KR20160056863A - Ｃｄ36 발현을 감소시키는 방법 - Google Patents

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하젤 에이치. 제토
사오이 리우
성희 조
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코넬 리서치 화운데이션,인크.
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Abstract

본 발명은 세포 내에서 CD36 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 순 양전하; 최소 4개의 아미노산; 최대 약 20개의 아미노산; 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r) 사이에, 3pm이 r+1 이하 중 최대값이 되는 관계; 및 방향족 기의 최소수(a)와 순 양전하의 총수(pt) 사이에, 2a가 pt+1 이하 중 최대값이 되는 관계(단, a가 1이고, pt가 1인 경우를 제외한다)를 갖는 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.

Description

ＣＤ36 발현을 감소시키는 방법{METHODS FOR REDUCING CD36 EXPRESSION}
본원은 2005년 9월 16일자로 출원된 미국 가출원 제60/718,170호를 우선권으로 주장한다. 미국 가출원 제60/718,170호의 명세서는 본원에 참고로 인용된다.
본원에 기술된 발명은 국립 약물남용 연구소(NIDA) 승인 제P01 DA08924호, 국립 신경질환, 뇌졸증 연구소(NINDS) 승인 제R21 NS48295호 및 국립 심장, 허파, 혈액 연구원(NHLBI) 승인 제RO1 HL082511호의 자금지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 소정의 권리를 가진다.
CD36은 B급 청소 수용체 패밀리의 막횡단 단백질이다. 상기 단백질은 다수의 세포들, 예를 들어 미세혈관 내피세포, 대식세포, 혈소판, 지방세포, 상피세포(예컨대, 장관 상피세포 및 신장 관상세포 등), 췌장섬 세포 및 심근 상에 널리 발현된다. 상기 수용체는 복수 개의 세포외 리간드, 예를 들어 트롬보스폰딘-1, 긴-사슬 지방산 및 산화된 저밀도 지질단백질과 상호작용할 수 있다.
CD36의 비정상적 발현은 다양한 유형의 질병 및 조건들과 관계되어 있다. 예를 들어, CD36이 부족한 생쥐는 정상 생쥐에 비해 서구식 식이를 공급받았을 때 죽상경화성 병변을 적게 갖는다. 또한, CD36 녹아웃(knock out) 생쥐는 급성 뇌경색에 반해 보호받는 것으로 보고되어 있다.
따라서, CD36 발현을 감소시키는 방법은 CD36의 비상적 발현으로 특징지어지는 질병 또는 조건을 처리하는 데 유익하다.
일 실시양태에서, 본 발명은 세포 내에서 CD36 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드와 접촉시키는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CD36 발현의 감소가 필요한 포유동물에서 CD36 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CD36 발현의 감소가 필요한 포유동물에서 CD36 발현 증가로 특징지어지는 질병 또는 조건을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CD36 발현의 감소가 필요한 포유동물에서 요관 폐쇄증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 CD36 발현의 감소가 필요한 포유동물에서 당뇨병성 신증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 제거된 기관 또는 조직에서 CD36 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에 유효량의 방향족-양이온성 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드는 하나 이상의 순 양전하; 최소 4개의 아미노산; 최대 약 20개의 아미노산; 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r) 사이에, 3pm이 r+1 이하중 최대값이 되는 관계; 및 방향족 기의 최소수(a)와 순 양전하의 총수(pt) 사이에, 2a가 pt+1 이하 중 최대값이 되는 관계(단, a가 1이고, pt가 1인 경우를 제외한다)를 갖는다.
(펩타이드의 합성)
본 발명의 방법에 유용한 펩타이드는 종래에 널리 알려진 임의의 방법으로 합성될 수 있다. 상기 단백질을 화학적으로 합성하기 위한 적합한 방법은, 예컨대, 스튜어트(Stuart) 및 영(Young)의 문헌 “고상 펩타이드 합성”[“Solid Phase Peptide Synthesis,” Second Edition, Pierce Chemical Company(1984)] 및 [“Solid Phase Peptide Synthesis,” Methods Enzymol. 289, Academic Press, Inc, New York(1997)]에 기재된 방법들을 포함한다.
(투여 방법)
세포, 기관 또는 조직을 펩타이드에 접촉시키기 위한 종래 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 시험관 시험(in vitro)법, 생체외 시험(ex vivo)법 또는 생체내 시험(in vivo)법을 포함한다.
시험관 시험법은 전형적으로 배양된 샘플을 포함한다. 예를 들면, 세포를 저장소(예컨대, 조직 배양판)에 위치시켜, 방향족-양이온 펩타이드와 함께 CD36 발현을 감소시키기에 적합한 상태에서 배양될 수 있다.
생체외 시험법은 전형적으로 인간과 같은 포유동물로부터 제거된 세포, 기관 또는 조직을 포함한다. 상기 세포, 기관 또는 조직은, 예컨대, 적절한 상태에서 상기 펩타이드와 함께 배양될 수 있다. 상기 접촉된 세포, 기관 또는 조직은 일반적으로 제공자에게 되돌아가거나, 수령자에게 위치시키거나, 추후 사용을 위해 보관된다. 따라서, 상기 펩타이드는 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체에 존재한다.
생체내 시험법은 전형적으로 상기 기재된 바와 같은 방향족-양이온 펩타이드를 포유동물, 바람직하게는 인간에 대해 투여하는 것으로 한정된다. 본 발명의 방법에 유용한 펩타이드는 CD36의 발현을 감소시키거나 상기 포유동물을 치료하기에 효과적인 양으로 포유동물에게 투여된다. 상기 효과적인 양은 내과의사 및 임상의학자에게 익숙한 방법으로 임상전 실험 및 임상 실험동안 결정된다.
본 발명의 방법에 유용한 효과량의 펩타이드는, 바람직하게는 약학 조성물에서, 약학적 화합물을 투여하기 위한 다양한 임의의 공지의 방법에 의해 상기 조성물의 투여를 필요로 하는 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 펩타이드는 전신 또는 국소 투여될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 펩타이드는 정맥주사로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 유용한 상기 방향족-양이온 펩타이드는 빠른 정맥 볼루스(bolus) 주사를 통해 투여될 수 있다. 그러나, 상기 펩타이드는 일정 속도의 정맥 주사로 투여되는 것이 바람직하다.
상기 펩타이드는 또한 구강으로, 국소로, 비강으로, 근육내로, 피하로 또는 경피로 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의한 상기 방향족-양이온 펩타이드의 경피 투여는 대전된 펩타이드가 전류에 의해 피부를 가로질러 전달되는 전리요법(iontophoresis)에 의할 수 있다.
다른 투여 방법은 뇌실내(intracerebroventricularly) 또는 수막강내(intrathecally) 투여를 포함한다. 뇌실내 투여는 뇌의 뇌실계(ventricular system)로 투여하는 것을 말한다. 수막강내 투여는 척수의 거미막(arachnoid membrane) 하의 공간으로 투여하는 것을 말한다. 따라서 뇌실내 투여 또는 수막강내 투여는 중추 신경계의 기관 또는 조직에 영향을 주는 질병 및 질환에 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 상기 펩타이드는 또한 당업계에 알려진 바와 같은 지속방출에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 지속 방출 투여는 특정 시간 동안 일정 수준의 약물을 달성하기 위한 약물 전달 방법이다. 상기 수준은 전형적으로 혈청 또는 혈장 농도로 측정된다.
조절 방출에 의한 화합물의 전달 방법은 국제 공개공보 제WO02/083106호에 기재되어 있다. 상기 국제출원은 그 전부가 본원에 참조로 기재되어 있다.
종래 공지된 임의의 약학 제형이 본 발명의 방법에 유용한 상기 방향족-양이온 펩타이드의 투여에 적합하다. 구강 투여를 위하여, 액상 또는 고체 제형이 사용될 수 있다. 이러한 제형은 정제, 젤라틴 캡슐, 알약, 구내정(troch), 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 오블라토(wafer), 츄잉 검(chewing gum) 등을 포함한다. 상기 펩타이드는 당업계의 숙련가들이 이해하는 바와 같이 적합한 약학적 담체(부형약) 또는 첨가제와 혼합될 수 있다. 이러한 담체 및 첨가제는 전분, 우유, 설탕, 특정 유형의 점토, 젤라틴, 젖산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트를 포함하는 스테아르산 또는 이들의 염, 탈크(talc), 식물성 기름 또는 오일, 검(gum) 및 글리콜을 포함한다.
