KR20160008575A - ＴＮＦＲ: Ｆｃ 융합 폴리펩티드에 대한 대체 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TNFR:Fc를 함유하는 폴리펩티드의 보관에 적절한 수성 안정한 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

ＴＮＦＲ: Ｆｃ 융합 폴리펩티드에 대한 대체 제제{ALTERNATIVE FORMULATIONS FOR TNFR: FC FUSION POLYPEPTIDES}

본 발명은 TNFR:Fc를 함유하는 폴리펩티드의 보관에 적절한 일부 선택된 아미노산이 없는 수성 안정한 약학적 조성물에 관한 것이다.

치료적 폴리펩티드 제제는 종종 사용전 보관된다. 그러나, 폴리펩티드는 연장된 시간 동안, 특히 아르기닌 등의 안정화제의 부재하에서 수성 형태로 보관될 경우 불안정하다. 수성 보관에 의존하는 대체법은 건조된 폴리펩티드의 재구성이 종종 응집 또는 변성을 초래하기는 하나, 폴리펩티드의 건조 동결건조된 형태를 생성하는 것이다. 폴리펩티드의 이러한 응집은 면역원성을 초래할 수 있어서 바람직하지 않다.

Fc 도메인에 융합된 TNF(종양 괴사 인자) 수용체(TNFR:Fc)의 시판중인 가용성 형태는 에타너셉트(etanercept)로서 공지되어 있다. 에타너셉트(상표명 엔브렐(ENBREL)^®)는 TNF 억제제로서 작용하여 종양 괴사 인자(TNF)를 방해한다. 사람 IgG1의 Fc 부분에 연결된 사람 75 kDa (p75) 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드-결합부로 이루어진 이량체 융합 폴리펩티드는 통상적으로 폴리펩티드의 응집을 방지하기 위하여 응집 억제제로서 L-아르기닌 및/또는 L-시스테인으로 제제화된다(EP1478394 B1 참조).

그럼에도 불구하고, 아르기닌은 일부 사람에서 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 구역, 위경련 또는 증가된 횟수의 변을 비롯한 위 불쾌감뿐 아니라, 아나필락시스로 불리우는 심각한 알러지 반응이 아르기닌 주사후 발생할 수 있다. 기타 잠재적 부작용으로는 저혈압 및, 고 칼륨, 고 염화물, 저 나트륨, 저 인산염, 고 혈중 우레아 질소 및 고 크레아티닌 레벨을 비롯한 혈중 각종 화학물질 및 전해질에서의 변화를 들 수 있다. 이론상, 아르기닌은 출혈의 위험성을 야기하며, 혈당 수치를 증가시키며, 칼륨 레벨을 증가시킬 수 있으며, 겸상 적혈구병의 증상을 악화시킬 수 있다.

시스테인은 비-필수 아미노산이며, 시스틴과 밀접하게 관련되어 있는데, 이는 시스틴이 함께 결합된 2개의 시스테인 분자로 이루어지기 때문이다. 이는 불안정한 영양소이며, 시스틴으로 쉽게 변환된다. 체내 지나치게 많은 시스틴은 시스틴 결정이 체내에 형성되어 방광 결석 또는 신장 결석을 생성할 수 있는 희귀 질환인 시스틴증을 야기할 수 있다. 또한, 당뇨병 및 시스틴뇨를 앓고 있는 사람은 시스테인 보충의 부작용을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다.

WO2013/006454에는 EP1478394 B1에 개시된 바와 유사한 조성으로 사용되는 아르기닌은 제공된 실시예에 의하면 140 mM(실시예 1 참조)인 염으로 대체되는 무-아르기닌 폴리펩티드-함유 조성물이 개시되어 있다. 고온에서의 안정화에 대하여서는 언급되지 않았다. 사실상, 이에 개시된 조성물은 2-8℃에서 또는 냉동시 액체로서 보관된다.

본 발명은 TNFR:Fc 폴리펩티드의 보관을 허용하는 신규한 안정한 액체 제제를 제공하여 이들 문제를 다룬다. 놀랍게도, 본 발명자들은 본원에 개시된 바와 같은 안정한 수성 조성물이 완전하게 아르기닌 및 시스테인 없이 생성될 수 있으며, 고온에서 매우 안정하다는 것을 관찰하였다.

발명의 개요

본 발명의 제1의 구체예

본 발명의 제1의 구체예는 사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드를 포함하는 수성 제제 중의 특정량의 염이 5℃ 초과의 고온에서 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있다는 발견에 기초한다. 게다가, 생리학적 체내 염 농도에 가깝도록 염 농도를 선택한다.

그러므로, 본 발명은

-사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;

-80 내지 130 mM의 농도로 존재하는 염; 및

-트레할로스 및 수크로스 또는 그의 조합의 군으로부터 선택된 부형제

를 포함하고, 조성물 중에 아르기닌도 시스테인도 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 수성 조성물에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 330 내지 310 ㎚ 사이의 형광비를 사용하여 발견된 오차 바아를 갖는 모든 샘플에 대하여 발견된 상대적 풀림(unfolding) 온도(T_개시/℃)를 나타내는 바아 차트를 도시한다.

도 2a 및 2b는 모든 제제에 대한 초기 시간에서의 pH 및 삼투압농도의 측정치의 막대 차트를 도시한다.

도 3a는 모든 시간(0 내지 14 일) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(-20℃/25℃) 및 3 일 진탕)에서 단백질 농도 측정치(280 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 3b는 제제 F3에 대한 6 개월 이하의 시간(0, 1, 3 및 6) 및 조건(-20℃, 2-8℃, 25℃, 1, 2 및 4회 냉동/해동(-20℃/25℃))에서의 단백질 농도 측정치(280 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 4a는 모든 시간(0 내지 14 일) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(-20℃/25℃) 및 3 일 진탕)에서 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 4ba는 제제 F3에 대하여 6 개월 이하의 시간(0, 1, 3 및 6개) 및 조건(-20℃, 2-8℃, 25℃, 1, 2 및 4회 냉동/해동(-20℃/25℃))에서 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 4bb는 이노베이터(Innovator)(t=0 및 3 개월 및 25℃에서)와 비교한 제제 F1, F5, F6 및 F8에 대한 3 개월 이하의 시간(0, 1 및 3) 및 조건(-20℃, 2-8℃, 25℃, 1, 2 및 4회 냉동/해동(-20℃/25℃))에서 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 5a는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼(Standards-Duke Scientific Count Cal)을 사용하여 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(-20℃/25℃) 및 3 일 진탕에서 측정한 F1, F2, F3 및 F4(1, 2, 3 및 4)에 대한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

도 5b는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃, 2-8℃, 25℃, 1 및 2회 냉동/해동(-20℃/25℃에서 1x 및 2x FzTh)에서 측정한 제제 F3에 대한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

도 5ca는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 -20℃ 및 2-8℃에서 t=0, 1 및 3 개월에서 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8 및, 또한 t=6 개월에서 F3에 대하여 측정한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

도 5cb는 F1, F3, F5, F6 및 F8에 대하여 25℃에서 및 -20℃/25℃에서 냉동/해동(1x, 2x, 4x(1, 2, 4))에 대하여 t=0, 1 및 3 개월에서 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8 및, t=6 개월에서 F3에 대하여 측정한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

도 6a는 모든 조건: 시간 0 및, -20℃, 25℃, 50℃에서 14 일, 3회 냉동/해동(-20℃/25℃) 및 3 일 진탕에서 배양한 쿠마시(Coomassie)로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다. (A)에서 F1 샘플, (B)에서 F2 샘플, (C)에서 F3 샘플 및 (D)에서 F4 샘플.

도 6ba는 모든 조건: -20℃, 2-8℃, 25℃에서 t=3 개월 배양, -20℃/25℃에서 2회 냉동/해동의 제제 F3에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6bb는 모든 조건: -20℃, 2-8℃, 25℃에서 t=6 개월 배양, -20℃/25℃에서 냉동/해동의 제제 F3에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6c는 t=0 및 -20℃/25℃ 조건에서 1회 냉동/해동 후 제제 F5, F6 및 F7 및 이노베이터(대조용)에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6d는 t=0 및 -20℃/25℃ 조건에서 1회 냉동/해동 후 제제 F8, F9 및 F1 및 이노베이터(대조용)에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6ea는 t=1 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F1 및 F5에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6eb는 t=3 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 및 -20℃/25℃ 조건에서 4 사이클 냉동/해동 후 제제 F1 및 F5에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6fa는 t=1 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 및 -0℃/25℃ 조건에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F6 및 F8에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 6fb는 t=3 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 4 사이클 냉동/해동 후 제제 F6 및 F8에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

도 7a-7d는 모든 조건: 모든 시점에서 -20℃(7A), 25℃(7B), 50℃(7C), 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(7D)에 대한 모든 제제에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7ea는 t=3 개월 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 2회 냉동/해동(2xFxTh)에 대한 제제 F3의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7eb는 t=6 개월 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 4회 냉동/해동(2xFxTh)에 대한 제제 F3의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7f는 t=0, 1, 3 및 6 개월 동안 25℃에서 제제 F3 및 t=3 개월 및 25℃에서 이노베이터의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7ga는 t=0에서의 이노베이터(대조용)와 비교한 t=0 및 3 개월 동안 25℃에서 제제 F3의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7gb는 t=0 및 3 개월 동안 25℃에서 제제 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7h는 t=0, 1 및 3 개월 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1 및 2회 냉동/해동(1x 및 2xFxTh)에서 제제 F3의 크기 배제 HPLC로 장기간 실험에 대한 결과 표를 제공한다.

도 7i는 t=0에서 제제 F1, F5, F6, F7, F8, F9 및 이노베이터(대조용)에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7j는 -20℃/25℃에서 1 사이클 냉동/해동 후 제제 F1, F5, F6, F7, F8, F9 및 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7ka는 t=1 개월 동안 -20℃에서 제제 F1, F5, F6, F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7kb는 t=3 개월 동안 -20℃에서 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7la는 t=1 개월 동안 2-8℃에서 제제 F1, F5, F6, F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7lb는 t=3 개월 동안 2-8℃에서 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7ma는 t=1 개월 동안 25℃에서 제제 F1, F5, F6, F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7mb는 t=3 개월 동안 25℃에서 제제 F1, F3, F5, F6, F8 및 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7na는 t=1 개월 동안 25℃에서 제제 F1, F5 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7nb는 t=3 개월 동안 25℃에서 제제 F1, F3, F5, F8 및 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7o는 t=1 개월 동안 25℃에서 제제 F1, F3, F5 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7p는 -20℃/25℃에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F1, F5, F6 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7q, 도 7r 및 도 7s는 조건: 제제 F3의 경우 6 개월 이하 및 제제 F1, F5, F6 및 F8의 경우 3개월 이하의 시점에서 -20℃(7q), 2-8℃(7r) 및 25℃(7s)에 대하여 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램의 그래프 요약을 도시한다. 피크 비율을 측정하였으며, (% 프리-피크, % 주요-피크 및 % 포스트-피크)로 제시하였다.

도 7t는 t=0에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1 및 2 사이클 냉동/해동(1x 및 2x FxTh) 후 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램의 그래프 요약을 도시한다. 피크 비율을 측정하고, (% 프리-피크, % 주요-피크 및 % 포스트-피크)로 나타냈다. 바아는 각각의 조건(즉 t=0, 1x FxTh 또는 2x FxTh)에 대하여 제제: F1, F3, F5, F6 및 F8의 기재된 순서로 나타낸다.

도 7u는 t=0, 1, 3 및 6 개월 동안 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 보관 조건에서 제제 F3에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램의 그래프 요약을 도시한다.

도 8a-8d는 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(8A), 25℃(8B), 50℃(8C), 3회 냉동/해동(-20℃/25℃) 및 3 일 진탕(8D)에 대하여 모든 제제에서 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함하는 그래프를 도시한다.

도 8e는 조건: 시간 0, 1, 3 및 6 개월에서 -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 -20℃/25℃에서 1x, 2x 및 4x 냉동/해동 후에 대하여 제제 F3에서의 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함하는 그래프를 도시한다. 데이타 표도 또한 도면의 옆에 제공한다.

