KR20160003080A - 친화성 수지를 이용하여 ａｄｃ를 합성하는 방법 - Google Patents

친화성 수지를 이용하여 ａｄｃ를 합성하는 방법 Download PDF

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데이비드 존 에반스
콜린 마틴 맥키
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에이디씨 바이오테크놀로지 리미티드
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Abstract

본 발명은 생분자-약물-컨쥬게이트를 합성하는 고체상 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항체-약물-컨쥬게이트(ADC)를 합성하는 고체상 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고정화되고, 화학적으로 변형된 생분자, 예를 들면, 항체를 생산하는 중간 방법(intermediate method)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포획 수지(capture resin)의 다양한 용도 및 본 발명의 방법의 생분자-약물-컨쥬게이트, 중간 생성물 및 조성물에 관한 것이다.

Description

친화성 수지를 이용하여 ＡＤＣ를 합성하는 방법{Method of Synthesising ADCs Using Affinity Resins}
본 발명은 생분자-약물-컨쥬게이트(biomolecule-drug-conjugate)를 합성하는 고체상 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항체-약물-컨쥬게이트(ADC)를 합성하는 고체상 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고정화되고, 화학적으로 변형된 생분자, 예를 들면, 항체를 생산하는 중간 방법(intermediate method)에 관한 것이다.
전술된 방법 외에, 본 발명은 또한 본 발명의 방법의 포획 수지(capture resin), 생분자-약물-컨쥬게이트, 중간 생성물 및 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.
면역독소(immunotoxin) 및 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate: ADC)는 표적-특이적 결합 도메인을 세포독성으로 분류될 수 있는 충분히 강력한 독성을 갖는 약물 분자와 통합한 단백질 약물(proteinaceous drug)이다. 항체는 높은 특이성과 높은 항원 친화성을 통합하여 세포독성 약물의 원하는 투여 부위로의 수송을 가능하게 하는 표적화 시스템을 생성하는, 이 목적을 위해 이상적인 생분자이다. 이러한 약물 구조체는 잠재적으로 질병에 대해 치료 효과를 갖고, 종양학에서 특히 널리 이용된다.
항체 약물 컨쥬게이트(ADC)의 주요 기준은 독소 '병기(warhead)' (약물)가 극히 낮은 수준(picoM)에서 활성을 갖는다는 것이다. 또한, 주기 중 시점에 관계없이, 종양 세포에 대한 효능을 갖는 것이 유리하다. DNA 손상은 회복가능하지 않다면, 주기 중 시점에 관계없이 아폽토시스를 유도할 것이므로, 이 목적을 위해, DNA 활성제가 독소 후보로서 장점을 가졌다.
원칙적으로, ADC에 대한 적합한 독소는 L01 ATC 분자(WHO 약물 통계 방법 협력 센터(WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology)에 의해 정의된, 항신생물제 및 면역조절제를 정의하는 서브그룹인, '해부학적 치료제 화학 분류 시스템(Anatomical Therapeutic Chemical Classification System)')로 정의된 모이어티일 수 있다. 대안적으로, ADC에 대한 적절한 패이로드(payload)로 분류될 수 있는 기타 모이어티는 내부화되면 세포에 독성인 것으로 단순하게 정의될 수 있다. 후자의 카테고리에 속하는 대부분의 모이어티는 효과적이기 위한 충분한 효능(potency)을 갖지 않는다. 따라서, '울트라-효능(ultra-potency)' 물질을 확인하고 이용하려는 업계의 경향이 있다.
면역독소 및 ADC의 근거, 설계 및 효과에 대한 전문가 리뷰를 J. Adair et al, Expert Opin. Biol. Ther., 2012, 12(9): P1 191-206, G. Casi et al, Journal of Controlled Release, 2012, 161, 2, PA22-A2Q and F. Dosio et al, Toxins, 2011, 3, P848-883에서 찾을 수 있다.
생분자-약물-컨쥬게이트, 예를 들면, 항체-약물-컨쥬게이트(ADC)를 제조하기 위해 다수의 용액-상 방법(solution-phase method)이 이용될 수 있다. 그러나, 용액상 방법은 그 자체로 다량의 폐기물을 생성한다는 점에서 소모적이고 합성 동안 생분자-약물-컨쥬게이트의 응집의 측면에서 문제가 있다.
생분자-약물-컨쥬게이트의 제조를 위한 용액상 방법에서 제1 단계는 일반적으로 생분자의 화학적 변형 또는 활성화를 포함한다. 예를 들면, 생분자가 항체인 경우, 항체는 상기 항체를 환원시키거나 또는 부분적으로 환원시키는 것에 의해 '화학적으로 변형(chemically modified)'되거나 또는 '활성화(activated)'될 수 있다. 항체의 부분적 산화를 위한 적절한 방법이 "Bioconjugate Techniques", page 96/97, Greg T. Hermanson, Academic Press; 2nd edition, 2008, ISBN-13: 978-0123705013에 기재된다. TCEP와 같은 환원제가 일반적으로 환원 공정에서 이용된다.
항체의 화학적 변형 또는 활성화, 예를 들면, 환원 후에, 후속 단계는 과량의 활성화/화학 변형제, 예를 들면, 과량의 환원제를 제거하는 것이다. 이 단계는 종종 시료를 분리 컬럼을 통해 수회 전개시키는 것이 필요하므로 매우 많은 시간을 소요한다. 이는 또한 생분자의 안정성이 이슈인 경우, 분해의 측면에서 문제가 될 수 있다. 공정이 과량의 환원제에 의한 ThiomAb의 완전한 환원을 포함하는 경우, 화학적으로 변형된/활성화된 생분자의 정제 이슈는 특히 문제가 된다.
전술된 정제 단계 후에, 화학적으로 변형된/활성화된, 예를 들면, 환원된 항체를 약물 모이어티와 접합시킨다. 이 단계의 주요 문제는 생분자-약물-컨쥬게이트의 응집의 높은 확률이다. 높은 소수성 약물이 공정에서 이용되는 경우, 이는 특히 문제가 된다. 응집은 불안정한 생분자-약물-접합체를 초래할 수 있으므로 주요 문제이다. 최적 케이스 시나리오(best case scenario)에서, 생분자-약물-컨쥬게이트 응집체로 오염된 생분자-약물-컨쥬게이트는 응집체를 제거하기 위해 더 정제되어야 하고, 이는 시간을 소요하고 또한 매우 소모적이다. 다량의 약물이 응집된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성하기 때문에 정제 동안 소실될 것이다. 생분자-약물-컨쥬게이트의 전체 배치가 생분자-약물-컨쥬게이트 응집체에 의해 높은 정도로 오염된 최악 케이스(worst case)에서, 생분자-약물-컨쥬게이트는 전적으로 불안정하고 처분되어야 한다.
단일클론 항체가 존재한 동안, 거의 30년 동안, 종양학자들은 세포독성 약물을 종양 부위로 전달하기 위해 표적-특이적 단일클론 항체를 이용하는 것에 대해 연구하고 있다. 현재까지, 세 종류(class)의 독소, 즉, 칼리케아미신(calicheamicin), 마이탄신(maytansine) 및 오리스타틴(auristatin)이 이 분야를 지배했다. 이러한 세포독성 약물 종류는 속성상 모두 전형적으로 소수성이다. 항체에 접합된 경우, 그들의 존재는 항체의 전체 소수성을 유의성 있게 증가시키고, 일부 경우에, 컨쥬게이트 간의 소수성 상호작용이 컨쥬게이트 응집(conjugate aggregation)을 초래하는 정도까지 증가시킨다. Mylotarg 및 CMC-544에 대한 공정이 모두 크로마토그래피 응집체(chromatographic aggregate) 제거 단계를 포함한다는 지식에 근거하여 이 이슈의 유의성의 순서는 칼리케아마이신 > 마이탄신 > 오리스타틴이다. 마이탄신 공정의 약 50%는 응집체 제거 단계를 포함하고 매우 소수의 오리스타틴 공정이 응집체 제거 단계를 포함한다.
보다 최근에, 두오카르마이신(duocarmycin) (www.syntarga.com) 및 피롤벤조디아제핀(pyrollebenzodiazepene) (PBD) 이량체 (www.spirogen.com)에 기반한 독소가 항체에 접합되었고 전임상 평가가 진행되고 있다. 이러한 새로운 종류의 독소는 그들의 전구체 세포독성 약물 종류보다 훨씬 더 소수성이 높고, 항체에 접합되었을 때, 응집되기가 더 쉽다.
친수성 링커를 결합(incorporate)시키는 것에 의해 약물의 소수성을 조절하는 것에 대해 상당한 노력이 집중되고 있다(Zhao et al, J. Med. Chem., 2011, 54, 10, 3606- 3623). 응집체 형성을 조절할 수 없는 경우, 개발자들은 단백질 기반 치료제로부터 응집체를 제거하기 위해 잘 알려진 기법들에 의존했다. 이들은 이온 교환, 소수성 상호작용, 히드록시아페타이트(hydroxyapatite) 및 당업자에게 잘 알려진 다른 것들을 포함한 광범위한 여러 크로마토그래피 분리를 포함한다. 그러한 크로마토그래피 정제 기법을 수행하는 것은 적절한 제품 품질을, 그러나, 공정 수율을 희생 하에, 달성하는 결과를 갖는다. 제조의 측면에서 항체 및 항체 기반 치료제를 이용한 작업시, 모호하고, 우연한 부작용 또는 원치않는 물리화학적 상호작용을 통한 물질의 물리적 손실이 엄청나게 중요한 재정적 영향을 갖는다.
따라서, 생분자-약물-컨쥬게이트의 제조를 위한 통상적인 용액-상 방법은 어려움이 있으며, 생분자-약물-컨쥬게이트의 제조를 위한 개선된 방법을 제공하는 것이 요구된다.
본 발명은 통상적인 용액-상 방법이 갖는 전술된 이슈 중 하나 이상을 해소한다.
본 개시의 요약
생분자 -약물- 컨쥬게이트의 합성 방법 :
본 발명에 따라, 생분자-약물-컨쥬게이트를 합성하는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 생분자를 고정화시키기에 적합한 조건 하에 생분자를 포획 수지(capture resin)와 접촉시켜 고정화된 생분자를 제공하는 단계로서; 상기 생분자는 항체, 변형된 항체 또는 항체 단편이고; 상기 포획 수지는 (1) 아미노산-기반을 포함한, 비-펩티드 기반(non-peptide based) 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체(mimetic), (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된 생분자 포획 모이어티(biomolecule capture moiety)를 포함하는 것인 단계;
(ii) 선택적으로, 상기 고정화된 생분자를 화학 변형제(chemical modification agent) 또는 활성화제와 접촉시켜 화학적으로 변형되거나 또는 활성화되고, 고정화된 생분자를 제공하는 단계;
(iii) 상기 고정화된 생분자 또는 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 접촉시켜, 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성시키는 단계;
(iv) 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 전술된 방법의 핵심 특징은 상기 방법에서 이용된 포획 수지가 일관성 있고 재현성 있는 방식으로 생분자를 고정화시킬 수 있다는 것이다. 포획 수지로의 생분자의 일관된 고정화는 전술된 방법에 의해 생성된, 결과적인 생분자-약물-컨쥬게이트의 감소된 변이를 가져올 것이다. 예를 들면, 약물 성분이 고정화된 생분자에 부착되는 부위(point)의 변이는 감소되어, 약물 성분과 고정화된 생분자 간의 보다 일정한 부착 부위를 초래한다. 이러한 위치-특이성(regio-specificity)의 개선은 결과적으로 수득되는 생분자-약물-컨쥬게이트 산물의 일관성의 개선이라는 측면에서 바람직할 것이다.
모(parent) 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L을 생분자 포획 모이어티로 이용하는 것 대비, 비-펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 모방체(mimetic) 또는 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 모방체의 이용 (즉, 전술된 방법의 제1 단계의 (1) 또는 (2))은 통상적인 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 기반 시스템 대비, 모방체의 증가된 위치-특이성 때문에 생분자의 고정화에서 일관성(consistency)의 상대적 개선을 가져올 수 있다. 생분자의 단백질로의 고정화의 위치-특이성이 낮은 경우, 생분자 포획 모이어티로서 모 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L의 이용은 내재적으로 생분자의 포획 수지로의 가변적(variable) 고정화를 초래할 것이다. 예를 들면, 상기 모 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L은 전체 상호작용을 복잡하게 할 수 있는 상기 단백질 상의 다른 부위를 통한 비-특이적 결합을 보일 수 있다. 앞서 설명된 바와 같이, 본 발명에서 고려되는 바와 같은 포획 수지로의 생분자의 일관성 있는 고정화는 전술된 방법에 의해 생성된 결과적인 생분자-약물-컨쥬게이트의 감소된 변이를 가져올 수 있다. 이는 유리할 것이다. 본 발명의 수지 시스템의 또 다른 장점은 통상적인 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 기반 시스템의 경우에 비해, 보다 광범위한 약물이 원칙적으로 수지에 접합될 수 있다는 사실에 있다. 예를 들면, 소수성 분자의 경우에, 모 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 기반 시스템에서 일어날 수 있는 다른 비-특이적 결합이 이러한 약물의 효과적인 접합을 파괴하거나 또는 방해할 수 있다.
생분자 포획 모이어티로서 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티 또는 당단백질(glycoprotein) 포획 모이어티의 이용(즉, 전술된 방법의 제1 단계의 (3) 또는 (4))에 대해 유사한 잇점이 존재한다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 비-단백질성(non-proteinaceous) 포획 수지이다. 일 구체예에서, 상기 포획 수지의 생분자 포획 모이어티는 약 1000 Da 이하, 선택적으로 약 500 Da 이하, 약 300 Da 이하, 또는 약 200 Da 이하의 분자량을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 포획 수지는 비-단백질성 포획 수지이고, 상기 포획 수지의 생분자 포획 모이어티는 약 1000 Da 이하의 분자량을 갖는다.
