KR20160012001A

KR20160012001A - 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법

Info

Publication number: KR20160012001A
Application number: KR1020140093443A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 홍승혜; 이선화
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2016-02-02
Also published as: KR101627921B1

Abstract

본 발명은 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법에 관한 것으로 본 발명의 기술은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 종래 타가토스 생산과 비교하여 기질에 있어서는 단가가 낮은 기질을 사용하고, 수율에 있어서는 현저하게 높기 때문에 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.

Description

알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법{A ALDOLASE MUTANT AND A D-TAGATOSE PRODUCTION METHOD BY USING THE SAME}

본 발명은 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법에 관한 것이다.

통상적으로 타가토스(D-tagatose)는 과당(D-fructose)의 C₄ 에피머로서 설탕에 대하여 92%의 당도를 나타내지만 칼로리는 1.5kcal/g으로 설탕의 약 30%인 저칼로리 감미료이다. 또한 체내에 흡수과정 중에 거의 대사가 되지 않는 비 열량(non-caloric) 감미료로서 섭취한 양의 15~20퍼센트가 체내에 흡수 되는데, 이는 인간이 갖는 자체적인 소화 능력이 아닌 대장 내 미생물에 의한 분해로 인한 흡수이므로 혈당 수치에 영향을 끼치지 않으며, 이로 인해 당뇨병 환자에게 혈당 조절 효과를 기대 할 수 있고, 장내 미생물에 먹이를 제공하게 되고, 이로 인해 미생물에 의한 배변활동에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 충치를 유발하지 않는 기능적 특성을 가지고 있어 어린이들이 좋아하는 쵸콜릿, 껌, 빵, 사탕 등에 설탕대신 넣어 어린이들이 안심하고 섭취할 수 있게 해주는 건강 감미료이며, 설탕 과잉으로 인한 질병의 예방에도 기여할 수 있는 물질로서 많은 관심을 받고 있다. 또한 타가토스는 끓는점이 134℃, pH 2-7로 열과 pH에 대한 안정성이 높아서 대부분의 인공 감미료와 달리 잘 파괴되지 않고 설탕과 가장 유사한 물리적, 화학적 성질을 가지며 특히 가열시 갈색화 반응(browning reaction)의 특성이 과당과 비슷한 ketose이므로 대체당으로서 중요한 특징을 갖는다.

이와 같은 이유로 타가토스는 식품보조제 및 다이어트 감미료로서 각광받고 있어 식품 산업 분야에 있어서 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다. 이는 유제품이나 일부 식물에 미량 함유되어 있는 희소당(rare sugar)이고 화학법으로는 합성되지 못하기 때문이다. 현재는 L-arabinose isomerase를 이용한 생물전환법으로 갈락토오스를 이성화해서 타가토스를 생산하고 있으나 갈락토오스의 수급이 불안정 하고 낙농시장의 변동에 따라 공급가액의 변화폭이 크기 때문에 안정적이고 지속적인 대량 생산량 확보에 어려움이 제기되고 있다.

따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 수급이 안정적이고 원가가 낮은 포도당이나 과당을 기질로 하여 효소를 이용하여 타가토스를 생산하는 방법이 활발히 연구되고 있는 실정이다.

현재까지 단일 효소반응으로 프락토스에서 타가토스를 생산하는 단일 enzyme반응은 알려져 있지 않다. 이 단일 효소의 경우 현재까지 알려진 에피머화 효소들의 메커니즘으로는 전환이 거의 일어나지 않고 생산수율이 현저히 낮아 산업화하기에는 부족함이 있다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허 출원번호 10-2001-0080711

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 프락토스를 기질로 고수율의 타가토스의 제조방법에 사용되는 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 프락토스를 기질로 고수율의 타가토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 프락토스를 기질로 고수율의 타가토스 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 서열번호 1 내지 4의 아미노산으로 이루어진 효소 중에서 선택된 하나의 효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 1로 이루어진 프락토스 알돌레이즈화 효소의 332번째 잔기, 314번째 잔기,227번째 잔기 및 62번째 잔기 중 하나 이상에서 치환된 돌연변이체이며, 여기서 상기 332번째 잔기는 아르기닌에서 글루타민으로 치환, 상기 314번째 잔기는 글루타민에서 알라닌으로 치환, 227번째 잔기는 히스티딘에서 알라닌으로 치환, 62번째 잔기는 세린에서 알라닌으로 치환된 것이 바람직하나

다른 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 야생형 효소에 돌연변이를 유발하여 해당 효소의 활성이 야생형보다 증가된 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함되며, 예를 들어 서열번호 2 내지 4 중 하나의 효소에 돌연변이를 유발하여 야생형보다 해당 효소의 활성이 증가된 돌연변이체는 당연하게 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 헥소카이네이즈, 및 파이테이즈를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 프락토스-6-포스페이트에 상기 본 발명의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 돌연변이체를 처리하는 단계를 포함하는 타가토스 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프락토스-6-포스페이트는 프락토스 또는 프락토스 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것이 바람직하나 다른 화학적 합성방법 등에 의하여 제공되는 경우에도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 타가토스 6-포스페이트에 파이테이즈를 작용시켜 타가토스로 전환하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 상기 타가토스 6-포스페이트는 다른 효소 또는 화학적인 방법 등에 의하여 인산기가 제거될 수도 있다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 아미노산으로 이루어진 효소 중에서 선택된 하나의 효소인 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 돌연변이체 효소를 제공한다.

