합하고, 상기 분말 혼합물에 물 267 g을 혼합하여 500 rpm으로 60 분 동안 교반하여 제1단계 반응물(346g)에 에탄올 519 g을 혼합한 후(제조예 3-1), 성상을 평가하고, 25 ℃, 4000 rpm에서 20 분 동안 원심분리한 후 다시 성상을 평가하고, 침전물과 상등액을 구분하여 각각의 무게를 측정하여 생산 수율을 계산하고, 이들 각각에 킬레이트된 미네랄 함량을 IPC 분석하였다.
상기 제조예 3-1과 동일하게 제1단계 반응에서 500 rpm에서 60 분 동안 교반한 후 80 ℃에서 30 분 동안 150 rpm으로 교반하여 가열처리한 후, 다시 동일하게 에탄올을 혼합하여 제조예 3-2를 제조하고 평가하였다.
2) 실험결과
도 3의 좌측 사진은 제조예 3-1, 우측 사진은 제조예 3-2이고, A는 GMP와 염화칼슘 분마을 혼합하고 물을 혼합하여 60 분 동안 교반한 제1단계 반응물의 사진이며, B는 제1단계 반응물에 반응물과 에탄올의 중량비율이 4:6이 되도록 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이고, C는 침전물을 동결건조한 후의 사진이며, D는 상등액을 동결건조한 후의 사진이다.
상기 제조예 3-1 및 3-2의 제1단계 반응물에 에탄올을 첨가하여 500 rpm에서 10분 동안 혼합하고, 25 ℃에서 4,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 8에 나타내었다.
침전물의 생산수율은 상기 원심분리 후, 침전물이 형성된 시료에 대해 침전물 대비 2 배 정도의 정제수를 혼합 및 현탁하여 25 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 원심분리하는 세척 과정을 5 회 실시하여 최종 동결건조후 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하여 표 10에 함께 나타내었다. 상등액의 생산수율은 상등액을 바로 동결전조하여 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하였다.
구분 성상 평가(에탄올혼합후/에탄올혼합후 원심후) 생산수율(%)
침전 응고 부착 부유 겔화 색상
제조예3-1 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 침전물 117%
상등액 12.6%
제조예3-2 -/+++ +/- +/- -/- +++/- 흰색/투명 침전물 95%
상등액 13.6%
에탄올의 중량비가 60 중량%가 되도록 혼합한 제조예 3-1 및 3-2는 제1반응 단계에서 가열처리 여부에 관계없이, 최초 기질인 글라이코마크로펩타이드의 대부분이 침전물을 형성하였음을 확인할 수 있었다.
상기 제조예 3-1 및 3-2의 제1단계 반응물의 에탄올 침전물의 유기태화 미네랄 함량을 글라이코마크로펩타이드(GMP)와 비교하여 IPC 분석을 통해 표 11에 나타내었다.
Figure pat00008
상기 제조예 3-1 및 3-2의 제1단계 반응물의 에탄올 침전물은 제1단계 반응에서 가열처리 여부에 관계없이 글라이코마크로펩타이드에 비해서 유기태 칼슘의 함량이 1500 배 정도 증가하였다.
제조예 4: 제2반응 단계의 반응물의 반응시간에 따른 N- 아세틸뉴라민산 함량, 입도 및 XRD 분석
1) 시료의 제조방법
상기 제조예 3에서 제조한 제조예 3-1 및 3-2의 침전물의 동결건조 분말, 대조군으로 글라이코마크로펩타이드(GMP) 분말을 각각 7 중량%로 희석한 후, 0.2 U/g의 뉴라미니다아제 1 중량%를 첨가하여 55 ℃에서 5 시간 제2반응 단계를 수행하였다. 상기 반응물은 열풍건조하여 각각 제조예 4-1 및 4-2, 대조군인 글라이코마크로펩타이드 가수분해물(GMPH) 분말로 하였다.
2) 실험결과
상기 시료 제조과정에서 효소반응 0 시간, 3 시간 및 5 시간째에 각각 N-아세틸뉴라민산 함량을 표 12에 나타내었다.