모 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L을 생분자 포획 모이어티로 이용하는 것 대비, 비-펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 모방체, 또는 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L을 생분자 포획 모이어티로 이용하는 것의 또 다른 잇점은 모방체 생분자 포획 모이어티가 광범위한 일반적 항체 접합 화학(common antibody conjugation chemistry)과 조화될 수 있고(compatible), 산업적 수준까지 확장(scale up)될 수 있다. 이는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 기반 생분자 포획 모이어티와 대조된다.
예를 들면, 종종 고정화된 항체 상의 라이신 곁사슬 작용기를 표적화하는 것이 바람직하다. 현재 임상 개발 중인 28개의 항체 약물 컨쥬게이트 중에서, 약 절반(하기 표에서 회색으로 음영이 표시된 것들)이 라이신 지향적 접합 화학(lysine directed conjugation chemistry)를 이용한다. 단백질 A, G, 또는 L의 표면에 있는 고정화 리간드의 단백질 속성은 단백질 포획 수지상에 있는 라이신 곁사슬 작용기의 의도하지 않은 표적화를 초래할 것이다. 단백질 A (swiss-prot P02976)는 59개의 라이신 잔기를 갖고, 단백질 G (swiss-prot P919909)는 59개의 라이신 잔기를 가지며, 단백질 L (swiss-prot Q51918)은 132개의 라이신 잔기를 갖는다.
Figure pct00001
전술된 바와 같이 리간드와 항체 라이신 잔기 간의 경쟁 외에, 단백질 A, G, 및 L 기반 포획 수지에 대한 다른 이슈도 있다. 이들은 단백질의 침출(leaching) 및 침출된 부가물(leached adduct)의 면역원성을 포함한다. 이는 이러한 친화성 지지체가 제조 방법의 목적(정제 또는 접합)을 위해 이용될 수 없다는 것을 의미한다. 단백질 A, G, 및 L 기반 포획 수지를 이용하는 방법으로부터 제공된 컨쥬게이트 물질은 항체 정제 및 생성물 품질에 대한 현재의 규제 가이드라인을 충족하지 못할 것이다.
화학적으로 변형되거나 활성화되고, 고정화된 생분자를 합성하는 방법:
본 발명에 따라, 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 합성하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 생분자를 고정화시키기에 적합한 조건 하에 생분자를 포획 수지(capture resin)와 접촉시켜 고정화된 생분자를 제공하는 단계로서; 상기 생분자는 항체, 변형된 항체 또는 항체 단편이고; 상기 포획 수지는 (1) 아미노산-기반을 포함한, 비-펩티드 기반(non-peptide based) 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체(mimetic), (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된 생분자 포획 모이어티를 포함하는 것인 단계; 및
(ii) 상기 고정화된 생분자를 화학 변형제 또는 활성화제와 접촉시켜 화학적으로 변형되거나 또는 활성화되고, 고정된 생분자를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
단백질 및 보다 구체적으로 항체의 접합이 종종 연구, 진단, 및 치료에서 이용된다. Bioconjugate Techniques, Second Edition (Greg T Hermanson)은 표지된 분자 또는 컨쥬게이트 분자를 생성하기 위한 화학, 시약 시스템 및 실질적 적용에 대한 고도로 상세한 정보를 제공한다. Bioconjugate Techniques는 또한 수백 개의 상업적으로 이용가능한 시약 및 펩티드 및 단백질, 당 및 다당류, 핵산 및 올리고뉴클레오티드, 지질 및 합성 폴리머를 변형 또는 가교시키기 위한 이러한 시약의 이용에 관한 상세한 설명과 함께 수십 개의 반응을 기술한다. 항체에 적용된 핵심적인 접합 화학의 간단한 요약이 하기에 제공된다.
천연 사슬간 디술피드(native interchain disulphid)의 환원 후 유리 티올로의 접합이 항체 접합의 일반적인 접근방식이고 상용 ADC ADCetris®에서 이용되는 화학이다. 방법은 항체를 환원제, 예를 들면, TCEP, DTT, 머셉토에틸아민(merceptoethylamine) 또는 당해 분야에서 잘 알려진 기타 적합한 환원제 접촉시키고, 뒤이어 D는 약물, 리간드 또는 표지(label)이고, X는 말레이미드, 할로알칸, 피리딘 디술피드 및 당해 분야에서 공지된 기타 티올 반응성 화합물(thiol reactive chemistry)인 것인 식 D-X의 약물, 리간드, 표지와의 접합을 포함한다.
항체와의 티올 접합에 대한 대안적인 접근방식은 항체 중 특정한 부위에 반응성 시스테인 잔기를 조작에 의해 생성시켜(engineer), 사슬간 디술피드 결합의 파괴 없이 약물이 정의된 화학량론(stoichiometry)으로 접합될 수 있게 하는 것이다. 조작에 의해 생성된 시스테인은 종종 시스테인 또는 글루타티온의 혼합 디술피드(mixed disulphide)로 존재한다. 완전한 환원 및 뒤이은 정용여과(diafiltration)에 의해 부가물(adduct)을 제거한다. 이는 공기, CuSO4, 또는 데히드로아스코르브산에 의한 산화에 의해 재형성되어야 하는 사슬간 디술피드를 깨뜨린다.
접합을 위한 또 다른 일반적인 부위는 라이신 잔기의 곁사슬에 존재하는 아미노기이다. 가장 단순한 접근방법은 항체를 식 D-Y의 약물, 리간드, 표지, 또는 링커와 접촉시키는 것을 포함한다. D는 전술된 것과 동일한 정의를 가지며, Y는 이소시아네이트, NHS 에스테르, 술포닐 클로라이드, 에폭시드 및 당해 기술 분야에서 당업자에게 알려진 기타 시약으로부터 선택된 반응성 기이다.
라이신으로의 간접적 접합이 종종 이용된다. 라이신 곁사슬의 아미노기를 상보적 반응성 화학(complimentary reactive chemistry)을 포함하는 약물과 접합시키기 전에, 먼저 헤테로이작용성 링커(heterobifunctional linker)로 활성화시킨다. 이러한 쌍(couplet)의 예는 라이신을 2-이미노티올란으로 변형시켜 새로운 티올을 생성하고, 뒤이어 전술된 티올 반응성 약물-링커(D-X)와 접합시키는 것을 포함한다. 또 다른 쌍은 SMCC에 의한 라이신의 변형에 의한 라이신 결합 말레이미드(lysine bound maleimide)의 생성 및 뒤이은 유리 티올을 함유하는 약물과의 접합이다. 간접적 라이신 접합에 유용한 잠재적인 쌍의 완전한 검토를 위해 Hermanson and the Perbio 가교제 카탈로그를 참조한다.
여러 그룹들이 단백질 중 20개의 단백질 생성 아미노산 사슬에 화학적으로 직교인(chemically orthogonal) 곁사슬을 갖는 비-천연 아미노산을 결합(incorporate)시키는 방법을 개발했다.
Redwood Bioscience (www.redwoodbioscience.com)는 알데히드 태깅(Aldehyde Tagging)이라 부르는 기술을 개발했다. 이 기술에서, 그들은 고도로 보존된 13개의 아미노산 서열 중 Cys 잔기를 정상적으로 Type I 술파타아제 중 포르밀 글리신 (알데히드)으로 전환시키는 포르밀 글리신 효소(formyl glycine enzyme)(FGE)라 불리는 천연 효소를 이용한다 (Wu et al, PNAS, 2009, 106, 9, 3001). 그러한 변형된 항체에 접합될 약물, 리간드 또는 표지는 옥시아민 또는 히드라진과 같은 알데히드 반응성 화학종(aldehyde reactive chemistry)를 포함해야 한다. 알데히드 반응성 작용기(aldehyde reactive functionality)의 완전한 개시는 Hermanson 및 Perbio 카탈로그에서 찾을 수 있다.
Ambryx는 EuCode라고 부르는 기술을 개발했다 (Liu et al, Anu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413). EuCode는 발현 시스템에 3개의 비-천연(non-natural) 성분을 포함시키는 것에 의해 이종 단백질에 비-천연 아미노산을 포함(incorporate)하도록 세포를 조작하는 플랫폼이다:
1. 배지에 보충된 비-천연 아미노산
2. 직교(orthogonal) 아미노아실-tRNA 합성효소 (aaRS)
3. 직교 tRNA
암버 종료 코돈(amber stop codon)에서 독파(read through)를 촉진하고 그 위치에 비-천연 아미노산을 포함하도록 직교 aaRS/tRNA 쌍을 조작(engineer)하고/선택했다. 이 방법을 이용하여 단백질에 많게는 70개의 nnAA을 포함시켰다. 하기의 도표는 직교 아미노산 곁사슬과 반응성 화학종의 가능한 조합을 확장시킨다(2012년 2월 Hanson Wade ADC summit 미팅에서 Ambryx 발표로부터 각색됨).
Sutro는 개방, 세포-불포함 합성(open, cell-free synthesis: OCFS) 기술을 이용한 항체 및 사이토카인의 생산을 기술했다. ODFS의 특징은 비-천연 아미노산을 단백질 상의 특정 위치로 전달하기 위해 특정 코돈으로 유도될 수 있는 하전된 tRNA로 비-천연 아미노산을 단백질에 포함시키는 능력이고, 이는 상기 단백질을 특이적 변형을 잘 받아들이게 하거나 또는 새로운 원하는 특징을 부여한다 (Goerke et al, Biotechnol. Bioeng., 2008, 99: 351-367).
고정화된 항체 접합은 하나의 단서가 있으나, 모든 비-천연 아미노산 곁사슬 및 상보적(complimentary) 반응성 화학종에 적합하다. 항체 포획 리간드는 비-천연 아미노산 곁사슬의 일부로 포함되는 신규한 화학종을 포함하지 않아야 한다.
Figure pct00002
소디움 페리오데이트(sodium periodate)에 의한 당단백질 중 다당류 잔기의 산화는 아민 또는 히드라진 함유 분자; 약물, 리간드 또는 표지(label)와의 후속 컨쥬게이션을 위한 반응성 알데히드를 생성하는 온화하고 효율적인 방법을 제공한다. 상기 방법은 먼저 항체를 소디움 페리오데이트와 접촉시키는 단계 및 그 후, 아민, 히드라지드, 아미녹시, 또는 당해 기술 분야에서 공지된 기타 알데히드 반응성 화학종(aldehyde reactive chemistry)과 컨쥬게이션시키는 단계를 포함한다.
단계 (i):
일 구체예에서, 생분자를 포획 수지와 접촉시키는 단계는 상기 생분자를 상기 포획 수지와 인큐베이션시키는 것을 포함한다.
상기 인큐베이션은 약 0 내지 약 100℃의 온도, 바람직하게는, 약 5 내지 약 50℃의 온도 및 선택적으로 약 10 내지 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 이상적으로, 상기 인큐베이션은 약 15 내지 약 37℃의 온도에서 수행되고, 예를 들면, 상기 인큐베이션은 실온, 예를 들면, 약 21℃에서 수행된다. 대안적으로, 상기 인큐베이션은 약 37℃에서 수행된다.
상기 인큐베이션은 약 1 분 내지 약 3 일의 기간 동안, 예를 들면, 약 10 분 내지 약 18 시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 인큐베이션은 약 20 분 내지 약 1 시간의 기간 동안 수행된다.
일 구체예에서, 상기 인큐베이션은 수성 매질(aqueous media)에서 수행된다. 대안적 구체예에서, 상기 인큐베이션은 완충액, 예를 들면, 인산염 완충 염수 (PBS) 또는 원하는 결합 pH 및 화학(chemistry)에 적합한 완충염에서 수행되고, 선택적으로 상기 인큐베이션은 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 완충액에서 수행된다. 일 구체예에서, 상기 인큐베이션은 DMSO 또는 DMF와 같은 용매를 포함한 공-용매를 이용하여 수행된다. 상기 공용매는 0.5-80%v/v의 범위, 예를 들면, 0.5-50%v/v로 존재할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 인큐베이션은 약 5 내지 약 10의 pH, 바람직하게는 약 5 내지 약 8의 pH, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 8의 pH에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 상기 인큐베이션은 약 6 내지 약 7.5의 pH, 이상적으로, 약 6.5의 pH에서 수행된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 인큐베이션은 약 7 내지 약 8의 pH, 이상적으로, 약 7.4의 pH에서 수행된다. 이는 항체의 유도체화된(derivatized) 지지체로의 개선된 결합을 가져온다.
일 구체예에서, 상기 고정화된 생분자(즉, 상기 포획 수지에 고정화된 생분자)를 세척하여 상기 포획 수지에 고정화되지 않은 생분자를 제거한다. 상기 고정화된 생분자의 세척은 신선한 용매에 의한 세정(rinsing)에 의해 수행될 수 있다(affected). 예를 들면, 상기 고정화된 생분자의 세척은 PBS와 같은 완충액에 의한 세정에 의해 수행될 수 있다. 선택적으로, 고정화된 생분자의 세정은 EDTA와 같은 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다. 대안적으로, 고정화된 생분자의 세척은 인산나트륨 완충액, NaCl, 및 킬레이팅제, 예를 들면, EDTA를 포함하는 '변형 완충액(Modification Buffer)'에 의한 세정에 의해 수행될 수 있다.
단계 (ii):
일 구체예에서, 상기 고정화된 생분자를 화학 변형제 또는 활성화제와 접촉시켜 변형되거나 또는 활성화되고, 고정화된 생분자를 제공하는 단계는 상기 생분자를 환원시키는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 생분자의 환원은 완전한 환원을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 생분자의 환원은 부분적 환원을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 생분자의 환원은 완전한 환원 및 뒤이은 재-산화를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 생분자는 그를 환원제 예를 들면, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 머셉토에틸아민(merceptoethylamine) 또는 기타 적합한 환원제와 접촉시키는 것에 의해 환원된다. 바람직하게는, 상기 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)이다.