또 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 헥소카이네이즈는 각각 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나 다른 서열의 효소 중에서 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 가지는 모든 해당 효소도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

본 발명에 따르면, 포스페이트 당의 4번탄소의 에피머화 효소를 이용하여 타가토스의 생산성을 증가시켰으며, 세포 자체 효소반응을 통한 생산방법을 이용하여 발효를 이용하였을 때 발생하는 문제점들에 대해 대비하였다. 특히 타가토스의 경우 프락토스부터 생산한 사례가 없으며 본 발명에서 첫 생산을 시도하였다. 또한 프락토스를 칵테일 반응을 이용하면 수율 80 %에 가까운 타가토스를 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 현재까지 자연적인 기질인 프락토스 1,6-비스포스페이트 이외의 기질에서 특성이 규명되지 않은 대장균 K-12 유래의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소 유전자 또는 단백질에 대응되는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 포함한 발현벡터로 형질 전환된 미생물을 배양하여 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 과발현시켜 효소의 특성을 규명한 결과,

기질특이성이 프락토스 6-포스페이트 4번 탄소 에피머화 작용을 나타내는 효소임을 입증하고, 상기 효소를 사용하여 타가토스 6-포스페이트를 생산 후 상업용 파이테이즈를 처리하여 타가토스를 생산하는 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로 본 발명에서 사용한 상기 공지 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 유전자는 기존에 이미 유전자가 알려져 있지만 프락토스 6-포스페이트를 이용한 4번 탄소 에피머화 작용 특성이 규명이 안 된 유전자 생산 균주들인, Escherichia coli K-12, Bacillus subtilis , Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Kluyveromyces lactis를 사용하였으며, 이 모든 효소들이 프락토스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환시키는 활성을 가지고 있음을 본 발명에서 세계 최초로 입증하였다.

이때, 효소의 특성을 규명하기 위하여, 본 발명은 종래 실험을 통해 전혀 기능적으로 규명되지 않고 다만 염기서열의 특성만으로 평가되어 명명된 공지의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 유전자를 함유하고 있는 균주로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 유전자를 대량으로 수득한 후, 적절한 발현 벡터에 삽입하여 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조한 후 상기 재조합 벡터로 적절한 미생물에 형질전환시킨 균주를 발효 배지에서 배양하여 과발현시킨 효소를 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 본 발명의 타가토스 생산 방법은 종래 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소라 불리우던 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈에 헥소카이네이즈 의해 얻은 프락토스 6-포스페이트를 기질로 반응시켜 타가토스 6-포스페이트를 얻고 이에 파이테이즈 처리로 타가토스를 얻는 3단계의 공정으로 이루어진다.

또한, 본 발명의 타가토스 생산방법에서 사용되는 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소는 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열에 국한되는 것이 아니라, 프락토스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환시켜줄 수 있는 것이라면 이들 서열번호에 기재된 아미노산에서 일부 아미노산이 치환 (substitution), 삽입 (insertion), 소실 (deletion)이 있는 경우에도 사용할 수 있다.

그리고, 본 발명의 타가토스 생산 방법에서 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소유전자를 클로닝할 때 사용되는 발현벡터는, RSF Duet-1를 비롯하여 유전자 재조합에 이용되어 온 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 재조합 벡터로 형질전환시킬 수 있는 균주는, 대장균 BL21(DE3)을 사용하는 것이 바람직하나 유전자 재조합 벡터로 형질전환된 다음 원하는 유전자를 과발현하여 활성이 있는 단백질을 생산할 수 있는 균주라면 어느 균주를 사용해도 된다.

보다 구체적으로 본 발명에서 미생물 배양은 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 얻기 위한 재조합 균주로, 대장균 BL21(DE3)[Escherichia coli BL21(DE3)] 균주를 사용하고, 미생물 생산 배지로는 LB를 사용하였고 효소 생산배지로는 글리세롤 10 g/ℓ, 펩톤 1 g/ℓ, 효모 추출물 30 g/ℓ, 이인산칼륨 0.14 g/ℓ, 일인산나트륨 1 g/ℓ로 구성된 배지를 사용하였다. 냉동 보관된 BL21(DE3) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 배양하고, 상기 배양액을 발효 배지 5ℓ가 들어있는 7ℓ의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 배양한 다음, 1mM IPTG를 첨가하여 과발현되는 효소의 생산을 유도하고 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃으로 유지하는 것이 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 대량생산에 바람직하다.

그리고, 과발현되어 생산된 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 정제하기 위하여, 본 발명의 정제된 효소는, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000× g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후, 0.85% NaCl에 두 번 세척한 후 라이소자임이 1 mg/ml이 함유된 세포파쇄 완충용액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0)에 세포를 넣어 얼음 안에서 30분간 방치하고, 상기 세포 용액을 프렌치 프레스로 15,000 lb/in²에서 파쇄한 다음, 상기 세포 파쇄물은 13,000× g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 제거하고 상등액은 0.45 μm여과지로 여과하여 정제하는 것이 바람직한 데, 이때 모든 정제과정은 저온실에서 단백질크로마토그라피(FPLC)로 수행하고, 상기 여과액을 pH 8.0인 300 mM 염화나트륨(NaCl)과 10 mM 이미다졸(imidazole)이 함유된 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 평형시킨 히스트랩 에이치피(HisTrap HP) 컬럼에 적용하는 데, 이때 컬럼을 같은 완충용액으로 세척시킨 후 부착된 효소는 같은 완충용액에 10 mM과 200 mM 사이의 일정 기울기 농도의 이미다졸이 포함된 용액을 1 ml/min 속도로 하여 용출(elution)되게 하는 것이 바람직하다. 상기 용출된 활성이 있는 효소의 부분(fraction)은 pH 8.5인 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 평형시킨 하이프렙(HiPrep 16/60) 탈염 수지 컬럼에 첨가한 후, 첨가된 단백질을 6 ml/min 속도로 하여 씻어 내리게 하고, 모아진 효소용액을 pH 8.5인 0.15 M 염화나트륨이 포함된 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 평형시킨 세파크릴 에스-100 에치알 (Sephacryl S-100 HR) 컬럼에 넣고 6.6 ml/min 속도로 하여 모아진 효소를 용출하고, 상기 용출된 용액은 최종적으로 50 mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에서 투석하여 수득한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 상기와 같이 본 발명에 따라 수득한 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 분자량이 78 kDa인 단량체이고, 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme)이다.