전신, 뇌실내, 뇌막강내, 국소, 비강, 피하 또는 경피 투여를 위하여, 본 발명의 방법에 유용한 상기 방향족-양이온 펩타이드의 제형은 상기 펩타이드를 전달하기 위해 당업계에 알려진 바와 같은 종래의 희석제, 담체 또는 첨가제 등을 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 하나 이상의 안정제, 계면활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 및 선택적으로 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 수용액 형태 또는 동결건조 형태로 전달될 수 있다.
상기 안정제는, 예컨대, 글리신과 같은 아미노산; 또는 수크로오즈(sucrose), 테트라로오즈(tetralose), 락토오즈(lactose) 또는 덱스트란(dextran)과 같은 올리고당일 수 있다. 다르게는, 상기 안정제는 마니톨(mannitol)과 같은 당알콜(sugar alcohol); 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 안정제 또는 안정제들의 조합은 상기 펩타이드의 중량에 대하여 약 0.1 내지 약 10 중량%를 구성한다.
상기 계면활성제는 폴리소르베이트(polysorbate)와 같은 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하다. 적합한 계면활성제는 트윈20(Tween20) 및 트윈80(Tween80); 및 플루로닉 F-68(Fluronic F-68)과 같은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜을 약 0.001%(w/v) 내지 약 10%(w/v)로 포함한다.
상기 염 또는 완충제는 임의의 염 또는 완충제, 예컨대 각각 염화나트륨 또는 나트륨/칼륨 인산염일 수 있다. 바람직하게는, 상기 완충제는 상기 약학 조성물의 pH를 약 5.5 내지 약 7.5의 범위로 유지한다. 상기 염 및/또는 완충제는 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합한 수준으로 삼투질농도(osmolality)를 유지하는 데에도 유용하다. 상기 염 또는 완충제는 약 150mM 내지 약 300mM의 대략적으로 등장(isotonic) 농도에서 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 유용한 상기 펩타이드의 제형은 추가적으로 하나 이상의 종래의 첨가제를 함유할 수 있다. 이들 첨가제 예는 글리세롤과 같은 가용제(solubilizer); 벤즈알코늄 클로라이드(“쿼츠(quats)”로 알려진 4차 암모늄 화합물의 혼합물), 벤질 알콜, 클로레톤 또는 클로로부탄올과 같은 항산화제; 모폴린 유도체와 같은 마취제; 또는 상기 기재된 바와 같은 등장제를 포함한다. 산화 또는 다른 손상에 대한 추가적인 예방조치로서, 상기 약학 조성물은 불투과성 마개로 밀봉된 유리병에 질소 가스 하에 보관될 수 있다.
본 발명에 따라 치료된 포유동물은 임의의 포유동물, 예컨대 양, 돼지, 소 및 말과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 애완 동물; 및 래트, 마우스 및 래빗과 같은 실험용 동물일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다.
도 1. SS-31는 oxLDL-유도된 CD36 mRNA 발현, CD36 단백질 발현 및 마우스 복막 대식세포에서의 포말 세포 형성을 감소시킨다.
도 2. SS-31 처리는 급성 뇌경색을 갖는 정상 생쥐에서 경색 부피 및 반구형 팽화를 감소시킨다.
도 3. SS-31 처리는 정상 생쥐에서 뇌허혈후의 감소된 글루타티온(GSH)의 결핍을 감소시킨다.
도 4. SS-31은 급성 뇌경색을 갖는 CD36 녹아웃 생쥐에서 경색 부피 또는 반구형 팽화를 감소시키는 데 전혀 효과가 없다.
도 5. SS-31은 CD36 녹아웃 생쥐로부터 뇌허헐후의 GSH 결핍을 감소시키지 않는다.
도 6. SS-31은 정상 생쥐에서 뇌허혈후의 CD36 mRNA 발현을 감소시킨다.
도 7. SS-31은 일측상의 요로 폐쇄(UUO) 후 신장 관상세포 상의 CD36 발현을 감소시킨다. 대측상의 비폐쇄된 신장(도 7A); 식염수로 처리된 동물에서 폐쇄된 신장(도 7B); 및 SS-31로 처리된 래트(rat)로부터 얻어진 폐쇄된 신장(도 7c).
도 8. SS-31은 UUO 후 신장에서의 지질 과산화를 감소시킨다. 폐쇄된 신장에서의 관상세포(도 8B), 대측상의 비폐쇄된 제어군(도 8A); SS-31로 처리된 래트로부터의 폐쇄된 신장(도 8C).
도 9. SS-31은 UUO 후 폐쇄된 신장에서의 관상 세포사멸(apoptosis)을 감소시킨다. 식염수-처리된 동물로부터의 폐쇄된 신장(도 9B); 반대쪽의 비폐쇄된 제어군(도 9A); SS-31 처리된 동물로부터의 폐쇄된 신장(도 9C).
도 10. SS-31은 UUO에 의해 유발된 폐쇄된 신장에서의 대식세포 침윤을 감소시킨다. 폐쇄된 신장(도 10B); 대측상의 비폐쇄된 제어군(도 10A); SS-31로 처리된 래트(도 10C).
도 11. SS-31은 UUO 후 폐쇄된 신장에서의 사이질 섬유화(interstitial fibrosis)를 감소시킨다. 폐쇄된 신장(도 11B); 대측상의 비폐쇄된 제어군(도 11A); SS-31로 처리된 래트(도 11C).
도 12. SS-31 또는 SS-20에 의한 격리된 심장의 한랭 저장으로 CD36 발현의 상향조절을 예방하였다. "배경" 제어군(도 12A 및 12B)은 주요 항-CD36 항체로 처리되지 않은 정상적인 비-허혈성 심장으로부터의 두 개의 분절을 나타낸다. 4℃에서 18시간 동안 토마스 용액(St. Thomas solution에 저장된 심장 표본으로부터의 분절은 "정상 심장"에 비해 CD36 염색이 증가됨을 보여주었다. CD36 염색은 1 nM SS-31(도 12G 및 12H) 또는 100 nM SS-20(도 12I 및 12J)를 함유하는 토마스 용액에 저장된 심장에서 크게 감소되었다.
도 13. SS-31 및 SS-20은 지속성 냉허혈 후 온열성 재관류 처리된 격리된 기니픽(guinea pig) 심장에서의 지질 과산화를 감소시킨다. 심장에서의 HNE 염색은 비-허혈성 심장(도 13A)에 비해 토마스 용액(EH 13B)에서 18시간 한랭 저장 처리된다. HNE 염색은 SS-31(도 9C) 또는 SS-20(도 13D)에 저장된 심장에서 감소된다.
도 14. SS-31 및 SS-20은 지속성 냉허혈 후 온열성 재관류 처리된 격리된 기니픽 심장에서의 내피 세포사멸을 없앤다. 토마스 용액에서 18 시간 한랭 저장 처리된 심장(도 14C 및 14D); 비-허혈성 정상 심장(도 14A 및 14B). 세포사멸성 세포는 SS-31(도 14E 및 14F) 또는 SS-20(도 14G 및 14H)에 저장된 심장에서 관찰되지 않았다.
도 15. SS-31 및 SS-20은 지속성 냉허혈 후 온열성 재관류 처리된 격리된 기니픽 심장에서의 관상 흐름을 유지한다. 기니픽 심장은 3분 동안 토마스 용액 단독, 또는 1 nM SS-31(도 15A) 또는 100 nM SS-20(도 15B)를 함유하는 토마스 용액으로 충만시킨 다음, 18시간의 냉허혈(4℃) 처리되었다.
도 16. SS-31은 당뇨 생쥐에서 근위 세관의 손상을 방지한다. 당뇨병은 5d에 대해 스트렙토조토신(STZ)을 주입함으로써 유발되었다. 3주 후에 얻어진 신장 분절은 STZ로 처리되지 않은 생쥐(패널 A)에서는 보이지 않았던, STZ-처리된 동물(도 16A, 패널 B)에서의 솔가장자리 손실을 보였다. 솔가장자리의 손실은 SS-31(3mg/kg)을 매일 받아 STZ-처리된 동물(패널 C)에서 보이지 않았다.