일 구체예에서, 상기 환원된 생분자는 그를 공기, CuS04 또는 데히드로아스코르브산 (DHAA)과 같은 산화제와 접촉시키는 것에 의해 재-산화된다. 바람직하게는, 상기 산화제는 데히드로아스코르브산 (DHAA)이다.
일 구체예에서, 상기 생분자를 환원시키는 방법은 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 완충액에서 수행된다.
일 구체예에서, 상기 생분자를 환원시키는 방법은 약 5 내지 약 10, 바람직하게는 약 7 내지 약 8, 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 수행된다.
일 구체예에서, 상기 생분자를 환원시키는 방법은 EDTA와 같은, 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다.
일 구체예에서, 상기 생분자를 환원시키는 방법은 상기 생분자를 환원제와 약 20 분 내지 약 3 일, 선택적으로, 약 1 시간 내지 약 2 일 및 또한 선택적으로, 약 6 시간 내지 약 18시간의 기간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 생분자를 화학 변형제 또는 활성화제와 접촉시켜 변형되거나 또는 활성화되고, 고정화된 생분자를 제공하는 단계는 상기 생분자를 가교제 모이어티(crosslinker moiety)와 반응시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 가교제 모이어티는 아미노-대-설프히드릴 가교제(amine-to-sulfhydryl crosslinker), 예를 들면, 대향 말단에 NHS-에스테르와 말레이미드 반응기를 갖는 가교제일 수 있다. 상기 생분자를 변형시키거나 활성화시키는 방법은 효과적으로 생분자-링커-약물-컨쥬게이트를 초래한다. 적절한 가교제는 일반적으로 약물 상의 일차 아민기와 (반응성 NHS 에스테르 말단을 통해) 반응할 수 있고, 또한 생분자 상의 시스테인 잔기와 (반응성 말레이미드 말단을 통해) 반응할 수 있다. 이 구체적 예에서, 말레이미드 말단은 상기 고정화된 생분자 중 시스테인과 반응할 것이다. 그러한 가교제의 예는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)이다.
일 구체예에서, 가교제와 반응시키는 공정은 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 완충액에서 반응시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 가교제와 반응시키는 공정은 인산염 나트륨 완충액, NaCl, 및 킬레이팅제, 예를 들면, EDTA를 포함하는 '변형 완충액'에서 수행된다.
일 구체예에서, 가교제와 반응시키는 공정은 약 7 내지 약 9, 바람직하게는 약 7 내지 약 8, 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 수행된다.
일 구체예에서, 가교제와 반응시키는 공정은 EDTA와 같은 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다.
일 구체예에서, 가교제와 반응시키는 공정은 상기 생분자를 가교제와 약 20 분 내지 약 3 일, 선택적으로, 약 1 시간 내지 약 2 일 및 또한 선택적으로, 약 6 시간 내지 약 18시간의 기간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 고정화된 생분자를 화학 변형제 또는 활성화제를 접촉시켜 변형되거나 또는 활성화되고, 고정화된 생분자를 제공하는 단계는 상기 생분자를 Traut 시약(Traut's reagent)와 반응시키는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 Traut 시약과 반응시키는 공정은 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 완충액에서 수행된다.
일 구체예에서, 상기 Traut 시약과 반응시키는 공정은 약 7 내지 약 9, 바람직하게는 약 7 내지 약 8, 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 수행된다.
일 구체예에서, 상기 Traut 시약과 반응시키는 공정은 EDTA와 같은 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다.
일 구체예에서, 상기 Traut 시약과 반응시키는 공정은 상기 생분자를 환원제와 약 20 분 내지 약 3 일, 선택적으로, 약 1시간 내지 약 2일, 및 또한 선택적으로 약 6시간 내지 약 18시간의 기간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 변형제 또는 활성화제를 제거하기 위해, 상기 활성화되고, 고정화된 생분자를 세척한다. 일 구체예에서, 상기 세척은 완충액에 의한 세정(rinsing)을 포함하고, 선택적으로 상기 완충액은 인산염 완충 염수 (PBS)이다. 기타 적합한 완충액은 인산칼륨 완충액; 인산나트륨 완충액; 소디움 시트레이트 완충액; 비스-트리스 프로판 완충액(Bis-Tris propane buffer); HEPES 완충액; 소디움 아세테이트 완충액; 소디움 시트레이트 완충액; 카코딜산 완충액(Cacodylic acid buffer); 암모늄 아세테이트 완충액; 이미다졸 완충액; 비신 완충액(Bicine buffer); 및 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액을 포함한다. 예를 들면, 고정화된 생분자를 약 7 내지 약 8, 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 완충액으로 세척할 수 있다. 선택적으로, 상기 활성화되고, 고정화된 생분자의 세정은 EDTA와 같은 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다. 상기 활성화되고, 고정화된 생분자의 세정의 또 다른 예는 수지를 PBS와 같은 완충액, 및 뒤이어 소디움 시트레이트, NaCl 및 EDTA와 같은 킬레이팅제를 포함하는 '접합 완충액(Conjugation Buffer)'에 의해 세정하는 것을 포함한다.
단계 (iii):
일 구체예에서, 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 접촉시켜 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성시키는 단계는 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 단계 (ii)와 관련하여 전술된 완충액에서 약물 성분과 접촉시키는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 접촉시켜 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성시키는 단계는 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약 5 내지 약 8, 바람직하게는 약 약 7 내지 약 8 및 보다 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 약물 성분과 접촉시키는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 접촉시켜 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성시키는 단계는 EDTA와 같은 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다.
일 구체예에서, 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 접촉시켜 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성시키는 단계는 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 약 20 분 내지 약 3 일, 선택적으로, 약 1 시간 내지 약 2 일 및 또한 선택적으로, 약 6 시간 내지 약 18시간의 기간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계 전에, 상기 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 세척한다. 상기 세척은 미반응 약물 성분을 제거한다. 일 구체예에서, 상기 세척은 완충액에 의한 세정을 포함하고, 선택적으로, 상기 완충액은 인산염 완충 염수 (PBS), 및 기타 용매이다. 기타 적합한 완충액은 인산칼륨 완충액; 인산나트륨 완충액; 소디움 시트레이트 완충액; 비스-트리스 프로판 완충액; HEPES 완충액; 소디움 아세테이트 완충액; 소디움 시트레이트 완충액; 카코딜산 완충액; 암모늄 아세테이트 완충액; 이미다졸 완충액; 비신 완충액; 및 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES) 완충액을 포함한다. 예를 들면, 상기 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 약 5 내지 약 7의 pH에서 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 완충액 및 디메틸아세트아미드 (DMA)로 세척할 수 있다. 선택적으로, 상기 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트의 세정은 EDTA와 같은 킬레이팅제의 존재 하에 수행된다.
단계 ( iv ):
일 구체예에서, 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계는:
a) 지지체-생분자 화합물을 방출제(release agent)에 노출시키는 단계; 및/또는
b) 상기 지지체-생분자 결합을 깨뜨리기 위해 pH를 변화시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방출제는 헥사플루오로이소프로판올, 2,2,2-트리플루오로에탄올 또는 디메틸술폭시드 (DMSO)의 공용매(co-solvent)와 같은 수소 결합 파괴제(hydrogen bond disrupter)이다.
일 구체예에서, 상기 방출제를 상기 지지체-생분자와 인큐베이션시킨다.
상기 인큐베이션은 약 0 내지 약 100℃의 온도, 바람직하게는 약 5 내지 약 50℃의 온도 및 선택적으로 약 10 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 이상적으로, 상기 인큐베이션은 약 15 내지 약 37℃의 온도에서 수행되고, 예를 들면, 상기 인큐베이션은 약 21℃와 같은 실온에서 수행된다. 대안적으로, 상기 인큐베이션은 약 37℃에서 수행된다.
상기 인큐베이션은 약 1분 내지 약 3일의 기간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인큐베이션은 약 30분 내지 약 2시간의 기간 동안 수행된다.
상기 인큐베이션은 수성 매질에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 인큐베이션은 DMF, DMSO, MeOH 또는 MeCN과 같은 용매에서 수행될 수 있다.
대안적으로, 상기 인큐베이션은 최대 80%의 용매, 바람직하게는 0.5 내지 50% 및 가장 바람직하게는 0.5% 내지 10%v/v의 용매를 포함하는 수-용매 혼합물에서 수행될 수 있다. 특정 경우에, 물을 포함한, 전술된 용매 중 하나 이상의 혼합물이 적합할 수 있다.
필요한 경우, 컨쥬게이트가 온전하게 유지될 수 있도록 하기 위해, 안정화제가 또한 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계는 pH를 변화시키는 것을 포함한다. pH를 상기 지지체-생분자 결합을 깨뜨리기에 충분하나, 상기 생분자의 활성, 온전성(integrity) 또는 3D 구조에 영향을 미치지 않을 양만큼 변화시킬 수 있다.
예를 들면, 상기 pH는 산성이 되도록 조정될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 pH는 약 pH 2 내지 약 pH 6까지 감소된다. 선택적으로, 상기 pH는 약 pH 5 미만으로, 예를 들면, pH 3 내지 5로, 예를 들면, 약 pH 4 미만으로 조정된다. 일 구체예에서, 상기 pH는 pH 3까지 감소된다.
대안적으로, pH는 염기성이 되도록 조정될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 pH는 약 pH 8 내지 약 pH 10까지 증가된다. 선택적으로, 상기 pH는 pH 8보다 더 높게 조정된다. 예를 들면, 상기 pH는 약 pH 9까지 증가시킬 수 있다. 상기 pH를 pH 9보다 더 높이 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 pH를 약 pH 10까지 증가시킬 수 있다. 상기 pH를 pH 10보다 높게 증가시킬 수 있으나, 통상적으로 pH 14 미만일 것이다.
상기 생분자-약물-컨쥬게이트는 방출제에 의한 하나 이상의 처리를 거칠 수 있다. 유리하게, 신선한 방출제에 의한 제2 또는 후속 처리의 이용은 상기 포획-수지로부터 방출되는 생분자-약물-컨쥬게이트의 양을 증가시키는 결과를 초래할 수 있다. 신선한 방출제는 이전에 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트와 인큐베이션되지 않았던 방출제이다.
일 구체예에서, 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계는 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 염과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 NaCl과 접촉시킬 수 있다. 상기 염의 농도는 약 0.1 내지 약 10 M, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1 M의 범위일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지로부터 상기 컨쥬게이트를 방출시키는 단계 후에, 용리된 생분자-약물-컨쥬게이트를 중화시킨다. 예를 들면, 상기 컨쥬게이트를 1 M 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 (TRIS)의 2% v/v 내로 포획시킬 수 있다.
세척 단계:
일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 중간체를 세척하는 단계는 오염물과 같이 포획 수지에 결합되지 않은 물질들을 제거하는 것을 포함한다. 전형적인 오염물은 고정화된 생분자를 활성화시키기 위해 이용된 과량의 시약, 포획 수지에 고정화되지 않은 생분자, 및 활성화되고, 고정화된 생분자와 반응하지 않은 약물 성분들을 포함한다. 생분자의 활성, 온전성(integrity), 또는 3D 구조, 또는 고정화된 생분자와 포획 수지 간의 결합의 온전성에 영향을 미치지 않는 매질이 중간체를 세척하기 위해 이용될 수 있다.
바람직하게는, 완충액은 등장성이고, 생리학적 pH 및 이온 강도를 모방(mimick)하는 것에 의해 항체와 같은 생분자에게 안정한 환경을 유도한다. 일 구체예에서, 상기 활성화되고, 고정화된 생분자를 여과에 의해 세척한다. 선택적으로, 결과적으로 수득된 여과액을 완충액-교환(buffer-exchange)시키고, 예를 들면, 막 카트리지를 이용한 원심분리에 의해 완충액-교환시킨다.
통상적으로, 첨가제를 완충 매질(buffer media)에 도입한다. 이러한 첨가제는 완충 시스템 및 그 안에 함유된 생분자에 제어 수준을 유도한다. 예를 들면, pH를 유지하고 부수적인 산성화를 최소화하기 위해 Tris 또는 히스티딘과 같은 첨가제를 완충 공정 흐름(buffered process stream)에 도입한다. 통상적으로, 생분자 공정 흐름의 pH는 pH 5 내지 pH 9.5에서 유지되어야 하고, pH 한계의 극단은 장기간 동안 피해야 한다. 공정 흐름의 이온 강도를 유지하기 위해 0.1 M NaCl(aq)과 같은 무기 염을 첨가할 수 있다. 완충 매질에서 난용성(poorly soluble) 생분자의 용해도를 유리하게 증가시키고 응집을 최소화하기 위해 Tween (폴리소르베이트)과 같은 이온성 및 비-이온성 디터전트를 완충액에 첨가할 수 있다.
포획 수지 및 활성화제를 포함하는 혼합물:
본 발명에 따라, (i) (1) 비-펩티드 기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체(mimetic), (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된, 항체, 변형된 항체 또는 항체 단편 포획 수지를 포함하는 포획 수지; 및
(ii) 화학 변형제 또는 활성화제를 포함하는 혼합물이 제공된다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 그의 표면 상에 고정화된 항체, 변형된 항체, 또는 항체 단편을 포함한다.
생분자 -약물- 컨쥬게이트의 합성에서 포획 수지의 용도:
본 발명에 따라, (1) 비-펩티드 기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된 항체, 변형된 항체, 또는 항체 단편 포획 모이어티를 포함하는 포획 수지의 생분자-약물-컨쥬게이트의 합성에서의 용도가 제공된다.