이때 상기 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소와 프락토스 6-포스페이트와의 반응 조건으로 은 55-75%(w/w)의 범위로 pH 8.5에서 50℃로 반응시키는 것이 타가토스 6-포스페이트 생산수율에 있어 바람직하다. 이는 과당의 기질 농도가 55-75%(w/w)범위에서 타가토스 6-포스페이트 생산수율이 우수하였으며, 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소의 최적 pH와 온도 범위이기 때문이다.

한편, 본 발명의 칵테일 반응은 헥소카이네이즈, 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈화 효소, 파이테이즈를 이용하여 프락토스를 세포 내에서 반응시켜 타가토스를 대량으로 생산하기 위한 방법으로, 대량으로 발현된 카이네이즈 효소, 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 과발현시켜 세포 내에서 사용하는 게 바람직하다. 이는 세포 내 환경은 과발현된 효소가 활성이 장기간 유지될 수 있도록 조성해 주고 반응 시 필요한 cofactor 재생이 가능하기 때문이며, 본 발명에서 사용 가능한 대장균은 효소들을 과발현 할 수 있는 대장균이라면 그 어느 것을 사용해도 무방하다.

본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 프락토스로부터 타가토 생산을 이전에 없던 방법으로 전환 시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.

그리고, 이와 같은 방법으로 대량 생산된 타가토스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 종래 타가토스 생산과 비교하여 기질에 있어서는 단가가 낮은 기질을 사용하고, 수율에 있어서는 현저하게 높기 때문에 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에서 소개한 칵테일 반응에 의한 프락토스에서 타가토스로의 생산을 도식화한 것이다.
도 2는 Saccharomyces cerevisiae 유래 핵소카이네이즈와 5 mM에서 50 mM 의 프락토스를 1시간 동안 반응하여 본 생산 활성 그래프이다.
도 3는 본 발명의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 금속 특이성(A), 최적 pH(B)와 최적 온도(C)에 따른 프락토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트의 전환율을 그래프로 나타낸 것이다.도 3(D)는 (A),(B),(C)의 결과에서 얻은 반응최적 조건에서 10mM 프락토스 6-포스페이트를 타가토스 6-포스페이트로 전환 반응한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명에서 전환한 타가토스 6-포스페이트와 파이테이즈 반응시 파이테이즈 농도에 따른 타가토스로의 전환율을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 사용한 duet vector 시스템을 도식화한 것이고 이는 헥소카이네이즈와 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈를 함께 클로닝 할 목적으로 하고 있다.
도 6은 본 발명에서 제작한 유전자변이 효소와 자연상태의 효소의 활성을 비교한 것으로 단위시간당 더 빠른 전환속도를 통해 전환속도를 증가시키고 생산성을 향상하는 것을 보여주는 것임.

이하, 비한정적인 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 헥소카이네이즈에 의한 프락토스로부터 프락토스 6- 포스페이트로의 전환 활성

본 발명의 고농도의 타가토스의 생산을 위하여 첫 단계로 5 mM에서 50 mM 프락토스를 동량의 ATP (Adenosine triphosphate)와 Saccharomyces cerevisiea 유래의 헥소카이네이즈를 반응 하여 프락토스 6-포스페이트 생산하기 위하여, 50 mM pH 7.5 트리스 완충용액에 함유된 250 단위/ml의 효소와 온도 30 ℃에서 60분간 반응을 수행하였다. 그런 다음, 효소의 활성을 측정하였다. 효소 농도에 따른 프락토스 6-포스페이트 생산량은 도 2에 나타내었다. 이의 결과, 5 mM에서 50 mM 의 프락토스 6-포스페이트가 생산되었고 이것은 전환수율 90 % 이상에 해당되는 것이다.

본 실시예에서 사용한 헥소카이네이즈는 sigma aldrich사의 H4502 Type F-300, 동결건조 분말, =130　units/mg protein (biuret) (Sigma)을 사용하였으며, 파이테이즈는 genofocus 사의 Genophos 10000G를 사용하였다.

실시예 2. 프락토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈화 효소의 대량생산

프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소 유전자는 대장균 k12 (Escherichia coli str. K12 substr. MG1655 ) 의 디앤에이(DNA)염기서열을 기본으로 프라이머(primer)를 도안하여 PCR 증폭하여 대량으로 얻은 다음, 제한효소 Sal I와 Not I을 사용하여 RSF Duet-1[Novagen]에 삽입하고, 재조합 벡터 RSF Duet-1/프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈(도 5 참조)를 제조하여, 이를 통상적인 형질전환 방법에 의해 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하였다. 그리고, 대량생산을 위한 배양을 하기 전에 재조합 균주의 보관은 액화질소에서 냉동보관 하였다.

프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소를 대량생산하기 위하여, 냉동 보관된 BL21(DE3) 균주를 LB 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여, 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 종균배양을 하고, 상기 종균배양된 배양액을 발효 배지(글리세롤 10 g/ℓ, 펩톤 1 g/ℓ, 효모 추출물 30 g/ℓ, 이인산칼륨 0.14 g/ℓ, 일인산나트륨 1 g/ℓ) 5ℓ가 들어있는 7ℓ의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 본배양하였다. 이때, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM IPTG를 첨가하여 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈효소의 대량생산을 유도하였다. 이때, 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 하였다.