도 17. SS-31은 당뇨 생쥐에서 세뇨관 상피 세포사멸을 예방하였다. 당뇨병은 5d에 대해 스트렙토조토신(STZ)을 주입함으로써 유발되었다. 3주 후에 얻어진 신장 분절은 STZ로 처리되지 않은 생쥐(도 17A, 패널 a)에서는 보이지 않았던, STZ-처리된 동물(도 17A, 패널 b)의 근위 세관에서 세포사멸성 세포의 엄청난 증가를 보였다. STZ-유발성 세포사멸은 SS-31(3mg/kg)을 매일 받은 생쥐에서는 보이지 않았다(도 17A, 패널 c). STZ에 의해 야기된 세포사멸성 세포의 백분율은 SS-31 처리에 의해 크게 감소되었다(도 17B).
(펩타이드)
본 발명은 특정 방향족-양이온성 펩타이드에 의해 CD36 발현을 감소시키는 것에 대한 것이다. 방향족-양이온성 펩타이드는 수용성이고 극성이 높다. 이러한 특성에도 불구하고, 펩타이드는 세포막을 용이하게 통과한다.
본 발명에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드는 펩타이드 결합으로 공유 결합되는 최소 3개의 아미노산, 바람직하게는 최소 4개의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 방향족-양이온성 펩타이드에 존재하는 아미노산의 최대수는 펩타이드 결합으로 공유 결합되는 아미노산 약 20개이다. 바람직하게, 아미노산의 최대수는 약 20개, 더욱 바람직하게는 약 9개, 더욱더 바람직하게는 약 6개이다. 적정하게는, 펩타이드에 존재하는 아미노산 수는 4개이다.
본 발명에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드의 아미노산은 임의의 아미노산일 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "아미노산"은 하나 이상의 아미노기 및 하나 이상의 카복실기를 함유하는 임의의 유기 분자를 가리키는 것으로 사용된다. 바람직하게, 하나 이상의 아미노기는 카복실기에 대해 α 위치에 있다.
아미노산은 자연 발생적일 수 있다. 자연 발생적 아미노산은, 예를 들어 포유동물 단백질, 즉 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파틱산(Asp), 시스테인(Cys), 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 아이소류신(Ileu), 라이신(Lys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 프롤린(Pro), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr) 및 발린(Val)에서 통상적으로 발견되는 20개의 가장 보편적인 좌선성(L) 아미노산을 포함한다.
다른 자연 발생적 아미노산은, 예를 들어 단백질 합성과는 무관한 대사 과정에서 합성되는 아미노산이다. 예를 들어, 아미노산 오르니틴 및 시트룰린은 요소 생산 도중 포유동물 대사작용에서 합성된다. 자연 발생적 아미노산의 또 다른 예는 하이드록시프롤린(Hyp)을 포함한다.
본 발명에 유용한 펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 비-자연 발생적 아미노산을 함유한다. 적정하게는, 상기 펩타이드는 자연 발생적 아미노산을 갖지 않는다. 상기 비-자연 발생적 아미노산은 좌선성(L-), 우선성(D-) 또는 이들의 혼합일 수 있다.
비-자연 발생적 아미노산은 전형적으로 살아있는 유기체에서 통상적인 대사 과정에서 합성되지 않으며, 단백질 내에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다. 또한, 본 발명에 유용한 상기 비-자연 발생적 아미노산은 바람직하게는 통상의 단백질 분해효소에 의해 인식되지도 않는다.
비-자연 발생적 아미노산은 펩타이드 내 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 비-자연 발생적 아미노산은 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 사이의 임의의 위치에 있을 수 있다.
비-자연 발생적 아미노산은, 예를 들어 천연 아미노산에서 발견되지 않는 알킬, 아릴 또는 알킬아릴기를 포함할 수 있다. 비-천연 알킬 아미노산의 몇몇 예는 α-아미노뷰티르산, β-아미노뷰티르산, γ-아미노뷰티르산, δ-아미노발레르산 및 ε-아미노카프로산을 포함한다. 비-천연 아릴 아미노산의 몇몇 예는 오르토-, 메타- 및 파라-아미노벤조산을 포함한다. 비-천연 알킬아릴 아미노산의 몇몇 예는 오르토-, 메타- 및 파라-아미노페닐아세트산 및 γ-페닐-β-아미노뷰티르산을 포함한다.
비-자연 발생적 아미노산은 자연 발생적 아미노산의 유도체를 포함한다. 자연 발생적 아미노산의 유도체는, 예를 들어 자연 발생적 아미노산에 하나 이상의 화학기를 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 화학기는 페닐알라닌 또는 타이로신 잔기의 방향족 고리의 2', 3', 4', 5' 또는 6', 또는 트립토판 잔기의 벤조 고리의 4', 5', 6', 또는 7' 중 하나 이상의 위치에 첨가될 수 있다. 기(group)는 방향족 고리에 첨가될 수 있는 임의의 화학기일 수 있다. 상기 기의 몇몇 예는 분지형 또는 비분지형 C1-C4 알킬옥시(즉, 알콕시), 아미노, C1-C4 알킬아미노 및 C1-C4 다이알킬아미노(예컨대, 메틸아미노, 다이메틸아미노), 나이트로, 하이드록실, 할로(즉, 풀루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도)를 포함한다. 자연 발생적 아미노산의 비-자연 발생적 유도체의 몇몇 특정 예로는 노르발린(Nva) 및 노르류신(Nle)을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 펩타이드에서 아미노산을 개질시키는 또 다른 예는 펩타이드의 아스파틱산 또는 글루타믹산 잔기의 카복실기의 유도체화 반응이다. 유도체화 반응의 일 예는 암모니아, 또는 1차 또는 2차 아민, 예컨대 메틸아민, 에틸아민, 다이메틸아민 또는 다이에틸아민에 의한 아마이드화 반응이다. 유도체화 반응의 또 다른 예는, 예를 들어 메틸 또는 에틸 알코올에 의한 에스테르화 반응을 포함한다.
상기 개질화 반응의 또 다른 예는 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘 잔기 중 아미노기의 유도체화 반응을 포함한다. 예를 들어, 상기 아미노기는 아실레이트화될 수 있다. 몇몇 적합한 아실기는, 예를 들어 아세틸기 또는 프로피오닐기와 같은 상술된 임의의 C1-C4 알킬기를 포함하는 벤조일기 또는 알카노일기를 포함한다.
비-자연 발생적 아미노산은 통상의 단백질 분해효소에 대해, 바람직하게는 저항성이고, 더욱 바람직하게는 비민감성이다. 단백질 분해효소에 대해 저항성이거나 비민감성인 비-자연 발생적 아미노산의 예는 상술된 자연 발생적 L-아미노산 중 임의의 우선성(D-) 형태뿐만 아니라, L- 및/또는 D- 비-자연 발생적 아미노산을 포함한다. D-아미노산은 세포의 통상적인 리보좀 단백질 합성 기구 이외의 수단에 의해 합성되는 특정 펩타이드 항생제에서 발견되지만, 통상적으로는 단백질에서 생기지 않는다. 본원에 사용된, D-아미노산은 비-자연 발생적 아미노산인 것으로 생각된다.
단백질 분해효소 민감성을 최소화하기 위해, 본 발명의 방법에 유용한 펩타이드는, 아미노산이 자연 또는 비-자연 발생적인 지에 무관하게 통상적인 단백질 분해효소에 의해 인식되는 5개 미만, 바람직하게는 4개 미만, 더욱 바람직하게는 3개 미만, 가장 바람직하게는 2개의 접촉형 L-아미노산을 가져야 한다. 적정하게는, 펩타이드는 D-아미노산만을 가지고, L-아미노산을 전혀 갖지 않는다.
펩타이드가 아미노산의 단백질 분해효소 민감성 배열을 함유한다면, 하나 이상의 아미노산은 바람직하게는 비-자연 발생적인 D-아미노산이며, 이에 의해 단백질 분해효소 저항성이 된다. 단백질 분해효소 민감성 서열의 예는 엔도펩티다아제 및 트립신과 같은 통상적인 단백질 분해효소에 의해 용이하게 분할되는 두 개 이상의 접촉형 염기성 아미노산을 포함한다. 염기성 아미노산의 예는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다.