포획 수지:
수년 동안, 연구자들은 전통적인 단백질 A, G, 또는 L 친화성 정제 지지체 에 대한 대체물로서 광범위한 전장 항체, 단편 또는 융합체(fusion)에 대한 친화성을 갖는 리간드를 개발하고자 하였다. 성공적인 리간드 발견/개발의 주요한 기준은 다음과 같다:
1. 높은 초기 정제(initial purification)를 가능하게 하는 항체에 대한 높은 선택성
2. 유용한 동적 결합 능력(dynamic binding capacity)
3. 항체 온전성(antibody integrity)의 유지와 양립가능한 용리 조건
4. 복수의 용리/세정(elusion/cleaning) 사이클 동안 지지체의 안정성
5. 단백질 A, G, 또는 L 지지체 대비 낮아진 비용
고체상 항체 접합을 위해 이러한 리간드의 사용시, 접합 공정은 정제된 항체로 개시되므로, 전술된 기준 1은 중요하지 않다. 그러나, 리간드는 나머지 4개의 기준을 모두 충족시켜야 한다. 또한, 리간드는 이상적으로 접합을 위해 적합한 친화성 결합 강도를 가능하게 하는 항체와의 상호작용의 정의된 부위를 갖는다. 항체가 지지체에 결합될 수 있고 시간의 경과에 따라 완충액 보충 동안 우연히 용리되지 않도록 하기 위해 이 속성이 필요하다. 또한, 상호작용의 정의된 부위는 일정하고 재현가능한 접합 화학을 위한 수단을 제공하는 효과로, 주변 용액상에 결합된 항체 복합체의 일관성 있는 입체구조적 제시(conformational presentation)를 부여하는 것이 바람직하다. 항체는 친화성 정제를 위해 이용되는 다수의 잘 정의된 결합 도메인을 갖는 규명된 생분자이다.
제1 정의 영역(defined region)은 단백질 A/G 및 단백질 A/G 지지체의 모방체를 이용한 친화성 크로마토그래피에서 이용되는 단백질 A 및 단백질 G 결합 포켓(binding pocket)이다. 단백질 A는 아미노산 잔기 Thr 250, Leu 251, Met 252, Ile 253, His 310, Gin 311, Leu 314, Asn 315, Lys 338, Glu 345, Ala 431, Leu 432, His 433, Asn 434 및 His 435와의 다수의 비-공유결합성 상호작용을 통해 Fc 영역에 있는 CH2 CH3 사슬간 도메인(interchain domain)과 상호작용한다. 단백질 A 모방체 지지체는 앞서 정의된 아미노산 중 하나 이상을 통해 이 도메인과 상호작용하도록 합리적으로 설계되었다. 이러한 모방체 지지체는 IgG 결합 및 접합을 위한 적합한 친화성 리간드를 제공한다. 단백질 A 모방체 지지체는 비-펩티드(non-peptide), 펩티드 또는 아미노산 기반 리간드를 결합하는 서브-클래스로 정의될 수 있다. 유사하게, 단백질 G는 아미노산 잔기 Ile 253, Ser 254, Gln 311, Glu 380, Glu 382, His 433, Asn 434 및 His 435와의 다수의 비-공유결합성 상호작용을 통해 Fc 영역에서 CH2 CH3 사슬간 도메인과 상호작용한다. 단백질 G 모방체 지지체는 전술된 아미노산 중 하나 이상을 통해 이 도메인과 상호작용하도록 합리적으로 설계되었다. 이러한 모방체 지지체는 IgG 결합 및 접합을 위해 적합한 친화성 리간드를 제공한다. 단백질 G 모방체 지지체는 비-펩티드, 펩티드, 또는 아미노산 기반 리간드를 결합하는 서브-클래스로 정의될 수 있다. 일 구체예에서, 포획 수지는 생분자 상의 단백질 A 또는 단백질 G 결합 포켓에 결합할 수 있다.
제 2 정의 영역은 단백질 L 친화성 매트릭스에 의해 표적화되는 항체 경쇄이다. 단백질 L은 특이적으로 카파(kappa) I, II, 및 IV 경쇄에 결합하나, 카파 III이나 감마 경쇄에 결합하지 않는다. 단백질 L과 항체 간의 상호작용이 맵핑되었고 수소 결합과 염 브릿지(salt bridge)가 결합에 중요하다는 것이 주목되었다. 단백질 L 도메인의 총 11개의 친수성 아미노산- 즉, Ala, Asp, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Phe, Thr, Tyr-이 이러한 결합을 형성하는데 중요하다. 앞서 개시된 11개의 아미노산에 대한 구조적으로 유사한 화학 화합물을 이용하여 트리아진 스카폴드 조합 라이브러리(triazine scaffold combinational library)를 생성하는 것에 의해 단백질 L 모방체 친화성 지지체가 개발되었다 (WO2004/035199A). WO2004/035199A에 개시된, 단백질 L 모방체는 Fab 단편의 결합에 의해 입증된 바와 같이 경쇄에 대한 특이성 및 항체 또는 단편에 대한 단백질 L의 친화성의 50%를 갖는 리간드로 정의된다. 경쇄에 대한 친화성 및 특이성의 특징을 유지하는 한, 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 공지된 적합한 스카폴드는 트리아진 스카폴드를 대체할 수 있다. 그러한 수지는 카파 I, II 및 IV 경쇄를 포함하는 항체 및 단편의 고정화를 위해 유용하다. 단백질 L 모방체의 하나의 상용 구체예는 Fabsorbent™ F1P HF (ProMetic Biosciences)이다. 이 친화성 지지체는 단백질 L 모방체에 대한 기준을 준수하나, 또한 감마 경쇄 함유 항체 및 단편에 결합한다. 따라서, 이 친화성 지지체는 보편적으로 항체 친화성 결합 및 접합에 적용가능하다. 일 구체예에서, 포획 수지는 단백질 L 친화성 매트릭스에 의해 표적화된 항체 경쇄에 결합할 수 있다.
제3 정의 영역은 광범위한 종에 걸쳐 모든 항체 이소형의 Fab 암(arm)에 있는 보존된 뉴클레오티드 도메인이다. 결합 부위는 4개의 아미노산 잔기를 포함하고 첫번째 아미노산은 Tyr 또는 Phe이고, 나머지 3개는 Tyr, Tyr, 및 Trp이다. 결합 포켓 위치 및 아미노산 곁사슬 배향(orientation)은 결정 구조 오버레이(crystal structure overlay)에서 보존되나, 항체 간에 전체 백본 서열 변이 및 번호매김 방식(numbering scheme)에 있어서 경미한 차이가 있다. 이는 상용 항체 허셉틴(Herceptin) 및 리툭시맙(Rituximab)에 대해 보존된 뉴클레오티드 결합 부위를 비교하는 것에 의해 하기에서 입증된다. 전술된 아미노산 중 하나 이상을 통해 이 도메인과 상호작용하도록 합리적으로 설계된 뉴클레오티드 모방체(비-펩티드, 펩티드, 뉴클레오티드 유사체 및 아미노산)는 IgG 결합 및 접합을 위한 적합한 친화성 리간드이다.
항체 아미노산 1 아미노산 2 아미노산 3 아미노산 4
허셉틴 경쇄 Tyr 36 경쇄 Tyr 87 중쇄 Tyr 95 중쇄 Trp 110
리툭시맙 경쇄 Phe 35 경쇄 Tyr 86 중쇄 Tyr 95 중쇄 Trp 111
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 항체의 Fab 암(arm)에 있는 보존된 뉴클레오티드 도메인에 결합할 수 있다.
제4 정의 영역은 온전한 항체의 Fc 영역의 CH2 도메인에 있는 Asn 297에 존재하는 글리칸(glycan) 구조이다. 친화성 리간드로서 작용하는 m-아미노페닐보론산은 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스와 같은 당 잔기에 존재하는 시스 디올(cis diol)기에 결합하여 당단백질 분자의 사카라이드 모이어티와 함께 존재한다. 이 상호작용으로부터 가역적 5원 고리 복합체(reversible five membered ring complex)가 제공된다. 항체 글리칸 중 만노오스 및 갈락토오스의 존재를 강조하기 위해 전형적인 항체 글리칸 구조가 하기에 표시된다(Adapted from Arnold et al, Advances in Experimental Medicine and Biology, 2005, 564, 27-43). 일 구체예에서, 포획 수지는 온전한 항체의 Fc 영역의 CH2 도메인 중 Asn 297에 존재하는 글리칸 구조에 결합할 수 있다.
Figure pct00003
리간드는 친화성 크로마토그래피 분야에서 잘 알려진 다양한 고체 지지체 매트릭스에 부착될 수 있다. 이들은 예로서, 합성 중합체, 예를 들면, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 또는 폴리스티렌, 특히 가교된 합성 중합체, 무기 지지체, 예를 들면, 실리카-기반 지지체 및 특히, 다당류 지지체, 예를 들면, 전분, 셀룰로오스 및 아가로오스를 포함한다.
항체 결합을 위해 적합한 특이적 리간드-지지체(ligand-support)가 하기에 기재된다:
'비 펩티드' 단백질 A, G 및 L 모방체 친화성 지지체
합성 화합물 라이브러리 스크리닝과 조합된 단백질 A, G, 또는 L 상호작용의 분자 모델링은 이러한 단백질의 소형 분자 모방체의 반-합리적(semi-rational) 설계를 가능하게 했다 (Li et al, Nature Biotechnology, 1998, 16, 190-195). 이러한 수지의 예는 상업적으로 입수가능한 지지체 A1P 및 FAbsorbent F1P HF (ProMetic Biosciences)를 포함한다.
mAbsorbent A1P 및 FAbsorbent F1P HF 지지체는 다성분 Ugi 반응을 이용하여 트리아진 스카폴드 상에 형성된다 (www.prometicbioscience.com).
US20010045384는 이미노 디아세테이트 (IDA) 타입 스카폴드 상에 조립된 단백질 A 모방체 리간드-복합체를 개시한다. IDA 스카폴드는 다가 트리아질 리간드-복합체를 제공할 수 있도록 트리아질 리간드에 의해 유도체화된다.
WO9808603은 친화성 수지를 이용하여 세포 배양액 상층액, 혈청, 혈장 또는 초유(colostrum)으로부터 면역글로불린을 단리하는 것을 기술한다. 이 친화성 수지는 면역글로불린 정제를 촉진하기 위해 합성 모노 또는 비시클릭-방향족 또는 헤테로방향족 리간드를 포함한다.
항체 친화성 수지로서 유망한 또 다른 리간드는 술파메타진(sulfamethazine)이다. 술파메타진과 커플링된 덱스트란 미세입자(microparticle)가 특이적으로 항체에 결합한다 (Yi et al, Prep. Biochem. Biotechnol., 2012, 42, 6, 598-610).
전술된 선도 후보 리간드(lead candidate ligand)의 선택에서, 항체 특이성의 부재에 근거하여 다수의 리간드가 배제되었다. 특이성은 고체상 항체 접합 수지에 대한 결합 효율성, 용량(capacity), 및 안정성보다 덜 중요하고 따라서 이들은 배제되지 않는 것으로 개시된다.
'펩티드' 단백질 A, G 또는 L 모방체 친화성 지지체
다수의 단백질 A 모방체 펩티드가 개시되었다. Menegatti는 항체 Fc 영역에 결합하는 서열 HWRGWV를 갖는 헵사펩티드를 확인했다 (Menegatti et al, Journal of Separation Science, 2012, 35, 22, 3139-3148). Fassina 등은 테트라덴데이트 라이신 코어(tetradendate lysine core)를 갖는 랜덤화 합성 분자들로 구성된 합성 다량체 펩티드 라이브러리의 합성 및 스크리닝을 통해 단백질 A 모방체 펩티드 TG191318을 확인했다(Fassina et al, J. Mol. Recognit., 1996, 9, 564). EP1997826은 X1-Arg-Thr-Tyr을 포함하는 펩티드를 개시한다. Lund 등은 항체 친화성 크로마토그래피를 위해 적합한 두 개의 펩티드 리간드를 개시한다 (Lund et al, J Chromatogr. A, 2012, 1225, 158-167). DAAG 및 D2AAG는 L-아르기닌, L-글리신, 및 합성 방향산 2,6-디-터트-부틸-4-히드록시벤질 아크릴레이트 (DBHBA)를 포함한다.
아미노산 단백질 A, G 또는 L 모방체 친화성 지지체
전술된 복합 마크로분자 리간드 외에, 단순한 아미노산이 동일한 방식으로 항체를 결합하는 단백질 A 모방체로 제안되었다 (Naik et al, J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 1756-1766). 이의 예는 AbSep, 항체의 Fc 영역에 있는 단백질 A 결합 부위에 대한 높은 친화성을 갖는 트립토판 함유 폴리메틸아크릴레이트 수지이다. 아미노산인 티로신, 히스티딘 및 페닐알라닌을 포함하는 수지는 또한 항체 고정화 및 접합에 적합하다(Bueno et al, J. Chromatogr. B, Biomed. Appl., 1995; 667, 1, 57-67).
뉴클레오티드 결합 부위 친화성 지지체
항체 정제 리간드를 개발하는 또 다른 전략은 항체의 Fab 가변 영역에 있는 덜 알려진 보존된 뉴클레오티드 결합 부위 (NBS)를 이용했다 (Alves et al, Anal. Chem., 2012, 84, 7721-7728). 뉴클레오티드 유사체 인돌부티르산이 전술된 기준 1 내지 5를 충족시키는 지지체를 제조하기 위해 ToyoPearl AF-650-아미노 M 수지에 커플링되었다. 항체 친화성 크로마토그래피를 위해 유용한 광범위한 기타 뉴클레오티드 유사체가 WO/2012/099949에 기재된다.
탄수화물 결합 수지
당단백질을 정제하기 위해 다양한 지지체에 고정화된 리간드 m-아미노페닐보론산이 이용되었다. 상기 리간드는 항체를 포함한 당단백질 분자의 사카라이드 모이어티 내에 존재하는 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스와 같은 당 잔기 상에 있는 시스-디올기에 결합하여, 가역적 5-원 고리 복합체(reversible five-member ring complex)를 형성한다. 이 복합체는 pH를 낮추거나, 또는 Tris 또는 소르비톨을 함유한 용리 완충액을 이용하여 해리시킬 수 있다.
