KR20160055922A - 신규 ctl 에피토프 4 연결 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

HLA 형 검사를 할 필요가 없고 특정 HLA 형을 가진 환자에 한정되지 않고, 암 펩티드 백신으로 다양한 암 환자에게 투여할 수 있는 암 항원 펩티드의 제공.
CTL 유도능을 가지고 있음이 보고된 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드 군으로부터 선택된 4 개의 CTL 에피토프 펩타이드에 대해 링커를 통해 연결하여 얻어진 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드.

Description

신규 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드{NOVEL FOUR-CTL EPITOPE-JOINED PEPTIDE}
본 발명은 암 항원 펩티드로서 유용한 신규 펩타이드 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HLA-A 구속성에 CTL 유도 능을 가지는 펩타이드를 4 개 연결하여 이루어지는 신규 암 항원 펩티드 및 이를 이용한 의약 조성물에 관한 것이다.
암은 일본인의 사망 원인 제 1 위를 차지하여 연간 약 35 만명이 사망하고 있으며, 지금도 심각한 질병이다. 확립된 암 치료법으로는 주로 외과적 절제술, 항암 치료 및 방사선 치료가 있다. 그러나, 이러한 치료는 재발, 삶의 질(QOL)의 저하, 심지어는 앞서 언급 한 치료법을 받을 수 없는 진행 암인 경우의 치료법이 없는 등의 문제가 있다.
암 면역 요법(암 백신 요법)은 오랫동안 새로운 치료법으로 기대되고 인간 종양 항원의 에피토프 펩타이드가 식별 가능하게 된 1990년부터 암 펩티드 백신 임상 연구가 전 세계적으로 시작되었다. 그러나 펩티드 단독 투여 또는 병용 요법으로 임상 연구 성과의 분석 결과에 따르면, 1,000 명 이상의 투여 예 중 반응률은 2.7%(비특허문헌 1)이며, 실용화의 어려움이 지적되어있다.
한편, 일본에서도 긴 세월에 걸쳐 자신의 암 펩티드 백신을 이용한 임상 연구가 지속적으로 이루어 점차 그 성과가 밝혀왔다. 최근에는 치료 성적 향상을 목표로 연구의 하나로서 1 종의 암 펩타이드를 투여하는 것이 아니라 여러 종류의 암 펩타이드를 투여하는 전략도 시작했다. 예를 들어, 환자의 HLA 유형 및 특이적 면역 반응을 미리 검사하여 투여하는 펩티드를 여러 종 선택 테일러 메이드 형 암 펩티드 백신 요법이 실시되고 있으며, 안전성 및 항 종양 효과가 확인되어 있다. 구체적으로는 테일러 메이드 형 펩티드 백신 단독 투여 및 항암제와의 병용에 의해 뇌종양, 자궁 경부암, 나아가서는 전립선암, 췌장암에서 뛰어난 임상 효과 및 안전성이 달성 되었다(비특허문헌 2,3,4).
암 펩티드 백신 요법에서 주요 이펙터 세포로 간주되는 에피토프 특이적 세포 독성 T 림프구 (이하, CTL로 약칭한다)에 의한 세포성 면역은 HLA 구속성이며 특정 HLA 형, 구체적으로 대상 환자 수가 많은 HLA-A2 또는 HLA-A24를 가진 환자만을 대상으로 한 암 펩티드 백신 개발이 실시되어 왔다.
그러나 이러한 2 종의 HLA 형 보유 비율은 일본인에 있어서 각각 약 40%, 60%(비특허문헌 5)이며, 이들 2 종 이외의 HLA 형을 가진 환자는 암 펩티드 백신의 혜택을 누릴 수 없는 문제점이 있다. 또한 치료 시작 전에 HLA 형 검사를 요한다는 것이 치료의 시작시기를 지연시키고 환자 부담을 증가시키는 요인이 되고 있다. 이상으로부터 HLA 형 검사를 필요로 하지 않고, 모든 암 환자에 적응할 수 있는 암 펩티드 백신의 개발 및 연구가 요구되고 있다.
또한 암 펩티드 백신 요법에서 세포 면역인 CTL의 활성화뿐만 아니라, 액성 면역인 면역 글로불린 생산이 유도됨으로써 연명 효과에 기여하는 것으로 알려져있다(비특허문헌 6).
[비특허문헌 1] Rosenberg SA et al., Nature Med. 2004, 10(9): 909-15 [비특허문헌 2] Terasaki M et al., J Clin Oncol. 2011, 29(3):337-44 [비특허문헌 3] Noguchi M et al., Cancer lmmunol. lmmunother. 2010, 59(7):1001-9 [비특허문헌 4] Yanagimoto H et al.，Cancer Sci. 2007, 98(4): 605-11 [비특허문헌 5] Sette A et al., Immunogenetics. 1999, 50(3-4):201-12 [비특허문헌 6] Noguchi M et al., Cancer Biol. Ther. 2011, 10(12):1266-79
본 발명은 특정 HLA 형을 가진 환자에 한정되지 않고, 암 펩티드 백신으로 다양한 암 환자에게 투여할 수 있으며, 또한 면역 글로불린을 강하게 유도할 수 있는 암 항원 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 또는 HLA-A3 슈퍼 타입 중 하나 또는 상기 복수의 HLA-A 구속성에 CTL 유도능을 갖는 것으로 보고되고 있는 CTL 에피토프 펩티드보다 선택된 4 개의 펩티드에 대해 링커를 통해 연결함으로써 CTL 에피토프 4 연결 펩티드를 얻었다. 상기 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드에 대해 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, 공지된 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드로부터 선택되는 특정 13 종류의 펩타이드로 구성된 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드가 HLA 형 검사를 필요로 하는 일 없이 특정 HLA 형을 가진 환자에 한정되지 않고 다양한 암 환자에게 투여 가능하다는 것을 발견 하였다. 또한 해당 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드를 투여함으로써 해당 펩타이드를 구성하는 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL에 추가되어 면역 글로불린이 강하게 유도되는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음과 같은 특징을 가진다.
[1] 다음의 CTL 에피토프 펩타이드: 서열번호 1로 표시되는 펩타이드 "PEP1", 서열번호 2로 표시되는 펩타이드 "PEP2", 서열번호 4로 표시되는 펩타이드 "PEP4", 서열번호 5 표시되는 펩타이드 "PEP5", 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드 "PEP6", 서열번호 7로 표시되는 펩타이드 "PEP7", 서열번호 8로 표시되는 펩타이드 "PEP8", 서열번호 9로 표시되는 펩타이드 "PEP9", 서열번호 10으로 표시되는 펩타이드 "PEP10", 서열번호 13으로 표시되는 펩타이드 "PEP13", 서열번호 15로 표시되는 펩타이드 "PEP15", 서열번호 17로 표시되는 펩타이드 " PEP17 ", 서열번호 18로 표시되는 펩타이드 "PEP18 "
로 이루어진 군에서 중복 선택될 수 있는 4 개의 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어지고 친수성 아미노산으로 구성된 새로운 펩타이드 서열을 가질 수 있는 에피토프 4 연결 펩티드이며,
하기 (1) ~ (5)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 상기 에피토프 4 연결 펩타이드:
(1) C 말단이 PEP2이다(단, N 말단이 PEP7 및 PEP8이며, N 말단에서 링커를 통해 이웃 순인 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4이다;
(3) C 말단이 PEP10이다;
(4) C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단에서 링커를 통해 이웃 순서이다;
(5) PEP5, PEP6, PEP9 및 PEP18을 포함한다.
[2] [1]에 있어서, PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18에서 선택되는 중복되지 않는 4 개의 펩티드가 링커를 통해 각각 연결되어 이루어지는 에피토프 4 연결 펩타이드.
[3] 하기의 (1) ~ (5)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가지는 [1] 또는 [2]의 에피토프 4 연결 펩타이드 :
(1) PEP1, PEP7, PEP8 및 PEP13에서 선택되는 3 개의 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP2임 (단, N 말단이 PEP7 및 PEP8이며, N 말단 측에서 링커를 통해 이어져 순서인 것을 제외);
(2) PEP5, PEP6 및 PEP9의 세 CTL 에피토프 펩티드를 포함하며 C 말단이 PEP4임;
(3) PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18에서 선택되는 3 개의 CTL 에피토프 펩티드를 포함하며 C 말단이 PEP10임;
(4) PEP1 및 PEP7의 두 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단에서 링커를 통해 이어진 순서임;
(5) PEP5, PEP6 및 PEP18의 세 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP9임.