실시예 3. 프락토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈효소의 정제

프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈효소의 특성을 정확히 파악하기 위해서 친화성 히스트랩 에이치피(affinity HisTrap HP) 컬럼, 탈염 하이프렙( HiPrep 16/60), 겔여과 세파크릴 에스-100 에치알 (gel filtration Sephacryl S-100 HR) 컬럼을 사용하여 정제하였다.

정제한 효소의 분자량을 측정한 결과 78,000 Da의 이량체임을 알 수 있었으며, 이의 아미노산 서열은 NCBI 등록번호(accession number) CAA32605.1와 동일함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 프락토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 금속 특이성

본래 이전 논문에서는 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 금속 아연에 의해서 프락토스 1,6-비스포스페이트 기질이 다이하이드록시 아세트- 포스페이트와 글라이세르 알데하이드 3-포스페이트로 전환 시 관여되며 역가를 향상 시킨다고 보고되어 있으나, 본 발명에서는 기질을 프락토스 6-포스페이트로 적용하였을 때 금속염 효과가 역가 향상에 영향을 미치지 않음을 보였다. 금속염 효과를 조사하기 위해서 효소활성은 하기 도 3a에 나타낸 바와 같이, 이디티에이(EDTA)를 처리하거나 또는 1 mM 금속이온 첨가 후 측정하였으며, 이때 반응은 1.0%의 과당과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 8.5와 50℃에서 30분간 수행하였고 HCl 0.2M을 첨가하여 반응을 멈추어 측정하였다.

이의 결과, 본 발명의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 금속이온에 의한 효소활성의 변화가 없었고, 이전 논문과 달리 아연 이온 첨가는 활성을 크게 저해하는 금속효소임을 알 수 있었다.

실시예 5. 프락토스 1,6- 비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 pH 및 온도 변화에 따른 활성

본 실시예는 pH 및 온도 변화에 따른 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 기질을 반응시키고, 효소 활성을 비교하고자 하였다. 이때, pH 효과를 조사하기 위해서 반응은 1.0%의 과당과 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM PIPES 완충용액 pH 6.5에서부터 7.5까지와 50mM 트리즈마 베이스(Trizma base) 완충용액 pH 7.0에서부터 10까지의 범위에서 반응 시켰다. 이때, 반응 온도는 37 ℃에서 30분간 반응을 시켰다. 그런 다음, 0.2 M HCl을 첨가 하여 반응을 종료하고, 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 3(b)에 나타내었다.

그리고, 온도 효과를 조사하기 위해서 반응은 온도 20℃에서 70℃까지 1.0%의 프락토스 6-포스페이트와 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액을 pH 8.5에서 30분간 반응을 시켰으며, 이때 0.2 M HCl을 첨가 하여 반응을 종료하고 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 3(c)에 나타내었다. 이의 결과, 최적 pH와 온도는 각각 8.5와 50℃이었다. 위 결과를 토대로 최적의 온도와 pH에서 프락토스 6-포스페이트에서 타가토스 6-포스페이트로의 전환을 시간별로 나타내어 전환율이 80 % 까지 도달하는 것을 확인하였고 도 3(d)에 나타내었다. 그러나 상기 반응에 있어 특정 pH와 온도를 규정하지 아니하고 원하는 수율이나 반응환경에 따라 어떠한 범주에서의 반응도 적용한다.

실시예 6. 파이테이즈에 의한 타가토스 6- 포스페이트로부터 타가토스 생산

본 발명의 고농도의 타가토스의 생산을 위하여 프락토스 6-포스페이트로부터 전환한 타가토스 6-포스페이트 10 mM 을 10에서 50 단위/ml의 파이테이즈와 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 5.5, 온도 60℃에서 60분간 반응을 수행하였다. 그런 다음, 효소의 활성을 측정하였다. 효소 농도에 따른 타가토스 생산량은 도 4에 나타내었다.

이의 결과, 배양시간 50 U/ml에 9 mM 의 타가토스가 생산되었고 이것은 전환수율 90 %에 해당되는 것이다.

실시예 7. 헥소카이네이즈 , 알돌레이즈 , 파이테이즈의 칵테일반응을 이용한 프락토스 로부터 타가토스 생산

앞선 실시 예들을 통한 결과를 토대로 헥소카이네이즈, 알돌레이즈, 파이테이즈의 칵테일반응을 이용한 프락토스 로부터 타가토스 생산을 실시하였다. 5 mM의 프락토스를 동량의 ATP (Adenosine triphosphate)와 Saccharomyces cerevisiea 유래의 헥소카이네이즈를 250 단위/ml 로 하여 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 7.5, 온도 30 ℃에서 60분간 반응을 수행하여 프락토스 6-포스페이트 생산한 결과 5mM의 프락토스를 5mM의 프락토스 6-포스페이트로 100% 전환하였으며 연속반응으로 0.5 단위/ml의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액을 pH 8.5에서 30분간 반응을 시킨 결과 5mM의 프락토스 6-포스페이트가 4.65mM의 타가토스 6-포스페이트로 93% 전환하였다. 이 후 50 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액에서 pH 5.5, 온도 60℃에서 60분간 반응을 수행한 결과 4.65mM의 타가토스 6-포스페이트가 4.65mM의 타가토스로 100% 전환하였다. 결론적으로 5mM의 프락토스를 이용하여 헥소카이네이즈, 알돌레이즈, 파이테이즈의 칵테일반응을 이용한 결과 4.65mM의 타가토스로 93% 전환하는 것에 성공하였다.