포획 수지의 리간드는 리간드와 생분자, 예를 들면, 단백질, 항체, 변형된 항체, 또는 항체 단편 간의 특이적, 가역적 및 비-공유 결합 상호작용에 의해 생분자와 상호작용할 수 있다. 비-공유결합성 상호작용은 이온성, 반 데르 바알스, 수소 결합 또는 소수성 상호작용으로 분류될 수 있다. 이 상호작용은 표적 생분자의 유연성 및 입체구조(conformation)를 포획 수지의 리간드에 맞추는 것을 보조하기 위해 3차원 방식으로 작용한다. 리간드와의 긴밀하게 근접했을 때, 생분자는 리간드-생분자 복합체를 제공하기 위해 이러한 상호작용 중 하나 또는 수개 또는 모두를 부여할 수 있다. 리간드와 생분자 간 거리 및 리간드의 극성 및 전기음성도가 이러한 상호작용의 강도를 결정할 것이다. 또한, 이러한 상호작용의 강도는 친화력(affinity force)으로 정의될 수 있다. 리간드와 생분자 간의 고 친화력은 증가된 안정성의 리간드-생분자 복합체를 구성한다 (US2009/0240033).
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 비-펩티드 기반 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 모방체를 포함한다. 상기 포획 수지는 항체, 변형된 항체 또는 항체 단편을 결합할 수 있다.
비-펩티드 기반 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 모방체가 염료 리간드 크로마토그래피에서 이용되었고, 이는 단백질을 정제하기 위해 아가로오스와 같은 고체 지지체에 고정화된 섬유 염료(textile dye)에 공유결합에 의해 결합하는 것을 이용하는 친화성 크로마토그래피의 모드이다. 이러한 염료는 단백질이 친화성을 갖는 천연 기질/단백질 리간드를 닮는다. 이러한 모드의 정제 및 분리는 종종 슈도-친화성 크로마토그래피(pseudo-affinity chromatography)로 지칭된다. 염료 리간드 친화성 크로마토그래피는 비-특이적이나, 이 기법은 다양한 단백질에 대한 광범위한 결합 범위를 위해 유리하다. 정제 기법의 진보는 단백질을 위한 경쟁적 억제제로 작용하는 변형된 염료를 정상 기질/리간드(normal substrate/ligand)로 이용했다 (P. Dean et al, J. Chromatography, 1979, 165, 3, 301- 319). Cibacron Blue 3GA, Procion Red H-3B, Procion Blue MX 3G, Procion Yellow H-A, 등과 같은 트리아지닐 기반 리간드가 일반적으로 이용되고 Blue Dextran과 같은 원래의 상용 염료의 순도, 누출(leakage) 및 독성의 우려를 해소한다 (Lowe et al, Trends Biotechnology, 1992, 10, 442-448). 트리아지닐 리간드가 알부민, 옥시도리덕타아제(oxidoreductase), 탈카르복실라아제(decarboxylase), 해당 효소(glycolytic enzyme), 뉴클레아제, 히드롤라아제(hydrolase), 리아제(lyase), 합성효소(synthetase) 및 트랜스퍼라아제의 정제를 위해 성공적으로 이용되었다 (N. Labrou, Methods Mol. Biol. 2002, 147, 129-139). 바이오미메틱(biomimetic) 염료 리간드 친화성 크로마토그래피의 한계는 생분자와 생분자간 친화성 강도가 상당히 가변적이고 다수의 경우에, 단백질에 대한 강한 친화성 강도를 제공하는 리간드가 또 다른 단백질에 적용될 수 없다는 것이다. 따라서, 목적 생분자에 대한 원하는 친화성을 갖는 적절한 합성 리간드를 확인하기 위해 대규모의 실증적인 스크리닝 프로세스를 수행하는 것이 종종 필수적이다.
결과적으로, 생분자로의 친화성 결합을 이루는 적절한 리간드의 체계화된 규명(structured elucidation)을 보조하기 위해, 지지체로부터 리간드의 엄격한 공간적 분리(rigid spatial separation)와 함께 리간드의 라이브러리가 도입되고, 스크리닝될 수 있는 구조체를 제공하기 위해 다가 스카폴드 모티프가 리간드의 구조로 결합되었다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 WO98/08603의 개시에서 기재된 구조에 따른 구조를 갖는다. WO98/08603의 포획 수지는 면역글로불린 정제를 촉진하기 위해 합성 모노 또는 비시클릭-방향족 또는 헤테로방향족 리간드를 포함한다. 포획 수지의 구조에 관한 WO98/08603의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. WO98/08603은 친화성 수지를 이용하여 세포 배양액 상층액, 혈청, 혈장, 또는 초유로부터 면역글로불린을 단리시키는 것을 기재한다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 WO2009/141384의 개시에서 청구된 구조에 따른 구조를 갖는다. WO2009/141384의 포획 수지는 하기 일반식을 갖는다:
Figure pct00004
식 중에서, R1, R2 및 R3은 15 내지 1000 g/mol의 분자량의 유기 모이어티를 나타내고, 총중량은 200 내지 2000 g/mol이며, R1, R2 및 R3 중 하나를 통한 아미드 결합을 통해 리간드가 고체상 지지체에 고정화된다. 포획 수지의 구조에 관한 WO2009/141384의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. WO2009/141384는 리간드가 단백질성 인자 VII 폴리펩티드에 결합된다는 것을 기재한다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 US20010045384의 개시에 기재된 구조에 따른 구조를 갖는다. US20010045384의 포획 수지는 이미노 디아세테이트 (IDA) 타입 스카폴드 상에 조립된 단백질 A 모방체 리간드-복합체이다. 포획 수지의 구조에 관한 US20010045384의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. IDA 스카폴드가 다가 트리아질 리간드-복합체를 제공하기 위해 트리아질 리간드에 의해 유도체화된다. US20010045384 내에 정의된 예시적 트리아질 리간드 복합체가 하기에 표시된다:
Figure pct00005
이 단백질 A 모방체는 IgG와 같은 면역글로불린을 위한 친화성 정제 매질로서의 유용성이 입증되었다. 리간드-복합체에서 인접한 트리아진 리간드의 분자 기하학적 구조가 IDA 스카폴드를 이용하는 장점인 것으로 주장되었다.
US20010045384에 정의된 또 다른 예시적 복합체가 하기에 표시된다:
Figure pct00006
이 분지형 다가 프탈산-리간드 스카폴드 단백질 A 모방체 리간드-복합체는 면역글로불린에 대한 친화성을 갖는 것으로 입증되었다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 WO9710887 및 US6117996의 개시에 기재된 구조에 따른 구조를 갖는다. 포획 수지의 구조에 관한 WO9710887 및 US6117996의 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. WO9710887 및 US6117996은 하기 타입의 트리아질-리간드 친화성 구조체를 개시한다:
Figure pct00007
상기에서, (A)는 선택적으로 리간드와 고체 지지체 사이에 배치된 스페이서 암(spacer arm)을 통해 다당류 고체 지지체로의 트리아진 스카폴드의 공유결합 부착 부위(covalent attachment point)를 나타내고, R1 및 Q는 선택적으로 단백질 물질에 대해 친화성을 갖는 치환된 리간드이다. 유기 모이어티가 단백질 A 모방체로 기재되고 단백질 물질의 정제를 위한 단백질 A에 대한 대안적인 정제 매질로 제안되고 예시된다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 WO2004/035199의 개시에 기재된 구조에 따른 구조를 갖는다. 포획 수지의 구조에 관한 WO2004/035199의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
WO2004/035199는 하기 일반식의 분지형 리간드 스카폴드(branched ligand scaffold)를 포함하는 단백질 L 모방체의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00008
식 중에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하고 각각 선택적으로 알킬 또는 아릴 리간드이며, R3은 선택적으로 스페이서 모티프가 부착된 고체 지지체이다. 트리아질-리간드 스카폴드는 면역글로불린 또는 그의 단편 항체 (fAb)의 친화성 결합을 위한 적합한 단백질 L 모방체 리간드로 개시되었다. 또한, 이러한 트리아질-리간드 스카폴드가 면역글로불린 κ 및 λ 경쇄에 대한 우선적인 결합 친화도를 갖는 것으로 개시된다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 US20110046353의 개시에 기재된 구조에 따른 구조를 갖는다. 포획 수지의 구조에 관한 US20110046353의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. US20110046353은 생산 배지(production media)로부터 단편 항체 (fAb)의 정제를 개시한다. 단편 항체는 단백질 A 매질 상에서 정제될 수 없다. fAb는 항원에 결합할 수 있는 결합 도메인을 갖는 것을 특징으로 하고 다수의 구체예에서 하나의 중쇄 (Vh), 또는 그의 기능성 단편, 및 하나의 경쇄 (Vl) 또는 그의 기능성 단편과 하나 이상의 다른 사슬로 구성되는 것으로 개시된다. 하기 식의 분지형 트리아질 스카폴드로 구성된, fAb에 대한 친화성 리간드가 정의된다:
Figure pct00009
식 중에서, Q는 선택적으로 스페이서 모티프를 갖는, 고체 지지체 매트릭스로의 부착 부위를 나타내고, 그룹 A 및 B는 수소 결합을 할 수 있는 하나 이상의 치환기, 바람직하게는, 하나 이상의 -OH, -SH 또는 -C02H로 치환된 페닐 또는 나프틸기이다. 상품명 MAbsorbent A1P 및 MAbsorbent A2P로 Prometic Biosciences로부터 상업적으로 입수가능한 지지된 친화성 리간드를 이용한 탁월한 결과가 보고되었다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00010
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일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00011
일 구체예에서, 상기 포획 수지의 리간드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00012
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일 구체예에서, 상기 포획 수지는 비드(bead)의 형태이다. 일 구체예에서, 상기 비드의 크기는 비드 직경의 측면에서 약 10 ㎛ 내지 약 2000 ㎛, 바람직하게는 약 50 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 및 가장 바람직하게는 약 75 ㎛ 내지 약 500 ㎛이다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 물질로 제조된 이동성 지지체(mobile support)를 포함한다: 폴리스티렌, 디비닐벤젠에 의해 저밀도로 가교된(lightly cross-linked) 폴리스티렌(PS-DVB)(0.1-5.0% DVB, 미세다공성(Microporous)으로 지칭됨), 디비닐벤젠에 의해 고도로 가교된 폴리스티렌 (PS-DVB)(5-60% DVB, 마크로다공성(Macroporous)으로 지칭됨), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 그라프트 폴리스티렌(Polyethylene glycol grafted polystyrene)(PS-PEG 공중합체), 폴리아크릴아미드, CPG(?ontrolled Pore Glass) 비드, 실리카, 규조토(Kieselguhr), 폴리프로필렌, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리에틸렌, 셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 기능성 모놀리스(Functionalised Monoliths), 기능성 섬유(Functionalised Fibres), 일체화 컬럼(monolithic column)(예를 들면, Nikzad et al, OPRD, 2007, 11, 458-462), 아가로오스, 세파로오스 및 자성에 의해 회수가능한 중합체 비드(Magnetic recoverable polymer bead).
바람직한 구체예에서, 상기 포획 수지는 아가로오스, 세파로오스 및 셀룰로오스로 구성된 군으로부터 선택된 물질로 제조된 이동성 지지체(mobile support)이다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 Fabsorbant™ F1P HF 수지와 같은 상업적으로 입수가능한 포획 수지이다.
일 구체예에서, 상기 포획 수지는 Mabsorbant™ 수지와 같은 상업적으로 입수가능한 포획 수지이다.
생분자:
일 구체예에서, 생분자는 살아있는 개체에서 자연적으로 발생한다.
대안적으로, 상기 생분자는 살아있는 개체에서 자연적으로 발생하는 화학 화합물의 유도체일 수 있다. 예를 들면, 상기 생분자는 그의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 방식으로 화학적으로 또는 유전적으로 변형된 생분자일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 생분자는 항체이다.
일 구체예에서, 상기 생분자는 변형된 항체, 예를 들면, 비-천연 아미노산을 포함하는 항체이다.
일 구체예에서, 상기 생분자는 항체 단편이다.
일 구체예에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
일 구체예에서, 상기 항체는 트라스투주맙이다.
일 구체예에서, 상기 항체, 변형된 항체, 또는 항체 단편은 면역글로불린 (Ig), 예를 들면, 5 종류의 인간 면역글로불린: IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 중 하나이다. 용어 항체는 단일클론 항체를 포함한다. 용어 항체는 다중클론 항체를 포함한다. 용어 항체는 항체 단편이 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 항체 단편을 포함한다. 항체는 인간 항체, 동물 항체, 마우스(murine) 항체, 인간화 항체 또는 인간 및 동물 서열을 포함하는 키메라 항체일 수 있다.
항체 구조의 기본 단위는 20,000 달톤 이상, 예를 들면, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질 복합체이다. 항체는 길이가 900 개 이상의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 예를 들면, 1400개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 항체는 비-공유결합(non-covalent association) 및 이-황화 결합에 의해 연결된, 두 개의 동일한 중쇄(H) 및 두 개의 동일한 경쇄(L)로 구성될 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 배치된 사슬간 이황화 브릿지(interchain disulfide bridge)를 갖는다. 각각의 중쇄는 약 50,000 달톤이다. 각각의 중쇄는 약 300개의 아미노산으로 이루어진 길이, 예를 들면, 약 450개의 아미노산으로 이루어진 길이이다. 항체는 중쇄만으로 이루어진 항체일 수 있다. 각 경쇄는 약 20,000 달톤이다. 각 경쇄는 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이, 예를 들면, 약 250개의 아미노산으로 이루어진 길이이다.
항체 생분자는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있고, 각 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 두 개의 영역으로 구성된다: 표적 항원의 결합에 관여되는 가변("V") 영역 및 면역계의 다른 성분들과 상호작용하는 불변("C") 영역. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3차원 공간에서 함께 합쳐져서 항원(예를 들면, 세포의 표면에 있는 수용체)을 결합하는 가변 영역을 형성한다.