효소반응시간(hr) GMPH 제조예 4-1 제조예 4-2
0 0 0 0
3 63,209 ppm 46,814 ppm 44,550 ppm
5 67,577 ppm 67,224 ppm 66,493 ppm
GMP에서 생성될 수 있는 이론적인 최대 N-아세틸뉴라민산의 생성량은 70,000 ppm으로 GMP를 기질로 했을 때는 효소반응 3 시간만에 90 % 이상의 N-아세틸뉴라민산이 생성되었다. 그러나 유기태화 칼슘이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드를 기질로 이용한 제조예 4-1 및 4-2에서는 3 시간 경에는 65 % 내외가 생성되었고, 5 시간 경에 95 % 이상의 생성되었다.
도 4는 상기 N-아세틸뉴라민산의 함량을 측정한 크로마토그램을 나타낸 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다.
도 5는 입도 분석 결과를 나타낸 그래프로서, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다. GMP의 평균 입자크기는 1249 ㎛이었으나, 제조예 4-1 및 4-2의 효소반응 생성물은 평균 입자크기가 16-19 ㎛로 현저히 감소하였다.
도 6은 XRD를 통해 결정구조분석을 실시한 것으로, A는 반응전의 글라이코마크로펩타이드(GMP), B는 제조예 4-1의 효소반응 5 시간째의 생성물, C는 제조예 4-2의 효소반응 5 시간째 생성물이다. 제조예 4-1 및 4-2의 효소반응 생성물은 GMP와 달리 칼슘의 킬레이트화에 따른 특이적인 피크를 형성함을 확인할 수 있다.
제조예 5: 제1반응 단계의 수용성 칼슘의 첨가량, 다른 수용성 미네랄 첨가 및 복 합미네날 첨가에 따른 유기태화 미네랄 함량 및 N- 아세틸뉴라민산 함량 분석
1) 시료의 제조방법
표 13의 제조방법으로 제1반응 단계 및 에탄올 혼합 단계를 수행하였다.
Figure pat00009
제조예 5-1-1 내지 5-1-4는 염화칼슘 분말[CaCl2·2H2O, Junsei, 일본]의 첨가량을 감소시켜 가면서 제조한 칼슘이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드(Ca-GMP)을 제조한 것이고, 제조예 5-2-1 내지 5-2-5는 염화칼슘 분말 대신, 황산제1철[FeSO4·7H2O(Yakuri Pure Chemical)] 분말, 황산아연[ZnSO4·7H2O(빅솔, 한국)] 분말, 황산동[CuSO4·5H2O(Yakuri Pure Chemical)] 분말, 소듐셀레나이트[Na2SeO3(XinXianShi Qiyuan Food Additive Co.)] 분말 및 염화크롬[CrCl3·6H2O] 분말을 사용하여 제조한 각각의 미네랄이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드(M-GMP)를 제조한 것이며, 제조예 5-3-1 및 5-3-2는 5종의 미네랄을 복합하여 제조한 복합 미네랄이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드(M(5)-GMP)를 제조한 것이다.
상기 제1반응 단계 및 에탄올 혼합 단계를 수행하여 얻은 제조예들의 침전물을 동결건조하여 분말화시키고, 분말을 각각 7 중량%로 희석한 후, 0.2 U/g의 뉴라미니다아제 1 중량%를 첨가하여 55 ℃에서 5 시간 제2반응 단계를 수행하였다.
2) 실험결과
도 7의 A는 제1단계 반응 후의 사진이고, B는 제1단계 반응물에 에탄올을 혼합하고 원심분리한 후의 사진이다. 1부터 4까지는 각각 제조예 5-1-1부터 제조예 5-1-4이고, 5부터 9까지는 각각 제조예 5-2-1부터 제조예 5-2-5까지이고, 10 및 11은 각각 제조예 5-3-1 및 5-3-2이다.
상기 제조예들의 제1단계 반응물에 에탄올을 첨가하여 500 rpm에서 10분 동안 혼합하고, 25 ℃에서 4,000rpm으로 20분 원심분리하여, 원심분리 전과 후의 성상을 비교하여 표 14에 나타내었다. 또한 생산수율은 상기 원심분리 후, 침전물이 형성된 시료에 대해 침전물 대비 2 배 정도의 정제수를 혼합 및 현탁하여 25 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 원심분리하는 세척 과정을 5 회 실시하여 최종 동결건조후 생산물의 무게를 최초 사용된 기질인 글라이코마크로펩타이드 무게에 대비하여 중량%로 계산하여 표 14에 함께 나타내었다.