[4] 하기로부터 선택되는 서열을 포함하는 에피토프 4 연결 펩타이드:
PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2；
PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2；
PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10;
PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10;
PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;
PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;
PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10；
PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9；
PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9；
PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5；또는,
PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5
(식 중 「-(L)-」는 링커를 나타낸다).
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서 링커가 아미노산 링커인 에피토프 4 연결 펩타이드.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서 아미노산 링커가 아르기닌을 2 개 또는 3 개 연결한 아르기닌 다이머 또는 아르기닌 트리머인 에피토프 4 연결 펩타이드.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서 친수성 아미노산으로 구성된 새로운 펩타이드 서열이 N 말단에 연결된 에피토프 4 연결 펩타이드.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서 친수성 아미노산으로 구성된 새로운 펩타이드 서열이 아르기닌을 3 개 연결한 아르기닌 트리머 또는 아르기닌을 4 개 연결한 아르기닌 테트라머 이루어진 에피토프 4 연결 펩타이드.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33 ; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 42; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 배열 번호 46; 서열번호 47; 서열번호 48; 서열번호 49; 서열번호 50; 서열번호 51; 서열번호 52; 서열번호 53; 서열번호 54; 서열번호 55; 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58 ; 서열번호 59; 서열번호 60; 서열번호 61; 서열번호 62; 서열번호 63; 서열번호 64; 서열번호 65; 또는 서열번호 66로 표시되는 아미노산 서열로 에피토프 4 연결 펩타이드.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 에피토프 4 연결 펩타이드를 이용하여 말초 혈액 림프구를 자극함으로써 얻어지는 CTL.
[11] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 에피토프 4 연결 펩타이드 또는 [10]에 기재된 CTL을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물.
[12] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 에피토프 4 연결 펩타이드를 2 종 이상 포함하는 약학 조성물.
[13] [11] 또는 [12]에 있어서 면역 요법제인 약학 조성물.
[14] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 에피토프 4 연결 펩타이드, [10]의 CTL 또는 [11] 내지 [13] 중 어느 하나의 의약 조성물을 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2013-218524 호, 2014-155132 호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함하고 있다.
본 발명에 의하면, 특정 HLA 형을 가진 환자에 한정되지 않고, 암 펩티드 백신으로 다양한 암 환자에게 투여할 수 있으며, 또한 면역 글로불린을 강하게 유도할 수 있는 암 항원 펩티드를 제공할 수 있다.
본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩티드는 HLA 형 검사가 필요없이 다양한 암 환자, 예를 들어 HLA-A2 양성 환자군, HLA-A24 양성 환자군, HLA-A26 양성 환자군, HLA-A3 슈퍼 유형 양성 환자군에 투여할 수 있으며, 해당 환자의 암 또는 그것에 기인하는 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드를 구성하는 종양 항원은 여러 암종에서 발현이 인정되고 있기 때문에 본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드는 다양한 암종을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물(보다 상세하게는 면역 요법제)로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 투여함으로써, 구성되는 CTL 에피토프 펩티드를 혼합하여 동량 투여한 경우에 비해 CTL 에피토프 펩타이드 특이적인 CTL 및 면역 글로불린을 강하게 유도하는 것이 가능하며, 항 종양 면역을 보다 효율적으로 활성화 할 수 있다.
[도 1-1] 실시예 1에서 얻은 4 연결 펩타이드(TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35, TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43, TPV45)의 각 HPLC의 결과를 나타낸다.
[도 1-2] 도 1-1의 연속.
[도 1-3] 도 1-2의 연속.
[도 1-4] 도 1-3의 연속.
[도 1-5] 도 1-4의 연속.
[도 1-6] 도 1-5의 연속.
[도 1-7] 도 1-6의 연속.
[도 2-1] 실시예 1에서 얻은 4 연결 펩타이드 (TPV39, TPV40, TPV41, TPV43, TPV45)의 MS의 결과를 나타낸다.
[도 2-2] 도 2-1 의 연속.
[도 2-3] 도 2- 2의 연속.
[도 3-1] 에피토프 4 연결 펩타이드 투여 마우스 모델에서, 에피토프 특이적 CTL 유도 결과를 나타낸다(*: 미 검토임을 나타낸다). 또한 에피토프 4 연결 펩타이드를 인간 면역 프로테아좀로 절단 후 고정된 PEP2 내지 PEP10 에피토프 펩티드의 C 말단의 절단 유무를 평가한 결과를 나타낸다.
[도 3-2] 도 3-1의 연속.
[도 3-3] 도 3-2의 연속.
[도 3-4] N 말단에 아르기닌으로 이루어진 펩타이드 서열을 갖는 에피토프 4 연결 펩타이드 또는 펩타이드 간의 링커로서 아르기닌 트리머를 갖는 에피토프 4 연결 펩타이드를 투여한 마우스 모델에서, 에피토프 특이적 CTL 유도 결과를 나타낸다(*: 미 검토임을 나타낸다). 또한 에피토프 4 연결 펩타이드를 인간 면역 프로테아좀로 절단 후 고정된 PEP2 내지 PEP10 에피토프 펩티드의 C 말단의 절단 유무를 평가한 결과를 나타낸다.
[도 4-1] 에피토프 4 연결 펩타이드 투여 마우스 모델에서 혈청 에피토프 특이적 IgG 항체가의 측정 결과를 나타낸다.
[도 4-2] 도 4-1의 연속.
[도 4-3] N 말단 아르기닌으로 이루어진 펩타이드 서열을 갖는 에피토프 4 연결 펩타이드 또는 펩타이드 간의 링커로서 아르기닌 트리머를 갖는 에피토프 4 연결 펩타이드를 투여한 마우스 모델에서 혈청 중 에피토프 특이적 IgG 항체가의 측정 결과를 나타낸다.
하기에 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
1. CTL 에피토프 4 연결 펩타이드
본 발명의 "CTL 에피토프 4 연결 펩타이드"는 동일한 및/또는 다른 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드에서 선정된 4 개의 펩티드를 링커를 통해 선형으로 연결하여 1 분자로 만든 펩티드를 의미한다.
"종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩타이드"는 종양 항원이 종양 세포 내에서 분해되어 생기는 펩타이드이며, HLA 클래스 I 분자와 결합하여 세포 표면에 제시됨으로써 종양 특이적인 CTL로 인식되는, 및/또는 종양 특이적인 CTL을 유도 및/또는 활성화할 수 있다. "종양 특이적인 CTL을 유도한다"는 것은 in vitro 또는 in vivo에서 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드를 특이적으로 인식하는 CTL을 분화 및/또는 증식시키는 것을 의미한다. 또한 "종양 특이적인 CTL을 활성화한다"는 것은 CTL이 HLA 클래스 I 분자에 의해 제시되는 항원을 인식하여 인터페론-γ (IFN-γ)를 생산하는 및/또는 세포 상해 물질 등의 방출에 의해 세포 독성 활성을 나타내는 것을 의미한다. 본 명세서에서는 "종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드”를 단순히 ‘CTL 에피토프 펩티드’라고 부르는 경우가 있다.
종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩타이드로는 다음과 같은 것이 알려져있다.