일 구체예에서, 상기 생분자는 항체 단편이다. 항체 단편은 전장 항체의 부분, 일반적으로 그의 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다.
항체 단편의 예는 Fab, pFc', F(ab')2, 및 scFv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(linear antibody); 단쇄 항체 생분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성(multispecific) 항체를 포함한다. 항체 단편은 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이일 수 있고, 예를 들면, 항체 단편은 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280 또는 300개의 아미노산으로 이루어진 길이일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 생분자는 변형된 항체 또는 변형된 항체 단편이다. "변형된 항체(modified antibody)" 또는 "변형된 항체 단편(modified antibody fragment)"은 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 항체(parent antibody)와 다른 항체를 의미한다. 변형된 항체 또는 변형된 항체 단편은 야생형 항체 대비, 크기가 상이하거나 또는 글리코실화가 상이하나, 야생형 항체와 유사한 친화성을 갖는 항체를 의미한다.
약물:
용어 "약물(drug)"은 살아있는 개체의 신체 내로 투여되었을 때, 정상적인 신체 기능을 변화시키는 물질을 포함한다. 일반적으로, 약물은 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단에서 사용되거나 또는 달리 신체적 또는 정신적 웰-빙(well-being)을 강화시키기 위해 사용되는 물질이다. 일 구체예에서, 상기 약물은 세포독성 약물이다.
현재까지 선도적인 '울트라-효능(ultra-potency)' (약물) 후보는 하기 두 개의 카테고리 중 하나로 정의된다: (i) 튜불린 억제제; 및 (ii) DNA 상호작용제(DNA interacting agent). 튜불린 억제제는 튜불린 중합을 조절한다. DNA 상호작용제는 세포 DNA를 표적으로 한다.
일 구체예에서, 상기 약물은 튜불린(tubulin) 억제제이다.
일 구체예에서, 상기 튜불린 억제제는 (a) 오리스타틴(auristatin); 및 (b) 마이탄신(maytansine) 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 오리스타틴이다.
오리스타틴은 천연 화합물 돌라스타틴(Dolastatin)-10의 합성 유도체를 포함한다. 오리스타틴은 항신생물/세포증식억제 슈도펩티드(antineoplastic/cytostatic pseudopeptide)의 패밀리이다.
돌라스타틴은 천연 생합성 산물에서 확인된 4개의 특이적 아미노산(돌라바인(Dolavaine). 돌라이소류인(Dolaisoleuine), 돌라프로인(Dolaproine), 및 돌라페닌(Dolaphenine))의 포함 때문에 구조적으로 독특하다. 또한, 이 종류의 천연 산물은 Pettit 등 (US 4,978,744)에 의한 토탈 합성 연구에 의해 정의된 수개의 비대칭 중심(asymmetric centre)을 갖는다. 돌라이소류인(Dolaisoleuine) 및 돌라프로인 잔기가 항신생 활성을 위해 필요한 것으로 보인다는 것이 구조 활성 관계로부터 나타날 것이다(US 5,635,483 및 US 5,780,588).
일 구체예에서, 오리스타틴은 오리스타틴 E (AE); 모노메틸오리스타틴 E (MMAE); 오리스타틴 F (MMAF); vcMMAE; 및 vcMMAF로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 마이탄신 또는 마이탄신의 구조적 유사체이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 마이탄신이다.
마이탄신은 구조적으로 복잡한 항유사분열 폴리케티드(antimitotic polyketide)를 포함한다. 마이탄신은 종양 세포의 아폽토시스를 향해 선도하는 마이크로튜불린(microtubulin) 조립의 강력한 억제제이다.
일 구체예에서, 상기 마이탄신은 메르탄신(mertansine) (DM1); 및 DM3 또는 DM4와 같은 마이탄신의 구조적 유사체로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 약물은 메르탄신 (DM1)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 DNA 상호작용제이다. DNA 상호작용제는 '초-강력(ultra-potent)' (약물) 후보로 알려져 있다.
일 구체예에서, 상기 DNA 상호작용제는 (a) 칼리케아미신(calicheamicin), (b) 두오카르마이신 및 (c) 피롤로벤조디아제핀 (PBD)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 칼리케아미신이다.
칼리케아미신은 이중-가닥 DNA 손상(double-strand DNA break)을 유발하여, 세포 사망을 초래하는 강력한 세포독성제이다. 칼리케아미신은 천연 엔다이인(enediyne) 항생제이다(A. L. Smith et al, J. Med. Chem., 1996, 39, 11, 2103-21 17). 칼리케아미신은 토양 미생물 마이크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora)에서 발견되었다.
일 구체예에서, 칼리케아미신은 칼리케아미신 감마 1이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 두오카르마이신이다.
두오카르마이신은 DNA 듀플렉스의 소 홈(minor groove)에 서열-선택적으로 결합하고 아데닌의 N3을 알킬화하는 것에 의해 생물학적 효과를 발휘하는 강력한 항-종양 항생제이다 (D. Boger, Pure & Appl. Chem., 1994, 66, 4, 837-844).
일 구체예에서, 두오카르마이신은 두오카르마이신 A; 두오카르마이신 B1; 두오카르마이신 B2; 두오카르마이신 C1; 두오카르마이신 C2; 두오카르마이신 D; 두오카르마이신 SA; 시클로프로필벤조인돌 (CBI) 두오카르마이신; 센타나마이신(Centanamycin); 라켈마이신(Rachelmycin) (CC-1065); 아도젤레신(Adozelesin); 비젤레신 (Bizelesin); 및 카르젤레신 (Carzelesin)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 피롤로벤조디아제핀이다.
피롤로벤젠디아제핀(PBD)은 천연 항-종양 항생제의 종류이다. 피롤로벤젠디아제핀은 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 발견된다. PBD는 특이적으로 퓨린-구아닌-퓨린 단위에서 소홈(minor groove)에서 DNA에 공유결합에 의해 결합하는 것에 의해 항-종양 활성을 발휘한다. 그들은 형태 때문에 아민 결합(aminal linkage)을 통해 구아민(guamine)의 N2에 삽입되고, DNA 헬릭스에 아주 적은 붕괴(minimal disruption)를 유발한다. DNA-PBD 부가물의 형성이 핵산 합성을 억제하고 DNA 헬릭스 중 절제-의존적(excision-dependent) 단일 및 이중가닥 손상을 유발하는 것으로 사료된다. 합성 유도체로서, 두 개의 PBD 유닛의 유연성 있는 폴리메틸렌 테더(tether)를 통한 연결(joining)은 PBD 이량체가 대향하는 DNA 가닥(opposite DNA strands)을 가교시킬 수 있게 하여, 고도로 치명적인 병변을 생성한다.
일 구체예에서, 상기 약물은 유연성 있는 폴리메틸렌 테더를 통해 함께 연결된 두 개의 피롤로벤젠디아제핀 단위의 합성 유도체이다.
일 구체예에서, 상기 피롤로벤조디아제핀은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 안트라마이신 (및 그의 이량체); 마제트라마이신(Mazethramycin) (및 그의 이량체); 토마이마이신(Tomaymycin) (및 그의 이량체); 프로트라카르신(Prothracarcin) (및 그의 이량체); 키카마이신(Chicamycin) (및 그의 이량체); 네오트라마이신(Neothramycin) A (및 그의 이량체); 네오트라마이신 B (및 그의 이량체); DC-81 (및 그의 이량체); 시비로마이신(Sibiromycin) (및 그의 이량체); 포로트라마이신(Porothramycin) A (및 그의 이량체); 포로트라마이신 B (및 그의 이량체); 시바노마이신(Sibanomycin) (및 그의 이량체); 아베이마이신(Abbeymycin) (및 그의 이량체); SG2000; 및 SG2285.
일 구체예에서, 상기 약물은 알킬화를 통해 DNA 사슬간 가교를 표적화하는 약물이다. 알킬화를 통해 DNA 사슬간 가교를 표적화하는 약물은: DNA 표적화 머스타드; 구아닌-특이적 알킬화제; 및 아데닌-특이적 알킬화제로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 DNA 표적화 머스타드(DNA targeted mustard)이다. 예를 들면, 상기 DNA 표적화 머스타드는 올리고피롤(oligopyrrole); 올리고이미다졸; 비스-(벤즈이미다졸) 담체; 폴리벤즈아미드 담체; 및 9-아닐리노아크리딘-4-카르복사미드 담체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약물은 네트로프신(Netropsin); 디스타마이신(Distamycin); 렉시트로프신(Lexitropsin); 탈리무스틴(Tallimustine); 디브로모탈리무스틴; PNU 157977; 및 MEN 10710으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 비스-(벤즈이미다졸) 담체이다. 바람직하게는, 상기 약물은 Hoechst 33258이다.
구아닌-특이적 알킬화제는 특정한 뉴클레오시드 위치에서 반응하는 높은 위치특이성 (regiospecific) 알킬화제이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 G-N2 알킬화제(alkylators); A-N3 알킬화제; 미토마이신(mitomycin); 카르메티졸 유사체(carmethizole analogue); 엑테이나시딘 유사체(ecteinascidin analogue)로 구성된 군으로부터 선택된 구아닌-특이적 알킬화제이다.
일 구체예에서, 상기 미토마이신은 미토마이신 A; 미토마이신 C; 포르피로마이신(Porfiromycin); 및 KW-2149로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 카르메티졸 유사체는 비스-(히드록시메틸)피롤리지딘; 및 NSC 602668로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 엑테이나시딘 유사체는 엑테이나시딘 743이다.
아데닌-특이적 알킬화제는 폴리피리미딘 서열 중 아데닌의 N3에서 반응하는 위치특이적 및 서열-특이적 소홈 알킬화제이다.
시클로프로파인돌론(cyclopropaindolone) 및 두오카마이신(duocamycin)은 아데닌-특이적 알킬화제로 정의될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약물은 시클로프로파인돌론 유사체이다. 바람직하게는, 상기 약물은 아도젤레신(adozelesin) 및 카르젤레신(carzelesin)으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 벤즈인돌론(benz[e]indolone)이다. 바람직하게는, 상기 약물은 CBI-TMI; 및 이소-CBI로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 비젤레신(bizelesin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 해양 항종양제(Marine Antitumor Drug)이다. 해양 항종양제는 항종양제 개발 분야에서 발전하고 있는 분야이다 (I. Bhatnagaref a/,Mar. Drugs 2010, 8, P2702-2720 and T. L. Simmons et al, Mol. Cancer Ther. 2005, 4(2), P333-342). 해면동물, 해면동물-미생물 공생 연합(sponge-microbe symbiotic association), 고르곤 산호(gorgonian), 방사선균(actinomycete), 및 연산호를 포함한 해양 개체들이 잠재적인 항암제를 위해 널리 탐구되고 있다.
일 구체예에서, 상기 약물은 시타라빈(Cytarabine), Ara-C; 트라벡테딘 (ET- 743); 및 에리불린 메실레이트(Eribulin Mesylate)로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 에리불린 메실레이트는 (E7389); 소블리도핀(Soblidotin) (TZT 1027); 수쿠알라민 락테이트(Squalamine lactate); 세마도틴 플리나불린(Cemadotin Plinabulin) (NPI-2358); 플리티데프신(Plitidepsin); 엘리시데프신(Elisidepsin); 잘리프시스(Zalypsis); 타시도틴(Tasidotin), 신타도틴(Synthadotin); (ILX-651); 디스코데르몰리드(Discodermolide); HT1286; LAF389; 카할랄리드(Kahalalide) F; KRN7000; 브리오스타틴(Bryostatin) 1; 헤미아스테를린(Hemiasterlin) (E7974); 마리조밉(Marizomib); 살리노스포라미드(Salinosporamide) A; NPI-0052; LY355703; CRYPTO 52; 데프시펩티드(Depsipeptide) (NSC630176); 엑테이나시딘(Ecteinascidin) 743; 신타도틴(Synthadotin); 카할랄리드(Kahalalide) F; 스쿠알라민; 데히드로디뎀닌(Dehydrodidemnin) B; 디뎀닌(Didemnin) B; 세마도틴(Cemadotin); 소블리도틴(Soblidotin); E7389; NVP-LAQ824; 디스코데르몰리드(Discodermolide); HTI-286; LAF-389; KRN-7000 (아젤라스핀(Agelasphin) 유도체); 쿠라신(Curacin) A; DMMC; 살리노스포라미드(Salinosporamide) A; 라울리말리드(Laulimalide); 비틸레부아미드(Vitilevuamide); 디아존아미드(Diazonamide); 엘레우테로빈(Eleutherobin); 사르코딕티인(Sarcodictyin); 펠로루시드(Peloruside) A; 살리실리할이미드(Salicylihalimide) A 및 B; 티오코랄린(Thiocoraline); 아시디데민(Ascididemin); 바리올린(Variolin); 라멜라린(Lamellarin) D; 딕티오덴드린(Dictyodendrin); ES-285 (스피술로신(Spisulosine)); 및 할리콘드린(Halichondrin) B로부터 선택된다.
하기 약물도 또한 본 발명에 포함된다: 아마톡신(Amatoxin) (α-아마니틴)-아마니타(Amanita) 속의 담자균(basidomycete), 예를 들면, Green Deathcap 버섯에 의해 생산된 비시클릭 옥타펩티드; 튜불리신(Tubulysin); 시토리신(Cytolysin); 돌라벨라닌(dolabellanin); 에포틸론(Epothilone) A, B, C, D, E, F.
에포틸론은 비-탁산(non-taxane) 튜불린 중합제(polymerisation agent)의 클래스를 구성하고 믹소박테리움 소랑기움셀룰로숨(myxobacterium Sorangiumcellulosum)의 자연 발효에 의해 수득된다. 이러한 모이어티는 미세소관(microtubule)의 안정화와 연관되고 G2/M 이행(transition)에서 유사분열 정지(mitotic arrest)를 초래하는 강력한 세포독성 활성을 갖는다. 에포틸론은 일련의 암세포주(a panel of cancer cell lines)에 대해 강력한 세포독성을 보였고 종종 파클리탁셀보다 더 강한 효능을 보였다 (X. Pivot et al, European Oncology, 2008;4(2), P42-45).