실시예 8. 알돌레이즈의 아미노산 치환에 따른 유전자 변이 효소의 활성변화

본 발명의 고농도의 타가토스의 생산을 위하여 알돌레이즈 효소의 활성을 증가시키기 위해 기본 유전자 서열을 조작하여 아미노산 치환을 일으키고 이에 따른 활성 변화를 관찰한 결과 더 빠른 초기반응속도를 통해 빠른 전환효과를 나타낼 수 있는 유전자 변이 효소를 만드는 것에 성공하였다. 변이하고자 하는 아미노산을 암호화하고 있는 유전자서열을 site directed mutation으로 변이시켜 유전자 변이 효소를 만들었다. Site directed mutation은 Muta-Direct™ Site Directed Mutagenesis Kit을 이용하여 진행하였으며 변이하고자 하는 아미노산 332R, 314Q, 227H, 62S 를 암호화하고 있는 유전자를 아미노산 glutamic cid 또는 alanine으로 암호화하도록 치환한 primer(표 1 서열 참조)를 제작하여 재조합 plasmid를 증폭하고 이를 형질전환 후 sequencing결과 치환된 변이 효소를 갖는 균체를 screening을 통해 선별하였다. 선별한 유전자 변이 효소는 실시예 3에 따라 야생주와 동일한 방법으로 정제과정을 수행한 후 활성의 비교를 위하여 1.0%의 프락토스 6-포스페이트와 0.04 단위/ml의 효소가 함유된 50 mM 트리즈마 베이스 완충용액 pH 8.5에서 10분간 반응을 시켰으며, 이때 0.2 M HCl을 첨가 하여 반응을 종료하고 전환된 타가토스 6-포스페이트와 잔존하는 프락토스 6-포스페이트의 양을 분석하고 야생주 효소의 활성을 상대활성 100%로 환산하여 효소의 활성을 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 결과적으로 R332Q 변이체에서는 자연상태 효소대비 약 140%, Q314A 변이체에서는 약 250%, H227A 변이체에서는 약 230%, S62A 변이체에서는 약 150% 정도의 활성증가가 있었다.

Name	Neucleotide sequence 5' to 3'
S62A	GGTTATCGTTCAGTTCGCCAACGGTGGTGCTTC(서열번호 7)
S62A anti	GAAGCACCACCGTTGGCGAACTGAACGATAACC(서열번호 8)
H227A	GCGTCCTTCGGTAACGTAGCCGGTGTTTACAAG(서열번호 9)
H227A anti	CTTGTAAACACCGGCTACGTTACCGAAGGACGC(서열번호 10)
Q314A	CTTATCTGCAGGGTGCGCTGGGTAACC(서열번호 11)
Q314A anti	GGTTACCCAGCGCACCCTGCAGATAAG(서열번호 12)
R331Q	TACGATCCGCAGGTATGGCTGCGTGCCG(서열번호 13)
R331Q anti	CGGCACGCAGCCATACCTGCGGATCGTA(서열번호 14)