PEP1 : KLVERLGAA (서열번호 1 WO 200l / 0l1044]);
PEP2 : ASLDSDPWV (서열번호 2 WO 2002/010369]);
PEP3 : ALVEFEDVL (서열번호 3 WO 2002/010369]);
PEP4 : LLQAEAPRL (서열번호 4 WO 2000/12701]);
PEP5 : DYSARWNEI (서열번호 5 특 개평 11-318455 호);
PEP6 : VYDYNCHVDL (서열번호 6 WO 2000/12701]);
PEP7 : LYAWEPSFL (서열번호 7 특개 2000-000270 호);
PEP8 : DYLRSVLEDF (서열번호 8 WO 2001/011044]);
PEP9 : QIRPIFSNR (서열번호 9 WO 2008/007711]);
PEP10 : ILEQSGEWWK (서열번호 10 WO 2009/022652]);
PEP11 : VIQNLERGYR (서열번호 11 WO 2009/022652]);
PEP12 : KLKHYGPGWV (서열번호 12 WO 1999/067288]);
PEP13 : RLQEWCSVI (서열번호 13 WO 2002/010369]);
PEP14 : ILGELREKV (서열번호 14 WO 2002/010369]);
PEP15 : DYVREHKDNI (서열번호 15 WO 2005/071075]);
PEP16 : HYTNASDGL (서열번호 16 WO 2001/011044]);
PEP17 : NYSVRYRPGL (서열번호 17 특개 2000-000270 호);
PEP18 : RYLTQETNKV (서열번호 18 특개 2007-145715 호);
PEP19 : TFDYLRSVL (서열번호 19 WO 2001/011044)
여기서 PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP8, PEP10, PEP12, PEP13, PEP14 및 PEP15는 HLA-A2에 구속되어 CTL을 유도 및/또는 활성화할 수 있다. PEP2, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP12, PEP13, PEP15, PEP16, PEP17, PEP18 및 PEP19는 HLA-A24에 구속되어 CTL을 유도 및/또는 활성화할 수 있다. PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP9, PEP10, PEP11, PEP12, PEP13, PEP15 및 PEP16는 HLA-A3 슈퍼 타입에 구속되어 CTL을 유도 및/또는 활성화할 수 있다. 또한, PEP2 및 PEP6는 HLA-A26에 구속되어 CTL을 유도 및/또는 활성화할 수 있다. 또한 이러한 CTL 에피토프 펩타이드를 코딩하는 유전자는 여러 암종에서 발현이 확인되었다(Yang D et al., Cancer Res. 1999, 59 : 4056-63, Harashima N et al., Eur . J. Immunol. 2001, 31 (2), 323-32).
본 발명의 "CTL 에피토프 4 연결 펩티드"는 상기 CTL 에피토프 펩타이드 중 특정 13 종류에서 선택되는 4 종류의 CTL 에피토프 펩타이드에 대해 링커를 통해 선형으로 연결하여 1 분자로 한 다양한 CTL 에피토프 4 연결 펩티드이며, 각 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL을 3 개 이상 유도 및/또는 활성화할 수 있다. 또한, CTL 에피토프 펩타이드 특이적인 유도가 직접 평가하지 못한 펩타이드(PEP2, PEP10)는 면역 프로테아좀에 의한 절단 실험(후술하는 실시예 3)에 의해 해당 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL 유도의 유무에 대해 판단할 수 있다. 일반적으로 항원 제시 세포에 포함된 항원 단백질은 프로테아좀, 면역 프로테아좀에 의해 절단을 받는 것으로 알려져 있으며, 캡처된 항원 단백질이 HLA을 통해 항원 제시되는데 필수적인 경로인 것으로 알려져 있다(예를 들어, Rock KL, York IA, Goldberg AL, Nat Immunol. 2004; 5 (7) : 670-677). 또한, 그 에피토프 펩타이드가 HLA의 주머니에 결합하기 위하여는 CTL 에피토프 펩타이드가 적절한 부위에서 절단 됨으로써 발생한다. 그것들은 프로테아좀, 면역 프로테아좀에 의한 절단에 의해 CTL 에피토프 펩티드의 C 말단 아미노산이 결정될 필요가 있다(Rock KL, York IA, Goldberg AL, Nat Immunol. 2004; 5 (7) : 670-677). 여기서 에피토프 4 연결 펩타이드를 인간에게 투여했을 때, 수지상 세포에서 CTL 에피토프 펩타이드가 제공되는 것을 상정하고 수지상 세포에서 고발현하는 면역 프로테아좀을 이용하여 in vitro에서 에피토프 4 연결 펩티드의 절단 패턴에 대해 분석했다. 면역 프로테아좀에 의한 절단에 의해 CTL 에피토프 펩타이드가 출현한 경우에는 해당 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL이 유도된 것으로 판단할 수 있다.
특정 13 종류에서 선택되는 4 종류의 CTL 에피토프 펩타이드는 본 명세서 중 서열번호 1로 표시되는 펩타이드 "PEP1", 서열번호 2로 표시되는 펩타이드 "PEP2", 서열번호 4로 표시되는 펩타이드 "PEP4", 서열번호 5로 표시되는 펩타이드 "PEP5", 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드 "PEP6", 서열번호 7로 표시되는 펩타이드 "PEP7", 서열번호 8로 표시되는 펩타이드 "PEP8", 서열번호 9로 표시되는 펩타이드를 "PEP9", 서열번호 10로 표시되는 펩타이드 "PEP10", 서열번호 13로 표시되는 펩타이드 "PEP13", 서열번호 15로 표시되는 펩티드 "PEP15", 서열번호 17로 표시되는 펩타이드 "PEP17", 서열번호 18로 표시되는 펩타이드 "PEP18"중 중복 선택될 수 있는 4 종류의 CTL 에피토프 펩티드이다.
본 발명에서 PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18의 각 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및/또는 부가 된 아미노산 서열을 가지며, 원래의 펩티드와 동등 또는 그 이상의 CTL 유도능, 면역 글로불린 생산 유도능을 가지는 펩타이드도 "CTL 에피토프 펩티드"로 사용할 수 있다. 여기에서 "복수"는 1 ~ 3 개, 바람직하게는 1 ~ 2 개이다. 이러한 펩티드로서, 예를 들어 원래 아미노산과 유사한 특성을 갖는 아미노산으로 치환된 (즉, 보존적 아미노산 치환에 의해 얻어진) 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드는 PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18에서 중복 선택될 수 있는 4 개의 에피토프 펩타이드가 링커를 통해 각각 직쇄상으로 연결된다.
링커는 CTL 에피토프 4 연결 펩티드가 생체에 투여되었을 때 절단되어 연결된 CTL 에피토프 펩타이드가 개별적으로 분리되는 것을 가능하게 하는 것이면 좋고, 예를 들면, 에스테르 결합, 에테르 결합, 아미드 결합, 당쇄 링커, 폴리에틸렌 글리콜 링커, 아미노산 링커 등을 들 수 있다. 아미노산 링커로 사용되는 아미노산 서열로는 아르기닌 다이머, 아르기닌 트리머, 아르기닌 테트라머, 리신 다이머, 리진 트리머, 라이신 테트라머, 글리신 다이머, 글리신 트리머, 글리신 테트라머, 글리신 펜타머, 글리신 헥사머, 알라닌-알라닌-티로신(AAY), 이소류신-루신-알라닌(ILA), 아르기닌-발린-리신-아르기닌(RVKR) 등이 예시되고, 바람직하게는 아르기닌 다이머 및 아르기닌 트리머이다.
선택되는 CTL 에피토프 펩타이드 및 그 연결 순서는 소정의 조합 및 소정의 연결 순서로 합성한 에피토프 4 연결 펩타이드를 인간 HLA-A 유전자 변형 생쥐에 투여하여 in vivo에서 각 CTL 에피토프 펩타이드 특이적인 CTL 유도의 유무를 평가하고 결정할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 다음의 (1) 내지 (5)에서 선택되는 하나 또는 여러 특징이 있다:
(1) C 말단이 PEP2(단, N 말단이 PEP7 및 PEP8이며, N 말단에서 링커를 통해 이어진 순인 것은 제외);
(2) C 말단이 PEP4;
(3) C 말단이 PEP10;
(4) C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단에서 링커를 통해 이웃인 순서;
(5) PEP5, PEP6, PEP9 및 PEP18을 포함.
보다 바람직하게는 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 다음의 (1) 내지 (5)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 상기 에피토프 4 연결 펩타이드:
(1) PEP1, PEP7, PEP8 및 PEP13에서 선택되는 3 개의 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP2 (단, N 말단이 PEP7 및 PEP8이며, N 말단에서 링커를 통해 이어진 순서인 것을 제외);
(2) PEP5, PEP6 및 PEP9의 세 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP4;
(3) PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18에서 선택되는 3 개의 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP10;
(4) PEP1 및 PEP7의 두 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단에서 링커를 통해 이어진 순서;
(5) PEP5, PEP6 및 PEP18의 세 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP9.
더욱 바람직하게는 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 하기에서 선택되는 서열을 포함하거나 해당 서열로 이루어진다(식 중 「-(L)-」는 링커를 나타낸다):
PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4(TPV01)；
PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4(TPV02)；
PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4(TPV03)；
PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4(TPV04)；
PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4(TPV05)；
PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4(TPV06)；
PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV07)；
PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV08)；
PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV09)；
PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2(TPV10)；
PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV11)；
PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV12)；
PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV13)；
PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV14)；
PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2(TPV15)；
PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV16)；
PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV17)；
PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV18)；
PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV19)；
PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV20)；
PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV21)；
PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV22)；
PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV23)；
PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV24)；
PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV25)；
PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10(TPV26)；
PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV27)；
PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10(TPV28)；
PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV29)；
PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10(TPV30)；
PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV31)；
PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV32)；
PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV33)；
PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10(TPV34)；
PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9(TPV35)；
PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9(TPV36)；
PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5(TPV37)；또는,
PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5(TPV38).