일 구체예에서, 상기 약물은 아마톡신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 튜불리신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 시토리신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 돌라벨라닌이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 에포틸론이다.
하기 약물들도 또한 본 발명에 의해 포함된다. 일 구체예에서, 상기 약물은 독소루비신; 에피루비신; 에소루비신; 데토루비신; 모르폴리노-독소루비신; 메토트렉세이트; 메토프테린; 블레오마이신; 디클로로메토트렉세이트; 5-플루오로우라실; 시토신-β-D-아라비노푸라노시드; 탁솔; 안구이딘; 멜팔란; 빈블라스틴; 포몹신 A; 리보솜-불활성화 단백질(RIP); 다우노루비신; 빈카 알칼로이드; 이다루비신; 멜팔란; 시스-플라틴; 리신(Ricin); 사포린; 안트라사이클린; 인돌리노-벤조디아제핀; 6-머캅토퓨린; 액티노마이신; 류로신; 류로시데인; 카르미노마이신; 아미노프테린; 탈리소마이신; 포도필로톡신; 에토포시드; 헤어핀 폴리아미드; 에토포시드 포스페이트; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 빈데신; 탁소테르 레티노산; N8-아세틸 스페르미딘; 캄포테신; 에스페라마이신; 및 엔-다이인으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 약물은 독소루비신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 에피루비신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 에소루비신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 데토루비신(Detorubicin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 모르폴리노-독소루비신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 메토트렉세이트이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 메토프테린(Methopterin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 블레오마이신이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 디클로로메토트렉세이트이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 5-플루오로우라실이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 시토신-β-D-아라비노푸라노시드(Cytosine-β-D-arabinofuranoside)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 탁솔(Taxol)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 안구이딘(Anguidine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 멜팔란이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 빈블라스틴(Vinblastine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 포몹신 A(Phomopsin A)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 리보솜-불활성화 단백질(Ribosome-inactivating protein: RIP)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 다우노루비신(Daunorubicin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 빈카 알칼로이드(Vinca alkaloid)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 이다루비신(Idarubicin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 멜팔란(Melphalan)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 시스플라틴(Cis-platin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 리신(Ricin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 사포린(Saporin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 안트라사이클린(Anthracycline)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 인돌리노-벤조디아제핀(Indolino-benzodiazepine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 6-머캅토퓨린(6-Mercaptopurine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 액티노마이신(Actinomycin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 류로신(Leurosine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 류로시데인(Leurosideine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 카르미노마이신(Carminomycin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 아미노프테린(Aminopterin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 탈리소마이신(Tallysomycin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 포도필로톡신(Podophyllotoxin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 에토포시드(Etoposide)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 헤어핀 폴리아미드(Hairpin polyamide)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 에토포시드 포스페이트(Etoposide phosphate)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 빈블라스틴(Vinblastine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 빈크리스틴(Vincristine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 빈데신(Vindesine)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 탁소테르 레티노산(Taxotere retinoic acid)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 N8-아세틸 스페르미딘(N8-acetyl spermidine)이다
일 구체예에서, 상기 약물은 캄포테신(Camptothecin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 에스페라마이신(Esperamicin)이다.
일 구체예에서, 상기 약물은 엔-다이인(Ene-diyne)이다.
생분자 -약물- 컨쥬게이트 :
본 발명에 따라, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 생분자-약물-컨쥬게이트가 제공된다.
상세한 설명
본 명세서의 설명 및 청구항에서, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "함유한다(contain)" 및 이들의 변형은 "포함하나, 그에 한정되지 않는다(including but not limited to)"를 의미하고, 이들은 다른 모이어티, 첨가제, 성분, 정수 또는 단계들을 배제하도록 의도되지 않는다(배제하지 않는다). 본 명세서의 설명 및 청구항에서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수는 복수를 포함한다. 구체적으로, 부정관사가 이용된 경우, 명세서는 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 및 복수를 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특정한 양태, 구체예 또는 실시예와 함께 기술된 특징, 정수, 특성, 화합물, 화학적 모이어티 또는 작용기는 양립될 수 없는 경우가 아니면, 본 명세서에 기재된 다른 양태, 구체예, 또는 실시예에 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. (수반된 청구항, 요약, 및 도면을 포함한) 본 명세서에 개시된 모든 특징 및/또는 개시된 방법 또는 공정의 모든 단계들은 적어도 그러한 특징 및/또는 단계들 중 일부가 상호 간에 배타적인 것인 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 발명은 전술된 구체예의 세부사항에 한정되지 않는다. 본 발명은 (수반된 청구항, 요약, 및 도면을 포함한) 본 명세서에 개시된 특징의 신규한 것 또는 신규한 조합, 또는 개시된 방법 또는 공정의 단계들의 신규한 것 또는 신규한 조합까지 확장된다.
본 출원과 관련하여 본 명세서와 동시에 또는 이전에 제출되고, 본 명세서의 공중의 검열에 개방된 모든 논문 및 문헌에 독자의 주의가 유도되고 모든 이러한 논문 및 문헌의 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
하기에서 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구체예가 더 설명된다:
도 1 - 실시예 2에 의해 제조된 고체상 허셉틴 vcMMAE 컨쥬게이트의 HIC 분석. 하부부터 상부까지의 트레이스(trace) 허셉틴-vcE1 .3, 허셉틴-vcE2 .4, 허셉틴-vcE3.4, 허셉틴-vcE4 .4. RT 4.3 분 - 미접합(unconjugated) 허셉틴, RT 5.9 분 - 약물 항체 비 2, RT 7.5 분 - 약물 항체 비 4, RT 8.9 분 - 약물 항체 비 6 및 RT 9.8 분 - 약물 항체 비 8.
도 2 - 실시예 2에 의해 제조된 고체상 허셉틴 vcMMAE 컨쥬게이트의 SEC 분석. 하부부터 상부 허셉틴까지의 트레이스, 허셉틴-vcE1 .3, 허셉틴-vcE2 .4, 허셉틴-vcE3.4, 허셉틴-vcE4 .4.
도 3 - 크로마토그래피 흐름 고체상 허셉틴 vcMMAE 컨쥬게이트의 HIC 분석. 용액상 허셉틴 vcMMAE 컨쥬게이트의 HIC 분석 (상부 패널), 컬럼 A 제조 허셉틴 vcMMAE (중간 패널), 컬럼 B 제조 vcMMAE (하부 패널).
도 4 - 고체상 허셉틴 vcMMAE 컨쥬게이트의 SEC 분석. 용액상 허셉틴 vcMMAE 컨쥬게이트 (상부 패널), 컬럼 A 제조 허셉틴 vcMMAE (중간 패널), 컬럼 B 제조 vcMMAE (하부 패널)의 SEC 분석.
실시예에서 하기 기법이 이용된다.
크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography: SEC)
TOSOH Bioscience TSK- Gel® GW3000SWxl 컬럼을 이용하여 0.25 mM 염화칼륨 및 10% IPA를 포함하는 0.2M 인산칼륨 pH 6.95에서 0.5 ml/분의 유속으로 크기 배제 크로마토그래피를 수행했다. 280 nm에서 용리된 피크 영역 흡광도의 통합에 의해 컨쥬게이트의 응집 상태를 결정했다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography: HIC)
0.8 ml/분의 유속으로 12분에 걸쳐 완충액 A 대 B 0 내지 100%의 선형 구배로 TOSOH TSK- Gel® 부틸 NPR 컬럼을 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행했다. 완충액 A는 25 mM 인산나트륨을 포함하는 1.5 M 암모늄 아세테이트 pH 6.95이고, 완충액 B는 25% IPA를 포함하는 25 mM 인산나트륨 pH 6.95이다.
280 nm에서 용리된 피크 영역 흡광도의 통합에 의해 컨쥬게이트의 항체 약물 비(antibody drug ratio of the conjugate)를 결정했다.
역상 크로마토그래피 (RP- PLRP )
0.25 ml/분의 유속으로, 31분에 걸쳐 25 내지 95%의 완충액 A 대 완충액 B의 구배로 Agilent PLRP-S PL1912-1502 컬럼을 이용하여 역상(polymer labs PLRP) 크로마토그래피를 수행했다. 완충액 A는 0.05% TFA를 포함하는 물이고, 완충액 B는 0.04% TFA를 포함하는 ACN이다. 시료를 주입당 15분 동안 37℃에서 50 mM DTT를 함유하는 20 mM 소디움 보레이트 pH 8.4로 환원시켰다. 280 nm에서 용리된 피크 영역 흡광도의 통합에 의해 컨쥬게이트의 항체 약물 비를 결정했다.
UV 분석에 의한 약물 대 항체 비(Drug to Antibody Ratio by UV Analysis)
UV 분석을 위해, 시료를 1 cm의 경로 길이(path length)를 갖는 400 ㎕ 쿼츠 큐벳(quartz cuvette)에 첨가하고 Thermo scientific multiskan GO 분광분석기에서 252 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정했다. 이 파장에서 허셉틴 및 DM1에 대한 공개된 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)에 근거하여 약물 항체 비를 계산하기 위해 252 nm 및 280 nm 데이터를 이용했다.
실시예 1 - 고체상 항체 약물 컨쥬게이트 스크리닝
이 실시예는 공정 개발의 필요성을 없애는 일반적인 공정으로, 고정화된 항체가 정의된 약물 로딩(drug loading)에 접합될 수 있다는 것을 보여준다. 이 접근방법은 96 웰 플레이트 고효율 스크리닝(high throughput screening)으로 개조하기에 적합하다.
수지 슬러리와 항체 용액을 60분 동안 조심스럽게 혼합하는 것에 의해 허셉틴 (PBS 중 1 mg/ml의 0.5, pH 7.4)을 PBS 중에 평형화시킨 Fabsorbant™ F1P HF 수지 100㎕(안정된(settled) 수지 부피)에 결합시켰다. 상기 수지를 PBS, 2mM EDTA로 세척하는 것에 의해 미결합 허셉틴을 제거하고, 수지를 최종적으로 0.5ml PBS/EDTA에 재현탁시켰다.
트리스-(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드를 2 mM의 최종 농도까지 첨가하고, 현탁액을 주변 온도에서 18시간 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 결합된 허셉틴 (Her)을 환원시켰다. 수지를 PBS/EDTA로 세척하여 미결합 TCEP를 제거하고 475㎕ PBS/EDTA에 재현탁시켰다.
vcMMAE (vcE), N-에틸 말레이미드 (NEM) 및 디메틸아세트아미드 (DMA)를 첨가하여 1 mM 말레이미드 (총 vcE 및 NEM) 및 5%v/v DMA의 최종 농도를 달성시켰다. vcE 대 NEM의 비를 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 및 0:100으로 변화시켰다. 수지 현탁액을 주변 온도에서 60분 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 환원된 항체를 접합시켰다. 수지를 순차적으로 PBS/EDTA/5%v/v DMA 및 0.1 M 글리신 pH 5.0으로 세척했다.
컨쥬게이트를 0.1 M 글리신 pH 3.0으로 용리시켰다. 용리된 컨쥬게이트를 1 M 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 (TRIS)의 2% v/v로 수집하여 중화시켰다.
그 후, 중화된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피(Polymer Labs, PLRP)로 분석하여 응집체 비율(percentage aggregate) 및 평균 약물 로딩(average drug loading)을 결정했다.
결과가 하기 표 1에 요약된다:
결합된 Her의 질량(mass)
(mg/ml 수지)		 vcE:NEM의 비 % 응집체 약물 대 항체 비 (DAR)
10 100:0 9.72 7.9
10 75:25 4.69 5.7
10 50:50 3.08 4.4
10 25:75 0.80 2.8
10 0:100 0.42 0.0
최고 약물 로딩 컨쥬게이트(highest drug loaded conjugate)의 응집체 함량도 항원 결합 및 세포 기반 분석에서 추가적인 평가를 위해 허용가능하다. PBS/ETDA/5%v/v DMA 및 그 후 0.1 M 글리신 pH 5.0에 의한 순차적 세척은 최종 컨쥬게이트에서 미반응 약물 링커, NEM 및 용매를 제거하고, 생체분석(bioassay) 데이터의 해석을 손상시키지 않는다. Fabsorbant™ F1P HF 수지를 이용하여, 이 접근방식은 후속 항체 약물 접합 개발을 위한 클론 선택의 일부로서, 온전한 항체 및 Fab 단편 항체를 함유하는 조직 배양액 상층액으로부터 ADC를 생산하기 위한 마우스 단일클론의 패널을 스크리닝하기 위해 유용하다.
실시예 2 - 배치 모드(batch mode)의 고체상 부분적 TCEP 환원
이 실시예는 고정화된 항체가 사슬간 이황화 결합의 환원 및 뒤이은 vcMMAE와의 접합에 의해 정의된 약물 로딩으로 접합될 수 있고 용액에서 제조된 동일한 컨쥬게이트 대비 생성물 품질이 개선된다는 것을 보여준다.
수지 슬러리와 항체 용액을 30분 동안 조심스럽게 혼합하는 것에 의해 허셉틴 (PBS 중 2 mg/ml의 0.5 ml, pH 7.4)을 PBS 중에 평형화시킨 Fabsorbant™ F1P HF 수지 100㎕(안정된 수지 부피)에 결합시켰다. 상기 수지를 PBS, 2mM EDTA로 세척하는 것에 의해 미결합 허셉틴을 제거하고, 수지를 최종적으로 0.5ml PBS/EDTA에 재현탁시켰다.