방향족-양이온성 펩타이드는 펩타이드의 아미노산 잔기의 총수에 대해 생리적 pH에서 순 양전하를 최소수로 갖는다는 것이 중요하다. 생리적 pH에서 순 양전하의 최소수는 이하에서 (pm)이라 칭한다. 펩타이드 내 아미노산 잔기의 총수는 이하에서 (r)이라 칭한다.
이하에서 논의되는 최소수의 순 양전하는 모두 생리적 pH에 있다. 본원에 사용된, 용어 "생리적 pH"는 포유동물 몸체의 조직 및 기관의 세포에서의 통상적인 pH를 가리킨다. 예를 들어, 인간의 생리적 pH는 통상적으로 대략 7.4이지만, 포유동물에서의 통상적인 생리적 pH는 약 7.0 내지 약 7.8 중 임의의 pH일 수 있다.
본원에 사용된, "순 전하"는 펩타이드에 존재하는 아미노산에 의해 운반되는, 양전하 개수와 음전하 개수의 수지를 가리킨다. 본원에서 순 양전하는 생리적 pH에서 측정된다는 것을 알아야 한다. 생리적 pH에서 양전하를 띠는 자연 발생적 아미노산은 L-라이신, L-아르기닌 및 L-히스티딘을 포함한다. 생리적 pH에서 음전하를 띠는 자연 발생적 아미노산은 L-아스파틱산 및 L-글루타믹산을 포함한다.
전형적으로, 펩타이드는 양전하의 N-말단 아미노기 및 음전하의 C-말단 카복실기를 갖는다. 전하는 생리적 pH에서 서로 상쇄된다.
순 전하를 계산하는 하나의 예로서, 펩타이드 Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg는 한 개의 음전하 아미노산(즉, Glu)과 네 개의 양전하 아미노산(즉, 두 개의 Arg 잔기, 하나의 Lys 및 하나의 His)을 갖는다. 따라서, 상기 펩타이드는 세 개의 순 양전하를 갖는다.
본 발명의 일 실시양태에서, 방향족-양이온성 펩타이드는 생리적 pH에서 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r) 사이에, 3pm이 r+1 이하 중 최대수인 관계를 갖는다. 본 실시양태에서, 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r) 사이의 관계는 다음과 같다.
Figure pat00001
또 다른 실시양태에서, 방향족-양이온성 펩타이드는 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r) 사이에, 2pm이 r+1 이하 중 최대수인 관계를 갖는다. 본 실시양태에서, 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r) 사이의 관계는 다음과 같다.
Figure pat00002
일 실시양태에서, 순 양전하의 최소수(pm)와 아미노산 잔기의 총수(r)는 같다. 또 다른 실시양태에서, 펩타이드는 3 또는 4개의 아미노산 잔기 및 하나의 순 양전하의 최소값, 바람직하게는 두 개의 순 양전하의 최소값, 더욱 바람직하게는 세 개의 순 양전하의 최소값을 갖는다.
방향족-양이온성 펩타이드는 또한 순 양전하의 총수(pt)에 비해 방향족 기를 최소수로 갖는다는 것이 중요하다. 방향족 기의 최소수는 이하에서 (a)라 칭한다.
방향족 기를 갖는 자연 발생적 아미노산은 아미노산 히스티딘, 트립토판, 타이로신 및 페닐알라닌을 포함한다. 예를 들어, 헥사펩타이드 Lys-Gln-Tyr-Arg-Phe-Trp는 두 개의 순 양전하(라이신 및 아르기닌 잔기에 의함) 및 세 개의 방향족 기(타이로신, 페닐알라닌 및 트립토판 잔기에 의함)를 갖는다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드는 생리적 pH에서 방향족 기의 최소수(a)와 순 양전하의 총수(pt) 사이에, 3a가 pt+1 이하 중 최대수인 관계를 갖는다(단, pt가 1이고, a가 1인 경우를 제외한다). 본 실시양태에서, 방향족 기의 최소수(a)와 순 양전하의 총수(pt) 사이의 관계는 다음과 같다.
Figure pat00003
또 다른 실시양태에서, 방향족-양이온성 펩타이드는 방향족 기의 최소수(a)와 순 양전하의 총수(pt) 사이에, 2a가 pt+1 이하 중 최대수인 관계를 갖는다. 본 실시양태에서, 방향족 아미노산 잔기의 최소수(a)와 순 양전하의 총수(pt) 사이의 관계는 다음과 같다.
Figure pat00004
또 다른 실시양태에서, 방향족 기의 개수(a)와 순 양전하의 총수(pt)는 같다.
카복실기, 특히 C-말단 아미노산의 말단 카복실기는 바람직하게는, 예를 들어 암모니아와 아마이드화 반응하여 C-말단 아마이드를 형성한다. 다르게는, C-말단 아미노산의 말단 카복실기는 임의의 1차 또는 2차 아민과 아마이드화 반응될 수 있다. 1차 또는 2차 아민은, 예를 들어 알킬, 특히 분지형 또는 비분지형 C1-C4 알킬, 또는 아릴 아민일 수 있다. 따라서, 펩타이드의 C-말단에 있는 아미노산은 아마이도, N-메틸아마이도, N-에틸아마이도, N,N-다이메틸아마이도, N,N-다이에틸아마이도, N-메틸-N-에틸아마이도, N-페닐아마이도 또는 N-페닐-N-에틸아마이도 기로 전환될 수 있다.
본 발명의 방향족-양이온성 펩타이드의 C-말단에서 발생하지 않는 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파틱산 및 글루탐산 잔기의 유리(free) 카복실레이트기는 펩타이드 내 어디에서 발생하든지 아마이드화될 수도 있다. 이들 내부 위치에서의 아마이드화는 상술된 암모니아, 또는 임의의 1차 또는 2차 아민과의 반응에 의할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드는 두 개의 순 양전하와 하나 이상의 방향족 아미노산을 갖는 트라이펩타이드이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드는 두 개의 순 양전하와 두 개의 방향족 아미노산을 갖는 트라이펩타이드이다.
본 발명의 방법에 유용한 방향족-양이온성 펩타이드는 하기의 펩타이드 예들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pat00005
Figure pat00006
일 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 펩타이드는 뮤-오피오이드(mu-opioid) 수용체 작용제 활성을 갖는다(즉, 이들은 뮤-오피오이드 수용체를 활성화시킨다). 뮤-오피오이드 수용체의 활성화는 전형적으로 진통제 효과를 유발한다.
소정의 예에서, 뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖는 방향족-양이온성 펩타이드가 바람직하다. 예를 들어, 급성 질병 또는 조건에서와 같은 단기간 치료 시, 뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키는 방향족-양이온성 펩타이드를 사용하는 것이 유익할 수 있다. 상기 급성 질병 및 조건은 종종 중등도 또는 중증 고통을 수반한다. 이들 예에서, 방향족-양이온성 펩타이드의 진통제 효과는 인간 환자 또는 기타 포유동물의 치료 요법에 유익할 수 있다. 그러나, 뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키지 못하는 방향족-양이온성 펩타이드는, 임상 요건에 따르면, 진통제와 함께 또는 진통제 없이도 사용될 수 있다.
다르게는, 다른 예들에서, 뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖지 않는 방향족-양이온성 펩타이드가 바람직하다. 예를 들어, 만성병 상태 또는 조건에서와 같은 장기간 치료 시, 뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키는 방향족-양이온성 펩타이드를 사용하는 것은 금기시될 수 있다. 이들 예에서, 방향족-양이온성 펩타이드의 잠재적인 역효과 또는 중독성은 인간 환자 또는 기타 포유동물의 처리 요법에서 뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키는 방향족-양이온성 펩타이드의 사용을 배제할 수 있다. 잠재적인 역효과는 진정, 변비 및 호흡 저하를 포함할 수 있다. 상기 예에서, 뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키지 못하는 방향족-양이온성 펩타이드는 적합한 치료일 수 있다.
뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖는 본 발명의 방법에 유용한 펩타이드는 전형적으로 N-말단(즉, 첫 번째 아미노산 위치)에 타이로신 잔기 또는 타이로신 유도체를 갖는 펩타이드이다. 타이로신의 바람직한 유도체는 2'-메틸타이로신(Mmt); 2',6'-다이메틸타이로신(2'6'Dmt); 3',5'-다이메틸타이로신(3'5'Dmt); N,2',6'-트라이메틸타이로신(Tmt); 및 2'-하이드록시-6'-메틸타이로신(Hmt)를 포함한다.