도 8f는 3 개월 후 25℃에서 이노베이터와 비교한, -20℃, 2-8℃, 25℃에서 3 개월 후 및 -20℃/25℃에서 4x 냉동/해동 후 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8(및 F3은 또한 6 개월 후)에서의 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함한 그래프를 도시한다. 데이타 표도 또한 도면의 옆에 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은, 아르기닌 또는 시스테인 중 어느 것도 수성 조성물 중에 존재하지 않는 것을 특징으로 하며,

-사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;

- 80 내지 130 mM의 농도로 존재하는 염; 및

-트레할로스 및 수크로스 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 부형제를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 조성물은 유리 아미노산이 조성물 중에 존재하지 않는 것을 추가의 특징으로 한다. 예를 들면 조성물은 아르기닌, 시스테인, 프롤린, 글리신, 메티오닌, 히스티딘, 세린, 발린, 리신, 글루타메이트 중 어느 것도 포함하지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조성물" 또는 "조성물들"은 치료를 필요로 하는 개체에게 주사 및/또는 투여에 적절하도록 생성된 폴리펩티드를 포함하는 제제(들)를 지칭할 수 있다. "조성물"은 또한 "약학적 조성물"로서 지칭될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 실질적으로 무균 상태이며, 수용체에게 부당하게 독성 또는 전염성인 임의의 약물을 함유하지 않는다. 추가로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용액 또는 수성 조성물은 적절한 용매(예, 물 및/또는 기타 용매, 예를 들면 유기 용매) 또는 상호 혼화성 용매의 혼합물 중에 용해된 1종 이상의 화학 물질을 함유하는 유체(액체) 제제를 의미할 수 있다. 추가로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 제시된 수치±그 수치의 2%를 의미하며, 바람직하게는 용어 "약"은 정확하게 제시된 값(±0%)을 의미한다.

본 발명에 의한 조성물이 단독으로 또는 조성물에 첨가된 아르기닌 또는 시스테인(또는 바람직하게는 임의의 기타 아미노산, 예컨대 프롤린, 글리신, 메티오닌, 히스티딘, 세린, 발린, 리신, 글루타메이트)을 포함하지 않기는 하나, 폴리펩티드 그 자체는 그의 쇄에서 아르기닌 또는 시스테인(또는 임의의 기타 아미노산, 예컨대 프롤린, 글리신, 메티오닌, 히스티딘, 세린, 발린, 리신, 글루타메이트) 아미노산 잔기를 함유할 수 있다는 점에 유의한다.

특정한 실시양태에서, 발현된 Fc 도메인 함유 폴리펩티드는 임의의 표준 방법에 의하여 정제된다. Fc 도메인 함유 폴리펩티드가 세포내 생성될 경우, 미립자 부스러기는 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의하여 제거된다. 폴리펩티드가 배지에 분비될 때, 상기 발현 시스템으로부터의 상청액을 우선 표준 폴리펩티드 농축 필터를 사용하여 우선 농축시킬 수 있다. 프로테아제 억제제는 또한 단백질분해를 억제하기 위하여 첨가될 수 있으며, 항생제는 미생물의 성장을 방해하기 위하여 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인 함유 폴리펩티드는 예를 들면 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석 및 친화도 크로마토그래피 및/또는 공지되거나 또는 발견하고자 하는 정제 기법의 임의의 조합을 사용하여 정제한다. 예를 들면 단백질 A는 사람 감마 1, 감마 2 또는 감마 4 중쇄에 기초하는 Fc 도메인 함유 폴리펩티드를 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., 1983, J. Immunol . Meth. 62: 1-13).

이온-교환 컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로세트(SEPHAROSET)™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전을 비롯한 폴리펩티드 정제를 위한 기타 기법은 또한 필요에 따라 사용될 수 있다. 기타 폴리펩티드 정제 기법을 사용할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 염 농도는 80 내지 130 mM, 바람직하게는 90 내지 130 mM, 예컨대 105 내지 130 mM, 예컨대 약 90 mM, 100 mM 또는 125 mM이다. 바람직하게는, 염 농도(바람직하게는 NaCl)는 약 90 mM이다. 농도와는 상관 없이, 염화칼륨, 시트르산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 차아염소산나트륨, 질산나트륨, 황화수은, 크롬산나트륨 및 이산화마그네슘도 또한 사용할 수 있으나, 염은 바람직하게는 염화나트륨이다. 염 농도의 이와 같은 특정한 범위는 심지어 50℃까지의 고온에서 안정한 본 발명에 의한 조성물을 얻도록 한다. 게다가, 이러한 범위에서의 값은 종래 기술에서 사용된 값(예, 140 mM)보다 사람 체내에서의 생리학적 삼투압농도에 더 가까워서 예를 들면 피하 투여에 사용되는 더욱 적절한 조성물을 초래한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 분리된 폴리펩티드는 에타너셉트이다. 에타너셉트의 Fc 성분은 사람 IgG1의 일정 중쇄 1(CH1) 도메인이 아닌 일정 중쇄 2(CH2) 도메인, 일정 중쇄 3(CH3) 도메인 및 힌지 영역을 함유한다. 에타너셉트는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 포유동물 세포 발현계에서의 재조합 DNA 기법에 의하여 생성될 수 있다. 이는 934개의 아미노산으로 이루어지며, 약 150 킬로달톤의 겉보기 분자량을 갖는다(Physicians' Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

분리된 폴리펩티드의 농도는 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 20 내지 60 ㎎/㎖이며, 더 더욱 바람직하게는 농도는 약 25 ㎎/㎖ 또는 약 50 ㎎/㎖이다. 바람직하게는, 농도는 약 50 ㎎/㎖이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 부형제는 10 내지 80 ㎎/㎖, 바람직하게는 30 내지 65 ㎎/㎖의 농도, 더욱 바람직하게는 60 ㎎/㎖의 트레할로스의 농도에서, 트레할로스 이수화물의 형태인 트레할로스이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 부형제는 5 내지 80 ㎎/㎖의 농도의 수크로스이며, 바람직하게는 수크로스는 10 내지 40 ㎎/㎖ 범위내로 존재한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 수크로스의 농도는 10 ㎎/㎖이다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 수크로스의 농도는 34 ㎎/㎖이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 부형제는 수크로스 및 트레할로스 사이의 조합이며, 여기서 농도는 각각 5 내지 80 ㎎/㎖ 및 10 내지 80 ㎎/㎖ 범위내이다. 바람직하게는, 부형제는 약 34 ㎎/㎖ 농도의 수크로스이다. 더욱 바람직하게는, 부형제는 약 10 ㎎/㎖ 농도의 수크로스이다.

본 발명에 의한 조성물은 수성 완충제를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 수성 완충제는 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨, 말레산, 아세트산암모늄, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 아세테이트, 숙시네이트, 디에탄올아민, 히스티딘 또는 그의 조합이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 수성 완충제는 인산나트륨이다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 수성 완충제는 숙시네이트이다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 수성 완충제는 히스티딘이다. 조성물에 사용된 완충제와는 상관 없이 단독으로 또는 조합하여 그의 농도는 바람직하게는 15 mM 내지 100 mM 범위내이며, 바람직하게는 20 mM 내지 30 mM 범위내이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 농도는 바람직하게는 20 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 25 mM 내지 50 mM 범위내이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 농도는 22 mM 또는 약 25 mM이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 농도는 50 mM이다. 바람직한 완충제는 인산나트륨 및 숙시네이트 완충제이며, 약 22 mM 농도의 마지막 것(숙시네이트 완충제)이 가장 바람직한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 수성 완충제의 부재 또는 존재와는 상관 없이, 본 발명에 의한 조성물은 조성물 중에 이미 제공된 것(트레할로스 또는 수크로스) 이외에 1종 이상의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중의 1종 이상의 부형제의 농도는 약 0.001 내지 5 중량%이며, 기타 실시양태에서는 1종 이상의 부형제의 농도는 약 0.1 내지 2 중량%이다. 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 공지의 방법에 의하여 제조되며, 통상의 공급업자로부터 입수 가능하다. 바람직하게는, 상기 부형제는 락토스, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 글루코스, 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민(SA), 재조합 헤마글루티닌(HA), 덱스트란, 폴리비닐 알콜(PVA), 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 프롤린, L-세린, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신, 사르코신, γ-아미노부티르산, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 나트륨 도데실 술페이트(SDS), 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체, 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥시드, 베타인, 아연 이온, 구리 이온, 칼슘 이온, 망간 이온, 마그네슘 이온, 3-[(3-콜아미드프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판술페이트(CHAPS), 수크로스 모노라우레이트 또는 그의 조합이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 부형제는 폴리소르베이트 20이며, 더 더욱 바람직한 실시양태에서, 폴리소르베이트 20은 0.1% 농도로 존재한다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 부형제는 글리신이며, 더 더욱 바람직한 실시양태에서, 글리신은 0.5% 농도로 존재한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물의 pH는 pH 6.0 내지 pH 7.0이며, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8 및 6.9로부터 선택된 임의의 pH가 가능하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 6.3이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨 완충제, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 125 mM 염화나트륨을 포함하며, 조성물의 pH는 6.3이다.

또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨 완충제, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 100 mM 염화나트륨을 포함하며, 조성물의 pH는 6.3이다.

또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하며, 조성물의 pH는 약 pH 6.2이다.

추가의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨, 34 ㎎/㎖ 수크로스, 90 mM 염화나트륨을 포함하며, 조성물의 pH는 6.3이다.

추가의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 90 mM 염화나트륨, 0.5% 글리신을 포함하며, 조성물의 pH는 6.3이다.

추가의 특정한 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 22 mM 숙시네이트, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 90 mM 염화나트륨을 포함하며, 조성물의 pH는 6.3이다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 (에타너셉트로 이루어진 것을 제외한) 추가의 아미노산이 없다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 아르기닌, 시스테인, 리신, 프롤린, 글루타메이트, 세린 또는 메티오닌 중 어느 것도 포함하지 않는다.

본원에 개시된 조성물은 비경구, 예를 들면 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 윤활막내 및/또는 경막내 투여될 수 있다.

본 발명에 의한 조성물에 포함된 분리된 폴리펩티드의 치료 효과는 당업계에 공지되어 있으며, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 육아종증, 크론병, 만성 폐쇄성 폐 질환, C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 건선 또는 아토피 피부염 또는 기타 염증성 또는 자가면역-관련 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 것을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 조성물은 질환을 치료(증상의 완화, 진행의 중지 또는 서행화)하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하며, 그의 범주를 한정하는 것으로 간주하여서는 안된다.

실시예

조성물의 제조

하기 조성물은 하기를 단순 혼합하여 생성하였다:

공급원 물질:

62.5 ㎎/㎖의 에타너셉트, 1.2 ㎎/㎖ 트리스, 40 ㎎/㎖ 만니톨, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 7.4를 함유하는 공학적 실시 물질. -20℃에서 보관함.

다수의 엔브렐^® 시판 제제를 대조용 샘플로서 사용하였다(본원에서 "엔브렐" 또는 "이노베이터"로서 지칭함). 시판 엔브렐 제제는 50 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 25 mM 아르기닌, 100 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3을 함유하였다.

엔브렐^® 제제와 동일한 제제내의 에타너셉트를 내부 대조용(50.9 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 25 mM 아르기닌, 100 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3)으로서 사용하였다. 이러한 제제를 F1로 지칭하였다.

후보 제제:

F2: 수성 제제(49.4 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 100 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F3: 수성 제제(49.5 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 125 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F4: 수성 제제(50.9 ㎎/㎖ 에타너셉트, 50 mM 인산Na, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, pH 6.2, 0.1% 폴리소르베이트 20) 중의 에타너셉트

F5: 수성 제제(50.0 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 90 mM NaCl, 34 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F6: 수성 제제(50.0 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 90 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 0.5%(5 ㎎/㎖) 글리신, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F7: 수성 제제(50.0 ㎎/㎖ 에타너셉트, 28 mM 히스티딘/HCl, 90 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 6 ㎎/㎖ 글리신, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F8: 수성 제제(50.0 ㎎/㎖ 에타너셉트, 22 mM 숙시네이트, 90 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 중의 에타너셉트. 숙시네이트 완충제는 숙신산 22 mM을 사용하여 생성하였으며, NaOH를 첨가하여 pH를 6.3으로 조절하였다.