트리스-(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드를 허셉틴의 몰당 1 내지 4 몰의 TCEP의 비까지 첨가하고, 현탁액을 주변 온도에서 2시간 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 결합된 허셉틴을 환원시켰다.
vcMMAE 및 디메틸아세트아미드 (DMA)를 첨가하여 허셉틴의 몰당 2.5 내지 10 몰의 vcMMAE 및 5%v/v DMA가 되게 하고, 주변 온도에서 30분 동안 접합을 진행시켰다. N-아세틸 시스테인 (NAC)을 첨가하여 미반응 vcMMAE를 퀀칭(quench)시키고 20분 동안 반응시킨 후, 수지를 PBS/EDTA/5%v/v DMA 및 0.1 M 글리신 pH 5.0으로 순차적으로 세척했다.
컨쥬게이트를 0.1 M 글리신 pH 3.0으로 용리시켰다. 용리된 컨쥬게이트를 1 M 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 (TRIS)의 2% v/v로 수집하여 중화시켰다.
일치되는(matched) DAR을 갖는, 동등한 일련의 허셉틴과 vcMMAE의 용액상 컨쥬게이트를 제조하고 분석하여 고체상 컨쥬게이트 품질과 용액상 컨쥬게이트 품질의 비교를 제공했다.
그 후, 용리된 컨쥬게이트를 소수성 상호작용 크로마토그래피 (도 1) 및 크기 배제 크로마토그래피 (도 2)에 의해 분석하여 응집체 비율 및 평균 약물 로딩을 결정했다.
결과가 하기 표 2에 요약된다:
DAR 용액
% 응집체		 고체
% 응집체
0 (허셉틴) 0.2
1.3 0.4 0.3
2.4 0.7 0.3
3.4 1.1 0.3
4.4 1.5 0.3
데이터는 고체 지지체 상에서, TCEP 대 항체 비와 최종 약물 로딩 간의 관계가 선형적이라는 것을 보여준다. 또한, 용액에서 제조된 동등량의 컨쥬게이트와 비교할 때, 고체상 컨쥬게이트는 더 낮은 응집 비율을 보인다.
실시예 3 - 컬럼에서의 고체상 부분적 TCEP 환원
이 실시예는 고정화된 항체 접합이 탁월한 재현성으로 크로마토그래피 흐름 공정(chromatographic flow process)로 개조될 수 있다는 것을 보여준다.
허셉틴 (2mg/ml PBS 5 ml, pH 7.4)을 120cm/hr로 로딩하는 것에 의해 Fabsorbant™ F1P HF 수지 (이전에 PBS로 평형화시킴)의 1 ml 컬럼에 결합시켰다. 수지를 PBS, 2mM EDTA로 평형화시키는 것에 의해 결합된 허셉틴을 환원을 위해 준비시켰다.
마이크로 정량 펌프(peristaltic pump)를 사용하여, 컬럼을 통한 작은 용량 PBS/EDTA 재순환 루프(recirculation loop)(컬럼 외부에 약 200 ㎕)를 생성하고, 상기 컬럼에 허셉틴의 몰당 2 TCEP의 몰비를 생성하기 위해 TCEP를 첨가하였다. 이는 허셉틴을 환원시키기 위해 주변 온도에서 120분 동안 재순환될 수 있게 하였다.
저장조(reservoir) 및 컬럼의 내용물을 플러싱시켜 제거하고 PBS/EDTA/5%v/v DMA로 대체하고, 여기에 vcMMAE를 첨가하여 환원된 허셉틴의 몰당 5 vcMMAE의 몰비를 생성시켰다. 이는 주변 온도에서 60분 동안 재순환시켜 환원된 허셉틴을 컨쥬게이시션시킬 수 있게 하였다.
N-아세틸 시스테인 (NAC)을 첨가하여 미반응 vcMMAE를 퀀칭시키고 20분 동안 반응시킨 후, 수지를 PBS/EDTA/5%v/v DMA 및 0.1 M 글리신 pH 5.0으로 순차적으로 세척했다.
컨쥬게이트를 0.1 M 글리신 pH 3.0으로 용리시켰다. 용리된 컨쥬게이트를 1 M 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 (TRIS)의 2% v/v로 수집하여 중화시켰다.
제2 컬럼/오퍼레이터를 이용하여 독립적인 제2 실험으로 공정을 반복했다.
그 후, 용리된 컨쥬게이트를 소수성 상호작용 크로마토그래피 (도 3) 및 크기 배제 크로마토그래피 (도 4)에 의해 분석하여 응집체 비율 및 평균 약물 로딩을 결정했다.
결과가 하기 표 3에 요약된다:
제조 방법 DAR % 응집체
허셉틴 0 0.2
용액상 2.4 0.6
컬럼 A 2.4 0.3
컬럼 B 2.4 0.3
데이터는 크로마토그래피 흐름 모드로 개조되었을 때, vcMMAE의 허셉틴으로의 접합이 표준 약물 로딩 및 응집체 생성에 대해 일관된다는 것을 보여준다. TCEP 대 항체 비를 일치(match)시키는 경우, 배치 모드 및 크로마토그래피 모드에서 달성된 DAR이 동일하다.
실시예 4 - 배치 모드의 라이신 곁사슬의 SMCC 활성화를 통한 고체상 허셉틴과 DM1 의 접합
이 실시예는 SMCC에 의한 변형 및 뒤이은 DM1과의 접합에 의해 고정화된 항체가 라이신의 곁사슬에 접합될 수 있고 생성물 품질이 용액에서 제조된 동일한 컨쥬게이트 대비 개선된다는 것을 보여준다.
수지 슬러리와 항체 용액을 30분 동안 조심스럽게 혼합하는 것에 의해 PBS로 평형화시킨 Fabsorbant™ F1P HF 수지 100 ㎕ (침전시킨 수지 부피)에 허셉틴 (4mg/ml PBS 0.5 ml, pH 7.4)을 결합시켰다. 수지를 PBS에 의해 세척하고, 뒤이어 '변형 완충액(Modification Buffer)' (50mM NaPi, 150mM NaCl, 2mM EDTA pH6.7)에 의해 세척하여 미결합 허셉틴을 제거하고 수지를 최종적으로 5%v/v DMA를 함유한 변형 완충액에 재현탁시켰다.
숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥실-1-카르복실레이트 (SMCC)를 허셉틴의 몰당 5 내지 20 몰의 SMCC의 비로 첨가하고 현탁액을 주변 온도에서 4시간 동안 인큐베이션시키는 것에 의해 결합된 허셉틴을 변형시켰다. 수지를 PBS/5%v/v DMA로 세척하고 뒤이어 '접합 완충액(Conjugation Buffer)' (35mM 소디움 시트레이트, 150mM NaCl, 2mM EDTA pH 5.0)으로 세척하여 미반응 SMCC를 제거하고, 수지를 최종적으로 3%v/v DMA를 함유한 접합 완충액에 재현탁시켰다.
DM1을 첨가하여 허셉틴 몰당 15 몰의 DM1이 되게 하고 주변 온도에서 접합을 18시간 동안 진행시켰다. 그 후, 수지를 PBS/EDTA/5%v/v DMA 및 0.1 M 글리신 pH 5.0으로 순차적으로 세척했다.
컨쥬게이트를 0.1 M 글리신 pH 3.0으로 용리시켰다. 용리된 컨쥬게이트를 1 M 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 (TRIS)의 2% v/v로 수집하여 중화시켰다.
허셉틴의 몰당 7.6 몰의 SMCC 및 뒤이어 5 몰의 DM1과 반응시키는 것에 의해 동등한, 일치된 DAR을 갖는 DM1과 허셉틴의 용액상 컨쥬게이트를 제조하고, 분석하여 고체상 컨쥬게이트와 용액상 컨쥬게이트의 품질 비교를 제공했다. 변형 및 접합 반응 동안 허셉틴의 농도는 각각 10 및 5mg/ml였다.
그 후 용리된 컨쥬게이트를 크기 배제 크로마토그래피 및 UV에 의해 분석하여 응집체 비율 및 평균 약물 로딩을 결정하였다.
결과가 하기 표 4에 요약된다:
제조 방법 접합 동안 [허셉틴] mg/ml DAR % 응집체
용액 5 3.6 3.2

고체상
20

 1.7 1.8
2.6 2.8
3.5 3.0
4.8 3.5
데이터는 고체 지지체 상에서 라이신 곁사슬 접합이 가능하고 SMCC 대 항체 비율과 최종 약물 로딩(drug loading) 간의 관계가 선형적이라는 것을 보여준다.
또한, 용액에서 제조된 동등한 컨쥬게이트와 비교할 때, 고체상 컨쥬게이트는 접합 반응 동안 단백질 농도의 4배 증가에도 불구하고 동등한 비율의 응집(aggregation)을 보인다.

Claims (31)

  1. 생분자-약물-컨쥬게이트를 합성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 생분자를 고정화시키기에 적합한 조건 하에 생분자를 포획 수지(capture resin)와 접촉시켜 고정화된 생분자를 제공하는 단계로서; 상기 생분자는 항체, 변형된 항체 또는 항체 단편이고; 상기 포획 수지는 (1) 아미노산-기반을 포함한, 비-펩티드 기반(non-peptide based) 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체(mimetic), (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된 생분자 포획 모이어티를 포함하는 것인 단계;
    (ii) 선택적으로, 상기 고정화된 생분자를 화학 변형제(chemical modification agent) 또는 활성화제와 접촉시켜 화학적으로 변형되거나 또는 활성화되고, 고정화된 생분자를 제공하는 단계;
    (iii) 상기 고정화된 생분자 또는 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 접촉시켜, 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 형성시키는 단계;
    (iv) 상기 생분자-약물-컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (i)은 상기 생분자를 상기 포획 수지와 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 인큐베이션은 약 10 내지 약 40℃의 온도, 선택적으로 약 15 내지 약 37℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  4. 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서, 상기 인큐베이션은 약 10분 내지 약 18시간 동안 수행되는 것인 방법.
  5. 청구항 2 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 완충액, 선택적으로 인산염 완충 염수(PBS)에서 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 2 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 약 5 내지 약 8의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  7. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 후에, 상기 포획 수지에 고정화되지 않은 생분자를 제거하기 위해 상기 고정화된 분자를 세척하는 것인 방법.
  8. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 상기 생분자를 환원시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 생분자를 환원제, 예를 들면, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 머셉토에틸아민(merceptoethylamine) 또는 기타 적합한 환원제와 접촉시키는 것에 의해 상기 생분자를 환원시키는 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 상기 생분자를 가교제 모이어티(crosslinker moiety)와 접촉시키는 것을 포함하고, 선택적으로, 상기 가교제 모이어티는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC)인 것인 방법.
  11. 청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 인산염 완충 염수(PBS)와 같은 완충액에서 수행되는 것인 방법.
  12. 청구항 8 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 약 7 내지 약 8의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 8 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 EDTA와 같은, 킬레이팅제의 존재하에 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 8 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 상기 생분자를 약 6시간 내지 약 18시간 동안 상기 환원제와 인큐베이션시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 후에, 변형제/활성화제를 제거하기 위해 상기 활성화되고, 고정화된 생분자를 세척하는 것인 방법.
  16. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)은 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 완충액 중에서 약물 성분과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)은 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 약 7 내지 약 8, 바람직하게는 약 7.4의 pH에서 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)은 EDTA와 같은, 킬레이팅제의 존재하에 수행되는 것인 방법.
  19. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)은 상기 화학적으로 변형되거나, 활성화되고, 고정화된 생분자를 약물 성분과 약 6시간 내지 약 18시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii) 후에, 미반응(unreacted) 약물 성분을 제거하기 위해 상기 고정화된 생분자-약물-컨쥬게이트를 세척하는 것인 방법.
  21. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)는 상기 지지체-생분자 결합을 깨기 위해 pH를 변화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 pH는 약 pH 5 미만, 선택적으로 약 pH 3 미만까지 감소되는 것인 방법.
  23. 청구항 21 또는 22에 있어서, 상기 컨쥬게이트를 상기 포획 수지로부터 방출시키는 단계 후에, 용리된 생분자-약물-컨쥬게이트를 중화시키고, 선택적으로, 상기 컨쥬게이트를 1M 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 (TRIS)의 2%v/v에 포획시키는 것인 방법.
  24. (i) (1) 비-펩티드 기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체(mimetic), (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된, 항체, 변형된 항체 또는 항체 단편 포획 모이어티를 포함하는 포획 수지; 및
    (ii) 화학 변형제 또는 활성화제를 포함하는 혼합물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 포획 수지는 그의 표면에 고정화된 항체, 변형된 항체, 또는 항체 단편을 포함하는 것인 혼합물.
  26. (1) 비-펩티드 기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체(mimetic), (2) 펩티드-기반 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 L 모방체, (3) 뉴클레오티드 결합 부위 포획 모이어티, 및 (4) 당단백질 포획 모이어티로 구성된 군으로부터 선택된 항체, 변형된 항체, 또는 항체 단편 포획 모이어티를 포함하는 포획 수지의 생분자-약물-컨쥬게이트의 합성에서의 용도.
  27. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 수지는 비-단백질성 포획 수지(non-proteinaceous capture resin)인 것인 방법, 혼합물, 또는 용도.
  28. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 수지의 생분자 포획 모이어티는 약 1000 Da 이하의 분자량을 갖는 것인 방법, 혼합물, 또는 용도.
  29. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 수지의 리간드는 하기 구조를 갖는 것인 방법, 혼합물, 또는 용도:
    Figure pct00013
    .
  30. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생분자는 항체이고, 선택적으로, 상기 항체는 단일클론 항체이고 및/또는 상기 항체는 트라스투주맙인 것인 방법, 혼합물, 또는 용도.
  31. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 튜불린 억제제 또는 DNA 상호작용제(DNA interacting agent)이고; 선택적으로, 상기 튜불린 억제제는 (a) 오리스타틴(auristatin); 및 (b) 마이탄신(maytansine) 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고; 선택적으로 상기 DNA 상호작용제는 (a) 칼리케아미신(calicheamicin), (b) 두오카르마이신(duocarmycin) 및 (c) 피롤로벤조디아제핀 (PBD)으로부터 선택되는 것인 방법, 혼합물, 또는 용도.
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