표 1은 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 돌연변이체 제작에 사용된 primer 정보를 나타낸 표.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A ALDOLASE MUTANT AND A D-TAGATOSE PRODUCTION METHOD BY USING THE SAME <130> FK13013PCK <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 359 <212> PRT <213> Escherichia coli (strain K12) <400> 1 Met Ser Lys Ile Phe Asp Phe Val Lys Pro Gly Val Ile Thr Gly Asp 1 5 10 15 Asp Val Gln Lys Val Phe Gln Val Ala Lys Glu Asn Asn Phe Ala Leu 20 25 30 Pro Ala Val Asn Cys Val Gly Thr Asp Ser Ile Asn Ala Val Leu Glu 35 40 45 Thr Ala Ala Lys Val Lys Ala Pro Val Ile Val Gln Phe Ser Asn Gly 50 55 60 Gly Ala Ser Phe Ile Ala Gly Lys Gly Val Lys Ser Asp Val Pro Gln 65 70 75 80 Gly Ala Ala Ile Leu Gly Ala Ile Ser Gly Ala His His Val His Gln 85 90 95 Met Ala Glu His Tyr Gly Val Pro Val Ile Leu His Thr Asp His Cys 100 105 110 Ala Lys Lys Leu Leu Pro Trp Ile Asp Gly Leu Leu Asp Ala Gly Glu 115 120 125 Lys His Phe Ala Ala Thr Gly Lys Pro Leu Phe Ser Ser His Met Ile 130 135 140 Asp Leu Ser Glu Glu Ser Leu Gln Glu Asn Ile Glu Ile Cys Ser Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Glu Arg Met Ser Lys Ile Gly Met Thr Leu Glu Ile Glu Leu 165 170 175 Gly Cys Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asp Asn Ser His Met Asp 180 185 190 Ala Ser Ala Leu Tyr Thr Gln Pro Glu Asp Val Asp Tyr Ala Tyr Thr 195 200 205 Glu Leu Ser Lys Ile Ser Pro Arg Phe Thr Ile Ala Ala Ser Phe Gly 210 215 220 Asn Val His Gly Val Tyr Lys Pro Gly Asn Val Val Leu Thr Pro Thr 225 230 235 240 Ile Leu Arg Asp Ser Gln Glu Tyr Val Ser Lys Lys His Asn Leu Pro 245 250 255 His Asn Ser Leu Asn Phe Val Phe His Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala 260 265 270 Gln Glu Ile Lys Asp Ser Val Ser Tyr Gly Val Val Lys Met Asn Ile 275 280 285 Asp Thr Asp Thr Gln Trp Ala Thr Trp Glu Gly Val Leu Asn Tyr Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Glu Ala Tyr Leu Gln Gly Gln Leu Gly Asn Pro Lys Gly 305 310 315 320 Glu Asp Gln Pro Asn Lys Lys Tyr Tyr Asp Pro Arg Val Trp Leu Arg 325 330 335 Ala Gly Gln Thr Ser Met Ile Ala Arg Leu Glu Lys Ala Phe Gln Glu 340 345 350 Leu Asn Ala Ile Asp Val Leu 355 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Streptococcus thermophilus <400> 2 Met Ala Ile Val Ser Ala Glu Lys Phe Val Gln Ser Ala Arg Asp Asn 1 5 10 15 Gly Tyr Ala Leu Gly Gly Phe Asn Thr Asn Asn Leu Glu Trp Thr Gln 20 25 30 Ala Ile Leu Arg Ala Ala Glu Ala Lys Lys Ala Pro Val Leu Ile Gln 35 40 45 Thr Ser Met Gly Ala Ala Lys Tyr Met Gly Gly Tyr Lys Leu Cys Lys 50 55 60 Ala Leu Ile Glu Glu Leu Val Glu Ser Met Gly Ile Thr Val Pro Val 65 70 75 80 Ala Ile His Leu Asp His Gly His Tyr Asp Asp Ala Leu Glu Cys Ile 85 90 95 Glu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Met Phe Asp Gly Ser His Leu Pro Ile 100 105 110 Glu Glu Asn Leu Lys Leu Ala Lys Glu Val Val Glu Lys Ala His Ala 115 120 125 Lys Gly Ile Ser Val Glu Ala Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly Glu Glu 130 135 140 Asp Gly Ile Val Gly Arg Gly Glu Leu Ala Pro Ile Glu Asp Ala Lys 145 150 155 160 Ala Met Val Ala Thr Gly Val Asp Phe Leu Ala Ala Gly Ile Gly Asn 165 170 175 Ile His Gly Pro Tyr Pro Glu Asn Trp Glu Gly Leu Asp Leu Asp His 180 185 190 Leu Gln Lys Leu Thr Glu Ala Ile Pro Gly Phe Pro Ile Val Leu His 195 200 205 Gly Gly Ser Gly Ile Pro Asp Asp Gln Ile Gln Glu Ala Ile Lys Leu 210 215 220 Gly Val Ala Lys Val Asn Val Asn Thr Glu Cys Gln Ile Ala Phe Ala 225 230 235 240 Asn Ala Thr Arg Lys Phe Val Ala Glu Tyr Glu Ala Asn Glu Ala Glu 245 250 255 Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Phe Asp Pro Arg Lys Phe Leu Lys Pro Gly 260 265 270 Phe Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Glu Arg Ile Asp Val Phe Gly 275 280 285 Ser Ala Asn Lys Ala 290 <210> 3 <211> 323 <212> PRT <213> Caldicellulosiruptor saccharolyticus (strain ATCC 43494 / DSM 8903) <400> 3 Met Pro Leu Val Thr Thr Lys Glu Met Phe Lys Lys Ala Ala Glu Gly 1 5 10 15 Lys Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Asn Val Asn Asn Met Glu Ile Ile Gln 20 25 30 Gly Ile Val Glu Ala Ala Lys Glu Glu Gln Ala Pro Leu Ile Leu Gln 35 40 45 Val Ser Ala Gly Ala Arg Lys Tyr Ala Lys His Val Tyr Leu Val Lys 50 55 60 Leu Val Glu Ala Ala Leu Glu Asp Ser Gly Asp Leu Pro Ile Ala Leu 65 70 75 80 His Leu Asp His Gly Glu Asp Phe Glu Ile Cys Lys Ala Cys Ile Asp 85 90 95 Gly Gly Phe Thr Ser Val Met Ile Asp Gly Ser Arg Leu Pro Phe Glu 100 105 110 Glu Asn Ile Ala Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Tyr Ala His Glu Arg 115 120 125 Gly Val Val Val Glu Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Gly Ile Glu Asp 130 135 140 Asn Val Lys Val Ala Glu His Glu Ala Ala Phe Thr Asp Pro Asp Gln 145 150 155 160 Ala Ala Glu Phe Val Glu Arg Thr Gly Val Asp Ser Leu Ala Val Ala 165 170 175 Ile Gly Thr Ser His Gly Ala Tyr Lys Phe Lys Gly Glu Pro Arg Leu 180 185 190 Asp Phe Glu Arg Leu Gln Arg Ile Val Glu Lys Leu Pro Lys Gly Phe 195 200 205 Pro Ile Val Leu His Gly Ala Ser Ser Val Leu Pro Glu Phe Val Glu 210 215 220 Met Cys Asn Lys Tyr Gly Gly Asn Ile Pro Gly Ala Lys Gly Val Pro 225 230 235 240 Glu Asp Met Leu Arg Lys Ala Ala Glu Leu Gly Val Arg Lys Ile Asn 245 250 255 Ile Asp Thr Asp Leu Arg Leu Ala Met Thr Ala Ala Ile Arg Lys His 260 265 270 Leu Ala Glu His Pro Asp His Phe Asp Pro Arg Gln Tyr Leu Lys Asp 275 280 285 Gly Arg Glu Ala Ile Lys Glu Met Val Lys His Lys Leu Arg Asn Val 290 295 300 Leu Gly Cys Ser Gly Lys Ala Pro Glu Ile Leu Glu Glu Ile Lys Lys 305 310 315 320 Asn Arg Gly <210> 4 <211> 361 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140 <400> 4 Met Pro Ala Gln Asp Val Leu Thr Arg Lys Thr Gly Val Ile Val Gly 1 5 10 15 Asp Asp Val Lys Ala Leu Phe Asp Tyr Ala Lys Glu His Lys Phe Ala 20 25 30 Ile Pro Ala Ile Asn Val Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Ala Ala Leu 35 40 45 Glu Ala Ala Arg Asp Asn Lys Ser Pro Ile Ile Leu Gln Thr Ser Asn 50 55 60 Gly Gly Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Lys Gly Val Ser Asn Glu Gly Gln 65 70 75 80 Asn Ala Ser Ile Arg Gly Ser Ile Ala Ala Ala His Tyr Ile Arg Ser 85 90 95 Ile Ala Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Val Val Leu His Thr Asp His Cys 100 105 110 Ala Lys Lys Leu Leu Pro Trp Phe Asp Gly Met Leu Lys Ala Asp Glu 115 120 125 Glu Tyr Phe Ala Lys His Gly Glu Pro Leu Phe Ser Ser His Met Leu 130 135 140 Asp Leu Ser Glu Glu Thr Asp Glu Glu Asn Ile Gly Leu Cys Val Lys 145 150 155 160 Tyr Phe Thr Arg Met Ala Lys Ile His Gln Trp Leu Glu Met Glu Ile 165 170 175 Gly Ile Thr Gly Gly Glu Glu Asp Gly Val Asn Asn Glu Gly Thr Ser 180 185 190 Asn Asp Lys Leu Tyr Thr Thr Pro Glu Thr Val Phe