실시예 1

고유 단백질 형광 발광 스펙트럼 및 정적 광 산란

266 ㎚에서 여기된 고유 단백질 형광 발광 스펙트럼뿐 아니라, 266 및 473 ㎚ 모두에서의 정적 광 산란 데이타를 수득하였다. 각각의 샘플을 마이크로-큐벳 어레이(MCA)에 로딩하고, 옵팀(Optim) 1000에 놓아서 콜로이드성 및 형태 안정성에서의 차이를 규명하였다. 본 실험에서, 온도 경사 실험에 대한 온도는 15로부터 95℃까지 1℃ 단계로 증가시켰으며, 샘플을 각각의 온도에서 60 초 동안 유지하여 열 평형되도록 하였다. 등온 실험에서, 온도를 62℃에서 유지하고, 샘플을 측정 사이의 60 초 유지로 200회 반복하여 측정하였다.

266 및 473 ㎚ 레이저 소스로 샘플을 조사하는 동안의 시간을 노출 시간으로 지칭한다. 노출 시간의 선택은 다수의 인자, 예컨대 형광 방출이 얼마나 강한지 및 샘플이 얼마나 민감하게 광퇴색되는지 등에 의존한다. 이들 샘플 모두의 경우에서 1초의 노출 시간을 사용하였다.

노출 시간이 변동됨에 따라 검출기에 투입되는 광의 양을 제어하는 물리적 슬릿의 크기를 변경시킬 수 있다. 이러한 개구의 크기를 증가시키는 것은 측정된 형광 신호를 증가시키지만, 기기의 분광 해상도를 감소시킨다.

옵팀 1000에 의하여 수행된 분석은 2종의 순차 레벨인 1차 및 2차를 포함한다. 옵팀 1000 소프트웨어는 자동화된 1차 및 2차 분석을 제공한다. 임의의 자동화 데이타 핏팅 소프트웨어를 사용함에 따라, 자동화 기능이 신뢰성이 있는 결과로 돌아가도록 입력 데이타가 우수한 품질을 갖는 것을 보장하도록 세심한 주의를 기울려야 한다.

1차 분석은 미가공 형광 방출 및 광 산란 데이타로부터의 분광 파라미터를 추출한다:

·옵팀은 과학 문헌에 보다 통상적으로 사용되는 예상 파장(또한 무게중심 수단으로 지칭함) 등의 1차 레벨 정보를 제공하는 수학 함수를 사용할 수 있다. 이는 평균 발광 파장(또는 질량의 중심)을 보며, 분광 데이타에서 임의의 노이즈를 제거하는 우수한 접근법이다.

·산란광 강도는 260 및 270 ㎚ 사이의 적분된 강도로부터 계산한다(레일리 산란된 UV 여기 광). 산란 효율은 파장에 대한 의존성이 커서 짧을수록 용액 중의 분자에 의하여 광이 더 많이 효율적으로 산란된다. 266 ㎚ 레이저의 산란은 평균 분자 질량에서의 작은 변화에 대한 매우 민감한 프로브가 된다.

이러한 실험에서, 350 내지 330 ㎚의 형광 강도의 비를 사용하여 항체의 열적 풀림을 실험하며, 266 ㎚ 및 473 ㎚ 레이저로부터의 산란광 강도는 열 유도된 샘플 응집을 측정하는데 사용하였다.

2차 분석은 1차 분석으로부터의 파라미터를 취하며, 이들이 존재한다면 샘플의 용융 온도 "T_m" 및 응집 개시 온도 "T_응집"를 구한다. 용융 온도는 온도에 대하여 플롯한 1차 데이타에서의 변곡점으로서 구한다.

응집 온도의 개시는 산란광 강도가 데이타에서의 노이즈에 대한 역치값보다 높게 증가되는 온도로서 측정한다. 측정된 최저 온도로부터, 측정된 각각의 산란된 강도 값은 모든 사전 측정된 값의 데이타세트에 가한다. 각각의 시점에서, 분석이 진행됨에 따라, 선형 핏을 적용하며, 핏의 우수성이 결정된다. 데이타가 직선으로부터 상당하게 벗어날 경우(데이타에서의 노이즈에 의하여 유의성이 측정될 경우), 이는 응집 개시 온도로 정의한다. 그렇지 않을 경우, 데이타세트에서 그 다음의 시점으로 알고리즘이 진행되며, 다시 한번 이러한 일탈에 대하여 테스트한다. 이러한 방법은 각종 단백질 및 조건에 대하여 테스트하였으며, 강하였다. 커다란 응집물이 형성되어 침전되는 극한의 상황에서, 현탁액 중의 입자가 입사 레이저의 초점 부피를 떠나면 광 산란 신호는 실제로 감소될 수 있다. 그러나, 초기 개시는 이후에 발생되는 임의의 침전에도 불구하고 재현 가능하게 검출된다.

모든 정적 광 산란 데이타의 경우, 샘플이 용액으로부터 침전되는 것으로 보이는지의 여부와는 상관 없이 모든 시점이 포함되었다. 상이한 반복된 실험에서 동일한 샘플은 때때로 침전될 것이며, 때때로 그렇지 않을 것이지만, 각각의 경우에서 응집 과정의 출발은 재현 가능하다.

결론

모든 샘플 사이에서의 T_응집 및 T_개시 데이타 모두는 매우 유사한 것으로 밝혀졌다.

·F1 완충제에서, 생성물은 63.7±0.3℃의 형광의 T_개시 및 66.8±0.3℃의 T_응집를 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F2 완충제에서, 생성물은 63.2±0.1℃의 형광의 T_개시 및 65.9±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F3 완충제에서, 생성물은 63.4±0.3℃의 형광의 T_개시 및 65.6±0.4℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F4 완충제에서, 생성물은 63.3±0.1℃의 형광의 T_개시 및 64.8±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F5 완충제에서, 생성물은 64.5±0.4℃의 형광의 T_개시 및 63.0±0.6℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F6 완충제에서, 생성물은 63.9±0.5℃의 형광의 T_개시 및 65.4±0.2℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F7 완충제에서, 생성물은 61.0±0.7℃의 형광의 T_개시 및 63.6±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F8 완충제에서, 생성물은 64.0±0.0℃의 형광의 T_개시 및 66.2±0.8℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·엔브렐 이노베이터 그 자체는 63.4±0.1℃의 형광의 T_개시 및 65.6±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 데이타는 모든 샘플 사이에서 콜로이드성 및 형태 안정성 모두가 높은 정도의 유사성을 나타낸다.

도 1은 F5>F8>F6>F1>엔브렐>F7의 경향을 갖는 제제 F1, F5, F6, F7, F8 및 이노베이터(대조용)에 대한 결과를 도시한다.

온도 경사 실험을 수행한 후, 등온 실험을 수행하였다. 온도 경사 결과의 분석 및 보고 후, 모든 샘플은 약 64℃의 T_응집 값을 가지며, 그리하여 62℃의 온도는 등온 실험에 대하여 T_응집 바로 아래이지만, 샘플이 타당한 기간 이내에 형태 및 콜로이드성 변화를 겪기에 충분히 근접하도록 선택되는 것으로 보인다.

형광에 대하여 밝혀진 T_개시 값은 63.2 내지 63.7℃이었으며, 평균 63.4℃ 및 비교적 낮은 표준 편차 0.3℃이었으며, 이는 5종의 샘플(F1 내지 F4 및 엔브렐-액체 제제) 사이의 높은 정도의 비교 가능성을 나타낸다.

모든 샘플의 안정성은 여전히 꽤 비교 가능한 것으로 고려될 수 있다.

실시예 2

짧은 응력 안정성 실험

접근법

짧은 기간(2주) 안정성 실험을 실시하여 장기간의 수행 이전에 가능한 제제를 평가하였다. 게다가, 장기간 안정성은 F3 제제의 경우 6 개월 이하, F5, F6 및 F8 제제의 경우 3 개월 이하로 수행하였다.

9종의 제제를 테스트하였다:

t=0, 3, 7 및 14 일에서의 각각의 제제의 안정성은, 진탕 및 냉동-해동 응력 이외에, 2개의 상승된 온도(25℃ 및 50℃) 및 1개의 실시간 온도에 노출 후 평가하였다.

F3 제제의 경우, 안정성은 -20℃ 냉동/25℃ 해동으로 처리하는 1, 2 및 4회의 냉동-해동 사이클을 사용한 냉동-해동 응력 이외에, 시점 0, 1, 3 및 6 개월로 3개의 온도(2-8℃, -20℃ 및 25℃)에 노출시킨 후 평가하였다.

F5, F6 및 F8 제제의 경우, 안정성은 또한 -20℃ 냉동/25℃ 해동으로 처리하는 1, 2 및 4회의 냉동-해동 사이클을 사용한 냉동-해동 응력 이외에, 시점 0, 1 및 3 개월로 3개의 온도(2-8℃, -20℃ 및 25℃)에 노출시킨 후 평가하였다.

8개의 분석 검정의 패널을 사용하여 각각의 제제의 안정성을 평가하였다.

·pH(t=0 단독)

·삼투압농도(t=0 단독)

·단백질 농도(A280 ㎚)

·혼탁도(A330 ㎚)

·HIAC

·환원 SDS-PAGE(쿠마시 블루 염색)

·크기 배제-HPLC(SE-HPLC)

·세포에 기초한 효능

pH 및 삼투압농도

도 2A 및 도 2B는 초기 시간에서 pH 및 삼투압농도의 측정치의 막대 차트를 도시한다. 모든 제제에 대하여 측정된 이들 값은 각각의 조건에서 샘플을 설정하기 이전에 목표 pH 또는 이론치 삼투압농도 값의 범위내에 포함되었다.

단백질 농도/A280

도 3A는 모든 시간(0 내지 14 일)에서의 단백질 농도 측정치(280 ㎚에서의 흡광도) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(3x FzTh) 및 3 일 진탕)을 도시한다. 얻은 데이타는 모든 시점 및 조건에서 모든 샘플에 대하여 검정의 변동성 이내에 및 목표값의 범위내에 남아 있었다.

도 3B는 시간 0, 1, 3 및 6 개월 및 조건(-20℃, 2-8℃, 25℃, 1, 2 및 4회 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FzTh))에서 제제 F3에 대한 단백질 농도 측정치(280 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다. 목표(50 ㎎/㎖)로부터의 단백질 농도에서의 약간의 증가가 관찰되었으나, 3 개월 이내에 모든 조건에 대하여 검정 변동성 이내에 여전히 남아 있었다. 상기 도 3B를 구성하는 데이타를 하기 표에 제공한다.

하기 표는 t=0 및 t=3 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 및 -20℃/25℃에서 4 사이클 냉동-해동 후 제제 F1, F5, F6, F8 및 이노베이터(대조용, 단지 25℃ t=0 및 t=3)에 대하여 얻은 데이타를 요약한다. 단백질 농도는 모든 제제에 대하여 목표치(50 ㎎/㎖)이거나 또는 이에 근접한다.

시간=3 개월에서 제제 F5, F6 및 F8에 대한 단백질 농도 측정값(280 ㎚에서의 흡광도)은 F1 이외에, 모든 조건(도면에 도시하지 않음)에서 이들 제제 모두에 대한 목표값에 남아 있다.

혼탁도/A330

도 4A는 모든 시점(0 내지 14 일) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(3x FzTh) 및 3 일 진탕)에서의 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다. 결과에 의하면, 혼탁도에서의 상당한 증가가 50℃ 조건에서 검출되었으며, F3은 시간 경과에 따라 최저의 증가를 나타냈다. 어떠한 제제에서도 -20℃, 25℃, 냉동-해동 또는 진탕에서 유의적 변화가 관찰되지 않았다.