바람직한 특정 실시양태에서, 뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖는 펩타이드는 식 Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2(편의상 두문자: DALDA로 표기함, 본원에서는 SS-01로 지칭됨)을 갖는다. DALDA는 아미노산 타이로신, 아르기닌 및 라이신에서 받은 세 개의 순 양전하를 가지며, 아미노산 페닐알라닌 및 타이로신에서 받은 두 개의 방향족 기를 갖는다. DALDA의 타이로신은, 식 2',6'-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2(즉, Dmt1-DALDA, 본원에서 SS-02로 지칭됨)를 갖는 화합물을 생성하기 위한 2',6'-다이메틸타이로신에서와 같은 타이로신의 개질된 유도체일 수 있다.
뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖지 않는 펩타이드는 일반적으로 N-말단(즉, 아미노산 1번 위치)에 타이로신 잔기 또는 타이로신의 유도체를 갖지 않는다. N-말단의 아미노산은 타이로신 이외 임의의 자연 발생적 또는 비-자연 발생적 아미노산일 수 있다.
일 실시양태에서, N-말단의 아미노산은 페닐알라닌 또는 이의 유도체이다. 페닐알라닌의 바람직한 유도체는 2'-메틸페닐알라닌(Mmp), 2',6'-다이메틸페닐알라닌(Dmp), N,2',6'-트라이메틸페닐알라닌(Tmp) 및 2'-하이드록시-6'-메틸페닐알라닌(Hmp)을 포함한다.
뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖지 않는 또 다른 방향족-양이온성 펩타이드는 식 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2(즉, Phe1-DALDA, 본원에서 SS-20으로 지칭됨)을 갖는다. 다르게는, N-말단 페닐알라닌은 페닐알라닌의 유도체, 예를 들어 2',6'-다이메틸페닐알라닌(2'6'Dmp)일 수 있다. 아미노산 1번 위치에서 2',6'-다이메틸페닐알라닌을 함유하는 DALDA는 식 2',6'-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2(즉, 2'6'Dmp1-DALDA)을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, Dmt1-DALDA(SS-02)의 아미노산 서열은 Dmt가 N-말단에 없도록 재배열된다. 뮤-오피오이드 수용체 작용제 활성을 갖지 않는 상기 방향족-양이온성 펩타이드의 예로는 식 D-Arg-2'6'Dmt-Lys-Phe-NH2(본원에서 SS-31로 지칭됨)을 갖는다.
DALDA, Phe1-DALDA, SS-31 및 이들의 유도체는 작용 유사체들을 더욱 포함할 수 있다. 유사체가 ALDA, Phe1-DALDA 또는 SS-31와 동일한 기능을 갖는다면, 펩타이드는 DALDA, Phe1-DALDA 또는 SS-31의 작용 유사체로 간주된다. 유사체는, 예를 들어 DALDA, Phe1-DALDA 또는 SS-31의 치환 변형체일 수 있으며, 이때 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산으로 치환된다.
DALDA, Phe1-DALDA 또는 SS-31의 적합한 치환 변형체는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산은 이들의 물리화학적 특성에 따라 다음과 같이 그룹화될 수 있다.
(a) 비-극성 아미노산: Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G);
(b) 산성 아미노산: Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);
(c) 염기성 아미노산: His(H) Arg(R) Lys(K);
(d) 소수성 아미노산: Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); 및
(e) 방향족 아미노산: Phe(P) Tyr(Y) Trp(W) His(H).
펩타이드 내 아미노산의 동일 그룹 내 또 다른 아미노산에 의한 치환은 보존성 치환이라 하고, 초기 펩타이드의 물리화학적 특성을 유지할 수 있다. 대조적으로, 펩타이드 내 아미노산의 다른 그룹 내 또 다른 아미노산에 의한 치환은 일반적으로 초기 펩타이드의 특성을 변형시킬 가능성이 높다.
뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키는 본 발명의 실시에 유용한 유사체의 예로는 표 1에 보인 방향족-양이온성 펩타이드를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Dab = 다이아미노뷰티릭
Dap = 다이아미노프로피온산
Dmt = 다이메틸타이로신
Mmt = 2'-메틸타이로신
Tmt = N,2',6'-트라이메틸타이로신
Hmt = 2'-하이드록시,6'-메틸타이로신
dnsDap = β-단실-L-α,β-다이아미노프로피온산
Bio = 바이오틴
뮤-오피오이드 수용체를 활성화시키지 않는 본 발명의 실시에 유용한 유사체의 예로는 표 2에 보인 방향족-양이온성 펩타이드를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pat00010
Figure pat00011
Cha = 사이클로헥실
1 및 2에 보인 펩타이드의 아미노산은 L- 또는 D-입체구조일 수 있다.
방법
상기 기재된 방향족-양이온 펩타이드는 세포 내에서 CD36 발현을 감소시키는 데에 유용하다. 본 발명의 목적상, CD36 발현이 약 10%, 바람직하게는 약 25%, 더욱 바람직하게는 약 50%, 더욱더 바람직하게는 약 75% 감소하는 경우 세포 내에서의 CD36 발현이 감소된 것으로 간주된다. 적정하게는, CD36이 세포 내에서 대략 정상 수준으로 감소된다.
CD36은 다양한 세포에서 발현된다. 이러한 세포의 예는 대식세포, 혈소판, 지방세포(adipocytes), 미세혈관내피세포(microvascular endothelial cells)와 제대정맥내피세포(umbilical vein endothelial cells)와 같은 내피세포; 장내상피세포, 담낭상피세포, 방광상피세포, 기관지상피세포 및 폐포상피세포와 같은 상피세포; 신세뇨관세포; 췌섬세포; 간세포; 골격근세포; 심장근육세포; 신경세포; 신경교세포(glia cells); 췌장세포; 정자세포 등을 포함한다.
본 발명의 목적상, 정상 세포보다 약 10%, 전형적으로는 약 25%, 더욱 전형적으로는 약 50%, 더욱더 전형적으로는 약 75%의 CD36을 더 발현시키는 세포가 증가된 수준의 CD36을 발현시키는 것으로 간주된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 세포 내에서 CD36 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. CD36을 발현시키는 임의의 세포가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있고, 상기 언급한 세포들을 포함한다. 세포 내에서 CD36 발현을 감소시키는 방법은 상기 세포를 상기 기재된 유효량의 방향족-양이온 펩타이드와 접촉시키는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CD36 발현의 감소가 요구되는 포유동물에서 CD36 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 포유동물에서 CD36 발현을 감소시키는 방법은 본원에 기재된 유효량의 방향족-양이온 펩타이드를 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
CD36 발현의 감소가 요구되는 포유동물은, 예컨대, 증가된 CD36 발현을 갖는 포유동물을 포함한다. 상기 증가된 CD36의 발현은 다양한 질병 및 질환과 관련된다. 증가된 CD36 발현을 특징으로 하는 질병 및 질환의 예는 죽상경화증, 염증, 비정상적 혈관신생, 비정상적 지질 대사, 세포사멸성 세포의 비정상적 제거, 뇌허혈 및 심근허혈과 같은 허혈, 허혈-재관류, 요관 폐쇄, 뇌졸중, 알츠하이머병, 당뇨병, 당뇨병성 신증 및 비만을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 문헌 [Febbraio M, Podrez EA, Smith JD, Hajjar DP, Hazen SL et al., Journal of Clinical Investigation 105:1049-1056, 2000]에서는 “B형 스캐빈저 수용체 CD36의 표적화된 혼란은 마우스에서 죽상경화성 환부의 확장으로부터 보호한다”라고 기재하고 있으며, 문헌 [Febbraio M, Hajjar DP and Silverstein RL. Journal of Clinical Investigation 108:785-791, 2001]에서는 “CD36: 혈관신생, 죽상경화증, 염증 및 지질 대사에 관련된 B형 스캐빈저 수용체”라고 기재하고 있는바, 죽상경화증에서의 CD36의 연관성에 대한 논의가 있었음을 알 수 있다.