본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩티드는 또한 친수성 아미노산으로 구성된 펩타이드 서열을 가질 수 있다. 해당 펩타이드 배열은 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가할 수 있지만, 바람직하게는 N 말단에 부가한다. 해당 펩타이드 배열은 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 트레오닌, 티로신, 세린, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 ~ 15 개, 바람직하게는 2 ~ 10 개, 더욱 바람직하게는 3 ~ 5 개의 친수성 아미노산으로 이루어진 것을 선택할 수 있다. 예를 들어 해당 펩타이드 배열로서 아르기닌 트리머(RRR)와 아르기닌 테트라머 (RRRR)를 이용할 수 있으며, 이러한 펩타이드 서열이 부가된 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드로는 RRR-TPV06, RRRR-TPV06, TPV06 -RRR, TPV06-RRRR, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, TPV10-RRR, TPV10-RRRR, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TPV12-RRR, TPV12-RRRR, RRR-TPV21, RRRR-TPV21, TPV21-RRR, TPV21-RRRR, RRR-TPV26, RRRR-TPV26, TPV26-RRR, TPV26-RRRR, RRR-TPV30, RRRR-TPV30, TPV30-RRR, TPV30-RRRR, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, TPV06-KKK, TPV06 -KKKK, KKK-TPV10, KKKK-TPV10, TPV10-KKK, TPV10-KKKK, KKK-TPV12, KKKK-TPV12, TPV12-KKK, TPV12-KKKK, KKK-TPV21, KKKK-TPV21, TPV21-KKK, TPV21-KKKK, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, TPV26-KKK, TPV26-KKKK, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, TPV30-KKK, TPV30-KKKK, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, TPV06-HHH, TPV06-HHHH, HHH -TPV10, HHHH-TPV10, TPV10-HHH, TPV10-HHHH, HHH-TPV12, HHHH-TPV12, TPV12-HHH, TPV12-HHHH, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, TPV21-HHH, TPV21-HHHH, HHH-TPV26 , HHHH-TPV26, TPV26-HHH, TPV26-HHHH, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, TPV30-HHH, TPV30-HHHH, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12, KHKH -TPV12 등이 예시되고, 바람직하게는 KKK-TPV06, KKKK-TPV06, KKK-TPV10, KKKK-TPV10, KKK-TPV12, KKKK-TPV12, KKK-TPV21, KKKK-TPV21, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, HHH-TPV10, HHHH-TPV10, HHH-TPV12, HHHH-TPV12, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, HHH-TPV26, HHHH-TPV26, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12, KHKH-TPV12을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 RRR-TPV06, RRRR-TPV06, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TRRR-TPV21, RRRR-TPV21, RRR-TPV26, RRRR-TPV26, RRR-TPV30, RRRR-TPV30을 들 수 있다. 해당 펩타이드 서열이 부가된 펩티드는 수성 용매에 대한 용해도가 향상하는 것으로 알려져 있다(Abdelkrim Alileche 등, Peptides 38 (2012) 302-311; 특개 2006-188507). 본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드에 해당 펩타이드 서열을 부가함으로써 수성 용매에 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드의 용해도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 에피토프 4 연결 펩티드는 결합된 4 종의 CTL 에피토프 펩티드 중 적어도 3 종 이상, 바람직하게는 4 종의 CTL 에피토프 펩타이드에 대해 각 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL을 유도 및/또는 활성화할 수 있을 뿐만 아니라 더욱 각 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 면역 글로불린 생산도 유도할 수 있다. 또한, 여기에서 "면역 글로불린"은 IgG, IgM, IgA, IgD를 의미한다.
본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 산 부가 염 또는 염기 부가 염 이어도 좋다. 산 부가 염을 형성하기 위해 통상적으로 사용되는 산은 염산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산, 옥살산, p-브로모 페닐 술폰산, 카르복실산, 호박산, 구연산, 안식향산, 초산, 트리플루오로 아세트산 등의 유기산이다. 염기 부가 염으로는 수산화 암모늄 또는 알칼리 또는 알칼리 토금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염 등의 무기 염기로부터 유도된 염을 들 수 있다.
2. CTL 에피토프 4 연결 펩타이드의 제조
본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드는 관용의 액상 합성법, 고체상 합성법 등의 펩타이드 합성법, 자동 펩타이드 합성기에 의한 펩타이드 합성 등에 의해 제조할 수 있다(Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, JK eds., Plenum Press NY (1990) Vol.12, p.1-19; S tewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) WH Freeman Co .; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82 : p.5132 "새로운 생화학 실험 강좌 1 단백질 IV」(1992) 일본 생화학 회편, 도쿄 화학 동인). 펩타이드 합성은 각 아미노산의 결합하려고 하는 α-아미노기와 α-카르복실기 이외의 관능기를 보호한 아미노산류를 준비하고 각각의 아미노산의 α-아미노기와 α-카르복실기 사이에서 펩타이드 결합 형성 반응을 한다. 일반적으로 펩타이드의 C 말단에 위치하는 아미노산 잔기의 카르복실기를 적당한 스페이서 또는 링커를 통해 고상에 결합해 둔다. 상기에서 얻은 디펩티드의 아미노 말단의 보호기를 선택적으로 제거한 다음 아미노산의 α-카르복실기 사이에 펩티드 결합을 형성한다. 이러한 작업을 연속하여 수행하는 측의 관능기가 보호된 펩타이드를 제조하고, 마지막으로, 모든 보호기를 제거하고 고상 분리한다. 보호기의 종류와 보호 방법, 펩타이드 결합법의 자세한 내용은 상기의 문헌에 자세히 설명되어 있다.
또는 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 재조합법이나 파지 디스플레이법 등에 의해 펩타이드를 제조할 수 있다.
유전자 재조합법은 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현 벡터 중에 삽입하여 적당한 숙주 세포에 벡터를 도입하고 세포를 배양하여 세포 내에서 또는 세포 외액에서 원하는 펩타이드를 회수하는 것을 포함한다. 벡터로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미도, 화지미도 바이러스 등의 벡터이다. 벡터를 도입하기 위한 숙주 세포는 대장균이나 고초균 등의 세균, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포 (예를 들어, 포유 동물 세포), 식물 세포 등이며, 이러한 세포에 형질 전환 또는 트랜스펙션, 예를 들어, 인산칼슘법(calcium phosphate method), 일렉트로포레이션법(electroporation), lipofection, particle gun method, PEG 법 등을 포함한다. 형질 전환 세포를 배양하는 방법은 숙주 생물의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 실시된다. 본 발명의 펩티드의 회수를 용이하게 하기 위해 발현에 의해 생성된 펩티드를 세포 밖으로 분비시키는 것이 바람직하다. 그래서 그 세포에서 펩타이드의 분비를 가능하게 하는 펩타이드 서열을 코딩하는 DNA를 목적 펩타이드를 코딩하는 DNA의 5 '말단에 결합한다. 또는 세포 내에 축적된 목적 펩티드를 회수할 수 있다. 이 경우 세포를 물리적 또는 화학적으로 파괴하고 단백질 정제 기술을 사용하여 원하는 펩타이드를 회수한다.
제조된 펩타이드는 통상적인 방법에 의해, 예를 들면, 겔여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상컬럼 크로마토그래피, HPLC 등의 크로마토그래피, 황산 암모늄 분획, 한외 여과, 면역 흡착법 등으로 회수 또는 정제할 수 있다.