도 4ba는 시간 t=0, 1 및 3 개월 및 조건(-20℃, 2-8℃, 25℃, 1회 냉동/해동(1x 및 2x FzTh(-20/25℃))에서 제제 F3에 대하여 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다. 도 4ba에서 알 수 있는 바와 같이, 25℃에서 3 개월 보관으로 처리한 샘플에 대하여 혼탁도에서의 약간의 증가가 관찰되었다. -20℃, 2-8℃에서 보관하고, 2회 냉동-해동 사이클로 처리한 샘플에 대하여 3 개월 후에는 변화가 관찰되지 않았다. 상기 도 4ba를 구성하는 데이타를 하기 표에 제공한다:

하기 표는 t=0 및 t=3 개월에서 및 -20℃/25℃에서의 1, 2 및 4 사이클 냉동-해동 후의 제제 F1, F5, F6, F7, F8, F9 및, t=0 및 25℃에서의 이노베이터(대조용)에 대하여 얻은 데이타를 요약한다. 제제 F1, F5 및 F8은 혼탁도에서 주요 변화가 나타나지 않았다. F6은 25℃에서 보관시 혼탁도에서의 최고의 변동을 나타냈다.

상기에서 언급한 바와 같이, t=0과 비교하여 1 또는 3 개월 후 모든 조건에서 제제 F5, F8 또는 F1에 대하여서는 혼탁도에서의 상당한 추가의 증가가 관찰되지 않았다(도 4bb).

HIAC (액체 입자 계수기)

방법:

HIAC 9703 액체 입자 계수 시스템을 실험에 사용하였다. HIAC는 샘플러, 입자 계수기 및 로이코(Royco) 센서로 이루어진다. 로이코 센서는 2 ㎛ 내지 100 ㎛의 입자를 사이징 및 계수할 수 있다. 이러한 기기는 입자≤10,000 계수/㎖를 계수할 수 있다.

·샘플 부피(㎖): 0.2

·유속 ㎖/min: 10

·실시 개수(샘플당): 4(첫번째 실시는 버림)

절차:

·처음, 샘플을 희석하지 않고 분석하였으나, 샘플의 높은 점도로 인하여, 보다 정확한 결과를 얻기 위하여 희석하여야만 하는 것으로 결정되었다.

·샘플은 1 시간 동안 실온이 되게 하였다.

·샘플을 적절한 제제 완충제 중에서 1:3으로 희석하고, 탈기시키고(1.5 hr), 조심스럽게 혼합한 후 측정하였다.

·스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼: 시스템 적합성 체크는 EZY-Cal 5 ㎛ 및 15 ㎛ 입자 크기 제어 기준으로 수행하였다. 대조용 표준물질은 센서의 해상도를 확인하기 위하여 초반에 분석한다.

도 5A는 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(3x FzTh) 및 3 일 진탕에서 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 측정한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

도 5A에서 알 수 있는 바와 같이, 보이지 않는 입자 계수에서의 상당한 증가는 F1, F2 및 F4에 대하여 50℃ 조건에서 측정하였으며, F2는 7일 정도로 이르게 최고의 증가를 나타냈다.

-20℃, 25℃, 3x FzTh에서 또는 3d RT 진탕 후 어떠한 제제에서도 상당한 변화가 관찰되지 않았다. F3 제제는 모든 조건 및 시점에서 보관후 t=0 대조용에 비하여 보이지 않는 입자에서 변화가 나타나지 않았다.

도 5B는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃, 2-8℃, 25℃에서, 1 및 2회 냉동/해동(-20℃/25℃에서의 1x 및 2x FzTh)에서 측정한 제제 F3에 대하여 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다. 도 5B에서 알 수 있는 바와 같이, 3 개월에서 25℃ 조건에 대하여 육안으로 보이지 않는 입자 계수에서의 약간의 추가의 증거가 관찰된다. -20℃ 조건은 3 개월까지 육안으로 보이지 않는 입자에서 최대 증가가 나타났다. t=0으로부터 2-8℃ 시점에 대하여 3 개월 후 또는 2 사이클 냉동-해동 후 변화가 관찰되지 않았다. 1 개월로부터 육안으로 보이지 않는 입자 계수에서 -20℃ 조건에서 약간의 추가의 증가가 관찰된다.

상기 도 5B를 구성하는 데이타는 하기 표에 제공한다:

도 5C(1 및 2)는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃, 2-8℃에서(도 5ca), 25℃, 1, 2, 3 및 4회 냉동/해동(-20℃/25℃에서 1x, 2x, 3x 및 4x FzTh)(도 5cb)에서 측정한 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8에 대하여 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

상기 도 5ca을 구성하는 데이타는 하기 표에 제공한다:

도 5cb는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 t=0, t=1 개월 및 t=3 개월에서 및 -20℃/25℃에서 1, 2 및 4회 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FzTh)에서 제제 F1, F5, F6 및 F8에 대하여 측정한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석를 도시한다.

도 5cb를 구성하는 데이타는 하기 표에 제공한다:

도 5C에서 알 수 있는 바와 같이, t=0으로부터 2-8℃ 시점에 대하여 3 개월 후 F1, F3, F5, F6 및 F8에 대하여 육안으로 보이지 않는 입자 계수에서의 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 게다가, F1 및 F6은 25℃에서 유사하게 수행하여 3 개월 이하의 시간에 걸쳐 육안으로 보이지 않는 입자가 증가되었다. 시간 경과에 대하여 25℃에서 F8에서 상당한 변화가 없었으며, 이는 이러한 제제의 안정성을 나타낸다. 25℃에서 3 개월 후 대조용 샘플(이노베이터 생성물)에 대하여서는 육안으로 보이지 않는 입자 계수에서의 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 이노베이터 생성물은 F1, F3, F5, F6 및 F8과 비교하여 시간 경과에 대하여 최고의 입자 계수를 나타냈다.

SDS-PAGE

도 6A는 시간 0 및 14 일에서 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕에서 배양한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다. (A)에서 F1 샘플, (B)에서 F2 샘플, (C)에서 F3 샘플 및 (D)에서 F4 샘플.

모든 제제에서 50℃ 조건에 대하여 모든 시점에서 상당한 변화가 관찰되었으며, 14 일차 샘플은 존재하는 추가의 HMW 밴드(>~250 kDa) 및 저 분자량(LMW) 분해 종(<50 kDa)에 의하여 입증되는 바와 같이 유사하게 공유-변형된 고 분자량(HMW) 종을 나타내며, 이는 50℃에서 모든 제제에 대하여 3 일 정도로 이르게 존재한다.

기준 표준물질과 비교하여 모든 기타 조건 및 시점에 대하여 어떠한 제제에서도 변화가 관찰되지 않았다.

도 6ba은 모든 조건: -20℃, 2-8℃, 25℃, -20℃/25℃에서 2회 냉동/해동에서 배양한 t=3 개월에서 제제 F3에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

~100 kDa 및 ~140 kDa에서의 추가의 밴드의 출현 및 ~50 kDa 및 ~30 kDa에서의 LMW(저 분자량) 분해 밴드의 강도 증가와 함께 25℃에서 3 개월 후 변화가 관찰되었다.

~30 kDa 및 ~50 kDa 밴드의 흑화와 함께 2 사이클 냉동-해동(-20℃/25℃) 후 변화가 관찰되었다.

도 6bb는 모든 조건: -20℃, 2-8℃, 25℃, -20℃/25℃에서 4회 냉동/해동에서 배양한 t=6 개월에서의 제제 F3에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

~100 kDa에서의 추가의 밴드의 출현 및 ~50 kDa 및 ~30 kDa에서의 LMW 분해 밴드의 강도에서의 증가와 함께 25℃에서 6 개월 후 F3에 대하여 변화가 관찰되었다.

도 6C는 t=0에서 및 -20℃/25℃에서 1회 냉동/해동 후 제제 F5, F6 및 F7 및 이노베이터(대조용)에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

t=0에서의 제제 F5, F6, F7 및 이노베이터(대조용)는 기준 표준물질과 유사하다.

-20℃/25℃에서 1 사이클 냉동-해동 후 제제 F5, F6, F7은 기준 표준물질과 유사하다.

도 6D는 t=0에서 및 -20℃/25℃에서 1회 냉동/해동 후 제제 F8, F9 및 F1 및 이노베이터(대조용)에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

t=0에서 및 -20℃/25℃에서 1 사이클 냉동-해동 후 제제 F8, F9, F1은 기준 표준물질과 유사하다.

도 6ea은 t=1 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F1 및 F5에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

모든 조건에서 1 개월 시점에서의 제제 F1 및 F5는 기준 표준물질과 유사하다.

제제 F5에 대한 추가의 ~100 kDa 밴드의 약간의 증거는 25℃에서 1 개월 후 나타난다.

도 6eb는 t=3 개월에서 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 및, -20℃/25℃ 조건에서 4 사이클 냉동/해동 후 제제 F1 및 F5에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

25℃에서 3 개월 후 F1에 비하여 25℃에서 3 개월 후 F5에 대하여 ~100 kDa, ~50 kDa 및 ~30 kD에서의 매우 희미한 밴드의 출현의 약한 증거는 또한 이들 추가의 밴드를 입증한다.

도 6fa은 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 t=1 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F6 및 F8에 대하여 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

-20℃/25℃에서 2 사이클 냉동/해동을 비롯한 1 개월 후 -20℃ 및 2-8℃에서 제제 F6 및 F8은 기준 표준물질과 유사한 것으로 나타났다.

25℃에서 1 개월 후 제제 F6은 주요 밴드의 거의 완전한 소실, 수개의 추가의 저분자량 분해 밴드가 뚜렷한 것을 입증한다.

도 6fb는 -20℃, 2-8℃ 및 25℃에서 t=3 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F6 및 F8에 대한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

150 kD 밴드의 소실 및 수개의 LMW 분해 밴드의 출현으로 25℃에서 3 개월 후 상당한 변화가 F6에서 관찰된다. ~50 kDa 및 ~30kD에서 매우 희미한 밴드 출현의 약한 증거만이 F6 및 F8 모두에 대하여 나타난다.

SE HPLC(크기 배제 HPLC )

조건:

·컬럼: TSKGel SuperSW3000 4.6x300 ㎜, 4 ㎛(토소(Tosoh), 18675) CV=2.5 ㎖

·컬럼 온도: 25℃

·이동상: 0.2 M 인삼염 완충제, pH 6.8

·유속: 0.35 ㎖/min

·실시시간: 20 min

·샘플 로드: 37.6 ㎍

·자동 샘플러 온도: 4℃

도 7은 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(7A), 25℃(7B), 50℃(7C), 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(7D)에 대하여 모든 제제의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다. 피크 비율을 측정하였으며, 표로 나타낸다.

모든 시점에서 50℃ 조건에 대하여 모든 제제에서 상당한 변화가 관찰되었으며, F2는 3 일 정도로 이르게 프리-피크 응집에서 급격한 증가(각각 26.3% 및 22.7%)로 전체적으로 최악으로 수행되었다. F1 및 F3은 50℃에서 3 일 후 프리-피크 응집에서 비교적 보다 중간 정도로 증가(각각 11.9% 및 9.3%)되지만, 14 일 후, 4종의 제제 모두에 대하여 >50% 프리-피크 응집으로 증가된 것으로 입증되었다.

25℃ 조건은 또한 7 일 후 % 주요 피크 면적 및 % 프리-피크 모두에서 모든 제제에 대하여 약간의 변화를 초래하며, 이는 추가로 14 일에 증가되며, F4는 프리-피크 응집에서 최고의 증가(0.5%)를 나타내며, F3은 이러한 조건에서 응집 전체에서 최저 증가를 나타냈다.

-20℃에서 14 일 이하 동안 진탕 및 냉동-해동 또는 보관의 조건에 노출시 어떠한 제제에서도 상당한 변화가 관찰되지 않았다.

도 7ea은 t=3 개월 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 2회 냉동/해동(2xFxTh)에 대한 제제 F3에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다

모든 기타 조건과 비교하여 3 개월 동안 25℃에 노출된 이러한 제제에 대하여 상당한 프리-피크 응집 및 포스트-피크 저하가 관찰된다.

도 7eb는 t=6 개월 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 4회 냉동/해동(4xFxTh)에 대한 제제 F3에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

6 개월 후 모든 기타 조건 및 4 사이클의 냉동-해동 후와 비교하여 6 개월 동안 25℃에 노출된 이러한 제제에 대하여 상당한 프리-피크 응집 및 포스트-피크 저하가 관찰된다.