CD36 발현의 감소가 요구되는 포유동물은 당뇨병성 합병증을 앓고 있는 포유동물도 포함한다. 당뇨병성 합병증은 신장병 외에도 신경병(neuropathy), 망막병증(retinopathy), 관상 동맥 질환 및 당뇨병과 연관된 말초혈관 질환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 제거된 기관 및 조직에서 CD36 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 제거된 기관 또는 조직을 상기 기재된 유효량의 방향족-양이온 펩타이드와 접촉시키는 것을 포함한다. 기관 또는 조직은, 예컨대, 자가 또는 이종 이식을 위해 제공자로부터 제거된다. 기관 및 조직은 심장, 폐, 췌장, 신장, 간, 피부 등을 포함한다.
<실시예 1: SS-31에 의한 산화된 저밀도 리포프로틴(lipoprotein)(oxLDL)-유도된 CD36 발현 및 마우스 복막 대식세포에서의 포말 세포(foam cell) 형성의 감소>
죽상경화증은 포말세포의 성장 및 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)의 합성을 일으켜 평활근세포의 증식을 유발시키는 혈관벽 대식세포에 의한 지방흡수의 결과로써 진행된다. CD36은 대식세포로의 oxLDL의 흡수 및 이어지는 포말세포의 발달을 매개하는 스캐빈저 수용체이다. CD36 결여 마우스(CD36 knock out mice)는 감소된 oxLDL의 흡수 및 감소된 죽상경화증을 보여준다.
CD36 발현은 글루코오스 및 oxLDL을 포함하는 다양한 세포 자극에 의한 전사적 수준(transcriptional level)에서 조절된다. 대식세포를 마우스의 복막강으로부터 채취하여 oxLDL 없이 하룻밤 동안 또는 oxLDL(50μg/ml)의 존재 하에 48시간 동안 배양하였다. oxLDL과 함께 배양시킴으로써 CD36 mRNA를 상당히 증가시켰다(도 1A). 배지에 SS-31(10nM 또는 1μM)을 함입하여 CD36의 상향조절을 억제시켰다(도 1A). SS-31 자체는 CD36 발현의 영향을 주지 않았다.
웨스턴 블럿(western blot)으로 측정한 바와 같이, 부형약 대조군(V)(도 1B)과 비교하는 경우, CD36 단백질의 발현은 25μg/ml의 oxLDL(oxL)과 함께 48시간 동안 배양한 후에도 상당히 증가했다. 다른 대조군들은 마우스 심장(H) 및 CD36 제거 마우스(KO)로부터 수득된 대식세포를 포함한다. CD36 단백질의 양은 β-액틴으로 표준화되었다. SS-31(1μM)(S)과 함께 배양함으로써 부형약 대조군(V)(P<0.01, ANOVA with posthoc Neuman Keuls test)에 노출된 대식세포에 비해 CD36 단백질 발현을 상당히 감소시켰다. 상기 배양에 더하여 SS-31(1μM)와 배양함으로써 25μg/ml oxLDL(oxL/S) (P<0.01, ANOVA with posthoc Neuman Keuls test)에 48시간 동안 노출된 대식세포에서의 CD36 단백질 발현의 상향조절 또한 상당히 억제시켰다.
대식세포와 oxLDL를 48시간 동안 배양시켜 포말세포의 형성 또한 증가시켰다(도 1C). 포말세포는 지방소적(lipid droplet)을 붉게 착색시키는 오일 레드 O(oil red O)로 표시된다. SS-31(1μM)의 함입은 oxLDL-유도 포말세포 형성을 억제시킨다(도 1C).
대식세포를 oxLDL과 배양시켜 6.7%에서 32.8%로 세포 사멸을 증가시켰다. 이와 함께 SS-31(1nM)을 수반한 처리에 의해 oxLDL에 의해 유도되는 세포 사멸을 20.8%로 상당히 감소시켰다.
<실시예 2: SS-31을 사용한 급성 뇌허혈로부터의 보호>
뇌허혈은 뇌손상을 일으키는 세포 및 분자의 사건들을 단계적으로 발생시킨다. 이러한 사건 중 하나는 허혈후 염증이다. 뇌허혈-재관류(중대뇌동맥의 20분간 폐쇄)의 마우스 모델을 사용하여, CD36이 허혈 후 뇌에서 소신경세포 및 대식세포에서 상향조절 되는 것이 발견되었으며, 증가된 반응성 산소종의 생성도 증가이 있었다. CD36 제거 마우스에서는 야생 마우스에 비하여 허혈 후 반응성 산소종이 상당히 감소하였고, 신경 기능이 개선되었다.
뇌허혈은 우측 중대뇌동맥의 폐쇄로 인하여 30분 동안 유도되었다. 야생형(WT) 마우스에게는 살린(saline) 부형약(Veh)(ip, n=9) 또는 SS-31(2mg/kg 또는 5mg/kg, ip, n=6) 중의 하나가 허혈 후 0, 6, 24 및 48시간에 제공되었다. 마우스들은 허혈 후 3일째 사망했다. 뇌를 제거하고, 냉동하고 절개하였다. 절개된 뇌를 니슬(Nissl) 착색제로 착색하였다. 경색부(infarct volume) 및 반구 부종(hemispheric swelling)이 영상 분석기를 사용하여 측정되었다. 데이터는 사후 검정을 이용하여 일원분산분석(one-way ANOVA)으로 분석하였다.
중대뇌동맥을 30분 동안 폐쇄한 후, 야생형 마우스를 0, 6, 24 및 48시간에서 SS-31(2mg/kg 또는 5mg/kg, ip, n=6)로 치료한 결과 살린 대조군과 비교했을 때 경색부(도 2A)와 반구 부종(도 2B)의 상당한 감소가 나타났다(Veh에 비해 *P<0.05).
야생 마우스에서의 30분간 뇌허혈은 동측성 피질(ipsilateral cortex) 및 선조체(striatum)에서 부형약 처리 동물에서의 대측성(contralateral) 측면에 비하여 감소된 글루타티온(GSH)에서 상당한 상실을 초래했다(도 3). 동측성 피질에서의 GSH의 상실은 SS-31(0, 6, 24 및 48시간에서의 2mg/kg ip)로 처리된 마우스에서 상당히 감소하였다(도 3). 선조체에서의 GSH의 상실의 경우도 SS-31에 의해 감소하였지만 통계적 의의가 존재하지는 않았다.
<실시예 3: CD36 제거 마우스에서 관찰된 급성 뇌허혈 모방 보호에 대한 SS-31 매개된 보호>
CD36 제거(CD36 KO) 마우스에게 실시예 2에 기재된 바와 같이 급성 뇌허혈을 발병시켰다. CD36 KO 마우스에게 살린(saline) 부형약(Veh)(ip, n=5) 또는 SS-31(2mg/kg, ip, n=5) 중의 하나를 30분 허혈 후 0, 6, 24 및 48시간에 제공하였다. CD36 KO 마우스의 경색부(도 4A) 및 반구 부종(도 4B)은 살린을 투여한 경우이건 SS-31을 투여한 경우이건 유사했다.
CD36 KO 마우스를 SS-31(2mg/kg, ip, n=5)로 치료한 경우도 30분 허혈에 의해 발생한 동측성 피질에서의 GSH 상실을 추가적으로 예방하지 못했다(도 5).
이들 데이터는 급성 뇌허혈에 대한 상기 SS-31의 보호 작용이 CD36의 상향조절을 억제함으로써 매개될 수 있다는 것을 암시한다.
<실시예 4: SS-31에 의한 허혈 후 뇌에서의 CD36 mRNA 발현의 감소>
중대뇌동맥의 일과성(transient) 폐쇄는 허혈 후 뇌에서 소신경세포 및 대식세포에서의 CD36 mRNA의 발현을 상당히 증가시킨다는 것이 알려져 왔다. 야생형 마우스에게 살린(saline) 부형약(Veh, ip, n=6) 또는 SS-31(5mg/kg, ip, n=6)을 30분 허혈 후 0 및 6시간에 제공하였고, CD36 mRNA 수준을 실시간(real time) PCR을 사용하여 결정하였다. 살린을 투여한 마우스의 대측성 뇌에 비해 동측성 뇌에서 CD36 발현을 거의 6배 상향조절하였다(도 6). CD36 mRNA는 SS-31을 투여한 마우스의 동측성 뇌에서 상당히 감소하였다(도 6).