3. 세포 장해성 T 임파구
본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 이용하여 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적이며, 암세포를 상해하는 CTL을 in vitro 및/또는 ex vivo에서 얻을 수 있다. CTL 에피토프 펩티드를 이용한 CTL의 in vitro 및/또는 ex vivo에서의 유도 방법은 공지된 사항이며(예를 들면, 특개 2006-14637 호 공보) 본 발명에서도 이러한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 정상인 또는 암 환자 유래의 말초 혈액 단핵구(PBMC) 중 플레이트 접착 세포를 GM-CSF, IL-4 등의 사이토 카인의 존재 하에서 배양하여 수지상 세포(DC)을 유도한다. 이 수지상 세포에 본 발명의 에피토프 4 연결 펩티드를 펄스 후 X 선 조사를 실시하여 항원 제시 세포(stimulator)를 준비한다. DC를 사용할 수 없는 경우는 정상인 또는 같은 암 환자 유래의 말초 혈액 단핵(PBMC)에 본 발명의 에피토프 4 연결 펩티드를 펄스 후 X 선 조사를 실시한 것을 사용하여도 좋다. 이어 정상인 유래의 말초 혈액 단핵구 (PBMC) 또는 암 환자 유래의 말초 혈액 단핵구 (PBMC) 또는 림프절 림프구 (responder)을 첨가하여 IL-2, IL-4, IL -7 등의 사이토카인 존재 하에서 배양한다. 그리고 또한 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 언급한 바와 같이 펄스하여 얻은 항원 제시 세포를 더해 재자극하고 IL-2 등의 사이토카인 존재 하에서 더 배양한다.
CTL의 유도에 사용되는 세포 배양용 배지로는 T 림프구가 생존할 수 있는 모든 배지를 사용하면 된다. 예를 들어, RHAMα 배지(Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K., Akaza, H., Koiso, K., and Ohno, T., Cancer Immunol. Immunother. 35, 225-229, 1992 에서 언급된 LAK medium), AIMV 배지 (GIBCO BRL, Life Technologies, INC.) 또는 RPMI1640 배지 등에 IL-2 등의 각종 사이토카인이나 소태아혈청 (FCS) 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다.
배양 조건은 당업자에게 주지의 조건에 따르게 된다. 예를 들어, 배양 온도를 33℃ ~ 41℃, 바람직하게는 37℃로 한다. 또한 공기 또는 적당한 농도의 산소와 배지의 pH를 약 7.4로 유지하기 위해 적당한 농도의 탄산 가스(예를 들어 5% CO2)를 포함하는 불활성 가스를 기상으로 사용할 수 있다. 배양은 4 ~ 10 일이 바람직하며, 7 일 또는 8 일이 더 바람직하다. 이러한 배양을 함으로써 유도된 CTL은 에피토프 4 연결 펩타이드를 구성하는 4 개의 CTL 에피토프 펩티드 중 적어도 3 종, 바람직하게는 4 종의 CTL 에피토프 펩타이드에 대해 각 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL을 포함하고, 암세포를 특이적으로 손상시킬 수 있다.
4. 의약 조성물
본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 암의 면역 요법에 사용하는 의약 조성물의 유효 성분으로서 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 상기 에피토프 4 연결 펩타이드 중 1 이상의 종을 유효 성분으로 포함할 수 있다. 여러 종의 에피토프 4 연결 펩티드를 포함하여 더 높은 효과를 얻을 수 있으며, 특정 HLA 형을 가진 환자에 한정되지 않고, 암 펩티드 백신으로 더욱 다양한 암 환자에게 투여하는 것이 가능한, 범용성이 더욱 높은 의약 조성물이다.
본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드에 포함된 PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18을 코드하는 유전자는 여러 고형암과 혈액암에 있어서 발현이 인정되고 있다. 고형암으로는 예를 들어, 뇌종양, 폐암, 유방암, 갑상선암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 난소암, 식도암, 위암, 위장관 기저 종양 (GIST), 췌장암, 대장암, 직장암, 항문암, 신장암, 간암, 담도암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 악성 흑색종 피부암, 설암, 골육종, 연골 육종, 섬유 육종, 지방 육종, 혈관 육종, 횡문근 육종, 평활근 육종 등이 꼽힌다. 혈액 암으로는 예를 들어, 백혈병, 악성 림프종, 골수종 등을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 이러한 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 여기에서 "암 치료 및/또는 예방"은 암의 발생/재발을 예방하는 암의 진행/악화를 억제하는 암의 병태를 개선하는 것을 의미한다.
본 발명의 의약 조성물은 의약상 허용되는 제제 소재로서 관용의 각종 유기 또는 무기 담체 물질 등을 포함할 수 있다. 유효한 의약 담체로서 제제의 투여 형태에 따라 일반적으로 사용되는 안정제, 살균제, 완충제, 등장화제(isotonizing agents), 킬레이트제, pH 조절제, 계면 활성제, 충진제, 증량제, 결합제, 습기제거제(humectants), 붕괴제, 표면 활성제, 활택제, 무통화제(soothing agents), 희석제 또는 부형제 등을 예시할 수 있고, 이러한 통상적인 방법에 의해 첨가한 배합제로서 제조되는 것이 바람직하다 .
또한, 본 발명의 의약 조성물은 백신 투여시 사용하는 것이 알려진 보조제를 포함할 수 있다. 보조제로는 Complete Freund 's adjuvant (CFA), Incomplete Freund 's adjuvant (IFA), 명반, Lipid A, monophosphoryl lipid A, BCG (Bacillus-Calmette-Guerrin) 등의 세균 제제, CpG-DNA, dsRNA 등의 핵산, tuberculin 등의 세균 성분 제제, keyhole limpet hemocyanin 과 효모 만난 등의 천연 고분자 물질, muramyl-tripeptide, muramyl-dipeptide 또는 그 유도체, 알럼(alum), 비이온성 블록 코폴리머, 인터루킨 2 (IL -2), Granulocyte Macrophage colony stimulating Factor (GM-CSF), 인터페론-α (IFN-α), 인터페론-β (IFN-β) 등의 사이토카인 등을 들 수 있으며, 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 보조제는 본 발명의 의약 조성물과 혼합 상태 또는 에멀젼으로 동시에 투여하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은 상기 에피토프 4 연결 펩타이드 이외에, 공지의 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩타이드 또는 이를 포함하는 펩티드, 또는 그것들을 연결하는 펩타이드 (이하 "공지의 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드 등”이라고 기재)를 1 또는 복수 조합하여 포함 할 수 있다. 공지의 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드로서는 예를 들면 WT-1 p126-134, modified (M236Y) WT-1 p235-243, NY-ESO-1 p157-165, modified (T210M) gp100 p209-217, survivin-2B p80-88, Her-2/neu p63-71, VEGFR2 p169-177, MART-1 p26-35, Glypican-3 p298-306, SPARC p143-151 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 경우, 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드와 공지의 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드 등은 한 제형의 제제 형태로도 좋고, 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 제제와 공지의 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드 등을 유효 성분으로 함유하는 제제가 별도의 제제 형태일 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 투여 형태에 따라 제제 형태를 선택할 수 있다. 대표적인 제제 형태로는 용액제, 유제, 리포좀 제제, 지방유제, 시클로 덱스트린 등의 포접체, 현탁제, 연고제, 크림제, 경피 흡수제, 경 점막흡수제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 분말제, 과립제, 세립제, 시럽제 등의 제작도 가능하지만 이에 국한되지 않는다. 이들은 또한 투여 경로에 따라 경구, 비 경구 제, 경후제(transnasal preparations), 경질제(transvaginal preparations), 좌제, 설하제(sublingual formulations), 흡입제(inhalants), 점안제, 점귀제 등으로 분류되며, 각각 통상의 방법에 따라 조제 성형 내지 조제할 수 있다. 또한 용액 제제로 사용할 수 있는 것 외에, 동결 건조하여 저장할 수 있는 상태로 한 후 사용시 물이나 생리식염수 등을 포함하는 완충액 등으로 용해하여 적당한 농도로 조제한 후 사용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은 상기 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 이용하여 in vitro 및/또는 ex vivo에서 유도된 CTL을 유효 성분으로 포함할 수 있다. 이러한 의약 조성물은 비경구제의 형태인 것이 바람직하다.