도 7F는 t=0, 1, 3 및 6 개월 동안 25℃에서 제제 F3 및 3 개월 후 25℃에서제제 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다

제제 F3은 1 및 3 개월 시점과 비교하여 프리-피크 응집 및 포스트-피크 응집에서의 추가의 증가가 나타낸다.

25℃에서 3 개월 동안의 이노베이터는 6 개월에서 25℃를 포함한, 테스트한 모든 기타 조건에서 F3과 비교하여 전체적으로 최고 % 프리-피크를 나타낸다.

도 7ga은 t=0에서 이노베이터(대조용)와 비교하여 25℃에서 t=0 및 3 개월동안 제제 F3의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

t=0에서의 이노베이터(대조용)는 전체적으로 상당히 더 높은 프리-피크 응집을 나타내지만, 25℃에서 3 개월 후 F3보다 포스트-피크 저하가 더 적다.

도 7G(2)gb는 25℃에서 t=0 및 3 개월에서 제제 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

프리-피크 응집 및 포스트-피크 저하 모두에서의 증가는 t=0에서의 이노베이터와 비교하여 이노베이터에 대하여 25℃에서 3 개월 후 관찰되었다.

도 7H는 t=0 동안 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1 및 2회 냉동/해동(1x 및 2xFxTh)에 대하여 제제 F3의 크기 배제 HPLC를 사용한 더 긴 시간의 실험에 대한 결과 표를 제공한다.

제제 F3은 프리-피크 응집에서의 상당한 추가의 증가(25℃에서 t=1 개월로부터 0.9%) 및 포스트-피크 저하에서의 약한 추가의 증가(1 개월로부터 LMW-1 피크에서의 0.1% 추가의 증가)를 나타낸다.

도 7I는 t=0에서 제제 F1, F5, F6, F7, F8, F9 및 이노베이터(대조용)의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

이들 제제 모두는 t=0에서 비슷한 크로마토그래피 프로파일을 제시한다.

t=0에서의 제제 F9는 F1, F6, F6, F7 및 F8보다 약간 더 높은 프리-피크를 제시한다.

t=0에서 이노베이터(대조용)는 t=0에서의 F1, F5, F6, F7, F8 및 F9와 비교하여 상당히 더 높은 % 프리- 및 포스트-피크 둘다를 제시한다.

도 7J는 -20℃/25℃에서 1 사이클 냉동/해동 후 제제 F1, F5, F6, F7, F8 및 F9에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

제제 F1, F5, F6, F7 및 F8은 1 사이클 냉동-해동 후 비슷하며, F9는 약간 더 높은 % 프리-피크를 나타낸다(그러나, t=0으로부터 추가의 증가는 없음).

하기 표는 t=0에 대한 제제 F1, F5, F6, F7, F8 및 F9 및 이노베이터(대조용)에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1 사이클 냉동/해동(1x FxTh) 후 크기 배제 HPLC를 사용한 더 긴 기간의 실험에 대한 결과를 제공한다.

대조용(이노베이터)은 t=0에서의 F1, F5, F6, F7, F8 및 F9와 비교하여 최고 % 프리-피크 응집을 나타낸다.

도 7ka는 -20℃에서 t=1 개월 동안의 제제 F1, F5, F6, F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

-20℃ 보관 조건에서 1 개월 후 제제 사이에는 큰 차이가 나타나지 않는다. 제제 F5의 경우 약간 더 적은 포스트 피크만이 관찰된다.

도 7kb는 -20℃에서 t=3 개월 동안 제제 F1, F3, F5, F6, F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

-20℃ 보관 조건에서 3 개월 후 F1, F5, F6 및 F8의 경우 제제 사이에는 큰 차이가 나타나지 않는다. 모든 기타 제제와 비교하여 -20℃에서 3 개월 후 F3의 경우 더 높은 프리- 및 포스트-피크가 관찰되었다.

도 7la는 2-8℃에서 t=1 개월 동안 제제 F1, F5, F6, F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

2-8℃ 보관 조건에서 1 개월 후 제제 사이에는 큰 차이가 나타나지 않는다. 제제 F5의 경우 약간 더 적은 포스트 피크가 관찰된다.

도 7lb는 2-8℃에서 t=3 개월 동안 제제 F1, F3, F5, F6, F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

2-8℃ 보관 조건에서 3 개월 후 제제 사이에는 큰 차이가 나타나지 않는다. 모든 기타 제제와 비교하면 2-8℃에서 3 개월 후 F3의 경우 더 높은 프리- 및 포스트-피크가 관찰되었다.

도 7ma는 t=1 개월 동안 25℃에서 제제 F1, F5, F6, F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

25℃ 조건에서 1 개월 후 F6에서는 급격한 변화가 관찰되며, 주요 피크의 완전 소실이 포스트 피크 저하를 초래한다. 25℃에서 1 개월 후 모든 기타 제제(F1, F5, F8)에서는 큰 차이가 관찰되지 않는다.

도 7mb는 25℃에서 t=3 개월에 대한 제제 F1, F3, F5, F6, F8 및 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

25℃ 보관 조건에서 3 개월 후 제제 F1, F3, F5, F6, F8 사이에는 큰 차이가 나타나지 않으며, F5의 경우 약간 적은 포스트 피크가 관찰된다. 이노베이터는 25℃에서 3 개월 후 F3에 대한 최고의 프리- 및 포스트-피크를 나타낸다. F6은 주요 피크의 완전 소실과 함께 프로파일에서의 급격한 변화를 나타낸다.

도 7na는 25℃에서 t=1 개월 동안 제제 F1, F5 및 F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

도 7nb는 25℃에서 t=3 개월 동안 제제 F1, F3, F5, F8 및 이노베이터의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

25℃ 보관 조건에서 3 개월 후 F1, F3, F5 및 F8 제제 사이에는 큰 차이가 없다. 이노베이터는 모든 기타 제제와 비교하여 커다란 프리-피크 응집 및 포스트-피크 저하를 나타낸다.

도 7O는 25℃에서 t=1 개월 동안 제제 F1, F3, F5 및 F8에서의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 나타낸다.

제제 F3은 25℃에서 1 개월 후 최고의 % 프리-피크 응집을 나타낸다.

도 7P는 -20℃/25℃에서 2 사이클 냉동/해동 후 제제 F1, F5, F6 및 F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다.

-20℃/25℃에서의 냉동-해동 2 사이클 후 제제 사이에는 큰 차이가 나타나지 않는다. 제제 F5의 경우 약간 적은 포스트 피크만이 관찰된다.

하기 표는 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 보관 조건에서 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서의 1, 2 및 4 사이클 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FxTh) 후 제제 F1의 크기 배제 HPLC을 사용한 장기간 실험에 대한 결과를 제공한다.

하기 표는 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 보관 조건에서 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1, 2 및 4 사이클 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FxTh) 후 제제 F5의 크기 배제 HPLC를 사용한 장기간 실험에 대한 결과를 제공한다.

하기 표는 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 보관 조건에서 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1, 2 및 4 사이클 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FxTh) 후 제제 F6의 크기 배제 HPLC를 사용한 장기간 실험에 대한 결과를 제공한다.

하기 표는 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 보관 조건에서 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1, 2 및 4 사이클 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FxTh) 후 제제 F8의 크기 배제 HPLC를 사용한 장기간 실험에 대한 결과를 제공한다.

도 7Q, 7R 및 7S는 제제 F3의 경우 6 개월 이하의 시점에서 및 제제 F1, F5, F6 및 F8의 경우 3 개월 이하의 시점에서 조건: -20℃(도 7Q), 2-8℃(7R) 및 25℃(7S)에 대하여 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램의 그래프 요약을 도시한다. 피크 비율을 측정하고, (% 프리-피크, % 주요-피크 및 % 포스트-피크)로 나타냈다.

도 7T는 t=0에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1 및 2 사이클 냉동/해동(1x 및 2x FxTh) 후 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램의 그래프 요약을 도시한다. 피크 비율을 측정하고, (% 프리-피크, % 주요-피크 및 % 포스트-피크)로 나타냈다. 막대는 각각의 조건(즉 t=0, 1x FxTh 또는 2x FxTh)에 대하여 제제: F1, F3, F5, F6 및 F8의 기재된 순서로 나타낸다.

하기 표는 25℃ 보관 조건에서 t=0에 대한 제제 이노베이터에서의 크기 배제 HPLC를 사용한 장기간 실험에 대한 결과를 제공한다.

하기 표는 -20℃, 2-8℃ 및 25℃ 보관 조건에서 t=0, 1 및 3 개월에서 및 -20℃/25℃ 조건에서 1, 2 및 4 사이클 냉동/해동(1x, 2x 및 4x FxTh) 후 제제 F3의 크기 배제 HPLC를 사용한 장기간 실험에 대한 결과를 제공한다.

결과를 도 7U에 제시한다. F3은 6 개월에서의 프리-피크 응집의 커다란 추가의 증가(25℃에서 t=3 개월로부터 1.1% 증가) 및 포스트-피크 저하에서의 약간의 추가의 증가(3 개월로부터 포스트-피크에서의 2.1% 추가의 증가)를 도시한다.

세포에 기초한 효능 검정

접근법:

-더 짧은 시점(0, 3, 7 및 14 일 )의 경우

·샘플을 2개의 배취(t=0 및 t=3 일(d) 후 및 t=7 및 t=14d 시점 후)로 테스트하였다.

·대조용 샘플을 각각 6일 시험일에 테스트한 것을 제외하고, 모든 샘플을 1명의 분석자가 1회 생물학적 검정으로 테스트하였다.

·A280 ㎚에서의 흡광도 측정은 1차 희석 및 차후의 샘플 희석의 정확한 농도를 구하기 위하여 실시하였다.

·전체 검정 수행은 허용 가능하였다. (53개의 플레이트로부터) 106개의 반응 곡선 중 3개는 1개의 웰이 2종 이하의 상이한 농도에서 웰-투-웰(well-to-well) 변동성 검정 기준을 충족시키기 위하여 차폐되는 것이 필요하였다.

·웰-투-웰 변동성 %CV ≤20%

·검정 창(window)(D/A) ≥6

·R² ≥0.98

47개의 테스트 샘플의 상대적 효능을 1회 측정하고, 대조용은 6회 상이한 시점에서 측정하였다. 대조용의 평균 상대적 효능은 100.2%이었으며, 95% CI는 96.9%로부터 103.6%이었다.

·대조용의 6개의 독립 측정에 대한 검정 변동성(%GCV)은 3.2%이었다. 이러한 방법의 낮은 검정 변동성은 단일 측정으로부터 얻은 테스트 샘플의 상대적 효능값이 허용 가능하였다는 것을 입증하였다.

·단일 측정에 기초하여, 대다수의 테스트 샘플은 (기준 표준물질과 비슷한) 100%에 가까운 상대적 효능을 가졌다.

·테스트 샘플은 높은 온도(50℃)에서 3 일 동안 보관시 효능을 상실하기 시작하였으며, 차후의 시점에서 효능은 감소하였다.

-더 긴 시점(3 개월 및 6 개월)의 경우

·샘플을 t=6 개월(F3) 및 t=3 개월(모든 기타 샘플 및 조건에 대하여)을 포함한 1개의 배취로 테스트하였다.

·모든 샘플을 1명의 분석자가 1회 생물학적 검정으로 테스트하였다. 사용한 기준 표준물질은 E16 ADS 로트 DC-4168-85이다.

·A280 ㎚에서의 흡광도 측정은 1차 희석 및 차후의 샘플 희석의 정확한 농도를 구하기 위하여 실시하였다.

·전체 검정 수행은 허용 가능하였다. 모든 투여 반응 곡선(6개의 플레이트로부터 12개의 투여 반응 곡선)은 임의의 웰의 차폐 없이 웰-투-웰 변동성 검정 기준을 충족한다. TME 0498-01에 명시된 검정 허용 기준은 하기와 같다:

- 웰-투-웰 변동성 %CV≤20%

- 검정 창(D/A) ≥6

- R² ≥0.98

·검정에서의 투여 반응 곡선에 대한 검정 창은 ~4 내지 4.5 범위내이었다. 투여 반응 곡선의 모든 핵심 파라미터(A, B, C 및 D)는 과거의 데이타의 정상 범위내에 포함된다. 이전에는 더 작은 검정 창(>3)이 검정 정확도를 포함하지 않아서 이러한 검정 결과가 허용되었던 것으로 나타났다.