<실시예 5: 신세뇨관 세포에서의 SS-31에 의한 CD36의 상향조절의 억제 mRNA 발현의 감소.일측성 요로 폐쇄>
일측성 요로 폐쇄(unilateral ureteral obstruction, UUO)는 관상세포사멸, 대식세포 침윤 및 간질성 섬유증(interstitial fibrosis)과 연관된 통상의 임상적 장애(clinical disorder)이다. 간질성 섬유증은 저산소 환경을 유도하고, 외과적인 교정에도 불구하고 신장 기능의 점진적인 감소를 야기한다. CD36은 신세뇨관 세포에서 발현한다는 것이 알려져 있다.
CD36은 UUO 후 관상 세포에서 상향조절되는 것이 밝혀졌다. UUO는 스프레이그-돌리(Spraque-Dawley) 래트에서 수행하였다. 상기 래트를 UUO의 도입 하루 전 및 UUO 후 14일 동안 매일 살린(ip, n=6) 또는 SS-31 (1mg/kg, ip, n=6)로 처리하였다. 래트가 사망한 후, 신장을 제거하여 파라핀에 임베딩하고 절개하였다. 상기 슬라이드를 상온에서 1.5시간 동안 항-CD36 다클론성 IgG(블록킹 혈청을 갖는 Santa Cruz #sc-9154; 1:100)로 처리하였다. 이후, 상기 슬라이드를 상온에서 30분 동안 바이오틴과 결합된 2차 항체(항-래빗 IgG-B1; ABC 키트, PK-6101)와 함께 배양시켰다. 이후, 상기 슬라이드를 아비딘으로 처리하여, DAB로 현상하고 10%의 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색하였다. 상기 대측성 비폐쇄 신장은 각 동물에 대한 대조군으로 작용하였다.
UUO는 관형 팽창(tubular dilation)을 일으켰고 관상 세포에서의 CD36의 발현에 있어서 상당한 증가를 가져왔다(도 7). 관형 팽창은 또한 SS-31로 처리된 래트에서도 관찰되었으나, CD36 발현에 있어서는 상당히 감소했다(도 3). CD36 발현(갈색 착색)은 주로 대측성 비폐쇄 신장의 관상 세포에서 발견된다(도 7A). CD36 발현은 살린으로 처리된 동물의 폐쇄된 신장에서 증가했으나(도 7B), SS-31로 처리된 래트로부터 수득된 폐쇄된 신장에서 훨씬 더 감소했다(도 7C).
SS-31이 UUO 후 신장에서 지질과산화를 감소시키는지 여부를 결정하기 위해서, 래트를 UUO의 도입 하루 전에 살린(n=6) 또는 SS-31(1mg/kg, ip, n=6)로 처리하였고, 이후 14일 동안 하루에 한번 씩 처리하였다. 래트가 사망한 후, 신장을 제거하여 파라핀에 임베딩하고 절개하였다. 슬라이드를 항-HNE 래빗 IgG와 함께 배양시켰고, 바이오틴-연계된 항-래빗 IgG를 2차 항체로 사용하였다. 상기 슬라이드를 DAB로 현상하였다. UUO에 의해 증가되는 지질과산화는 SS-31 처리에 의해 감소되었다(도 8). HNE 염색(갈색)은 상기 대측성 대조군(도 8A)에 비해 상기 폐쇄된 신장(도 8B)의 관상 세포에서 상당히 증가했다. SS-31로 처리된 래트의 폐쇄된 신장은 살린-처리된 래트(도 8B)에 비해 훨씬 덜 HNE 염색(도 8C)되는 것을 나타냈다.
SS-31이 UUO 후 폐쇄된 신장에서 관상 세포 사멸을 감소시키는지 여부를 결정하기 위해서, 래트를 UUO의 도입 하루 전에 살린(n=6) 또는 SS-31(1mg/kg, ip, n=6)로 처리하였고, 이후 14일 동안 하루에 한번 씩 처리하였다. 래트가 사망한 후, 신장을 제거하여 파라핀에 임베딩하고 절개하였다. 핵을 단편화된 DNA로 정량화하기 위하여, 터넬 분석(TUNEL assay)을 in situ 터넬 키트(Intergen, Purchase, NY)로 수행하였다. 슬라이드를 DAB로 현상하고 10%의 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 관상 세포 사멸과 연관된 살린-처리된 대조군에서의 CD36의 상향조절은 SS-31 처리(도 9)에 의해 상당히 억제되었다. 상기 대측성 비폐쇄 대조군(도 9A)과 비교하여, 세포사멸성 세포의 상당한 증가가 살린-처리된 대조군(도 9B)으로부터의 폐쇄된 신장에서 관찰되었다. 세포사멸성 세포의 수는 SS-31 처리된 동물(도 9C)(P<0.001; n=6)로부터의 폐쇄된 신장에서 상당히 감소되었다.
대식세포 침윤(도 10) 및 간질성 섬유증(도 11)은 또한 SS-31 처리에 의해 억제된다. 래트를 UUO의 도입 하루 전에 살린(n=6) 또는 SS-31(1mg/kg, ip, n=6)으로 처리하였고, 이후 14일 동안 하루에 한번 씩 처리하였다. 래트가 사망한 후, 신장을 제거하여 파라핀에 임베딩하고 절개하였다. 슬라이드를 EDI 대식세포(1:75; Serotec)에 대한 단일클론 항체로 처리하였다. 호스래디쉬-퍼옥시다제(Horseradish-peroxidase)-연관 래빗 항-마우스 2차 항체(Dako)를 대식세포 검출을 위해 사용하였다. 절개 부분을 이후 10%의 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색하였다. 관상 세포 사멸과 연관된 살린-처리된 래트(도 10B)의 폐쇄된 신장에서의 대식세포의 수는 상기 대측성 비폐쇄 대조군(도 10A)와 비교하여 상당히 증가하였다. 대식세포 침윤은 SS-31로 처리된 래트(도 10C)에서 상당히 감소하였다(P<0.005; t-시험).
래트를 UUO의 도입 하루 전에 살린(n=6) 또는 SS-31(1mg/kg, ip, n=6)으로 처리하였고, 이후 14일 동안 하루에 한번 씩 처리하였다. 래트가 사망한 후, 신장을 제거하여 파라핀에 임베딩하고 절개하였다. 슬라이드를 헤마톡실린, 에오신(eosin) 및 간질성 섬유증에 대한 메이슨 트리콤(Masson's trichome)으로 염색하였다(파란 염색). 살린-처리된 래트로부터의 폐쇄된 신장은 상기 대측성 비폐쇄 대조군(도 11A)와 비교하여 증가된 섬유증을 나타내었다(도 11B). 반면에, SS-31 처리된 래트로부터의 폐쇄된 신장은 상당히 절 섬유증을 나타내었다(P<0.05; t-test).
이들 결과는 SS-31이 UUO에 의해 유도되는 신세뇨관 세포의 상향조절을 억제한다는 것을 보여준다.
<실시예 6: 연장된 저온 허혈성 보관 후 재관류시의 분리된 심장에서의 SS-31 및 SS-20에 의한 CD36 발현의 감소>
기관 이식은 수령자에게 옮기기 위해 분리된 기관의 냉각 보관을 필요로 한다. 현재, 심장 이식은 관상동맥의 혈류가 심각하게 손상되기 전까지(<4시간) 견딜 수 있는 짧은 기간의 저온 허혈성 보관으로 제한받는다. 관상동맥 내피세포 및 심장 근육에서의 CD36의 발현은 저온 허혈성 저장 및 온열 재관류를 받는 분리된 심장에서 상향조절된다.
격리시킨 기니픽 심장을 3분 동안 토마스 용액 단독, 또는 1 nM SS-31 또는 100 nM SS-20을 함유하는 토마스 용액으로 충만시킨 다음, 동일한 용액에서 4℃에서 18시간 동안 저장시켰다. 허혈 저장 후, 심장을 34℃ 크렙-헨슬레(Kreb-Henseleit) 용액으로 90분 동안 충만시켰다. 기니픽으로부터 새롭게 격리된 심장을 제어군으로 사용하였다.