5. 치료 방법
본 발명의 의약 조성물은 다양한 암 환자, 예를 들어 HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 및 HLA-A3 슈퍼 타입으로 이루어진 군에서 선택되는 HLA 유형 양성 환자군에 투여하는 것이 가능 있으며, 치료 시작 전에 HLA 형 검사를 필요로하지 않고 치료를 시작할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 암 환자에게 투여함으로써 유효 성분으로 함유된 에피토프 4 연결 펩타이드를 구성하는 적어도 3 종, 바람직하게는 4 종의 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 CTL을 유도 및/또는 활성화 할 수 있으며, 해당 CTL 에피토프 펩타이드에 특이적인 면역 글로불린 생산을 유도할 수 있다. 유효 성분으로 함유된 에피토프 4 연결 펩타이드의 투여에 의한 면역 글로불린 생산의 유도는 에피토프 4 연결 펩타이드에 포함된 CTL 에피토프 펩타이드를 연결하지 않고 개별적으로 혼합하여 투여한 경우에 인정되는 면역 글로불린 생산의 유도보다 현저하게 높다. 따라서, 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드는 암 환자에서 암을 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 경구 투여, 정맥 투여, 동맥 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 설하 투여, 복강 내 투여, 직장 내 투여, 경피 투여(transdermal administration), 경 점막 투여(transmucosal administration), 비강 투여(transnasal administration), 경질 투여(transvaginal administration), 경안투여(transocular administration), 흡입 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 여러 종의 에피토프 4 연결 펩타이드, 또한 공지의 종양 항원 분자 유래의 CTL 에피토프 펩티드 등을 유효 성분으로 함유하는 제제가 별도의 약학 조성물로서 제제되어 있는 경우 각 약제학적 조성물은 동일하거나 별도 투여 경로에서 동시 또는 개별적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여량은 치료하는 암의 상태/중증도 개별 환자의 연령, 체중 등의 요인에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 에피토프 4 연결 펩타이드의 양으로, 0.0001 mg ~ 1000 mg, 바람직하게는 0.001 mg ~ 100 mg, 보다 바람직하게는 0.01 mg ~ 50 mg을 포함한 약학 조성물을 며칠 또는 몇 주 또는 몇 달에 한 번씩 반복 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효 성분으로서 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 이용하여 in vitro 및/또는 ex vivo에서 유도된 CTL을 포함하는 경우에는 하루에 체중 1 kg 당 2x106 ~ 2x108 개의 CTL을 1 주일 ~ 2 주 간격으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은 암 화학 치료에 일반적으로 사용되는 의약품과 병용하여 암 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 시클로 포스 파미드(cyclophosphamide), 테모졸로미드(temozolomide), 벤다무스틴(bendamustine) 등의 알킬화제, tegafur-uracil, tegafur-gimeracil-oteracil potassium, methotrexate, 젬시타빈(gemcitabine) 등의 대사 길항제(antimetabolites), 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등의 플래티넘 제제; 이리노테칸(irinotecan), 에리부린(eribulin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 빈 크리스틴(vincristine) 등의 식물 알칼로이드 제제; 독소루비신(doxorubicin), 부레오마이신(bleomycin), 악티노마이신 D(actinomycin D) 등의 항암 항생제; 이마티닙(imatinib), 수니티니브(sunitinib), 제피티닙(gefitinib), 소라페닙(sorafenib), 에베로리무스(everolimus), 트라스트주맙(trastuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 리툭시 맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 파니츠무맙(panitumumab), 모가무리즈마부(mogamulizumab) 등의 분자 표적 치료제; 비카루타미도(bicalutamide), 에스트무스진(estramustine), 에키세메스탄(exemestane) 등의 호르몬 요법 제제; 렌치낭(lenthinan), 파시바닐(Picibanil), 크레스틴(Krestin) 등의 면역 부활 요법제 등을 들 수 있다. 이러한 제약은 본 발명의 의약 조성물과 동일하거나 별도의 투여 경로에서 동시 또는 개별적으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드의 합성 및 정제
CTL 에피토프 펩티드 및 에피토프 4 연결 펩타이드는 상용 펩타이드 합성기 Prelude (ProteinTechnologies, Inc.)를 이용하여 고상 합성법 (Fmoc 법)에서 합성 하였다. 즉, Alko-PEG 수지에 활성기를 보호한 아미노산을 흡착시켜 이에 디블로킹 액을 주입하여 보호기를 제거하고 활성기를 보호한 아미노산을 주입하여 양자를 반응시켜 디펩티드를 합성한다. 이 작업을 반복함으로써 목적하는 서열을 갖는 펩타이드를 합성한다. 펩티드의 보호기는 2.5 % 트리이소프로필실란, 2.5 % 물, 95 % 트리플루오로 아세트산을 포함하는 탈보호액에서 2 시간 동안 반응하여 제거하고 얻은 여액에 냉 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전으로 회수할 수 있다. 얻어진 각종 합성 펩타이드는 YMC-Pack Pro C18 컬럼 (YMC Co., Ltd.) 및 HPLC 시스템 (Gilson)에서 용매계에 0.1 % TFA 수용액 및 아세토 니트릴을 사용하여 정제하였다. 최종 정제 펩타이드는 LC-MS 시스템 (WATERS ACQUITY UPLC system, micromass ZQ)에 의해 순도 및 분자량을 확인하고 동결 건조 후 냉온의 어두운 곳에서 보관하고, 이후에 나타내는 실시예에 제공했다. 표 1-1 ~ 표 1-8에, 획득한 4 연결 펩타이드 (TPV01 ~ TPV45)의 MS 스펙트럼 데이터를 나타내었다. 또한 TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35, TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 및 TPV45의 LC 데이터를 도 1-1 ~ 1-7에 나타내었다. 또한 TPV39, TPV40, TPV41, TPV43 및 TPV45의 MS 데이터를 도 2-1 ~ 2-3에 나타내었다.
[표 1-1]
Figure pct00001
[표 1-2]
Figure pct00002
[표 1-3]
Figure pct00003
[표 1-4]
Figure pct00004
[표 1-5]
Figure pct00005
[표 1-6]
Figure pct00006
[표 1-7]
Figure pct00007
[표 1-8]
Figure pct00008
"ND"는 측정되지 않은 것을 나타낸다.
합성한 CTL 에피토프 펩타이드의 아미노산 서열을 표 2에, 에피토프 4 연결 펩타이드의 아미노산 서열을 표 3 및 표 4에 나타내었다. 표 4에 기재된 에피토프 4 연결 펩타이드는 표 3에 기재된 TPV12, TPV06, TPV26에서 N 말단에 아르기닌으로 이루어진 펩타이드 서열을 부가한 것, 및 펩타이드 간의 링커가 아르기닌 트리머인 것이다.
또한 HLA-A2에 결합하는 대조 펩타이드로 WT1 (서열번호 20), HLA-A24에 결합하는 대조 펩타이드로 Her2 (서열번호 21)를 각각 합성 하였다.
[표 2]
CTL 에피토프 펩티드
Figure pct00009
[표 3]
에피토프 4 연결 펩티드
Figure pct00010
"-RR-"는 아르기닌 다이머를 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00011
"-RR-"는 아르기닌 다이머를 나타낸다.
"-RRR-"는 아르기닌 트리머를 나타낸다.
"RRR-" 및 "RRRR-"는 N 말단에 부가한 펩티드 배열이며, 각각 아르기닌 잔기가 3 개 추가 및 아르기닌 잔기가 4 개 추가하고 있는 것을 나타낸다.
실시예 2: 마우스 모델에서 에피토프 펩타이드 특이적 CTL 의 유도와 ELISPOT 법에 의한 CTL 의 검출
에피토프 4 연결 펩타이드를 증류수 (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.)에서 2 mg/mL 내지 4 mg/mL로 조제하고, B Braun Injekt 주사기에 충전했다. 다른 주사기에 동등한 양의 Incomplete Freund 's adjuvant (IFA)를 충전 후 두 주사기를 GP 주사기 커넥터에 연결하고 에피토프 4 연결 펩티드 용액과 IFA를 잘 혼합시킴으로써 에멀젼을 제조하였다. 이것을 마우스 (HLA-A2.1 transgenic, HLA-A24 transgenic (Taconic))의 능선부 주변에 100 μL씩 주 1 회, 2 회 투여했다. 최종 투여 1 주일 후에 마우스로부터 서혜부 림프절(Inguinal lymph nodes)을 회수했다. 림프절 세포 현탁액을 Complete Medium (RPMI-1640, 10% heat-inactivated FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 50 μM 2-Mercaptoethanol)에서 5 × 106 cells/mL로 조제하여 표적 CTL 에피토프 펩티드 (최종 농도 10 μg/mL), recombinant mouse IL-15 (최종 농도 100 ng/mL), recombinant mouse IL-21 (최종 농도 100 ng/mL)을 각각 추가하고 1 mL/well로 24 well plate에 파종 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 8 일간 배양하였다. 8 일 후 세포를 회수하여 Murine IFN-γ ELISpot Kit (GEN-PROBE)에 첨부된 anti IFN-γ 항체가 고정화된 플레이트에 1 × 105 cells/well로 파종했다. 계속해서 같은 계열 마우스 비장에서 조제한 30 Gy로 X 선을 조사하여 비장 세포를 동일한 well에 항원 제시 세포로 1 × 105 cells/well에 파종 후 표적 CTL 에피토프 펩티드 또는 negative control 펩티드 (최종 농도 10 μg/mL )을 넣고 37℃, 5 % CO2 배양기에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 키트의 첨부 문서에 따라 IFN-γ 생산 세포 명소를 발색시켰다. IFN-γ 생산 세포 스팟의 수는 ELISPOT 분석기 (Immunospot S6, Cellular Technology Ltd.)로 측정하였다. CTL 에피토프 펩타이드 특이적 CTL의 유도는 해당 시험에 의해 얻어진 표적 CTL 에피토프 펩티드 첨가 웰의 IFN-γ 생산 세포 스팟 수가 negative control 펩타이드 첨가 웰의 그것에 비해 상당히 높은 (Student 's t-test, p <0.05) 경우 양성으로 판단했다. 또한 negative control 펩타이드로는 WT1 또는 Her2를 사용하였다. 또한, CTL 유도 강도를 가시화할 목적으로 (표적 CTL 에피토프 펩티드 첨가 웰의 평균 IFN-γ 생산 세포 스팟 수) - (negative control 펩타이드 첨가 웰의 평균 IFN-γ 생산 세포 스팟 수) = Δ로 했을 때, 10 ≤ Δ <100의 경우를 양성, 100 ≤ Δ < 200의 경우 중양성, 200 ≤ Δ의 경우를 강양성으로 나타냈다.