이 경우, 데이타는 검정 허용 기준을 입증하기 위하여 및 필요할 경우 웰을 차폐시키기 위하여 소프트맥스 프로(Softmax Pro) v5.2를 사용하여 분석하였다.

세포에 기초한 생물학적 검정 결과:

도 8은 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(8A), 25℃(8B), 50℃(8C), 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(8D)에 대하여 모든 제제에서 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함하는 그래프를 도시한다.

(기준 표준물질의 효능과 비교한) 효능에서의 차이는 50℃ 조건에서 모든 제제에서 검출되었으며, 모든 테스트 샘플은 3 일 정도로 이르게 효능을 잃으며, 50℃에서 14 일 보관까지 크게 증가되었다.

F3은 50℃에서 14일 후 최고의 효능을 나타내며, 나머지는 42.2% 상대적 효능을 나타낸다.

모든 제제에 대한 상대적 효능은 냉동-해동 및 RT 진탕의 조건 이외에 -20℃, 25℃ 및 50℃에서 100%에 근접하게 된다.

도 8E는 조건: 시점 t=0, t=1 개월, t=3 개월 및 t=6 개월에서 -20℃, 2-8℃, 25℃ 및 -20℃/25℃에서 1x, 2x 및 4x 냉동/해동 후에 대하여 제제 F3에서 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함하는 그래프를 도시한다. 데이타 표도 또한 도면의 옆에 제공한다.

6 개월 이하의 모든 조건에서 및 -20℃/25℃에서의 4 사이클 냉동-해동에서의 제제 F3은 기준 표준물질과 비슷한 % 상대적 효능을 나타내며, 검정 변동성(≤20%) 내에 존재한다. F3의 경우 25℃에서 3 개월 후 최저 % 상대적 효능 값(89.5%)이 측정되었다.

도 8F는 25℃에서 3 개월 후의 이노베이터와 비교한 -20℃, 2-8℃, 25℃에서 3 개월 후의 제제 F1, F3, F5, F6 및 F8(및 6 개월 후 F3)에서 및 -20℃/25℃에서 4x 냉동/해동 후 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함하는 그래프를 도시한다. 데이타 표도 또한 도면의 옆에 제공한다.

모든 조건에서 이노베이터와 비교하면 F1, F3, F5 및 F8 사이에는 % 상대적 효능에서는 큰 차이가 없다. 모든 샘플은 기준 표준물질과 비슷한 상대적 효능을 가졌다. 25℃에서 3 개월 후 F6은 잔존하는 효능이 없었다.

모든 샘플은 기준 표준물질과 비슷한 상대적 효능을 가졌다.

제제 F5(50 mM 인산Na, 90 mM NaCl, 34 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 및 F8(50 mM 숙시네이트/NaOH, 90 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3)은 상기 표에 제시한 바와 같이, 수행한 분석으로부터 전체 최고의 안정성 및 상대적 효능으로부터 선두의 제제로서 확인되며, F8은 F1(이노베이터 액체 제제)과 비슷하거나 또는 더 우수하게 수행되었으며, 또한 F3 및 F6 제제보다 더 우수하였다.

본 발명의 제1의 구체예의 항목

1. - 사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;

-9 0 내지 130 mM의 농도로 존재하는 염; 및

- 트레할로스 및 수크로스 또는 그의 조합의 군으로부터 선택된 부형제

를 포함하는 수성 조성물로서, 아르기닌도 시스테인도 조성물 중에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.

2. 염 농도가 105-130 mM인 항목 1에 의한 조성물.

3. 염 농도가 125 mM인 임의의 항목 1 또는 2에 의한 조성물.

4. 염이 염화나트륨인 임의의 항목 1 내지 3에 의한 조성물.

5. 분리된 폴리펩티드가 에타너셉트인 임의의 항목 1 내지 4에 의한 조성물.

6. 부형제가 20 내지 80 ㎎/㎖의 농도의 트레할로스인 임의의 항목 1 내지 5에 의한 조성물.

7. 부형제가 5 내지 80 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 수크로스인 임의의 항목 1 내지 6에 의한 조성물.

8. 조성물이 수성 완충제를 추가로 포함하는 임의의 항목 1 내지 7에 의한 조성물.

9. 수성 완충제가 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨, 숙신산, 말레산, 아세트산암모늄, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 아세테이트, 디에탄올아민, 히스티딘 또는 그의 조합인 항목 8에 의한 조성물.

10. 수성 완충제가 20 mM 내지 100 mM의 농도로 존재하는 임의의 항목 8 또는 9에 의한 조성물.

11. 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 임의의 항목 1 내지 10에 의한 조성물.

12. 부형제가 락토스, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 글루코스, 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 재조합 헤마글루티닌, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 프롤린, L-세린, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신, 사르코신, γ-아미노부티르산, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80, 나트륨 도데실 술페이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체, 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥시드, 베타인, 아연 이온, 구리 이온, 칼슘 이온, 망간 이온, 마그네슘 이온, 3-[(3-콜아미드프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판술페이트, 수크로스 모노라우레이트 또는 그의 조합인 항목 11의 조성물.

13. 조성물의 pH가 pH 6.0 내지 pH 7.0인 임의의 항목 1 내지 12에 의한 조성물.

14. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨 완충제, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 125 mM 염화나트륨을 포함하며, 조성물의 pH가 6.3인 임의의 항목 1 내지 13에 의한 조성물.

15. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.2인 임의의 항목 1 내지 13에 의한 조성물.

16. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨 완충제, 90 mM 염화나트륨, 24 ㎎/㎖ 수크로스를 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.3인 임의의 항목 1 내지 13에 의한 조성물.

17. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM 인산나트륨 완충제, 90 mM 염화나트륨, 10 ㎎/㎖ 수크로스, 5 ㎎/㎖ 글리신을 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.3인 임의의 항목 1 내지 13에 의한 조성물.

18. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 22 mM 숙시네이트, 90 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스를 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.3인 임의의 항목 1 내지 13에 의한 조성물.

본 발명의 제2의 구체예

본 발명의 제2의 구체예는 TNFR:Fc를 함유하는 폴리펩티드의 보관에 적절한 일부 선택된 염 및 일부 선택된 아미노산이 없는 수성 안정한 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제2의 구체예는 하기 개시된 기술적 특징에 의한 수성 제제가 5℃ 초과의 고온에서 단백질의 증가된 안정성을 초래할 수 있다는 발견에 기초한다.

그러므로, 본 발명의 제2의 구체예는 아르기닌, 시스테인 또는, 염화나트륨, 염화칼륨, 시트르산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 차아염소산나트륨, 질산나트륨, 황화수은, 크롬산나트륨 및 이산화마그네슘으로부터 선택된 염 중 어느 것도 함유하지 않는 것을 특징으로 하며,

-사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;

-단당류 또는 이당류; 및

-수성 완충제를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 9는 초기 시간에서 pH 및 삼투압농도의 측정치의 막대 차트를 도시한다.

도 10은 모든 시간(0 내지 14 일) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕)에서 단백질 농도 측정치(280 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 11은 모든 시간(0 내지 14 일) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕)에서 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다.

도 12는 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕에서 측정한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

도 13는 시간 0 및 14 일에서 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕에서 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다. (A)에서 F1 샘플 및 (B)에서 F4 샘플.

도 14는 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(14A), 25℃(14B) 및 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(14C)에 대하여 모든 제제의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다. 피크 비율을 측정하고, 표에 나타낸다.

도 15는 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(15A), 25℃(15B), 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(15C)에 대하여 모든 제제의 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함한 그래프를 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 아르기닌, 시스테인 또는, 염화나트륨, 염화칼륨, 시트르산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 차아염소산나트륨, 질산나트륨, 황화수은, 크롬산나트륨 및 이산화마그네슘으로부터 선택된 염 중 어느 것도 함유하지 않는 것을 특징으로 하며,

-사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;

-단당류 또는 이당류;

-수성 완충제를 포함하는 수성 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제2의 구체예에서 사용된 바와 같이, 용어 "조성물" 또는 "조성물들"은 치료를 필요로 하는 개체에게 주사 및/또는 투여에 적절하도록 생성된 폴리펩티드를 포함하는 제제(들)을 지칭할 수 있다. "조성물"은 또한 "약학적 조성물"로서 지칭될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 실질적으로 무균 상태이며, 수용체에게 부당하게 독성 또는 전염성인 임의의 약물을 함유하지 않는다.

추가로, 본 발명의 제2의 구체예에서 사용된 바와 같이, 용액 또는 수성 조성물은 적절한 용매(예, 물 및/또는 기타 용매, 예를 들면 유기 용매) 또는 상호 혼화성 용매의 혼합물 중에 용해된 1종 이상의 화학 물질을 함유하는 유체(액체) 제제를 의미할 수 있다. 추가로, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 나타낸 값±그의 값의 2%을 의미하며, 바람직하게는 용어 "약"은 정확하게 나타낸 값(±0%)을 의미한다.

본 발명의 제2의 구체예에 의한 조성물이, 조성물에 첨가된 또는 단독의 아르기닌 또는 시스테인을 포함하지 않기는 하나, 폴리펩티드 그 자체는 그의 쇄에서 아르기닌 또는 시스테인 아미노산 잔기를 함유하지 않을 수 있다는 점에 유의한다.

특정한 실시양태에서, 발현된 Fc 도메인 함유 폴리펩티드는 임의의 표준 방법에 의하여 정제된다. Fc 도메인 함유 폴리펩티드가 세포내에서 생성될 경우, 미립자 부스러기는 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의하여 제거된다. 폴리펩티드가 배지로 분비될 경우, 우선 표준 폴리펩티드 농축 필터를 사용하여 상기 발현계로부터의 상청액을 농축시킬 수 있다. 프로테아제 억제제는 또한 단백질분해를 억제하기 위하여 첨가할 수 있으며, 항생제는 미생물의 성장을 방해하기 위하여 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 도메인 함유 폴리펩티드는 예를 들면 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석 및 친화도 크로마토그래피 및/또는 공지되거나 또는 발견하고자 하는 정제 기법의 임의의 조합을 사용하여 정제된다. 예를 들면 단백질 A는 사람 감마 1, 감마 2 또는 감마 4 중쇄에 기초하는 Fc 도메인 함유 폴리펩티드를 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62: 1-13).

폴리펩티드 정제를 위한 기타 기술, 이온-교환 컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로세트™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 위의 크로마토그래피(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전도 또한 필요에 따라 사용될 수 있다. 기타 폴리펩티드 정제 기술을 사용할 수 있다.

본 발명의 이와 같은 제2의 구체예의 바람직한 실시양태에서, 분리된 폴리펩티드는 에타너셉트이다. 에타너셉트의 Fc 성분은 일정 중쇄 2(CH2) 도메인, 일정 중쇄 3(CH3) 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만, 사람 IgG1의 일정 중쇄 1(CH1) 도메인을 함유하지 않는다. 에타너셉트는 차이니즈 햄스너 난소(CHO) 포유동물 세포 발현계에서 재조합 DNA 기술에 의하여 생성될 수 있다. 이는 934개의 아미노산으로 이루어지며, 약 150 킬로달톤의 겉보기 분자량을 갖는다(Physicians' Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.).

분리된 폴리펩티드의 농도는 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 20 내지 60 ㎎/㎖이며, 심지어 더욱 바람직하게는 농도는 약 25 ㎎/㎖ 또는 약 50 ㎎/㎖이다.

본 발명의 제2의 구체예의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 단당류 또는 이당류는 트레할로스 및 수크로스로부터 선택된다. 바람직하게는, 트레할로스는 20 내지 80 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 ㎎/㎖, 더 더욱 바람직하게는 60 ㎎/㎖의 농도로, 바람직하게는 트레할로스 이수화물의 형태로 존재한다. 바람직하게는, 수크로스는 10 내지 80 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 ㎎/㎖, 더 더욱 바람직하게는 60 ㎎/㎖의 농도로 존재한다. 본 발명의 제2의 구체예의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 부형제는 수크로스 및 트레할로스 사이의 조합이다.