Ser Val His Glu 195 200 205 Ala Leu Ser Lys Ile Ser Pro Asn Phe Ser Ile Ala Ser Ala Phe Gly 210 215 220 Asn Val His Gly Val Tyr Lys Ile Ala Ala Ala Leu Lys Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Thr Phe Gln Asp Tyr Ala Ala Lys Gln Leu Asn Lys Lys Ala 245 250 255 Glu Asp Lys Pro Leu Tyr Leu Val Phe His Gly Gly Ser Gly Ser Ser 260 265 270 Thr Lys Asp Phe His Thr Ala Ile Asp Phe Gly Val Val Lys Val Asn 275 280 285 Leu Asp Thr Asp Cys Gln Phe Ala Tyr Leu Ser Gly Ile Arg Asp Tyr 290 295 300 Val Leu Asn Lys Lys Asp Tyr Leu Met Thr Pro Val Gly Asn Pro Thr 305 310 315 320 Gly Glu Asp Ser Pro Asn Lys Lys Tyr Tyr Asp Pro Arg Val Trp Val 325 330 335 Arg Glu Gly Glu Lys Thr Met Ser Lys Arg Ile Thr Gln Ala Leu Glu 340 345 350 Ile Phe Arg Thr Lys Gly Ala Leu Glu 355 360 <210> 5 <211> 485 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) <400> 5 Met Val His Leu Gly Pro Lys Lys Pro Gln Ala Arg Lys Gly Ser Met 1 5 10 15 Ala Asp Val Pro Lys Glu Leu Met Asp Glu Ile His Gln Leu Glu Asp 20 25 30 Met Phe Thr Val Asp Ser Glu Thr Leu Arg Lys Val Val Lys His Phe 35 40 45 Ile Asp Glu Leu Asn Lys Gly Leu Thr Lys Lys Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Ile Pro Gly Trp Val Met Glu Phe Pro Thr Gly Lys Glu Ser Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu 85 90 95 Val Lys Leu Ser Gly Asn His Thr Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Tyr 100 105 110 Lys Leu Pro His Asp Met Arg Thr Thr Lys His Gln Glu Glu Leu Trp 115 120 125 Ser Phe Ile Ala Asp Ser Leu Lys Asp Phe Met Val Glu Gln Glu Leu 130 135 140 Leu Asn Thr Lys Asp Thr Leu Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asn Lys Ile Asn Glu Gly Ile Leu Gln Arg Trp Thr Lys 165 170 175 Gly Phe Asp Ile Pro Asn Val Glu Gly His Asp Val Val Pro Leu Leu 180 185 190 Gln Asn Glu Ile Ser Lys Arg Glu Leu Pro Ile Glu Ile Val Ala Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ser Tyr Tyr Thr Asp Pro 210 215 220 Glu Thr Lys Met Gly Val Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Phe 225 230 235 240 Tyr Asp Val Val Ser Asp Ile Glu Lys Leu Glu Gly Lys Leu Ala Asp 245 250 255 Asp Ile Pro Ser Asn Ser Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser 260 265 270 Phe Asp Asn Glu His Leu Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Val Ala 275 280 285 Val Asp Glu Gln Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Ala Phe Glu Lys Met 290 295 300 Thr Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Leu Leu Arg Leu Val Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Gly Leu Met Leu Lys Asp Gln Asp Leu Ser Lys Leu 325 330 335 Lys Gln Pro Tyr Ile Met Asp Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Ile Glu Asp 340 345 350 Asp Pro Phe Glu Asn Leu Glu Asp Thr Asp Asp Ile Phe Gln Lys Asp 355 360 365 Phe Gly Val Lys Thr Thr Leu Pro Glu Arg Lys Leu Ile Arg Arg Leu 370 375 380 Cys Glu Leu Ile Gly Thr Arg Ala Ala Arg Leu Ala Val Cys Gly Ile 385 390 395 400 Ala Ala Ile Cys Gln Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Gly His Ile Ala Ala 405 410 415 Asp Gly Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Ala Ala Ala 420 425 430 Lys Gly Leu Arg Asp Ile Tyr Gly Trp Thr Gly Asp Ala Ser Lys Asp 435 440 445 Pro Ile Thr Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ala 450 455 460 Val Ile Ala Ala Leu Ser Glu Lys Arg Ile Ala Glu Gly Lys Ser Leu 465 470 475 480 Gly Ile Ile Gly Ala 485 <210> 6 <211> 486 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) <400> 6 Met Val His Leu Gly Pro Lys Lys Pro Gln Ala Arg Lys Gly Ser Met 1 5 10 15 Ala Asp Val Pro Lys Glu Leu Met Gln Gln Ile Glu Asn Phe Glu Lys 20 25 30 Ile Phe Thr Val Pro Thr Glu Thr Leu Gln Ala Val Thr Lys His Phe 35 40 45 Ile Ser Glu Leu Glu Lys Gly Leu Ser Lys Lys Gly Gly Asn Ile Pro 50 55 60 Met Ile Pro Gly Trp Val Met Asp Phe Pro Thr Gly Lys Glu Ser Gly 65 70 75 80 Asp Phe Leu Ala Ile Asp Leu Gly Gly Thr Asn Leu Arg Val Val Leu 85 90 95 Val Lys Leu Gly Gly Asp Arg Thr Phe Asp Thr Thr Gln Ser Lys Tyr 100 105 110 Arg Leu Pro Asp Ala Met Arg Thr Thr Gln Asn Pro Asp Glu Leu Trp 115 120 125 Glu Phe Ile Ala Asp Ser Leu Lys Ala Phe Ile Asp Glu Gln Phe Pro 130 135 140 Gln Gly Ile Ser Glu Pro Ile Pro Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asn Lys Ile Asn Glu Gly Ile Leu Gln Arg Trp Thr Lys 165 170 175 Gly Phe Asp Ile Pro Asn Ile Glu Asn His Asp Val Val Pro Met Leu 180 185 190 Gln Lys Gln Ile Thr Lys Arg Asn Ile Pro Ile Glu Val Val Ala Leu 195 200 205 Ile Asn Asp Thr Thr Gly Thr Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Thr Asp Pro 210 215 220 Glu Thr Lys Met Gly Val Ile Phe Gly Thr Gly Val Asn Gly Ala Tyr 225 230 235 240 Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ile Glu Lys Leu Gln Gly Lys Leu Ser Asp 245 250 255 Asp Ile Pro Pro Ser Ala Pro Met Ala Ile Asn Cys Glu Tyr Gly Ser 260 265 270 Phe Asp Asn Glu His Val Val Leu Pro Arg Thr Lys Tyr Asp Ile Thr 275 280 285 Ile Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Gly Gln Gln Thr Phe Glu Lys Met 290 295 300 Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Gly Glu Ile Leu Arg Leu Ala Leu Met Asp 305 310 315 320 Met Tyr Lys Gln Gly Phe Ile Phe Lys Asn Gln Asp Leu Ser Lys Phe 325 330 335 Asp Lys Pro Phe Val Met Asp Thr Ser Tyr Pro Ala Arg Ile Glu Glu 340 345 350 Asp Pro Phe Glu Asn Leu Glu Asp Thr Asp Asp Leu Phe Gln Asn Glu 355 360 365 Phe Gly Ile Asn Thr Thr Val Gln Glu Arg Lys Leu Ile Arg Arg Leu 370 375 380 Ser Glu Leu Ile Gly Ala Arg Ala Ala Arg Leu Ser Val Cys Gly Ile 385 390 395 400 Ala Ala Ile Cys Gln Lys Arg Gly Tyr Lys Thr Gly His Ile Ala Ala 405 410 415 Asp Gly Ser Val Tyr Asn Arg Tyr Pro Gly Phe Lys Glu Lys Ala Ala 420 425 430 Asn Ala Leu Lys Asp Ile Tyr Gly Trp Thr Gln Thr Ser Leu Asp Asp 435 440 445 Tyr Pro Ile Lys Ile Val Pro Ala Glu Asp Gly Ser Gly Ala Gly Ala 450 455 460 Ala Val Ile Ala Ala Leu Ala Gln Lys Arg Ile Ala Glu Gly Lys Ser 465 470 475 480 Val Gly Ile Ile Gly Ala 485 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ggttatcgtt cagttcgcca acggtggtgc ttc 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gaagcaccac cgttggcgaa ctgaacgata acc 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gcgtccttcg gtaacgtagc cggtgtttac aag 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cttgtaaaca ccggctacgt taccgaagga cgc 33 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cttatctgca gggtgcgctg ggtaacc 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggttacccag cgcaccctgc agataag 27 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tacgatccgc aggtatggct gcgtgccg 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 cggcacgcag ccatacctgc ggatcgta 28