CTL 에피토프 펩타이드 특이적 CTL 유도 검토 결과를 도 3-1 ~ 도 3-3 및 도 3-4에 나타내었다. 도 3-1 ~ 도 3-4과 같이, 본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드가 다음의 <1> ~ <3>에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 경우 연결된 4 종의 CTL 에피토프 펩티드 중 적어도 3 종 이상의 CTL 유도를 보여 주었다.
<1> C 말단이 PEP4이다.
<2> C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단에서 링커를 통해 이웃한 순서이다.
<3> PEP5, PEP6, PEP9 및 PEP18을 포함한다.
또한 도 3-4와 같이 N 말단에 추가적으로 아르기닌으로 이루어진 펩타이드 서열을 부가한 경우에도, 또한 펩타이드 간의 링커가 아르기닌 트리머에도 상기와 마찬가지로 좋은 CTL 유도가 나타났다.
한편, 도 3-1 ~ 도 3-3과 같이, CPV01 ~ CPV16 같은 연결 순서의 4 연결 체는 3 종 이상의 CTL 유도를 보이지 않았다.
즉, 특정의 13 종류 (PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18)에서 선택되는 4 종류의 CTL 에피토프 펩타이드로 구성된 에피토프 4 연결 펩타이드 (CPV14, CPV15 및 CPV16)도, 연결된 4 종의 CTL 에피토프 펩타이드 중 3 종 이상의 CTL 유도를 보이지 않았다.
실시예 3: 인간 20S 면역 프로테아좀(i20S)에 의한 펩타이드 절단 위치의 추정
하기의 단계에 따라 에피토프 4 연결 펩타이드 절단 샘플을 제조하였다. 즉, 에피토프 4 연결 펩타이드를 reaction buffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 2 mM MgAc2, 2 mM dithiothreitol)에서 66.7 μg/mL에 희석하여 반응 튜브에 300 μL/tube가 되도록 분주했다. 여기 human 20S immuno프로테아좀 (R & D systems)을 2 μg/tube 첨가하여 교반 후 진탕 조건 37 ℃에서 1, 2, 4 시간 동안 배양하였다. 배양 시간 경과 후 30 μL/tube의 초산을 추가하여 효소 반응을 중지시키고 즉시 -80 ℃ 냉동고에서 샘플을 냉동 보관했다.
이어서 얻은 에피토프 4 연결 펩타이드 절단 샘플을 LC/MS-MS 시스템 (Acquity UPLC system (waters 사제) Synapt G2 HDMS (waters 사제))을 이용하여 포괄적으로 펩티드 단편의 분자량을 측정 하고 해석 소프트(MassLynx, ver4.1, SCN712, waters 사제)를 이용하여 분석 및 펩티드 단편의 동정을 실시했다. 평가는 면역 프로테아좀에 의한 절단의 결과 에피토프 펩타이드 자체가 절단된 펩티드, 에피토프 펩티드의 N 말단에 아르기닌을 첨가한 펩타이드, 및 에피토프 펩티드의 N 말단에 아르기닌 다이머가 부가한 펩티드 중 하나가 출현한 경우 절단이 가능하다고 판단했다.
도 3-1 ~ 도 3-4에 나타낸 면역 프로테아좀을 이용한 분석 결과 PEP2, PEP10 2 종의 CTL 에피토프 펩타이드는 각각 에피토프 4 연결 펩타이드의 가장 C 말단에 위치하지 않는 한 기대되는 CTL 에피토프 펩티드의 C 말단 아미노산이 결정되지 않은 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 CTL 에피토프 4 연결 펩타이드는 펩타이드의 C 말단에 PEP2 또는 PEP10을 연결하는 것이 바람직하다.
실시예 4: CTL 에피토프 펩티드 고상화 비드의 준비
xMAP Multi-Analyte COOH Microspheres (Luminex corporation, 이하 비드라 한다)에 다음과 같이 펩티드를 고상화하였다. MES buffer (0.1 M MES-NaOH, pH 7.0)으로 비드를 세척 후 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 이것을 두 번 반복한 후, 75 μL의 MES buffer에서 비드를 혼탁하였다. 거기에, 1 mg/mL로 조제한 CTL 에피토프 펩티드 용액을 100 μL 이외에도 10 mg/mL EDC(1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)를 5 μL 추가하여 잘 혼합한 후 30 ℃, 어두운 곳 에서 밤새 반응시켰다. 다음날 원심 분리하여 상층액을 제거한 후, 1 M Tris-HCl을 125 μL 추가하여 30 ℃, 어두운 곳에서 30 분 배양하였다. 상청액을 제거 후 wash buffer (PBS (-), 0.05 % Tween20) 두 번 세척 후 면역 블록 (DS 파마 바이오 메디컬)에 현탁하여 CTL 에피토프 펩타이드의 고상화를 완료했다.
실시예 : 5 CTL 에피토프 특이적 IgG 항체가 측정
본 발명의 에피토프 4 연결 펩타이드를 증류수 (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.)에서 2 mg/mL로 조제하고, B Braun Injekt 주사기에 충전했다. 다른 주사기에 동등한 양의 IFA를 충전 후 두 주사기를 GP 주사기 커넥터에 연결하고, 상기 에피토프 4 연결 펩티드 용액과 IFA를 잘 혼합시킴으로써 에멀젼을 제조하였다. 이를 CBF1 마우스 (C57BL/6 × Balb/c F1) 능선부 주변에 100 μL씩 주 1 회, 총 3 회에 걸쳐 투여했다. 최종 투여 1 주일 후에 마우스보다 채혈 혈청 샘플을 얻었다. 대조군으로 PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15 또는 PEP18에서 선택되는 4 종류의 각 펩티드 혼합물(각 1 mg/mL)을 이용하여 에멀젼을 제조 하고 에피토프 4 연결 펩타이드와 같은 일정으로 투여 하였다(mixture 투여군).
96 웰 필터 플레이트에 면역 블록에 희석한 CTL 에피토프 펩티드 고상화 비드를 분주하여 wash buffer로 세척 후 면역 블록에 200 배 희석한 마우스 혈청 샘플을 100 μL/well 첨가하였다. 플레이트를 30 ℃ 인큐베이터에서 600 rpm으로 교반하면서 90 분 동안 배양했다. Wash buffer로 3 회 세척 후 면역 블록에 500 배 희석한 biotinylated-anti-mouse IgG (H + L) (Vector Labolatories)을 100 μL/well에 첨가하여 30 ℃, 600 rpm 교반 조건에서 60 분 동안 배양했다. wash buffer로 3 회 세척 후 면역 블록에 500 배 희석한 Streptavidin R-phycoerythrin conjugate (Invitrogen)을 100 μL/well 첨가하여 30 ℃, 600 rpm 교반 조건에서 30 분 동안 배양했다. wash buffer로 3 회 세척 후 wash buffer를 100 μL/well 첨가하여 비즈를 현탁한 후 Bio-Plex Suspension Array System (BIO-RAD)에서 각 비드 특이적으로 결합하는 PE 색소의 평균 형광 강도를 측정하였다.