심장을 파라핀에 고정하고, 항-CD36 래빗 다클론성 항체에 의한 면역염색용으로 조각내었다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 각 처리군마다 두 개의 분절을 보였다. 항체 염색은 CD36이 정상 심장의 내피 세포 및 심근에서 발현되었다. "배경" 제어군(도 12A 및 12B)은 1차 항체로 처리되지 않은 비-허혈성 정상 심장으로부터의 두 개 분절을 나타낸다. "정상 심장"(도 12C 및 12D)은 비-허혈성 심장으로부터 얻어진 두 개의 분절을 나타낸다. 4℃에서 18시간 동안 토마스 용액에 저장된 심장 표본으로부터의 분절(도 12E 및 12F)은 "정상 심장"에 비해 증가된 CD36 염색을 보였다. CD36 염색은 18시간 동안 토마스 용액 중 1nM SS-31(도 12G 및 12H) 또는 100nM SS-20(도 12I 및 12J)에 저장된 심장에서 가장 감소되었다.
CD36 염색은 18시간의 냉허혈 저장 및 온열 재관류를 거친 심장에서 증가되었다. 그러나, 1nM SS-31 또는 100nM SS-20에 저장된 심장은 CD36 발현의 상향조절을 보이지 않았다.
심장에서의 지질 과산화는 또한 방향족-양이온성 펩타이드에 의해 감소되었다. 기니픽 심장을 심장정지액(St. Thomas solution) 단독, 또는 1nM SS-31 또는 100nM SS-20을 함유하는 토마스 용액으로 3분 동안 충만시킨 다음, 18시간의 냉허혈(4℃) 처리하였다. 이어서, 심장을 34℃에서 90분 동안 크렙스 헨슬레 완충액으로 재관류시켰다. 조직의 얇은 조각으로부터의 파라핀 분절에서 4-하이드록시노넨올(HNE)-개질 단백질의 면역조직화학적 분석을 항-HNE 항체(산타 크루즈) 및 형광성 2차 항체 배양으로 수행하였다. HNE 염색은 비-허혈성 심장(도 13A)에 비해 토마스 용액(도 13B)에 18시간 한랭 저장 처리된 심장에서 크게 증가되었다. HNE 염색은 SS-31(도 13C) 또는 SS-20(도 13D)에 저장된 심장에서 감소되었다.
또한, 펩타이드는 내피 세포사멸을 크게 감소시켰다(도 14). 기니픽 심장을 심장정지액(St. Thomas solution) 단독, 또는 1nM SS-31 또는 100nM SS-20을 함유하는 토마스 용액으로 3분 동안 충만시킨 다음, 18시간의 냉허혈(4℃) 처리하였다. 이어서, 심장을 34℃에서 90분 동안 크렙스 헨슬레 완충액으로 재관류시켰다. 탈파라핀화한 후, 분절을 다이곡시제닌-dNTP를 함유한 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(Tdt)로 배양시켰다. 종결용 완충액으로 반응을 정지시켰다. 이어서, 형광성 항-다이곡시제닌 항체를 적용하였다. 토마스 용액에 18시간 한랭 저장시킨 심장(도 14C 및 14D)은 내피 세포사멸을 현저히 보이는 반면, 비-허혈성 정상 심장(도 14A 및 14B)에서는 내피 세포사멸이 전혀 관찰되지 않았다. 세포사멸성 세포는 SS-31(도 14E 및 14F) 또는 SS-20(도 14G 및 14H)에 저장된 심장에서 관찰되지 않았다.
지속성 냉허혈 저장 및 온열성 재관류 후 관상동맥 혈류량은 크게 향상되었다(도 15). 기니픽 심장을 심장정지액(St. Thomas solution; 토마스 용액) 단독, 또는 1nM SS-31(도 15A) 또는 100nM SS-20(도 15B)을 함유하는 토마스 용액으로 3분 동안 충만시킨 다음, 18시간의 냉허혈(4℃) 처리시켰다. 이어서, 심장을 34℃에서 90분 동안 크렙스 헨슬레 완충액으로 재관류시켰다. 관상동맥 흐름은 예비-허혈성 제어군(100%로 발현됨)에 비해 지속성 허혈 후에 크게 감소되었다. SS-31 또는 SS-20에서의 보존으로 예비-허혈성 흐름의 대략 80%까지 관상동맥 흐름을 상당히 회복하였다.
<실시예 7: SS-31에 의한 당뇨 생쥐의 신장 손상 예방>
CD36은 단핵구, 심장, 신장 및 플라즈마를 포함하는 당뇨 환자의 다양한 조직에서 상향조절된다. 고혈당은 CD36 mRNA의 전이 효능을 향상시킴으로써 CD36의 발현을 상향조절시키는 것으로 알려져 있다. 당뇨병성 신증은 1형 당뇨 및 2형 당뇨의 통상적인 합병증이고, 관상 내피 퇴화 및 사이질 섬유화와 관련되어 있다. CD36은 당뇨병성 신증에서 관상 내피 세포사멸의 중개자로 확인되었다. 고혈당은 근위 관상 내피세포에서의 CD36 발현 및 세포사멸을 자극한다.
스트렙토조토신(STZ)은 생쥐의 당뇨병을 유발시키는 데 사용되었다. CD-1 생쥐의 3개 그룹이 연구되었다: I 그룹-STZ 처리 없음; II 그룹-STZ(50mg/kg)는 5d에 대해 하루에 한번 처리되었다; III 그룹-STZ(50mg/kg, ip)는 5d에 대해 하루에 한번 처리되었고, SS-31(3mg/kg, ip)은 16d에 대해 하루에 한번 처리되었다. STZ 처리로 혈당이 누진적으로 증가하게 되었다. 3주 쯤에, 혈당값은: I 그룹(10.6±0.27mmol/L); II 그룹(24.5±1.15mmol/L); III 그룹(21.3±1.48mmol/L)이었다. 동물을 3주 후에 희생시키고, 신장 조직을 조직병리학용으로 보존하였다. 신장 분절을 신장 관상 솔가장자리용 주기성 쉬프 염색(PAS)으로 관찰하였다.
STZ 처리는 신장 피층(도 16)의 근위 세관의 솔가장자리의 엄청난 손실을 야기시켰다. STZ로 처리되지 않은 생쥐에서, 피층에서의 신장 솔가장자리는 PAS로 붉게 염색되었다(도 16A, 흰 화살표 참조). STZ로 처리된 생쥐에서, 솔가장자리는 없어졌고, 관상 상피세포는 응축된 작은 핵을 보였다(도 16B). SS-31(3mg/kg, ip)로 매일 처리하면 STZ-처리된 생쥐에서 솔가장자리의 손실은 방지되었고(도 16C), 핵은 정상인 것처럼 보였다(도 16C, 상부와 중간 패널). 일반적으로, 근위 신장 세관의 구조는 SS-31로 처리된 당뇨 생쥐에서 유지되었다.
STZ 처리는 관상 상피세포에서의 세포사멸을 크게 감소시켰다(도 17). 신장 분절은 TUNEL 분석을 사용하여 세포사멸용으로 관찰되었다. 탈파라핀화한 후, 분절을 다이곡시제닌-dNTP를 함유한 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(Tdt)에 의해 배양되었다. 반응을 종결용 완충액으로 정지시켰다. 이어서, 형광성 항-다이곡시제닌 항체가 적용되었다. STZ로 처리된 생쥐로부터의 신장 분절은, STZ로 처리되지 않은 생쥐에서 세포사멸이 전혀 없는 것과 달리(도 17A, 패널 a), 근위 세관(PT)에서 다수의 세포사멸성 세포를 보여주었다(도 17A, 패널 b). 매일 SS-31로 처리하면 근위 세관에서 세포사멸성 세포가 현저히 감소되었다(도 17A, 패널 c). 도 17B는 SS-31에 의해 제공된 관상 세포사멸에서 큰 감소가 있었음을 보여준다.
근위 관상 상피세포에서의 CD36 발현은 고혈당에 의해 증가되는 것으로 알려져 있고, 당뇨 모델에서 상향조절된다. SS-31은, CD36 발현을 감소시킴으로써, STZ로 처리된 생쥐의 혈당에는 영향을 미치지 않으면서 이의 솔가장자리 손실 및 관상 세포사멸을 억제시킬 수 있었다.

Claims (3)

  1. 당뇨병성 합병증 치료용 의약 조성물로서, 상기 조성물은 D-Arg-2',6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 구강, 국소, 비강, 전신, 정맥주사, 피하, 근육내 또는 경피 투여되는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 당뇨병성 합병증은 당뇨병성신경병증(diabetic neuropathy)인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
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