본 발명의 제2의 구체예의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 수성 완충제는 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨, 말레산, 아세트산암모늄, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 아세테이트, 디에탄올아민으로부터 및 그의 조합으로부터 선택된다. 조성물에 사용된 완충제 단독으로 또는 병용과는 상관 없이, 그의 농도는 바람직하게는 20 mM 내지 150 mM이며, 더욱 바람직하게는 농도는 약 50 mM이며, 더욱 바람직한 수성 완충제는 인산나트륨이다.

본 발명의 제2의 구체예의 또다른 실시양태에서, 본 발명에 의한 조성물은 1종 이상의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 제2의 구체예의 특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중의 1종 이상의 부형제의 농도는 약 0.001 내지 5 중량%이며, 본 발명의 제2의 구체예의 기타 실시양태에서, 1종 이상의 부형제의 농도는 약 0.1 내지 2 중량%이다. 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 공지의 방법에 의하여 제조되며, 통상의 공급업자로부터 입수 가능하다. 바람직하게는, 상기 부형제는 락토스, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 글루코스, 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민(SA), 재조합 헤마글루티닌(HA), 덱스트란, 폴리비닐 알콜(PVA), 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 프롤린, L-세린, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신, 사르코신, γ-아미노부티르산, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 나트륨 도데실 술페이트(SDS), 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체, 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥시드, 베타인, 아연 이온, 구리 이온, 칼슘 이온, 망간 이온, 마그네슘 이온, 3-[(3-콜아미드프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판술페이트(CHAPS), 수크로스 모노라우레이트 또는 그의 조합이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 부형제는 폴리소르베이트 20이며, 더 더욱 바람직한 실시양태에서 폴리소르베이트 20은 0.1%의 농도로 존재한다.

본 발명의 제2의 구체예의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물의 pH는 pH 6.0 내지 pH 7.0이며, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8 및 6.9로부터 선택된 임의의 pH가 가능하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 조성물의 pH는 6.2이다.

본 발명의 제2의 구체예의 특정한 실시양태에서, 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물을 포함하며, 조성물의 pH는 pH 6.2이다.

본 발명의 제2의 구체예의 특정한 실시양태에서, 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하며, 조성물의 pH는 pH 6.2이다.

본 발명의 제2의 구체예의 특정한 실시양태에서, 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 수크로스를 포함하며, 조성물의 pH는 pH 6.2이다.

본 발명의 제2의 구체예의 특정한 실시양태에서, 조성물은 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 수크로스, 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하며, 조성물의 pH는 pH 6.2이다.

본 발명의 제2의 구체예에 개시된 조성물은 비경구, 예를 들면 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 윤활막내 및/또는 경막내 투여될 수 있다.

본 발명의 제2의 구체예에 의한 조성물에 함유되는 분리된 폴리펩티드의 치료적 효과는 당업계에 공지되어 있으며, 그의 예로는 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 육아종증, 크론병, 만성 폐쇄성 폐 질환, C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 건선 또는 아토피 피부염, 또는 기타 염증성 또는 자가면역-관련 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 것을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 조성물은 장애를 치료(증상의 완화, 진행의 중지 또는 서행화)에 충분한 양(예를 들면, 치료적 유효량)으로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 제2의 구체예를 예시하기 위한 것이며, 이는 그의 범주를 한정하고자 하지 않는다.

본 발명의 제2의 구체예의 실시예

조성물의 제조

하기 조성물은 하기를 단순 혼합하여 생성하였다:

공급원 물질:

62.5 ㎎/㎖의 에타너셉트, 1.2 ㎎/㎖ 트리스, 40 ㎎/㎖ 만니톨, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 7.4를 함유하는 공학적 실시 물질. -20℃에서 보관함.

기준 제제(본원에서 "엔브렐"로 지칭함):

다수의 엔브렐^® 시판 제제를 대조용 샘플로서 사용한다. 시판 제제는 50 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 25 mM 아르기닌, 100 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3을 함유한다.

후보 제제:

F1: 내부 대조용으로서 엔브렐^® 제제(50.9 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 25 mM 아르기닌, 100 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3)와 동일한 제제 중의 에타너셉트

F2: 수성 제제(49.4 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 100 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F3: 수성 제제(49.5 ㎎/㎖ 에타너셉트, 25 mM 인산Na, 125 mM NaCl, 10 ㎎/㎖ 수크로스, pH 6.3) 중의 에타너셉트

F4: 수성 제제(50.9 ㎎/㎖ 에타너셉트, 50 mM 인산Na, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, pH 6.2, 0.1% 폴리소르베이트 20) 중의 에타너셉트

일부 실험에서, 시판중인 다수의 엔브렐^®은 기준으로서 사용하였다(상기 참조).

실시예 1

고유 단백질 형광 발광 스펙트럼 및 정적 광 산란

266 ㎚에서 여기된 고유 단백질 형광 발광 스펙트럼뿐 아니라, 266 및 473 ㎚ 모두에서의 정정 광 산란 데이타를 얻었다. 각각의 샘플을 마이크로-큐벳 어레이(MCA)에 로딩하고, 옵팀 1000에 넣어 콜로이드성 및 형태 안정성에서의 차이를 규명하였다. 이러한 실험에서, 온도 경사 실험에 대한 온도는 15로부터 95℃까지 1℃ 단계로 증가시켰으며, 샘플을 각각의 온도에서 60 초 동안 유지하여 열 평형을 이루도록 하였다. 등온 실험에서, 온도를 62℃에서 유지하고, 샘플을 측정 사이에서 60 초 유지로 200회 반복으로 측정하였다.

266 및 473 ㎚ 레이저 소스로 샘플을 조사하는 동안의 시간을 노출 시간으로서 지칭한다. 노출 시간의 선택은 다수의 인자, 예컨대 형광 방출이 얼마나 강한지 및 샘플이 얼마나 민감하게 광퇴색되는지 등에 의존한다. 이들 샘플 모두의 경우에서 1초의 노출 시간을 사용하였다.

노출 시간이 변동됨에 따라 검출기에 투입되는 광의 양을 제어하는 물리적 슬릿의 크기를 변경시킬 수 있다. 이러한 개구의 크기를 증가시키는 것은 측정된 형광 신호를 증가시키지만, 기기의 분광 해상도를 감소시킨다.

옵팀 1000에 의하여 수행된 분석은 2종의 순차 레벨인 1차 및 2차를 포함한다. 옵팀 1000 소프트웨어는 자동화된 1차 및 2차 분석을 제공한다. 임의의 자동화 데이타 핏팅 소프트웨어를 사용함에 따라, 자동화 기능이 신뢰성이 있는 결과로 돌아가도록 입력 데이타가 우수한 품질을 갖는 것을 보장하도록 세심한 주의를 기울여야 한다. 모든 결과는 숙련된 분석자가 수동으로 체크하였다.

1차 분석은 미가공 형광 방출 및 광 산란 데이타로부터의 분광 파라미터를 추출한다:

·옵팀은 과학 문헌에 보다 통상적으로 사용되는 예상 파장(또한 무게중심 수단으로 지칭함) 등의 1차 레벨 정보를 제공할 수 있다. 이는 평균 발광 파장(또는 질량의 중심)을 보며, 분광 데이타에서 임의의 노이즈를 제거하는 우수한 접근법이 된다.

·산란광 강도는 260 및 270 ㎚ 사이의 적분된 강도로부터 계산한다(레일리 산란된 UV 여기 광). 산란 효율은 파장에 대한 의존성이 커서 짧을수록 용액 중의 분자에 의하여 광이 더 효율적으로 산란된다. 266 ㎚ 레이저의 산란은 평균 분자 질량에서의 작은 변화에 대한 매우 민감한 프로브가 된다.

이러한 실험에서, 350 내지 330 ㎚의 형광 강도의 비를 사용하여 항체의 열적 풀림을 실험하며, 266 ㎚ 및 473 ㎚ 레이저로부터의 산란광 강도는 열 유도된 샘플 응집을 측정하는데 사용하였다.

2차 분석은 1차 분석으로부터의 파라미터를 취하며, 이들이 존재한다면 샘플의 용융 온도 "T_m" 및 응집 개시 온도 "T_응집"를 구한다. 용융 온도는 온도에 대하여 플롯한 1차 데이타에서의 변곡점으로서 구한다.

응집 온도의 개시는 산란광 강도가 데이타에서의 노이즈에 대한 역치값보다 높게 증가되는 온도로서 측정한다. 측정된 최저 온도로부터, 측정된 각각의 산란된 강도 값을 모든 사전 측정된 값의 데이타세트에 가한다. 각각의 시점에서, 분석이 진행됨에 따라, 선형 핏을 적용하며, 핏의 우수성이 결정된다. 데이타가 직선으로부터 상당하게 벗어날 경우(데이타에서의 노이즈에 의하여 유의성이 측정될 경우), 이는 응집 개시 온도로 정의한다. 그렇지 않을 경우, 데이타세트에서 그 다음의 시점으로 알고리즘이 진행되며, 다시 한번 이러한 일탈에 대하여 테스트한다. 이러한 방법은 각종 단백질 및 조건에 대하여 테스트하였으며, 강하였다. 커다란 응집물이 형성되어 침전하는 극한의 상황에서, 현탁액 중의 입자가 입사 레이저의 초점 부피를 떠나면 광 산란 신호는 실제로 감소될 수 있다. 그러나, 초기 개시는 이후에 발생되는 임의의 침전에도 불구하고 재현 가능하게 검출된다.

모든 정적 광 산란 데이타의 경우, 샘플이 용액으로부터 침전되는 것으로 보이는지의 여부와는 상관 없이 모든 시점이 포함되었다. 상이한 반복된 실험에서 동일한 샘플은 때때로 침전될 것이며, 때때로 그렇지 않을 것이지만, 각각의 경우에서 응집 과정의 출발은 재현 가능하다.

결론

모든 샘플 사이에서의 T_응집 및 T_개시 데이타 모두는 매우 유사한 것으로 밝혀졌다.

·F1 완충제에서, 생성물은 63.7±0.3℃의 형광의 T_개시 및 66.8±0.3℃의 T_응집를 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F2 완충제에서, 생성물은 63.2±0.1℃의 형광의 T_개시 및 65.9±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F3 완충제에서, 생성물은 63.4±0.3℃의 형광의 T_개시 및 65.6±0.4℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·F4 완충제에서, 생성물은 63.3±0.1℃의 형광의 T_개시 및 64.8±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

·엔브렐 이노베이터 그 자체는 63.4±0.1℃의 형광의 T_개시 및 65.6±0.1℃의 T_응집을 갖는 것으로 밝혀졌다.

그러므로, 데이타는 모든 샘플 사이에서 콜로이드성 및 형태 안정성 모두에서 높은 정도의 유사성을 나타낸다.

형광에 대하여 밝혀진 T_개시 값은 63.2 내지 63.7℃이었으며, 평균 63.4℃ 및 비교적 낮은 표준 편차 0.3℃이며, 이는 5종의 샘플(F1 내지 F4 및 엔브렐-액체 제제) 사이의 높은 정도의 비교 가능성을 나타낸다.

모든 실험에 나타난 바와 같이, F4 제제는 엔브렐 액체 제제에 대하여 형태적으로 형태 및 콜로이드성 안정성의 관점에서 매우 유사한 것으로 보인다.

실시예 2

짧은 응력 안정성 실험

접근법

짧은 기간(2주) 안정성 실험을 실시하여 장기간의 수행 이전에 가능한 제제를 평가하였다.

4종의 제제를 테스트하였다:

t=0, 3, 7 및 14 일에서의 각각의 제제의 안정성은, 진탕 및 냉동-해동 응력 이외에, 2개의 상승된 온도(25℃ 및 50℃) 및 1개의 실시간 온도에 노출 후 평가하였다.

8개의 분석 검정의 패널을 사용하여 각각의 제제의 안정성을 평가하였다.