CTL 에피토프 특이적 IgG 항체 측정 결과는 도 4-1 ~ 도 4-3에 나타낸 바와 같다. 또한 도 4-1 ~ 도 4-3는 IFA과 증류수(Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.)을 동량 혼합한 에멀젼을 조제하고, CTL 에피토프 펩타이드 혼합물 (mixture)과 에피토프 4 연결 펩타이드와 같은 일정으로 마우스에 투여한 음성 대조군(이하 IFA 군 약칭)의 혈청 중 CTL 에피토프 특이적 IgG 항체가 측정 결과에 비해 몇 배의 해당하는 IgG 항체의 생산을 유도되었는지를 보여 주었다.
도 4-1 ~ 도 4-3과 같이, mixture 투여군에서는 CTL 에피토프 특이적 IgG 항체 생산 유도 강도는 낮고 빈도도 낮았다. 한편, 에피토프 4 연결 펩타이드를 투여한 경우는 높은 빈도로 강한 CTL 에피토프 특이적 IgG 항체의 생산 유도가 인정되어, 또한 해당 IgG 생산량은 투여된 에피토프 4 연결 펩타이드 따라 IFA 군의 수십배 에서 백배 이상 현저하게 유도되는 것이 판명되었다.
이상의 결과는 에피토프 4 연결 펩타이드를 투여함으로써 해당 에피토프 4 연결 펩타이드를 구성하는 CTL 에피토프 펩티드를 혼합하여 투여하는 것보다 항암 면역이 강하고 활력화되는 것을 나타낸다.
암 펩티드 백신 치료를 받은 암 환자에서, CTL 에피토프 펩타이드 특이적 IgG 생산의 유도는 에피토프 펩타이드 특이적 CTL의 유도와 함께 연명 효과에 기여한다. 따라서, 본 발명은 기존의 CTL 에피토프 펩타이드 및 그 혼합물로 구성되는 암 펩티드 백신 요법에 비해 우수한 연명 효과가 있을 수 있다. 따라서 본 발명의 에피토프 4 연결 펩티드는 알려진 CTL 에피토프 펩타이드 및 그 혼합물로 구성되는 암 펩티드 백신 요법에 비해 치료 성적을 향상시킬 수 있게 되는, 암 또는 그것에 기인하는 질환 치료제 및/또는 예방제 암 펩티드 백신로서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본원에 도입한다.
<110> TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Novel peptide comprising linearly-connected four-CTL epitope peptides <130> PH-5981-PCT <150> JP 2013-218524 <151> 2013-10-21 <150> JP 2014-155132 <151> 2014-07-30 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Leu Val Glu Phe Glu Asp Val Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Tyr Ser Ala Arg Trp Asn Glu Ile 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Tyr Asp Tyr Asn Cys His Val Asp Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Tyr Ala Trp Glu Pro Ser Phe Leu 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Tyr Leu Arg Ser Val Leu Glu Asp Phe 1 5 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Asp Leu Arg Arg Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu 35 40 45 <210> 65 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 65 Arg Arg Arg Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Arg Arg Arg 1 5 10 15 Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Lys Leu Val Glu Arg 20 25 30 Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp Lys 35 40 45 <210> 66 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 66 Arg Arg Arg Arg Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Arg Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Arg Arg Lys Leu Val Glu 20 25 30 Arg Leu Gly Ala Ala Arg Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu Trp Trp 35 40 45 Lys

Claims (14)

  1. 다음 CTL 에피토프 펩타이드: 서열번호 1로 표시되는 펩타이드 "PEP1", 서열번호 2로 표시되는 펩타이드 "PEP2", 서열번호 4로 표시되는 펩타이드 "PEP4", 서열번호 5로 표시되는 펩티드 "PEP5", 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드 "PEP6", 서열번호 7로 표시되는 펩타이드 "PEP7", 서열번호 8로 표시되는 펩타이드 "PEP8", 서열번호 9로 표시되는 펩타이드 "PEP9", 서열번호 10로 표시되는 펩타이드 "PEP10", 서열번호 13으로 표시되는 펩타이드 "PEP13", 서열번호 15로 표시되는 펩타이드 "PEP15 ", 서열번호 17로 표시되는 펩타이드 "PEP17", 서열번호 18로 표시되는 펩타이드 "PEP18"
    로 이루어진 군에서 중복 선택될 수 있는 4 개의 펩타이드가 링커를 통해 각각 연결되어지고, 친수성 아미노산으로 구성된 새로운 펩타이드 서열을 가질 수 있는, 에피토프 4 연결 펩티드이며,
    하기의 (1) ~ (5)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는, 상기 에피토프 4 연결 펩타이드:
    (1) C 말단이 PEP2 (단, N 말단이 PEP7 및 PEP8이며, N 말단 측에서 링커를 통해 이웃 순서인 것을 제외);
    (2) C 말단이 PEP4;
    (3) C 말단이 PEP10;
    (4) C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단 측에서 링커를 통해 이웃 순서인 것;
    (5) PEP5, PEP6, PEP9 및 PEP18을 포함.
  2. 제 1항에 있어서, PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18에서 선택되는 중복되지 않는 4 개의 펩티드가 링커를 통해 각각 연결되는 에피토프 4 연결 펩타이드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하기 (1) ~ (5)에서 선택되는 어느 하나의 특징을 갖는 에피토프 4 연결 펩타이드:
    (1) PEP1, PEP7, PEP8 및 PEP13에서 선택되는 3 개의 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP2임(단, N 말단이 PEP7 및 PEP8이며, N 말단 측에서 링커를 통해 이어진 순서인 것을 제외);
    (2) PEP5, PEP6 및 PEP9의 세 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP4임;
    (3) PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 및 PEP18에서 선택되는 3 개의 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP10임;
    (4) PEP1 및 PEP7의 두 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP6 및 PEP5이며, N 말단 측에서 링커를 통해 이어진 순서임;
    (5) PEP5, PEP6 및 PEP18 세 CTL 에피토프 펩티드를 포함하고 C 말단이 PEP9임.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택되는 서열을 포함하는 에피토프 4 연결 펩타이드:
    PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
    PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
    PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
    PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
    PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
    PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
    PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
    PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
    PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
    PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2；
    PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
    PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
    PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
    PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
    PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2；
    PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
    PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
    PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
    PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
    PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
    PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
    PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
    PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
    PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
    PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
    PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
    PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
    PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
    PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10;
    PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10;
    PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10;
    PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10;
    PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
    PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10；
    PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9；
    PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9；
    PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5；또는
    PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5
    (식 중 「-(L)-」는 링커를 나타낸다).
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 아미노산 링커인 에피토프 4 연결 펩타이드.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 링커는 아르기닌을 2 개 또는 3 개 연결한 아르기닌 다이머 또는 아르기닌 트리머인 에피토프 4 연결 펩타이드.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 아미노산으로 구성된 새로운 펩타이드 서열이 N 말단에 연결된 에피토프 4 연결 펩타이드.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 아미노산으로 구성된 새로운 펩타이드 서열은 아르기닌을 3 개 연결한 아르기닌 트리머 또는 아르기닌를 4 개 연결한 아르기닌 테트라머로 이루어진 에피토프 4 연결 펩타이드.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 22; 서열번호 23; 서열번호 24; 서열번호 25; 서열번호 26; 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 30; 서열번호 31; 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 서열번호 35; 서열번호 36; 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39; 서열번호 40; 서열번호 41; 서열번호 42; 서열번호 43; 서열번호 44; 서열번호 45; 서열번호 46; 서열번호 47; 서열번호 48; 서열번호 49; 서열번호 50; 서열번호 51; 서열번호 52; 서열번호 53; 서열번호 54; 서열번호 55; 서열번호 56; 서열번호 57; 서열번호 58; 서열번호 59; 서열번호 60; 서열번호 61; 서열번호 62; 서열번호 63; 서열번호 64; 서열번호 65; 또는 서열번호 66로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프 4 연결 펩타이드.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 에피토프 4 연결 펩타이드를 이용하여 말초 혈액 림프구를 자극함으로써 얻어지는 CTL.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 에피토프 4 연결 펩타이드 또는 제 10항에 기재된 CTL을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 에피토프 4 연결 펩타이드를 2 종 이상 포함하는 약학 조성물.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 면역 요법제인 의약 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 기재된 에피토프 4 연결 펩타이드, 제 10항에 기재된 CTL 또는 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 암 환자에게 투여 하는 것을 포함하는 암 치료 방법.

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