Figure pat00010
상기 결과 제조예 5-1-1에서 거품이 발생하고, 제조예 5-1-1, 제조예 5-2-3, 제조예 5-3-1 및 5-3-2의 경우는 글라이코마크로펩타이드 및 수용성 미네랄 분말의 용해를 위해 용해수를 더 추가할 필요성이 있다는 점을 제외하고는 모든 제조예에서 큰 문제는 발생하지 않았다.
생산수율 면에서는 셀레늄이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드를 제조한 제조예 5-2-4의 생산수율이 다른 것들에 비해 낮았고, 제조예 5-1-1은 생산수율은 높았으나 원심분리를 통한 침전물의 분리에 다소 어려움이 있었다.
상기 제조예들의 유기태화 미네랄 함량을 IPC 분석을 통해 표 15에 나타내었다.
Figure pat00011
제조예 5-1-1 내지 5-1-4에서는 염화칼슘 분말의 사용량이 감소함에 따라 킬레이트된 칼슘의 함량이 감소함을 알 수 있었고, 제조예 5-2-1 내지 5-2-5에서는 각각 목적하는 철, 아연, 구리, 셀레늄 및 크롬 함량이 현저히 증가하였음을 확인할 수 있었으며, 제조예 5-3-1 및 5-3-2는 5종의 미네랄을 복합하여 제조한 복합 미네랄이 킬레이트된 글라이코마크로펩타이드가 제조되었음을 확인할 수 있었다.
상기 제1반응 단계, 에탄올 혼합 단계 및 제2반응 단계를 수행하여 얻은 분말의 N-아세틸뉴라민산 함량을 분석하여 표 16에 나타내었다.
Figure pat00012
상기 결과 미네랄의 킬레이트 양이나 미네랄의 종류에 관계없이 제2반응 단계를 통해 5 시간 효소반응시 일정한 N-아세틸뉴라민산이 생성됨을 확인하였다.
실험예 1: 에탄올 혼합 단계의 에탄올 잔류 농도에 따른 제2반응 단계의 N- 아세틸뉴라민산 생성 능력 차이 확인
제조예 5-1-1의 제1반응 단계 및 에탄올 혼합 단계에서는 생성된 침전물을 건조하면서 에탄올이 제거되고, 이를 물로 7 중량%로 희석하므로 에탄올의 잔류 농도는 0.1 중량% 미만이다. 그러나 상기 에탄올 혼합 단계의 침전물을 건조하지 않고 바로 물로 희석할 경우 에탄올의 잔류 농도는 1-2 중량%까지 높아질 수 있으므로, 제조예 5-1-1의 침전물의 건조물에 물로 희석할 때를 대조군으로, 각각 5 중량%, 10 중량% 및 20 중량%의 에탄올 수용액으로 희석하여 제2반응 단계를 제조예 5-1-1과 동일하게 수행하고 이때의 N-아세틸뉴라민산의 함량을 측정하여 표 17에 나타내었다.
Figure pat00013
에탄올 5 중량% 함유 에탄올 수용액으로 제2반응 단계를 수행한 경우 대조군에 비해 다소 낮은 N-아세틸뉴라민산 생성능을 나타내었으나, 효소반응에 큰 영향을 주지 않았으나, 에탄올 농도가 높아지면서 N-아세틸뉴라민산의 생성능은 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 헬리코박터에 대한 항균능력 확인
제조예 5-1-1의 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드(N-아세틸뉴라민산 7 중량%, 유기태화 칼슘 3 중량%, 이하 'CaNANA-GMP'라고도 함), 순도 98 중량%의 N-아세틸뉴라민산 표준품(이하, 'S-NANA'라고도 함) 및 글라이코마크로펩타이드(GMP)의 헬리코박터 파이로리 P1WT에 대한 항균활성을 확인하였다.