Claims

프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소는 서열번호 1 내지 4의 아미노산으로 이루어진 효소 중에서 선택된 하나의 효소인 것을 특징으로 하는 타가토스 생산용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 헥소카이네이즈, 및 파이테이즈를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 1로 이루어진 프락토스 알돌레이즈화 효소의 332번째 잔기, 314번째 잔기,227번째 잔기 및 62번째 잔기 중 하나 이상에서 치환된 돌연변이체이며, 여기서 상기 332번째 잔기는 아르기닌에서 글루타민으로 치환, 상기 314번째 잔기는 글루타민에서 알라닌으로 치환, 227번째 잔기는 히스티딘에서 알라닌으로 치환, 62번째 잔기는 세린에서 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 타가토스 생산용 조성물.
프락토스-6-포스페이트에 제1항의 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈 효소의 돌연변이체를 처리하는 단계를 포함하는 타가토스 생산 방법.
제 5항에 있어서, 상기 프락토스-6-포스페이트는 프락토스 또는 프락토스 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것을 특징으로 하는 타가토스 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 방법은 타가토스 6-포스페이트에 파이테이즈를 작용시켜 타가토스로 전환하는 단계를 더욱 포함하는 타가토스 생산 방법.
서열번호 1 내지 4의 아미노산으로 이루어진 효소 중에서 선택된 하나의 효소인 프락토스 1,6-비스포스페이트 알돌레이즈의 돌연변이체 효소.
제 8항에 있어서, 상기 돌연변이체 효소는 서열번호 1로 이루어진 프락토스 알돌레이즈화 효소의 332번째 잔기, 314번째 잔기,227번째 잔기 및 62번째 잔기 중 하나 이상에서 치환된 돌연변이체이며, 여기서 상기 332번째 잔기는 아르기닌에서 글루타민으로 치환, 상기 314번째 잔기는 글루타민에서 알라닌으로 치환, 227번째 잔기는 히스티딘에서 알라닌으로 치환, 62번째 잔기는 세린에서 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 프락토스 알돌레이즈화 돌연변이체 효소.
제 9항의 돌연변이체를 코딩하는 유전자.