·pH(t=0 단독)

·삼투압농도(t=0 단독)

·단백질 농도(A280 ㎚)

·혼탁도(A330 ㎚)

·HIAC

·환원 SDS-PAGE(쿠마시 블루 염색)

·크기 배제-HPLC(SE-HPLC)

·세포에 기초한 효능

pH 및 삼투압농도

도 9는 초기 시간에서 pH 및 삼투압농도의 측정치의 막대 차트를 도시한다. 모든 제제에 대하여 측정된 이들 값은 각각의 조건에서 샘플을 설정하기 이전에 목표 pH 또는 이론치 삼투압농도 값의 범위내에 포함되었다.

단백질 농도/A280

도 10은 모든 시간(0 내지 14 일)에서의 단백질 농도 측정치(280 ㎚에서의 흡광도) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(3x FzTh) 및 3 일 진탕)을 도시한다. 얻은 데이타는 모든 시점 및 조건에서 모든 샘플에 대하여 검정의 변동성 이내에 및 목표값의 범위내에 남아 있었다.

혼탁도/A330

도 11은 모든 시점(0 내지 14 일) 및 조건(-20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(3x FzTh) 및 3 일 진탕)에서의 혼탁도 측정치(330 ㎚에서의 흡광도)를 도시한다. 결과에 의하면, 혼탁도에서의 상당한 증가가 50℃ 조건에서 검출되었으며, F3은 시간 경과에 따라 최저의 증가를 나타냈다. 어떠한 제제에서도 -20℃, 25℃, 냉동-해동 또는 진탕에서 유의적 변화가 관찰되지 않았다.

HIAC(액체 입자 계수기)

방법:

HIAC 9703 액체 입자 계수 시스템을 실험에 사용하였다. HIAC는 샘플러, 입자 계수기 및 로이코(Royco) 센서로 이루어졌다. 로이코 센서는 2 ㎛ 내지 100 ㎛의 입자의 사이징 및 계수가 가능하다. 이러한 기기는 입자≤10,000 계수/㎖를 계수할 수 있다.

절차:

·처음, 샘플을 희석하지 않고 분석하였으나, 샘플의 높은 점도로 인하여, 보다 정확한 결과를 얻기 위하여 희석하여야만 한 것으로 결정되었다.

·샘플은 1 시간 동안 실온이 되게 하였다.

·샘플을 적절한 제제 완충제 중에서 1:3으로 희석하고, 탈기시키고(1.5 hr), 조심스럽게 혼합한 후 측정하였다.

·스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼: 시스템 적합성 체크는 EZY-Cal 5 ㎛ 및 15 ㎛ 입자 크기 제어 기준으로 수행하였다. 대조용 표준물질은 센서의 해상도를 확인하기 위하여 초반에 분석한다.

도 12는 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동(3x FzTh) 및 3 일 진탕에서 스탠다즈-듀크 사이언티픽 카운트 칼을 사용하여 측정한 HIAC에 의한 육안으로 보이지 않는 입자 분석을 도시한다.

보이지 않는 입자 계수에서의 상당한 증가는 F1, F2 및 F4에 대하여 50℃ 조건에서 측정하였으며, F2는 이르게는 7일 정도로부터 최고 증가를 나타냈다.

-20℃, 25℃, 3x FzTh에서 또는 3d RT 진탕 후 임의의 제제에 대하여 상당한 증가가 관찰되지 않았다.

F4는 모든 조건 및 시점하에서 보관 후 t=0 대조용과 비교하여 보이지 않는 입자에서의 변화가 나타나지 않았다.

SDS-PAGE

도 13은 시간 0 및 14 일에서 모든 조건: -20℃, 25℃, 50℃, 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕에서 배양한 쿠마시로 염색한 SDS-PAGE 겔을 도시한다. (A)에서 F1 샘플, (D)에서 F4 샘플.

모든 제제에서 50℃ 조건에 대하여 모든 시점에서 상당한 변화가 관찰되었으며, 14 일차 샘플은 존재하는 추가의 HMW 밴드(>~250 kDa) 및 저 분자량(LMW) 분해 종(<50 kDa)에 의하여 입증되는 바와 같이 유사하게 공유-변형된 고 분자량(HMW) 종을 나타내며, 이는 50℃에서 모든 제제에 대하여 이르게는 3 일 정도로부터 존재하였다.

모든 기타 조건 및 시점에 대하여 및 기준 표준물질과 비교하여 어떠한 제제에서도 변화가 관찰되지 않았다.

SE HPLC(크기 배제 HPLC )

조건:

·컬럼: TSKGel SuperSW3000 4.6x300mm, 4 ㎛(토소, 18675) CV=2.5 ㎖

·컬럼 온도: 25℃

·이동상: 0.2 M 인삼염 완충제, pH 6.8

·유속: 0.35 ㎖/min

·실시시간: 20 min

·샘플 로드: 37.6 ㎍

·자동 샘플러 온도: 4℃

도 14는 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(14A), 25℃(14B), 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(14C)에 대하여 모든 제제의 크기 배제 HPLC의 크로마토그램을 도시한다. 피크 비율을 측정하였으며, 표로 나타냈다.

25℃ 조건은 7 일 후 % 주요 피크 면적 및 % 프리-피크 모두에서 모든 제제에 대한 약간의 변화를 초래하며, 이는 추가로 14 일에 증가되며, F4는 프리-피크 응집에서 최고의 증가(0.5%)를 나타내지만, 이러한 증가는 고려할 가치가 미미하다.

-20℃에서 14 일 이하 동안 진탕 및 냉동-해동 또는 보관의 조건에 노출시 어떠한 제제에서도 상당한 변화가 관찰되지 않았다.

세포에 기초한 효능 검정

접근법:

·샘플을 2개의 배취(t=0 및 t=3d 후 및 t=7 및 t=14d 시점 후)로 테스트하였다.

·대조용 샘플을 각각 6 시험일에 테스트한 것을 제외하고, 모든 샘플을 단일 분석자에 의하여 1회 생물학적 검정으로 테스트하였다.

·A280 ㎚에서의 흡광도 측정은 1차 희석 및 차후의 샘플 희석의 정확한 농도를 구하기 위하여 실시하였다.

·전체 검정 수행은 허용 가능하였다. (53개의 플레이트로부터) 106개의 투여 반응 곡선 중 3개는 웰-투-웰 변동성 검정 기준을 충족시키기 위하여 1개의 웰이 2종 이하의 상이한 농도에서 차폐되는 것이 필요하였다.

·웰-투-웰 변동성 %CV ≤20%

·검정 창(window)(D/A) ≥6

·R² ≥0.98

47개의 테스트 샘플의 상대적 효능을 1회 측정하고, 대조용은 6회 상이한 시점에서 측정하였다. 대조용의 평균 상대적 효능은 100.2%이었으며, 95% CI는 96.9%로부터 103.6%이었다.

·대조용의 6개의 독립 측정에 대한 검정 변동성(%GCV)은 3.2%이었다. 이러한 방법의 낮은 검정 변동성은 단일 측정으로부터 얻은 테스트 샘플의 상대적 효능값이 허용 가능하였다는 것을 입증하였다.

·단일 측정에 기초하여, 대다수의 테스트 샘플은 (기준 표준물질과 비슷한) 100%에 가까운 상대적 효능을 가졌다.

세포에 기초한 생물학적 검정 결과:

도 15는 모든 시점에서 모든 조건: -20℃(15A), 25℃(15B), 3회 냉동/해동 및 3 일 진탕(15C)에 대하여 모든 제제에서 세포에 기초한 효능 검정의 분석(기준 표준물질의 효능과 비교한 상대적 효능의 %)을 포함하는 그래프를 도시한다.

도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 제제에 대한 상대적 효능은 냉동-해동 및 RT 진탕의 조건 이외에 -20℃ 및 25℃에서 100%에 가까웠다.

본 발명의 제2의 구체예의 항목

1. 아르기닌, 시스테인 또는, 염화나트륨, 염화칼륨, 시트르산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 차아염소산나트륨, 질산나트륨, 황화수은, 크롬산나트륨 및 이산화마그네슘으로부터 선택된 염을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는,

-사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;

-단당류 또는 이당류;

-수성 완충제를 포함하는 수성 조성물.

2. 분리된 폴리펩티드가 에타너셉트인 항목 1에 의한 조성물.

3. 단당류 또는 이당류가 트레할로스 및 수크로스 및 그의 조합으로부터 선택되는 임의의 항목 1 또는 2에 의한 조성물.

4. 트레할로스가 20 내지 80 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 항목 3에 의한 조성물.

5. 수크로스가 10 내지 80 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 항목 3에 의한 조성물.

6. 수성 완충제가 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨, 말레산, 아세트산암모늄, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 아세테이트, 디에탄올아민 또는 그의 조합으로부터 선택되는 임의의 항목 1 내지 5에 의한 조성물.

7. 수성 완충제가 20 mM 내지 150 mM의 농도로 존재하는 항목 6에 의한 조성물.

8. 1종 이상의 부형제를 더 포함하는 임의의 항목 1 내지 7에 의한 조성물.

9. 부형제가 락토스, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 글루코스, 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 재조합 헤마글루티닌, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 프롤린, L-세린, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신, 사르코신, γ-아미노부티르산, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 나트륨 도데실 술페이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체, 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥시드, 베타인, 아연 이온, 구리 이온, 칼슘 이온, 망간 이온, 마그네슘 이온, 3-[(3-콜아미드프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판술페이트, 수크로스 모노라우레이트 또는 그의 조합인 항목 8의 조성물.

10. 조성물의 pH가 pH 6.0 내지 pH 7.0인 임의의 항목 1 내지 9에 의한 조성물.

11. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물을 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.2인 임의의 항목 1 내지 10에 의한 조성물.

12. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 수크로스를 포합하며, 조성물의 pH는 pH 6.2인 임의의 항목 1 내지 10에 의한 조성물.

13. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 트레할로스 이수화물, 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.2인 임의의 항목 1 내지 10에 의한 조성물.

14. 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 50 mM 인산나트륨 완충제, 60 ㎎/㎖ 수크로스, 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.2인 임의의 항목 1 내지 10에 의한 조성물.

Claims (15)

1. - 사람 IgG1의 Fc 영역에 융합된 사람 p75 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드-결합부인 분리된 폴리펩티드;
   - 80 내지 130 mM의 농도로 존재하는 염; 및
   - 트레할로스 및 수크로스 또는 그의 조합의 군으로부터 선택되는 부형제를 포함하는 수성 조성물로서,
   조성물 중에 아르기닌도 시스테인도 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 수성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 염 농도가 90 mM인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 염이 염화나트륨인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 폴리펩티드가 에타너셉트인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 부형제가 5 내지 80 ㎎/㎖의 농도로 존재하는 수크로스인 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 완충제를 더 포함하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 수성 완충제가 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨, 숙신산, 말레산, 아세트산암모늄, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 아세테이트, 디에탄올아민, 히스티딘 또는 그의 조합인 조성물.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 수성 완충제가 15 mM 내지 100 mM의 농도로 존재하는 조성물.
9. 제8항에 있어서, 수성 완충제가 20 내지 30 mM의 농도로 존재하는 조성물.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 완충제가 숙신산(숙시네이트)인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 부형제를 더 포함하는 조성물.
12. 제11항에 있어서, 부형제가 락토스, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 글루코스, 소 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 재조합 헤마글루티닌, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 히드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 히드록시에틸셀룰로스(HEC), 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 프롤린, L-세린, 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신, 사르코신, γ-아미노부티르산, 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-80, 나트륨 도데실 술페이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 공중합체, 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥시드, 베타인, 아연 이온, 구리 이온, 칼슘 이온, 망간 이온, 마그네슘 이온, 3-[(3-콜아미드프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판술페이트, 수크로스 모노라우레이트 또는 그의 조합인 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH가 pH 6.0 내지 pH 7.0인 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 22 mM의 숙시네이트, 90 mM의 NaCl, 10 ㎎/㎖의 수크로스를 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.3인 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 50 ㎎/㎖의 에타너셉트, 25 mM의 인산나트륨 완충제, 90 mM의 염화나트륨, 34 ㎎/㎖의 수크로스를 포함하며, 조성물의 pH가 pH 6.3인 조성물.

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