헬리코박터 파이로리 P1WT는 페트리 디쉬에 브루셀라 브로쓰를 멸균하고 60 ℃이하로 식힌 후 항생제 vancomycin 10㎍/㎖, trimethoprim 5㎍/㎖, nystatin 1㎍/㎖와 10% FBS를 첨가한 브로쓰를 8 ㎖ 넣고 배양된 헬리코박터 파이로리를 1㎖ 넣어 37℃, 10% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다.
상기 배양한 헬리코박터 파이로리를 3000rpm, 20min, 4℃ 원심분리 후 상층액 브로쓰를 제거하고 PBS로 H. pylori 펠릿을 풀어준 후 96 웰 플레이트에 100㎕ 넣어 분관광도계를 이용하여 OD 600 nm에서 0.6을 맞춘 후 사용하였다.
헬리코박터 파이로리 균수(CFU)는 각각의 물질을 농도별로 희석하여 6 웰 플레이트에 2㎖씩 넣고 OD 600nm를 0.6으로 맞춘 헬리코박터 파이로리를 50㎕씩 넣고 37℃, 10% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 상기 배양 후 OD 600 nm에서 흡광도를 측정하고, 브루셀라 아가에 Brucella Agar에 50㎕씩 넣어 접종한 후 37℃, 10% CO2 배양기에서 4~5일간 배양 후 콜로니를 계수하여 표 18에 나타내었다.
Figure pat00014
도 8의 A는 무처리구, B는 GMP 처리군, C는 S-NANA 처리군, D는 CaNANA-GMP 처리군의 24 시간 배양 후의 플레이트 사진이고, 2-1부터 2-4까지는 GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 3-1부터 3-2까지는 S-NANA를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이고, 4-1부터 4-2까지는 CaNANA-GMP를 각각 0.05, 0.1, 0.5 및 2 중량% 첨가한 플레이트이다.
글라이코마크로펩타이드(GMP)는 전혀 항균 활성을 나타내지 않았고, 합성 N-아세틸뉴라민산(S-NANA)와 제조예 5-1-1의 유기태 칼슘 강화 글라이코마크로펩타이드(CaNANA-GMP)에서는 0.5 중량%에서 헬리코박터 파이로리 균주에 대해 동등한 항균 활성을 나타내었다.
그러나 CaNANA-GMP는 S-NANA에 비해서 1/14 미만의 N-아세틸뉴라민산 함량을 갖는다는 점에서 CaNANA-GMP의 항균 효과는 단순한 N-아세틸뉴라민산에 의한 것이 아닌 복합적인 작용에 의한 것임을 암시하고 있었다.

Claims (8)

  1. 글라이코마크로펩타이드 분말과 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말을 혼합한 후, 물을 혼합하여 반응시키는 제1반응 단계; 상기 제1반응 단계의 반응물에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 혼합하여, 혼합물의 에탄올 농도를 55 내지 95 중량%로 조정하는 에탄올 혼합 단계; 및 상기 에탄올 혼합 단계에서 얻어진 침전물에 뉴라미니다아제를 첨가하여 효소반응시키는 제2반응 단계;를 포함하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2반응 단계의 침전물 또는 그 침전물을 물로 희석한 희석액에 잔류하는 에탄올 함량은 5 중량% 이하인 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글라이코마크로펩타이드 분말에 포함된 유단백 100 중량부에 대하여, 상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말 5 내지 500 중량부 첨가하는 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 용해엔탈피가 음성인 수용성 미네랄 분말의 1 내지 50 배 중량의 물을 혼합하는 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1반응 단계의 반응은 10 내지 100 ℃에서 15 분 내지 5일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미네랄은 칼슘, 아연, 마그네슘, 칼륨, 철, 구리, 셀렌, 크롬, 몰리브덴 및 요오드 중에서 선택되는 어느 하나의 미네랄 또는 둘 이상의 복합 미네랄인 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물은 유기태화 미네랄 0.1 내지 10 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 99 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물의 제조방법.
  8. 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 유기태화 미네랄 0.1 내지 10 중량% 및 N-아세틸뉴라민산 4 내지 99 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 유기태화 미네랄 강화 글라이코마크로펩타이드 가수분해물.
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